JP2006056982A - 親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲル、キラリティー分離用ゲル、ゲルを用いた分析システムおよびゲルを用いた分析方法 - Google Patents
親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲル、キラリティー分離用ゲル、ゲルを用いた分析システムおよびゲルを用いた分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 親水性／疎水性またはキラリティーによる分析を容易にかつ簡便に行うことができる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルまたはキラリティー分離用ゲルを提供する。
【解決手段】 一般式
【化２７】
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを得る。
【選択図】 図２
【解決手段】 一般式
【化２７】
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを得る。
【選択図】 図２
Description
この発明は、親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲル、キラリティー分離用ゲル、ゲルを用いた分析システムおよびゲルを用いた分析方法に関し、例えば、タンパク質、核酸、多糖類、アミノ酸、糖、脂質、薬物、抗生物質等の各種化合物の分析に適用して好適なものである。
従来、ゲルを用いた分析方法としては、ゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー（gel permeation chromatography,ＧＰＣ）等が知られている。これらの分析方法は、ゲルの３次元網目構造のメッシュサイズを利用し、互いに大きさ（分子量）が異なる分子をその大きさによって分離するものである。例えば、水溶性タンパク質、ＤＮＡ等の生体分子の分離に広く用いられているゲル電気泳動では、ゲルとして通常、ポリアクリルアミドゲルが用いられ、試料液中の分子の電荷密度の制御のために硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を系に添加して電気泳動を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Laemmli 法とも呼ばれる) が知られている（非特許文献１）。このゲル電気泳動の様子を図９に示す。図９に示すように、２枚の平板１０１、１０２の間にゲル１０３を詰め、陽極１０４と陰極１０５との間に電圧を印加して電気泳動を行い、互いに大きさが異なる分子１０６と分子１０７との移動速度が異なることを利用して分析を行う。
Laemmli, UK., Nature 227:680(1970)
Laemmli, UK., Nature 227:680(1970)
なお、特許文献１および非特許文献２〜４には、この発明による親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルおよびキラリティー分離用ゲルとほぼ同組成のゲル状発色組成物およびその合成方法が開示されている。
特開平１−１５８０１１号公報
Kouichi Naitoh, Yasuo Ishii, Kaoru Tsujii, J. Phys. Chem, 1991, 95, 7915-7918
Masaki Hayakawa, Tomohiro Onda, Toyoichi Tanaka, Kaoru Tsujii, Langmuir, 1997, 13, 3595-3597
Kaoru Tsujii, Masaki Hayakawa, Tomohiro Onda, Toyoichi Tanaka, Macromolecules, 1997, 30, 7397-7402
しかしながら、上述の従来のゲルを用いた分析方法では、大きさ以外の分子の特性、例えば親水性／疎水性、キラリティー等による分析を行うことはできなかった。
そこで、この発明が解決しようとする課題は、親水性／疎水性による分析を容易にかつ簡便に行うことができる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルならびにこれを用いた分析システムおよび分析方法を提供することである。
この発明が解決しようとする他の課題は、キラリティーによる分析を容易にかつ簡便に行うことができるキラリティー分離用ゲルならびにこれを用いた分析システムおよび分析方法を提供することである。
そこで、この発明が解決しようとする課題は、親水性／疎水性による分析を容易にかつ簡便に行うことができる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルならびにこれを用いた分析システムおよび分析方法を提供することである。
この発明が解決しようとする他の課題は、キラリティーによる分析を容易にかつ簡便に行うことができるキラリティー分離用ゲルならびにこれを用いた分析システムおよび分析方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、上記の特許文献１に開示されたゲル状発色組成物とほぼ同組成のゲルにおいて、化合物が親水性であるか疎水性であるかによって移動速度が互いに異なり、あるいは、化合物のキラリティーの相違により移動速度が互いに異なり、従って親水性／疎水性あるいはキラリティーにより化合物の分析を行うことができることを発見し、この発明を案出するに至ったものである。
すなわち、第１の発明は、
一般式
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルである。
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルである。
第２の発明は、
一般式
または
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルである。
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルである。
第３の発明は、
ゲルを用いた分析システムにおいて、
一般式
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
ゲルを用いた分析システムにおいて、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
第４の発明は、
ゲルを用いた分析システムにおいて、
一般式
または
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
ゲルを用いた分析システムにおいて、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
第５の発明は、
ゲルを用いた分析方法において、
一般式
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
ゲルを用いた分析方法において、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
第６の発明は、
ゲルを用いた分析方法において、
一般式
または
（式中、Ｒは炭素数８〜２４の炭化水素基または炭素数８〜２４の炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換したものを示す）
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
ゲルを用いた分析方法において、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルを用いることを特徴とするものである。
第１〜第６の発明の一般式中、Ｒとしては飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖の炭素数８〜２４の炭化水素基が挙げられるが、直鎖炭化水素基の好ましい例としてはラウリル基、ステアリル基、テトラデシル基等が挙げられ、分岐鎖炭化水素基の好ましい例としては、２−ヘキシルデシル基、２−デシルテトラデシル基、メチル分岐イソステアリル基等が挙げられる。また、炭化水素基の水素の一部をフッ素で置換した基の好ましい例としては１Ｈ，１Ｈ，１１Ｈ−エイコサフルオロウンデシル基、ヘプタフルオロデシル基、２−ペンタフルオロエチルペンタフルオロヘキシル基等が挙げられる。
イオン性界面活性剤はアニオン性、カチオン性いずれでもよく特に制限はないが、アニオン性界面活性剤の具体例としては、硫酸ドデシルナトリウム、ｎ−ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、アルケニルコハク酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸カリウム等が挙げられ、カチオン性界面活性剤の具体例としては、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルピリジニウム等が挙げられる。
さらに、有機アミン類としては、例えば、モノ、ジ、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン等が挙げられる。
水溶性ビニルモノマーとしては、アクリルアミド、Ｎ−アセトアミドアクリルアミド、アクリル酸−２−ヒドロキシエチル等が挙げられ、架橋剤としては、メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコール、ジアクリレート等が挙げられる。
さらに、有機アミン類としては、例えば、モノ、ジ、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン等が挙げられる。
水溶性ビニルモノマーとしては、アクリルアミド、Ｎ−アセトアミドアクリルアミド、アクリル酸−２−ヒドロキシエチル等が挙げられ、架橋剤としては、メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコール、ジアクリレート等が挙げられる。
この発明による親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルおよびキラリティー分離用ゲルは、上記のイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより合成される。
ラジカル重合の開始方法については特に制限はなく、紫外線照射やアゾビスイソブチロニトリル、過酸化水素、過硫酸カリウム等の開始剤を用い、光または熱分解により重合を開始すればよい。重合反応は、例えば紫外線照射の場合５〜３０分程度で終了し、この発明による親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルおよびキラリティー分離用ゲルが得られる。
なお、この発明において使用されるイタコン酸ジエステルは、例えば、下記の反応式で示されるような２段階の反応で容易に合成される。
この発明による親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルおよびキラリティー分離用ゲルは、例えば塩化ナトリウム等の濃厚塩水溶液中に浸漬したり、低温、例えば−２０℃程度に冷却したり、比較的高温、例えば８０℃程度に加熱したりしても特に変化せず、非常に安定である。この安定性は、ゲル中においてイタコン酸ジエステルとイオン性界面活性剤および／または有機アミンとが形成するラメラ構造またはラメラ液晶が重合により固定化されているためであると考えられる。
第３〜第６の発明において、ゲルを用いた分析には、ゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）等が含まれる。
第３〜第６の発明において、ゲルを用いた分析には、ゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）等が含まれる。
この発明による親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルまたはキラリティー分離用ゲルを用いてゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー等による分析を行うことにより、親水性化合物と疎水性化合物とを容易にかつ簡便に分離することができ、あるいは、互いにキラリティーが異なる化合物を容易にかつ簡便に分離することができ、これによってタンパク質、核酸、多糖類、アミノ酸、糖、脂質、薬物、抗生物質等の各種の化合物の分析を行うことができる。
以下、この発明の一実施形態について図面を参照しながら説明する。
まず、この発明の一実施形態による親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルおよびキラリティー分離用ゲルの合成方法について説明する。以下においては、親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを２分子膜固定化ゲル、キラリティー分離用ゲルをキラル２分子膜固定化ゲルと呼ぶ。
下記反応式に示すように、ドデカノールとイタコン酸無水物とを１１５℃で反応させ、ドデシルイタコン酸を得る。
まず、この発明の一実施形態による親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルおよびキラリティー分離用ゲルの合成方法について説明する。以下においては、親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを２分子膜固定化ゲル、キラリティー分離用ゲルをキラル２分子膜固定化ゲルと呼ぶ。
下記反応式に示すように、ドデカノールとイタコン酸無水物とを１１５℃で反応させ、ドデシルイタコン酸を得る。
次に、下記反応式に示すように、こうして得られたドデシルイタコン酸とグリシドールとをパラトルエンスルホン酸のピリジン塩触媒の存在下１００〜１０５℃で反応させ、重合性界面活性剤であるイタコン酸ｎ−ドデシル＝グリセリル（ＤＧＩ；ｎ−Ｃ12Ｈ25ＯＣＯＣＨ2 Ｃ（＝ＣＨ2 ）ＣＯＯＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2 −ＯＨ）を得る。
図１に示すように、こうして得られたイタコン酸ｎ−ドデシル＝グリセリルを水中に入れると２分子膜１１が規則的に形成され、その規則的配列により可視光が回折されることで発色する。２分子膜１１の各分子膜を構成するイタコン酸ｎ−ドデシル＝グリセリル分子は親水部と長い炭化水素鎖からなる疎水部とからなり、各分子膜の疎水部側が互いに対向している。
次に、図２に示すように、この発色溶液に、アクリルアミドと架橋剤であるメチレンビスアクリルアミドと重合開始剤であるイルガキュア（Irgacure）２９５９とを共存させ、高圧水銀ランプによる紫外線を用いて光重合を行い、生成したゲル１２中に発色構造、すなわち２分子膜１１を固定化し、２分子膜固定化ゲルを合成する。
こうして得られた２分子膜固定化ゲルをゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー等の基材として用いて分析を行う。
こうして得られた２分子膜固定化ゲルをゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー等の基材として用いて分析を行う。
２分子膜固定化ゲルを作製するための、重合性界面活性剤であるイタコン酸ｎ−ドデシル＝グリセリル（ＤＧＩ）は、上記の非特許文献２〜４に従って次のように合成した。
まず、ドデカノール０．４３モルをイタコン酸無水物０．４４モルと、１１５℃で１時間反応させ、ドデシルイタコン酸を得た。さらに、このドデシルイタコン酸をシリカゲルカラム(Wakosil C-200,Wako)で精製し、減圧濃縮した。カラム溶媒としてヘキサン：アセトン＝1 : 1 （重量比）を使用した。
次に、ドデシルイタコン酸０．０１７モルに脱水トルエン１０ｍｌ、グリシドール０．０５１モル、パラトルエンスルホン酸のピリジン塩３９．７μモルを触媒として加え、撹拌しながら１００〜１０５℃で５時間反応させた。
まず、ドデカノール０．４３モルをイタコン酸無水物０．４４モルと、１１５℃で１時間反応させ、ドデシルイタコン酸を得た。さらに、このドデシルイタコン酸をシリカゲルカラム(Wakosil C-200,Wako)で精製し、減圧濃縮した。カラム溶媒としてヘキサン：アセトン＝1 : 1 （重量比）を使用した。
次に、ドデシルイタコン酸０．０１７モルに脱水トルエン１０ｍｌ、グリシドール０．０５１モル、パラトルエンスルホン酸のピリジン塩３９．７μモルを触媒として加え、撹拌しながら１００〜１０５℃で５時間反応させた。
反応後、減圧濃縮によりトルエンを除去した。さらに、これをシリカゲルカラムを使って精製した。溶媒としてヘキサン：酢酸エチル＝４: 6 （重量比）を使った。その後、減圧濃縮を行い、ヘキサン、酢酸エチルを除去して真空乾燥させてＤＧＩを得た。
ゲル電気泳動に用いる２分子膜固定化ゲルは、以下のように作製した。アクリルアミドを１２重量％、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）を０．０８重量％、Ｔｒｉｓ緩衝液を４．５重量％、ＤＧＩを１．９重量％、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）をＤＧＩの０．５モル％（ＤＧＩが規則的な２分子膜構造を形成するために微量のイオン性界面活性剤が必要) 、光重合開始剤としてイルガキュア２９５９を微量添加し混合したもの（水の含有量は８１．２重量％）を、アルゴンを通して脱気した後、５０〜５５℃の温浴に４時間置いて、規則的な２分子膜構造（ラメラ構造またはラメラ液晶）を得た。次に、この溶液に超音波照射（１５分、２０ｋＨｚ）して溶液を均一にした。その後、このモノマー溶液を２枚の石英板（８．０×８．４ｃｍ、間隔１ｍｍ）の間に注ぎ、高圧水銀ランプ（５００Ｗ、３６５ｎｍ）を使って紫外線（ＵＶ）を１０分照射（ＵＶ装置一式：SEN LIGHTS Corporation）して重合させて、ゲル電気泳動に使用する２分子膜固定化ゲルを得た。
図３に、こうして得られた２分子膜固定化ゲルの走査型電子顕微鏡写真を示す。同図より、２分子膜が規則的に配列しているのが良く分かる。
ゲル電気泳動に用いる２分子膜固定化ゲルは、以下のように作製した。アクリルアミドを１２重量％、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）を０．０８重量％、Ｔｒｉｓ緩衝液を４．５重量％、ＤＧＩを１．９重量％、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）をＤＧＩの０．５モル％（ＤＧＩが規則的な２分子膜構造を形成するために微量のイオン性界面活性剤が必要) 、光重合開始剤としてイルガキュア２９５９を微量添加し混合したもの（水の含有量は８１．２重量％）を、アルゴンを通して脱気した後、５０〜５５℃の温浴に４時間置いて、規則的な２分子膜構造（ラメラ構造またはラメラ液晶）を得た。次に、この溶液に超音波照射（１５分、２０ｋＨｚ）して溶液を均一にした。その後、このモノマー溶液を２枚の石英板（８．０×８．４ｃｍ、間隔１ｍｍ）の間に注ぎ、高圧水銀ランプ（５００Ｗ、３６５ｎｍ）を使って紫外線（ＵＶ）を１０分照射（ＵＶ装置一式：SEN LIGHTS Corporation）して重合させて、ゲル電気泳動に使用する２分子膜固定化ゲルを得た。
図３に、こうして得られた２分子膜固定化ゲルの走査型電子顕微鏡写真を示す。同図より、２分子膜が規則的に配列しているのが良く分かる。
こうして得られた２分子膜固定化ゲルを使用し、以下の条件でゲル電気泳動を行った。ゲル電気泳動装置は、市販のBIO CRAFT 社製, BE-230型を使用した。電気泳動は定電圧（約１５０Ｖ）で行い、ランニングバッファーとして、Ｔｒｉｓ０．３％、グリシン０．１４６％のものを使用した。
３種類の色素にゲル電気泳動分析を適用した。使用した色素サンプルはBromphenol Blue （ＢＰＢ）（青、Ｃ19Ｈ10Ｏ5 Ｂｒ4 Ｓ、分子量６６９．９７）
と、Disodium Fluorescein（黄色、Ｃ20Ｈ10Ｏ5 Ｎａ2 ・２Ｈ2 Ｏ、分子量４１２．３１）
と、Sulforhodamine 640（ピンク、Ｃ31Ｈ30Ｎ2 Ｏ7 Ｓ2 、分子量６０６．７２）
である。サンプルを作製するバッファーは、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５ｍｌとスクロース１ｇとを混合して希釈し全量２０ｍｌにして、それぞれの色素を０．０４％になるように添加した。また、電気泳動は１レーンにつき２０μｌずつ重層した。
図４に電気泳動を開始してから３０分経過後および７５分経過後の分析結果を示す。
３種類の色素にゲル電気泳動分析を適用した。使用した色素サンプルはBromphenol Blue （ＢＰＢ）（青、Ｃ19Ｈ10Ｏ5 Ｂｒ4 Ｓ、分子量６６９．９７）
図４に電気泳動を開始してから３０分経過後および７５分経過後の分析結果を示す。
比較例１として、２分子膜を含まない、通常のゲル電気泳動を行うためのゲルを次のように作製した。アクリルアミドを１．８ｇ、架橋剤としてＢＩＳを１２ｍｇ、１．５ＭのＴｒｉｓをＨＣｌでｐＨ８．８に調節した緩衝液を３．７５ｍｌ、ＳＤＳを１５ｍｇ、重合開始剤として１０％ＡＰＳを６０μｌ、重合促進剤としてＴＥＭＥＤを２０μｌ混合して全量を１５ｍｌにしてモノマー溶液を作製した。このモノマー溶液を、２枚の石英板（８．０×８．４ｃｍ、間隔１ｍｍ）の間に注ぎ、室温でゲルが固まるまで約１時間放置して重合させ、ゲル電気泳動に使用する通常のゲルを得た。
こうして得られたゲルを使用して、以下の条件でゲル電気泳動を行った。ゲル電気泳動装置は、市販のBIO CRAFT 社製, BE-230型を使用した。電気泳動は定電圧（約１５０Ｖ）で行い、ランニングバッファとして、Ｔｒｉｓ０．３％、グリシン０．１４６％、ＳＤＳ０．１％を使用した。
実施例１と同様な３種類の色素にゲル電気泳動分析を適用した。
図５に電気泳動を開始してから３０分経過後および７５分経過後の分析結果を示す。
こうして得られたゲルを使用して、以下の条件でゲル電気泳動を行った。ゲル電気泳動装置は、市販のBIO CRAFT 社製, BE-230型を使用した。電気泳動は定電圧（約１５０Ｖ）で行い、ランニングバッファとして、Ｔｒｉｓ０．３％、グリシン０．１４６％、ＳＤＳ０．１％を使用した。
実施例１と同様な３種類の色素にゲル電気泳動分析を適用した。
図５に電気泳動を開始してから３０分経過後および７５分経過後の分析結果を示す。
図５より、比較例１で分析された色素は、アクリルアミドゲル中をDisodium Fluorescein、Sulforhodamine 640、Bromphenol Blue の順、すなわち分子量の小さい順に速く流れていくことが分かる。これに対し、図４より、２分子膜固定化ゲルを用いた実施例１の結果は、Disodium Fluorescein、Bromphenol Blue 、Sulforhodamine 640の順に速く流れており、比較例１の結果とは一致しない。また、実施例１の結果は、比較例１におけるアクリルアミドゲル電気泳動と比較して、分離のされ方が顕著であり分離能が高いことは明らかである。これらの結果は、従来のゲル電気泳動分析法では、分子の大きさあるいは分子量による分離のみが可能であったのに比較して、この２分子膜固定化ゲルを用いたゲル電気泳動分析法では、分子の親水性／疎水性という特性によって分離ができることを示している。具体的には、この場合、Disodium Fluorescein、Bromphenol Blue 、Sulforhodamine 640の順に親水性が高いと考えられる。
キラル２分子膜固定化ゲルを作製するための、キラル重合性界面活性剤である（Ｒ）−（＋）−イタコン酸ｎ−ドデシル＝グリセリル（（Ｒ）−（＋）−ＤＧＩ）
および（Ｓ）−（−）−イタコン酸ｎ−ドデシル＝グリセリル（（Ｓ）−（−）−ＤＧＩ）
は、次のように合成した。
まず、ドデカノール０．４３モルをイタコン酸無水物０．４４モルと、１１５℃で１時間反応させ、粗ドデシルイタコン酸を得た。さらに、このドデシルイタコン酸をシリカゲルカラム(Wakosil C-200,Wako)で精製し、減圧濃縮した。カラム溶媒としてヘキサン：アセトン＝1 : 1 （重量比）を使用した。
次に、ドデシルイタコン酸０．０１７モルに脱水トルエン１０ｍｌ、光学活性体である（Ｒ）−（＋）−グリシドールまたは（Ｓ）−（−）−グリシドール０．０５１モル、パラトルエンスルホン酸のピリジン塩３９．７μモルを触媒として加え、撹拌しながら１００〜１０５℃で５時間反応させた。
次に、ドデシルイタコン酸０．０１７モルに脱水トルエン１０ｍｌ、光学活性体である（Ｒ）−（＋）−グリシドールまたは（Ｓ）−（−）−グリシドール０．０５１モル、パラトルエンスルホン酸のピリジン塩３９．７μモルを触媒として加え、撹拌しながら１００〜１０５℃で５時間反応させた。
反応後、上記２種の反応液の各々より、減圧濃縮によりトルエンを除去した。さらに、これをシリカゲルカラムを使って精製した。溶媒としてヘキサン：酢酸エチル＝４: 6 （重量比）を使った。その後、減圧濃縮を行い、ヘキサン、酢酸エチルを除去して真空乾燥させてキラルＤＧＩ（（Ｒ）−（＋）−ＤＧＩおよび（Ｓ）−（−）−ＤＧＩ）を得た。
ゲル電気泳動に用いるキラル２分子膜固定化ゲルは、以下のように作製した。アクリルアミドを７００ｍＭ、架橋剤としてＢＩＳを１０ｍＭ、ＤＧＩを１．０〜３．０重量％、ＳＤＳをＤＧＩの０．５モル％、光重合開始剤としてイルガキュア２９５９または過酸化水素水を微量添加し混合したものを、アルゴンを通して脱気した後、５５℃の温浴に５時間置いて、規則的な２分子膜構造を得た。その後、このモノマー溶液を、高圧水銀ランプ（５００Ｗ、３６５ｎｍ）を使って紫外線を２０分照射（ＵＶ装置一式：ウシオ電機株式会社）して重合させて、ゲル電気泳動に使用するキラル２分子膜固定化ゲルを得た。
ゲル電気泳動に用いるキラル２分子膜固定化ゲルは、以下のように作製した。アクリルアミドを７００ｍＭ、架橋剤としてＢＩＳを１０ｍＭ、ＤＧＩを１．０〜３．０重量％、ＳＤＳをＤＧＩの０．５モル％、光重合開始剤としてイルガキュア２９５９または過酸化水素水を微量添加し混合したものを、アルゴンを通して脱気した後、５５℃の温浴に５時間置いて、規則的な２分子膜構造を得た。その後、このモノマー溶液を、高圧水銀ランプ（５００Ｗ、３６５ｎｍ）を使って紫外線を２０分照射（ＵＶ装置一式：ウシオ電機株式会社）して重合させて、ゲル電気泳動に使用するキラル２分子膜固定化ゲルを得た。
比較例としてのラセミ体であるＤＧＩ溶液（図６）と、キラルＤＧＩ溶液（図７）とでは、同濃度において色の違いが観察された。すなわち、１．８重量％ＤＧＩ溶液において、ラセミ体の場合は青色であるのに対して、キラル体の場合は緑色を示した。この結果は、キラル体の場合、ラセミ体より二分子膜を形成している分子間距離が狭い、つまり密に二分子膜形成分子（ＤＧＩ）が並んでいることによると考えられる。
以上のように、この一実施形態による２分子膜固定化ゲルを基材としてゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー等により分析を行うことにより、分子の大きさに加えて親水性／疎水性により分析を行うことができる。このため、例えば、従来のゲル電気泳動分析では分析できなかった、水に不溶性または難溶性の生体分子、例えば膜タンパク質の分析を行うことが可能となる。また、キラル２分子膜固定化ゲルを基材としてゲル電気泳動、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー等により分析を行うことにより、分子のキラリティー、すなわち光学活性による分析が可能となる。そして、これらの分析方法により、タンパク質、核酸、多糖類、アミノ酸、糖、脂質、薬物、抗生物質等の各種の化合物の分析を行うことができる。
これらの２分子膜固定化ゲルおよびキラル２分子膜固定化ゲルを用いた分析方法は各種用途に利用することができる。すなわち、ゲル電気泳動では、血液検査、生化学分析、家庭用診断キット、ゲノム解析等に利用することができる。ゲル浸透クロマトグラフィーでは、合成高分子分析、生体高分子分析等に利用することができる。ゲル濾過では、食品中のタンパク質の分析、香料のキラリティーによる分析に利用することができる。
ここで、２分子膜固定化ゲル中を水に不溶性の膜タンパク質が移動する機構は現在解明中であるが、考えられる一つのモデルを図８に示す。図８に示すように、２分子膜固定化ゲル中の２分子膜に膜タンパク質分子の疎水部が埋め込まれ、その状態を保ちながら２分子膜中を移動するものと考えられる。言い換えると、膜タンパク質分子はいわば２分子膜に溶けて移動するものと考えられる。
以上、この発明の実施形態および実施例について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施形態および実施例に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施形態および実施例において挙げた数値、プロセス等はあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、プロセス等を用いてもよい。
例えば、上述の実施形態および実施例において挙げた数値、プロセス等はあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、プロセス等を用いてもよい。
１１…２分子膜、１２…ゲル
Claims (6)
- 一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲル。 - 一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲル。 - ゲルを用いた分析システムにおいて、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを用いることを特徴とする、ゲルを用いた分析システム。 - ゲルを用いた分析システムにおいて、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルを用いることを特徴とする、ゲルを用いた分析システム。 - ゲルを用いた分析方法において、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られる親水性化合物／疎水性化合物分離用ゲルを用いることを特徴とする、ゲルを用いた分析方法。 - ゲルを用いた分析方法において、
一般式
で表されるイタコン酸ジエステルを０．５〜２０重量％、イオン性界面活性剤および／または有機アミンを０．００５〜０．２重量％、水溶性ビニルモノマーを０．５〜３０重量％、架橋剤を０．０５〜５重量％含有する水溶液において、ラジカル重合を行うことにより得られるキラリティー分離用ゲルを用いることを特徴とする、ゲルを用いた分析方法。
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|---|---|---|---|---|
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| US8173848B2 (en) | 2008-07-01 | 2012-05-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Fluorinated alcohols |
| US8263800B2 (en) | 2008-07-01 | 2012-09-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Partially fluorinated sulfonated surfactants |
| WO2019181602A1 (ja) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 光応答性高分子化合物、接着剤、光応答体、および光応答性高分子化合物の製造方法 |
-
2004
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