CN102268422B

CN102268422B - 一种可抑制hiv-1反转录酶的蝉花蛋白酶及制备方法

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Publication number: CN102268422B
Application number: CN2011101879648A
Authority: CN
Inventors: 王守现; 刘宇; 王贺祥; 张国庆; 赵爽; 许峰; 耿小丽; 王兰青; 孟莉莉
Original assignee: China Agricultural University; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences; Beijing University of Agriculture
Current assignee: China Agricultural University; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences; Beijing University of Agriculture
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-07-06
Also published as: CN102268422A

Abstract

本发明公开了一种可抑制HIV-1反转录酶的蝉花(Cordyceps sobolifera)蛋白酶及制备方法，包括以下步骤：1)破碎蝉花细胞；2)收集蛋白粗提物；3)从步骤2)收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶，得到的蛋白酶即为蝉花提取物，所述蛋白酶的分子量为31KD，N末端氨基酸序列见序列表序列1，属于丝氨酸族蛋白酶，在如下条件下酶的活力最高：pH值为12-12.5、温度为55-65℃。依据本发明的制备方法所获得的蝉花提取物对HIV-1反转录酶有极其明显的抑制作用，在抗艾滋病新药研究领域中具有重要价值。

Description

一种可抑制HIV-1反转录酶的蝉花蛋白酶及制备方法

技术领域

本发明涉及一种可抑制HIV-1反转录酶的蝉花蛋白酶及制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质水解反应的酶，能作用于蛋白质分子中的肽键，形成长度较短的肽链或是氨基酸。蛋白酶广泛存在于生物体内，对蛋白质的新陈代谢起调节作用，从细胞、器官、机体等各个水平上发挥各种各样的功能。蛋白酶种类繁多，应用领域也十分广泛，主要涉及到去污剂、皮革、纺织、食品、医药、环保与资源等多方面。近年来，随着生物学研究技术的发展，开发蛋白酶资源，寻找新的高品质的蛋白酶一直是各国研究人员关注的焦点。

蝉花(Cordyceps sobolifera)又名蝉蛹草、蛹茸、虫花，是麦角菌科真菌大蝉草(蝉拟青霉)及其寄主山蝉若虫的干燥体。医学上认为，蝉花是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材。蝉花中分离的蝉拟青霉具有极为广谱并具较强的致病性，可以寄生鳞翅目、膜翅目中的很多昆虫，在害虫防治上显示很大的优越性，其作用机制可认为是菌丝体分泌蛋白酶侵染虫体，利用其中的蛋白养分完成生活史。

艾滋病是严重威胁人类健康的病毒性传染病。艾滋病病毒HIV属于反转录病毒科的慢病毒亚科。反转录是HIV病毒最重要的特征之一，其过程就是在病毒体内反转录酶的作用下以病毒RNA为模板合成病毒DNA的过程。在反转录过程中，反转录酶起着重要作用，这也是研究抗艾滋病药物的最佳靶点之一，目前正在研制的大部分药物都是以HIV的反转录为靶点的。Mitsuya等首先发现脱氧胸苷类AZT具有显著的抑制艾滋病病毒的作用，随后研究又陆续发现脱氧核苷、无环核苷、核苷类似物能有效的抑制HIV的复制，但这些抑制剂的耐药问题日益突出，并且具有严重的毒副作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑制HIV-1反转录酶活性的蝉花蛋白酶及其制备方法。

本发明提供的蝉花蛋白酶，其制备方法包括以下步骤：1)破碎蝉花细胞；2)收集蛋白粗提物；3)从步骤2)中收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶，得到的蛋白酶即为蝉花提取物，所述蛋白酶的分子量为31KD且N末端序列见序列表序列1。

所述蛋白酶为丝氨酸族蛋白酶，所述蛋白酶在如下条件下酶的活力最高：pH值为12-12.5、温度为55-65℃。

所述破碎蝉花细胞可为破碎蝉花子实体的细胞。

所述步骤2)中，采用离心的方式收集蛋白粗提物，所使用的离心力为6010-15151g，具体为12000g。

从步骤2)收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶包括如下a)～c)三步：

a)将从步骤2)收集的蛋白粗提物进行阴离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，用pH8.9-9.9的碳酸氢铵缓冲溶液进行洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为9.5-10.5mM NH₄HCO₃，溶剂为水，用氨水调pH；

b)将从步骤a)获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所采用的洗脱程序为进行NaCl线性洗脱，所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为4.5-5.5，溶质为NaCl，溶剂为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；所述线性洗脱的时间是150分钟，所述线性洗脱中NaCl的浓度在150分钟内由0M线性升至0.8M；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为4.0-5.0mM柠檬酸和5.0-6.0mM柠檬酸钠，溶剂为水；

c)将从步骤b)获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围包括31KD，所用的层析柱的柱长度和柱内径比为25∶1-50∶1。

所述步骤a)阴离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤b)阳离子交换柱层析的载体为Sepharose，所述步骤c)凝胶过滤层析的介质为Superdex 75。

所述步骤a)中洗脱用pH9.4的所述碳酸氢铵缓冲溶液洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为10mM碳酸氢铵，溶剂为水，用氨水调pH；

所述步骤b)中所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为5.0，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为4.1mM柠檬酸和5.9mM柠檬酸钠，溶剂为水；

所述步骤c)中所述得到具有蛋白酶活性的洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的：pH值为8.5的0.2M的NH₄HCO₃水溶液。

所述步骤c)所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30∶1。

本发明提供的蝉花提取物，其分子量为31KD且N末端序列见序列表序列1；所述蛋白酶为丝氨酸族蛋白酶，所述蛋白酶在如下条件下酶的活力最高：pH值为12-12.5、温度为55-65℃。

所述的蝉花提取物在制备下述任一产品中的应用也是本发明的保护范围：

A)抑制HIV-1反转录酶活性的产品；B)改善艾滋病患者健康状况的产品。

依据本发明的制备方法所获得的蝉花蛋白酶对HIV反转录酶活性有非常明显的抑制作用，是以一种新型的抗病毒抑制剂，在抗艾滋病新药研究领域中具有重要价值。

附图说明

图1为DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析洗脱图谱。

图2为SP-Sepharose强阳离子交换柱层析洗脱图谱。

图3为FPLC-Superdex 75凝胶过滤层析洗脱图谱。

图4为蝉花蛋白酶SDS-PAGE电泳鉴定图谱。标准分子量M(购自GE Healthcare公司)从上到下依次为：磷酸化酶b(94KD)，牛血清白蛋白(67KD)，卵清蛋白(43KD)，碳酸酐酶(30KD)，大豆胰岛素抑制剂(20KD)，乳白蛋白(14.4KD)；P为蝉花蛋白酶。

图5为蝉花蛋白酶在不同反应温度下的相对酶活力。

图6为蝉花蛋白酶经不同温度处理40min后的相对酶活力。

图7为蝉花蛋白酶在不同pH条件下的相对酶活力。

图8为不同剂量蝉花蛋白酶对HIV-1反转录酶的抑制率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、蝉花(Cordyceps sobolifera)蛋白酶的分离纯化与鉴定

1、提取与粗级分离

用0.15M的NaCl溶液悬浮蝉花(Cordyceps sobolifera)(Liu，Z.-Y.，Liang，Z.Q.，Whalley，A.J.S.，Liu，A.-Y.& Yao*，Y.-J.A new species of Beauveria，the anamorph of Cordyceps sobolifera.Fungal Diversity，2001，7：61-70.公众可从北京市农林科学院获得)子实体，利用组织捣碎机进行组织破碎至子实体为糊状，4℃条件下放置12小时后，8000rpm(12000g)离心15min，收集上清溶液，得到粗提液；向粗提液中加入(NH₄)₂SO₄至80％饱和度，于4℃条件下静置4小时，8000rpm(12000g)离心15min，收集沉淀，得到蛋白粗提物，蒸馏水溶解蛋白粗提物沉淀并在蒸馏水中透析12-16小时。

2、离子交换柱层析分离纯化

层析柱利用相应的缓冲溶液以4ml/min的流速平衡8-10个柱体积后，利用pH计测定层析柱流出液的pH值以确定层析柱是否平衡好，透析后的蛋白粗样品以1.5ml/min的流速匀速上样，待样品上完后，将流速调制2.5ml/min(SP-Sepharose层析为1ml/min)进行洗脱，各洗脱峰利用蛋白酶活性检测方法确定是否为活性峰。

DEAE-Cellulose层析柱洗脱时选用添加0、0.1M和1M NaCl进行分步洗脱；SP-Sepharose层析柱洗脱时选用添加0-0.8M NaCl进行线性洗脱。

(1)DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析

透析后的蛋白粗提物经过pH9.4的碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为10mM NH₄HCO₃，用氨水调pH，溶剂为水)平衡后，经DEAE-Cellulose(Sigma公司，D0909)弱阴离子交换柱层析。该离子交换柱的柱体积为100ml。进行三步洗脱，流速2.5ml/min。第一步洗脱用pH9.4的碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为10mM NH₄HCO₃，用氨水调pH，溶剂为水)洗脱2个柱体积；第二步洗脱用pH9.4的如下溶液洗脱1.5个柱体积：溶质是0.1M NaCl，溶剂是碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为10mM NH₄HCO₃，用氨水调pH，溶剂为水)；第三步洗脱用pH9.4的如下溶液洗脱1.3个柱体积：溶质是1.0M NaCl，溶剂是碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为10mM NH₄HCO₃，用氨水调pH，溶剂为水)。

收集得到的洗脱峰进行蛋白酶活性检测，结果表明第一步洗脱得到的第一洗脱峰D1(图1中洗脱体积为第40-120ml，即第0.4-1.2个柱体积)为目标提取物的活性峰(其蛋白酶活性为1949.83U/mg)，将D1活性峰在蒸馏水中透析10-12小时。

(2)SP-Sepharose强阳离子交换柱层析

进行SP-Sepharose(GE Healthcare公司，17-0729-10)强阳离子交换柱层析。先用pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(溶质为4.1mM柠檬酸和5.9mM柠檬酸钠，溶剂为水)平衡离子交换柱(该离子交换柱的柱体积为10ml)，将D1组分上样，再用100ml pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(溶质为4.1mM柠檬酸和5.9mM柠檬酸钠，溶剂为水)平衡，流速1ml/min。然后，再进行150分钟的NaCl线性洗脱，流速1ml/min。该NaCl线性洗脱溶液pH值为5.0，溶质为NaCl，溶剂为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(溶质为4.1mM柠檬酸和5.9mM柠檬酸钠，溶剂为水)，NaCl的浓度在150分钟内由0M线性升至0.8M。

收集得到的洗脱峰进行蛋白酶活性检测，结果表明得到的第三洗脱峰SP3(图2中洗脱体积为第160-180ml，即第16-18个柱体积)为目标提取物的活性峰(该活性峰的蛋白酶活性为36395.35U/mg)，将SP3活性峰在蒸馏水中透析10-12小时。

3、凝胶过滤层析

SP3组分经FPLC-Superdex 75(GE Healthcare公司，17-5174-01)凝胶过滤层析，洗脱液为pH8.5 0.2M NH₄HCO₃溶液，层析柱规格30cm(柱长)×1cm(内径)，上样体积为0.2ml，流速为0.8ml/min。收集得到的洗脱峰进行蛋白酶活性检测，结果表明得到的第一洗脱峰SU1(图3中洗脱体积为第11.2-14.4ml，即第0.47-0.61个柱体积)为目标提取物的活性峰(该活性峰的蛋白酶活性为56780.98U/mg)。

经过阴、阳离子交换柱层析和凝胶过滤层析，以25g干蝉花子实体为材料，得到纯化的蝉花蛋白酶活性为56780.98U/mg，回收率为7.37％(表1)。

表1 蝉花蛋白酶回收率与纯化倍数(25g干蝉花子实体)

上述蛋白酶活性均按照如下方法检测：

收集洗脱峰，利用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德科技公司，PP0103)测定洗脱峰的蛋白含量，利用下述蛋白酶活性检测方法测定出洗脱峰的活性，通过计算得出每毫克蛋白中存在的酶活力单位数。

蛋白酶活性检测方法：用0.1M pH7.2磷酸缓冲液配制1％酪蛋白溶液，作为反应底物。取140μl底物，酶样品25μl加入样品管，空白对照管预先加入435μl 5％三氯乙酸(TCA)提前终止反应，其它同样品管。充分混匀，37℃水浴保温15min，保温结束后取出于样品管迅速加入435μl 5％TCA终止反应。将反应管于8,000rpm(12000g)离心10min，去除未降解的酪蛋白。以对照管调零，280nm波长下测定吸光度。酶活力单位定义为：以280nm处每分钟每毫升产生0.001个吸光值所需要的酶量作为一个酶活力单位。

4、超滤浓缩

SU1活性峰在蒸馏水中透析10-12小时，在4℃进行截留分子量为3KD的超滤浓缩后，于-80℃条件下至完全冰冻，将冰冻样品冻干成粉备用，该干粉即为蛋白酶纯品，也即本发明保护的蝉花提取物。该蛋白酶纯品的蛋白酶活性为56780.98U/mg(蛋白酶活性检测同上)。将该蛋白酶纯品进行SDS-PAGE电泳鉴定，并结合凝胶过滤层析洗脱曲线确定该提取物的大小为31KD(见图4)。

5、氨基酸序列测定

采用自动化EDMAN降解法对蛋白酶纯品的N末端氨基酸序列进行测定，用HewlettPackard 1000A配有HPLC系统的蛋白序列测定仪测定N末端序列，测得序列见序列表序列1。

实施例2、蝉花蛋白酶性质的表征

取实施例1得到的蝉花蛋白酶纯品，按照实施例1的蛋白酶活性检测方法，研究蝉花蛋白酶的最适温度、热稳定性、最适pH值、离子对蝉花蛋白酶活性的影响、蛋白酶抑制剂对蝉花蛋白酶的影响等酶学性质。

1、最适温度

取实施例1得到的蝉花蛋白酶纯品，用0.1M pH7.2磷酸缓冲液配制成浓度为10mM的酶液，按实施例1的蛋白酶活性检测方法，先配成相同的反应体系混匀后，然后分别在20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、85℃的温度下反应15min，测定蛋白酶活性，以37℃反应15min测得的酶活定为100％，以相对酶活力对温度作图(图5)，得到蝉花蛋白酶的最适温度为55-65℃。

2、热稳定性

取实施例1得到的蝉花蛋白酶纯品，用0.1M pH7.2磷酸缓冲液配制成浓度为10mM的酶液，在0℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度条件下放置40min，然后按实施例1中蛋白酶活性检测方法测定蛋白酶活性。以37℃条件下放置40min后测得的酶活定为100％，以相对酶活力对温度作图(图6)，得出蝉花蛋白酶在0-40℃下活性相对稳定。

3、最适pH值

混合液：称取柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸和巴比妥酸加蒸馏水定容至1000mL，使上述四种成份在混合液中的浓度均为0.02875mol/L。每100mL混合液加入700-800mL蒸馏水用0.2M NaOH分别调pH值至4，5，6，7，8，9，10，11，11.5，12，12.5，13，最后加蒸馏水定容至1000mL。

按照实施例1蛋白酶活性检测方法，分别用上述12种pH值的缓冲液配制底物，测定实施例1获得的蝉花蛋白酶纯品酶活性，以pH12.5的上述缓冲液配制底物所测得的蝉花蛋白酶活定为100％，以相对酶活力和对应的pH值作图(图7)。结果表明该蝉花蛋白酶的最适pH值为12-12.5，为强碱性蛋白酶。

4、离子对蝉花蛋白酶活性的影响

按照实施例1中蛋白酶活性检测方法测定实施例1获得的蝉花蛋白酶纯品活性，其中，酶活测定反应体系中分别含FeCl₂、MCl₃、CaCl₂、MgCl₂、CdCl₂、ZnCl₂、HgCl₂、KCl、CuSO₄、EDTA、Pb(Ac)₂或MnCl₂的终浓度分别为10mM，5mM，2.5mM，1.25mM，4℃下放置1小时，然后测定蝉花蛋白酶活性。以未添加以上物质的反应体系测得的酶活定为100％，得到的蝉花蛋白酶相对酶活力(％)结果如表2所示。

表2 不同浓度金属离子对蝉花蛋白酶活性的影响

由表2可以看出，大部分金属离子对蝉花蛋白酶都有抑制效果。Fe²⁺在高浓度时对蛋白酶具有抑制作用，在低浓度时具有激活作用，10mM的Fe²⁺存在下，蛋白酶活性为93.99％，5mM的Fe²⁺存在下可被激活达到144.18％；Hg²⁺、Cu²⁺严重抑制蝉花蛋白酶的活性，1.25mM Hg²⁺、Cu²⁺存在时，蛋白酶被抑制，保留的活性分别为13.37％、78.14％；10mM Hg²⁺、Cu²⁺存在时，保留的活性分别为0.81％、12.57％。

5、蛋白酶抑制剂对蝉花蛋白酶的影响

按照实施例1中蛋白酶活性检测方法测定实施例1获得的蝉花蛋白酶纯品活性，其中，酶活测定反应体系中分别含酶抑制剂Pepstatin A(天冬氨酸蛋白酶抑制剂)0.2mM、EDTA(金属蛋白酶抑制剂)1mM、PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)1mM或Lima bean trypsininhibitor(大豆胰蛋白酶抑制剂或类丝氨酸蛋白酶抑制剂)0.25mM，以未添加上述蛋白酶抑制剂的反应体系测得的酶活定为100％，测得的相对酶活力见表3。结果表明，PMSF对蝉花蛋白酶的抑制最强烈，其它三种抑制剂的抑制效果不明显，这说明蝉花蛋白酶属于丝氨酸族蛋白酶。

表3 蛋白酶抑制剂对蝉花蛋白酶活性的影响

蛋白酶抑制剂	蝉花蛋白酶相对酶活力(％)
		Pepstatin A(0.2mM)	104.05±3.69^a
EDTA(1mM)	104.33±0.77^a
		Lima bean trypsin inhibitor(0.25mM)	93.49±4.58^b
PMSF(1mM)	1.14±0.32^c

实施例3、蝉花(Cordyceps sobolifera)蛋白酶抑制HIV-1反转录酶活性的功能检测

1、精确称取实施例1得到的蝉花蛋白酶纯品，配置成不同剂量溶液(见表4)，以检测抑制HIV-1反转录酶的活性；

2、使用Non-radioactive reverse transcriptase ELISA试剂盒(Roche公司，11468120910)，按照试剂盒说明书操作，具体方法参考文献Shuang Zhao & YongchangZhao & Shuhong Li & Jingkun Zhao & Guoqing Zhang & Hexiang Wang & Tzi Bun Ng.A novel lectin with highly potent antiproliferative and HIV-1 reversetranscriptase inhibitory activities from the edible wild mushroom Russuladelica.Glycoconj J(2010)27：259-265，结果见表4和图8。

抑制率(％)＝(A405_正对照-A405_样品)/(A405_正对照-A405_负对照)×100％

A405_正对照：反应体系中不含有蝉花蛋白酶，含有HIV-1反转录酶

A405_负对照：反应体系中不含有HIV-1反转录酶及蝉花蛋白酶

表4 不同剂量蝉花蛋白酶对HIV-1反转录酶的抑制率

IC 50为抑制率达到50％时蝉花蛋白酶的浓度。

Claims

1.蝉花（Cordyceps sobolifera）提取物的制备方法，包括以下步骤：

1）破碎蝉花细胞；

2）收集蛋白粗提物；

3）从步骤2）收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶，得到的蛋白酶即为蝉花提取物，所述蛋白酶的分子量为31KD且N末端序列见序列表中序列1；

所述从步骤2）收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶包括如下步骤：

a）将从步骤2）收集的蛋白粗提物进行阴离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，用pH8.9-9.9的碳酸氢铵缓冲溶液洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为9.5-10.5mM碳酸氢铵，溶剂为水；

b）将从步骤a）获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所采用的洗脱程序为进行NaCl线性洗脱，所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为4.5-5.5，溶质为NaCl，溶剂为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；所述线性洗脱的时间是150分钟，所述线性洗脱中NaCl的浓度在150分钟内由0M线性升至0.8M；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为4.0-5.0mM柠檬酸和5.0-6.0mM柠檬酸钠，溶剂为水；

c）将从步骤b）获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围包括31KD，所用层析柱的柱长度和柱内径比为25:1-50:1；

所述步骤a）阴离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤b）阳离子交换柱层析的载体为Sepharose，所述步骤c）凝胶过滤层析的介质为Superdex 75；

所述步骤a）中洗脱用pH9.4的所述碳酸氢铵缓冲溶液洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为10mM碳酸氢铵，溶剂为水，用氨水调pH；

所述步骤b）中所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为5.0，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为4.1mM柠檬酸和5.9mM柠檬酸钠，溶剂为水；

所述步骤c）中所述得到具有蛋白酶活性的洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的：pH值为8.5的0.2M的NH₄HCO₃水溶液；

所述步骤c）所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30:1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶为丝氨酸族蛋白酶。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶在如下条件下酶的活力最高：pH值为12-12.5、温度为55-65℃。

4.由权利要求1-3中任一所述的制备方法得到的提取物。

5.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于：所述提取物的分子量为31KD且N末端序列见序列表序列1；所述提取物为丝氨酸族蛋白酶；所述提取物在如下条件下酶的活力最高：pH值为12-12.5、温度为55-65℃。

6.权利要求4或5所述的提取物在制备下述任一产品中的应用：

A）抑制HIV-1反转录酶活性的产品；

B）改善艾滋病患者健康状况的产品。