JP2006104119A - 生理活性高分子物質の精製方法及びその方法により得られる精製物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 生理活性高分子物質含有液に対し、透析処理及び等電点沈殿処理を同時に行うことにより生理活性高分子物質を精製する。
【選択図】 なし
Description
したがって、これらの生理活性高分子物質について、簡単に、かつ効率よく純度をあげる精製方法を開発することが重要な課題となっている。
また、一般に赤血球凝集素については100℃での熱処理によって、その糖鎖結合能力を喪失するという欠点がある。
本発明では透析処理及び等電点沈殿処理を同時に行う処理を透析同時等電点処理という。
すなわち、オゴノリ属紅藻類から塩類水溶液で抽出される抽出液に、最終濃度20〜40%飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第1段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度60〜80%飽和濃度程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第2段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶液で溶解した粗活性画分を以下の操作(1)〜(3)を行って、透析同時等電点沈殿処理済みの活性画分を得る。
これらの紅藻類は、寒海にも存在するが特に暖海に多く、わが国ではほとんどすべての海岸地帯に分布しており、寒天の増量物や刺身のつまなどに用いられている。
この処理の1つの操作例を述べると、上部が開放されたセルあるいは容器で底部・側面に透析膜を取り付けた透析用器具を用いて適当なpHに調整した蒸留水や緩衝液で透析同時等電点処理を行い、沈殿が生じた後、透析器具内の可溶性画分をピペットなどで取り出し、別のpHに調整した蒸留水や緩衝液に浸したもう一つの透析用器具内へ移す。この操作を繰り返すことによって、連続的に高純度化を行うことができる。
これに対し、本発明方法においては、あらかじめ適当なpHに調節した蒸留水や緩衝液を透析液として用いて等電点沈殿を生成させているので、試料液中での急激なpH変化が起こらず、タンパク質が変性しない。
ツルシラモ(徳島県吉野川河口域産)を0.15M塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物100gに0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)700mlを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を4℃で6時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が35%飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて1段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、4℃で1時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が70%飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、4℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分(沈殿状態の粗活性画分)を、最少量の緩衝液A[30mM 塩化カリウム、3μM 硫酸亜鉛、1mM 2−メルカプトエタノールを含む25mM Tris−HCl(pH7.6)]に溶解し、液状の粗活性画分を得た。次いで粗活性画分の一部を0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)に対して透析し、ウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を測定した結果、256単位であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。これらの結果を表1に示す。
生理活性高分子物質の精製画分である透析同時等電点処理した活性画分の赤血球凝集活性とタンパク質量を測定した結果、粗活性画分よりも比活性が高かった。この結果を表1に示す。
以上の結果から、本発明方法を用いると、紅藻類由来の赤血球凝集素が、その活性を保持したまま効果的に得られることが分かる。
透析同時等電点処理の代わりにオゴノリ属紅藻類の粗活性画分を温度100℃で10分間加熱処理を行い、遠心分離により夾雑タンパク質を除去し、熱処理した活性画分を得る以外は、実施例1記載の方法と同様にして赤血球凝集素の精製を行った。得られた熱処理した活性画分のタンパク質量、赤血球凝集活性を測定し比活性を求めた。結果を表1に示す。
表1から赤血球凝集素は熱処理により失活せず、耐熱性があることが分かる。また熱処理により熱に弱い夾雑タンパク質が沈殿として除去されるため、熱処理により比活性が上昇することが分かる。しかし、熱処理による比活性の上昇は、透析同時等電点処理による比活性の上昇よりは小さい結果であり、赤血球凝集素の精製方法としては、透析同時等電点処理の方が、熱処理よりもより効果的であることが分かる。
ツルシラモ(徳島県吉野川河口域産)湿質量500gを0.15M塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、−30℃で凍結した。30mM塩化カリウムと3μM硫酸亜鉛、5mM2−メルカプトエタノールを含んだ0.5Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液(pH8.2)を抽出用緩衝液として使用し、細かく粉砕した凍結海藻(ツルシラモ湿質量500g相当)に対し、抽出用緩衝液800mlを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を4℃で6時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が35%飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて1段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、4℃で1時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が70%飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、4℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分(沈殿状態の粗活性画分)を、最少量の緩衝液A[30mM 塩化カリウム、3μM 硫酸亜鉛、1mM 2−メルカプトエタノールを含む25mM Tris−HCl(pH7.6)]に溶解し、液状の粗活性画分を得た。次いで粗活性画分の一部を0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)に対して透析し、アルドラーゼ活性を測定した結果、0.0122単位であった[画分200μl中に含まれている活性(unit)]。
。ここで、酵素活性の単位は、25℃において1分間に基質であるフルクト−ス−1,6−ビスリン酸(FBPと略する)を1μモル分解する活性を1単位と定義した。これらの結果を表2に示す。
活性測定は、5mMのフルクト−ス−1,6−ビスリン酸を基質として、40mMトリスー塩酸緩衝液(pH7.6)の溶液の中で25℃で測定した。
また、生理活性高分子物質の精製画分である透析同時等電点処理した活性画分の赤血球凝集活性とタンパク質量を測定した結果、組活性画分よりも比活性が高かった。これにより、本発明の精製方法が有効であることが分かる。この結果を表2に示す。
以上の結果から、本発明の生体高分子の精製方法を用いると、紅藻類由来のアルドラーゼが、その活性を保持したまま効果的に得られることが分かる。
透析同時等電点処理の代わりにオゴノリ属紅藻類の粗活性画分を温度100℃で10分間加熱処理を行い、遠心分離により夾雑タンパク質を除去し、熱処理した活性画分を得る以外は、実施例1記載の方法と同様にしてアルドラーゼの精製を行った。得られた熱処理した活性画分のタンパク質量、アルドラーゼ活性を測定し比活性を求めた。結果を表2に示す。
表2からアルドラーゼは熱処理により活性が低下し、熱に不安定であることが分かる。したがって、酵素タンパク質であるアルドラーゼの濃縮方法としては、本発明方法の方が、熱処理よりもより効果的であることが分かる。
本発明方法により得られる生理活性高分子物質の精製画分は、臨床分野、医療分野、生化学工業分野における治療用、検査用材料、試薬及び化粧品分野の添加剤などとして有用である。
Claims (12)
- 生理活性高分子物質含有液に対し、透析処理及び等電点沈殿処理を同時に行うことを特徴とする生理活性高分子物質の精製方法。
- 生理活性高分子物質及び不純分を含有する緩衝液を透析膜を介して、生理活性高分子物質の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を含む溶液から生理活性高分子物質を沈殿させて回収する請求項1記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 生理活性高分子物質及び不純分を含有する緩衝液を透析膜を介して、高分子不純分の等電点に調整された透析液と接触させ、低分子不純分を透析液中に移行させて除去すると同時に高分子不純分を沈殿させて除去する請求項1記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 透析液が二酸化炭素でpH調整された蒸留水又は緩衝液である請求項2又は3記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 透析膜が再生セルロースチューブである請求項2ないし4のいずれかに記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 生理活性高分子物質が赤血球凝集活性物質である請求項1ないし5のいずれか記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 生理活性高分子物質がタンパク質である請求項1ないし5のいずれか記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 生理活性高分子物質が酵素である請求項1ないし5のいずれか記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 生理活性高分子物質が海藻抽出物である請求項1ないし5のいずれか記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 高分子不純分が可溶性糖類である請求項2ないし9のいずれか記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 低分子不純分が硫酸アンモニウムである請求項2ないし10のいずれかに記載の生理活性高分子物質の精製方法。
- 請求項1ないし11のいずれか記載の精製方法により得られる生理活性高分子物質精製物。
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