JP2005535699A - ムチン−免疫グロブリン融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、ムチン免疫グロブリン融合ポリペプチド、その生産方法、および超急性拒絶の処置または予防のための方法に関するもので、特に融合ポリペプチドのムチン部分がアルファ１，３−ガラクトシル基転移酵素とベータ１，６Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素とによってグリコシル化されている。本発明は、ひとつには、ムチン型タンパク質主鎖上の異なるコア糖鎖によって炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌ（αＧａｌ）が特異的に高密度で発現しうるという発見にもとづいている。このような高密度のαＧａｌエピトープによって、遊離糖類と比較して、抗αＧａｌの結合または除去（すなわち、吸着）の増大が生じるか、または固相に結合したαＧａｌ決定基をもたらす。本明細書ではポリペプチドをαＧａｌ融合ポリペプチドと称する。

Description

（発明の分野）
本発明は、概して超急性を処置または予防するための組成物および方法に関し、より詳しくは、炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌを含む融合ポリペプチドを含有する組成物に関する。

（発明の背景）
同種移植用のドナー器官が慢性的に欠乏していることは、動物からヒトへの器官または組織、すなわち異種移植が実施できれば解決することが可能である。ブタは、ヒトの異種移植とって最も適したドナー種であると考えられている。しかし、それを常套手段として用いる前に解決すべきいくつかの問題がある。最初の免疫性障害は、炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌ（α−Ｇａｌ）（ブタ等の他の哺乳類に存在）に特異的なヒト、類人猿、および旧大陸サルの異種反応性（ｘｅｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）天然抗体（ＸＮＡｂ）によって、引き起こされる。ブタ血管内皮細胞上のα−Ｇａｌエピトープに対するＸＮＡｂｓの結合によって、数分から数時間のうちに移植片機能損失に至る一連のイベントが開始される（（Ｇａｌｉｌｉ， Ｕ．， １９９３； Ｏｒｉｏｌ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９３）。

（発明の要旨）
本発明は、ひとつには、ムチン型タンパク質主鎖上の異なるコア糖鎖によって炭水化物エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌ（αＧａｌ）が特異的に高密度で発現しうるという発見にもとづいている。このような高密度のαＧａｌエピトープによって、遊離糖類と比較して、抗αＧａｌの結合または除去（すなわち、吸着）の増大が生じるか、または固相に結合したαＧａｌ決定基をもたらす。本明細書ではポリペプチドをαＧａｌ融合ポリペプチドと称する。

本発明は、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ特異的抗体に結合する融合ポリペプチドを特徴とする。融合ポリペプチドとして、ムチン・ポリペプチドと免疫グロブリン・ポリペプチドとが挙げられる。ムチン・ポリペプチドは、以下の配列Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ、ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ、およびＮｅｕＧｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘを含むグリカン・レパートリーを有する。

また、本発明は、第２のポリペプチドに結合したβ１，６，Ｎ−アセチルグリコサミン転移酵素とα１，３ガラクトシル基転移酵素とによってグリコシル化されたムチン・ポリペプチドの少なくとも一領域を含む第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドである特徴とする。

また、本発明によって提供されるものは、融合ポリペプチドを生産する方法である。融合ポリペプチドの生産を、免疫グロブリン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードしている核酸に対して操作可能に結合したムチン・ポリペプチドをコードする核酸と、α１，３，ガラクトシル基転移酵素ポリペプチドをコードする核酸と、β１，６，−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ポリペプチドをコードする核酸とを含む細胞を与えることでおこなう。あるいは、融合ポリペプチドの生産を、免疫グロブリン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードしている核酸に対して操作可能に結合したムチン・ポリペプチドをコードする核酸、α１，３，ガラクトシル基転移酵素ポリペプチドをコードする核酸、およびβ１，６，−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ポリペプチドをコードする核酸を、細胞に対して導入すること（例えば、トランスフェクションまたは形質転換）によって、おこなう。融合ポリペプチドの生産を可能とする条件下で上記細胞を培養し、該培養から融合ポリペプチドを単離する。融合ポリペプチドの単離は、既知の方法を用いておこなわれる。例えば、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィを用いて、上記融合ポリペプチドを単離する。

上記細胞は、真核細胞または原核細胞（例えば、細菌細胞）である。例えば、真核細胞は、ほ乳類動物細胞、昆虫細胞、または酵母細胞である。典型的な真核細胞として、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、または２９３細胞が挙げられる。

ムチン・ポリペプチドは、例えばＰＳＧＬ−１である。好ましくは、ムチン・ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分である。好ましい実施形態では、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン・ポリペプチドの少なくとも一領域を含む。例えば、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの少なくとも一領域を含む。あるいは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のＦＣ領域を含む。

上記融合ポリペプチドは、多量体である。好ましくは、上記融合ポリペプチドは二量体である。

また、本発明は、本明細書に記載するαＧａｌ融合ポリペプチド・コード化核酸を含むベクターと同様に、αＧａｌをコードする核酸と、本明細書に記載するベクターまたは核酸を含む細胞とを包含する。あるいは、ベクターは、α１，３ガラクトシル基転移酵素および／または２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素をコードする核酸をさらに含む。本発明はまた、αＧａｌ融合ポリペプチドを発現させるために遺伝子操作された宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）も包含する。

別の態様では、本発明は被験体での抗体媒介拒絶（例えば、超急性拒絶）を処置する方法を提供する。この方法は、生体試料（例えば、被験体由来の全血または血漿）を本発明のαＧａｌ融合ポリペプチドと接触させて、融合ポリペプチド−抗体複合体を形成することを含む。この複合体を生体試料から除去し、該生体試料を被験体に再び融合させる。

また、本発明に包含されるものは、本発明のαＧａｌ融合ペプチドに試料を接触させて抗体−融合ペプチド複合体を形成させ、該複合体を生体試料から除去することで、その試料から抗体を除去する方法である。

また、本発明に包含されるものは、αＧａｌ融合ポリペプチドを含む医薬品組成物である。

特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する当該技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を持つ。本明細書中で記載されるそれらに対する方法と類似の材料または等価物が本発明の実行またはテストで使われることができるにもかかわらず、適した方法と材料は後述する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献を、全体として本明細書で援用する。矛盾する場合、定義を含む本明細書がコントロールする。また、材料、方法、および実施例は例証のためのものであって、限定することを意図したものではない。

本発明の他の特徴および効果は、以下の詳細な説明から、さらに特許請求の範囲から、明らかである。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ひとつには、炭水化物エピトープ Ｇａｌα１，３Ｇａｌ （αＧａｌ）が高密度で、かつムチン型タンパク質主鎖上の異なるコア糖鎖によって、特異的に発現しうるということの発見にもとづいている。より具体的には、本発明は、ムチン型タンパク質主鎖のαＧａｌエピトープの発現が該ポリペプチドを発現する細胞株に依存するという驚くべき発見にもとづいている。さらに、ムチンのグリカン・レパートリーを外来α１，３ガラクトシル基転移酵素およびコア２分岐酵素の共発現によって修飾することができる。この修飾によって、αＧａｌエピトープの密度がよりいっそう高くなり、糖類が無いもの、固相に結合したαＧａｌデターミナント、またはα１，３ガラクトシル基転移酵素単独によりトランスフェクションした細胞と比較して、抗αＧａｌ抗体の結合または除去（すなわち、吸着）の増加が生ずる。

ＣＯＳ細胞でのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質およびブタα１，３ガラクトシル基転移酵素（α１，３ＧａｌＴ）の一時的トランスフェクションは、α−Ｇａｌエピトープにより大幅に置換された二量体融合タンパク質を生ずる。この融合タンパク質は、大体、１つの二量体あたり複数の末端α−Ｇａｌエピトープを有するとともに、アガロース・ビーズに固定されたブタ・チログロブリンよりも２０倍高く（炭水化物モル基準で）、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ共役アガロースおよびマクロ孔ガラス・ビーズよりもそれぞれ５，０００および３０，０００高い異種反応性天然抗体（ＸＮＡｂ）吸着効率を有する。

ＰＳＧＬ−１／ｍｌｇＧ２ｂ上のαＧａｌエピトープ密度およびＰＳＧＬ−１／ｍｌｇＧ_２ｂの抗ブタ抗体吸着効率に対する宿主細胞の重要性を調べるために、そのタンパク質を、ブタα１，３ＧａｌＴとともに、ＣＨＯ、ＣＯＳ、および２９３Ｔ細胞で安定的に発現させた。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上でのα−Ｇａｌ置換のレベルとその抗ブタ抗体吸着能は、宿主細胞に依存した。ＣＯＳ細胞で作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂでは、α１，３ＧａｌＴなしでＣＯＳ細胞で作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂと比較して、相対的Ｏ．Ｄ（ＧＳＡ−反応性／抗マウスＩｇＧ反応性）が５．３倍増加した（図２）。同様に、２９３Ｔ細胞で作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂでは、相対的Ｏ．Ｄが３．１倍増加した。それとは対照的に、ＣＨＯ細胞で作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂでは、１．８倍増加したのみであった（図２）。異なる宿主細胞で作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの抗ブタ抗体吸着効率は、そのαＧａｌ置換の度合いと相関関係があった。

驚くべきことに、ＣＨＯ細胞でのコア２β１，６ＧａｌｃＮＡｃ転移酵素（Ｃ２ ＧｎＴＩ）の共発現は、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂαＧａｌ エピトープ密度および抗ブタ抗体吸着効率を改善した。さらに、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂは、ブタα１，３ＧａｌＴとともにＣＨＯ細胞で発現し、Ｃ２ ＧｎＴＩは、末端Ｇａｌ−Ｇａｌと一致する配列を持つ３つの異なるＯ−グリカンを担持した（図２）。それとは対照的に、末端Ｇａｌ−Ｇａｌエピトープは、Ｃ２ ＧｎＴＩなしのＣＨＯ細胞で発現されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上のＯ−グリカンでは、検出されなかった。図２に示すように、Ｃ２ ＧｎＴＩおよびα１，３ＧａＩＴの両方を発現しているＣＨＯ細胞で生産された融合タンパク質上のα−Ｇａｌのレベルは、著しく増加し、外来α１，３ＧａｌＴのみを発現するＣＯＳおよび２９３Ｔ細胞で作られた融合タンパク質のα−Ｇａｌエピトープ・レベルを超えた。さらに、融合タンパク質の抗ブタ抗体吸着能が、ＣＯＳおよび２９３Ｔ細胞と比べて、ＣＨＯ細胞で増加した（図３）。マススペクトル分析によって確認されたことは、α−Ｇａｌエピトープ密度増加の原因が、Ｃ２ ＦｎＴＩおよびα１，３ＧａｌＴの両方を発現させるために操作されたＣＨＯ細胞で作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ のＯ−グリカン上でのコア２分岐およびラクトサミン伸張にあるということであった（図７および図８、ならびに表ＩＩ）。

炭水化物エピトープに対する抗体の結合は、提示された糖類の立体構造（コンホメーション）に依存している。組織血液型抗原が溶液中で異なる立体構造をとることが示されており（（Ｉｍｂｅｒｔｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９５）、また立体構造に依存する抗血液型抗体が炭水化物デターミナント（所謂マイクロ・エピトープ）の異なる領域を認識することも示されている（Ｉｍｂｅｒｔｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９６）。同様に、研究によって明らかになったことは、リガンドに結合すると、より少ないエネルギーで好ましい立体構造を誘導することができるレセプターである（Ｉｍｂｅｒｔｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９３）。２種類の異種抗原（αＧａｌ−ＬａｃＮＡｃおよびαＧａｌ−Ｌｅｗｉｓ ｘ）に対する研究によって明らかにされたことは、たとえ後者のエピトープのフコース残基がラクトサミン構造に対して立体構造的規制を誘導した場合であっても、末端Ｇａｌα１，３Ｇａｌ二糖類がかなりフレキシブルであった（Ｃｏｒｚａｎａ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ２００２）。したがって、ともに所謂天然抗体によって認識された組織血液型抗原および異種抗原は、いくつかの異なる立体構造を採用することができ、これらの抗体が認識するエピトープの立体構造を予測することが困難かもしれない。さらに、オリゴ糖の内側コア構造は、タンパク質−炭水化物複合体の結合に直接関係するものではないが、その結合親和性に影響することが示された（Ｍａａｈｅｉｍｏ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９５）。α１，３ＧａｌＴおよびＣ２ ＧｎＴＩを共発現するＣＨＯ細胞上で発現したＯ−グリカンの構造的分析によって、α−Ｇａｌエピトープが３つの異なるオリゴ糖で発現されることが明らかになった（図７および表ＩＩ）。したがって、コア２およびラクトサミン構造の効果とは別に、オリゴ糖のコア２分岐のうちの１つの分岐上に位置したＮ−アセチルおよびＮ−グリコリル・ノイラミン酸がそれらの異種抗原によってとられた立体構造に影響を及ぼす可能性があった。また、シアル酸は結合エピトープの一部である可能性がある。したがって、一部の異種反応性抗体レパートリーは、それらの分岐エピトープを、Ｇａｌｉｌｉ抗原を認識するものとは異なる結合特異性で認識する（（Ｇａｌｉｌｉ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， １９８５）。さらにまた、Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、ブタで発現される （Ｂｏｕｈｏｕｒｓ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｍａｌｙｋｈ， Ｙ． Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｍａｌｙｋｈ， Ｙ． Ｎ． ｅｔ ａｌ．， ２００１）。しかし、Ｎ−グリコリルノイラミン酸の発現は、ヒトではみとめられず（Ｖａｒｋｉ， Ａ．， ２００１）、ヒト異種反応性抗体によって認識されることが明らかになっている（Ｚｈｕ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， ２００２）。したがって、Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有グリカンは、異種反応性抗体のさらに別のグループと結合する可能性がある。

本発明は、抗αＧａｌ抗体の吸着剤として有用な多数のαＧａｌエピトープを含むムチン免疫グロブリン融合タンパク質（以下、「αＧａｌ融合タンパク質」という）を提供する。例えば、αＧａｌ融合タンパク質は、異種移植に先立って血液または血漿からレシピエント抗αＧａｌ抗体を取り除くことに有用である。αＧａｌ融合タンパク質は、レシピエントの血液または血漿から１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％の抗αＧａｌ抗体を吸着する。

αＧａｌ融合ペプチドは、炭水化物モル基準で、野生型αＧａｌデターミナントの糖類なしと比較して、抗血液型抗体の除去または結合に対して、よりいっそう効率的である。αＧａｌ融合タンパク質が結合する抗αＧａｌ抗体の数は、等量の野生型αＧａｌデターミナントの糖類なしと比べると、２倍、４倍、６倍、１０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍、またはそれ以上多い。

（融合ポリペプチド）
種々の態様では、本発明は、第２のポリペプチドに結合した糖タンパク質（例えば、ムチン・ポリペプチド）の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを有する融合タンパク質を提供する。本明細書で用いられるように、「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「キメラ・タンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、非ムチン・ポリペプチドに対して操作可能に結合したムチン・ポリペプチドの少なくとも一部分を含む。「非ムチン・ポリペプチド（ｎｏｎ−ｍｕｃｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、その質量の少なくとも４０％未満がグリカンに起因するポリペプチドをいう。

「ムチン・ポリペプチド（ｍｕｃｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ムチン・ドメインを持つポリペプチドをいう。このムチン・ポリペプチドのムチン・ドメイン数は、１、２、３、５、１０、２０、またはそれ以上である。ムチン・ポリペプチドは、Ｏ−グリカンによって置換されたアミノ酸配列によって特徴づけられる任意の糖タンパク質である。例えば、ムチン・ポリペプチドは２つ目または３つ目のアミノ酸ごとにセリンまたはスレオニンを有する。ムチン・ポリペプチドは、分泌されたタンパク質である。あるいは、ムチン・ポリペプチドは細胞表面タンパク質である。

ムチン・ドメインは、アミノ酸のスレオニン、セリン、およびプロリンが豊富であり、そこでＮ−アセチルガラクトサミンを介してオリゴ糖がヒドロキシアミノ酸（Ｏ−グリカン）に結合する。ムチン・ドメインは、Ｏ−結合グリコシル化部位を含む、あるいは代わりに、該Ｏ−結合グリコシル化部位からなる。ムチン・ドメインのＯ−グリコシル化部位の数は、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個、またはそれ以上である。あるいは、ムチン・ドメインは、Ｎ−結合グリコシル化部位を含む、あるいは代わりに、該Ｎ−結合グリコシル化部位からなる。ムチン・ポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％がグリカンに起因する。ムチン・ポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、またはＭＵＣ１２）によってコードされた任意のポリペプチドである。あるいは、ムチン・ポリペプチドは、Ｐ分泌糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、Ｇ１ｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ、赤血球グリコホリン、グリコカリシン、グリコホリン、シアロフォリン、ロイコ・シアリン、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）−Ｒ、ＺＰ３、およびエピグリカニンである。好ましくは、ムチンは、ＰＳＧＬ−１である。ＰＳＧＬ−１は、各々が４０２個のアミノ酸を含む、１型トランスメンブレン・トポロジーの２つのジスルフィド結合１２０ｋＤａサブユニットを持ち、該サブユニットの各々が４０２のアミノ酸を含むホモ二量体糖タンパク質である。細胞外ドメインには、１０アミノ酸コンセンサス配列Ａ Ｑ（Ｍ） Ｔ Ｔ Ｐ（Ｑ） Ｐ（ＬＴ） Ａ Ａ（ＰＧ） Ｔ（Ｍ） Ｅが１５回繰り返して存在し、該配列はＯ−結合オリゴ糖を付加するための潜在的部位を３または４カ所有する。ＰＳＧＬ−１は、各モノマーあたり、Ｏ−結合グリコシル化のための部位数が５３を上回り、またＮ−結合グリコシル化のための部位を３つ有する。

ムチン・ポリペプチドは、ムチン・タンパク質の全てまたは一部を含む。あるいは、ムチン・タンパク質は、該ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチン・ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分またはその一部を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ａ５７４６８に開示されるアミノ酸１９−３１９）。ムチン・ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１のシグナル配列部分（例えば、アミノ酸１−１８）、膜貫通（トランスメンブラン）ドメイン（例えば、アミノ酸３２０−３４０）、および細胞質ドメイン（例えば、アミノ酸３４４−４１２）を含む。

本発明のαＧａｌ融合タンパク質内で、ムチン・ポリペプチドはムチン・タンパク質の全てまたは一部分に一致する。例えば、αＧａｌ融合タンパク質は、ムチン・タンパク質の少なくとも一部分を含む。「少なくとも一部分（ａｔ ｌｅａｓｔ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、ムチン・ポリペプチドが少なくとも１つのムチン・ドメイン（例えば、Ｏ−結合グリコシル化部位）を含むことを意味している。任意に、ムチン・タンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分から構成される。例えば、ムチン・ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分から構成される。

ムチン・ポリペプチドは、表２に示すようにグリカン・レパートリーで装飾される。例えば、ムチン・ポリペプチドは、表２に示す炭水化物配列を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上有する。例えば、ムチン・ポリペプチドはグリカン・レパートリーを有し、該グリカン・レパートリーとしてＨｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ、ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ、およびＮｅｕＧｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘが挙げられる。ムチン・ポリペプチドは、末端αＧａｌ糖を１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上有する。好ましくは、その末端糖は、２、３、４、５、またはそれ以上の数の異なるオリゴ糖で発現される。任意に、ムチンはＮ−アセチル・ノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、および／またはシアル酸を含む。さらに、ムチンのオリゴ糖として、コア２分岐、コア１分岐、およびラクトサミン伸張が挙げられる。

第１のポリペプチドは、１種類または複数の転移酵素によって、グリコシル化される。転移酵素は外来性である。あるいは、転移酵素は内在性である。第１のポリペプチドは、２つ、３つ、５つ、またはそれ以上の転移酵素によってグリコシル化される。グリコシル化は経時的または連続的である。あるいは、グリコシル化は同時、またはランダム、すなわち特に決まった順序もなくおこなわれる。例えば、第１のポリペプチドは、α１，３ガラクトシル基転移酵素によってグリコシル化される。α１，３ガラクトシル基転移酵素のための適当なソースとして、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７３５５８、Ｌ３６１５０、ＢＡＢ３０１６３、ＡＫ０１６２４８、Ｅ４６５８３、またはＰ５０１２７が挙げられ、本明細書ではそれらをそのまま援用する。あるいは、第１のポリペプチドは、コア２分岐酵素またはＮ−アセチルゴルコサミン転移酵素（例えば、β１，６Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素）によって、グリコシル化される。β１，６Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素のための適当なソースとして、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ７９６１０、Ｚ１９５５０、ＢＡ−Ｂ６６０２４、またはＡＰ００１５１５が挙げられる。好ましくは、第１のポリペプチドは、１，３ガラクトシル基転移酵素およびβ１，６Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の両方によってグリコシル化される。

融合タンパク質内では、用語「操作可能に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、第１のポリペプチドのＯ−結合グリコシル化を可能とするようにして、第１および第２のポリペプチドが化学的に結合（最も一般的にはペプチド結合等の共有結合を介して）することを示すように意図されている。融合ポリペプチドをコードする核酸を言及するために用いる場合、「操作可能に結合」という用語は、ムチン・ポリペプチドおよび非ムチン・ポリペプチドをコードする核酸が互いにフレーム単位（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合していることを意味している。非ムチン・ポリペプチドは、ムチン・ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合しうる。

任意に、αＧａｌ融合タンパク質は、１つ以上の付加的構成成分に結合する。例えば、αＧａｌ融合タンパク質はＧＳＴ融合タンパク質と付加的に結合し、該αＧａｌ融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−転移酵素）配列のＣ末端と融合する。そのような融合タンパク質は、αＧａｌ融合タンパク質の精製を促進することができる。あるいは、αＧａｌ融合タンパク質は、固相に対して付加的に結合する。種々の固相が当業者に知られている。そのような組成物は、抗αＧａｌ抗体の除去を促すことができる。例えば、αＧａｌ融合タンパク質は、金属化合物、シリカ、ラテックス、高分子材料等から作られた粒子；マイクロタイター・プレート； ニトロセルロース、もしくはナイロン、またはそれらの組み合わせに結合する。固体支持体に結合したαＧａｌ融合タンパク質は、生体試料（例えば、血液または血漿）から抗αＧａｌ抗体を除去するための吸着剤として用いられる。

融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列（すなわち、ムチン核酸によってコードされているポリペプチドに存在しないポリペプチド配列）を含む。例えば、天然ムチン・シグナル配列を取り除いて、他のタンパク質由来のシグナル配列と置き換えることができる。ある種の宿主細胞（例えば、ほ乳類の宿主細胞）では、ポリペプチドの発現および／または分泌を、異種シグナル配列の使用を介して増加させることができる。

本発明のキメラ・タンパク質および融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって作ることができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術にもとづいてフレーム単位で連結する（例えば、連結反応のための平滑末端化（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）または突出末端化（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）された末端、適当な末端を生ずる制限酵素による消化、必要に応じた付着端の充填、不要な結合を避けるためのアルカリ・ホスファターゼ処理、および酵素による連結反応を用いる）。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成装置等、従来の技術によって合成することができる。あるいは、２つの連続的な遺伝子フラグメントの間に相補的なオーバーハングを生じるアンカー・プライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅をおこなうことができる。その後、これらの遺伝子フラグメントをアニーリングおよび再増幅することで、キメラ遺伝子配列が得られる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２を参照せよ）。さらに、多くの発現ベクターが商業的に入手可能であり、それらは融合構成成分（例えば、免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域）をコードする。融合構成成分がフレーム単位で免疫グロブリン・タンパク質に結合されるように、ＰＳＧＬ−１をコードする核酸をそのようなベクターにクローニングすることができる。典型的なＰＳＧＬ−１発現ベクターは、配列番号２１を含む。

αＧａｌ融合ポリペプチドは、オリゴマーとして存在する。すなわち、二量体、三量体、または五量体として存在する。好ましくは、αＧａｌ融合ポリペプチドは、二量体である。

第１のポリペプチド、および／または該第１のポリペプチドをコードする核酸は、当業者公知のムチン・コード配列を用いて構築される。ムチン・ポリペプチドおよび該ムチン・ポリペプチドをコードする核酸の適当なソースとして、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ６６３６２５および ＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５および ＡＪ４１７８１５、ＸＰ１４０６９４および ＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７および ＸＭ００６８６７、ならびに ＮＰ００３３１７７７および ＮＭ００９１５１がそれぞれ挙げられ、本明細書ではそれらをそのまま援用する。

あるいは、ムチン・ポリペプチド構成成分は、炭水化物含有量の増加（非突然変異配列と比較して）をもたらす天然ムチン配列（野生型）の突然変異を持つ変異ムチン・ポリペプチドとして、提供される。例えば、変異ムチン・ポリペプチドは、野生型ムチンと比較して、付加的なＯ−結合グリコシル化部位を含んでいた。あるいは、変異ムチン・ポリペプチドは、野生型ムチン・ポリペプチドと比較して、セリン、スレオニン、またはプロリンの数が増加するアミノ酸配列突然変異を含む。このような炭水化物含有量の増加は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質と炭水化物との比率を決定することで、評価することができる。

いくつかの実施形態では、ムチン・ポリペプチド構成成分は、タンパク質分解に対してより高い耐性を示すムチン配列（非突然変異配列と比較して）をもたらす天然ムチン配列（野生型）での突然変異を有する変異ムチン・ポリペプチドとして、提供される。

第１のポリペプチドは、完全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、第１のポリペプチドは、完全長よりも短いＰＳＧＬ−１ポリペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分）を含む。例えば、第１のポリペプチドは、長さが４００アミノ酸未満、例えば３００、２５０、１５０、１００、５０、または２５アミノ酸以下である。典型的なＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび核酸配列として、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＸＰ００６８６７、ＸＭ００６８６７、ＸＰ１４０６９４、および ＸＭ１４０６９４が挙げられる。

第２のポリペプチドは、好ましくは可溶性である。第２のポリペプチドは、αＧａｌ融合と第２のムチン・ポリペプチドとの結合を促進する配列を含む。好ましくは、第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン・ポリペプチドの一領域を含む。「少なくとも一領域（ａｔ ｌｅａｓｔ ａ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、免疫グロブリン分子の任意の部分、例えばＬ鎖、Ｈ鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域、またはそれらの任意のフラグメントを含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは公知であり、例えば米国特許第５，５１６，９６４号、第５，２２５，５３８号、第５，４２８，１３０号、第５，５１４，５８２号、第５，７１４，１４７号、および第５，４５５，１６５号に記載されている。

第２のポリペプチドは、完全長免疫グロブリンは、完全長免疫グロブリン・ポリペプチドを含む。あるいは、第２のポリペプチドは、完全長よりも短い免疫グロブリン・ポリペプチド（例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆｖ、またはＦｃ）を含む。好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン・ポリペプチドのＨ鎖を含む。より好ましくは、第２のポリペプチドは免疫グロブリン・ポリペプチドのＦｃ領域を含む。

本発明の別の態様では、第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも劣るエフェクター機能を持つ。Ｆｃエフェクター機能は、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体固定、およびＴ細胞減少活性が含まれる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照せよ）。Ｔ細胞減少活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性を評価する方法は、公知である。一実施形態では、第２のポリペプチドはＦｃレセプターに対して低親和性を示すか、あるいは親和性を示さない。別の実施形態では、第２のポリペプチドは補体タンパク質Ｃ１ｑに対して低親和性を示すか、あるいは親和性を示さない。

本発明の別の態様は、ムチン・ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体、もしくは相同体（ホモログ）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。種々の態様では、ベクターは免疫グロブリン・ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に結合したムチン・ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体、もしくは相同体（ホモログ）をコードする核酸を含む。さらに、ベクターは、α１，３ガラクトシル基転移酵素、コア１，６，−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素またはそれらの任意の組み合わせを含む。転移酵素は、αＧａｌ融合タンパク質のムチン部分のペプチド主鎖上に対するαＧａｌデターミナントの付加を促す。典型的なベクターは、配列番号１、１１、または２１を含む。本明細書で用いられるように、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は核酸分子であり、該核酸分子が結合する別の核酸を搬送することが可能なものをいう。ベクターの１つの種類として、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」があり、該プラスミドとは追加のＤＮＡセグメントが連結しうる環状二重鎖ＤＮＡループのことである。ベクターの別の種類として、ウイルス・ベクターがあり、追加のＤＮＡセグメントがウイルス・ゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、該ベクターが導入される宿主細胞で自律複製ができる（例えば、細菌複製開始点を持つ細菌ベクターおよびエピソームほ乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームほ乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると直ちに該宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによってその宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それが操作可能に連結している遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）」と称する。一般に、発現ベクターは、しばしばプラスミドの形で、組換えＤＮＡ技術で有用である。本明細書では、ベクターの最も一般的な使用形態がプラスミドであることから、「プラスミド」および「ベクター」を互いに置き換えて使用することができる。しかし、本発明は、等価な機能を呈するそのような発現ベクターの他の形態、例えばウイルス・ベクター（例：複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）を含むことを意図している。

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸発現に適した形状の核酸を含む。このことは、その組換え発現ベクターが１種類以上の調節配列を含むことをを意味し、該配列は発現に使用される宿主細胞にもとづいて選択され、発現される核酸配列に操作可能に結合している。組換え発現ベクターの中で、「操作可能に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ−ｌｉｎｋｅｄ）」とは、ヌクレオチド配列の発現（例えば、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写／翻訳系で、または宿主細胞にベクターが導入された場合は宿主細胞で）を可能とするようにして、目的とするヌクレオチド配列が調節配列に結合していることを意味している。

用語「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」が意味することには、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）に記載されている。調節配列として、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの、およびある種の宿主細胞のみにあるヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。当業者が容易に理解することは、発現ベクターの設計が、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のファクターに依存しうることである。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することで、本明細書に記載した核酸によってコードされる融合タンパク質または融合ペプチド等（例えば、ＡＢＯ融合ポリペプチド、ＡＢＯ融合ポリペプチドの変異体、その他）のタンパク質またはペプチドを生産することができる。

本発明の組換え発現ベクターを、原核細胞または真核細胞でのαＧａｌ融合ポリペプチドの発現用に設計することができる。例えば、αＧａｌ融合ポリペプチドは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌参謀、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、またはほ乳類動物細胞で発現することができる。適当な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）でさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクターを、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写および翻訳することができる。

原核生物でのタンパク質発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を目的とした構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含むベクターを持つ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）でおこなわれる。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそこでコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、加える。そのような融合タンパク質は、概して３つの目的、すなわち（ｉ）組換えタンパク質の発現を高めること、（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を高めること、および（ｉｉｉ）親和性精製でリガンドとして作用することで組換えタンパク質の精製を助けること、にかなう。しばしば、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製の後の融合構成成分（ｆｕｓｉｏｎ ｍｏｉｅｔｙ）からの組換えタンパク質分離を可能とするために、タンパク質分解切断部位が融合構成成分と組換えタンパク質との接続部分で導入される。そのような酵素（および該酵素の同種認識配列）として、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとして、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｎｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ； Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， １９８８． Ｇｅｎｅ ６７： ３１−４０）， ｐＭＡＬ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．） 挙げられ、これらはグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡのそれぞれを標的組換えタンパク質に融合させる。

適当な誘導可能な非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ （Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）および ｐＥＴ １１ｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） ６０−８９）が挙げられる。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換えタンパク質発現を最大にする１つの戦略は、組み換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力に欠けた宿主細菌でそのタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） １１９−１２８を参照せよ。別の戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で優先的に用いられように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである（例えば、Ｗａｄａ， ｅｔ ａｌ．， １９９２． Ｎｕｃｉ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０： ２１１１−２１１８を参照せよ）。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準的ＤＮＡ合成技術によっておこなうことができる。

別の実施形態では、αＧａｌ融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｎｒｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅでの発現用ベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃｌ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， １９８７． ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ２２９−２３４）、ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， １９８２． Ｃｅｌｌ ３０： ９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９８７． Ｇｅｎｅ ５４： １１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ （ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。

あるいは、αＧａｌ融合ポリペプチドをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現させることができる。 培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルス・ベクターとして、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．， １９８３． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３： ２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系 （Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， １９８９． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０： ３１−３９）が挙げられる。

さらに別の実施形態では、本発明の核酸はほ乳類発現ベクターを用いてほ乳類細胞で発現させることができる。ほ乳類発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ， １９８７． Ｎａｔｕｒｅ ３２９： ８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｉｎａｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８７． ＥＭＢＯ Ｊ． ６： １８７−１９５）が挙げられる。ほ乳類細胞で用いた場合、発現ベクターの調節機能は、しばしばウイルスの調節要素によって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物および真核細胞のための他の適当な発現系に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９の第１６章および第１７章を参照せよ。

本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」および「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、本明細書では相互に置き換え可能なかたちで用いられる。そのような用語が特定の被験体細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫にも言及することが理解される。突然変異または外界の影響によって後続世代で一定の修飾が生ずることから、実際のところ、そのような子孫は親細胞とは同一ではないと思われるが、それでも本明細書で用いられるようにその用語の範囲内である。

宿主細胞は、任意の原核生物または真核細胞である。例えば、αＧａｌ融合ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）等の細菌細胞、昆虫細胞、酵母、またはほ乳類細胞（例えば、ヒト、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはＣＯＳ細胞）で発現される。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知である。

従来の形質転換または形質移入（トランスフェクション）技術によって、ベクターＤＮＡ免疫を原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いられるように、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の公知技術に言及するものである。上記技術として、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法が挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションさせるための適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．， ｅｔ ａｌ． （ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）および他の研究室マニュアルに見いだすことができる。

ほ乳類細胞の安定的なトランスフェクションのために、用いた発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のわずかなフラクションのみが外来ＤＮＡを該細胞のゲノムに組み込まれる可能性がある。これらの組み込まれた要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が一般に、目的とする遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択可能マーカーとして、薬物（Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）に対する耐性を与えるものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、糖タンパク質Ｉｂαをコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入されるか、もしくは別のベクター上で導入される。誘導核酸により安定的にトランスフェクションした細胞は、薬物選択によって同定される（例えば、選択マーカー遺伝子が取り込まれた細胞は生存し、他の細胞は致死する）。

本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核または真核宿主細胞）を用いてαＧａｌポリペプチドを生産（すなわち、発現）させることができる。したがって、本発明は、該発明の宿主細胞を用いてαＧａｌ融合ポリペプチドを生産するための方法を、さらに提供する。一実施形態では、この方法は、本発明の宿主細胞（αＧａｌ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、αＧａｌ融合タンパク質が生産されるように、適当な培地で培養することを含む。別の実施形態では、本発明はさらに培地または宿主細胞からαＧａｌポリペプチドを単離することを、さらに含む。

αＧａｌ融合ポリペプチドを、従来の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィ、泳動、その他）にもとづいて単離および精製してもよい。例えば、免疫グロブリン融合タンパク質は、該融合タンパク質のＦｅ部分に選択的に結合する固定化プロテインＡおよびプロテインＧを含むカラムに溶液を通すことによって、精製することが可能である。例えば、Ｒｅｉｓ， Ｋ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３２：３０９８−３１０２ （１９８４）および ＰＣＴ出願公開番号 Ｗ０８７／００３２９を参照せよ。融合ポリペプチドの溶離は、カオトロピック塩処理または酢酸（１Ｍ）水溶液によっておこなうことが可能である。

あるいは、本発明にもとづくαＧａｌ融合ポリペプチドを、公知の方法を用いて化学的に合成することができる。ポリペプチドの化学合成が記載されており、例えば、種々のタンパク質合成方法が当該技術分野で普及しており、例えばペプチド合成装置を用いた合成が挙げられる。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ， Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ， Ｅｄ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９８８、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２： ２４１−２４７ （１９８６）、 Ｂａｒａｎｙ， ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３０： ７０５−７３９ （１９８７）、 Ｋｅｎｔ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：９５７−９８９ （１９８８）、および Ｋａｉｓｅｒ， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： １８７−１９８ （１９８９）を参照せよ。ポリペプチドの精製は、標準的なペプチド精製技術を用いて、ポリペプチドが化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まないようにして、おこなう。「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い方は、ペプチドの合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から該ペプチドが分離されるペプチド調製を包含する。一実施形態では、「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い方は、化学物質前駆体または非ペプチド化学物質が約３０％（乾燥重量で）未満、より好ましくは化学物質前駆体または非ペプチド化学物質が約２０％未満、さらに好ましくは化学物質前駆体または非ペプチド化学物質が約１０％未満、最も好ましくは化学物質前駆体または非ペプチド化学物質が約５％未満であるペプチドの調製を包含する。

ポリペプチドの化学合成は、Ｄ−アミノ酸等の修飾または非転々アミノ酸および他の小有機分子の取り込みを促進する。対応のＤ−アミノ酸アイソフォームによるペプチド内の１つ以上のＬ−アミノ酸の置換は、酵素的加水分解に対するペプチドの耐性を高めるために、また生物学的に活性なペプチドの１種類以上の特性（すなわち、レセプター結合、機能的潜在能力、または作用の持続時間）を高めるために、用いることができる。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ， ｅｔ ａｌ．， １９９３． Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３６： ２５８５−２５９４、Ｋｉｒｂｙ， ｅｔ ａｌ．， １９９３． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３６：３８０２−３８０８、Ｍｏｒｉｔａ， ｅｔ ａｌ．， １９９４． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３５３： ８４−８８、 Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９３． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４２： ３９２−３９９、Ｆａｕｃｈｅｒｅ ａｎｄ Ｔｈｉｕｎｉｅａｕ， １９９２． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ２３： １２７−１５９を参照せよ。

ペプチド配列への共有結合的架橋の導入は、立体構造的およびトポグラフィックにポリペプチド主鎖を抑制することができる。この戦略は、能力、選択性、および安定性が高まった融合ポリペプチドのペプチド類似体の開発に用いることができる。環状ペプチドの立体構造的エントロピーが線形相対物よりも低いので、特異的立体構造の採用は、非環式の類似体よりも環状類似体に対するエントロピーの減少が少ないかたちでおこるので、それによって、結合のための自由エネルギーがより好ましく作られる。大環化（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）は、しばしば、ペプチドＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端またはＣ末端との間［例えば、Ｋ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６、ｐＨ８．５］（Ｓａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １３７： ５１８２−５１８５ （１９９６））、またはアミノ酸側鎖間での、アミド結合によって達成される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ， Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ， ３９： ５１−１２４ （１９８８）を参照せよ。ジスルフィド架橋もまた、線形配列に導入されて、該配列の柔軟性を減少させる。例えば、Ｒｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ， ３７： １−１０９ （１９８５）、Ｍｏｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｉｎ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， １０６： ５０５−５１２ （１９８２）を参照せよ。さらに、ペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）によるシステイン残基の置換が、いくつかのオピオイド・レセプターの選択性を高めるのに用いられている。Ｌｉｐｌｃｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｒｒ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｇｕｔｔｅ， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ． ２８７−３２０（１９９５）。

（超急性拒絶を処置または予防する方法）
本発明は、超急性拒絶（ＨＡＲ）、例えば異種移植拒絶を処置または予防する方法も含む。そのような移植組織として、限定されるものではないが、そのような移植組織は含む腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、角膜、または心臓が挙げられ、ＨＡＲの意味にはレシピエントによる任意の抗体媒介移植拒絶が含まれる。移植臓器の超急性拒絶は、臓器がレシピエントの血行にさらされてから数秒または数分のうちに生ずる。臓器は、急速に蒼白になって、レシピエントの体内に残存する場合、壊死が生ずる。この超急性反応は、ドナー臓器に対して抗体が予め形成されたため、起こる。ＨＡＲは、子宮内で多数の非自己抗原にさらされていることから、経産婦で最も一般的である。輸血回数が多いレシピエントも危険にさらされている。

この方法は、被験体由来の生体試料を本発明のαＧａｌ融合ペプチドと接触させることを含む。生体試料は、例えば血液、すなわち全血または血漿である。試料は、抗体（例えば、抗血液型抗体）を含むことが知られている、または含むと考えられている。いくつかの態様では、生体試料をαＧａｌ融合ペプチドに接触させる前に、該生体試料を被験体から回収する。生体試料を、αＧａｌ融合ペプチド− 抗血液型抗体複合体の形成を可能とさせる条件下で、融合ペプチドに接触させる。αＧａｌ融合ペプチド−複合体を、もし存在するならば、抗血液型抗体を除去するために生体試料から分離し、さらに該生体試料を被験体に再注入する。ＨＡＲの処置または予防は、被験体に対して本発明のαＧａｌ融合ペプチドを投与することによってもおこなわれる。

被験体は、例えばいずれかのほ乳類（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）である。被験体が異種移植を受ける前に、上記処置を施す。あるいは、被験体が異種移植を受けた後に処置を施す。

当業者に公知の方法で、生体試料をαＧａｌ融合タンパク質に接触させる。例えば、血漿分離交換法または体外免疫吸着である。

基本的に、ＨＡＲに病原学的に関連しているどのような疾患でも、予防または処置が受けいられると考える。臓器移植組織の生存率が、本発明の方法によって処置していない臓器移植組織よりも高い場合、ＨＡＲが処置または予防されている。移植組織の生存率が意味することは、レシピエントによって移植組織が拒絶される前の時間である。例えば、移植組織が該移植後の少なくとも１、２、４、または８週目に生存している場合に、ＨＡＲが処置または予防される。好ましくは、移植組織は、３、６、１３ヶ月生存する。より好ましくは、移植組織は２、３、５、またはそれ以上の年数生存する。

（試料からαＧａｌ抗体を除去する方法）
本発明はまた、試料から抗αＧａｌ抗体を除去または減少させる方法を含む。試料は、血液または血漿等の体液である。あるいは、試料は生体組織、例えば心臓組織、肝臓組織、皮膚、または腎臓組織である。この方法を試料を本発明のαＧａｌ融合ペプチドと接触させることを含む。αＧａｌ融合ペプチド− 抗αＧａｌ抗体複合体の形成を可能とさせる条件下で、その試料をαＧａｌ融合ペプチドと接触させる。αＧａｌ融合ペプチド−抗体複合体を、もし存在するならば、抗αＧａｌ抗体を除去または減少させるために、生体試料から分離する。

（αＧａｌ融合ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む医薬組成物）
ＡＢＯ融合タンパク質、または該融合タンパク質をコードする核酸分子（本明細書では「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」または「活性化合物（ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」ともいう）ならびにその誘導体、フラグメント、類似体、およびホモログを、投与のために適当な医薬組成物に取り込むことができる。そのような組成物は、概して核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に許容される担体を含む。 本明細書で用いられるように、「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」は、任意の、および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤、等張性および吸着性遅延薬剤、その他を含むことを意図しており、薬学的投与（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｄｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）と互換性を持つ。適当な担体は、当該分野での標準的参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最近の版に記載されており、本明細書ではこの文献を援用する。そのような担体または希釈剤の好ましい例として、限定されるものではないが、水、食塩水、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。不揮発性油のようなリポソームおよび非水溶ビヒクルも使用可能である。薬学的活性物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当分野では周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない範囲を除いて、組成物でのそれらの使用を意図している。追加の活性成分もまた、組成物に取り込むことができる。

本明細書に開示した活性剤もリポソームとして処方することができる。リポソームの調製は、公知の方法、例えばＥｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）、ならびに米国特許第 ４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載された方法でおこなう。循環時間を高めたリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。

特に有用なリポソームの生成は、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆相蒸着法によって、おこなうことができる。リポソームを所定のポア・サイズのフィルターから押し出されることで、所望の径を持つリポソームが得られる。

本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適合するように処方される。投与経路の例として、非経口（例えば、静脈内、皮内、および皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に用いる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる。すなわち、無菌希釈剤（例えば注射用蒸留水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチル・パラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩）、および張性調整剤（例えば、塩化ナトリウムおよびデキストロース）である。ｐＨは、酸または塩基（例えば塩化水素または水酸化ナトリウム）で調整することができる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多人数用バイアルに封入することができる。

注射可能な用途に適した医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性）もしくは分散液、または注射可能な滅菌溶液もしくは分散液の即席調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与用に関して、適当な担体として、生理的塩類溶液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、上記組成物は滅菌されていなければならず、また注射が容易にとなる範囲で流動的でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下に安定でなければならず、また細菌および菌類等の微生物による汚染作用から保護されなければならない。担体を、例えば、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）を含む溶媒または分散媒体、ならびにそれらの適当な混合物とすることができる。適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用を防止することは、種々の抗菌剤および抗かび剤、例えば、パラベン、クロロプタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールによって達成可能である。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール（例として、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム等が組成物中に含まれていことが好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸着は、吸着を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含有させることによって達成することができる。

注射可能な滅菌溶液の調製は、必要に応じて上記に列挙される成分の１つまたは組み合わせとともに、適当な溶媒中に活性化合物（例えばＡＢＯ融合タンパク質）を所望量取り込み、続いて濾過滅菌することによっておこなうことができる。通常、分散液は、塩基性分散媒と上記に列挙したうちの所望の他成分とを含む滅菌ビヒクルに活性化合物を取り入れることによって、調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製法は、事前に濾過滅菌した溶液から活性成分プラス任意の追加の所望成分の粉末を生ずる真空乾燥および凍結乾燥である。

経口組成物は、一般に不活性希釈剤または食用の担体を含む。それをゼラチンカプセルに封入または錠剤に圧縮することができる。経口治療薬投与の目的で、活性化合物を賦形剤とともに取り入れることができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形で使用することができる。経口組成物の調製は、流動性の担体を使用しておこなうこともでき、うがい薬として試用することができる。この場合、流動担体の化合物を経口投与し、口の中を洗い、吐き出すか、または飲み込む。薬学的に互換の結合剤および／または補助材料を組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれかまたは類似の性質の化合物を含むことができる。すなわち、バインダー（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）、賦形剤（例えば、澱粉またはラクトース、崩壊剤（例えばアルギン酸）、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはトウモロコシ澱粉）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））、流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、甘味料（例えば、スクロースまたはサッカリン）、あるいは香料（例えば、ペパーミント、メチルサリチレート、またはオレンジ香料）である。

吸入投与では、適当な推進体（例えばガス（例えば二酸化炭素）を含む加圧容器もしくはディスペンサ、または噴霧器からのエアゾール・スプレーのかたちで化合物を送達する。

全身投与は、経粘膜または経皮手段によってもおこなうことができる。経粘膜もしくは経皮投与のために、透過すべきバリヤーに対する適当な浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は周知であって、例えば、経粘膜投与用に、該浸透剤として、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐薬を用いることにより達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は周知の軟膏、塗剤、ゲル類、またはクリームとして処方される。

上記化合物を、直腸送達のための坐薬（例えば、カカオ脂および他のグリセリド等、従来の坐剤基剤による）または保持浣腸の形で調製することもできる。

一実施形態において、活性化合物は担体とともに調製され、該担体は、身体から化合物が迅速に除去されないように保護するもので、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化した送達系等の徐放製剤である。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための方法は、当業者にとって明らかである。上記材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対する単クローン抗体により感染細胞を標的化したリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として使うこともできる。これらは、米国特許第号４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に知られている方法によって調整することができる。

いくつかの実施形態では、経口のまたは非経口組成物は、投与の容易さと投薬量の均一性とのために投薬量単位形状で処方される。本明細書で用いられるように投薬量単位の形態は、処置される被験体のために一体的投薬量として適している物理的に離散的な単位をいう。すなわち、各々の単位は、必須の薬学的担体に関連して所望の治療効果を得るために計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬量単位形態の仕様は、活性化合物のユニークな特徴、達成すべき特定の治療効果、および個人の治療のためのそのような活性化合物を合成する当該技術分野固有の限界に指図され、かつ直接的に依存している。

本発明の核酸分子をベクターに挿入して遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照せよ）、または定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９４． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３０５４−３０５７）によって達成することができる。 遺伝子治療ベクターの製剤は、許容可能な希釈剤に遺伝子治療ベクターを含むことができ、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え型の細胞（例えばレトロウイルス・ベクター）からインタクトなかたちで生ずることができる場合は、製剤は遺伝子送達系を生ずる１種類以上の細胞を含むことができる。

必要に応じて、徐放製剤を調製することができる。徐放製剤の適当な例として、抗体含有固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、膜等の造形品の形状、またはマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル類、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルーメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩、非分解性エチレンビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体およびロイプロイドアセテートから構成される注射可能なミクロスフェア ）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸グリコール酸のようなポリマーが１００日以上にわたって分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルはより短時間のあいだにタンパク質を放出する。

医薬組成物を、投与のためのインストラクションと共に、容器、パック、またはディスペンサに入れることができる。

（略語）
以下の略語が本明細書で用いられる。すなわち、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞障害； ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン； ＤＸＲ、遅発性異物性拒否；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着検定法； ＦＴ、ｆｕｃｏｓｙｌ転移酵素；Ｇａｌ、Ｄ−ガラクトース； ＧＴ、ガラクトシル基転移酵素；Ｇｌｃ、Ｄ‐グルコース； Ｇ１ｃＮＡｃ、Ｄ−Ｎアセチルグルコサミン； Ｇ１ｙＣＡＭ−１、グリコシル化依存性細胞接着分子−１；ＨＡＲ， 超急性拒絶；Ｉｇ、免疫グロブリン； ＭＡｄＣＡＭ、粘膜アドレシン細胞接着分子； ＰＡＥＣ、ブタの大動脈血管内皮細胞； ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞； ＰＳＧＬ−１、Ｐ分泌糖タンパク質リガンド−１；ＲＢＣ、赤血球； ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法； Ｈｅｘ、ヘキソース； ＨｅｘＮＡｃ、Ｎ−アセチル・ヘキソサミン； ＮｅｕＡｃ、Ｎ−アセチル・ノイラミン酸； ＮｅｕＧｃ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸；およびＨｅｘＮｏｌはＮ−アセチル・ヘキソサミンの開いた（環でない）形状である。

本発明を、以下の非限定的例で更に説明する。

（実施例１：置換組換えＰセレクチン糖タンパク質リガンド／免疫グロブリン融合タンパク質の一時的発現）
（一般的方法）
（細胞培養）
ＣＯＳ−７ ｍ６細胞（３５）およびＳＶ４０ラージＴ抗原固定化ブタ大動脈内皮細胞株ＰＥＣ−Ａ（３６）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２５μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）で継代した。ヒトの赤血白血病細胞株Ｋ５６２とバーキットリンパ腫細胞株ＲａｊｉをＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ １６４０で培養した。

（発現ベクターの構築）
ブタα１，３ＧＴ（３７−３９）を、コーディング配列の５′末端、コザック（Ｋｏｚａｋ）翻訳開始コンセンサス配列、およびＨｉｎｄ３制限部位に相補的な６つのコドンを持つフォワード・プライマーと、コーディング配列の３′末端、翻訳停止およびＮｏｔ１制限部位に相補的な６つのコドンを持つリバース・プライマーとを用いて、ブタ脾臓ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。増幅１，３ＧＴｃＤＮＡを、Ｈｉｎｄ３およびＮｏｔ１（３５）を用いて、ＣＤＭ８のポリリンカーにクローニングした。Ｐ分泌糖タンパク質リガンド−１ （ＰＳＧＬ−１）、Ｐセレクチン（４０）コーディング配列に媒介結合した高グリコシル化ムチン型タンパク質を、ＨＬ−６０ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって得て、Ｈｉｎｄ３およびＮｏｔ１を用いてＣＤＭ８にクローニングし、さらにＤＮＡの塩基配列決定（シーケンシング）をおこなって確認した。ムチン免疫グロブリン発現プラスミドは、フレーム単位のＰＳＧＬ−１の細胞外部分のＰＣＲ増幅ｃＤＮＡをＢａｍＨ１部位を介して、ＣＤＭ７（Ｓｅｅｄ， Ｂ． ｅｔ ａｌ）の発現カセットとして担持されたマウスＩｇＧ２のＦｅ部分（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）に融合させることによって、構築した。

（分泌ムチン／免疫グロブリン・キメラの生産および精製）
ＣＯＳｍ６細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン・プロトコールおよび１μｇのＣｓＳＩ勾配生成プラスミドＤＮＡ／ｍｌトランスフェクション・カクテルを用いてトランスフェクトさせた。ＣＯＳ細胞を、空ベクター（ＣＤＭ８）、ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂプラスミド単独またはα１，３ＧＴコード化プラスミドとの組み合わせにより、約７０％密集度でトランスフェクトさせた。トランスフェクション細胞を、トランスフェクションの翌日にトリプシン処理して新しいフラスコへ移した。約１２時間にわたる付着の後で、培地を捨て、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、その後、新たに７日間にわたって無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（ｃａｔ．ｎｒ． １２０３０， Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で培養した。培養後、上清を回収し、デブリスを遠心（１，４００ｘｇ、２０分）により沈殿させ、ＮａＮ_３を０．０２％まで添加した。ＰＳＧＬＩ／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質を、４℃で一晩、ヤギ抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ（Ａ−６５３１、Ｓｉｇｍａ）上で転倒回転させて精製した。ビーズをＰＢＳで洗い、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析、またはヒトＡＢ血清および精製ヒト免疫グロブリンの吸着に用いた。

（ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの精製）
ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｅ特異的、Ａ−３３１６，Ｓｉｇｍａ）、ＩｇＭ（μ鎖特異的、Ａ−９９３５、Ｓｉｇｍａ）、およびＩｇＡ（α鎖特異的、Ａ−２６９２、Ｓｉｇｍａ）アガロース・ビーズを用いて、ヒトＡＢ血清（２０人を上回る人数の健康血液ドナーからプールした）から精製した。手短に言うと、５ｍｌのスラリー（２．５ｍｌ充填ビーズ）を、１０ｍｍ直径のカラムに注入し、ＰＢＳで洗浄した。プールしてあるヒトＡＢ血清１０ｍｌを、ペリスタル型ポンプを使用して１ｍｌ／分で適用し、カラム容量のＰＢＳのＰＢＳで数回洗浄し、１ｍｌ／分の流速で０．１Ｍグリシン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．４により溶離させた。１ｍｌのフラクションを、０．７ｍｌの中和緩衝液（０．２Ｍトリス／塩酸、ｐＨ ９）を含んでいる試験管に回収した。２８０ｎｍの吸着を分光光度的に読み取り、タンパク質を含んでいる試験管をプールし、１％ＰＢＳに対して透析し、さらに凍結乾燥した。凍結乾燥免疫グロブリンを蒸留水に再懸濁し、その濃度を１ｇＧについては１６ｍｇ／ｍｌ、ＩｇＡについては４ｍｇ／ｍｌ、さらにＩｇＭについては２ｍｇ／ｍｌに合わせてた。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット分析）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、垂直型Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｕｓ， Ｃａｌｉｆ．）（４１）を用いて５％の濃縮用ゲルと６または１０％の分離ゲルとによるＬｅａｍｍｌｉの方法で、おこなった。Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ電気泳動トランスファー・セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｕｓ， Ｃａｌｉｆ．） （４２）を用いて、分離タンパク質をＨｙｂｏｎｄ（商標）−Ｃエクストラ・メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロッティングした。タンパク質ゲルの染色を、製造元の指示（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｕｓ， Ｃａｌｉｆ．）に従って、銀染色キットを使用しておこなった。３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで少なくとも２時間にわたってブロッキングした後、上記メンブレンを、室温で、０．２ｍＭＣａＣｌ_２含有ＰＢＳ（ｐＨ６．８）に１μｇ／ｍｌの濃度で希釈されたペルオキシダーゼ共役バンデイレイア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｒｅｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）イソレクチンＢ４（Ｌ−５３９１、Ｓｉｇｍａ）により、２時間プロービングした。メンブレンをＰＢＳ（ｐＨ６．８）で５回洗浄し、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の指示に従ってＥＣＬ（商標）キットを用いたケミルミネセンスで結合レクチンを視覚化した。
（抗マウスＩｇＦｃＥＬＩＳＡによるＰＳＧＬｂ１／ｍｇＧ２ｂの定量化）
吸着前後の細胞培養上清の融合タンパク質濃度の測定は、融合タンパク質を親和性精製多クローン性ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ抗体（ｃａｔ．ｎｒ． ５５４８２， Ｃａｐｐｅｌ／Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ， Ｄｕｒｈａｍ， Ｎ．Ｃ．）で捕獲する９６穴ＥＬＩＳＡアッセイによっておこなった。３％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした後、融合タンパク質を捕獲し、Ｏ−フェニレンジアミン二塩化水素化物（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いてペルオキシダーゼ共役親和性精製多クローン性抗マウスＩｇＧＦｃ抗体（ｃａｔ．ｎｒ． ５５５６６， Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ， Ｄｕｒｈａｍ， Ｎ．Ｃ．） で検出した。プレートを４９２ｎｍで読み取り、ＡＩＭＶ無血清培地に再懸濁した精製マウスＩｇＧＦｃフラグメント（（ｃａｔ．ｎｒ． ０１５−０００−００８， Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， Ｐａ．）の希釈シリーズを用いてＥＬＳＡのキャリブレーションをおこなった。

（ブタ大動脈血管内皮細胞ＥＬＩＳＡ）
ＰＥＣ−Ａ細胞を、ゼラチン・コーティング９６穴プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ）に１５，０００細胞／ウエルの密度で播種し、ＡＩＭＶ無血清培地で４８時間インキュベートした。プレートを、０．１５ＭＮａＣｌ_２含有０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、５０μｌ／ウエルの精製ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡを含むＰＢＳで、各々の開始濃度を８、１、および２ｍｇ／ｍｌとして、室温で１時間培養した。上記のようにプレートを再び洗浄し、５０μｌアルカリ・ホスファターゼ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的；Ａ３３１２、Ｓｉｇｍａ）、ＩｇＭ（μ鎖特異的；Ａ１０６７、Ｓｉｇｍａ）、およびＩｇＡ（α鎖特異的；Ａ３０６２、Ｓｉｇｍａ）Ｆ（ａｂ）’_２フラグメント含有ＰＢＳ（１：２００希釈）を添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、基質ｐ−ニトロフェニル・リン酸（Ｓｉｇｍａ１０４−１０５）でインキュベートし、４０５ｎｍで読み取った。

（ブタ大動脈血管内皮細胞細胞毒性アッセイ）
ＰＥＣ−Ａ ＥＬＩＳＡについて記載したように、ＰＥＣ−Ａ細胞を９６穴プレートに播種して培養した。４８時間培養した後、細胞をＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４（ｃａｔ．ｎｒ． ＣＪＳ４、Ａｍｅｒｓｈａｍ）１μＣｉ／ウエルで３７℃、１時間にわたりロードし、ＡＩＭＶ培地で３回洗浄した。１５μｌの連続希釈した吸着または非吸着ヒトＡＢ血清または精製ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ抗体を、補体源としての５０μｌのウサギ血清（Ｃａｔ． ｎｏ． ４３９６６５、Ｂｉｏｔｅｓｔ ＡＧ， Ｄｒｅｉｅｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに添加した。５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で４時間インキュベートした後、上清をＳｋａｔｒｏｎ上清回収システム（Ｓｋａｔｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｎｏｒｗａｙ）を用いて収集し、ガンマ・カウンター（１２８２ Ｃｏｍｐｕｇａｍｍａ， ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ）で分析した。各血清およびＩｇ試料を三重反復分析した。パーセント致死を、最大放出と自然発生的放出との差で割った自然発生的放出で差し引いた測定放出として、計算した。

（抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ））
ヒトＰＢＭＣを、南（Ｓｏｕｔｈ）病院（ストックホルム）の血液バンクで、健康なドナーから調製した新鮮な軟膜 （バフィー・コート）を単離した。６ｍｌのバフィー・コートと、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび３．３５ｍｇ／ｍｌＥＤＴＡを含む１５ｍｌのＰＢＳとを、５０ｍｌポリプロピレン管内で混合した。
１０分間にわたり５００ｇで遠心した後、血小板リッチな上清を捨てて、６ｍｌの下部相を６ｍｌのハンクス液（ＨＢＳＳ）と混合し、さらに６ｍｌＬｙｍｐｏｐｒｅｐ（商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ）で下層を形成した。遠心後（８００ｘｇ、２０分）、界面を新しい管に移し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、さらに無血清ＡＩＭＶ培地に再懸濁した。エフェクター細胞調製の最終ステップは、３７℃および５％ＣＯ_２で１時間インキュベートしてプラスチック粘着細胞を取り除いた組織培養フラスコに、ＰＢＭＣを移すことであった。標的細胞は、上記のように保ったＫ５６２およびＲａｊｉ細胞、またはＰＥＣ−Ａ細胞であり、これらの細胞をアッセイの前日にトリプシン処理し、その後ＡＩＭＶ無血清培地で培養することでプラスチック表面への再粘着を防いだ。アッセイの時点で、ＰＥＣ−Ａ細胞をフラスコの底から洗い落とした。標的細胞をＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４、１００μＣｉ／１ｘ１０^６細胞で、３７℃で１時間にわたりロードし、ＨＢＳＳで３回洗浄し、さらにＡＩＭＶに再懸濁することで、最終濃度を５ｘ１０^４／ｍｌとした。５、０００個の標的細胞を、２倍希釈で５０：１から６．２５：１の範囲にあるエフェクター細胞（Ｅ）：標的細胞（Ｔ）比で、１０％加熱不活性化ヒトＡＢ血清有りまたは無しの２００μｌＡＩＭＶ培地に含まれたエフェクター細胞がある各ウエルに加えた。

自然発生的放出を、エフェクター細胞無しのＡＩＭＶ培地２００μｌでインキュベートした５，０００個の標的細胞を有するウエルで読み取り、最大放出を、ＡＩＭＶ培地１００μｌで５，０００個の標的細胞を１００μｌの５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とともにインキュベートした。各Ｅ：Ｔ比を三重反復分析した。３７℃で４時間インキュベートした後、上清をＳｋａｔｒｏｎ上清回収システム（Ｓｋａｔｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｎｏｒｗａｙ）を用いて収集し、ガンマ・カウンター（ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ）で分析した。パーセント致死を、最大放出と自然発生的放出との差で割った自然発生的放出で差し引いた測定放出として、計算した。

（結果）
（ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質の発現および特徴付け）
ベクター・プラスミドＣＤＭ８、ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂプラスミド、またはブタα１，３ＧＴプラスミドとともにＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂプラスミドによりトランスフェクションしたＣＯＳ−７ｍ６細胞由来の上清を、トランスフェクション後、約７日目に回収した。分泌ムチン／Ｉｇ融合タンパク質を、抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ上での吸着によって精製し、検出のためにバンデイレイア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｒｅｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）イソレクチンＢ_４ （ＢＳＡ ＩＢ_４）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析にかけた。図１に示すように、融合タンパク質は、銀による染色が相対的に弱い１４５ｋＤａの見かけ分子量を持つ広帯域として、還元条件下で移動した。大きさの不均一性（約１２５ないし１６５ｋＤａ）および低染色性は、高グリコシル化ムチン型タンパク質（４３，４４）の挙動に関して既におこなわれた観察と一致する。融合タンパク質は、おそらくホモ二量体として生産される。なぜなら、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、見かけ分子量が２５０ｋＤａを上回る二重のバンドが見られたためである。ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂプラスミド単独またはα１，３ＧＴプラスミドとともにトランスフェクションした同一数のＣＯＳ−７ｍ６細胞に由来する２種類の上清から親和性精製された融合タンパク質の量は、同じであった。ＢＳＡ ＩＢ_４によってエレクトロブロッティング・メンブレンをプロービングすることで、ブタα１，３ＧＴによるトランスフェクション後に得られた融合タンパク質の強い染色が明らかになった（図１）。しかし、ＣＯＳ細胞がシミアン（Ｓｉｍｉａｎ）サル（α１，３活性が欠けた旧大陸サル）由来であるという事実にもかかわらず、α１，３ＧＴ ｃＤＮＡの同時トランスフェクションなしでＣＯＳ−７ｍ６細胞で生産されたＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂもまたＢＳＡ ＩＢ_４による染色が弱かった。このことは、ＢＳＡ ＩＢ_４レクチンがまさしくＧａ１α１，３Ｇａｌエピトープ（４５）よりもわずかに広い特異性を持つことを示している。それにもかかわらず、ブタα１，３ＧＴｃＤＮＡの同時トランスフェクションは、高度にＧａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質の発現を支持した。

トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の上清中、および吸着後のヤギ抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ上でのＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの定量化。トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の上清に含まれるＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの量を定量するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた。一般に、材料および方法で説明したように、７０％コンフルエンスでＣＯＳ細胞を含む５本の培養フラスコ（２６０ｍｌフラスコ、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標））をトランスフェクトさせ、かつインキュベートした。フラスコ１本あたり１０ｍｌのＡＩＭＶ培地中で７日間にわたるインキュベーション期間の後、培地を回収した。そのようなトランスフェクションからの上清に含まれる融合タンパク質の濃度を、抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ（５０μｌ充填ビーズに対応）の１００μｌゲル・スラリー上での吸着後の異なる容量の上清と同様に、精製マウスＩｇＧＦｃフラグメントで較正したＥＬＩＳＡによって測定した（図２）。上清に含まれるＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの濃度は、１５０ないし２００ｎｇ／μｌの範囲内であり、この特定の実験では、その濃度は約１６０ｎｇ／μｌであった（図２Ａ、非吸着カラム）。５０ｐｌ充填抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ上に吸着した後の２、４、および８ｍｌの上清に残るＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの濃度は、それぞれ３２、８９、および１１７ｎｇ／μｌであった。このことは、２、４、および８ｍｌの上清由来の５０μｌの充填抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ上に吸着されている２６０、２９０、および３６０ｎｇのＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂに一致する。Ｂ．シンプリシフォリア（Ｂ．ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）１１３４レクチンによるウエスタン・ブロット分析によって、５０μｌの充填ビーズが１ｍｌの上清からＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質を吸着しうること、また２ｍｌではやっと気づくほどのレベル（不図示）であることが明らかになった。

固定化Ｇａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂの吸着能力。ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂプラスミド単独で、またはブタα１，３ＧＴｃＤＮＡとともにトランスフェクションしたＣＯＳ細胞由来の上清２０ｍｌを抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズのゲル・スラリー５００μｌと混合した。しっかりと洗浄した後、ビーズを等量ずつ分け、１００μｌのゲル・スラリー（５０μｌ充填ビーズ）を０．２５、０．５、１．０、２．０、および４．０ｍｌのプールされた補体減少ヒトＡＢ血清と混合し、４℃で４時間にわたり転倒回転させた。ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂおよびＧａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂ上での吸着の後、４時間^５１Ｃｒ放出アッセイを用いてウサギ補体の存在下、血清をブタ内皮細胞細胞毒性についてアッセイした（図３）。図３に示すように、各希釈ステップで約３００ｎｇのＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂ（上記参照）を担持するビーズ１００μｌが４および２ｍｌのＡＢ血清の細胞毒性を減ずることができ、また１ｍｌ以下のヒトＡＢ血清に存在する細胞毒性を完全に吸着することができる。注意すべきことは、非Ｇａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂの同一量が０．２５ｍｌ吸着ヒトＡＢ血清の細胞毒性をわずかだけ減少させることである（図３）。

（補体依存ブタ内皮細胞細胞毒性および結合に対するＧａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂの効果）
ＰＳＧＬＩ／ｍｌｇＧ２ｂが個々のヒト免疫グロブリンクラスを吸収することができた効率を調べるために、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡアガロース・ビード上で、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってヒトＡＢ血清から、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡを精製した。単離後、ＩｇＡを抗ＩｇＧおよびＩｇＭカラムに通過させ、ＩｇＧおよびＩｇＭの痕跡を取り除く。この手順を、同様に他のＩｇクラスについても実行した。Ｉｇ分画純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでチェックした（図４）。正常血清で見いだされる濃度で、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（ＩｇＡではない）をウサギ補体の存在下、ＰＥＣ−Ａに対して細胞毒性を示した（図５）。ＩｇＧおよびＩｇＭ分画に存在する細胞毒性は、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂ上での吸着によって、完全に除去された。ＩｇＡ分画によって示される細胞毒性の欠如がＰＥＣ−Ａに対するヒトＩｇＡ抗体の結合の欠如によるものかどうかを調べるために、細胞ＥＬＩＳＡを、結合ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体を検出するために細胞毒性アッセイで使用された同一Ｉｇ分画で実施した。アルカリホスファターゼ共役クラス特異的Ｆ（ａｂ）′_２フラグメントを２次抗体として用いた。ＩｇＧおよびＩｇＭｎｏ細胞毒性がＧａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ２ｂの吸着によって完全に取り除かれても、ＩｇＧに関しては７０％（３０から７０％の範囲）を上回って、ＩｇＭに関しては５５％（１０から５５％の範囲）を上回っては、結合は決して減少しなかった（図５）。ヒト免疫グロブリンＡは明らかにＰＥＣ−Ａと結合し、結合はＧａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬＩ／ｍＩｇＧ_２ｂ上での吸着後に、わずかに減少しただけだった（２９％以下）。したがって、ＩｇＡ分画の細胞毒性の欠如は、ＰＥＣ−Ａを結合することがＩｇＡ分画のできないことによって説明されるものではなく、補体を活性化させることによると思われる。

（ブタ内皮細胞のＡＤＣＣに対するＧａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの効果）
いくつかのアッセイが無血清条件下でおこなわれ、Ｋ５６２およびＲａｊｉ細胞と比較した場合、ＰＥＣ−Ａは新たに単離したＰＢＭＣによって致死を指示する中間の感度を有し、Ｋ５６２はヒトＮＫ細胞による致死に対して感度が高く、Ｒａｊｉは鈍感であった（図６Ａ）。１０％ヒト補体不活性化ＡＢ血清の存在下、致死率がほぼ倍となり、以前の公表データ（３０）と一致して生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＡＤＣＣ効果が支持される（図６Ｂ）。しかし、全てのＰＥＣ−Ａ細胞毒性抗体（上記参照）を取り除くことが知られている条件下で、もし血清がＧａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂによって吸着されると、致死率は無血清条件下で見られる致死率よりもわずかに低いレベルまで減少する。一方、Ｇａｌα１，３Ｇａｌエピトープを持たないＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質それ自体は、ヒトＡＢ血清存在下で致死率の増加を引き起こすことはできない（図６Ｂ）。これらのデータは、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ特異性による抗ブタ抗体が生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で抗体依存性細胞性細胞毒性を支持することができるということ、またそれが効果的に補体結合の細胞毒性の抗ブタ抗体を除去するちょうどその時、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ−置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂ融合タンパク質はこれらの抗体を効果的に除去すること、という考えを支持する。

（参考文献）

（実施例２： 置換された組換えＰ分泌糖タンパク質リガンド／免疫グロブリン融合タンパク質の安定な発現）
（一般法）
（細胞培養）
ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、２９３Ｔ、およびブタ大動脈内皮細胞株ＰＥＣ−Ａ（Ｋｈｏｄａｄｏｕｓｔ， Ｍ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９５）を１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および２５μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。選択培地は、下記に示すように、ピューロマイシン（ｃａｔ． ｎｏ． Ｐ７２５５； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ． ６３１７８）、ハイグロマイシン（ｃａｔ． ｎｏ． ４０００５１； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３９）、およびＧ４１８（ｃａｔ． ｎｏ． Ｇ７０３４； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ ６３１７８）を含有していた
（発現プラスミドの構築）
記載（Ｌｉｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９７）されるように、ブタα１，３Ｇａ１Ｔ（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９４）およびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ発現プラスミドを構築した。フォワードおよびリバース・プライマーとして、それぞれｃｇｃｇｇｇｃｔｃｇａｇａｔｇａａｇａｔａｔｔｃａａａｔｇｔおよびｃｇｃｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａｔｇａｔｇｔｇｇｔａｇｔｇａｇａｔを用いて、ＨＬ６０ ｃＤＮＡライブラリからＣ２ ＧｎＴＩ ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。安定なトランスフェクタントを生成するために用いられるベクターは、両方向性であり、ポリリンカーの上流のＥＦ１αプロモーター、スプライス・ドナーおよびアクセプター部位、ならびにＳＶ４０の両方向性ポリ（Ａ）付加シグナルを有していた。この転写ユニットとは反対の配向で、かつ逆方向からのポリ（Ａ）シグナルを用いているのが、ＨＳＶ ＴＫプロモーターに続いてピューロマイシン・アセチル転移酵素（ＥＦ１α／ＰＡＣ）、ハイグロマイシンｂ（ＥＦ１α／Ｈｙｇ）、およびネオマイシン（ＥＦ１α／Ｎｅｏ）耐性遺伝子（Ｎ． Ｃｈｉｕ， Ｊ． Ｈｏｌｇｅｒｓｓｏｎ ａｎｄ Ｂ． Ｓｅｅｄ）のコーディング配列からなる第２の転写ユニットであった。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて、ブタα１，３ＧａｌＴおよびＰＳＧＬ−ｌ／ｍＩｇＧ_２ｂのｃＤＮＡをＥＦ１α／ＨｙｇおよびＥＦ１α／ＰＡＣベクターにそれぞれ交換した。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いて、Ｃ２ＧｎＴＩ遺伝子をＥＦ１α／Ｎｅｏに交換した。

（ＤＮＡトランスフェクションおよびクローン選択）
付着ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、および２９３Ｔ細胞を７５ｃｍ^２Ｔ型フラスコに播種し、約２４時間後に、７０ないし８０％の細胞集密（ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）でトランスフェクションした。改変ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法をトランスフェクションに対して用いた（Ｂｏｕｓｓｉｆ， Ｏ． ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｈｅ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， ２００１）。トランスフェクション後２４時間に、各Ｔ型フラスコ中の細胞を５つの１００ｍｍペトリ皿に分け、選択培地中でインキュベートした。選択培地中のピューロマイシンの濃度は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、および２９３Ｔ細胞に対して、それぞれ６．０、１．５、および１．０μｇ／ｍｌであった。ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、および２９３Ｔ細胞に対して、それぞれ５５０、５０、および１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンｂ濃度を用い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して、９００μｇ／ｍｌのＧ４１８濃度を用いた。選択培地を３日毎に変えた。約２週間後に、薬剤耐性クローンが形成した。クローンを顕微鏡下で同定し、ピペットマンを用いて手で採取した。選択したコロニーを、選択薬剤の存在下９６穴プレート中でさらに２週間培養した。細胞が８０ないし９０％集密に達したとき細胞培養上清を回収し、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタン・ブロット法によって、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇ_２ｂを評価した。最も高いＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ発現を有するＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、および２９３Ｔクローンを、プラスミドをコードするブタα１，３Ｇａ１Ｔでトランスフェクトし、ハイグロマイシン含有培地中で選択した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体と、末端αＧａｌを認識するＧＳＡ Ｉ １Ｂ_４−レクチンとの両方を用いて、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタン・ブロットによって、耐性クローンを単離および特徴付けした。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上で相対的に高いαＧａｌ発現を有する２つのＣＨＯクローンをＣ２ ＧｎＴＩでさらにトランスフェクトして、Ｇ４１８含有培地中で選択した。より多くの複合体Ｏ−グリカンを示すＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの大きさの増加によって、Ｃ２ ＧｎＴＩの発現が確認された。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット法）
垂直型Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、５％スタッキング・ゲルおよび８％分離ゲルを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ． Ｋ．， １９７０）によってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。還元および非還元条件下で、試料を電気泳動にかけた。分離度を増加するために、４ないし１５％勾配ゲル（ｃａｔ．ｎｏ． １６１−１１０４； Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）または４ないし１２％勾配ｇｅｌｓ（ｃａｔ．ｎｏ ＮＰ０３２２； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌｉｄｉｎｇｏ， Ｓｗｅｄｅｎ）を複数の実験で用いた。後者のゲルは、ＭＥＳ緩衝液（ｃａｔ．ｎｏＮＰ０００２； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み合わせて用いた。高精度タンパク質標準（ｃａｔ．ｎｏ ＲＰＮ７５６； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）をタンパク質分子量測定のための基準として適用した。Ｒｕｂｙと組み合わせてＰｒｏ Ｑ Ｅｍｅｒａｌｄ ３００糖タンパク質検出キット（ｃａｔ．ｎｏ Ｐ２１８５５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｌｅｉｄｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、タンパク質ゲルを染色した。ＣＣＤカメラを搭載するＦｌｏｕｒ−Ｓ Ｍａｘ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒで、これらのゲルを可視化した。Ｍｉｎｉ ＴｒａｎｓＢｌｏｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）電気泳動トランスファー・セルを用いて、Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ外膜（ｃａｔ．ｎｏ． ＲＰＮ２０３Ｅ； Ａｍｅｒｓｈａｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはニトロセルロース膜（ｃａｔ．ｎｏ ＬＣ２００１； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に分離されたタンパク質も電気泳動的にブロットした（Ｔｏｗｂｉｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９７９）。０．２Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中３％ＢＳＡで１時間ブロッキングした後、１μｇ／ｍｌ濃度に希釈したペルオキシダーゼ結合ＧＳＡ Ｉ ＩＢ_４−レクチン（ｃａｔ．ｎｏ． Ｌ−５３９１； Ｓｉｇｍａ）、１：１，０００で希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｃａｔ．ｎｏ． Ａ−９９１７； Ｓｉｇｍａ）、および１：１，０００で希釈したマウス抗ＰＳＧＬ−１抗体（クローンＫＰＬ−１、ｃａｔ．ｎｏ ５５７５０２； ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて、膜を室温で１時間プロービングした。２次抗体は、１：５０，０００で希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ）′_２（ｃａｔ．ｎｏ Ａ ２３０４； Ｓｉｇｍａ）であった。ブロッキング緩衝液で、全ての希釈をおこなった。インキュベーション間および後で、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで膜を３回洗浄した。ＥＣＬキット（ｃａｔ．ｎｏ． ＲＰＮ ２１０６； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造元の指示にしたがい、化学発光によって結合レクチンおよび抗体を可視化した。

（ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上のαＧａｌエピトープ密度および酵素免疫検定法を用いたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの定量）
二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡによって、細胞培養上清中の組み換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの濃度と、その相対的α−Ｇａｌエピトープ密度とを測定した。２０μｇ／ｍｌの濃度で、アフィニティー精製ポリクローナル・ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｃａｔ． ｎｒ． ５５４８２； Ｃａｐｐｅｌ／Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを一晩４℃で被覆した。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて、該プレートを１時間ブロッキングした。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂを含有する上清を４時間インキュベートし、その後、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、１：３，０００希釈のペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｃａｔ．ｎｏ． Ａ−９９１７； Ｓｉｇｍａ）または１：２，０００で希釈したペルオキシダーゼ結合ＧＳＡ Ｉ ＩＢ_４−レクチン（ｃａｔ．ｎｏ． Ｌ−５３９１；Ｓｉｇｍａ）でプレートを２時間インキュベートした。３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンジハイドロクロライド（ｃａｔ． ｎｒ． Ｔ−３４０５； Ｓｉｇｍａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、結合ペルオキシダーゼ結合抗体またはペルオキシダーゼ結合ＧＳＡ−レクチンを可視化した。２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４によって、反応を停止し、４５０ｎｍでプレートを読み取った。較正に対して、融合タンパク質生成のために用いられる培地中または１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で再懸濁した精製マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメント（ｃａｔ． Ｎｒ． ０１５−０００−００８； Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）の希釈系列を用いて、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ濃度を評価した。２つのＥＬＩＳＡから得た相対的Ｏ．Ｄ．（ＧＳＡ反応性／抗マウスＩｇＧ反応性）を比較することによって、α−Ｇａｌエピトープ密度を測定した。

（ブタ大動脈内皮細胞細胞毒性アッセイ）
記載（Ｌｉｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ２００３）されるように、ブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）細胞毒性アッセイを行った。細胞毒性を最大４０％（ｙ＝０．４）に減少させるために各細胞クローンから必要とされるＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの量を式から導きだし、各融合タンパク質に対する測定値の直線回帰後に得た曲線を記載した後、対応するｘ値（マイクログラム吸着体）を算出した。

（ＣＨＯクローンの撹拌フラスコ・バッチ培養）
６．０ｘ１０^７個の細胞（９０ないし１００％集密を持つ細胞を含む１０個の１７５ｃｍ^２Ｔ型フラスコを表す）を用いて、各バッチ培養を開始した。トリプシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）・ＥＤＴＡ（０．２ｍｇ／ｍｌ）での消化後に、細胞を少量の培地中で再懸濁し、２００ｘｇで５分間遠心して、過剰なトリプシンを除去した。Ｂuｒｋｅｒチャンバー中の細胞を計数することによって細胞密度を測定し、培地を添加して、最終濃度３．０ｘ１０^５個細胞／ｍｌにした。細胞懸濁物を１Ｌ撹拌フラスコに移し、速度６０ｒｐｍで培養物を撹拌するために細胞回転装置（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。単独またはＣ２ ＧｎＴＩとの組合せでα１，３ＧａｌＴを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を分泌するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂを、それぞれピューロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）またはピューロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）およびＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。細胞を２日毎に計数した。細胞密度が５．０ｘ１０^５個細胞／ｍｌに達したとき、細胞密度がもう１度３．０ｘ１０^５個細胞／ｍｌに等しくなるように新たな培地を添加した。細胞懸濁物量が１，０００ｍｌになるまでこれを繰り返した。その後、細胞生存率が５０％に減少するまで、細胞を持続的に培養した。

（組み換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの精製）
２０分間１，４２０ｘｇで遠心することによって、堆積物から上清を取り除いた。取り除いた上清を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（分子全体）−アガロース（ｃａｔ．ｎｏ． Ａ ６５３１； Ｓｉｇｍａ）１０ｍｌを含有するカラムに流速０．５ｍｌ／分で通過させた。ＰＢＳ１２０ｍｌでの洗浄後に、３Ｍ ＮａＳＣＮ１２０ｍｌで、結合融合タンパク質を溶出した。検出用の抗マウスＩｇＧを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット法による分析に続いて、融合タンパク質を含有する管の内容物をプールした。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂを含む画分を蒸留水に対して透析し、蒸留Ｈ_２Ｏの１ないし２ｍｌ中で、凍結乾燥および再懸濁した。融合タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。より低い分子量の夾雑物を除去するために、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて流速０．５ｍｌ／分でＰＢＳで溶出させるＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲカラム（ｃａｔ．ｎｏ． １７−１１６６−０１； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）上でのゲル濾過によって、融合タンパク質をさらに精製した。５ｍｌ画分を回収し、２８０ｎｍでのＵＶ分光測光によって、タンパク質を含有する管を同定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット法によって、プールした画分を再び分析し、蒸留水中でプール、透析、および再懸濁した。

（精製ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂからのＯ結合グリカンの化学的放出および過メチル化）
記載（Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， １９９３）されるように、β脱離によってオリゴ糖を放出させた。放出されたオリゴ糖を４５℃窒素流動下で気化し、記載（Ｈａｎｓｓｏｎ， Ｇ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９３）されるように、わずかな修飾で、ＣｉｕｃａｎｕおよびＫｅｒｅｋ（Ｃｉｕｃａｎｕ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， １９８４）にしたがって、過メチル化した。

（質量分析法）
ＬＣＱイオン・トラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて、陽イオンモードでのエレクトロスプレー・イオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を実行した。メタノール：水（１：１）中で試料を溶解し、質量分析計に流速５ないし１０μｌ／分で導入した。窒素を空間電荷層ガスとして用いて、ニードル電圧を４．０ｋＶに設定した。加熱キャピラリーの温度を２００℃に設定した。合計１０ないし２０個のスペクトルを総計し、ＥＳＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを産生した。

（結果）
（異なる宿主細胞中でのα−Ｇａｌ置換Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１／マウスＩｇＧ_２ｂの安定的な発現）
ピューロマイシンを添加した選択培地中での培養の１５ないし２０日後に、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、および２９３Ｔ細胞の異なる大きさのコロニーを位相差顕微鏡によって同定した。該顕微鏡下で、各細胞型の１９２個のコロニーをピペットによって採取し、選択下での更なる増殖のために２つの９６穴プレートに移した。ＩｇサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、個々のクローンの上清中の融合タンパク質濃度を評価し、３１個のＣＨＯ−Ｋ１コロニー、８個のＣＯＳ７ｍ６コロニー、および３６個の２９３Ｔコロニーが抗マウスＩｇＧ Ｆｃ陽性であった。各細胞株由来のコロニーを分泌する上位５つを２４ウェル・プレートに移動し、さらに増殖させた。最もよく発現するＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ７ｍ６、および２９３Ｔクローンを、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を保持するα１，３ＧａＩＴ・コード・プラスミドでトランスフェクションした。ピューロマイシンおよびハイグロマイシンを用いて、α１，３ＧａｌＴ遺伝子を安定的に組み込んだＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ発現細胞を選択した。２７個のＣＨＯ−Ｋ１コロニー、３個のＣＯＳ７ｍ６コロニー、および３１個の２９３Ｔコロニーが選択された。抗マウスＩｇＧおよびグリフォニア・シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）Ｉ ＩＢ_４レクチンＥＬＩＳＡで測定されるような融合タンパク質の濃度と、そのα−Ｇａｌエピトープ置換の相対的レベルとにもとづいて、増殖すべきコロニーを選択した。ブタα１，３ＧａｌＴ有りまたは無しでＣＨＯ−Ｋ１（それぞれ、クローン５Ｌ４−１および１０）、ＣＯＳ７ｍ６（それぞれ、クローン５１および２Ｈ５）、および２９３Ｔ（それぞれ、クローン１４およびＣ）細胞中で発現するイムノアフィニティー単離ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット法によって特徴づけた（表１、図７）。全ての細胞株は、非還元条件下で、約３００ｋＤａの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ反応性タンパク質を産生した（図７Ａ）。先行の観察（Ｌｉｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｌｉｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ２００３）と一致して、還元での半分の大きさへの減少によって示される（図７Ａおよび図７Ｂを比較せよ）ように、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂはニ量体として産生された。ＧＳＡ Ｉ ＩＢ_４レクチンを用いて、異なる細胞型で生成された融合タンパク質上のα−Ｇａｌエピトープの存在を検出した（図７Ｂ）。ＣＨＯ−Ｋ１（クローン５Ｌ４−１）、ＣＯＳ７ｍ６（クローン５１）、および２９３Ｔ（クローン１４）中のα１，３Ｇａ１Ｔの共発現は、レクチンによって検出されたように、融合タンパク質上のα−Ｇａｌエピトープの発現に至った。α１，３ＧａｌＴ無しで２９３Ｔ細胞中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂのレクチン反応性は予想外であり、融合タンパク質上のＧａｌｉｌｉ抗原以外のα−Ｇａｌ残基の存在を示す（図７Ｂ）。α１，３ＧａｌＴの存在下でＣＯＳおよび２９３Ｔ細胞中で産生された融合タンパク質は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で産生された融合タンパク質より大きい大きさの糖形態を含有していた（図７Ｂ）。

（表１ ＣＨＯ、ＣＯＳ、および２９３Ｔ由来の細胞クローン）

（ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上のα−Ｇａｌエピトープ密度は、その生成のために用いられる宿主細胞に依存する）
ＣＨＯ、ＣＯＳ、および２９３Ｔ細胞中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上の相対的なα−Ｇａｌエピトープ密度をＥＬＩＳＡによって測定した（図８）。α１，３ＧａｌＴの存在下でＣＯＳ細胞中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂは、α１，３ＧａｌＴ無しでＣＯＳ中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂと比べて、相対的Ｏ．Ｄ．（ＧＳＡ反応性／抗マウスＩｇＧ反応性）で５．３倍の増加を示した（図８）。２９３Ｔ細胞に関しては、相対的Ｏ．Ｄ．で３．１倍の増加があり、ＣＨＯ細胞に関しては、１．８倍の増加だけであった（図８）。ＥＬＩＳＡ結果は、イムノアフィニティ精製ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂのウエスタン・ブロット実験で見られる相対的ＧＳＡレクチン染色と一致していた（図７Ｂ）。

（異なる宿主細胞中で生成されるＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの抗ブタ抗体吸着効果は、そのα−Ｇａｌ置換の程度と相関する）
ブタ大動脈内皮細胞細胞毒性を用いて、ブタα１，３ＧａｌＴを共発現するＣＨＯ−Ｋ１（クローン５Ｌ４−１）、ＣＯＳ７ｍ６（クローン５Ｉ）、および２９３Ｔ（クローン１４）細胞中で産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの、ヒト血液型ＡＢ血清の抗ブタ反応性抗体を吸着する能力を評価した（図９）。ヒトＡＢ血清ＰＡＥＣ細胞毒性を最大４０％に減少させるために、ＣＨＯ細胞生成ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ９．１μｇが必要であった（図９）。ＣＯＳおよび２９３Ｔ細胞生成ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ関しては、ＰＡＥＣ細胞毒性を同レベルまで減少するために、それぞれ１６倍および４倍少なく必要であった。さらに、α１，３ＧａｌＴ遺伝子の存在下でＣＨＯ−Ｋ１細胞中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂは、血液型ＡＢ血清のＰＡＥＣ細胞毒性を３６％をより下に減少することができなかった一方で、１２および２５％への減少がそれぞれ、非飽和条件下であっても、α１，３ＧａｌＴ発現ＣＯＳおよび２９３Ｔ細胞中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂで見られた。

（ＣＨＯ細胞中のコア２β１，６ＧｌｃＮＡｃ転移酵素の共発現は、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂαＧａｌエピトープ密度および抗ブタ抗体吸着効果を向上する）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞分泌ムチン／Ｉｇ上のα−Ｇａｌエピトープの数を増加させる試みでは、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ、α１，３ＧａｌＴ、およびＣ２ ＧｎＴＩを安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を樹立し、抗マウスＩｇＧ抗体およびＧＳＡ Ｉ ＩＢ_４を用いて、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタン・ブロットによって、それらの細胞によって分泌されるＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂを分析した。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの明らかなＭＷは、コア２酵素の安定的な発現に続いて増加し、融合タンパク質上のより多くの複合体グリカンを示した（図１０）。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上のα−Ｇａｌエピトープ密度は、α１，３ＧａｌＴ無しでＣＨＯ−Ｋ１細胞中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂと比べて１３．０倍の増加を示し、α１，３ＧａｌＴ単独を用いて生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂと比べて７．４倍の増加を示した（図８）。さらに、α１，３ＧａｌＴおよびＣ２ ＧｎＴＩを安定的に発現するａＣＨＯ−Ｋ１（ＣＨＯ−Ｃ２−１−９）中で産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの抗ブタ抗体吸着効果は、α１，３ＧａｌＴを共発現する２９３ＴおよびＣＯＳ細胞中で産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの吸着効果と同様であり（図９）、ＣＨＯクローン５Ｌ４−１中で生成されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂと比べて、ヒトＡＢ血清のＰＡＥＣ細胞毒性を最大４０％に減少させるために１０倍少ない融合タンパク質が必要であった。

（Ｏ結合グリカン構造的特徴付けのための組み換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの精製）
単独、ブタα１，３ＧａｌＴとの組み合わせ、またはα１，３ＧａｌＴおよびＣ２ ＧｎＴＩとの組み合わせでＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂを発現する安定的にトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞（それぞれ、クローン１０、クローン５Ｌ４−１、またはクローンＣ２−１−９）の１Ｌ撹拌フラスコ培養物から、組み換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂを精製した。Ｏグリカン構造分析を干渉する可能性のある混入するグリコシル化タンパク質を完全に除去するために、抗マウスＩｇＧアフィニティー・クロマトグラフィーおよびゲル濾過を含むツー・ステップ精製法を設定した。各細胞クローンから得た細胞上清２リットルのアフィニティー精製は、ＥＬＩＳＡによって評価されたように、ＣＨＯ−１０、５Ｌ４−１、およびＣ２−１−９から、それぞれＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ２．２ｍｇ、１．２ｍｇ、および０．９５ｍｇを生じた。ゲル濾過カラム上での更なる精製は、それぞれ、０．２２ｍｇ、０．１９ｍｇ、および０．２９ｍｇの最終ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ収率を生じた。アフィニティーおよびゲル濾過カラムから溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロット法によって分析した（ここではクローン１０に対して示す）。糖タンパク質染色キットをＲｕｂｙと組み合わせて用いて、グリコシル化タンパク質と、非グリコシル化タンパク質とを検出し（図１１Ａおよび１１Ｂ）、抗ＰＳＧＬ−１抗体は、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂの存在を確認した（図１１Ｃ）。この抗体は、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ二量体を表す３００ｋＤａ付近のバンド（図１１Ｃレーン２および４ないし９）と強く結合した。還元形態の融合タンパク質由来の１５０ｋＤａ付近のバンドも見られ（レーン４ないし６）、融合タンパク質分解産物を表す可能性が最も高い６０ないし７０ｋＤａの弱いバンドも見られる（レーン７ないし９）。図１１Ａおよび１１Ｂでは、抗ＰＳＧＬ−１抗体で染色されていない３００ｋＤａバンドもレーン１および３で見られ、細胞培養培地由来のタンパク質を表す可能性が最も高い。このことは、アフィニティー精製上清中のその存在（レーン３）によっても裏づけされ、該タンパク質が抗Ｉｇアフィニティー・カラムに吸着されていないことを示す。しかし、抗ＰＳＧＬ−１抗体に染色されていない５０ないし６０ｋＤａのＭＷを持つグリコシル化バンドをアフィニティー精製画分で見ることができる（図１１Ａレーン４）。このタンパク質も、恐らく細胞培養培地に由来するものであり、融合タンパク質とともにアフィニティー・カラムに吸着される。このタンパク質をゲル濾過によって除去し、該ゲル濾過の間、該タンパク質（図１１Ａおよび１１Ｂ，レーン７ないし９）は、融合タンパク質（図１１Ａ，１１Ｂ，および１１Ｃ、レーン５ないし６）より遅れて溶出した。５０ないし７０ｋＤａ付近の付加的な非グリコシル化タンパク質をゲル濾過によって除去した（図１１Ｂ、レーン４とレーン７ないし９とを比較せよ）。各クローンに対して、最も多い量の融合タンパク質を含有するゲル濾過画分をオリゴ糖放出のために選択した。クローン１０に対して示すように（図１１Ａおよび１１Ｂ、レーン５）、この画分は、いずれの有意な量の混入するタンパク質（グリコシル化または非グリコシル化）も含有していなかった。

（精製組み換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから放出される過メチル化オリゴ糖の質量分析法）
クローンＣＨＯ−１０および５Ｌ４−１から放出された過メチル化オリゴ糖は、ｍ／ｚ８９５．４および１２５６．５付近のピークの２つの最も多数を占める群を持つ類似のＭＳスペクトルを与え（図１２）、一方で、クローンＣ２−１−９によって産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから放出されたＯ−グリカンの質量スペクトルは、より複雑なパターンを示した（図１３）。タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によって、ＥＳＩ−ＭＳスペクトル中のイオンのオリゴ糖配列を導き出した。このように得られた配列および仮構造を表２に示す。下記に、我々は、α１，３ＧａｌＴおよびＣ２ ＧｎＴＩも発現するＣＨＯ細胞（Ｃ２−１−９）中で産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上のＯ−グリカンのＭＳ／ＭＳ分析の結果について記載する。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトル中のイオン全てをナトリウム化イオンとして検出した。

（Ｃ２−１−９のＭＳ／ＭＳ分析）
親スペクトル中の最も強度のピークは、一連のステップのＭＳ／ＭＳによって評価されるように、ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ構造を表すｍ／ｚ１５４８．７の偽分子イオン（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）である（図１４）。このイオンのＭＳ^２は、ｍ／ｚ９５１．３（［Ｍ−ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−Ｏ＋ＮＡ］^＋）および１１７３．５（［Ｍ−ＮｅｕＡｃ＋Ｎａ］^＋）の２つのより大きなフラグメント・イオンと、ｍ／ｚ５０６．１（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ−ＮｅｕＡｃ＋Ｎａ］^＋）、６２０．２（［ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−Ｏ＋Ｎａ］^＋）、６９０．２（［Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ＋Ｎａ］^＋）、７５１．３（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＮｅｕＡｃ＋Ｎａ］^＋または［Ｍ−Ｈｅｘ−ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）、８８１．３（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ＋Ｎａ］^＋）、９６９．５（［Ｍ−ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）、および１３３０．７（［Ｍ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）の複数のより小さなフラグメント・イオンとを与えた。ｍ／ｚ１１７３．５のフラグメント・イオンを単離して、ＭＳ^３によって分析すると、ｍ／ｚ９５１．４、５０６．２、６９０．３、および７５１．５のフラグメント・イオンを生じた。より大きなピーク、すなわち９５１．４をＭＳ^４によってさらに分析し、ｍ／ｚ４４５．３（［Ｈｅｘ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）、４６３．０（［Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−Ｏ＋Ｎａ］^＋）、６９０．３ 、および７３３．６（［Ｍ−Ｈｅｘ−ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−Ｏ＋Ｎａ］^＋）のフラグメント・イオンを生じた。最終的に、ＭＳ^４分析の優勢なフラグメント・イオン（６９０．３）をＭＳ^５によって分析した。これによって、末端Ｈｅｘ−Ｈｅｘを表すｍ／ｚ４１５．１および４４５．３の配列イオンを生じ、前者のイオンは、１つの酸素およびそのメチル基を消失していた。Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−Ｏ構造も見いだされた（４６３．０）。さらに、内部Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ構造が、ヘキソースに結合する１つの酸素を持つもの（４７２．２）および持たないもの（４５４．０）で見られた。Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ構造からのＯ−Ｍｅの消失（６６０．１）、Ｃ−Ｏ−Ｍｅの消失（６４８．２）、およびＮ−Ｃ−Ｏ−Ｍｅの消失（６１９．４）も見られ、ここで、最後の１つは、恐らく内部ＨｅｘＮからのＮ−アセチル基の消失を表す。ｍ／ｚ５３３．２のより大きなフラグメント・イオンもＭＳ^５スペクトル中で見られた。このイオンは、最内側のＨｅｘＮのクロス・リング・フラグメントに対応し（図１４）、ヘキソースが１−４結合中のＨｅｘＮに結合することを示す。この配列は、２型構造および末端Ｇａｌで伸張されたシアル酸付加コア２と整合する可能性が最も高い。

ｍ／ｚ１５４８．７のイオンを以外に、Ｇａｌα１，３Ｇａｌで終了すると考えられる２つの他の偽分子イオンが、ｍ／ｚ１５７８．７および１１８７．６で、クローンＣ２−１−９のＥＳＩ−ＭＳスペクトル中で見出された。ｍ／ｚ１５７８．７のイオンをＭＳ^２分析のために単離した。その結果は、ＮｅｕＧｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＯｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ構造を示し、ｍ／ｚ１１７３．５（［Ｍ−ＮｅｕＧｃ＋Ｎａ］^＋）、９５１．５（［Ｍ−ＮｅｕＧｃ−Ｈｅｘ−Ｏ＋Ｎａ］^＋）、９１１．３（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ＋Ｎａ］^＋）、６９０．３（［Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ＋Ｎａ］^＋）、および６７６．３（［Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ−Ｍｅ＋Ｎａ］^＋）のフラグメント・イオンを持つ。１１７３．５イオンのＭＳ^３分析は、ｍ／ｚ９５１．５のより大きなフラグメント・イオンと、ｍ／ｚ５０６．１（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ−ＮｅｕＡｃ＋Ｎａ］^＋）、６９０．２、および９６９．３（［Ｍ−ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）の複数のより小さなフラグメント・イオンとを生じた。ｍ／ｚ９５１．５のフラグメント・イオンを第４のステップ中のＭＳ／ＭＳによって分析し、ｍ／ｚ６９０．４の１つのより大きなフラグメント・イオンおよびｍ／ｚ６５８．２（６９０．４−Ｏ−Ｍｅ）のより小さなフラグメント・イオンを与えた。しかし、ｍ／ｚ１５７８．７のイオンのＭＳ^２スペクトルでは、ｍ／ｚ９８１．５および１２０３．４の未同定のフラグメント・イオンが観察された。ｍ／ｚ１２０３．４のイオンのＭＳ^３およびＭＳ^４分析は、ｍ／ｚ９８１．４、７２０．４、６９０．１、５０６．１、および６８８．３（７２０．１−Ｏ−Ｍｅ）のフラグメント・イオンを生じた。ＭＳ^３およびＭＳ^４スペクトル両方で見られるｍ／ｚ７２０．４のイオンは、ｍ／ｚ６９０．１の特徴的なフラグメント・イオンより多い３０質量単位であり、Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ配列を表す。残念なことに、ｍ／ｚ７２０．４のイオンの更なるＭＳ／ＭＳ分析は可能でなかった。考えられる末端Ｇａｌα１−３Ｇａｌを持つＥＳＩ−ＭＳスペクトル中の他の偽分子イオン（図１３）がｍ／ｚ１１８７．６で観察された。このイオンのＭＳ^２実験は、Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘまたは２型伸張および末端Ｇａｌを持つコア２と整合するｍ／ｚ９６９．５（［Ｍ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）、９５１．４（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｏ＋Ｎａ］^＋）、７５６．２（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）、６９０．３（［Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ＋Ｎａ］^＋）、５２０．３（［Ｍ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ＋Ｎａ］^＋）、および４４５．１（［Ｈｅｘ−Ｈｅｘ＋Ｎａ］^＋）のフラグメント・イオンを生じた（表２）。したがって、末端Ｇａｌα１，３Ｇａｌを潜在的に発現する中性およびシアリル酸付加オリゴ糖は、Ｃ２−１−９クローンによって産生されるが、シアル酸付加（ＮｅｕＡｃ）構造は、最も多量なものであると考えられる。これに加えて、末端Ｈｅｘ−Ｈｅｘ（Ｇａｌα１−３Ｇａｌ）を持たない複数のシアル酸付加オリゴ糖を見ることができるが、相対的存在量はより少ない（図１３および表２）。

（表２ ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ由来Ｏ−グリカンの配列および仮構造）

（実施例３ 発現ベクター）
融合ポリペプチドの生成に有用な好例の発現ベクターは次のとおりである。

（参考文献）

（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明とともに記載されたが、上記の記載は、添付の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を説明するものであって、限定を意図するものではない。他の態様、利点、および変更は以下の請求項の範囲内にある。

図１は、ベクター単独（ＣＤＭ８）、ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ、またはＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂおよびブタα１，３ＧＴ発現プラスミドによって、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の上清から単離されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。これらを、続いてペルオキシダーゼ共役バンデイレイア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒｅｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）イソレクチンＢ_４レクチンでプローブ化して、化学発光による視覚化で免疫精製タンパク質上のＧａｌα１，３Ｇａｌエピトープを検出した。 図２Ａは、５０μｌ抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ上での吸着前後にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上清の容量を増加させる際に、ＰＳＦＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂの抗マウスＩｇＧのＦｃをＥＬＩＳＡにより定量化した結果を示す棒グラフである。試料を三重分析した。図２Ｂは、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞上清の容量を増加させる際に、ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質濃度を示すゲルの写真である。 図３は、^５１Ｃｒ遊離測定で推定される約３００ｎｇのＧａｌα１，３Ｇａｌ置換または非置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ２ｂを担持する抗マウスＩｇＧアガロース・ビーズ５０μｌ上への吸着後の異なる容量のヒトＡＢ血清による抗体依存型補体媒介ＰＥＣ−Ａ細胞毒性を示す折れ線グラフである。 図４は、免疫親和性精製ヒトヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。各試料の４μｇを還元および非還元条件下で流し、銀染色でタンパク質を視覚化した。 図５は、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩＧ_２ｂ置換または非置換ＰＳＧＬ１／ｍｇＩｇＧ_２ｂ上での吸着を^５１Ｃｒ遊離測定で調べた前後における免疫親和性精製ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡの抗体依存型補体媒介ＰＥＣ−Ａ細胞毒性を示す折れ線グラフである（右手側Ｙ軸；％致死）。 図６は、熱不活性化ヒトＡＢ血清の添加による致死に対する直接的相乗効果を４時間^５１Ｃｒ遊離測定で調べたＫ５６２、ＲａｊｉおよびＰＥＣ−Ａ細胞に対するヒトＰＢＭＣの直接的細胞毒性効果（血清無し条件）を示す折れ線グラフである（グラフＡ）。ＰＥＣ−Ａ細胞の抗体依存型細胞性細胞毒性に対する熱不活化ヒトＡＢ血清の効果を、Ｇａｌα１，３置換および非置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＩｇＧ^２ _２ｂ上への吸着前後での４時間^５１Ｃｒ遊離測定で測定した（グラフＢ）。 図７は、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂｃＤＮＡを単独（−）で、またはブタα１，３ガラクトシル基転移酵素ｃＤＮＡ（＋）とともに用いて、安定的にトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、および２９３Ｔ細胞の上清から精製したＰＳＧＬ−ｌ／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク免疫親和性を示すウエスタンブロットの写真である。 図８は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、および２９３Ｔ細胞によって発現されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上の相対的α−Ｇａｌエピトープを示す棒グラフである。ブタα１，３ガラクトシル基転移酵素（ＧａｌＴ）の共発現なし（白色棒）または共発現あり（黒色棒）、さらにＣＨＯ−Ｋ１に関してはコア２β１，６Ｎ−アセチルグロコサミニル転移酵素（Ｃ２ ＧｎＴＩ）（灰色棒）で、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、または２９３Ｔで生産されたＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１−マウス免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質（ＰＳＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ）上の相対的α−Ｇａｌエピトープ密度。 図９は、異なる宿主細胞で生産されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ上に吸着したヒト血液型ＡＢ血清のブタ大動脈血管内皮細胞細胞毒性を示す折れ線グラフである。 図１０は、安定的に形質移入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の上清から精製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂ融合タンパク質のウエスタンブロット分析の写真である。 図１１は、アフィニティー・クロマトグラフィおよびゲル濾過によって精製されたＰＳＧＬ−１ｍＩｇＧ_２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。 図１２は、ＣＨＯクローン５Ｌ４−１に作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから遊離したＯ−グリカンのエレクトロスプレー・イオントラップ・マススペクトル分析を示す。 図１３は、ＣＨＯクローンＣ２−１−９に作られたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから遊離したＯ−グリカンのエレクトロスプレー・イオントラップ・マススペクトル分析を示す。 図１４は、ＣＨＯクローンＣ２−１−９で作られたＰＳＬ−１／ｍＩｇＧ_２ｂから放出されたＯ−グリカンのマザー・スペクトルに見られる顕著なピークのＭＳ／ＭＳ分析を示す一連の説明図である。

Claims (31)

1. 融合ポリペプチドであって、
   （ａ） ｉ） Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ、
   ｉｉ） ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ、および
   ｉｉｉ） ＮｅｕＧｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮｏｌ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ
   の配列を含むグリカン・レパートリーを持つムチン・ポリペプチドと、
   （ｂ） 免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域とを有し、
   該融合ポリペプチドは、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ特異的抗体に結合することを特徴とする融合ポリペプチド。
2. 前記ムチン・ポリペプチドが、ＰＳＧＬ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ３またはそれらのフラグメントからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
3. 前記ムチン・ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも一領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
4. 前記ムチン・ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
5. 前記第２のポリペプチドが、Ｈ鎖免疫グロブリン・ポリペプチドの一領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
6. 前記免疫グロブリンポリペプチドが、免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
7. 前記融合ポリペプチドが二量体であることを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
8. 請求項１の融合ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されたことを特徴とする宿主細胞。
9. 前記宿主細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
10. 第２のポリペプチドに結合した第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、該第１のポリペプチドは、
    （ａ）ムチン・ポリペプチドであり、そして
    （ｂ）α１，３−ガラクトシル基転移酵素およびβ１，６，Ｎ−アセチルグリコサミニル転移酵素であり、そして
    該第２のポリペプチドは免疫グロブリン・ポリペプチドの少なくとも一領域を含むことを特徴とする融合ポリペプチド。
11. 前記ムチン・ポリペプチドがヒト・ポリペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
12. 前記ムチン・ポリペプチドが、ＰＳＧＬ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ３またはそれらのフラグメントからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
13. 前記ムチン・ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも一領域を含むことを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
14. 前記ムチン・ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含むことを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
15. 前記第２のポリペプチドが、Ｈ鎖免疫グロブリン・ポリペプチドの一領域を含むことを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
16. 前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域を含むことを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
17. 前記融合タンパク質が二量体であることを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
18. 融合ポリペプチドを生産する方法であって、
    （ａ）ｉ）免疫グロブリン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードする核酸に、操作可能に結合したムチン・ポリペプチドをコードする核酸、
    ｉｉ）α１，３ガラクトシル基転移酵素ポリペプチドをコードする核酸、および
    ｉｉｉ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素ポリペプチドをコードする核酸、
    を有する細胞を提供するステップと、
    （ｂ）該融合ポリペプチドの生産を可能とする条件下で細胞を培養するステップと、
    （ｃ）該融合ポリペプチドを単離するステップと、
    を包含することを特徴とする融合ポリペプチドの生産方法。
19. 前記ムチン・ポリペプチドが、ＰＳＧＬ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ３またはそれらのフラグメントからなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 前記ムチン・ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも一領域を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
21. 前記ムチン・ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
22. 前記免疫グロブリン・ポリペプチドが、Ｈ鎖免疫グロブリン・ポリペプチドの一領域を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
23. 前記免疫グロブリン・ポリペプチドが、免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
24. 前記細胞が真核細胞または原核細胞であること特徴とする請求項１８に記載の方法。
25. 前記真核細胞がほ乳類細胞、昆虫細胞、または酵母細胞であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 前記原核細胞が細菌細胞であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
27. 前記真核細胞がＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、または２９３細胞であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
28. 融合ポリペプチドを生産する方法であって、
    （ａ）細胞に対して、
    （ｉ）免疫グロブリン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードする核酸に操作可能に結合したムチン・ポリペプチドをコードする核酸、
    （ｉｉ）α１，３−ガラクトシル基転移酵素ポリペプチドをコードする核酸、および
    （ｉｉｉ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素ポリペプチドをコードする核酸を導入するステップと、
    （ｂ）前記融合ポリペプチドの生産を可能とする条件下で細胞を培養するステップと、
    （ｃ）前記融合ポリペプチドを単離するステップと、
    を包含することを特徴とする融合ポリペプチドの生産方法。
29. 請求項２８の方法によって生産されることを特徴とする融合ポリペプチド。
30. 細胞であって、
    （ａ）免疫グロブリン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードする核酸に操作可能に結合したムチン・ポリペプチドをコードする核酸と、
    （ｂ）α１，３−ガラクトシル基転移酵素ポリペプチドをコードする核酸と、
    （ｃ）β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素をコードする核酸と、
    を含むことを特徴とする細胞。
31. 前記細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項３０に記載の細胞。

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