JP2006006330A - 腫瘍の治療のための組成物と方法 - Google Patents

腫瘍の治療のための組成物と方法 Download PDF

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Abstract

【課題】腫瘍細胞のゲノムにおいて、同じ組織型の正常細胞に比べて遺伝子産物を過剰発現する遺伝子は、腫瘍形成の一因であると予想される。従って、増幅遺伝子によってコードされているタンパク質は、ある癌の診断及び／治療（予防を含む）にとって有用な標的であると考えられ、腫瘍治療の予後の予測指標となりうるので、ヒトを含む哺乳類における腫瘍性細胞の成長及び増殖の診断と治療についての組成物及び方法を提供する。
【解決手段】腫瘍細胞のゲノムにおいて、同じ組織型の正常細胞に比べて過剰発現される、新規ポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子。また、これらの核酸分子、異種ポリペプチド配列へ融合している該ポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド、該ポリペプチドと結合する抗体を含んでなるベクター及び宿主細胞、そして該ポリペプチドを生産する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、腫瘍の診断及び治療のための組成物及び方法に関する。
悪性腫瘍（癌）は、米国特許において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である（Boring等, CA Cancel J. Clin., 43: 7 [1993]）。
癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍実体を形成する異常な、又は腫瘍形成性の細胞数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節及び離間部位に拡散（転移）する悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
遺伝子発現の交互変化は制御不能な細胞成長及び脱分化に強く関連しており、全ての癌に共通する特徴である。或る種の良く研究されたゲノムが、通常は腫瘍抑制遺伝子と呼ばれ、正常には悪性細胞成長又は或る種の優性遺伝子、例えば悪性成長を促進するように作用するオンコジーンの過剰発現を防止するように作用する劣性遺伝子発現の現象を示すことが見出された。これらの遺伝子変化は、凝集して十分な腫瘍形成性フェノタイプを示す形質の幾つかが移入される原因であることが明らかとなった（Hunter, Cell 64: 1129 [1991]; Bishop, Cell 64: 235-248 [1991]）。
癌細胞における良く知られた遺伝子(例えばオンコジーン）の過剰発現のメカニズムは遺伝子増幅である。これは、祖先細胞の染色体において特定遺伝子の多重コピーが生成されるプロセスである。このプロセスは、遺伝子を含む染色体の領域の計画性のない複製、次いで複製されたセグメントが染色体へ戻る再組換えを含む（Alitalo等, Adv. Cancer Res. 47: 235-281 [1986]）。遺伝子増幅に平行する遺伝子の過剰発現は、即ち作成されるコピーの数に比例すると考えられている。
成長因子及び成長因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、乳癌を含む様々なヒトの悪性腫瘍の原因に重要な役割を担っていることが確認されている。例えば、表皮成長因子レセプター(ＥＧＦＲ)に関連した１８５-ｋｄの膜貫通糖タンパク質レセプター(ｐ１８５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２）をコードするヒトＥｒｂＢ２遺伝子(ｅｒｂＢ２、ｈｅｒ２としても知られている、又はｃ-ｅｒｂＢ-２)は、ヒトの乳癌の約２５％〜３０％で過剰発現されていることが見出されている(Slamon等, Science 235:177-182[1987]；Slamon等, Science 244:707-712[1989])。
プロトオンコジーンの遺伝子増幅は、典型的には癌のより悪性の形態に含まれる事象であり、臨床的結果の予言者として作用しうることが報告されている（Schwab等, Genes Chromosomes Cancer 1, 181-193 [1990]; Alitalo等, 上掲）。即ち、ｅｒｂＢ２の過剰発現は、特に腋窩のリンパ節を含む一次疾患を持つ患者において、不完全な予後の前兆と共通して見なされており（Slamon等, [1987]及び[1989], 上掲; Ravdin及びChamness, Gene 159: 19-27 [1995]; 及びHynes及びStern, Biochem Biophys Acta 1198: 165-184 [1994]）、ホルモン療法及びＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキセート、及びフルオロウラシル）を含む化学治療薬に対する感受性又は耐性と関連付けられていた（Baselga等, Oncology 11 (3 Suppl 1): 43-48 [1997]）。しかしながら、ｅｒｂＢ２過剰発現と不完全な予後との関連にも関わらず、ＨＥＲ２-ポジティブな患者のタキサンでの処理に臨床的に反応する可能性は、ＨＥＲ２-ネガティブ患者の３倍も大きかった（上掲）。組換えヒト化抗ＥｒｂＢ２(抗ＨＥＲ２）モノクローナル抗体(マウス抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化型、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２又はHerceptin(商品名)と呼ばれる）は、広範な従来の抗癌治療を受けたＥｒｂＢ２を過剰発現する転移性乳癌を持つ患者で臨床的に活性である(Baselga等, J. Clin. Oncol. 14: 737-744[1996]）。
上記に照らして、遺伝子増幅に関連する腫瘍の診断及び治療に有用な新規な方法及び組成物を同定することに明らかな興味がある。
（発明の概要）
１．実施態様
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における腫瘍細胞成長及び増殖の診断及び治療のための組成物及び方法に関する。本発明は、腫瘍細胞のゲノムにおいて増幅される遺伝子の同定に基づく。このような遺伝子増幅は、遺伝子産物の過剰発現を伴い、腫瘍形成に寄与すると予測される。従って、増幅された遺伝子にコードされるタンパク質は、或る種の癌の診断及び治療（予防を含む）に有用であると考えられ、腫瘍治療の予後の予言者として作用する。
一実施態様では、本発明は、ここでＰＲＯポリペプチドと命名されるポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。一側面では、単離された抗体は、ＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する。他の側面では、抗体はＰＲＯポリペプチドを発現する細胞の死を誘導する。多くの場合、ＰＲＯポリペプチドを発現する細胞は、当該ポリペプチドを同じ組織型の正常細胞に比較して過剰に発現する腫瘍細胞である。さらに他の側面では、抗体はモノクローナル抗体であり、それは好ましくは非ヒトの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を有する。抗体はラベル化されてもよいし、固体支持体へ固定されてもよい。さらに他の側面では、抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又はヒト化抗体であって、好ましくはＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する。
他の実施態様では、本発明は、製薬的に許容される担体と混合された、好ましくはＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体とを含む物質の組成物に関する。一側面では、この物質の組成物は抗体の治療的有効量を含有する。他の側面では、この組成物は、例えば更なる抗体又は細胞毒性又は化学治療薬であってよい更なる活性成分を含む。好ましくは、この組成物は無菌である。
さらなる実施態様では、本発明は、抗ＰＲＯ抗体をコードする単離された核酸分子、及びそのような核酸分子を含むベクター及び組換え宿主細胞に関する。
またさらなる実施態様では、本発明は抗ＰＲＯ１８７、抗ＰＲＯ５３３、抗ＰＲＯ２１４、抗ＰＲＯ２４０、抗ＰＲＯ抗体の製造方法に関し、当該方法は、その抗体をコードする核酸分子で形質転換した宿主細胞を当該抗体を発現させるのに十分な条件下で培養し、細胞培地から抗体を回収することを含んでなる。
さらに本発明は、ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能又は活性の一又は複数を阻害するＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストに関する。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はその相補鎖をコードする核酸配列にハイブリダイゼーションする単離された核酸分子に関する。単離された核酸分子は、好ましくはＤＮＡであり、ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる。このような核酸分子は、ここで同定される増幅された遺伝子のアンチセンス分子として作用でき、また翻って各増幅遺伝子の転写及び／又は翻訳の調節において、又は増幅反応におけるアンチセンスプライマーとしての用途が見出される。さらに、このような配列は、リボザイム(ribozyme)及び／又は三重螺旋配列の一部として使用することができ、それは翻って増幅遺伝子の調節に置いて使用してもよい。
他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドを含有すると推測される試料中でＰＲＯポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、当該方法は、当該試料を抗ＰＲＯ抗体に暴露し、当該抗体の試料中のＰＲＯポリペプチドへの結合を測定することを含んでなる。他の実施態様では、本発明は、細胞中でのＰＲＯポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、当該方法は、当該細胞を抗ＰＲＯ抗体に曝露し、抗体の細胞への結合を測定することを含む。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物において腫瘍を診断する方法に関し、（ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料中、及び（ｂ）同じ細胞型の知られた正常組織細胞の対照試料中におけるＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、対照試料に比較した試験試料における高いレベルが、当該試験組織細胞を得た哺乳動物における腫瘍の存在を示す。
他の実施態様では、本発明は、哺乳動物において腫瘍を診断する方法に関し、（ａ）抗ＰＲＯ抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料と接触させ、そして（ｂ）抗ＰＲＯ抗体と試験試料中のＰＲＯポリペプチドとの間の複合体の形成を検出することを含んでなり、複合体の形成が前記哺乳動物における腫瘍の存在を示す。測定は定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の知られた正常組織細胞の対照試料における複合体形成の監視と比較して実施してもよい。試験試料中の複合体形成量の増加が、試験試料を得た哺乳動物における腫瘍の存在を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を担持する。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又はこの分野で公知の他の技術によって監視できる。
試験試料は通常、腫瘍性細胞成長又は増殖（例えば癌性細胞）を有すると推測される個体から得る。
他の実施態様では、本発明は、抗ＰＲＯ抗体及び担体（例えば緩衝液）を適切な包装内に含んでなる癌診断用キットに関する。このキットは、好ましくは当該抗体が、ＰＲＯポリペプチドを含有することが推測される試料中のそれらの存在をを検出するために用いられるという説明書を具備する。
さらに他の実施態様では、本発明は腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関し、ＰＲＯポリペプチドを発現する腫瘍細胞を、ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性及び／又は発現を阻害する薬剤の有効量に暴露することを含んでなり、それにより当該腫瘍細胞の成長が阻害される。この薬剤は、好ましくは抗ＰＲＯ抗体、小さな有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、又は三重螺旋分子である。特別な態様では、薬剤、例えば抗ＰＲＯ抗体は細胞死を誘発する。さらなる態様では、腫瘍細胞には、放射線処理、細胞毒性薬又は化学治療薬がさらに施される。
さらなる実施態様では、本発明は、
容器；
当該容器上のラベル；及び
当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物とを具備し、当該組成物が腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効であり、容器上のラベルが当該組成物は前記腫瘍細胞中で同じ組織型の正常細胞に比較してＰＲＯポリペプチドの過剰発現を特徴とする状態の治療に有効であることを表示する製造品に関する。特別な側面では、組成物中の活性剤は、ＰＲＯポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する薬剤である。好ましい側面では、活性剤は抗ＰＲＯ抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
また本発明は、ＰＲＯポリペプチドの生物学的又は免疫学的活性を阻害する化合物を同定する方法を提供し、候補化合物をＰＲＯポリペプチドと、２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性が阻害されるか否かを測定することを含んでなる。他の態様では、非固定化成分が検出可能な標識を担持している。好ましい態様では、この方法は、（ａ）細胞とスクリーニングすべき候補化合物とを、ＰＲＯポリペプチドの存在下で、ＰＲＯポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ、そして（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して試験化合物が有効なアンタゴニストか否かを決定することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドを発現する細胞で前記ポリペプチドの発現を阻害する化合物を同定する方法を提供し、当該細胞を化合物と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含んでなる。好ましい側面では、この方法は、（ａ）細胞とスクリーニングすべき候補化合物とを、ＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で接触させ、（ｂ）前記ポリペプチド発現の阻害を測定する工程を具備する。
Ｂ．更なる実施態様
本発明の他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列、ここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインでシグナルペプチドを共なう又は共なわないもの、ここに開示した全長アミノ酸配列の任意の特異的に定義された断片、又は又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示した膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列でシグナルペプチドを共なう又は共なわないもの、又はここに開示した全長アミノ酸配列の任意の特異的に定義された断片のコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
さらなる側面では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣへ寄託された任意のヒトタンパク質ｃＤＮＡにコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
その他の側面では、本発明は、膜貫通ドメイン欠損或いは膜貫通ドメイン不活化のどちらか、又はそのようなコード化配列へ相補的なＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示されている。従って、ここにおいて記載されるＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮されている。
その他の実施態様では、例えば、抗ＰＲＯ抗体の結合部位を含むポリペプチドを選択的にコードするＰＲＯポリペプチドのコード化断片のためのハイブリダイゼーションプローブ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての使用を見出すことができるＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖について向けられている。そのような核酸断片は、通常少なくとも約２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、この文脈において「約」という語句は、引用されているヌクレオチド配列の長さのプラス又はマイナス１０％を意味してる。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規の断片は、任意の良く知られた配列アライメントプログラムを使用し、ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の既知のヌクレオチド配列を整列させ、どのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるのかを決定することによる日常的方法によって決定が可能であることは注目される。全てのそのようなＰＲＯポリペプチドコード化配列はが、本出願において検討される。さらに、検討されるのは、これらヌクレオチド配列断片によってコードされているＰＲＯポリペプチド、好ましくは抗ＰＲＯ抗体の結合部位を含むこれらＰＲＯポリペプチド断片である。
その他の実施態様では、本発明は、上文において特定された全ての単離された核酸配列によってコードされている単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
ある側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有する全長ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片に対して少なくとも約８０％配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の配列同一性、あるいは少なくとも約８２％配列同一性、あるいは少なくとも８３％の配列同一性、あるいは少なくとも８４％の配列同一性、あるいは少なくとも８５％の配列同一性、あるいは少なくとも８６％の配列同一性、あるいは少なくとも８７％の配列同一性、あるいは少なくとも８８％の配列同一性、あるいは少なくとも８９％の配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９１％の配列同一性、あるいは少なくとも９２％の配列同一性、あるいは少なくとも９３％の配列同一性、あるいは少なくとも９４％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性、あるいは少なくとも９６％の配列同一性、あるいは少なくとも９７％の配列同一性、あるいは少なくとも９８％の配列同一性、あるいは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されたＡＴＣＣへ寄託された全てのヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の配列同一性、あるいは少なくとも約８２％配列同一性、あるいは少なくとも８３％の配列同一性、あるいは少なくとも８４％の配列同一性、あるいは少なくとも８５％の配列同一性、あるいは少なくとも８６％の配列同一性、あるいは少なくとも８７％の配列同一性、あるいは少なくとも８８％の配列同一性、あるいは少なくとも８９％の配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９１％の配列同一性、あるいは少なくとも９２％の配列同一性、あるいは少なくとも９３％の配列同一性、あるいは少なくとも９４％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性、あるいは少なくとも９６％の配列同一性、あるいは少なくとも９７％の配列同一性、あるいは少なくとも９８％の配列同一性、あるいは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有するＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片と比較して、少なくとも約８０％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも約８１％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも約８２％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも８３％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも８４％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも８５％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも８６％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも８７％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも８８％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも８９％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９０％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９１％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９２％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９３％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９４％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９５％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９６％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９７％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９８％の陽性(ポジティブ）、あるいは少なくとも９９％の陽性(ポジティブ）のスコアのアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
特別な側面においては、本発明は、Ｎ−末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを含まず、前記に記載したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされている単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。ＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びＰＲＯポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたＰＲＯポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
その他の側面においては、本発明は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性の単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。ＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びＰＲＯポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたＰＲＯポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
さらなるその他の実施態様においては、ここにおいて開示される天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様においては、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様においては、ＰＲＯポリペプチドを候補化合物と接触せしめ、そして前記ＰＲＯポリペプチドによって仲介される生物活性を監視することを含むＰＲＯポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
さらにさらなる実施態様においては、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに開示されるＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、抗ＰＲＯ抗体を含んでなる製造品で容器との組合せに関する。場合によっては、容器は、製薬的に許容しうるものである。
本発明のその他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチドの使用、又はＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト或いは抗ＰＲＯ抗体に対して反応性のある条件の治療に有効な薬剤の調製のための前文に記載したようなＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗ＰＲＯ抗体を対象としている。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載する任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
「遺伝子増幅」及び「遺伝子複製」なる語句は交換可能に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で生成されるプロセスを意味する。複製された領域（増幅されたＤＮＡの伸展）は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療が必要なものは、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は直接的に腫瘍細胞の病理を低下させてもよいし、又は腫瘍細胞を他の治療媒介物、例えば放射線及び／又は化学治療に対してより敏感にしてもよい。
癌の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化などを含む。
治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の自己形成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。
一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
ここで用いられる「細胞毒性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第4,675,187号）、５−ＦＵ、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、ＶＰ−１６、クロランブシル、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１期停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１期停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
本出願で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物に比べて、腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、より活性な親形態に、酵素的に活性化又は転換され得る製薬的に活性な物質の先駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)及びStellaら,「Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」, Directed Drug Delivery, Borchardtら,(編), pp.247-267, Humana Press(1985)を参照。 限定するものではないが、本発明のプロドラッグには、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、前掲の化学療法剤が含まれる。
ここに開示されるポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」とは、腫瘍性細胞成長、腫瘍成長に関しては、標的細胞の成長を或る程度阻害できる量である。この用語は、標的細胞の成長阻害、細胞分裂停止及び／又は細胞毒性効果及び／又はアポトーシスを誘起することのできる量を含む。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
「治療的有効量」は、腫瘍の治療に関しては、次の効果：（１）遅延化及び完全な成長停止を含む、腫瘍成長の或る程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの縮小；（４）腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（５）転移の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（６）抗腫瘍免疫反応の促進、これは、腫瘍の退行又は拒絶をもたらしてもよいが、必ずしも必要ではない；及び／又は（７）疾患に伴う徴候の１つ又は複数の或る程度の軽減の１つ又は複数を誘起することのできる量を意味する。腫瘍の治療の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「治療的有効量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「成長阻害量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「細胞毒性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニストの「細胞毒性量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここの記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。
本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列ＰＲＯポリペプチドは、添付の図面に示されている全長アミノ酸配列を含んでなる成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、図面に太字及び下線部で示されている。添付されている図面に開示されているＰＲＯポリペプチドは、図面のアミノ酸位置１と命名されているメチオニン残基から開始することが示されているが、図面のアミノ酸位置１より上流又は下流のどちらかに位置する他のメチオニン残基がＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられてもよい。
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン及び／又は細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」のおおよその位置は、添付の図面に示されている。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
ここに定義されるＰＲＯポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて発生させ、ここでALIGN-2プログラムに対する完全なソースコードは以下の表１に提供される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社により作成され、以下の表１に示されたソースコードは、米国著作権庁、Washington D.C., 20559にユーザー資料と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社（South San Francisco, California）を通じて公的に利用でき、以下の表１に提供されるソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムはUNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。
この目的において、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する付与されたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性(別に、付与されたアミノ酸配列Ａが、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する所定の％アミノ酸配列を有するか、又はこれを含むものとしても呼称することができる)は、次の式：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列プログラムALIGN-2に同一符合するとスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性とは等しくないと認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の算出例としては、図２Ａ-２Ｂには、「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性の算出方法を示している。
特に記載しない場合は、ここで使用される全％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを使用して上述したようにして得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25：3389-3402(1997))を使用して決定することもできる。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードすることができる。NCBI-BLAST2はいくつかのサーチプログラムを使用しており、その全てのサーチパラメータは、例えばアンマスク＝yes、ストランド＝all、予測発生値＝１０、最低複雑長さ＝１５／５、マルチパス ｅ値＝０．０１、マルチパス定数＝２５、最終間隙アラインメントのドロップオフ＝２５、スコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含むデフォルト値に設定される。
アミノ酸配列比較においてNCBI-BLAST2が使用される状況では、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する付与されたアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性(別に、付与されたアミノ酸配列Ａが、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する所定の％アミノ酸配列を有するか、又はこれを含むものとしても呼称することができる)は、次の式：
フラクションＸ／Ｙの１００倍
により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列プログラムNCBI-BLAST2に同一符合するとスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性とは等しくないと認識されるであろう。
さらに、％アミノ酸配列同一性はWU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を使用して決定することもできる。殆どのWU-BLAST-2サーチパラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列（即ち、関心あるＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2で決定された一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）関心あるＰＲＯポリペプチドの残基の総数で割ることにより決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する又は有しているアミノ酸配Ａを含有するポリペプチド」という表示は、アミノ酸配列Ａが関心ある比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴う又は伴わないここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドの他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくあるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかしながら、ここにおける目的のために、パーセント(％)核酸配列同一性値は、下記に示されているように配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を使用することで得られ、ALIGN-2プログラムのための完全なソースコードは表１に提供されている。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下へ登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、表２Ｃ-２Ｄは、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化配列の核酸配列と、対象とする比較核酸分子（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の配列が比較される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、添付している図面に示す全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできる。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基を含む。対象とするアミノ酸残基に対してポジティブ値のスコアとされるアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の（下記の表３で特定するように）好ましい置換とされるものである。
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％ポジティブ値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによってポジティブであるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることは理解されるであろう。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。ＰＲＯＲの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
ＰＲＯポリペプチドをコードしている「単離された」核酸分子、又は抗ＰＲＯ抗体をコードしている「単離された」核酸分子は、同定され、ポリペプチド核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、天然に付随するすべての組成物が無いものである。単離されたＰＲＯコード化核酸分子又は抗ＰＲＯコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。従って、 単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯコード化核酸分子又は抗ＰＲＯコード化核酸分子とは区別される。しかし、ＰＲＯポリペプチドをコードしている単離された核酸分子、又は抗ＰＲＯ抗体をコードしている単離された核酸分子は、通常はＰＲＯポリペプチド又は抗ＰＲＯ抗体を発現する細胞に包含されているＰＲＯ核酸分子又は抗ＰＲＯ核酸分子を含み、その核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある。
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適な対照配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗ＰＲＯモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗ＰＲＯ抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。さらに、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明は、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃でのホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高いストリンジェントな洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェンシーより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
ここに開示されるスクリーニングアッセイによって同定できる抗体又は他のアンタゴニスト分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等）の文脈における「生物学的活性」は、それらの分子がここに同定される増幅された遺伝子にコードされるペプチドと結合又は複合体形成する能力、又はコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を妨害する能力、又はＰＲＯポリペプチドの転写又は翻訳を妨害する能力を指す。好ましい生物学的活性は、標的細胞の成長阻害である。他の好ましい生物学的活性は、標的腫瘍細胞の死をもたらす細胞毒性活性である。
ＰＲＯポリペプチドの文脈における「生物学的活性」という用語は、ＰＲＯポリペプチドが腫瘍形成細胞成長又は制御されない細胞成長を誘発する能力を意味する。
「免疫学的活性」という語は、ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１つのエピトープとの免疫学的交差反応性を意味する。
ここで用いられる「免疫学的交差反応性」とは、候補ポリペプチドが、この活性を持つＰＲＯポリペプチドの定性的生物学的活性を、周知の活性ＰＲＯポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗血清と競合的に阻害できることを意味する。そのような抗血清は、例えばヤギ又はウサギに、完全フロイントアジュバント中の周知の活性類似物を皮下注射し、次いで不完全フロイント中で腹膜内又は皮下に追加免疫することにより従来の方法で調製される。免疫学的交差反応性は好ましくは「特異的」であり、これは同定される免疫学的交差反応性分子（例えば抗体）の対応するＰＲＯポリペプチドに対する結合親和性が、その分子の他の任意の知られた天然ポリペプチドに対する結合親和性より有意に高い（好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約４倍、さらにより好ましくは少なくとも約８倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍高い）ことを意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性又はその転写又は翻訳を全体的又は部分的に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。好適なアンタゴニスト分子は特に、アンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片、ペプチド、有機小分子、アンチセンス核酸などを含む。ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストの同定方法は、候補アンタゴニスト分子と接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
「小分子」は、ここで約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持つ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体及び抗原特異性を持たない他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、ミエローマによって向上したレベルで生産される。「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、限定されることなく、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を有している限り抗体断片を包含する。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンの異種四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域(ＣＤＲｓ)と呼ばれる３つ又は４つののセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、ＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つ又５つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁[1991]を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性活性への抗体の関与を示す。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｌ２)及び９６−１０１(Ｌ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「抗体断片」は、未変性の抗体の一部、好ましくは未変性の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabody)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異的抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を持つ２つの同一な抗原結合断片、及び残りの「Ｆｃ」断片、その名称は容易に結晶化する能力を反映している、を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')２断片が生成される。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の二量体からなる。この配置では、VＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を決定するために各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用する。正確には、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識し結合する能力を持つが、結合部位全体よりは親和性が低い。
また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域から，の１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる１つ又は２つの明らかに異なる型に分類できる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラスに分けられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は良く知られている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で優れている。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler ほかによってネイチャー（256:495 (1975)）に掲載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法(例えば米国特許第4,816,567号を参照のこと)によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は例えばClackson ら，（624-628 (1991)）及びMarksら，（J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分は他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(Cabilly ら， 前掲; Morrison ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいは断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの変更は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jones ほか, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann ら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照されたい。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が対象抗体でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来するプリマタイズしたPrimatized（商品名）抗体を含む。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは一本鎖ポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、ｓＦｖを結合させて抗原結合に望ましい構造を形成してもよい。ｓＦＶの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Mooreeds., Spring-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)のPluckthunを参照されたい。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体断片を意味し、これらの断片は同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖における２つのドメイン間に対を形成するには短すぎるリンカーを用いると、ドメインは他の鎖の相補的ドメインと強制的に対をなし、２つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えばEP404,097; WO 93/11161; 及び Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により完全に記載されている。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、抗体に直接的又は間接的に結合して「標識化」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。検出可能な標識として機能する放射性核種は、例えば，Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、及びＰｄ−１０９を含む。また、標識は、毒素のような非検出可能な物質でも良い。
「固相」とは、本発明の抗体が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔の制御されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々の粒子の不連続な固体相も含む。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はそれらに対する抗体、場合によっては化学治療薬）の送達に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々の型の小さな小胞である。リポソームの成分は、通常は生物学的メンバーの脂質配列に類似した２層構造に配列される。
ここで用いるように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫部ロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
下記に示すように、表１はALIGN-2配列比較コンピュータープログラムのための完全なソースコードを提供する。このソースコードは、ALIGN-2配列比較コンピュータープログラムを提供するために、ＵＮＩＸオペレーテイングシステムでの利用のため日常的にコンパイルされても良い。
さらに、表２Ａ-２Ｄは、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた％アミノ酸配列同一性（表２Ａ-２Ｂ）及び％核酸配列同一性（表２Ｃ-２Ｄ）を決定するために下記の方法を使用した仮説的例示を示す図であり、「ＰＲＯ」は対象とする仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は対象とする仮説的ＰＲＯＸＸＸ-又はＰＲＯＸＸＸ-コード化核酸配列を示し、「比較ＤＮＡ」は対象とする「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。
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II. 本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯポリペプチドの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
Ｂ．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表３に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表３
元の残基 例示的置換 好ましい置換
Ala(A) val; Leu; ile val
Arg(R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; lys; arg gln
Asp(D) glu glu
Cys(C) ser ser
Gln(Q) asn ans
Gln(E) asp asp
Gly(G) pro; ala ala
His(H) asn; gln; lys; arg arg
Ile(I) leu; val; met; ala; phe;
ノルロイシン leu
Leu(L) ノルロイシン; ile; val;
met; ala; phe ile
Lys(K) arg; gln; asn arg
Met(M) leu; phe; ile leu
Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr; phe tyr
Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe
Val(V) ile; leu; met; phe;
ala; ノルロイシン leu
ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-Ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。
ａ．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
ｂ．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎ<SUP>r</SUP>を有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行 米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
ｃ．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号44076あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
ｄ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
ｅ．ポリペプチドの精製
ＰＲＯポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。
Ｅ．ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の腫瘍組織及び細胞系での増幅
この発明は或る種の癌細胞で増幅される遺伝子の同定及び特徴付けに基づいている。
原核生物及び真核生物ゲノムに２つの見掛け上は矛盾する要件を課した。一方は、遺伝情報としてのＤＮＡのその最初の形態での保存及び繁殖であり、複数の世代を通して安定な遺伝を確保する。他方では、細胞又は生物が最近の環境変化を採用しなければならない。適応メカニズムは遺伝子物質の質的又は量的改変を含みうる。質的改変は、コード化配列が変化して構造的又は機能的に異なるタンパク質を生ずるＤＮＡ変異を含む。遺伝子増幅は量的改変であり、それにより実際の完全なコード化配列、即ち遺伝子の数が増加し、転写に利用できるテンプレート数の増加、翻訳可能な転写物の数の増加、及び最終的には増幅された遺伝子にコードされるタンパク質の量の増加をもたらす。
遺伝子増幅の現象及びそこにあるメカニズムは、幾つかの原核及び真核生物細胞培養系でインビトロ実験されている。遺伝子増幅の最も特徴づけられた例は、種々の濃度の細胞毒性薬メトトレキセート（ＭＴＸ）を含有する培地での真核生物細胞の培養を含む。ＭＴＸは葉酸類似物であり酵素デヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）のブロックによりＤＮＡ合成を妨害する。低濃度のＭＴＸに最初に暴露すると殆どの細胞（99.9%）が死亡する。少量の細胞は生き残り、多量のＤＨＦＲ-ＲＮＡ及びタンパク質を生産することによりＭＴＸ濃度を増加させても成長できる。この過剰生産の基礎は単一のＤＨＦＲ遺伝子の増幅である。遺伝子のさらなるコピーは、小さく過剰な染色体（二重微小）の形態で染色体外コピーとして、又は一体化染色体コピーとして見られる。
遺伝子増幅は、細胞毒性薬（最近に対する抗生物質及び真核生物に対する化学治療薬）への耐性の進行及び腫瘍形成性形質転換において最も普通に起こる。自発的事象としての又はウイルス又は化学／環境侵襲による真核生物の形質転換は典型的にその細胞の遺伝物質における変化を伴う。ヒト悪性収容で観察される最も通常の遺伝的変化はｐ５３タンパク質の突然変異である。ｐ５３は、定常（Ｇ１）から複製（Ｓ）相への細胞の転移を制御し、ＤＮＡ損傷の存在下でこの転移を防止する。言い換えれば、ｐ５３変異不全の主な結果の一つは、ＤＮＡ損傷の蓄積及び成長、即ち遺伝的変化である。腫瘍形成細胞における遺伝的変化の通常の型は、点変異に加えて、増幅及び全体、構造的改変、例えば転位置である。
ＤＮＡ配列の増幅は、ＤＨＦＲ実験系で例示したように特定の機能的要件を示す。従って、悪性におけるある種のオンコジーンの増幅は悪性形質転換及び形質転換フェノタイプの維持のプロセスにおけるこれらの遺伝子の原因となる役割を示す。この仮説が最近の研究で支持されている。例えば、ｂｃｌ-２タンパク質はある型の非ホジキンリンパ腫において増幅されることが見いだされた。このタンパク質はアポトーシスを阻害して腫瘍形成細胞の蓄積を進行させる。成長因子レセプターの遺伝子ファミリのメンバーが種々の型の癌で増幅されることが見いだされ、これらのレセプターの過剰発現が、腫瘍細胞の制限された量の利用可能な成長因子に対する感受性を低下させる。例としては、アンドロゲン欠乏治療の間の再発前立腺癌におけるアンドロゲンレセプターの増幅、及び乳癌における成長因子レセプター相同体ＥＲＢ２の増幅を含む。最近、細胞間シグナル伝達及び細胞周期進行に含まれる遺伝子が悪性形質転換の間に増幅を受けうる。これは、種々の上皮及びリンパ腫瘍形成におけるｂｃｌ-Ｉ及びｒａｓ遺伝子の増幅によって例示される。
これらの初期の研究は、これらの方法が悪性形質転換に重要な遺伝子の同定が可能であるため、腫瘍形成において増幅されたＤＮＡ配列の同定の可能性を例示する。ＥＲＢ２の場合も、形質転換タンパク質が腫瘍治療のための新規で特異的な標的を示すので、治療的立場からの可能性を示す。
増幅されたゲノム配列を示すのに幾つかの異なる技術を使用できる。癌細胞から調製した染色体展開の古典的な細胞発生分析は、転位置、欠失及び変換といった全体構造変化を同定するには十分である。増幅ゲノム領域は、それらが高いコピー数を含むか染色体外物質として存在する場合にのみ可視化される。細胞発生は特定の腫瘍形成を持つ特定の染色体変化の一貫した関係を示すための第１の技術だが、管理可能なＤＮＡ配列の同定及び単離には不十分である。より最近に開発された技術の競合ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は腫瘍形成におけるゲノム増幅の広範な現象を例示する。腫瘍及び正常ＤＮＡは正常細胞の分裂中期に同時にハイブリダイゼーションし、腫瘍に高頻度で存在するＤＮＡ配列についての画像分析で全ゲノムをスクリーニングする（WO 93/18,186; Gray等, Radiation Res. 137: 275-289 [1994]）。スクリーニング法として、このタイプの分析は、種々のヒト腫瘍における再発アンプリコン（増幅ＤＮＡの伸展）の多数を明らかにした。ＣＧＨは古典的細胞発生分析よりＤＮＡの増幅伸展の同定において感度が高いが、それは標準的な遺伝子技術によりアンプリコン内のコード化配列の迅速な同定及び単離ができない。
遺伝子増幅の検出に最も感度の良い方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイである。これらのアッセイは極めて少量の腫瘍ＤＮＡを出発材料として用い、精巧で感度が良く、配列決定などの更なる分析に利用できるＤＮＡを提供し、高容量スループット分析に適している。
上記のアッセイは相互に排他的ではなく、腫瘍形成における増幅の同定にしばしば組み合わせて使用される。細胞発生分析及びＣＧＨは増幅領域の全ゲノムの概観のためのスクリーニング法を代表し、ＰＣＲベースのアッセイはコード化配列、即ち増幅領域の遺伝子を最終的に同定するのに最も適している。
本発明により、このような遺伝子は定量的ＰＣＲ（S. Gelmini等, Clin, Chem. 43: 752 [1997]）により、乳、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、精巣、卵巣、子宮など、腫瘍、又は腫瘍細胞系を含む種々の原発腫瘍からのＤＮＡを健常ドナーからのプールしたＤＮＡと比較することにより同定される。定量的ＰＣＲは、TaqMan（商品名）装置（ABI）を用いて実施された。遺伝子特異的プライマー及び蛍光発生プローブは、ＤＮＡのコード化配列に基づいて設計される。
ヒト肺癌細胞系は、Ａ５４９(ＳＲＣＣ７６８)、Ｃａｌｕ-１(ＳＲＣＣ７６９)、Ｃａｌｕ-６(ＳＲＣＣ７７０)、Ｈ１５７(ＳＲＣＣ７７１)、Ｈ４４１(ＳＲＣＣ７７２)、Ｈ４６０(ＳＲＣＣ７７３)、ＳＫＭＥＳ-１(ＳＲＣＣ７７４)、ＳＷ９００(ＳＲＣＣ７７５)、Ｈ５２２（ＳＲＣＣ８３２）、及びＨ８１０（ＳＲＣＣ８３３）を含み、全てＡＴＣＣから入手可能である。原発ヒト肺腫瘍細胞は通常は腺癌、扁平上皮細胞癌、大細胞癌、非-小細胞癌、小細胞癌、及び気管支肺胞癌から誘導され、例えば、ＳＲＣＣ７２４（「AdenoCa」と略記される腺癌）（ＬＴ１）、ＳＲＣＣ７２５(「SqCCa」と略記される扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１ａ)、ＳＲＣ７２５(「ＮＳＣＣａ」と略記される非-小細胞癌)(ＬＴ１ａ)、ＳＲＣＣ７２６(腺癌)(ＬＴ２)、ＳＲＣＣ７２７(腺癌)(ＬＴ３)、ＳＲＣＣ７２８（腺癌）(ＬＴ４)、ＳＲＣＣ７２９(扁平上皮細胞癌)(ＬＴ６)、ＳＲＣＣ７３０(腺／扁平上皮細胞癌)(ＬＴ７)、ＳＲＣＣ８２５（腺癌）（ＬＴ８）、ＳＲＣＣ７３１(腺癌)(ＬＴ９)、ＳＲＣＣ７３２（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１０)、ＳＲＣＣ７３３（扁平上皮細胞癌）(ＬＴ１１)、ＳＲＣＣ７３４(腺癌)(ＬＴ１２)、ＳＲＣＣ７３５(腺／扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１３)、ＳＲＣＣ７３６（扁平上皮細胞癌）(ＬＴ１５)、ＳＲＣＣ７３７（扁平上皮細胞癌）(ＬＴ１６)、ＳＲＣＣ７３８(扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１７)、ＳＲＣＣ７３９(扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１８)、ＳＲＣＣ７４０(扁平上皮細胞癌)(ＬＴ１９)、ＳＲＣＣ７４１(肺細胞癌、「LCCa」と略記)(ＬＴ２１)、ＳＲＣＣ８１１(腺癌)(ＬＴ２２)、ＳＲＣＣ８８７(扁平上皮細胞癌)(ＬＴ２６)、ＳＲＣＣ８８８(腺-BAC癌)(ＬＴ２７)、ＳＲＣＣ８８９（扁平上皮細胞癌)(ＬＴ２８)、ＳＲＣＣ８９０（扁平上皮細胞癌）(ＬＴ２９)、ＳＲＣＣ８９１(腺癌)(ＬＴ３０)、ＳＲＣＣ８９２(扁平上皮細胞癌)(ＬＴ３１)、ＳＲＣＣ８９４（腺癌）(ＬＴ３３）を含む。また、ＳＲＣＣ１１２５［HF-000631］、ＳＲＣＣ１１２７［HF-000641］、ＳＲＣＣ１１２９［HF-000643］、ＳＲＣＣ１１３３［HF-000840］、ＳＲＣＣ１１３５［HF-000842］、ＳＲＣＣ１２２７［HF-001291］、ＳＲＣＣ１２２９［HF-001293］、ＳＲＣＣ１２３０［HF-001294］、ＳＲＣＣ１２３１［HF-001295］、ＳＲＣＣ１２３２［HF-001296］、ＳＲＣＣ１２３３［HF-001297］、ＳＲＣＣ１２３５［HF-001299］、ＳＲＣＣ１２３６［HF-001300］、ＳＲＣＣ１２９６［HF-001640］、ＳＲＣＣ１２９９［HF-001643］、ＳＲＣＣ１３００［HF-001644］、ＳＲＣＣ１３０１［HF-001645］、ＳＲＣＣ１３０２［HF-001646］、ＳＲＣＣ１３０３［HF-001647］、及びＳＲＣＣ１３０４［HF-001648］と称されるヒト肺腫瘍も含まれる。
結腸癌細胞系は、例えば、ＡＴＣＣ細胞系ＳＷ４８０(腺癌、ＳＲＣＣ７７６)、ＳＷ６２０(結腸腺癌のリンパ節転移、ＳＲＣ７７７)、Ｃｏｌｏ３２０(癌、ＳＲＣＣ７７８)、ＨＴ２９（腺癌、ＳＲＣＣ７７９）、ＨＣＣ２９９８(癌、ＳＲＣＣ８３０)、ＨＭ７(ＡＴＣＣ大腸腺癌細胞系ＬＳ１７４Ｔの高ムシン産生変異体、ＳＲＣＣ７８０、Robert Warren博士, UCSFから得た）、ＣａＷｉＤｒ(腺癌、ＳＲＣＣ７８１)、ＨＣＴ１１６(癌、ＳＲＣＣ７８２)、ＳＫＣＯ１(腺癌、ＳＲＣＣ７８３)、ＳＷ４０３(腺癌、ＳＲＣＣ７８４)、ＬＳ１７４Ｔ(癌、ＳＲＣＣ７８５)、Ｃｏｌｏ２０５(癌、ＳＲＣＣ８２８)、ＨＣＴ１５(癌、ＳＲＣＣ８２９)、ＨＣＣ２９９８（癌、ＳＲＣＣ８３０）、及びＫＭ１２(癌、ＳＲＣＣ８３１)を含む。原発大腸腫瘍は、ＣＴ２(ＳＲＣＣ７４２)、ＣＴ３(ＳＲＣＣ７４３)、ＣＴ８(ＳＲＣＣ７４４)、ＣＴ１０(ＳＲＣＣ７４５)、ＣＴ１２(ＳＲＣＣ７４６)、ＣＴ１４(ＳＲＣＣ７４７)、ＣＴ１５(ＳＲＣＣ７４８)、ＣＴ１６(ＳＲＣＣ７４９)、ＣＴ１７(ＳＲＣＣ７５０)、ＣＴ１(ＳＲＣＣ７５１)、ＣＴ４(ＳＲＣＣ７５２)、ＣＴ５(ＳＲＣＣ７５３)、ＣＴ６(ＳＲＣＣ７５４)、ＣＴ７(ＳＲＣＣ７５５)、ＣＴ９(ＳＲＣＣ７５６)、ＣＴ１１(ＳＲＣＣ７５７)、ＣＴ１８(ＳＲＣＣ７５８) 、ＣＴ１９（腺癌、ＳＲＣＣ９０６）、ＣＴ２０（腺癌、ＳＲＣＣ９０７）、ＣＴ２１（腺癌、ＳＲＣＣ９０８）、ＣＴ２２（腺癌、ＳＲＣＣ９０９）、ＣＴ２３（腺癌、ＳＲＣＣ９１０）、ＣＴ２４（腺癌、ＳＲＣＣ９１１）、ＣＴ２５(腺癌、ＳＲＣＣ９１２)、ＣＴ２６（腺癌、ＳＲＣＣ９１３）、ＣＴ２７（腺癌、ＳＲＣＣ９１４）、ＣＴ２８(腺癌、ＳＲＣＣ９１５)、ＣＴ２９（腺癌、ＳＲＣＣ９１６）、ＣＴ３０（腺癌、ＳＲＣＣ９１７）、ＣＴ３１（腺癌、ＳＲＣＣ９１８）、ＣＴ３２（腺癌、ＳＲＣＣ９１９）、ＣＴ３３（腺癌、ＳＲＣＣ９２０）、ＣＴ３５(腺癌、ＳＲＣＣ９２１)及びＣＴ３６（腺癌、ＳＲＣＣ９２２）と称される大腸腺癌を含む。また、ＳＲＣＣ１０５１［HF-000499］、ＳＲＣＣ１０５２［HF-000539］、ＳＲＣＣ１０５３［HF-000575］、ＳＲＣＣ１０５４［HF-000698］、ＳＲＣ１０５９［HF-000755］、ＳＲＣＣ１０６０［HF-000756］、ＳＲＣ１１４２［HF-000762］、ＳＲＣＣ１１４４［HF-000789］、ＳＲＣ１１４６［HF-000795］及びＳＲＣＣ１１４８［HF-000811］と称されるヒト大腸腫瘍中心も含まれる。
ヒト乳癌細胞系は、例えば、ＨＢＬ１００(ＳＲＣＣ７５９)、ＭＢ４３５ｓ(ＳＲＣＣ７６０)、Ｔ４７Ｄ(ＳＲＣＣ７６１)、ＭＢ４６８(ＳＲＣＣ７６２)、ＭＢ１７５(ＳＲＣＣ７６３)、ＭＢ３６１(ＳＲＣＣ７６４)、ＢＴ２０(ＳＲＣＣ７６５)、ＭＣＦ７(ＳＲＣＣ７６６)、及びＳＫＢＲ３（ＳＲＣＣ７６７）、及びＳＲＣＣ１０５７［HF-000545］と称されるヒト乳腫瘍中心を含む。また、ＳＲＣＣ１０９４、ＳＲＣＣ１０９５、ＳＲＣＣ１０９６、ＳＲＣＣ１０９７、ＳＲＣＣ１０９８、ＳＲＣＣ１０９９、ＳＲＣＣ１１００、ＳＲＣＣ１１０１と称されるヒト乳腫瘍、及びＳＲＣＣ８９３［LT32］と称されるbreast-met-ling-NS腫瘍が含まれる。
ヒト直腸腫瘍はＳＲＣＣ９８１［HF-000550］及びＳＲＣＣ９８２［HF-000551］を含む。
ヒト腎臓腫瘍中心は、ＳＲＣＣ９８９［HF-000611］及びＳＲＣＣ１０１４［HF-000613］を含む。
ヒト精巣腫瘍中心はＳＲＣＣ１００１［HF-000733］、そして精巣腫瘍辺縁はＳＲＣＣ９９９［HF-000716］を含む。
ヒト上皮小体腫瘍はＳＲＣＣ１００２［HF-000831］及びＳＲＣＣ１００３［HF-000832］を含む。
ヒトリンパ節腫瘍はＳＲＣＣ１００４［HF-000854］、ＳＲＣＣ１００５［HF-000855］、及びＳＲＣＣ１００６［HF-000856］を含む。
Ｆ．組織分布
ここでの遺伝子増幅アッセイの結果は、種々のヒト組織でのｍＲＮＡ発現の測定などのさらなる実験により確認できる。
上記したように、種々の組織における遺伝子増幅又は遺伝子発現は、ｍＲＮＡの転写の定量化のための従来のサザンブロット、ノーザンブロット（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]）、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーションにより、ここに提供する配列にもとづいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識する抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片及び細胞培地又は体液の免疫組織学的染色などの免疫的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色及び／又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利には、抗体は天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここに提供するＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ ＤＮＡ配列に融合し特異的抗体エピトープをコードする細胞外配列に対して調製される。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリダイゼーションのプロトコールは以下に提供する。
Ｇ．染色体マッピング
与えられた遺伝子の増幅が機能的に関連する場合は、その遺伝子は、腫瘍生存に重要でない隣接ゲノム領域より多く増幅すべきである。これを試験するために、例えば放射性ハイブリッド分析により、遺伝子を特定染色体にマッピングできる。次いで、増幅レベルを特定した位置及び隣接ゲノム領域において測定する。遺伝子がマッピングされたゲノム領域での選択的又は優先的増幅は、観察された遺伝子増幅が腫瘍成長又は生存を促進する可能性と一致する。染色体マッピングはフレームワーク及びエピセンターマッピングの両方を含む。さらなる詳細は、例えば、Stewart等, Genome Research 7, 422-433 (1997)を参照。
Ｈ．抗体結合実験
遺伝子増幅実験の結果は、腫瘍（癌）細胞上でのＰＲＯポリペプチドの発現を阻害する抗ＰＲＯ抗体の能力が試験される抗体結合実験によって更に確認できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合実験は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の（腫瘍細胞で増幅された遺伝子にコードされる）標的タンパク質の量は、抗体に結合し始める標準物の量に逆比例する。結合し始める標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に固定化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々が検出すべきタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される。例えば米国特許第4,376,110号参照。第２の抗体は検出可能部分で標識され（直接サンドウィッチアッセイ）、あるいは検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のために、腫瘍試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
Ｉ．細胞ベースの腫瘍アッセイ
細胞ベースアッセイ及び腫瘍（例えば、癌）の動物モデルを用いて、遺伝子増幅アッセイに発見を確認し、ここでの遺伝子増幅と腫瘍形成細胞成長の進行及び病理との関係をさらに理解することができる。ここで同定する遺伝子産物の腫瘍又は癌の進行及び病理における役割は、ここで遺伝子を増幅すると同定された原発腫瘍細胞又は細胞系を用いて試験することができる。このような細胞は、例えば、上記した乳、大腸及び肺癌細胞及び細胞系を含む。
異なる方法では、特定の腫瘍に含まれることが知られた細胞型の細胞をここのｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡの過剰成長誘発能力を分析する。適当な細胞は、例えば、Ｂ１０４-1-１（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移入された安定なＮＩＨ-３Ｔ３細胞液）及びｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞等の安定な腫瘍細胞系を含み、これらは所望の遺伝子で形質移入し、そして腫瘍形成的成長を監視できる。このような形質移入細胞系は、次いで、形質転換細胞の成長に対する細胞分裂停止又は細胞毒性活性の発揮により、又は抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の媒介により、ポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の腫瘍形成細胞成長を阻害する能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、癌治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、（下記のような）トランスジェニック動物の腫瘍から誘導された一次培地は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な細胞系が好ましい。トランスジェニック動物から連続細胞系を誘導する技術はこの分野で良く知られている（Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照）。
Ｊ．動物モデル
腫瘍の進行及び原因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。腫瘍及び癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌など）の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植、又はオルトピン(orthopin)移植、例えば大腸組織に移植された結腸癌細胞により、腫瘍細胞を同系マウスに導入することにより作成される。（1997年9月18日に発行されたＰＣＴ公報WO 97/33551参照。）
癌遺伝子の研究におそらく最もしばしば用いられる動物種は、免疫不全マウス、特にヌードマウスである。ハイポ／形成不全を持つヌードマウスがヒト腫瘍異種移植の宿主として行動するという観察は、この目的のための広い用途を導いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子が、例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、I／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲIII及びＳＪＬを含むヌードマウスの極めて多数の異なる共通遺伝子系統に導入された。さらに、遺伝的な免疫不全を持つヌードマウス以外の広範な他の動物が生育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして用いられた。さらなる詳細については、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven 及び B. Winograd 編, CRC Press, Inc., 1991を参照。
これらの動物に導入される細胞は、周知の腫瘍／癌細胞系、例えば上記列挙した腫瘍細胞系、及び、例えばＢ１０４-１-１細胞系（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞系）；ｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞：Ｃａｃｏ-２（ATCC HTB-37）、中程度に良く分化したグレードIIヒト大腸腺癌細胞系、ＨＴ-２９（ATCC HTB-38）から、あるいは腫瘍及び癌から誘導することができる。腫瘍又は癌細胞の試料は、手術を受けている患者から、液体窒素中での凍結及び保存を含む標準的な条件を用いて得ることができる（Karmali等, Br. J. Cancer 48, 689-696 [1983]）。
腫瘍細胞は、ヌードマウスなどの動物に、種々の手法によって導入できる。マウスの皮下（s.c.）空間は、腫瘍移植に非常に好ましい。腫瘍は、固体ブロックとして、トロチャー(trochar)を用いてニードル生検として、細胞懸濁物としてs.c.移植できる。固体ブロック又はトロチャー移植のために、適切な大きさの腫瘍組織断片がs.c.空間に導入される。細胞懸濁物は、原発腫瘍又は安定な腫瘍細胞系から新たに調製され、皮下注射される。また腫瘍細胞は、皮下植え込みとして注射することもできる。この位置において、種菌が皮膚結合組織の下層とs.c.組織との間に析出される。Boven及びWinograd (1991), 上掲。
乳癌の動物モデルは、例えば、神経芽腫細胞（それからｎｅｕ癌遺伝子が最初に単離される）、又はｎｅｕ形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植することにより、基本的にはDrebin等, PNAS USA 83, 9129-9133 (1986)に記載されているように生成される。
同様に、結腸癌の動物モデルは、結腸癌細胞を動物、例えばヌードマウスに継代し、これらの動物における腫瘍の発現を導くことにより生成される。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所性移植モデルは、例えば、Wang等, Cancer Research 54, 4726-4728 (1994)及びToo等, Cancer Research 55, 681-684 (1995)に記載されている。このモデルは、いわゆるAntiCancer, Inc. (SanDiego, California)から市販の「METAMOUSE」に基づく。
動物に生じた腫瘍は、取り出してインビトロで培養することができる。インビトロ培地からの細胞は、次いで動物に継代することができる。これらの腫瘍は、さらなる試験及び薬物スクリーニングの標的として提供され得る。あるいは、継代から得られる腫瘍は単離でき、継代前細胞及び１又はそれ以上の継代後に単離した細胞のＲＮＡを、対象とする遺伝子の識別可能な発現について分析する。このような継代技術は、周知の腫瘍又は癌細胞系で実施することができる。
例えば、Ｍｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１、及びＷＥＨＩ-１６４がＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの線維肉腫に導入され（DeLeo等, J. Exp. Med. 146, 720 [1977]）、それは、種々の抗原の抗腫瘍活性の研究のための高度に制御可能なモデル系を提供する（Palladino等, J. Immunol. 138, 4023-4032 [1987]）。簡便には、腫瘍細胞は細胞培地中でインビトロで成長させる。動物に注射する前に、細胞系は洗浄してバッファー中に約１０ｘ１０６から１０ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁する。次いで動物を１０から１００μｌの細胞懸濁物で皮下感染し、腫瘍が現れるまで１から３週間放置する。
さらに、最も完全に研究された実験的腫瘍の一つであるマウスのルイス肺（３ＬＬ）癌腫は、研究用腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルにおける有効性は、肺の小細胞癌腫（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の治療における有利な効果と相関していた。この腫瘍は、影響を受けたマウスからの腫瘍断片又は培地に残った細胞の注射に際して正常マウスに導入でき（Zupi等, Br. J. Cancer 41, suppl. 4, 309 [1980]）、証拠は、腫瘍がたった一つの細胞の注射から開始され、感染した腫瘍細胞の極めて高い集団が生存することを示している。この腫瘍モデルに関する更なる情報については、Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 [1986]を参照のこと。
移植された腫瘍の動物モデルにおける試験化合物の有効性を評価する一つの方法は、治療前後での腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植した腫瘍の大きさは、二又は三次元のスライドキャリパーで測定される。二次元に制限された測定は、腫瘍の大きさを正確に反映せず、従って、通常は数式を用いて対応する容積に換算される。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は極めて不正確である。候補薬の治療効果は、治療-誘発性の成長遅延及び特異的な成長遅延としてより良く記述できる。腫瘍成長の記述における他の重要な変数は、腫瘍容積倍加時間である。Rygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu及びSheng編, Basel, 1989, 301によって報告されたプログラムなどの、腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピュータプログラムも利用可能である。しかし、腫瘍に続く壊死及び炎症反応が実際には少なくとも初期に腫瘍の大きさを増大させ得ることを注記しておく。従って、これらの変化は、形態学的方法及びフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とする動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、全核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Thompsonら, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子転移（Lavitranoら, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。動物は、腫瘍又は癌発生の徴候についてさらに試験される。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、そのポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ここに同定するＰＲＯポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、ＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特にＰＲＯポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
自発的な動物腫瘍の治療におけるここに同定されるポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の有効性も試験できる。このような研究のための適切な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコ口腔ＳＣＣは高度に侵襲的な悪性腫瘍で、ネコに最も通常の口腔悪性腫瘍であり、この種に報告される口腔腫瘍の６０％以上を占める。それは、離れた部位には殆ど転移しないが、この転移の低い発生率は単にこの腫瘍を持つネコの短い生存期間を反映しているにすぎない。これらの腫瘍は通常手術できないが、主にネコの口腔の解剖学的形状による。現在では、この腫瘍の有効な治療法は存在しない。研究に入る前に、各々のネコに完全な臨床検査、生体組織検査を施し、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によりスキャンした。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍を持つと診断されたネコは研究から排除した。舌はこの腫瘍のために麻痺し始め、治療がこの腫瘍を殺した後でも、動物は自分で餌を取ることができないであろう。各々のネコを長期に渡って繰り返し治療する。腫瘍の写真を治療期間中の毎日及び引き続く再チェックの時点で撮影した。治療の後、各ねこに再度ＣＴスキャンを施した。ＣＴスキャン及びラジオグラフは、その後８週間ごとに評価した。データは、対照群と比較した生存数、反応性及び毒性における相違について評価した。ポジティブ反応は、腫瘍の縮小、好ましくは生存の質の向上又は生存期間の延長を必要とする。
さらに、他の自発的動物腫瘍、例えばイヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、クロンドローマ(chrondroma)、平滑筋肉腫も試験できる。これらのイヌ及びネコでの乳腺癌は、その発現及び挙動がヒトのものに極めて類似しているので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの型の腫瘍の発生比率によって制限される。
Ｋ．候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチドと結合又は抱合する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。小分子とは、抗体合成有機又は無機化合物を含むと考え、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定される核酸にコードされるポリペプチドと、それら２成分が相互作用するのに十分な時間接触させることで共通している。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチドのレセプター即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、その相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定されるＰＲＯのコード化配列と他の細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験することができる：通常は、増幅された遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で２つの生成物が相互作用及び結合する時間に渡って調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視する。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＰＲＯポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに細胞に添加してもよく、ＰＲＯポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＰＲＯポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のＰＲＯポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＰＲＯポリペプチドへ曝露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
レセプター同定の代替的方法として、標識したＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、よってＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (SRS Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、一般的に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発行）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
Ｌ．腫瘍治療のための組成物及び方法
ここで同定した遺伝子の増幅を伴う腫瘍の治療に有用な組成物は、限定されないが、抗体、小有機及び無機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子などを含み、標的遺伝子産物の発現又は活性を阻害するものである。
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発行）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの分子は上記のスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組み合わせにより、又は当業者に知られた他のスクリーニング技術により同定できる。
Ｍ．抗体
本発明で最も有望な候補薬剤の幾つかは、ここで同定される増幅遺伝子の生成又は遺伝子産物を阻害する及び／又は遺伝子産物の活性を低下させる抗体及び抗体断片である。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には断片を含むＰＲＯポリペプチド、又はそのタンパク質又はその断片の融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用されるか、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化細胞系は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性のものである。より好ましい不死化細胞系はマウス骨髄腫系であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのソーク研究所（Salk Institute）Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞系も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4,816,567；Morrisonら, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
３．ヒト及びヒト化抗体
抗ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
４．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照のこと)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えばWO88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、グリコシダーゼ、グルコース置きシダーゼ、ヒトリソザイム、ヒトグルコロニダーゼ、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＧ２及びカルボキシペプチダーゼＡ）及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458[1987]を参照のこと)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＰＲＯ抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neubergerら, Nature 312:604-608[1984])。
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
WO96/27011に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体フラグメントを作成する別のメカニズムを提供した。フラグメントは、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインは他のフラグメントの相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体フラグメントを製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら，J. Immunol. 147:60(1991)。
例示的二重特異性抗体は、ここで与えられるタンパク質上の２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗ポリペプチドアームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲII(ＣＤ３２)及びＦｃγＲIII(ＣＤ１６)等のＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）に結合するアームに結合し、細胞防御メカニズムを特定のタンパク質発現細胞に集中するようにしてもよい。二重特異性抗体は、特定のポリペプチドを発現する細胞に対する局所的細胞毒性薬として使用してもよい。これらの抗体は、ポリペプチド結合アーム及び細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡに結合するアームを有する。他の対象とする二重特異性抗体は、ポリペプチドに結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
６．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
７．エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caronら, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolffら, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
８．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。小分子毒素は、例えばカリケアマイシン（calicheamicins）、マイタンシノイド(maytansinoids)、パリトキシン（palytoxin）及びＣＣ１０６５を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026を参照のこと。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
９．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwangら, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)を参照のこと。
Ｎ．製薬組成物
ここで同定される増幅遺伝子の産物に特異的に結合するアゴニスト抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、癌を含む腫瘍、ウイルス性疾患などの上記で議論した種々の病理学的状態の治療のために、免疫調節剤として、製薬組成物の形態で投与することができる。
増幅された遺伝子にコードされるタンパク質が細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。 抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が通常は好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる（例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]）。
抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
本発明のスクリーニングアッセイで同定された非-抗体化合物は、同様の方式で、この分野で知られた標準技術を用いて製剤される。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的仮性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系<BR（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
Ｏ．治療方法
本発明の抗体及び他の抗腫瘍化合物は、ここで同定される増幅遺伝子の過剰発現及び／又は活性化を特徴とするものを含む種々の状態の治療に用いてもよいと考えられる。このような抗体及び、これらに限られないが有機及び無機小分子、ペプチド、アンチセンス分子等を含む他の化合物で治療される状態又は疾患の例としては、良性又は悪性腫瘍（例えば、腎臓(renal)、肝臓、腎臓(kidney)、膀胱、乳房、胃、卵巣、大腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、甲状、肝臓の癌；肉腫；膠芽細胞腫；及び種々の頭部及び頸部の腫瘍）；白血病及びリンパ悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の疾患；及び炎症、脈管形成及び免疫学的な疾患が含まれる。
本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
他の治療的養生法を抗癌剤、例えば本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療薬は、本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。本発明の抗体は、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 616812参照）の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
また、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。ときどきは、患者にサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここの抗癌剤は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗癌剤を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
疾患の防止又は治療のための、ここでの抗腫瘍剤の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。薬剤は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
Ｐ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は通常、ここで同定される遺伝子産物の活性を妨害することのできる抗腫瘍剤、例えば抗体である。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
Ｑ．腫瘍の診断及び予知
或る種の腫瘍で過剰発現される成長レセプター等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は腫瘍（例えば、癌）治療の優れた標的であるが、同じタンパク質は腫瘍細胞で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに腫瘍の診断及び予知に用途が見出される。例えば、腫瘍細胞で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は腫瘍診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅された遺伝子にコードされるタンパク質（「マーカー遺伝子産物」）の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。これらの技術は、増幅された遺伝子が細胞表面タンパク質、例えば成長因子をコードする場合に特に好ましい。このような結合アッセイは、上記５節に実質的に記載されたように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ユニヴァーシティー・ビルディング、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９である。本出願で言及される全ての元の寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定の下でなされた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、３５米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innisら, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y.., 1990; Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, Oligonucleotide synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coliganら, Current Protocols in Immunology, 1991。
ヒトＰＲＯ５８００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、GenBank）を含んだ。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Blastスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
コンセンサスＤＮＡ配列は他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて上記のように構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ１０２８３６と命名した。幾つかの場合には、コンセンサス配列は中間コンセンサスＤＮＡ配列から誘導され、それはBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、その中間コンセンサス配列は上記のＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
ＤＮＡ１０２８３６コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５８００の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０〜３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０-５５ｂｐ長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きな場合には更なるオリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubelら, Current Protocols in Molecular Biologyのように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１：
５'-CAGCGAACCGGGTGCCGGGTC-３'（配列番号：２１)
正方向ＰＣＲプライマー２：
５'-GAGCGACGAGCGCGCAGCGAAC-３'（配列番号：２２)
正方向ＰＣＲプライマー３：
５'-ATACTGCGATCGCTAAACCACCATGCGCCGCCGCCTGTGGCTG-３'
（配列番号：２３)
逆方向ＰＣＲプライマー１：
５'-GCCGGCCTCTCAGGGCCTCAG-３'（配列番号：２４)
逆方向ＰＣＲプライマー２：
５'-CCCACGTGTACAGAGCGGATCTC-３'（配列番号：２５)
逆方向ＰＣＲプライマー３：
５'-GAGACCAGGACGGGCAGGAAGTG-３'（配列番号：２６)
逆方向ＰＣＲプライマー４：
５'-CAGGCACCTTGGGGAGCCGCC -３'（配列番号：２７)
逆方向ＰＣＲプライマー５：
５'-CCCACGTGTACAGAGCGGATCTC-３'（配列番号：２８)
逆方向ＰＣＲプライマー６：
５'-GAGACCAGGACGGGCAGGAAGTG-３'（配列番号：２９)
さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブをコンセンサスＤＮＡ１０２８３６配列から構築した：
ハイブリダイゼーションプローブ：
５'-CTCTACGGGTACTGCAGGTTCCGGGAGCGCATCGAAGAGAACGG-３'
(配列番号：３０)
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡをヒト胎児肺組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmesら, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。
上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列は、全長ＰＲＯ５８００ポリペプチドについての全長ＤＮＡ配列（ＤＮＡ１０８９１２-２６８０と命名する［図１、配列番号：１］）及び当該ＰＲＯ５８００ポリペプチドの誘導タンパク質配列を与えた。
上記で同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７−９に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置５１７−５１９の停止シグナルを有していた（図１；配列番号：１）。予測されるポリペプチド前駆体は１７０アミノ酸長であり、約１９，６６３ダルトンの計算上の分子量及び約１１．８１の見積もられたｐＩを有する。図２（配列番号：２）に示した全長ＰＲＯ５８００の分析は、図２に示したような種々の重要なポリペプチドドメインの存在を明らかにし、ここで重要なポリペプチドドメインに与えた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１０８９１２−２６８０は１９９９年５月２５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２４が付与されている。
図２（配列番号：２）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ５８００アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W52595, P_W57313, FGFA_HUMAN, P_W57264, FGFA_RAT, P_W52597, MMU94517_1, FGFA_MOUSE, P_W57306 及びD86333_1との間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ６０００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
天然ヒトＰＲＯ６０００ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ１０２８８０−２６８９）を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的に示すヒト子宮ｃＤＮＡライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。
クローンＤＮＡ１０２８８０−２６８９は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２８−３０に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置５８０−５８２に見かけの停止コドンを含む（図３；配列番号：３）。予測されるポリペプチド前駆体は１８４アミノ酸長である（図４；配列番号：４）。図４に示された全長ＰＲＯ６０００配列は、約２１，０５２ダルトンの見積上の分子量及び約５．０１の見積もられたｐＩを有する。図４（配列番号：４）に示した全長ＰＲＯ６０００の分析は、図４に示したような種々の重要なポリペプチドドメインの存在を明らかにし、ここで重要なポリペプチドドメインに与えた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１０２８８０−２６８９は１９９９年７月２０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３８３が付与されている。
図４（配列番号：４）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ６０００アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、SPS_VICFA, ADU85448_1, G64635, AE001516_3, P_W20328, P_W20747, 及びSPS_SPIOLとの間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ６０１６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ９６８８１−２６９９は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は個人的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。
上記に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用は、ここで３０３５２４８Ｈ１と命名されたLIFESEQ(商品名)データーベース、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAからのＥＳＴ配列の同定を可能にした。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ８２３８９と命名する。
ＤＮＡ８２３８９コンセンサス配列とLIFESEQ(商品名)データーベースIncyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAのＥＳＴクローン番号３０３５２４８Ｈ１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号３０３５２４８Ｈ１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図５に示し、ここでＤＮＡ９６８８１−２６９９と命名する。
クローンＤＮＡ９６８８１−２６９９は単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６０−６２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１００５−１００７の停止コドンで終端する（図５；配列番号：５）。予測されるポリペプチド前駆体は３１５アミノ酸長である（図６；配列番号：６）。図６に示す全長ＰＲＯ６０１６タンパク質は、約３５，９６３ダルトンの見積もられた分子量及び約５．３８のｐＩを有する。図６（配列番号：６）に示した全長ＰＲＯ６０１６配列の分析は、図６に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ９６８８１−２６９９は１９９９年８月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５５３が付与されている。
図６（配列番号：６）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ６０１６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W88499; HGS_RE347; P_W88647; YO87_CAEEL; S44095; P_W03626; P_W03627; IE68_HSVSA; PN0009; RNU51583_1との間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ６０１８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ９６５６５−２７０１は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は個人的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。
上記に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用は、ここで７４５５７５Ｈ１と命名されたLIFESEQ(商品名)（Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）データーベースからのＥＳＴ配列の同定を可能にした。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ８２４１１と命名する。
ＤＮＡ８２４１１コンセンサス配列とLIFESEQ(商品名)データーベースIncyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAのＥＳＴクローン番号７４５５７５Ｈ１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号７４５５７５Ｈ１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図７に示し、ここでＤＮＡ９８５６５−２７０１と命名する。
クローンＤＮＡ９６５６５−２７０１は単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３５２−３５７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３０８５−３０８７の停止コドンで終端する（図７；配列番号：７）。予測されるポリペプチド前駆体は９１１アミノ酸長である（図８；配列番号：８）。図８に示す全長ＰＲＯ６０１８タンパク質は、約９９，１１７ダルトンの見積もられた分子量及び約４．６２のｐＩを有する。図８（配列番号：８）に示した全長ＰＲＯ６０１８配列の分析は、図８に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ９８５６５−２７０１は１９９９年８月３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４８１が付与されている。
図８（配列番号：８）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ６０１８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、PGCB_BOVIN; P_R85442; P_R77034; P_R12609; AC003110_2; PGCV_HUMAN; AF116856_1; P_W75099; HGS_A176; A098460_1との間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ６４９６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならな、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、自社のＥＳＴ ＤＮＡデーターベース(LIFESEQ(商品名）、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA）を含んだ。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Blastスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
コンセンサスＤＮＡ配列は他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて上記のように構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４３０４８と命名した。幾つかの場合には、ＤＮＡ４３０４８コンセンサス配列は中間コンセンサスＤＮＡ配列から誘導され、それはBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、その中間コンセンサス配列は上記のＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
ＤＮＡ４３０４８コンセンサス配列に基づいて、そしてＤＮＡ４３０４８コンセンサス配列とLIFESEQ(商品名)データーベースIncyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAのＥＳＴクローン番号１６３６９５２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号１６３６９５２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図９に示し、ここでＤＮＡ１１９３０２−２７３７と命名する。
上記にて同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６３−６５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２３２８−２３３０の停止コドンで終端する（図９；配列番号：９）。予測されるポリペプチド前駆体は７５５アミノ酸長であり、約８２，７８５ダルトンの見積もられた分子量及び約８．７１のｐＩを有する。図１０（配列番号：１０）に示した全長ＰＲＯ６４９６配列の分析は、図１０に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１１９３０２−２７３７は１９９９年８月１０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５２０が付与されている。
図１０（配列番号：１０）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ６４９６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W81365; NEC3_MOUSE; MUSPRCON14_1; FURI_HUMAN; P_R77540; S71340; P_W73932; DROFUR1ISO_1; GEN12660; 及びP_R59784との間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ７１５４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならな、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、（１）公的ＥＳＴデーターベース（例えば、Merck/Washington University)、及び（２）自社のＥＳＴ ＤＮＡデーターベース(LIFESEQ(商品名）、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA）を含んだ。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Blastスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
コンセンサスＤＮＡ配列は他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて上記のように構築した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３８２３７と命名した。幾つかの場合には、ＤＮＡ３８２３７コンセンサス配列は中間コンセンサスＤＮＡ配列から誘導され、それはBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、その中間コンセンサス配列は上記のＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
ＤＮＡ３８２３７コンセンサス配列に基づいて、そしてＤＮＡ３８２３７コンセンサス配列とLIFESEQ(商品名)データーベースIncyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAのＥＳＴクローン番号１８５５７５５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号１８５５７５５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１１に示し、ここでＤＮＡ１０８７６０−２７４０と命名する。
上記にて同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１０２−１０４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０８３−１０８５の停止コドンで終端する（図１１；配列番号：１１）。予測されるポリペプチド前駆体は３２７アミノ酸長であり、約３４，３４８ダルトンの見積もられた分子量及び約７．８８のｐＩを有する。図１２（配列番号：１２）に示した全長ＰＲＯ７１５４配列の分析は、図１２に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１０８７６０−２７４０は１９９９年８月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５４８が付与されている。
図１２（配列番号：１２）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ７１５４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF061022_1; AF061024_1; HS889N15_1; GGY14064_1; GGY14063_1; AF061023_1; XLU43330_1; GEN14531; MMCARH_1; 及びMMU90715_1との間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ７１７０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ１０８７２２−２７４３は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は個人的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。
上記に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用は、ここでＣＬＵ５７８３６と命名されたLIFESEQ(商品名)データーベース、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAからのＥＳＴクラスター配列の同定を可能にした。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５８７５６と命名する。
ＤＮＡ５８７５６コンセンサス配列とLIFESEQ(商品名)データーベースIncyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAのＥＳＴクローン番号２２５１４６２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号２２５１４６２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３に示し、ここでＤＮＡ１０８７２２−２７４３と命名する。
クローンＤＮＡ１０８７２２−２７４３は単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６０−６２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５０６−１５０８の停止コドンで終端する（図１３；配列番号：１３）。予測されるポリペプチド前駆体は４８２アミノ酸長である（図１４；配列番号：１４）。図１４に示す全長ＰＲＯ７１７０タンパク質は、約４９，０６０ダルトンの見積もられた分子量及び約４．７４のｐＩを有する。図１４（配列番号：１４）に示した全長ＰＲＯ７１７０配列の分析は、図１４に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１０８７２２−２７４３は１９９９年８月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５５２が付与されている。
図１４（配列番号：１４）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ７１７０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_Y12291, I47141, D88733_1, DMC56G7_1, P_Y11606, HWP1_CANAL, HSMUC5BEX_1, HSU78550_1, HSU70136_1, HSU70136_1, 及びSGS3_DROMEとの間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ７４２２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ１１９５３６−２７５２は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は個人的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。
上記に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用は、ここで８１５７５と命名されたIncyte データーベースからのＥＳＴクラスター配列の同定を可能にした。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ１０４３９１と命名する。
ＤＮＡ１０４３９１コンセンサス配列とIncyteデーターベースのクローン番号１９２２８８８に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号１９２２８８８を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１５に示し、ここでＤＮＡ１１９５３６−２７５２と命名する。
クローンＤＮＡ１１９５３６−２７５２は単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４７−４９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３１１−３１３の停止コドンで終端する（図１５；配列番号：１５）。予測されるポリペプチド前駆体は８８アミノ酸長である（図１６）。図１６に示す全長ＰＲＯ７４２２タンパク質は、約９，６４５ダルトンの見積もられた分子量及び約５．４５のｐＩを有する。図１６（配列番号：１６）に示した全長ＰＲＯ７４２２配列の分析は、図１６に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１１９５３６−２７５２は１９９９年８月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５５１が付与されている。
ヒトＰＲＯ７４３１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ１１９５４２−２７５４は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は個人的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。
上記に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用は、ここでクローン番号２２０１１８２と命名されたLIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAデーターベースからのＥＳＴクラスター配列の同定を可能にした。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ１０４３９２と命名する。
ＤＮＡ１０４３９２コンセンサス配列とIncyteデーターベースのクローン番号２２０１１８２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、クローン番号２２０１１８２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１５に示し、ここでＤＮＡ１１９５４２−２７５４と命名する。
クローンＤＮＡ１１９５４２−２７５４は単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２４７−２４９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８３８−８４０の停止コドンで終端する（図１７；配列番号：１７）。予測されるポリペプチド前駆体は１９７アミノ酸長である（図１８）。図１８に示す全長ＰＲＯ７４３１タンパク質は、約２１，９９２ダルトンの見積もられた分子量及び約１２．１８のｐＩを有する。図１８（配列番号：１８）に示した全長ＰＲＯ７４３１配列の分析は、図１８に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１１９５４２−２７５４は１９９９年８月３１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１９が付与されている。
図１８（配列番号：１８）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ７４３１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列AF061943_1; RNU08136_1; MAV011838_1; HXAA_HUMAN; Y653_HUMAN; P_R51263; P_R74041; AF101057_1; AF101058; AF101059_1との間の配列同一性を明らかにした。
ヒトＰＲＯ７４７６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
サイトカイン／成長因子相同体のために、相同体検索をコンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。９４．５ＫＢ断片が成長因子をコードするエクソンを含むことが見出されたが、この断片は大きなイントロンによって分割されていた。イントロンは、コンピューターアルゴリズムによって除かれた。ＤＮＡ１０２８６３コンセンサス配列に基づいて、１）対象となる配列を含んだｃＤＮＡライブラリがＰＣＲによって同定されるように、そして２）ＰＲＯ７４７６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして利用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは、一般的に２０〜３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいとき付加的オリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡをAusubelら, Current Protocols i Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた対象とする遺伝子クローンの単離に使用した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：
５'-ATGCAGCTCCCACTGGCCCTG-３' （配列番号：３１）
逆方向ＰＣＲプライマー：
５'-CTAGTAGGCGTTCTCCAGCTCGGCCTG-３'
（配列番号：３２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ１０２８６３配列から作成した：
ハイブリダイゼーションプローブ：
５'-CTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTG-３' （配列番号：３３） 上記のような単離されたクローンのＤＮＡ配列は、全長ＰＲＯ７４７６ポリペプチド（ここでＤＮＡ１１５２５３−２７５７［図１９，配列番号：１９］と命名された）の全長ＤＮＡ配列、及びそのＰＲＯ７４７６ポリペプチドの誘導タンパク質配列を与える。
上記の同定された全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６２−６４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７０１−７０３の停止コドンで終端する（図１９；配列番号：１９）。予測されるポリペプチド前駆体は２１３アミノ酸長であり、約２４，０３１ダルトンの計算上の分子量及び約９．５９のｐＩを有する。図２０（配列番号：２０）に示した全長ＰＲＯ７４７６配列の分析は、図２０に示した種々の重要なポリペプチドドメインのの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は上記のようにおよそのものである。クローンＤＮＡ１１５２５３−２７５７は１９９９年８月３１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６１２が付与されている。
図２０（配列番号：２０）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ７４７６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W58704; P_W95711; P_W09408; P_Y12009; T08710; P_W44090; P_W27654; P_Y03225; LSHB_MELGA; AB011030_1との間の配列同一性を明らかにした。
遺伝子増幅
この実施例は、ＰＲＯ５８００−，ＰＲＯ６０００−，ＰＲＯ６０１６−，ＰＲＯ６０１８−，ＰＲＯ６４９６−，ＰＲＯ７１５４−，ＰＲＯ７１７０−，ＰＲＯ７４２２、ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６コード化遺伝子が或る種のヒト肺、結腸及び／又は乳癌及び／又は細胞系のゲノムで増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、ポリペプチドが結腸、肺、乳及び他の癌等の或る種の癌において治療的処置の有用な標的であることを示している。治療薬は、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ポリペプチドのアンタゴニストの形態をとりうることができ、例えばＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。
スクリーニングの出発物質は種々の癌から単離したゲノムＤＮＡである。ＤＮＡは、定量的、例えば蛍光的に正確である。ネガティブコントロールとして、ＤＮＡを１０の正常健常個体からＤＮＡを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ対照として使用した（示さず）。５’ヌクレアーゼアッセイ（例えばTaqMan(商品名)）及び実時間定量的ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System(商品名)(Perkin Elmer, applied Biosystems Division, Foster City, CA)）を、或る種の癌で潜在的に増幅される遺伝子の発見に使用した。結果は、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６をコードするＤＮＡがスクリーニングされた原発性肺又は結腸癌又は癌細胞系又は乳癌細胞系の何れかで過剰表現されるか否かを決定するために用いた。原発性肺癌は、表４に示した型及び段階の腫瘍を持つ個体から得た。表４に列挙した原発腫瘍及びこの実施例を通して参照される原発腫瘍及び細胞系の表示に使用した略語の説明は、上文に示されている。
TaqMan(商品名)の結果はデルタ(Δ)Ｃｔ単位で報告した。１単位は１ＰＣＲサイクル又は正常に対して約２倍の増幅に相当し、２単位は４倍、３単位は８倍増幅等々に相当する。定量化はプライマー及びＰＲＯ５８００−，ＰＲＯ６０００−，ＰＲＯ６０１６−，ＰＲＯ６０１８−，ＰＲＯ６４９６−，ＰＲＯ７１５４−，ＰＲＯ７１７０−，ＰＲＯ７４２２、ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６コード化遺伝子から誘導したTaqMan(商品名)蛍光プローブを用いて得た。独特の核酸配列を含む可能性が高く、イントロンをスプライシングしている可能性が少ないと思われるＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の領域がプライマー及びプローブ誘導に好適であり、例えば３-非翻訳領域である。ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６遺伝子増幅分析に使用したプライマー及びプローブ（正、逆及びプローブ）の配列は次の通りである：
ＰＲＯ５８００(ＤＮＡ１０８９１２−２６８０）：
１０８９１２．ｔｍ．ｆ１：
５'-GCGTCGTGGTCATCAAAG-３' （配列番号：３４）
１０８９１２．ｔｍ．ｒ１：
５'-TGCAGTCCACGGTGTAGAG-３' （配列番号：３５）
１０８９１２．ｔｍ．ｐ１：
５'-CTTCTACGTGGCCATGAACCGC-３' （配列番号：３６）
１０８９１２．ｔｍ．ｆ２：
５'-CCTGGAGATCCGCTCTGTA-３' （配列番号：３７）
１０８９１２．ｔｍ．ｐ２：
５'-CTTTGATGACCACGACGCCCA-３' （配列番号：３８）
１０８９１２．ｔｍ．ｒ２：
５'-ACGTAGAAGCCTGAGGACAC-３' （配列番号：３９）

ＰＲＯ６０００（ＤＮＡ１０２８８０−２６８９）：
１０２８８０．ｔｍ．ｆ１：
５'-GATGCTCCAGCTGAAATCC-３' （配列番号：４０）
１０２８８０．ｔｍ．ｒ１：
５'-CACATGGCTGGAAATGATG-３' （配列番号：４１）
１０２８８０．ｔｍ．ｐ１：
５'-AAGCTAAGCTCCCAACTGACAGCCA-３' （配列番号：４２）

ＰＲＯ６０１６（ＤＮＡ９６８８１−２６９９）：
９６８８１．ｔｍ．ｆ１：
５'-TGGCCTACATGTGTCTTCATC-３' （配列番号：４３）
９６８８１．ｔｍ．ｒ１：
５'-CACAACTTTCTGGTCATAT CCAT-３' （配列番号：４４）
９６８８１．ｔｍ．ｐ１：
５'-CCTGCCCCAAGACGGCATTAG-３' （配列番号：４５）

ＰＲＯ６０１８（ＤＮＡ９８５６５−２７０１）
９８５６５．ｔｍ．ｆ１：
５'-CCTGGGCACCAGATCTTC-３' （配列番号：４６）
９８５６５．ｔｍ．ｒ１：
５'-AGGGCAGTTGAGGCACTT-３' （配列番号：４７）
９８５６５．ｔｍ．ｐ１：
５'-CATCAGGGCCGGAGTAAATCCCT -３' （配列番号：４８）

ＰＲＯ６４９６（ＤＮＡ１１９３０２−２７３７）：
１１９３０２．ｔｍ．ｆ１：
５'-TCCATGGACCTCCCACTATAC-３' （配列番号：４９）
１１９３０２．ｔｍ．ｒ１：
５'-GCTGACAACTTCAGGTTCCA-３' （配列番号：５０）
１１９３０２．ｔｍ．ｐ１：
５'-ACCCCCACCAAACCCCAGGT-３' （配列番号：５１）

ＰＲＯ７１５４（ＤＮＡ１０８７６０−２７４０）：
１０８７６０．ｔｍ．ｆ１：
５'-GATCTCTGAGCACACTTGTATGAG-３' （配列番号：５２）
１０８７６０．ｔｍ．ｒ１：
５'-GGCAGACGAGGGTCTTTC-３' （配列番号：５３）
１０８７６０．ｔｍ．ｐ１：
５'-CAGGAACCCCTTGCTAGAATCAGCC-３' （配列番号：５４）

ＰＲＯ７１７０（ＤＮＡ１０８７２２−２７４３）：
１０８７２２．ｔｍ．ｆ１：
５'-CCCAGAAGGTTCCCATGA-３' （配列番号：５５）
１０８７２２．ｔｍ．ｒ１：
５'-GGGTCCTGTTGCCACATC-３' （配列番号：５６）
１０８７２２．ｔｍ．ｐ１：
５'-CAGCATGTCC AAGCCCCTAACCC-３' （配列番号：５７）

ＰＲＯ７４２２（ＤＮＡ１１９５３６−２７５２）：
１１９５３６．ｔｍ．ｆ１：
５'-TCTCCCCGATTCTCATCTG-３' （配列番号：５８）
１１９５３６．ｔｍ．ｒ１：
５'-CCCTGAGAGTCCTGCACAT-３' （配列番号：５９）
１１９５３６．ｔｍ．ｐ１：
５'-CCCATAATCATGGACACAGCCCC-３' （配列番号：６０）

ＰＲＯ７４３１（ＤＮＡ１１９５４２−２７５４）：
１１９５４２．ｔｍ．ｆ１：
５'-AGTGAAGTTTCTCCAGTCCCTAGT-３' （配列番号：６１）
１１９５４２．ｔｍ．ｒ１：
５'-CCTGGGGTAAGTGAGCAAA-３' （配列番号：６２）
１１９５４２．ｔｍ．ｐ１：
５'-CCTCTCTTTTCACCCACCTTCCTCAG-３' （配列番号：６３）

ＰＲＯ７４７６（ＤＮＡ１１５２５３−２７５７）：
１１５２５３．ｔｍ．ｆ１：
５'-GGGACTGGTTAAGAAAGTTGGAT-３' （配列番号：６４）
１１５２５３．ｔｍ．ｒ１：
５'-CGCCTCAGGCTTTCTGAT-３' （配列番号：６５）
１１５２５３．ｔｍ．ｐ１：
５'-AGATTCCCCCTTGCACCTCGC-３' （配列番号：６６）
５’ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光ＰＣＲベースの技術であり、実時間での増幅監視のためのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する。ＰＣＲ反応に典型的な単位複製配列の生成に２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計された。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素により非伸展性であり、レポーター蛍光染料及びクエンチャー蛍光染料で標識される。２つの染料がプローブ上に接近して位置する場合、レポーター染料からのレーザー誘導発光は消光染料によって消光される。増幅反応の間、プローブはＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりテンプレートに依存する形で切断される。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは第２のフルオロホアからの消光効果を受けない。レポーター染料の一分子は、新たに合成された各分子に対して遊離せしめられ、非消光レポーター染料の検出がデータの定量的解釈の基礎を提供する。
５’ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM配列検出などの実時間定量的ＰＣＲ装置で実施される。系は温度サイクル器、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及びコンピュータからなる。系は温度サイクル器上で96-ウェルでの試料を増幅させる。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルは、実時間で、光ファイバーケーブルで９６ウェルに集められ、ＣＣＤで検出される。系は装置の実行及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はＣｔ又は境界サイクルで表される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドを越えて蓄積されるサイクルとして定義される。正常なヒトＤＮＡの結果を癌ＤＮＡの結果と比較する場合に、△Ｃｔ値を核酸試料における特定の標的配列の出発コピー相対数の定量的尺度として使用した。
表４は、本発明のＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６化合物のスクリーニングに用いた種々の原発腫瘍の段階、Ｔ段階及びＮ段階を記載する。
Figure 2006006330
ＤＮＡ調製：
ＤＮＡは培養した細胞系、原発腫瘍、正常ヒト血液から調製した。単離は、全てQuiagenからの、精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と下記に従って実施した。
細胞培養溶解：
細胞を洗浄し、チップ当たり７．５ｘ１０８の濃度でトリプシン化し、４℃で５分間1000rpmで遠心分離してペレット化し、次いで１／２容量のＰＢＳ再遠心で洗浄した。ペレットを３回洗浄し、懸濁細胞を回収して２ｘＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を10mLのＰＢＳに懸濁させた。バッファーＣ１を４℃で平衡化させた。Quiagenプロテアーゼ#19155を６．２５mlの冷ｄｄＨ２Ｏで最終濃度20mg/mlまで希釈して４℃で平衡化させた。10mLのＧ２バッファーを、QuiagenＲＮＡｓｅＡストック（１００mg/ml）を２００μg/mlの最終濃度まで希釈して調製した。
バッファーＣ１（10mL、４℃）及びｄｄＨ２Ｏ（４０mL、４℃）を、次いで１０mlの細胞懸濁物に添加し、反転させて混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞核をBeckmanスイングバケットロータで４℃において２５００rpmで１５分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、核をボルテックスしながら2mlのバッファーＣ１（４℃）及び6mlのｄｄＨ２Ｏに懸濁し、４℃において２５００rpmで１５分間２回目の遠心分離をした。次いで核を残りのバッファー中にチップ当たり２００μlを用いて再懸濁した。Ｇ２バッファー（１０ml）を懸濁した核に添加しながら緩いボルテックスを適用した。バッファー添加が完了したら、強いボルテックスを３０秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ（２００μl、上記のように調製）を添加し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベートし、４℃で１０分間３０００ｘｇでペレット化する）。
固体ヒト腫瘍試料の調製及び溶解：
腫瘍試料を秤量し５０mlのコニカル管に配して氷上に保持した。加工は調製当たり２５０mgの組織未満に制限した（１チップ／調製）。プロテアーゼ溶液を６．２５mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度２０mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを最終濃度２００mg/mlまで希釈することによりＧ２バッファー（20ml）を調製した（１００mg/mlのストックから）。エアロゾルの吸入を避けるために層流ＴＣフード内でポリトロンの大きなチップを用いて、腫瘍組織を１９mlのＧ２バッファー中で６０秒間均一化し、室温に保持した。試料間で、各々２LのｄｄＨ２Ｏで２ｘ３０秒間、次いでＧ２バッファー（５０ml）でスピンさせることによりポリトロンを清浄化した。組織がジェネレータチップ上に存在する場合は、装置を分解して清浄化した。
Quiagenプロテアーゼ（上記のように調製、１．０ml）を添加し、次いでボルテックスして５０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベートし、４℃で１０分間３０００ｘgでペレット化する）。
ヒト血液調製及び溶解：
健常なボランティアから標準的な感染薬プロトコールを用いて血液を採りだし、チップ当たり１０mlの試料にクエン酸化した。Quiagenプロテアーゼを６．２５mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度２０mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを１００mg/mlのストックから最終濃度２００mg/mlまで希釈することによりＧ２バッファー（２０ml）を調製した。血液（１０ml）を５０mlのコニカル管に配し、１０mlのＣ１バッファー及び３０mlのｄｄＨ２Ｏ（ともに４℃で平衡化したもの）を添加し、反転させて混合して氷上に１０分間保持した。Beckmanスイングバケットローターで、４℃において２５００rpmで１５分間核をペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスしながら、核を２mlのＣ１バッファー（４℃）及び６mlのｄｄＨ２Ｏ（４℃）中に懸濁させた。ボルテックスはペレットが白くなるまで繰り返した。次いで核を残りのバッファー中に２００μlチップを用いて懸濁させた。Ｇ２バッファー（１０ml）を懸濁核に添加しながら緩くボルテックスし、次いで３０秒間強くボルテックスした。Quiagenプロテアーゼを添加（２００μl）し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに３０−６０分間インキュベートし、４℃で１０分間３０００ｘgでペレット化する）。
透明化溶解物の精製：
（１）ゲノムＤＮＡの単離：
ゲノムＤＮＡを１０mlのＱＢＴバッファーで平衡化した（最大チップ調製当たり１試料）。ＱＦ溶離バッファーを５０℃で平衡化した。試料を３０秒間ボルテックスし、次いで平衡化チップに負荷して重力により排液した。チップを２ｘ１５mlのＱＣバッファーで洗浄した。ＤＮＡを、３０mlのシラン化したオートクレーブ３０mlCortex管に１５mlのＱＦバッファー（５０℃）で溶離した。イソプロパノール（１０．５ml）を各試料に添加し、管をパラフィンで被覆し、ＤＮＡが沈殿するまで繰り返し反転させて混合した。試料を、ＳＳ-３４ロータで４℃において１５，０００rpmで１０分間遠心分離してペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨て、１０mlの70%エタノール（４℃）を添加した。試料を、ＳＳ-３４ロータで４℃において１０，０００rpmで１０分間遠心分離して再度ペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨てた。次いで管を乾燥棚の各面に置き、３７℃で１０分間乾燥させたが、使用の過剰乾燥には注意した。
乾燥後、ペレットを１．０mlのＴＥ（pH８．５）に溶解し、５０℃に１−２時間置いた。試料を４℃に終夜保持して溶解を続けた。次いでＤＮＡ溶液を、ツベルクリンシリンジ上に２６ゲージの針を具備する１．５ml管に移した。ＤＮＡを剪断するために移行を５ｘ繰り返した。次いで試料を５０℃に１−２時間置いた。
（２）ゲノムＤＮＡの定量及び遺伝子増幅アッセイのための調製：
各管のＤＮＡレベルを１：２０希釈（５μlＤＮＡ＋９５μlｄｄＨ２Ｏ）での標準的なＡ２６０、Ａ２８０スペクトルにより、Beckman ＤＵ６４０分光光度計の０．１ml石英キュベットを用いて定量した。Ａ２６０／Ａ２８０比率は１．８−１．９の範囲であった。次いで各ＤＮＡ試料をＴＥ（pH８．５）中に約２００ng/mlまで希釈した。最初の材料が高濃度（約７００ng/μl）である場合、材料を５０℃に再懸濁するまで数時間置いた。
次いで、希釈した材料（２０−６００ng/ml）に対して、製造者の指示を以下のように改変して蛍光ＤＮＡ定量を実施した。これは、Hoeffer DyNA Quant 200蛍光計を約１５分間暖めて実施した。Hoechst染料作業溶液（＃Ｈ３３２５８、１０μl、使用の１２時間以内に調製）を１００mlの1xＴＮＥバッファーに希釈した。２mlキュベットを蛍光計溶液で満たし、機械に配し、機械をゼロ調節した。ｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)（２μl、ロット＃３６０８５１０２６）を２mlの蛍光計溶液に添加して２００単位で校正した。次いで、さらに２μlのｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)ＤＮＡを試験し、４００＋／−１０単位で読みを確認した。次いで各試料を少なくとも３回読んだ。３試料が互いに１０％以内であることが見られたとき、それらの平均をとり、この値を定量化値として用いた。
次いで、蛍光測定で決定した濃度を、各試料をｄｄＨ２Ｏ中に１０ng/μlμまで希釈するのに用いた。これは、１回のTaqManプレートアッセイについて全てのテンプレート試料について同時に行い、５００−１０００アッセイを実施するのに十分な材料で行った。試料は、Taqman(商品名)プライマー及びプローブで３回試験し、Ｂ-アクチン及びＧＡＰＤＨともに正常なヒトＤＮＡを持ちテンプレート対照を持たない単一のプレート上にある。希釈した試料を用いたが、試験ＤＮＡから減算した正常ヒトＤＮＡのＣＴ値は+/-１ＣＴであった。希釈した、ロット定性化したゲノムＤＮＡを、１．０mlアリコートで−８０℃において保存した。続いて遺伝し増幅アッセイに使用するアリコートは、４℃で保存した。各１mlのアリコートは、８−９プレート又は６４試験に十分である。
遺伝子増幅アッセイ：
本発明のＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６化合物を以下の原発腫瘍でスクリーニングし、得られたΔＣｔ値を表５に報告する。
Figure 2006006330
議論と結論：
ＰＲＯ５８００（ＤＮＡ１０８９１２−２６８０）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ２７８６４-１１５５についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は、原発肺腫瘍：ＨＦ−００１６４４及びＨＦ−００１６４７で生じたＰＲＯ５８００をコードする核酸ＤＮＡ１０８９１２−２６８０の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１０８９１２−２６８０の増幅が種々の肺腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１０８９１２−２６８０にコードされるタンパク質（ＰＲＯ５８００）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ６０００（ＤＮＡ１０２８８０−２６８９）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ１０２８８０−２６８９についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は、原発肺腫瘍：ＨＦ−００１２９５で生じたＰＲＯ６０００をコードする核酸ＤＮＡ１０２８８０−２６８９の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１０２８８０−２６８９の増幅が種々の肺腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１０２８８０−２６８９にコードされるタンパク質（ＰＲＯ６０００）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ６０１６（ＤＮＡ９６８８１−２６９９）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ２７８６４-１１５５についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は（１）原発肺腫瘍ＨＦ−０００６４１；及び（２）原発大腸腫瘍中心：ＨＦ−０００６４１、ＨＦ−０００７８９、及びＨＦ−０００８１１で生じたＰＲＯ６０１６をコードする核酸ＤＮＡ９６８８１−２６９９の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ９６８８１−２６９９の増幅が種々の腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ９６８８１−２６９９にコードされるタンパク質（ＰＲＯ６０１６）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ６０１８（ＤＮＡ９８５６５−２７０１）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ９８５６５−２７０１についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は（１）原発肺腫瘍ＨＦ−０００８４０；及び（２）原発大腸腫瘍中心ＨＦ−０００８１１で生じたＰＲＯ６０１８をコードする核酸ＤＮＡ９８５６５−２７０１の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ９８５６５−２７０１の増幅が種々の腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ９８５６５−２７０１にコードされるタンパク質（ＰＲＯ６０１８）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ６４９６（ＤＮＡ１１９３０２−２７３７）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ１１９３０２−２７３７についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は、原発肺腫瘍：ＨＦ−０００８４２、ＨＦ−００１２９４及びＨＦ−００１２９６で生じたＰＲＯ６４９６をコードする核酸ＤＮＡ１１９３０２−２７３７の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１１９３０２−２７３７の増幅が種々の肺腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１１９３０２−２７３７にコードされるタンパク質（ＰＲＯ６４９６）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ７１５４（ＤＮＡ１０８７６０−２７４０）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ１０８７６０−２７４０についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は、原発肺腫瘍：ＨＦ−００１２９６及ＨＦ−００１２９９で生じたＰＲＯ７１５４をコードする核酸ＤＮＡ１０８７６０−２７４０の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１０８７６０−２７４０の増幅が種々の肺腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１０８７６０−２７４０にコードされるタンパク質（ＰＲＯ７１５４）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ７１７０（ＤＮＡ１０８７２２−２７４３）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ１０８７２２−２７４３についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は、原発肺腫瘍ＨＦ−００１２９６で生じたＰＲＯ７１７０をコードする核酸ＤＮＡ１０８７２２−２７４３の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１０８７２２−２７４３の増幅が肺腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１０８７２２−２７４３にコードされるタンパク質（ＰＲＯ７１７０）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ７４２２（ＤＮＡ１１９５３６−２７５２）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ１１９５３６−２７５２についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は、原発肺腫瘍：ＨＦ−００１６４７で生じたＰＲＯ７４２２をコードする核酸ＤＮＡ１１９５３６−２７５２の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１１９５３６−２７５２の増幅が肺腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１１９５３６−２７５２にコードされるタンパク質（ＰＲＯ７４２２）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ７４３１（ＤＮＡ１１９５２４−２７５４）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ１１９５２４−２７５４についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は（１）精巣腫瘍中心ＨＦ−０００７３３；及び（２）原発大腸腫瘍中心：ＨＦ−０００５３９；及び（３）原発肺腫瘍：ＨＦ−０００８４２、及びＨＦ−００１２９６で生じたＰＲＯ７４３１をコードする核酸ＤＮＡ１１９５２４−２７５４の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１１９５２４−２７５４の増幅が種々の腫瘍で生じるので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１１９５２４−２７５４にコードされるタンパク質（ＰＲＯ７４３１）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ＰＲＯ７４７６（ＤＮＡ１１５２５３−２７５７）：
種々の腫瘍におけるＤＮＡ１１５２５３−２７５７についてのΔＣｔ値を表５に報告する。ΔＣｔ＞１は典型的に増幅評点化の閾値として用い、これは２倍の遺伝子コピーを表す。表５は（１）精巣腫瘍中心ＨＦ−０００７３３；及び（２）原発大腸腫瘍中心ＨＦ−０００５３９及びＨＦ−０００５７５；及び（３）原発肺癌ＨＦ−００１２９４及びＨＦ−００１２９６で生じたＰＲＯ７４７６をコードする核酸ＤＮＡ１１５２５３−２７５７の有意な増幅を示す。
ＤＮＡ１１５２５３−２７５７の増幅が種々の腫瘍で生じたので、それは腫瘍形成又は成長において有意な役割を果たす可能性が高い。結果として、ＤＮＡ１１５２５３−２７５７にコードされるタンパク質（ＰＲＯ７４７６）に対するアンタゴニスト（例えば抗体）は、癌治療における有用性を持つと予測される。
ハイブリダイゼーションプローブとしてのＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の利用
以下の方法は、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６をコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。
ここに開示した全長又は成熟「ＰＲＯ５８００」，「ＰＲＯ６０００」，「ＰＲＯ６０１６」，「ＰＲＯ６０１８」，「ＰＲＯ６４９６」，「ＰＲＯ７１５４」，「ＰＲＯ７１７０」，「ＰＲＯ７４２２」、「ＰＲＯ７４３１」又は「ＰＲＯ７４７６」ポリペプチドのコード化配列を含んでなるDNA及び／又はその断片は、ヒト組織cDNAライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同的なDNA（例えば、ＰＲＯ７１７０、ＰＲＯ７４２２、ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーDNAを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高いストリンジェントな条件で実施した。放射標識ＰＲＯ誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘSSC、０．１％SDS、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード溶液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘSSC及び０．１％SDSの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６をコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
大腸菌におけるのＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の非グリコシル化形態の調製を例示する。
ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来のもの；Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリ-Ｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴIIコドン、ポリ-Ｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６コードする領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、Sambrookら, 上掲に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
数時間の培養の後、遠心分離による集菌が可能である。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６タンパク質を、タンパク質が堅く結合する条件下で金属キレート化カラムを用いて精製した。
以下の手法を用いて、ポリ-Ｈｉｓ（ポリ-ヒス）タグ形態でＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６を大腸菌で発現させてもよい。ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６をコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) cllpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（3.57gの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１gのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７gのＫＣｌ、５．３６gのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００mL水中の５．３６gのShefield hycase SF、並びに１１０mMのＭＰＯＳ、pH７．３、０．５５%（w/v）のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
０．５から1Lの発酵（６−１０gペレット）からの大腸菌ペーストを、７Mのグアニジン、２０mMのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００rpmで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５mlのQiagen Ni+2-NTA金属キレートカラムに負荷した。カラムを５０mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を２５０mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０nmにおけるその吸収により見積もった。
試料を、２０mMのトリス、pH８．６、０．３MのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０mMのグリシン及び１mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２ンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の再生したＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ６．８に調製した。
哺乳動物細胞におけるＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６のグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ307,247参照のこと）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、Sambrookら, 上掲に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、各々ｐＲＫ５−［ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６］と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−［ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６］ＤＮＡを約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μＣｉ／ml３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ml３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ポリペプチドの存在を現すとして選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ ＤＮＡは、Somparyacら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−［ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６］ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を２０%グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μg/mlウシインシュリン及び０．１μｇ/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−［ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６］ベクターは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６を含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ＨｉｓタグＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ＨｉｓタグＰＲＯを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。 また，一過性発現法によって、ＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞の発現を完遂させてもよい。
ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６は、一過性発現法によってＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＣＨＯ細胞における安定な発現は，以下の方法を用いて実施することが可能である。タンパク質を、各タンパク質の可溶形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現する。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucasらに記載されているように成長させた。約３ｘ１０７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０mLの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０mLの選択培地（０．２μm濾過ＰＳ２０、５％の０．２μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０mLの選択培地を含む１００mlスピナーに分けた１−２日後、細胞を１５０mLの選択培地を満たした２５０mLスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後、２５０mL、５００mL及び２０００mLのスピナーを３ｘ１０<SUP>５</SUP>細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０<SUP>６</SUP>細胞/mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、５００g/Lのグルコース及び０．６mLの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０mLとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷した。
ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi+2-NTAカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのHepes、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μｌの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン（Edman）分解によりＮ−末端アミノ酸配列決定した。
酵母菌でのＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからの ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。 ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入して ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の細胞内発現を指示する。分泌のために、 ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば） ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を示す。 ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６コードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６コード化配列，又はＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６のコード化配列の所望する部分［例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列］が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
次に、発現されたポリ-ＨｉｓタグＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６は、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＭのHepes、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ EDTA；１０％グリセロール；０．１％のNP-40；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０mMリン酸塩、３００mMのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μmフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、２５mLの水で洗浄し、２５mLの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５mLでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMリン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００mMイミダゾール勾配で展開した。１mLの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６を含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ＰＣＲ増幅に続いて、各コード化配列をバキュロウィルス発現ベクター（ＩｇＧ融合のためのpb.PH.ＩｇＧ及びポリ-Ｈｉｓタグタンパク質のためのpb.PH.His.c）中にサブクローニングし、ベクターとBaculogold（商品名）バキュロウィルスＤＮＡ（Pharmingen）を１０５のSpodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（Gibco-BRL）を用いて同時形質移入した。pb.PH.ＩｇＧ及びpb.PH.Hisは商業的に利用できるバキュロウィルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmingen）の改変物で、Ｈｉｓ又はＦｃタグ配列を含む修飾ポリリンカー領域を持つ。１０％ＦＢＳを補填したＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＨ培地（Hyclone）で細胞を増殖させた。細胞を２８℃で５日間インキュベートした。上清を収集し、続いて１０％ＦＢＳを補填したHinkのＴＮＭ−ＦＨ培地中のＳｆ９細胞を１０のおよその感染効率（MOI）で感染させることにより最初のウィルス増幅に使用した。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を収集し、バキュロウィルス発現ベクター中における作成物の発現を、ヒスチジンタグタンパク質に対して２５ｍＬのＮｉ+2−ＮＴＡビード（QIAGEN）へ、又はＩｇＧタグタンパク質に対してプロテイン−ＡセファロースＣＬ−４Ｂビード（Pharmacia）へ１ｍｌの上清をバッチ結合させ、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行って、クーマシーブルー染色により既知の濃度のタンパク質標準と比較することにより決定した。
最初のウィルス増幅上清は、０．１のおよそのＭＯＩでＥＳＦ−９２１培地（Expression Systems LLC）中で増殖したＳｆ９細胞の撹拌培養（５００ｍｌ）を感染させるために使用した。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を収集し、濾過した。撹拌培養の発現が確認されるまでバッチ結合とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地（０．５から３Ｌ）を遠心分離により収集して細胞を除去し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ-Ｈｉｓタグ作成物に対しては、Ｎｉ+2−ＮＴＡカラム（Qiagen）を使用してタンパク質作成物を精製した。精製前に、５ｍＭの濃度まで条件培地にイミダゾールを添加した。条件培地を、４℃で４−５ml/minの流量で２０ｍＭ Hepes、ｐＨ７．４、０．３ＭのＮａＣｌと５ｍＭのイミダゾールを含むバッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ+2−ＮＴＡカラムに汲み上げた。充填後、カラムを更なる平衡化バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化バッファーで溶出させた。高度に精製されたタンパク質は続いて２５ｍｌのＧ２５ Superfine（Pharmacia）カラムで１０ｍＭ Hepes、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を次のようにして条件培地から精製した。２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８で平衡化された５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）に条件培地を汲み上げた。充填後、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５での溶出前にカラムを平衡化バッファーで十分に平衡化した。溶出したタンパク質を、２７５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ９を含むチューブ中に１ｍｌのフラクションを収集することにより即座に中和させた。高度に精製したタンパク質を上述のようにポリ-Ｈｉｓタグタンパク質の貯蔵バッファー中に脱塩した。タンパク質の一様性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動法とエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定により証明した。
あるいは、修飾バキュロウイルス法をhigh5細胞取り込みに使用してもよい。この方法では、所望の配列をコードするＤＮＡは、Ｐｆｕ（Stratagene）等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流（５’−）に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域等）を含む。種々のプラスミドを用いることができ、ｐＩＥ−１（Novagen）等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む。ｐＩＥ−１及びｐＩＥ−２ベクターは、安定に形質転換された昆虫細胞におけるバキュロウイルスｉｅ１プロモーターからの組換えタンパク質の構成的発現のために設計される。このプラスミドは複数のクローニング部位の方向においてのみ相違し、未感染昆虫細胞におけるｉｅ１媒介遺伝子発現に重要であることが知られた全てのプロモーター配列並びにｈｒ５エンハンサー成分を含む。ｐＩＥ−１及びｐＩＥ−２はｉｅ翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の製造に使用できる。簡単には、ＰＲＯポリペプチドの所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５’プライマーは隣接する（選択された）制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、ｐＩＥ１−１の誘導体はヒトＩｇＧ（pb.PH.IgG）のＦｃ領域又はＮＡＭＥ配列の８ヒスチジン（pb.PH.His）タグ下流（３’−）を含むことができる。好ましくは、確認のために、構築ベクターの配列の確認する。
High-5細胞は、２７℃、ＣＯ２無し、ペン／ストレプトト無しの条件下で５０％の集密度まで成長させた。１５０ｍｍプレート各々について、３０μｇのＰＲＯポリペプチドを含むｐＩＥベースベクターを１ｍｌのＥｘ−細胞培地（媒質：Ｅｘ−細胞４０１＋１／１００のＬ−Ｇｌｕ ＪＲＨ Biosciences ＃１４４０１−７８Ｐ（注：この媒質は軽感受性））と混合し、別の管において、１００μｌのセルフェクチン（CellFECTIN（Gibco BRL #10362-010）（ボルテックスで混合））を１ｍｌのＥｘ−細胞培地と混合した。２つの溶液を混合し、室温で１５分間インキュベーションした。８ｍｌのＥｘ−細胞培地を２ｍｌのＤＮＡ／セルフェクチン混合物に添加し、Ｅｘ−細胞培地で１回洗浄したＨｉ５細胞上に層形成させた。次いでプレートを暗中室温でインキュベートした。次いでＤＮＡ／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をＥｘ−細胞で１回戦乗して過剰のセルフェクチンを除去した。３０ｍｌの新鮮なＥｘ−細胞培地を添加し、細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収して、バキュロウイルス感染ベクターでのＰＲＯポリペプチドの発現を、１ｍｌの上清の２５ｍＬのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。
形質移入細胞からの条件培地（０．５〜３Ｌ）を、遠心分離により細胞を除去し０．２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ−Ｈｉｓタグ作成物については、タンパク質作成物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのHepes，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのHepes、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー、ｐＨ６．８中で２５ｍｌのＧ２５Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５ｍＬの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。ＰＲＯポリペプチドの均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン（Edman）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ７１５４、ＰＲＯ７１７０、及びＰＲＯ７４７６は、上記のhigh-５細胞を用いたバキュウロウイルスの方法によって発現された。
ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６を含むＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＰＲＯ５８００，抗ＰＲＯ６０００，抗ＰＲＯ６０１６，抗ＰＲＯ６０１８，抗ＰＲＯ６４９６，抗ＰＲＯ７１５４，抗ＰＲＯ７１７０，抗ＰＲＯ７４２２，抗ＰＲＯ７４３１，又は抗ＰＲＯ７４７６抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ５８００、ＰＲＯ６０００、ＰＲＯ６０１６、ＰＲＯ６０１８、ＰＲＯ６４９６、ＰＲＯ７１５４、ＰＲＯ７１７０、ＰＲＯ７４２２、ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６の静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ５８００，ＰＲＯ６０００，ＰＲＯ６０１６，ＰＲＯ６０１８，ＰＲＯ６４９６，ＰＲＯ７１５４，ＰＲＯ７１７０，ＰＲＯ７４２２，ＰＲＯ７４３１又はＰＲＯ７４７６に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲＯ５８００，抗ＰＲＯ６０００，抗ＰＲＯ６０１６，抗ＰＲＯ６０１８，抗ＰＲＯ６４９６，抗ＰＲＯ７１５４，抗ＰＲＯ７１７０，抗ＰＲＯ７４２２，抗ＰＲＯ７４３１，又は抗ＰＲＯ７４７６モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
材料の寄託：
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９米国(ＡＴＣＣ)に寄託した：
材料 ATCC寄託番号 寄託日
DNA108912-2680 PTA-124 1999年5月25日
DNA102880-2689 PTA-383 1999年7月20日
DNA96881-2699 PTA-553 1999年8月17日
DNA98565-2701 PTA-481 1999年8月3日
DNA119302-2737 PTA-520 1999年8月10日
DNA108760-2740 PTA-548 1999年8月17日
DNA108722-2743 PTA-552 1999年8月17日
DNA119536-2752 PTA-551 1999年8年17日
DNA119542-2754 PTA-619 1998年8月31日
DNA115253-2757 PTA-612 1998年8月31日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
ヌクレオチド配列（配列番号：１）が、ここにおいてＤＮＡ１０８９１２−２６８０と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５８００をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図１に示された配列番号：１のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ５８００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）。 ヌクレオチド配列（配列番号：３）が、ここにおいてＤＮＡ１０２８８０−２６８９と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０００をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図３に示された配列番号：３のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ６０００ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４）。 ヌクレオチド配列（配列番号：５）が、ここにおいてＤＮＡ９６８８１−２６９９と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０１６をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図５に示された配列番号：５のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ６０１６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）。 ヌクレオチド配列（配列番号：７）が、ここにおいてＤＮＡ９６５６５−２７０１と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０１８をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図７に示された配列番号：７のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ６０１８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８）。 ヌクレオチド配列（配列番号：９）が、ここにおいてＤＮＡ１１９３０２−２７３７と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６４９６をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図９に示された配列番号：９のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ６４９６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１０）。 ヌクレオチド配列（配列番号：１１）が、ここにおいてＤＮＡ１０８７６０−２７４０と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７１５４をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図１１に示された配列番号：１１のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ７１５４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２）。 ヌクレオチド配列（配列番号：１３）が、ここにおいてＤＮＡ１０８７２２−２７４３と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７１７０をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図１３に示された配列番号：１３のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ７１７０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４）。 ヌクレオチド配列（配列番号：１５）が、ここにおいてＤＮＡ１１９５３６−２７５２と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７４２２をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図１５に示された配列番号：１５のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ７４２２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６）。 ヌクレオチド配列（配列番号：１７）が、ここにおいてＤＮＡ１１９５４２−２７５４と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７４３１をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図１７に示された配列番号：１７のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ７４３１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１８）。 ヌクレオチド配列（配列番号：１９）が、ここにおいてＤＮＡ１１５２５３−２７５７と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７４７６をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）。また、太字及び下線部は、それぞれ開始及び終止コドンである。 図１９に示された配列番号：１９のコード化配列より誘導された、天然配列ＰＲＯ７４７６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２０）。

Claims (21)

  1. 配列番号：１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された核酸。
  2. （ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料、及び、（ｂ）同じ細胞型の既知の正常細胞のコントロール試料から配列番号：１６で示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸からなる遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなり、コントロール試料と比較して試験試料でのより高い発現レベルが、試験組織細胞が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示す、哺乳動物における腫瘍を検査する方法。
  3. 前記試験試料が腫瘍細胞の成長又は増殖があると疑われる個体から得られた、請求項２の方法。
  4. 同じ組織型の正常細胞と比較して、配列番号：１６で示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドを過剰発現する肺腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞を、前記ポリペプチドをコードする塩基配列又はその相補鎖とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量に曝露することを含んでなり、前記腫瘍細胞の成長がそれによって阻害される前記方法。
  5. 前記腫瘍細胞が、さらに放射線治療、細胞毒性剤又は化学療法剤へ曝露される、請求項４の方法。
  6. 以下の(a)又は(b)のポリペプチドをコードする単離された核酸：
    (a) 配列番号：１６に示されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
    (b) アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチド。
  7. 以下の(a)又は(b)の単離された核酸：
    (a) 配列番号：１５に示されているにヌクレオチド配列からなる核酸；及び
    (b) (a)の核酸と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチドをコードする核酸。
  8. 以下の(a)又は(b)の単離された核酸：
    (a) 配列番号：１５で示されるヌクレオチド配列の完全長コード化配列からなる核酸；及び
    (b) (a)のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチドをコードする核酸。
  9. 以下の(a)又は(b)の単離された核酸：
    (a) ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−５５１で寄託されたＤＮＡの完全長コード化配列からなる核酸；及び
    (b) (a)の核酸と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチドをコードする核酸。
  10. 請求項７〜９の何れか一項の核酸を含んでなるクローニングベクター。
  11. ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列と作用可能に連結している請求項１０のベクター。
  12. 請求項１０のベクターを含んでなる宿主細胞。
  13. 前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１２の宿主細胞。
  14. 前記細胞が大腸菌である、請求項１２の宿主細胞。
  15. 前記細胞が酵母細胞である、請求項１２の宿主細胞。
  16. 前記細胞がバキュロウイルス感染昆虫細胞である、請求項１２の宿主細胞。
  17. 配列番号：１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１２の宿主細胞を培養すること、及び、細胞培養から前記ポリペプチドを回収することを含んでなる、前記ポリペプチドを生産する方法。
  18. 以下の(a)又は(b)の単離されたポリペプチド：
    (a) 配列番号：１６に示されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
    (b) アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチド。
  19. 以下の(a)又は(b)の単離されたポリペプチド：
    (a) ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−５５１で寄託されたＤＮＡによってコードされているアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
    (b) アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチド。
  20. 以下の(a)又は(b)の単離された核酸：
    (a)配列番号：１６に示されているアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列の１位〜１５位に位置するシグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードする核酸；及び
    (b) (a)のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチドをコードする核酸。
  21. 以下の(a)又は(b)の単離されたポリペプチド：
    (a) 配列番号：１６に示されているアミノ酸配列からなり、該アミノ配列の１位〜１５位に位置するシグナルペプチドを欠くポリペプチド；及び
    (b) アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加された(a)のアミノ酸配列からなり、かつ肺腫瘍細胞において過剰発現しているポリペプチド。
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