JP2005535699A5

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Publication number: JP2005535699A5
Application number: JP2004527246A
Authority: JP
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2023-08-11

Description

（発明の分野）
本発明は、概して超急性拒絶を処置または予防するための組成物および方法に関し、より詳しくは、炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌを含む融合ポリペプチドを含有する組成物に関する。

（発明の背景）
同種移植用のドナー臓器が慢性的に欠乏していることは、動物からヒトへの臓器または組織、すなわち異種移植が実施できれば解決することが可能である。ブタは、ヒトの異種移植とって最も適したドナー種であると考えられている。しかし、それを常套手段として用いる前に解決すべきいくつかの問題がある。最初の免疫性障害は、炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌ（α−Ｇａｌ）（ブタ等の他の哺乳類に存在）に特異的なヒト、類人猿、および旧大陸サルの異種反応性（ｘｅｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）天然抗体（ＸＮＡｂ）によって、引き起こされる。ブタ血管内皮細胞上のα−Ｇａｌエピトープに対するＸＮＡｂｓの結合によって、数分から数時間のうちに移植片機能損失に至る一連のイベントが開始される（（Ｇａｌｉｌｉ，Ｕ．，１９９３；Ｏｒｉｏｌ，Ｒ．ｅｔａｌ．，１９９３）。

（発明の要旨）
本発明は、ひとつには、ムチン型タンパク質主鎖上の異なるコア糖鎖によって炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌ（αＧａｌ）が特異的に高密度で発現しうるという発見にもとづいている。このような高密度のαＧａｌエピトープは、遊離糖類または固相に結合したαＧａｌ決定基と比較して、抗αＧａｌの結合または除去（すなわち、吸着）の増大をもたらす。本明細書ではポリペプチドをαＧａｌ融合ポリペプチドと称する。

また、本発明は、本明細書に記載するαＧａｌ融合ポリペプチド・コード化核酸を含むベクターと同様に、αＧａｌ融合ポリペプチドをコードする核酸と、本明細書に記載するベクターまたは核酸を含む細胞とを包含する。あるいは、ベクターは、α１，３ガラクトシル基転移酵素および／または２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素をコードする核酸をさらに含む。本発明はまた、αＧａｌ融合ポリペプチドを発現させるために遺伝子操作された宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）も包含する。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ひとつには、炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌ（αＧａｌ）が高密度で、かつムチン型タンパク質主鎖上の異なるコア糖鎖によって、特異的に発現しうるということの発見にもとづいている。より具体的には、本発明は、ムチン型タンパク質主鎖のαＧａｌエピトープの発現が該ポリペプチドを発現する細胞株に依存するという驚くべき発見にもとづいている。さらに、ムチンのグリカン・レパートリーを外来α１，３ガラクトシル基転移酵素およびコア２分岐酵素の共発現によって修飾することができる。この修飾によって、αＧａｌエピトープの密度がよりいっそう高くなり、遊離糖類、固相に結合したαＧａｌ決定基、またはα１，３ガラクトシル基転移酵素単独によりトランスフェクションした細胞と比較して、抗αＧａｌ抗体の結合または除去（すなわち、吸着）の増加が生ずる。

ＣＯＳ細胞でのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質およびブタα１，３ガラクトシル基転移酵素（α１，３ＧａｌＴ）の一時的トランスフェクションは、α−Ｇａｌエピトープにより大幅に置換された二量体融合タンパク質を生ずる。この融合タンパク質は、大体、１つの二量体あたり複数の末端α−Ｇａｌエピトープを有するとともに、アガロース・ビーズに固定されたブタ・チログロブリンよりも２０倍高く（炭水化物モル基準で）、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ共役アガロースおよびマクロ孔ガラス・ビーズよりもそれぞれ５，０００倍および３０，０００倍高い異種反応性天然抗体（ＸＮＡｂ）吸着効率を有する。

炭水化物エピトープに対する抗体の結合は、提示された糖類の立体構造（コンホメーション）に依存している。組織血液型抗原が溶液中で異なる立体構造をとることが示されており（（Ｉｍｂｅｒｔｙ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９５）、また抗血液型抗体が、立体構造に依存する炭水化物決定基（所謂マイクロ・エピトープ）の異なる領域を認識することも示されている（Ｉｍｂｅｒｔｙ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９６）。同様に、研究によって、レセプターが、リガンドに結合するときに、よりエネルギー的に好ましくない立体構造を誘導することができるということも示されている（Ｉｍｂｅｒｔｙ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９３）。２種類の異種抗原（αＧａｌ−ＬａｃＮＡｃおよびαＧａｌ−Ｌｅｗｉｓｘ）に対する研究によって明らかにされたことは、たとえ後者のエピトープのフコース残基がラクトサミン構造に対して立体構造的規制を誘導した場合であっても、末端Ｇａｌα１，３Ｇａｌ二糖類がかなりフレキシブルであった（Ｃｏｒｚａｎａ，Ｆ．ｅｔａｌ．，２００２）。したがって、ともに所謂天然抗体によって認識された組織血液型抗原および異種抗原は、いくつかの異なる立体構造を採用することができ、これらの抗体が認識するエピトープの立体構造を予測することが困難かもしれない。さらに、オリゴ糖の内側コア構造は、タンパク質−炭水化物複合体の結合に直接関係するものではないが、その結合親和性に影響することが示された（Ｍａａｈｅｉｍｏ，Ｈ．ｅｔａｌ．，１９９５）。α１，３ＧａｌＴおよびＣ２ＧｎＴＩを共発現するＣＨＯ細胞上で発現したＯ−グリカンの構造的分析によって、α−Ｇａｌエピトープが３つの異なるオリゴ糖で発現されることが明らかになった（図７および表ＩＩ）。したがって、コア２およびラクトサミン構造の効果とは別に、オリゴ糖のコア２分岐のうちの１つの分岐上に位置したＮ−アセチルおよびＮ−グリコリル・ノイラミン酸がそれらの異種抗原によってとられた立体構造に影響を及ぼす可能性があった。また、シアル酸は結合エピトープの一部である可能性がある。したがって、一部の異種反応性抗体レパートリーは、それらの分岐エピトープを、Ｇａｌｉｌｉ抗原を認識するものとは異なる結合特異性で認識する（（Ｇａｌｉｌｉ，Ｕ．ｅｔａｌ．，１９８５）。さらにまた、Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、ブタで発現される（Ｂｏｕｈｏｕｒｓ，Ｄ．ｅｔａｌ．，１９９６；Ｍａｌｙｋｈ，Ｙ．Ｎ．ｅｔａｌ．，２００３；Ｍａｌｙｋｈ，Ｙ．Ｎ．ｅｔａｌ．，２００１）。しかし、Ｎ−グリコリルノイラミン酸の発現は、ヒトではみとめられず（Ｖａｒｋｉ，Ａ．，２００１）、ヒト異種反応性抗体によって認識されることが明らかになっている（Ｚｈｕ，Ａ．ｅｔａｌ．，２００２）。したがって、Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有グリカンは、異種反応性抗体のさらに別のグループと結合する可能性がある。

αＧａｌ融合ペプチドは、炭水化物モル基準で、野生型αＧａｌ決定基の遊離糖類と比較して、抗血液型抗体の除去または結合に対して、よりいっそう効率的である。αＧａｌ融合タンパク質が結合する抗αＧａｌ抗体の数は、等量の野生型αＧａｌ決定基の遊離糖類と比べると、２倍、４倍、６倍、１０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍、またはそれ以上多い。

ムチン・ドメインは、アミノ酸のスレオニン、セリン、およびプロリンが豊富であり、そこでＮ−アセチルガラクトサミンを介してオリゴ糖がヒドロキシアミノ酸（Ｏ−グリカン）に結合する。ムチン・ドメインは、Ｏ−結合グリコシル化部位を含む、あるいは代わりに、該Ｏ−結合グリコシル化部位からなる。ムチン・ドメインのＯ−グリコシル化部位の数は、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個、またはそれ以上である。あるいは、ムチン・ドメインは、Ｎ−結合グリコシル化部位を含む、あるいは代わりに、該Ｎ−結合グリコシル化部位からなる。ムチン・ポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％がグリカンに起因する。ムチン・ポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、またはＭＵＣ１２）によってコードされた任意のポリペプチドである。あるいは、ムチン・ポリペプチドは、Ｐセレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、Ｇ１ｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ、赤血球グリコホリン、グリコカリシン、グリコホリン、シアロフォリン、ロイコ・シアリン、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）−Ｒ、ＺＰ３、およびエピグリカニンである。好ましくは、ムチンは、ＰＳＧＬ−１である。ＰＳＧＬ−１は、各々が４０２個のアミノ酸を含む、１型トランスメンブレン・トポロジーの２つのジスルフィド結合１２０ｋＤａサブユニットを持ち、該サブユニットの各々が４０２のアミノ酸を含むホモ二量体糖タンパク質である。細胞外ドメインには、１０アミノ酸コンセンサス配列ＡＱ（Ｍ）ＴＴＰ（Ｑ）Ｐ（ＬＴ）ＡＡ（ＰＧ）Ｔ（Ｍ）Ｅが１５回繰り返して存在し、該配列はＯ−結合オリゴ糖を付加するための潜在的部位を３または４カ所有する。ＰＳＧＬ−１は、各モノマーあたり、Ｏ−結合グリコシル化のための部位数が５３を上回り、またＮ−結合グリコシル化のための部位を３つ有すると予測される。

ムチン・ポリペプチドは、ムチン・タンパク質の全てまたは一部を含む。あるいは、ムチン・タンパク質は、該ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチン・ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分またはその一部を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ａ５７４６８に開示されるアミノ酸１９−３１９）。ムチン・ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１のシグナル配列部分（例えば、アミノ酸１−１８）、膜貫通（トランスメンブラン）ドメイン（例えば、アミノ酸３２０−３４３）、および細胞質ドメイン（例えば、アミノ酸３４４−４１２）を含む。

あるいは、ムチン・ポリペプチド構成成分は、天然ムチン配列（野生型）に、炭水化物含有量の増加（非突然変異配列と比較して）をもたらす突然変異を持つ変異ムチン・ポリペプチドとして、提供される。例えば、変異ムチン・ポリペプチドは、野生型ムチンと比較して、付加的なＯ−結合グリコシル化部位を含んでいた。あるいは、変異ムチン・ポリペプチドは、野生型ムチン・ポリペプチドと比較して、セリン、スレオニン、またはプロリンの数が増加するアミノ酸配列突然変異を含む。このような炭水化物含有量の増加は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質と炭水化物との比率を決定することで、評価することができる。

いくつかの実施形態では、ムチン・ポリペプチド構成成分は、天然ムチン配列（野生型）に、タンパク質分解に対してより高い耐性のムチン配列（非突然変異配列と比較して）をもたらす突然変異を有する変異ムチン・ポリペプチドとして、提供される。

第２のポリペプチドは、好ましくは可溶性である。第２のポリペプチドは、αＧａｌ融合ポリペプチドと第２のムチン・ポリペプチドとの結合を促進する配列を含む。好ましくは、第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン・ポリペプチドの一領域を含む。「少なくとも一領域（ａｔｌｅａｓｔａｒｅｇｉｏｎ）」とは、免疫グロブリン分子の任意の部分、例えばＬ鎖、Ｈ鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域、またはそれらの任意のフラグメントを含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは公知であり、例えば米国特許第５，５１６，９６４号、第５，２２５，５３８号、第５，４２８，１３０号、第５，５１４，５８２号、第５，７１４，１４７号、および第５，４５５，１６５号に記載されている。

第２のポリペプチドは、完全長免疫グロブリン・ポリペプチドを含む。あるいは、第２のポリペプチドは、完全長よりも短い免疫グロブリン・ポリペプチド（例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆｖ、またはＦｃ）を含む。好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン・ポリペプチドのＨ鎖を含む。より好ましくは、第２のポリペプチドは免疫グロブリン・ポリペプチドのＦｃ領域を含む。

本発明の別の態様は、ムチン・ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体、もしくは相同体（ホモログ）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。種々の態様では、ベクターは免疫グロブリン・ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に結合したムチン・ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体、もしくは相同体（ホモログ）をコードする核酸を含む。さらに、ベクターは、α１，３ガラクトシル基転移酵素、コア１，６，−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素またはそれらの任意の組み合わせを含む。転移酵素は、αＧａｌ融合タンパク質のムチン部分のペプチド主鎖上に対するαＧａｌ決定基の付加を促す。典型的なベクターは、配列番号１、１１、または２１を含む。本明細書で用いられるように、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は核酸分子であり、該核酸分子が結合する別の核酸を搬送することが可能なものをいう。ベクターの１つの種類として、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」があり、該プラスミドとは追加のＤＮＡセグメントが連結しうる環状二重鎖ＤＮＡループのことである。ベクターの別の種類として、ウイルス・ベクターがあり、追加のＤＮＡセグメントがウイルス・ゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、該ベクターが導
入される宿主細胞で自律複製ができる（例えば、細菌複製開始点を持つ細菌ベクターおよびエピソームほ乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームほ乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると直ちに該宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによってその宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それが操作可能に連結している遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ）」と称する。一般に、発現ベクターは、しばしばプラスミドの形で、組換えＤＮＡ技術で有用である。本明細書では、ベクターの最も一般的な使用形態がプラスミドであることから、「プラスミド」および「ベクター」を互いに置き換えて使用することができる。しかし、本発明は、等価な機能を呈するそのような発現ベクターの他の形態、例えばウイルス・ベクター（例：複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）を含むことを意図している。

本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞（ｈｏｓｔｃｅｌｌ）」および「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｏｓｔｃｅｌｌ）」は、本明細書では相互に置き換え可能なかたちで用いられる。そのような用語が特定の被験体細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫にも言及することが理解される。突然変異または外界いずれかの影響によって後続世代で一定の修飾が生ずることから、実際のところ、そのような子孫は親細胞とは同一ではないと思われるが、それでも本明細書で用いられるようにその用語の範囲内である。

ポリペプチドの化学合成は、修飾アミノ酸または非天然アミノ酸（Ｄ−アミノ酸および他の小有機分子が挙げられる）の取り込みを促進する。対応のＤ−アミノ酸アイソフォームによるペプチド内の１つ以上のＬ−アミノ酸の置換は、酵素的加水分解に対するペプチドの耐性を高めるために、また生物学的に活性なペプチドの１種類以上の特性（すなわち、レセプター結合、機能的潜在能力、または作用の持続時間）を高めるために、用いることができる。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ，ｅｔａｌ．，１９９３．ＪＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２５８５−２５９４、Ｋｉｒｂｙ，ｅｔａｌ．，１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８０２−３８０８、Ｍｏｒｉｔａ，ｅｔａｌ．，１９９４．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５３：８４−８８、Ｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，１９９３．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．４２：３９２−３９９、ＦａｕｃｈｅｒｅａｎｄＴｈｉｕｎｉｅａｕ，１９９２．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＲｅｓ．２３：１２７−１５９を参照せよ。

ペプチド配列への共有結合的架橋の導入は、立体構造的およびトポグラフィックにポリペプチド主鎖を抑制することができる。この戦略は、能力、選択性、および安定性が高まった融合ポリペプチドのペプチド類似体の開発に用いることができる。環状ペプチドの立体構造的エントロピーは、その直鎖状の対応物よりも低いので、特異的立体構造の採用は、非環式の類似体に対するエントロピーよりも環状類似体に対するエントロピーにおいてより少ない減少を伴っておこるので、それによって、結合のための自由エネルギーがより好ましいものとなる。大環化（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）は、しばしば、ペプチドＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端またはＣ末端との間［例えば、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、ｐＨ８．５］（Ｓａｍｓｏｎｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、または２つのアミノ酸側鎖間での、アミド結合によって達成される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，ＡｄｖＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照せよ。ジスルフィド架橋もまた、線形配列に導入されて、該配列の柔軟性を減少させる。例えば、Ｒｏｓｅ，ｅｔａｌ．，ＡｄｖＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ，３７：１−１０９（１９８５）、Ｍｏｓｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｉｎＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１０６：５０５−５１２（１９８２）を参照せよ。さらに、ペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）によるシステイン残基の置換が、いくつかのオピオイド・レセプター相互作用の選択性を高めるのに用いられている。ＬｉｐｌｃｏｗｓｋｉａｎｄＣａｒｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｇｕｔｔｅ，ｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓｐｐ．２８７−３２０（１９９５）。

（αＧａｌ融合ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む医薬組成物）
ＡＢＯ融合タンパク質、または該融合タンパク質をコードする核酸分子（本明細書では「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」または「活性化合物（ａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」ともいう）ならびにその誘導体、フラグメント、類似体、およびホモログを、投与のために適当な医薬組成物に取り込むことができる。そのような組成物は、概して核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられるように、「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙａｃｃｅｐｔａｂｌｅｃａｒｒｉｅｒ）」は、薬学的投与に適合性の、任意の、および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤、等張性および吸着性遅延薬剤、その他を含むことを意図しており、薬学的投与（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｄｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）と互換性を持つ。適当な担体は、当該分野での標準的参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓの最近の版に記載されており、本明細書ではこの文献を援用する。そのような担体または希釈剤の好ましい例として、限定されるものではないが、水、食塩水、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。不揮発性油のようなリポソームおよび非水溶ビヒクルも使用可能である。薬学的活性物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当分野では周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない範囲を除いて、組成物でのそれらの使用を意図している。追加の活性成分もまた、組成物に取り込むことができる。

いくつかの実施形態では、経口のまたは非経口組成物は、投与の容易さと投薬量の均一性とのために投薬量単位形状で処方される。本明細書で用いられるように投薬量単位の形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適している物理的に分離した単位をいう。すなわち、各々の単位は、必須の薬学的担体に関連して所望の治療効果を得るために計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬量単位形態の仕様は、活性化合物のユニークな特徴、達成すべき特定の治療効果、および個人の治療のためのそのような活性化合物を合成する当該技術分野固有の限界に指図され、かつ直接的に依存している。

必要に応じて、徐放製剤を調製することができる。徐放製剤の適当な例として、抗体含有固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、膜等の造形品の形状、またはマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル類、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルーメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体、非分解性エチレンビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体およびロイプロイドアセテートから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸グリコール酸のようなポリマーが１００日以上にわたって分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルはより短時間のあいだにタンパク質を放出する。

（略語）
以下の略語が本明細書で用いられる。すなわち、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞障害；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＤＸＲ、遅発性異物性拒否；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着検定法；ＦＴ、フコシル転移酵素；Ｇａｌ、Ｄ−ガラクトース；ＧＴ、ガラクトシル基転移酵素；Ｇｌｃ、Ｄ‐グルコース；Ｇ１ｃＮＡｃ、Ｄ−Ｎアセチルグルコサミン；Ｇ１ｙＣＡＭ−１、グリコシル化依存性細胞接着分子−１；ＨＡＲ，超急性拒絶；Ｉｇ、免疫グロブリン；ＭＡｄＣＡＭ、粘膜アドレシン細胞接着分子；ＰＡＥＣ、ブタの大動脈血管内皮細胞；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＳＧＬ−１、Ｐセレクチン糖タンパク質リガンド−１；ＲＢＣ、赤血球；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法；Ｈｅｘ、ヘキソース；ＨｅｘＮＡｃ、Ｎ−アセチル・ヘキソサミン；ＮｅｕＡｃ、Ｎ−アセチル・ノイラミン酸；ＮｅｕＧｃ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸；およびＨｅｘＮｏｌはＮ−アセチル・ヘキソサミンの開いた（環でない）形状である。

（実施例１：置換組換えＰセレクチン糖タンパク質リガンド／免疫グロブリン融合タンパク質の一時的発現）
（一般的方法）
（細胞培養）
ＣＯＳ−７ｍ６細胞（３５）およびＳＶ４０ラージＴ抗原不死化ブタ大動脈内皮細胞株ＰＥＣ−Ａ（３６）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２５μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）で継代した。ヒトの赤血白血病細胞株Ｋ５６２とバーキットリンパ腫細胞株ＲａｊｉをＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０で培養した。

（発現ベクターの構築）
ブタα１，３ＧＴ（３７−３９）を、コーディング配列の５′末端、コザック（Ｋｏｚａｋ）翻訳開始コンセンサス配列、およびＨｉｎｄ３制限部位に相補的な６つのコドンを持つフォワード・プライマーと、コーディング配列の３′末端、翻訳停止およびＮｏｔ１制限部位に相補的な６つのコドンを持つリバース・プライマーとを用いて、ブタ脾臓ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。増幅１，３ＧＴｃＤＮＡを、Ｈｉｎｄ３およびＮｏｔ１（３５）を用いて、ＣＤＭ８のポリリンカーにクローニングした。Ｐ−セクレチンへの結合を媒介する高度にグリコシル化したムチン型のタンパク質であるＰセレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）（４０）をコードする配列を、ＨＬ−６０ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって得て、Ｈｉｎｄ３およびＮｏｔ１を用いてＣＤＭ８にクローニングし、さらにＤＮＡの塩基配列決定（シーケンシング）をおこなって確認した。ムチン免疫グロブリン発現プラスミドは、フレーム単位のＰＳＧＬ−１の細胞外部分のＰＣＲ増幅ｃＤＮＡをＢａｍＨ１部位を介して、ＣＤＭ７（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ｅｔａｌ）の発現カセットとして担持されたマウスＩｇＧ２のＦｅ部分（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）に融合させることによって、構築した。

自然発生的放出を、エフェクター細胞無しのＡＩＭＶ培地２００μｌでインキュベートした５，０００個の標的細胞を有するウエルで読み取り、最大放出を、ＡＩＭＶ培地１００μｌで５，０００個の標的細胞を１００μｌの５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とともにインキュベートしたウェルで読み取った。各Ｅ：Ｔ比を三重反復分析した。３７℃で４時間インキュベートした後、上清をＳｋａｔｒｏｎ上清回収システム（ＳｋａｔｒｏＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，
Ｎｏｒｗａｙ）を用いて収集し、ガンマ・カウンター（ＬＫＢＷａｌｌａｃ）で分析した。パーセント致死を、最大放出と自然発生的放出との差で割った自然発生的放出で差し引いた測定放出として、計算した。

固定化Ｇａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂの吸着能力。ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂプラスミド単独で、またはブタα１，３ＧＴｃＤＮＡとともにトランスフェクションしたＣＯＳ細胞由来の上清２０ｍｌを抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズのゲル・スラリー５００μｌと混合した。しっかりと洗浄した後、ビーズを等量ずつ分け、１００μｌのゲル・スラリー（５０μｌ充填ビーズ）を０．２５、０．５、１．０、２．０、および４．０ｍｌのプールされた補体減少ヒトＡＢ血清と混合し、４℃で４時間にわたり転倒回転させた。ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂおよびＧａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ上での吸着の後、４時間^５１Ｃｒ放出アッセイを用いてウサギ補体の存在下、血清をブタ内皮細胞細胞毒性についてアッセイした（図３）。図３に示すように、各希釈ステップで約３００ｎｇのＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ（上記参照）を担持するビーズ１００μｌが４および２ｍｌのＡＢ血清の細胞毒性を減ずることができ、また１ｍｌ以下のヒトＡＢ血清に存在する細胞毒性を完全に吸着することができる。注意すべきことは、非Ｇａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの同一量が０．２５ｍｌ吸着ヒトＡＢ血清の細胞毒性をわずかだけ減少させることである（図３）。

（補体依存ブタ内皮細胞細胞毒性および結合に対するＧａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの効果）
ＰＳＧＬＩ／ｍｌｇＧ２ｂが個々のヒト免疫グロブリンクラスを吸収することができた効率を調べるために、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡアガロース・ビード上で、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってヒトＡＢ血清から、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、７およびＩｇＡを精製した。単離後、ＩｇＡを抗ＩｇＧおよびＩｇＭカラムに通過させ、ＩｇＧおよびＩｇＭの痕跡を取り除く。この手順を、同様に他のＩｇクラスについても実行した。Ｉｇ分画純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでチェックした（図４）。正常血清で見いだされる濃度で、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（ＩｇＡではない）をウサギ補体の存在下、ＰＥＣ−Ａに対して細胞毒性を示した（図５）。ＩｇＧおよびＩｇＭ分画に存在する細胞毒性は、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ上での吸着によって、完全に除去された。ＩｇＡ分画によって示される細胞毒性の欠如がＰＥＣ−Ａに対するヒトＩｇＡ抗体の結合の欠如によるものかどうかを調べるために、細胞ＥＬＩＳＡを、結合ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体を検出するために細胞毒性アッセイで使用された同一Ｉｇ分画で実施した。アルカリホスファターゼ共役クラス特異的Ｆ（ａｂ）′_２フラグメントを２次抗体として用いた。ＩｇＧおよびＩｇＭの細胞毒性がＧａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂの吸着によって完全に取り除かれても、ＩｇＧに関しては７０％（３０から７０％の範囲）を上回って、ＩｇＭに関しては５５％（１０から５５％の範囲）を上回っては、結合は決して減少しなかった（図５）。ヒト免疫グロブリンＡは明らかにＰＥＣ−Ａと結合し、結合はＧａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬＩ／ｍＩｇＧ_２ｂ上での吸着後に、わずかに減少しただけだった（２９％以下）。したがって、ＩｇＡ分画の細胞毒性の欠如は、ＩｇＡフラクションがＰＥＣ−Ａに結合できないことによって説明することはできず、補体を活性化させることによると思われる。

（実施例２：置換された組換えＰセレクチン糖タンパク質リガンド／免疫グロブリン融合タンパク質の安定な発現）
（一般法）
（細胞培養）
ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、２９３Ｔ、およびブタ大動脈内皮細胞株ＰＥＣ−Ａ（Ｋｈｏｄａｄｏｕｓｔ，Ｍ．Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９５）を１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および２５μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。選択培地は、下記に示すように、ピューロマイシン（ｃａｔ．ｎｏ．Ｐ７２５５；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．６３１７８）、ハイグロマイシン（ｃａｔ．ｎｏ．４０００５１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３９）、およびＧ４１８（ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ７０３４；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８）を含有していた
（発現プラスミドの構築）
記載（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９７）されるように、ブタα１，３Ｇａ１Ｔ（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｋ．ｅｔａｌ．，１９９４）およびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ発現プラスミドを構築した。フォワードおよびリバース・プライマーとして、それぞれｃｇｃｇｇｇｃｔｃｇａｇａｔｇａａｇａｔａｔｔｃａａａｔｇｔおよびｃｇｃｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａｔｇａｔｇｔｇｇｔａｇｔｇａｇａｔを用いて、ＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリからＣ２ＧｎＴＩｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。安定なトランスフェクタントを生成するために用いられるベクターは、両方向性であり、ポリリンカーの上流のＥＦ１αプロモーター、スプライス・ドナーおよびアクセプター部位、ならびにＳＶ４０の両方向性ポリ（Ａ）付加シグナルを有していた。この転写ユニットとは反対の配向で、かつ逆方向からのポリ（Ａ）シグナルを用いているのが、ＨＳＶＴＫプロモーターに続いてピューロマイシン・アセチル転移酵素（ＥＦ１α／ＰＡＣ）、ハイグロマイシンｂ（ＥＦ１α／Ｈｙｇ）、およびネオマイシン（ＥＦ１α／Ｎｅｏ）耐性遺伝子（Ｎ．Ｃｈｉｕ，Ｊ．ＨｏｌｇｅｒｓｓｏｎａｎｄＢ．Ｓｅｅｄ）のコーディング配列からなる第２の転写ユニットであった。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて、ブタα１，３ＧａｌＴおよびＰＳＧＬ−ｌ／ｍＩｇＧ_２ｂのｃＤＮＡをＥＦ１α／ＨｙｇおよびＥＦ１α／ＰＡＣベクターにそれぞれ交換した。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いて、Ｃ２ＧｎＴＩ遺伝子をＥＦ１α／Ｎｅｏに交換した。

（ブタ大動脈内皮細胞細胞毒性アッセイ）
記載（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔａｌ．，２００３）されるように、ブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）細胞毒性アッセイを行った。細胞毒性を最大の４０％（ｙ＝０．４）に減少させるために各細胞クローンから必要とされるＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの量を、各融合タンパク質に対する測定値の直線回帰後に得た曲線を記述する式から推論し、その後対応するｘ値（マイクログラム吸着体）を算出した。

（組み換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの精製）
２０分間１，４２０ｘｇで遠心することによって、堆積物から上清を取り除いた。取り除いた上清を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（分子全体）−アガロース（ｃａｔ．ｎｏ．Ａ６５３１；Ｓｉｇｍａ）１０ｍｌを含有するカラムに流速０．５ｍｌ／分で通した。ＰＢＳ１２０ｍｌでの洗浄後に、３ＭＮａＳＣＮ１２０ｍｌで、結合融合タンパク質を溶出した。検出用の抗マウスＩｇＧを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット法による分析に続いて、融合タンパク質を含有する管の内容物をプールした。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂを含む画分を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、蒸留Ｈ_２Ｏの１ないし２ｍｌ中で再懸濁した。融合タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。より低い分子量の夾雑物を除去するために、ＦＰＬＣ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて流速０．５ｍｌ／分でＰＢＳで溶出させるＨｉＰｒｅｐ１６／６０ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲカラム（ｃａｔ．ｎｏ．１７−１１６６−０１；ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上でのゲル濾過によって、融合タンパク質をさらに精製した。５ｍｌ画分を回収し、２８０ｎｍでのＵＶ分光測光によって、タンパク質を含有する管を同定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット法によって、プールした画分を再び分析し、蒸留水中でプール、透析、および再懸濁した。

図１は、ベクター単独（ＣＤＭ８）、ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ、またはＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂおよびブタα１，３ＧＴ発現プラスミドによって、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の上清から単離されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。これらを、続いてペルオキシダーゼ共役バンデイレイア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒｅｉａｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）イソレクチンＢ_４レクチンでプローブ化して、化学発光による視覚化で免疫精製タンパク質上のＧａｌα１，３Ｇａｌエピトープを検出した。図２Ａは、５０μｌ抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ上での吸着前後にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上清の容量を増加させる際に、ＰＳＦＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの抗マウスＩｇＧのＦｃをＥＬＩＳＡにより定量化した結果を示す棒グラフである。試料を三重分析した。図２Ｂは、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞上清の容量を増加させる際に、ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質濃度を示すゲルの写真である。図３は、^５１Ｃｒ遊離測定で推定される約３００ｎｇのＧａｌα１，３Ｇａｌ置換または非置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂを担持する抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ５０μｌ上への吸着後の異なる容量のヒトＡＢ血清による抗体依存型補体媒介ＰＥＣ−Ａ細胞毒性を示す折れ線グラフである。図４は、免疫親和性精製ヒトヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。各試料の４μｇを還元および非還元条件下で流し、銀染色でタンパク質を視覚化した。図５は、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ上での吸着を^５１Ｃｒ遊離測定で調べた前後における免疫親和性精製ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの抗体依存型補体媒介ＰＥＣ−Ａ細胞毒性を示す折れ線グラフである（右手側Ｙ軸；％致死）。図６は、熱不活性化ヒトＡＢ血清の添加による致死に対する直接的相乗効果を４時間^５１Ｃｒ遊離測定で調べたＫ５６２、ＲａｊｉおよびＰＥＣ−Ａ細胞に対するヒトＰＢＭＣの直接的細胞毒性効果（血清無し条件）を示す折れ線グラフである（グラフＡ）。ＰＥＣ−Ａ細胞の抗体依存型細胞性細胞毒性に対する熱不活化ヒトＡＢ血清の効果を、Ｇａｌα１，３置換および非置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＩｇＧ^２ _２ｂ上への吸着前後での４時間^５１Ｃｒ遊離測定で測定した（グラフＢ）。図７は、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂｃＤＮＡを単独（−）で、またはブタα１，３ガラクトシル基転移酵素ｃＤＮＡ（＋）とともに用いて、安定的にトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、および２９３Ｔ細胞の上清から精製したＰＳＧＬ−ｌ／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク免疫親和性を示すウエスタンブロットの写真である。図８は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、および２９３Ｔ細胞によって発現されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上の相対的α−Ｇａｌエピトープを示す棒グラフである。ブタα１，３ガラクトシル基転移酵素（ＧａｌＴ）の共発現なし（白色棒）または共発現あり（黒色棒）、さらにＣＨＯ−Ｋ１に関してはコア２β１，６Ｎ−アセチルグロコサミニル転移酵素（Ｃ２ＧｎＴＩ）（灰色棒）で、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、または２９３Ｔで生産されたＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１−マウス免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質（ＰＳＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ）上の相対的α−Ｇａｌエピトープ密度。図９は、異なる宿主細胞で生産されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上に吸着したヒト血液型ＡＢ血清のブタ大動脈血管内皮細胞細胞毒性を示す折れ線グラフである。図１０は、安定的に形質移入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の上清から精製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質のウエスタンブロット分析の写真である。図１１は、アフィニティー・クロマトグラフィおよびゲル濾過によって精製されたＰＳＧＬ−１ｍＩｇＧ_２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。図１２は、ＣＨＯクローン５Ｌ４−１に作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから遊離したＯ−グリカンのエレクトロスプレー・イオントラップ・マススペクトル分析を示す。図１３は、ＣＨＯクローンＣ２−１−９に作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから遊離したＯ−グリカンのエレクトロスプレー・イオントラップ・マススペクトル分析を示す。図１４は、ＣＨＯクローンＣ２−１−９で作られたＰＳＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから放出されたＯ−グリカンのマザー・スペクトルに見られる顕著なピークのＭＳ／ＭＳ分析を示す一連の説明図である。