KR19980037261A - 랜덤 프라이머 집합을 이용한 mRNA의 증폭방법과 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 역전사 효소(reverse transcriptase)로 mRNA를 첫째가닥(first strand) cDNA로 합성한 후, 랜덤 프라이머 집합(random primer pool)을 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)의 프라이머로 해서 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법과 이의 용도로써 효율적인 유전자의 발현 유무 검색과 탐색방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 방법은 특정 세포로 부터 순수분리한 전체 RNA를 기존의 표준화된 방법으로 첫째가닥의 cDNA로 합성한 후 랜덤을 올리고머집합을 프라이머로 사용하여 합성된 RNA : DNA 융합체를 주형으로 이용한 RT-PCR 방법으로 랜덤 올리고머 집합을 최초로 RT-PCR에 적용한 것이다. 상기 방법으로 mRNA가 cDNA로 합성 증폭된 생산물을 유전자의 발현유무 검색 및 새로운 유전자의 탐색에 주형이나 프로브로 응용하는 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 기존 방법들의 문제점을 개선하여 소량의 시료 요구와 비용 및 노동력 절감으로 빠른 시간내에 다양하고 많은 유전자를 원활하게 검색하거나 탐색할 수 있는 새로운 분자 생물학적 기술을 제공한다.

Description

랜덤 프라이머 집합을 이용한 mRNA의 증폭방법과 이의 용도

본 발명은 역전사 효소(reverse transcriptase)로 mRNA를 첫째가닥(first strand) cDNA로 합성한 후, 랜덤 프라이머 집합(random primer pool)을 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)의 프라이머로 해서 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법과 이의 용도로서 효율적인 유전자의 발현 유무 검색과 탐색방법에 관한 것이다.

본 발명은 유전자의 발현 유무 검색과 유전자의 탐색 방법과 관련한다. 유전자의 발현은 유전자의 전사(transcription)와 해독(translation)을 걸쳐 최종생산물로 단백질을 합성하는 일련의 생물학적 현상이다. 이때, mRNA는 유전자 발현의 중간체로서 세포의 종류, 분화 그리고 외부 환경의 변화 등에 의해 그 합성되는 유전자 조합과 빈도에 따라 조절된다. 그러므로, 특정 유전자의 발현과 조절, 그 발현 양상 등을 연구할 때 mRNA는 매력적이고 직접적인 연구 대상이 된다.

세포 내에서 특정유전자의 발현 유무는 mRNA의 존재 여부에 따라 검색이 된다. 유전자의 발현 검색 방법으로는 노던 블라트(Northern blots), RNA 도트/스로트 블라트(RNA dot/slot blots), RT-PCR 방법 등이 알려져 있다. 이 방법들은 확인하고자 하는 세포의 RNA 집합을 주형으로 사용하고 밝혀진 특정유전자의 염기배열순서를 가지는 프로브를 사용하여 접합(hybridization) 방법을 실시함으로써 유전자의 발현 유무를 검색한다. 노던 블라트와 RNA 도트/스로트 블라트 방법은 일반적으로 발현정도가 높은 고카피(high copy) 유전자의 경우 검색이 용이하며 다량의 전체 RNA(20 ㎍ 이상)를 요구하고 저카피(low copy) 유전자의 경우, 전체 RNA로 부터 순수분리된 많은 양의 mRNA를 사용하여야만 검색이 가능하거나 아예 검색하기 어려운 경우가 종종 발생한다. 반면, RT-PCR 방법은 상기 방법에서 요구하는 시료양이 1/100배 이하 소량의 RNA를 역전사효소로 단일 cDNA로 합성한 후, 합성한 cDNA를 주형으로 사용하고 특정유전자의 염기배열 순서를 프라이머로 작성하여 PCR 방법을 실시함으로써 저카피 유전자의 경우도 증폭되어 검색할 수 있다. 그러므로, RT-PCR 방법은 상기 방법들에 비해 휠씬 민감도(sensitivity)가 높은 검색 방법으로 알려져 있다. 그 예로, 근 위축증에 관여하는 다이스트로핀(dystrophin) 유전자는 근육세포의 전체 RNA중 그 발현정도가 0.01∼0.001% 정도의 저카피 유전자로 기존의 노던 블라트나 RNA 도트/스로트 블라트와 같은 방법으로 확인하기가 어렵다. 그러나 Chelly 등은 RT-PCR 방법을 이용하여 환자로 부터 진단시료를 확보하는데 성공하였다(Chelly, J., Kplan, J-C., Gautron, S. and Kahn, A. Nature 333 : 858∼860, 1988). 이와 같이 RT-PCR은 소량의 시료를 요구하며 검색방밥으로써 민감도가 높지만 상기 방법들과 만찬가지로 실시하기 위해서는 프로브 제작시 반드시 특정유전자의 염기배열암호를 알아야 한다는 단점이 있다. 게다가 최근에 세포특이적으로 발현하는 유전자 탐색을 위해 많이 사용되는 방법으로 디퍼렌셜 디스플레이(differential display) 방법(P.Liang and A.B.Pardee, Science 257 : 967∼971, 1992)이며, 서브트랙티브 cDNA 라이브러리 방법(S.W.Lee,et.al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 88 : 2825∼2829, 1991)이 도입되고 있는데 상기 방법들은 특정 세포마다 유전자 발현에 차이를 보이는 많은 샘플들을 얻을 수 있다. 디퍼렌셜 디스플레이 방법은 소량의 전체 RNA를 시료로 하여 선택한 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 증폭시켜 이때 나타나는 밴드 유형에서 차이를 보이는 유전자를 탐색하는 방법(P.Liang and A.B.Pardee, Science 257 : 967∼971, 1992)이며, 서브트랙티브 cDNA 라이브러리 방법은 탐색하고자 하는 특정세포의 유전자 집합을 대조되는 다른 특정세포의 유전자 집합과 접합시켜 차별되는 유전자를 얻는 방법이다.(S.W.Lee,et.al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 88 : 2825∼2829, 1991). 그러나, 현재 상기 명시한 방법들에 따라 얻은 다양한 각 샘플 유전자들을 각각 노던 블라트나 RT-PCR 방법을 통해 발현 유무를 증명하는데 있어서 문제점으로 상기 언급한 바와 같이 첫째, 다량의 시료를 필요로 하는 것, 둘째, 프라이머 작성을 위해 유전자의 염기서열정보를 서열화 방법을 통해 얻어야만 한다는 점, 세째, 한번에 한종류의 유전자 발현만 검색 할 수 있다는 점, 넷째, 많은 노동력과 시간 및 비용을 요구하는 점 등이 존재한다. 그러므로, 상기 명시한 기존의 유전자 발현유무 검색 방법의 한계는 유전자의 탐색 방법을 수행하는데도 많은 공통된 문제점을 안견준다.

따라서, 본 발명에서는 상기 명시한 기존의 유전자 발현 유무 검색과 탐색 방법의 단점을 극복하기 위해 mRNA 증폭 방법을 사용하였다. 기존의 RT-PCR 방법은 소량의 전체 RNA(200ng 이하)를 사용하며 발현 빈도가 낮은 유전자도 검색할 수 있다는 장점이 있지만 동시에 특정 유전자의 서열화 방법에 의한 염기배열 정보가 있어야만 한다는 단점이 있다. 본 발명에서는 이와같은 단점을 해결하기 위해 각 샘플 유전자의 염기배열 정보를 탐색하지 않고도 유전자의 발현을 검색할 수 있는 방법으로써 랜덤 프라이머 집합을 RT-PCR의 프라이머로 하여 mRNA를 증폭시켰다. 랜덤 프라이머는 세포 내에 존재하는 전체 mRNA 집합의 정보를 완전하게 PCR로 증폭시킬 수 있다.

최근에 랜덤 프라이머를 이용하여 성공적으로 게놈 DNA를 PCR로 증폭하였다고 보고되고 있으나(H.Z.Peng, et al., J.Clinic.Pathol., 47 : 605∼608, 1994, L.Zhang, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 89 : 5847∼5851, 1992) RT-PCR을 통한 RNA : DNA 융합체를 랜덤 프라이머 집합을 이용하여 증폭한 경우는 최초이다.

본 발명의 목적은 소량의 RNA 시료를 이용하여 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시킴으로써 단순하며 효율적으로 특정 유전자의 발현 유부를 검색할 수 있고 여러 종류의 유전자 발현도 동시에 검색할 수 있는 방법과 세포 특이적으로 발현되는 유전자를 직접적으로 cDNA 라이브러리를 탐색함으로서 분리 동정 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 첫째, 랜덤 프라이머 집합을 이용해 전체 mRNA를 증폭하여 증폭된 생산물을 주형이나 프로브로 유전자 발현유무 검색방법에 적용할 수 있다. 둘째, 디퍼렌셜 디스플레이와 서브트랙티브 cDNA 라이브러리 방법에 의해 얻은 다양한 샘플 유전자의 발현 검색 방법에 적용할 수 있다. 세째, 특정 유전자의 발현 유무 검색 방법으로 노던 블라트나 기존의 RT-PCR 방법에 대신 적용할 수 있다. 네째, 세로운 유전자 탐색을 위한 직접적인 cDNA 라이브러리 스크리닝 방법에 적용할 수 있다.

제 1도는 랜덤 프라이머 집합의 올리고머의 뉴클레오타이드 길이에 따른 mRNA의 증폭을 나타낸 것이다.

제 2 도는 랜덤 프라이머 집합을 이용한 전체 mRNA의 증폭시 dNTP의 농도 변화에 따른 영향을 나타낸 것이다.

제 3도는 랜덤 프라이머 집합을 이용한 전체 mRNA의 증폭시 올리고머 농도 변화에 따른 영향을 나타낸 것이다.

제 4도는 랜덤 프라이머 집합을 이용한 전체 mRNA의 증폭시 PCR의 온도 및 시간 조건 변화에 따른 영향을 나타낸 것이다.

따라서 본 발명은 전체 mRNA 시료에 역전사 효소(reverse transcriptase)를 작용시켜 제조된 mRNA : cDNA 결합체를 주형으로 사용하여 최소 6-머 내지 15-머까지의 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합 또는 최소 6-머 내지 15-머까지의 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합과 올리고 dT를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)시켜 전체 mRNA를 cDNA를 cDNA로 증폭시키는 방법에 관한 것으로, 특히 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합은 원핵세포의 전체 mRNA를 cDNA로 증폭하기 위하여 프라이머로 사용하여 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법과 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합과 올리리고 dT는 진핵세포의 전체 mRNA를 cDNA로 증폭하기 위하여 프라이머로 사용하여 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법에 관한 것이다.

상기의 방법으로 증폭된 cDNA는 전체 cDNA에 유전자 발현을 검색하기 위한 주형(template) 또는 프로브(probe)로 사용하거나, 증폭된 전체 cDNA를 유전자 탐색을 위한 프로브로서 사용함을 특징으로 한다.

본 발명의 첫번째 단계로서 특정 세포에서 전체 RNA를 분리한다. 분리한 소량의 전체 RNA는 기존에 알려진 방법으로 역전사효소(하기, RT라 칭함) 반응을 이용하여 첫째가닥 cDNA를 합성한다. 다만 진핵세포의 경우 랜덤 헥사머(random hexamer)나 oligo-dT(15)를 RT의 프라이머로 사용하고 원핵세포의 경우는 poly(A) 테일이 없기 때문에 랜덤 헥사머를 RT의 프라이머로 사용한다.

본 발명에서는 상기 방법으로 합성한 첫째가닥 cDNA를 이용해서 발현 정도가 낮은 mRNA를 포함한 모든 종류의 mRNA를 간단히 이중가닥 cDNA로 증폭시킬 수 있도록 단일가닥 cDNA로를 주형으로 사용하고 랜덤 프라이머 집합을 올리고머의 뉴클레오티드 길이별로, 예를 들면, 헥사머, 7-머, 8-머, 9-머 혹은 10-머를 합성하여 PCR의 프라이머로 사용하였다. 일반적으로 헥사머처럼 프라이머의 길이가 짧은 경우는 낮은 Tm값을 나타냄으로 PCR의 Taq DNA 폴리머라제의 최적반응온도인 72℃에서는 효율적으로 주형에 결합하기 어렵다고 보고되고 있고 지금까지 헥사머를 PCR의 프라이머로 사용하는 경우는 거의 없었다.(J.K.G. Williams, et al., Nucleic Acid.Res., 18, 6531∼6535, 1991 ; P.Liang and A.B.Pardee, Science, 257, 967∼971, 1992). 그러나 최근에 소량의 게놈 DNA를 PCR 방법을 이용하여 전체 게놈 DNA를 증폭하고자 하는 시도로써, 랜덤 헥사머 집합을 PCR의 프라이머로 사용하여 성공적으로 증폭·합성한 것이 보고되고 있다(H.Z,Peng, et al., J.Clinic.Pathol., 47,605∼608(1994)). 이는 랜덤 헥사머 집합을 PCR 방법의 프라이머로써 사용할 수 있다는 것을 뒷받침한다. 다시 말해, 첫째가닥 cDNA를 주형으로 PCR 방법을 수행할 때 랜덤 헥사머 집합을 프라이머로 사용하면 전체 mRNA를 증폭시킬 수 있다는 것을 뜻한다. 최근에 15-염기 랜덤 올리고뉴클레오타이드를 PCR의 프라이머로 사용해서 전체 게놈 DNA 증폭 시켰다는 또 다른 보고가 있다(L.Zhang, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 5847∼5851 1992). 본 발명에서는 랜덤 6-머에서 부터 랜덤 15-머 까지를 증폭하기 위한 프라이머로 사용하였다.

이하 본 발명의 방법을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

전체 RNA를 유채(Brassica napus L. cv Naehan)의 뿌리, 줄기, 꽃으로 부터 전체 RNA 분리 키트(Qiagen #14162)를 이용하여 분리하였다. 분리한 전체 RNA로 부터 oligo(dT)15를 이용하여 기존의 표준화된 역전사 방법을 통하여 첫째가닥 cDNA를 합성하였다. 역전사 반응은 20㎕ 의 용량으로 조성은 다음과 같다.

1X RT 버퍼, 2㎕ oligo(dT)15(10μM), 1.6㎕ dNTP(250μM), 200 유니트의 MMLV(Promega, M5301), 0.2㎍ 전체 RNA의 조성으로 65℃에서 5분간 처리후 37° 수욕상에서 1시간 반응시켜 첫째가닥 cDNA를 합성 하였다. 합성된 cDNA를 5배 희석하여 10㎕를 PCR의 주형으로 사용하였다. PCR 반응의 용량은 40㎕로 하였으며 1X PCR 버퍼, 2.5mM MgSO₄(Promega), 200μM dNTP, 5 unit Taq 폴리머라제(Promega, M1661), 1μM∼10μM 랜덤 올리고머(6-머∼10-머, 바이오니아, 한국), 10㎕ diluted cDNA의 조성으로 94℃에서 5분 동안 이니셜 디내튜레이션(inital denaturation)를 시킨후 94℃/1분, → 37℃/2분, → 72℃/2분, 40 사이클의 조건으로 Perkin-Elmer DNA 주형 사이클러를 이용하여 합성한 cDNA를 증폭하였다.

이하 본 발명은 다음 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

전체 RNA의 분리 및 역전사 방법을 통한 cDNA의 합성

전체 RNA의 분리는 다음과 같이 하였다. 조직을 액체질소와 막자사발을 이용하여 마쇄한 후 전체 RNA 분리키트(Qiagen, #14162)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 분리한 전체 RNA를 MMLV 역전사 효소(Promega, M5301)를 이용하여 첫째가닥 cDNA를 합성하였다.

[실시예 2]

랜덤 프라이머 집합의 올리고뉴클레오타이드 길이에 따른 전체 mRNA 증폭에 미치는 영향

실시예 1에서와 같이 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 랜덤 6-머에서 부터 10-머까지의 집합을 각각 프라이머로 사용하여 94℃/1분, → 37℃/2분, → 72℃/2분으로 40 사이클의 조건에서 PCR을 수행하여 cDNA를 증폭하였다. 그 결과 각 랜던 올리고뉴클레오타이드 집합을 PCR의 프라이머로 사용시 모두 mRNA의 증폭이 잘 일어났음을 알 수 있었다(제 1 도).

[실시예 3]

랜덤 프라이머 집합을 이용한 전체 mRNA 증폭시 dNTP의 농도변화에 따른 영향

실시예 2에서와 같이 cDNA 증폭시 dNTP의 최종농도를 각 400μM, 200μM, 100μM, 10μM로 하여 PCR을 수행하였다. 이때 400μM, 200μM, 100μM의 dNTP 농도에서는 mRNA의 증폭이 일어났지만 10μM의 농도에서는 증폭이 일어나지 않았다(제 2 도).

[실시예 4]

랜덤 프라이머 집합을 이용한 전체 mRNA 증폭시 올리고머 농도 변화에 따른 영향

실시예 2에서와 같이 mRNA의 증폭시 랜덤 올리고머의 최종 농도를 각 100μM, 10μM, 1μM로 하여 PCR을 수행하였다. 이때 각 100μM, 10μM, 1μM의 농도에서 mRNA의 증폭이 잘 일어났음을 알 수 있었다(제 3도).

[실시예 5]

랜덤 프라이머 집합을 이용한 전체 mRNA 증폭시 PCR의 온도 및 시간조건 변화에 따른 영향

실시예 3, 4를 통해서 얻어진 dNTP와 랜덤 올리고머의 농도중 200μM dNTP와 1μM 램덤 올리고머를 사용하고 랜덤 헥사머를 프라이머로 mRNA 증폭시 PCR 조건을,

1) 94℃/1분 → 37℃/2분 → 55℃/5분 : 40cycles

2) 94℃/1분 → 42℃/2분 → 55℃/5분 : 40cycles

3) 94℃/1분 → 37℃/2분 → 72℃/2분 : 40cycles

4) 94℃/1분 → 42℃/2분 → 72℃/2분 : 40cycles의 방법으로 각각 PCR을 수행하였다. 이때 어닐링 온도는 37℃에서가 42℃보다 더 많은 cDNA의 증폭이 일어남을 알수 있었다.(제 4 도)

본 발명의 효과는 기존의 방법들과 달리 소량의 시료 요구와 노동력 절감으로 빠른 시간내에 전체 mRNA를 cDNA로 증폭 시킴으로서 다양하고 많은 유전자를 원활하게 검색하거나 탐색할 수 있는 새로운 분자생물학적 기술을 제공한다.

Claims (5)

1. 전체 mRNA 시료에서 역전사 효소(reverse transcriptase)를 작용시켜 제조된 mRNA : cDNA 결합체를 주형으로 사용하여 최소 6-머 내지 15-머까지의 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합 또는 최소 6-머 내지 15-머까지의 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합과 올리고 dT를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)시켜 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법
2. 제 1 항에 있어서, 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합은 원핵세포의 전체 mRNA를 cDNA로 증폭하기 위하여 프라이머로 사용함을 특징으로 하는 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법
3. 제 1 항에 있어서, 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합과 올리고 dT는 진핵세포의 전체 mRNA를 cDNA로 증폭하기 위하여 프라이머로 사용함을 특징으로 하는 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법
4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한항에 있어서, 랜덤 올리고뉴클레오타이드 집합중 랜덤 올리고헥사뉴클레오타이드를 프라이머로 사용함을 특징으로 하는 전체 mRNA를 cDNA로 증폭시키는 방법
5. 유전자 발현을 검색하기 위한 주형(template) 또는 프로브(probe)로 사용하거나,증폭된 전체 cDNA를 유전자 탐색을 위한 프로브로서 제 1 항의 cDNA 증폭방법을 사용하는 방법