JP2006003543A - 顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】 複数の反射界面をもつ観察体においても安定したピント合わせが可能なオートフォーカス技術を提供する。
【解決手段】 利用者に観察部位を入力させる、観察部位に最も近い反射界面が前記対物レンズの異動先である反射界面と異なる場合、厚み情報のうち必要な情報を用いて、対物レンズを観察部位に最も近い反射界面まで移動させる。上記の反射界面のうちオートフォーカス動作により検出可能なものが唯一である場合、アクティブオートフォーカス動作により上記の唯一の反射界面に一旦合焦させ、厚み情報のうち必要な情報を用いて、対物レンズを現在の位置から観察部位に最も近い反射界面まで移動させる。
【選択図】 図８

Description

本発明は、概してオートフォーカス機能を備えた顕微鏡システムに関し、さらに詳細には、そのような顕微鏡システムにおいて観察対象（観察体または標本とも言う）に自動的に焦点を合わせる技術に関する。

近年、顕微鏡を用いて検査や記録などを行う装置は、各種機能面の自動化が進んでおり、標本にピント合わせを行うオートフォーカス（以下、ＡＦと略す）機能も自動化の必須項目となっている。これに伴い、オートフォーカスに関する種々の提案がなされている。

例えば、アクティブ方式のＡＦを用いて標本を封入するスライドガラスやカバーガラスに赤外線反射膜を施し、その膜に対してレーザを投射してその反射光により、ピント合わせを行う方法がある（特許文献１）。

また、使用する対物レンズにより、対物レンズに応じたオートフォーカス制御パラメータを用いてオートフォーカス動作を行う方法がある（特許文献２）。
さらに、スライドガラスの厚みに応じて対物レンズとステージとの距離を調節する方法もある（特許文献３）。
特開昭５８−６３９０６ 特開平１０−２０２０９（第６頁、図３） 特開平１０−３９１９９（第３頁、図１）

図１３はオイル対物レンズを用いた従来技術による顕微鏡オートフォーカスのモデルである。同図のように対物レンズ３から出射したレーザ光Ｌは、オイルＯＬと標本Ｓｓを乗せたガラスＳｇを通過して培養液ＳｃとガラスＳｇとの境界に形成されるレーザ反射界面ＲＢにより反射される。これはオイルＯＬとガラスＳｇの屈折率がほぼ一致している（屈折率：ｎ＝１．４）のに対し、ガラスＳｇと培養液Ｓｃ（ｎ＝１．３）とでは屈折率に差があるためである。反射したレーザ光Ｌｒは再び対物レンズ３に入射し、この反射レーザ光Ｌｒを用いて、例えば特許文献１のように合焦制御を行ってピント合わせを行う。

なお、本明細書においては、標本Ｓｓ、培養液Ｓｃ、およびこれらを載せたガラスＳｇを一括して観察対象Ｓと称する。
反射レーザ光Ｌｒは対物レンズ３によりその強度や反射光分布が異なるため、それに応じた制御が必要である。特許文献２では、光路中の（使用中の）対物レンズ３に適したＡＦ制御の方法が開示されており、合焦時における焦準部の速度を最適化することにより、対物レンズ３によらず安定してピントあわせが可能である。

図１４は対物レンズ３に水（ＷＴ）浸対物レンズを用いた場合のモデルである。同図のように水浸対物レンズ３使用時には水ＷＴ（屈折率ｎ＝１．３）とガラスＳｇ（ｎ＝１．４）との界面ＲＢ１、およびガラスＳｇ（同）と培養液Ｓｃ（ｎ＝１．３）との界面ＲＢ２の２カ所でレーザ反射が生じる。このような屈折率の界面が２カ所ある場合、従来の技術では合焦と判断する場所が２カ所存在してしまうため、安定したピント合わせを行うことができない。

一方、特許文献３では、ガラスの厚みを計測し、その厚みに応じて、合焦位置を予測して標本をサーチする範囲を変更する技術が開示されている。しかし、図のように合焦点が２カ所ある場合には、反射レーザ光Ｌｒα（α＝１or２）が水−ガラス界面ＲＢ１およびガラス−培養液界面ＲＢ２の何れによって反射されたものであるか判断することができないため、ように安定したＡＦ制御を行うことはできない。また、この複数の界面ＲＢ１およびＲＢ２からの反射光Ｌｒ１およびＬｒ２は対物レンズ３とガラスＳｇの厚みにより反射強度分布が異なるため、ガラスＳｇの厚み情報のみではＡＦ制御を正確に行うことは不可能である。上述の現象は、ドライ対物レンズにおいても、空気（ｎ＝１．０）−ガラス（ｎ＝１．４）界面およびガラス（同）−培養液（ｎ＝１．３）界面において発生するため、ドライ対物レンズでも安定したＡＦ制御を行うことができない。

本発明は以上のような問題を解決するものであり、その目的は、複数の反射界面をもつ観察体においても安定したピント合わせを行うことができる顕微鏡システムを提供することにある。

本発明の一面によれば、少なくとも２つの反射界面をもつ観察体を乗せるステージと、対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズとの光軸に沿った相対距離を変化させる手段とを備えた顕微鏡システムにおいて、少なくともアクティブオートフォーカス方式により前記変化を制御する顕微鏡オートフォーカスシステムを与える。本システムは、上記の少なくとも２つの反射界面の間にある媒体の厚み情報と対物レンズの対物レンズ情報により上記制御の方法を変更する制御方法変更手段を含むことを特徴とする。

好ましい実施形態による制御方法変更手段は、上記の少なくとも２つの反射界面の間にある媒体の厚み情報を格納する手段と、対物レンズの可動範囲を定義する第１および第２の限界位置を格納する手段と、対物レンズの焦点が上記の少なくとも２つの反射界面で挟まれた領域の外側にある場合、第１および第２の限界位置のうち近い方の限界位置に対物レンズを一度移動させてから、アクティブオートフォーカス動作により、現在の焦点位置から最も近い最近反射界面まで対物レンズを移動させる手段と、利用者が観察部位を入力することを可能とする手段と、観察部位に最も近い反射界面が対物レンズの異動先である反射界面と異なる場合、厚み情報のうち必要な情報を用いて、対物レンズを観察部位に最も近い反射界面まで移動させる手段とを備える。

本発明の顕微鏡オートフォーカスシステムは、上記の少なくとも２つの反射界面のうちオートフォーカス動作により検出可能なものが唯一であるか否かを判断する判断手段と、オートフォーカス動作により検出可能な反射界面が唯一である場合、アクティブオートフォーカス動作により上記の唯一の反射界面に合焦させる手段と、厚み情報のうち必要な情報を用いて、対物レンズを現在の位置から観察部位に最も近い反射界面まで移動させる手段とをさらに含んでもよい。

本発明の顕微鏡オートフォーカスシステムは、アクティブオートフォーカス動作により検出可能な反射界面が唯一でない場合、現在の焦点位置に最も近い最近反射界面を中心とするサーチ範囲を決定する手段と、決定したサーチ範囲でアクティブオートフォーカス動作により、最近反射界面に合焦させる手段と、厚み情報のうち必要な情報を用いて、対物レンズを現在の位置から観察部位に最も近い反射界面まで移動させる手段とをさらに含んでもよい。

上記の少なくとも２つの反射界面が、ガラスの両面であり、上記判断手段に、ガラスの厚さ、および各反射界面における反射強度分布範囲に基づいて判断する手段を含めてもよい。

一実施例では、上記の少なくとも２つの反射界面が、ガラスの両面であり、上記判断手段が、ガラスの厚さ、および対物レンズの情報に基づいて判断する手段を含む。
一実施例では、上記の情報が、水浸、ドライおよび油浸などの対物レンズの使用形態、倍率、開口数の少なくとも１つを含む。

好ましい実施例では、上記の判断手段が、利用可能な対物レンズの各々に対する水浸、ドライおよび油浸などの当該対物レンズの使用形態、倍率、開口数の少なくとも１つのデータを当該対物レンズの識別情報とともに収容したテーブルを参照する手段を含む。

本発明の顕微鏡システムは、対物レンズ情報と界面間隔情報により合焦制御を変更させ、観察体に照射するレーザ光の反射界面が複数存在する状況でも安定したピント合わせを行うことができる。

以下、本発明の実施形態と添付図面とにより本発明を詳細に説明する。なお、複数の図面に同じ要素を示す場合には同一の参照符号を付ける。
〔第１の実施形態〕
第１図は、本発明の第１の実施形態による顕微鏡システムの全体構成をす。図１において、顕微鏡システム１００は、観察対象Ｓ（これは、上記のガラスＳｇ、培養液Ｓｃおよび細胞Ｓｓなどをまとめて示したものである）を乗せる固定ステージ１、照明用光源２７、平行光生成レンズ２８，ミラー２９、集光レンズ３０、複数の対物レンズ３、これらの対物レンズ３を取り付け回転可能な電動レボルバ２、任意の対物レンズ３を光路中に挿入できるようにレボルバ２を回転させるレボルバ用モータ１７、レボルバ２のどの対物レンズ取り付け位置が現在光路中に挿入されているかを検出する為のレボ穴位置検出部１８、およびレボルバ２を光軸方向に移動させる焦準用モータ２１を備えている。さらに、顕微鏡システム１００は、使用者が入力するための操作部２３、操作部２３からの入力情報とレボ穴位置検出部１８からの使用中の対物レンズ３の情報に基づきシステム全体を制御するコントロール部１５、コントロール部１５からの制御信号に基づいてレボルバ用モータ１７を駆動するレボルバ用モータ駆動部１６および焦準用モータ２１を駆動する焦準用モータ駆動部２０を備える。

観察対象Ｓは、固定ステージ１の上に乗せられ、対物レンズ３で下側から観察できるようになっている。
コントロール部１５は周知のＣＰＵ回路であり、第２図に示す如く、ＣＰＵ本体３０と、システムを制御するためのプログラムを格納するＲＯＭ３１と、制御に必要なデータを格納するＲＡＭ３２と、制御信号の入出力を行うＩ／Ｏポート３３、及びＣＰＵを制御する為に必要な図示しない発振器、アドレスデコーダー等の周知の周辺回路から構成される。このＩ／Ｏポート３３やデータバス３４から、各々の周辺装置の制御を行うことになる。また、コンロトール部１５は、システム導入後に発生する種々の設定データが保存できるように、不揮発性メモリ（図示せず）を備えてもよい。

また、操作部２３は、各種操作スイッチを備え、ＡＦ開始／停止や対物レンズの切り替え等の操作やガラス厚などのＡＦに関する必要情報の入力を、観察者が行えるようになっている。さらに、操作部２３は、ＪＯＧダイアル２４を備え、これによりレボルバ２の上下移動が容易にできるようにすることが好ましい。

顕微鏡システム１００は、オートフォーカス手段として、レーザ駆動部１９、基準光源４、コリメートレンズ５、投光側ストッパ６、変更ビームスプリッタ（ＰＢＳ）７，集光レンズ群８，色差補正レンズ群９、λ／４版１０、ダイクロックミラー１１、ＰＢＳ７を通過した戻り光を集光する集光レンズ群１２、集光レンズ群１２からの光を受光する受光センサ１３、受光センサ１３の出力を後述のように処理してコントロール部１５に渡す信号処理部１４、色差補正レンズ群９を光軸方向に動かす色差補正レンズ駆動モータ２６、および色差補正レンズ駆動部２５を備える。

オートフォーカスに使用される基準光源４としては、赤外線レーザ等の可視外光波長領域の光源が使用される。レーザ駆動部１９は、基準光源４の強弱を制御しながら、光源４をパルス点灯させる。基準光源４からのレーザ光は、平行光を保つ為のコリメートレンズ５を通り、光束径の半分を投光側ストッパ６によりカットされる。その後、ＰＢＳ７でＰ偏光成分のみが反射され、標本側に導かれる。

集光レンズ群８により一旦集光された光束は、色収差補正レンズ群９を通過する。この色収差補正レンズ群９は、色収差補正レンズ群駆動用モータ２６により光軸方向に移動することにより、観察光と赤外線レーザの色収差補正を可能とし、ＡＦを行うとピントのあった目視観察が可能となる。

色収差補正レンズ群９を通過した光は、λ／４板１０を通過する時に４５°偏光され、ダイクロイックミラー１１に入射する。ダイクロイックミラー１１では、赤外域のみ反射されるため、レーザ光束は反射される。

反射された光束は、対物レンズ３により観察対象Ｓにスポット形状の像を形成する。そして、観察対象Ｓにより反射された光束は、逆に対物レンズ３、ダイクロイックミラー１１を通り、λ／４板１０を再び通過する時に更に４５°偏光され、Ｓ偏光成分に切り換わる。さらに、色収差補正レンズ群９、集光レンズ群８を経て、ＰＢＳ７に入射される。この時、光束は、Ｓ偏光成分になっているので、そのままＰＢＳ７を透過し、集光レンズ群１２を通過した後に受光センサ１３に結像する。

受光センサ１３は、光軸を中心に設置された２分割フォトダイオードからなる。受光センサ１３に結像されたスポットは、観察対象Ｓが対物レンズ３のピント位置にある場合は、図３Ｂに示すように、範囲が狭く高い信号強度となり、ピント位置より上側（後ピン位置）にある場合は図３Ａのように、Ｂの範囲に偏った強度分布となり、下側（前ピン位置）にある場合は図３Ｃのように、Ａの範囲に偏った強度分布となり、それぞれ図４（ａ）に示したセンサ信号に変換される。変換された検出信号は、信号処理部１４で、ＡとＢの範囲に分割され、それぞれの範囲における強度の総和が算出される。従って図４(ａ)に示すように、横軸を対物レンズ３のピント位置に対する観察対象Ｓの相対位置、縦軸をそれぞれの受光センサに入射する光強度とすると、ピント位置を挟んで左右対称なＡ，Ｂ２つのカーブが検出できる。

この信号はコントロール部１５に入力される。コントロール部１５は、入力されたＡ，Ｂ信号から、図４(ｂ)に示すような
Ａ＋Ｂ ・・・・・（１）
及び、(ｃ)に示すような
Ｋ・（Ｂ−Ａ）／（Ａ＋Ｂ） ・・・・（２）
を算出する。ただし、Ｋは、式（２）の値が適当な範囲に収まるような定数である。特に図４（ｃ）の信号は、Ｓ字カーブのような特性を示し、その値を評価関数値（以下、Ｅｆ値と略す）と称する。図４（ｂ）および（ｃ）は、対物レンズ３の焦点に対する観察対象Ｓの相対位置により式（１）および（２）の値が変化するようすを示すグラフ（ｂ）および（ｃ）である。コントロール部１５はＥｆ値の符号により合焦位置方向を判定する。例えば、図４のＰ１の位置からＡＦ動作を開始した場合には、Ｅｆ値の符号が正であるから、レボルバを下降させる制御を行い、Ｐ２の位置からＡＦ動作を開始した場合には、Ｅｆ値の符号が負であるから、レボルバを上昇させる制御を行い、最終的にＥｆ値が０となるように合焦制御を行い、観察対象Ｓを合焦へと導く。

このように、レーザ光が点灯制御され、標本に投影したレーザ光束の反射光を検出する事で、アクティブ型のＡＦ光学系が実現する。
また、観察のための照明光は照明用光源２７からレンズ２８を通り、ミラー２９で反射され、レンズ３０で集光された後、観察対象Ｓを上側から照射する。標本を透過した光は、対物レンズ３を通り、ダイクロイックミラー１１を通過して観察光となる。

ここで、対物レンズに水浸対物レンズを用いた場合の観察対象Ｓに対する赤外線レーザのモデルを図５に示す。図５のように水浸対物レンズでは、水ＷＴとガラスＳｇとの境界ＲＢ１、およびガラスＳｇと培養液Ｓｃとの境界ＲＢ２の２カ所でレーザ反射が生じる。ガラスの厚みをｄとした場合のＳ字カーブを図６に示す。図５に示すような水浸対物レンズでは、ガラス厚みｄだけ離れた位置に図中のＦＰ１およびＦＰ２のような合焦と判断する位置（ゼロクロス点）が２カ所発生する。そのため、対物レンズ３の焦点がＲ１ｄまたはＲ１ｕの位置からＡＦ動作を開始すると合焦位置はＦＰ１の位置となり、位置Ｒ２ｄ、Ｒ２ｕからＡＦ動作を開始すると合焦位置はＦＰ２の位置となり、ＡＦ開始位置により合焦位置が変化することになる。

すなわち図５中の細胞Ｓｓを観察する場合には、ガラスＳｇと培養液Ｓｃとの界面であるレーザ反射面ＲＢ２に対するＡＦが必要となり、以下の方法が考えられる。
（ａ）焦点位置がＲ２ｄまたはＲ２ｕの点からＡＦ動作を開始し、レーザ反射面ＲＢ２に合焦させる。
（ｂ）焦点位置がＲ１ｄまたはＲ１ｕの点からＡＦ動作を開始し、一旦、レーザ反射面ＲＢ１に合焦させてから、レーザ反射面ＲＢ２に合焦させる。

これらの２つの方法が挙げられるが、いずれにしてもＡＦによる合焦位置を安定させるためにはＡＦ開始位置（Ｒ１ｄ、Ｒ１ｕ、Ｒ２ｄ、Ｒ２ｕ）を特定しなければならない。
本発明のＡＦ制御では、ＡＦ開始位置を図７のようなフローを用いて必ずＲ２ｕまたはＲ１ｄの位置からＡＦを行い、レーザ反射面ＲＢ２またはレーザ反射面ＲＢ１に合焦させることが可能となる。図７Ａは必ずＲ１ｄの位置からＡＦ動作を行う場合の制御を示したものである。

図７Ａにおいて、ＡＦ動作が開始されると、対物レンズをシステムの最下限まで下降させる（Ｓ１）。対物レンズ３を最下限まで下降させれば必ずＲ１ｄの範囲となる。そこでＥｆ値の符号に応じて対物レンズ３を駆動し（この例では、Ｅｆ値は負であるから対物レンズを上昇させる）（Ｓ２）、Ｅｆ値が０となるまで対物レンズを駆動し（Ｓ３）、ＡＦを終了する。これにより、対物レンズ３のピント位置は反射面ＲＢ１上に設定される。

一方、図７ＢはＡＦ開始位置を必ずＲ２ｕの位置からＡＦを行う場合の制御を示したものである。ＡＦ動作が開始されると、対物レンズ３をシステムの最上限まで上昇させる（Ｓ１１）。対物レンズ３を最上限まで上昇させれば必ずＲ２ｕの範囲となる。そこでＥｆ値の符号に応じて対物レンズを駆動し（この例では、Ｅｆ値が正なので対物レンズ３を下降させる）（Ｓ１２）、Ｅｆ値が０となるまで対物レンズを駆動し（Ｓ１３）、ＡＦを終了する。これにより、対物レンズ３のピント位置は反射面ＲＢ２上に設定される。

上記のような制御を行うことにより、合焦させる反射界面ＲＢ１またはＲＢ２の特定が可能となる。
また、対物レンズ３の焦点位置を上限または下限のどちらに駆動するかの判定は、対物レンズが観察体に近づける範囲のリミット（上限リミット）が設定されている場合には、対物レンズと観察体が衝突する可能性が低いため、より着目点に近い最上限に移動し、上限リミットが設定されていない場合には、対物レンズと観察体が衝突する可能性があるため、最下限に移動する。したがって、図７Ｂの処理を可能とするため、対物レンズの上限をＲＯＭ３１または図示しない不揮発性メモリに保存しておくことが好ましい。

図７Ａの処理により反射面ＲＢ１を特定した場合は、ガラスの厚みｄより僅かに短い距離だけ対物レンズ３を移動させて、再び合焦制御を行って反射面ＲＢ２に合焦してもよいし、反射面ＲＢ１から対物レンズ３を上昇させながらＥｆ値が負から正に変化する点を探してもよい。

以上のように構成・制御される本発明の顕微鏡システムは、水浸対物レンズでボトムシャーレを観察する場合などにおける水−ガラス、ガラス−培養液の複数反射界面をもち、合焦と判断する界面が複数存在する観察体においても、オートフォーカス開始位置を変更する制御を行うことにより、安定したピントあわせを行うことが可能となる。

また本実施例の顕微鏡システムは、対物レンズを上下させる機構となっているが、これをステージが上下する顕微鏡であっても同様の効果を得ることが可能であり、操作部およびコントローラをコンピュータに置き換えても同様の効果を得ることが可能である。

さらに本実施例では水浸対物レンズを用いた場合に生じる水−ガラス、ガラス−培養液の複数反射面に関して記載したが、これをドライ対物レンズで生じる空気−ガラス、ガラス−培養液の複数反射面でも同様の制御でピント合わせを安定させることができ、例えば培養液中に別の観察容器があるような３つ以上の反射面をもつ観察体でもその反射面の最外郭をＡＦ開始位置とすることで合焦位置を安定させることが可能である。

本実施例においては、複数反射面をもち、合焦と判断する界面が複数存在する観察体においても、オートフォーカス開始位置を変更する制御を行うことにより、安定したピントあわせを行うという本発明の技術思想から逸脱することなく、種々の変形が可能である。
〔第２の実施形態〕
第２の実施形態による顕微鏡システムのハードウェア構成は、第１実施例と同様のため省略し、本実施形態の特徴である観察体のサーチ範囲制御に対する説明を行う。

サーチ範囲とは予め観察者が入力するおおよその合焦位置範囲であり、例えば観察体を交換した際のガラス厚みのばらつきや周囲温度変化による合焦位置の変化を考慮して設定され、この設定された領域において合焦制御を行うことになる。すなわち図６のように複数の合焦点をもつ場合に、サーチ範囲をそれぞれの合焦点付近のみとなるように設定すれば、ピント合わせは安定することになる。

しかし、第１の実施形態に関連して説明した例ように複数の反射界面（ＢＲ１およびＢＲ２）が存在する場合でも、図１に示したアクティブＡＦ光学系（斜線部分）により、全ての反射界面が図６に示したようなゼロクロスポイントとして検出できるとは限らない。

ゼロクロスが複数存在するか否かは、このガラス厚と予め設定された対物レンズパラメータのＺ方向の光強度分布によって予測できるものである。例えば、オイル対物レンズを用いた場合にはゼロクロスは１つとなり、水浸・ドライ対物レンズでは複数発生する可能性がある。また、対物レンズに関しては、倍率、ＮＡが大きいほど、瞳径が小さいほど輝度分布のＺ方向範囲が狭くなるため、複数発生しやすい。このような対物レンズ３の例を図１０に示す。図１０は、各対物レンズにおけるレーザ反射光の強度分布範囲±Ｐｚ［μｍ］を示す。例えば、水浸対物レンズＡでは、レーザ反射光が水−ガラス、ガラス−水の界面から±５０［μｍ］の範囲で受光センサに入射されることを示している。

たとえば、図５のように水浸対物レンズを用いてガラス厚ｄを観察する場合には、図５、６のように複数のゼロクロスが発生する。しかし、図９のようにガラス厚が非常に小さい場合にはそれぞれの反射点が分離されず、ゼロクロスは１つとなる。図９において、対物レンズ３の焦点が第１の反射界面ＲＢ１（例えば、水とガラスとの境界）の近傍にある時のＡ範囲信号およびＢ範囲信号をそれぞれＡ１およびＢ１とし、対物レンズ３の焦点が第２の反射界面ＲＢ２（例えば、ガラスと培養液との境界）の近傍にある時のＡ範囲信号およびＢ範囲信号をそれぞれＡ２およびＢ２とした場合、Ａ範囲信号Ａ１およびＡ２どうしも、Ｂ範囲信号Ｂ１およびＢ２どうしも、互いに接近して分離しないので、式（２）による合成信号は、ゼロクロスは唯一となる。

また、図１２は、ガラス厚み０．１７［ｍｍ］のボトムディッシュの観察体をドライ対物レンズＤ（２０倍）で観察した場合のサーチ範囲のモデルである。表１のようにドライ対物レンズＤではガラス−空気の反射光分布が±２００［ｕｍ］であり、同図のようにガラス−培養液のレーザ反射分布に干渉するため、同図のように０．１７［ｍｍ］の厚さのガラスにおいて、ガラス−培養液の反射光に対して空気−ガラスにおけるレーザ反射光が強度、Ｚ方向の強度分布ともに大きくなり、ガラス−培養液の反射に対するゼロクロスは発生しないため、ゼロクロスポイントは１つとなる。

図８は、本発明により以上の点を考慮したサーチ範囲設定方法のフローを示す図である。図８において、検鏡者は検鏡に用いる対物レンズを設定する（Ｓ２０）。対物レンズの設定項目は、例えばドライ・オイル・水浸などの対物レンズ種類（対物レンズの使用形態）や対物レンズ倍率、ＮＡ（開口数）、瞳径である。しかし、これらの設定項目は対物レンズ名称により既知なので、検鏡者は対物レンズ名称を設定すれば、予め保存されている対物レンズ名称に応じた各パラメータが展開されるように構成することが好ましい。さらに検鏡者は観察体のガラス厚ｄを入力する（Ｓ２１）。ここでガラス厚ｄは、Ｓ字カーブが合焦判定位置であるゼロクロスが複数発生するか否かを判定するために用いるパラメータである。次に、観察者が着目する観察部位（通常は、反射界面ＲＢ２またはＲＢ２より上方）を設定する（Ｓ２２）。ここで、アクティブＡＦ動作で検出可能な合焦点は唯一か否かを判断する（Ｓ２３）。

ステップＳ２３の判断がＮＯの場合（合焦点が複数の場合）とは、図１１Ａに示すような場合である。図１１Ａは、検鏡者により設定されたボトムディッシュの観察体Ｓｓを厚さ０．１７［ｍｍ］のガラスＳｇと水浸対物レンズＢ（６０倍）で観察する場合のサーチ範囲のモデルを示す。図１１Ｂは、この時のサーチ範囲の決定方法を説明するためのＥｆ値のグラフである。図１０に示した水浸対物レンズＢ（６０倍）の場合、反射光の分布は±３０ミクロンであるから、ガラス厚０．１７［ｍｍ］に対して互いの界面からの干渉はなく、図のように０．１７［ｍｍ］厚のガラスにおいてゼロクロスは２カ所発生すると予測する。図１１Ｂから分かるように、ガラス厚ｄが反射強度分布範囲（即ち、２ｘＰｚ）より大きければ、ゼロクロスは２カ所発生する。概して、比較的厚いガラスと浸水対物レンズを用いると、ゼロクロスは２カ所発生する。また、比較的薄いガラスとドライ物レンズを用いると、ゼロクロスは１つのみとなる。

このように、ステップＳ２３の判断がＮＯの場合（合焦点が複数の場合）、サーチ幅の上限は０．１７［ｍｍ］−３０［μｍ］と計算され、０．１４［ｍｍ］となるが（実際にはＳ字カーブのゼロクロス周辺を考慮する必要があるが実測的に非常に小さいので本実施例では無視する）、現在の焦点に最も近い反射界面を中心とするサーチ範囲を設定し（Ｓ３０）、その反射界面に一旦合焦させ、ステップＳ２２において検鏡者が設定した観察部位に最も近い反射界面（図１１の例では、反射界面ＲＢ２）を中心位置とする±Ｐｚのサーチ範囲Ｚが決定される（Ｓ３１）。サーチ幅Ｚが最大サーチ範囲幅以下となっているのは、必要以上にサーチ幅を広くすると無駄に合焦時間を要したり、反射点Ｂ’からの反射光の影響を十分なくすためである。このサーチ範囲ＺにおいてＡＦを行えばサーチ範囲Ｚ領域における合焦点のみを検出することになるので複数の反射界面が存在する観察体であっても確実にピント合わせが可能となる。 一方、ステップＳ２３の判断がＹＥＳの場合（合焦点が唯一の場合）、最大サーチ幅はゼロクロスポイントが１つしかないので、合焦時間の効率化を考慮した上で適当な値が設定される。即ち、上記の唯一の合焦点（即ち、反射界面ＲＢ１）に対するサーチ範囲として反射界面ＲＢ１を中心として±Ｐｚの範囲を設定する（Ｓ２４）。そして、唯一の合焦点（反射界面ＲＢ１）からガラス厚ｄだけ上方へ移動した点を観察部位とする（Ｓ２５）。あるいは、唯一の合焦点（反射界面ＲＢ１）からガラス厚ｄだけ上方へ移動した点を中心とする±Ｐｚの範囲をサーチ範囲と設定して、パッシブＡＦ処理を行ってもよい。ステップＳ２４で求めたサーチ範囲においてＡＦ動作を開始するとサーチ範囲における合焦点を検出することになるので確実にピント合わせが可能となる。つまり、合焦点が唯一の場合、ステップＳ２４で設定されたサーチ範囲から反射界面ＲＢ１を特定したのち、ＲＢ１からｄだけ対物レンズ３を上方に移動させて観察するか、もしくはＲＢ１からｄだけ対物レンズ３を上方に移動させた点から上方にパッシプＡＦで合焦動作を行ってもよい。

以上の例では、反射界面が２の場合に限って説明したが、３以上の場合にも本発明の技術思想を応用することが可能である。例えば、反射界面が３つで、それぞれに対応するゼロクロスがある場合は、対物レンズ３の現在の焦点が最も近い、反射界面をまず特定し、特定した反射界面から反射界面間の距離を用いて観察部位に最も近い反射界面の位置を高精度に予測することができる。

また、反射界面が３つで、Ｓ字カーブにゼロクロスが１つしかない場合、ゼロクロス点（に対応する反射界面）の前後に±Ｐｚのサーチ範囲を設定したのち、ゼロクロス点に対応する反射界面から反射界面間の距離を用いて観察部位に最も近い反射界面の位置を高精度に予測することができる。

以上のように構成・制御される本発明の顕微鏡システムは、対物レンズの種類（使用形態）とガラスの厚みなどの界面間隔情報から予測されるＳ字カーブに基づいて、誤動作しないオートフォーカスのサーチ範囲を決定することができる。したがって反射界面が複数存在する観察体においても、安定したピントあわせを行うことが可能となる。

また本実施形態の標本サーチ範囲は反射界面が単独となるような例を示したが、図１１のように複数の反射界面を含む領域として、実施形態１のＡＦ開始位置を決定する手段と組み合わせてサーチ範囲の端としてピント合わせを安定させてもよい。その際に最終的な観察箇所として細胞が存在するレーザ反射面ＢＲ２に合焦させる場合には、レーザ反射面ＢＲ１に合焦させ、ガラス厚みｄを既知として、レーザ反射面ＢＲ１に合焦させた後、ガラス厚みｄ分だけ移動させ、再び合焦制御を行う方法やレーザ反射面ＢＲ１に合焦させた後、Ｅｆ値が再び負から正へと変化する位置まで対物レンズを駆動して、レーザ反射面２に合焦させるなどが可能である。

さらに、本実施形態のサーチ範囲の決定は、予め実験で求めた値としたが、これをＡＦ実行前処理としてＳ字カーブを一旦取得してから最適化すれば、計算上ゼロクロスが複数発生するか否かの微妙なガラス厚や対物レンズ情報においても確実にＡＦを行うことが可能となる。

また、以上述べた実施形態では、観察体を積載あるいは封入する物の例として、ガラスボトムディッシュ（ケース底面がガラスとなっている観察体封入ケース）を用いたが、これを材質をプラスティックに変えても、その形状を変えても本発明に対する影響は皆無である。要するに、観察体を積載あるいは封入する物は、透明で観察に適した部材であればよい。

以上は、本発明の説明のために実施形態を掲げたに過ぎない。したがって、本発明の技術思想または原理に沿って上述の実施形態に種々の変更、修正または追加を行うことは、当業者には容易である。

なお、特許請求の範囲には種々の「顕微鏡オートフォーカスシステム」を記したが、これらに対応する顕微鏡オートフォーカス方法も実施可能であることは、当業者には明らかである。顕微鏡オートフォーカス方法の例を次に掲げる。
（付記１）少なくとも２つの反射界面をもつ観察体を乗せるステージと、対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズとの光軸に沿った相対距離を変化させる手段と、前記変化を少なくともアクティブオートフォーカス方式により制御するオートフォーカス手段とを備えた顕微鏡システムにおいて、効率的に焦点を決定する顕微鏡オートフォーカス方法であり、
前記の少なくとも２つの反射界面の間にある媒体の厚み情報と前記対物レンズの対物レンズ情報により前記制御の方法を変更する制御方法変更ステップを含むことを特徴とする顕微鏡オートフォーカス方法。
（付記２）
前記制御方法変更ステップは、
前記の少なくとも２つの反射界面の間にある媒体の厚み情報を記録するステップと、
前記対物レンズの可動範囲を定義する第１および第２の限界位置を予め設定し記録するステップと、
前記対物レンズの焦点が前記の少なくとも２つの反射界面で挟まれた領域の外側にある場合、前記第１および第２の限界位置のうち近い方の限界位置に前記対物レンズを一度移動させてから、アクティブオートフォーカス動作により、現在の焦点位置から最も近い最近反射界面まで対物レンズを移動させるステップと、
利用者に観察部位を入力させるステップと、
前記観察部位に最も近い反射界面が前記対物レンズの異動先である反射界面と異なる場合、前記厚み情報のうち必要な情報を用いて、前記対物レンズを前記観察部位に最も近い反射界面まで移動させるステップとを含むことを特徴とする付記１記載の顕微鏡オートフォーカス方法。
（付記３） 前記の少なくとも２つの反射界面のうち前記オートフォーカス動作により検出可能なものが唯一であるか否かを判断する判断ステップと、
前記オートフォーカス動作により検出可能な反射界面が唯一である場合、前記アクティブオートフォーカス動作により前記唯一の反射界面に合焦させるステップと、
前記厚み情報のうち必要な情報を用いて、前記対物レンズを現在の位置から前記観察部位に最も近い反射界面まで移動させるステップとをさらに含むことを特徴とする付記１または２記載の顕微鏡オートフォーカス方法。
（付記４） 前記アクティブオートフォーカス動作により検出可能な反射界面が唯一でない場合、現在の焦点位置に最も近い最近反射界面を中心とするサーチ範囲を決定するステップと、
前記サーチ範囲で前記アクティブオートフォーカス動作により、前記最近反射界面に合焦させるステップと、
前記厚み情報のうち必要な情報を用いて、前記対物レンズを現在の位置から前記観察部位に最も近い反射界面まで移動させるステップとをさらに含むことを特徴とする付記３記載の顕微鏡オートフォーカス方法。
（付記５） 前記の少なくとも２つの反射界面が、観察体を積載または封入した透明な保持部材の両面であり、
前記判断ステップが、前記保持部材の厚さ、および各反射界面における反射強度分布範囲に基づいて判断するステップを含むことを特徴とする付記３または４記載の顕微鏡オートフォーカス方法。
（付記６） 前記の少なくとも２つの反射界面が、保持部材の両面であり、
前記判断ステップが、前記保持部材の厚さ、および前記対物レンズ情報に基づいて判断するステップを含むことを特徴とする付記３または４記載の顕微鏡オートフォーカス方法。
（付記７） 前記対物レンズ情報が、水浸、ドライおよび油浸などの前記対物レンズの使用形態、倍率、開口数の少なくとも１つを含むことを特徴とする付記１，２、３または６記載の顕微鏡オートフォーカス方法。
（付記８） 前記判断ステップが、利用可能な対物レンズの各々に対する水浸、ドライおよび油浸などの当該対物レンズの使用形態、倍率、開口数の少なくとも１つのデータを当該対物レンズの識別情報とともに収容したテーブルを参照するステップを含むことを特徴とする付記６記載の顕微鏡オートフォーカス方法。

本発明の第１の実施形態による顕微鏡システムの全体構成を示す構成図である。 図１のコントロール部１５の一実施例を示すブロック図である。 後ピン位置の場合の受光センサ上でのレーザスポットを示す図。 合焦位置の場合の受光センサ上でのレーザスポットを示す図。 前ピン位置の場合の受光センサ上でのレーザスポットを示す図。 対物レンズ３の焦点と標本Ｓとの相対位置と受光センサ対の出力信号ＡおよびＢ、和信号Ａ＋Ｂならびに正規化差信号（Ｂ−Ａ）／（Ａ＋Ｂ）との関係をそれぞれ示すグラフである。 対物レンズ３に水浸対物レンズを用いた場合の観察対象Ｓに対する赤外線レーザのモデルを示す図である。 図５のモデルにおける受光センサ対の出力信号ＡおよびＢ、ならびに正規化差信号（Ｂ−Ａ）／（Ａ＋Ｂ）のグラフである。 本発明の第１の実施形態により前ピン位置からＡＦ動作を行うフローチャートである。 本発明の第１の実施形態により後ピン位置からＡＦ動作を行うフローチャートである。 本発明の第２の実施形態により対物レンズの使用形態およびガラスの厚みからサーチ範囲を決定するフローチャートである。 複数の反射界面が存在しても、レンズの厚さｄが薄いためにゼロクロスが１つしか現れない場合の受光センサ対の出力信号ＡおよびＢ、ならびに正規化差信号（Ｂ−Ａ）／（Ａ＋Ｂ）のグラフである。 対物レンズの種類とレーザ反射光の強度分布範囲±Ｐｚ［μｍ］との関係を示す表である。 複数の反射界面が存在するために反射界面付近のようすを示す図である。 複数の反射界面が存在するために反射界面に対応したゼロクロスが出現する場合の受光センサ対の出力信号ＡおよびＢ、ならびに正規化差信号（Ｂ−Ａ）／（Ａ＋Ｂ）のグラフである。 複数の反射界面が存在するが、一方の強度分布範囲が広いため他方の強度分布範囲が吸収されてゼロクロスが１つしか現れない場合の受光センサ対の出力信号ＡおよびＢ、ならびに正規化差信号（Ｂ−Ａ）／（Ａ＋Ｂ）のグラフである。 オイル対物レンズを用いた従来技術による顕微鏡オートフォーカスのモデルである。 対物レンズ３に水（ＷＴ）浸対物レンズを用いた場合のモデルである。

符号の説明

１ ステージ
２ リボルバ
３ 対物レンズ
４ 基準光源
５ コリメートレンズ
６ 投光側ストッパ
７ 変更ビームスプリッタ（ＰＢＳ）
８ 集光レンズ群
９ 色差補正レンズ群
１０ λ／４版
１１ ダイクロックミラー
１２ 集光レンズ群
１３ 受光センサ
１４ 信号処理部
１５ コントロール部
１６ レボルバ用モータ駆動部
１７ レボルバ用モータ
１８ レボ穴位置検出部
１９ レーザ駆動部
２０ 焦準用モータ駆動部
２１ 焦準用モータ
２３ 操作部
２４ ＪＯＧダイヤル
２５ 色差補正レンズ駆動部
２６ 色差補正レンズ駆動モータ
３０ ＣＰＵ本体３０
３１ ＲＯＭ３１
３２ ＲＡＭ３２
３４ データバス
１００ 顕微鏡システム

Claims (9)

1. 少なくとも２つの反射界面をもつ観察体を乗せるステージと、対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズとの光軸に沿った相対距離を変化させる手段とを備えた顕微鏡システムにおいて、少なくともアクティブオートフォーカス方式により前記変化を制御する顕微鏡オートフォーカスシステムであり、
   前記の少なくとも２つの反射界面の間にある媒体の厚み情報と前記対物レンズの対物レンズ情報により前記制御の方法を変更する制御方法変更手段を含むことを特徴とする顕微鏡オートフォーカスシステム。
2. 前記制御方法変更手段は、
   前記の少なくとも２つの反射界面の間にある媒体の厚み情報を格納する手段と、
   前記対物レンズの可動範囲を定義する第１および第２の限界位置を格納する手段と、
   前記対物レンズの焦点が前記の少なくとも２つの反射界面で挟まれた領域の外側にある場合、前記第１および第２の限界位置のうち近い方の限界位置に前記対物レンズを一度移動させてから、アクティブオートフォーカス動作により、現在の焦点位置から最も近い最近反射界面まで対物レンズを移動させる手段と、
   利用者が観察部位を入力することを可能とする手段と、
   前記観察部位に最も近い反射界面が前記対物レンズの異動先である反射界面と異なる場合、前記厚み情報のうち必要な情報を用いて、前記対物レンズを前記観察部位に最も近い反射界面まで移動させる手段とを備えたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡オートフォーカスシステム。
3. 前記の少なくとも２つの反射界面のうち前記オートフォーカス動作により検出可能なものが唯一であるか否かを判断する判断手段と、
   前記オートフォーカス動作により検出可能な反射界面が唯一である場合、前記アクティブオートフォーカス動作により前記唯一の反射界面に合焦させる手段と、
   前記厚み情報のうち必要な情報を用いて、前記対物レンズを現在の位置から前記観察部位に最も近い反射界面まで移動させる手段とをさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の顕微鏡オートフォーカスシステム。
4. 前記アクティブオートフォーカス動作により検出可能な反射界面が唯一でない場合、現在の焦点位置に最も近い最近反射界面を中心とするサーチ範囲を決定する手段と、
   前記サーチ範囲で前記アクティブオートフォーカス動作により、前記最近反射界面に合焦させる手段と、
   前記厚み情報のうち必要な情報を用いて、前記対物レンズを現在の位置から前記観察部位に最も近い反射界面まで移動させる手段とをさらに含むことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡オートフォーカスシステム。
5. 前記の少なくとも２つの反射界面が、保持部材の両面であり、
   前記判断手段が、前記保持部材の厚さ、および各反射界面における反射強度分布範囲に基づいて判断する手段を含むことを特徴とする請求項３または４記載の顕微鏡オートフォーカスシステム。
6. 前記の少なくとも２つの反射界面が、保持部材の両面であり、
   前記判断手段が、前記保持部材の厚さ、および前記対物レンズ情報に基づいて判断する手段を含むことを特徴とする請求項３または４記載の顕微鏡オートフォーカスシステム。
7. 前記対物レンズ情報が、水浸、ドライおよび油浸などの前記対物レンズの使用形態、倍率、開口数の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項６記載の顕微鏡オートフォーカスシステム。
8. 利用可能な対物レンズの各々に対する水浸、ドライおよび油浸などの当該対物レンズの使用形態、倍率、開口数の少なくとも１つのデータを当該対物レンズの識別情報とともに収容したテーブルをさらに備え、
   前記判断ステップが、前記テーブルを参照するステップを含むことを特徴とする請求項６記載の顕微鏡オートフォーカスシステム。
9. 請求項１乃至８の何れか一項に記載の顕微鏡オートフォーカスシステムを備えたことを特徴とする顕微鏡システム。

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