JP2005533785A - 代謝産物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、糖質コルチコイド代謝の調整に関する。特に、本発明は、糖質コルチコイドの５α還元代謝破壊産物による糖質コルチコイド受容体の機能活性の調整に関する。

Description

本発明は、糖質コルチコイド代謝の調整に関する。特に、本発明は、糖質コルチコイドの特異的還元代謝産物破壊産物による糖質コルチコイド受容体の機能活性の調整に関する。
糖質コルチコイドホルモンは、強力な抗炎症性効果、心血管効果、および代謝効果を有する。これらには、脂肪組織（肥満症、グルコース取り込み障害、インスリン抵抗性、および高脂血症(hyperlipidaemia)の促進）、肝臓（グルコース産生増大、インスリン抵抗性、および高脂血症の促進）、骨（骨減少症および骨粗鬆症の促進）、免疫系（炎症応答の抑制および消炎の促進）、脳（神経毒性、認識機能障害、および気分障害の促進）、血管（血管収縮および高血圧の促進）、および腎臓（ナトリウム貯留および高血圧の促進）における臨床的に重要な作用が含まれる。
糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体に結合し、これを活性化するステロイドである。特徴的に、これらは、１７−ヒドロキシル基、２１−ヒドロキシル基、１１−ヒドロキシル基、３−ケト基を含み、４〜５位が二重結合の２１個の炭素ステロイドである。糖質コルチコイドの例には、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、デキサメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、βメタゾン、およびベクロメタゾンが含まれる。
糖質コルチコイド作用は、大部分が糖質コルチコイド受容体（ＧＲ:glucocorticoid receptor）の活性化によって媒介される。ＧＲは、炎症細胞でほとんど普遍的に発現する。細胞質中の糖質コルチコイドリガンドの結合時、これらの受容体は、核に能動輸送され、他の転写因子とヘテロ二量体および互いにホモ二量体を形成し、５’プロモーター領域中でのＧＲ応答エレメントへの結合によって広範な標的遺伝子の転写を調節する。ＧＲ活性化により、遺伝子転写を刺激または阻害することができる。
糖質コルチコイドの生物活性がその末梢代謝によっていくつかの方法で影響を受けることが最近認識されている。最初に、糖質コルチコイドを代謝する酵素は、循環糖質コルチコイド濃度に影響を与え、それによりＡＣＴＨおよびコルチコステロイド産生を調節する。糖質コルチコイドは、一連の酵素（６β−ヒドロキシラーゼ、２０−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、５β−レダクターゼ、５α−レダクターゼ、および１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが含まれる）によって不活化される。Ａ環レダクターゼ（５β−レダクターゼおよび５α−レダクターゼ）は、ヒトにおける末梢コルチゾール代謝の大部分で重要である。これらは、コルチゾールを５β−ジヒドロコルチゾールおよび５α−ジヒドロコルチゾールに変換し、次いで、肝臓中で３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって５β−テトラヒドロコルチゾールおよび５α−テトラヒドロコルチゾールに迅速に変換され、次いで、肝臓中でテトラヒドロ代謝産物はグルクロニルトランスフェラーゼおよびスルホニルトランスフェラーゼ酵素による抱合(conjugation)に供される。外因性糖質コルチコイドに対して、これらの酵素活性は、生物学的利用能に影響を与える。内因性糖質コルチコイド、コルチゾール、およびコルチコステロンについて、末梢代謝産物クリアランス速度（これらの代謝酵素の活性の和および尿または胆汁中の糖質コルチコイドの任意のさらなるクリアランスによって決定される）は、循環糖質コルチコイドレベルに影響を与え、それにより、視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸の中心的なフィードバック調節に影響を与える。末梢代謝クリアランス障害により、正常なコルチゾールレベルを維持するためにＨＰＡ軸の負のフィードバック抑制が起こる。代謝クリアランスの増大により、ＨＰＡ軸が活性化され、循環中の正常なコルチゾールレベルが維持されるが、高レベルの他のＡＣＴＨ依存性ステロイド（副腎アンドロゲンであるジヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、およびその代謝産物など）が犠牲になる。５α−レダクターゼによるコルチゾールが代謝の増大に起因するこのＨＰＡ軸の活性化は、肥満症(Andrew et al 1998)および多嚢胞性卵巣症候群(Stewart et al 1990)におけるアンドロゲンの過剰（およびそれによる多毛症および代謝障害）の機構であると予想されている。
第２に、糖質コルチコイド代謝酵素活性は、細胞内糖質コルチコイド濃度にも影響を与え、それにより、標的組織内のコルチコステロイド受容体の活性化を調整する。この現象は、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１ＨＳＤ）の役割について十分に記載されている(Stewart & Krozowski 1999;Seckl & Walker 2001)。１１ＨＳＤ２型は、限定された範囲のヒト組織（遠位ネフロン、結腸、および汗腺が含まれる）で発現する。これらの部位では、１１ＨＳＤ２型は、コルチゾールのコルチゾン（不活性ステロイド）への変換によってコルチゾールを不活化し、それにより、細胞内コルチゾール濃度を低下させる。この不活化の不全（例えば、先天的な１１ＨＳＤ２欠損症またはグリチルレシン酸またはカルベノキロソンでの１１ＨＳＤ２の阻害後）により、細胞内コルチゾールレベルが増加し（上記のようにＨＰＡ軸によって調節される循環コルチゾールレベルのいかなる変化も無い）、コルチゾールが鉱質コルチコイド受容体に結合する。正常な１１ＨＳ２Ｄ活性により、コルチゾールによる鉱質コルチコイド受容体の占拠が有意に阻害され、インビボでこれらの受容体にアルドステロンの選択性が付与される(Funder et al 1988;Edwards et al 1988)。逆に、１１ＨＳＤ１型は、他の組織（肝臓、脂肪組織、免疫系、および中枢神経系が含まれる）で発現される(Seckl & Walker 2001)。ここで、１１ＨＳＤ１は、不活性コルチゾンをコルチゾールに反応させ、それにより細胞内コルチゾール濃度が増加する。この反応は、これらの組織中での糖質コルチコイド受容体の活性化の維持で重要である(Walker et al 1995;Kotelevtsev et al 1997;Masuzaki et al 2001)。
ステロイド−甲状腺ホルモンスーパーファミリーの他のメンバーについてのステロイド作用に対する代謝酵素の影響の第３の機構が記載されている。これは、活性ステロイドの生物学的に活性な代謝産物への変換を含む(Stewart & Sheppard 1992)。例には、５’−モノデイオジナーゼ(monodeiodinases)によるチロキシンのトリヨードチロニンへの変換、５α−レダクターゼによるテストステロンの５α−ジヒドロテストステロンへの変換、１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによるエストロンのエストラジオールへの変換およびアンドロステンジオンのテストステロンへの変換、およびアロマターゼによるアンドロステンジオンのエストロンへの変換が含まれる。
しかし、糖質コルチコイドに関して、内因性糖質コルチコイドの代謝産物（ヒトにおけるコルチゾール、ラットおよびマウスにおけるコルチコステロン）は、不活性である（すなわち、生物活性を有さない）と報告されている(Golf et al 1984)。５α−レダクターゼによって産生される代謝産物（本発明の主題）に関して、この仮定を試験した実験はほとんど存在しなかった。５α−ジヒドロコルチコステロンのみが試験されているが、矛盾した結果が得られている。５α−ジヒドロコルチコステロンは、例えば、肝臓中の糖新生酵素活性の低下によって糖質コルチコイド作用を妨害するが(Golf et al 1984)、長期神経増強作用の阻害において糖質コルチコイド作用を模倣する(Dubrovsky et al 1987)ことも報告されている。これらの効果は、５α−ジヒドロコルチコステロンの膜効果の反映と解釈されており(Dubrovsky et al 1987)、その観点は、このステロイドが糖質コルチコイド受容体に結合しないという所見によって強化される。これは、結合したデキサメタゾン置換の失敗によって判断された(Carlstedt-Duke et al 1977)。
抗炎症薬としての臨床使用において（例えば、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチ、リウマチ性多発性筋痛など）、ほとんどの組織における糖質コルチコイド受容体によって媒介されるその作用のために、糖質コルチコイドは副作用（骨粗鬆症、肥満症、インスリン抵抗性、高血糖症、脂質代謝異常、高血圧、気分障害、睡眠障害、認識機能障害など）を誘導する。さらに、過剰レベルの内因性糖質コルチコイドは、類似の疾患に寄与し得る。外因性および内因性糖質コルチコイドのこれらの副作用を防止しながら有利な抗炎症効果を維持するために、糖質コルチコイド受容体活性化の組織特異的操作が必要である。現在まで、１１ＨＳＤ１を発現する標的組織内の糖質コルチコイドの再活性化の操作によってこれが提案されている。他のステロイドのために、主要なホルモンの活性代謝産物への変換の防止によってもホルモン作用を組織特異的に操作可能である（例えば、前立腺疾患におけるテストステロンの５α−ジヒドロテストステロンへの変換を防止するための５α−レダクターゼインヒビターの使用または乳房疾患におけるアンドロゲンのエストロゲンへの変換を防止するためのアロマターゼインヒビターの使用）。しかし、コルチゾールまたはコルチコステロンのこのような活性代謝産物は公知ではなく、糖質コルチコイドについてこのアプローチは提案されていなかった。
したがって、治療および他の用途のための糖質コルチコイド受容体活性の調整に適切な方法および組成物を同定することが当分野で必要である。
本発明者らは、驚くべきことに、５α還元糖質コルチコイド代謝産物は糖質コルチコイド受容体に結合して活性化することができるが５β還元糖質コルチコイド代謝産物ではできないことを見出した。さらに、これらの代謝産物の受容体に対する親和性および効率は、その内因性糖質コルチコイドリガンドの受容体に対する親和性および効率よりも高い。さらに、本発明者らは、受容体結合に利用可能な５α還元代謝産物の内因性レベルの調整は、受容体結合に利用可能な内因性糖質コルチコイドレベルに影響を与えないことを示した。したがって、本発明者らは、糖質コルチコイド受容体結合に利用可能な５β代謝産物ではなく５α還元糖質コルチコイド代謝産物のレベルの調整により、糖質コルチコイド受容体結合によって媒介される活性化およびその後の機能への影響も調整することができることを証明した。
したがって、第１の態様では、本発明は、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化を調整する方法であって、１つまたは複数の受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整するステップを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化を調整するため薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーターの使用を提供する。
本発明によれば、用語「５α還元代謝産物」は、５α−レダクターゼ酵素による内因性糖質コルチコイドの崩壊の結果として産生された１つまたは複数の産物をいう。有利には、本発明の５α還元代謝産物は、５α−ジヒドロコルチコステロン、５α−テトラヒドロコルチコステロン、５α−ジヒドロコルチゾール、および５α−テトラヒドロコルチコールからなる群から選択される。本発明のこの態様の最も好ましい実施形態では、５α還元代謝産物は５α−ジヒドロコルチコステロンである。当業者は、本明細書中に記載の本発明の使用に適切な他の５α還元代謝産物を承知している。
本明細書中で定義される、「１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーター」は、１つまたは複数の５α還元代謝産物の本明細書中で定義の機能活性を変化させる（増加、減少、その他）任意の薬剤、方法、または手順を意味する。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、モジュレーターは薬剤であり、フィナステリド、ＧＩ１９８７４５、Ｇ１１０８７４５、ＬＹ１９１７０４、およびインドメタシンからなる群から選択される。
本発明によれば、１つまたは複数の５α還元代謝産物の用語「機能活性」は、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に結合し、これを活性化する、当該１つまたは複数の代謝産物の能力を示す。
当業者は、異なる５α還元代謝産物の混合物の調整により、５α還元代謝産物による全受容体結合レベルが同一になるように１つまたは複数の還元代謝産物の機能活性を増大させ、同一の混合物内で１つまたは複数の別の代謝産物の機能活性を減少させることができることを認識する。この状況では、異なる還元代謝産物が糖質コルチコイド受容体に媒介される機能効果を活性化および／または発生させる能力が異なる代謝産物で異なる場合、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の機能活性は、それに応じて調整される。
上記のように、用語「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化」は、１つまたは複数の受容体が本明細書中に定義の１つまたは複数の「機能的効果」を得ることができるようなリガンド結合およびその後の１つまたは複数の受容体の形態の結合依存性変化をいう。形態のこのようなリガンド結合依存性変化は、リガンド結合で起こる受容体の高次構造の変化によって起こり得る。あるいはまたはさらに、受容体に一旦結合したリガンド自体により、本明細書中で定義の１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に媒介される「機能効果」が得られるエフェクター機能を提供することができる。当業者は、１つまたは複数の受容体へのリガンド結合によりこのような「機能的効果」の発生を促進することができるさらなる機構を承知している。
本発明によれば、「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化の調整」には、その範囲内に、同一または類似の条件下で本明細書中に定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物と結合接触させていない受容体の同一または類似のサンプルと比較した場合、本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物と結合接触した１つまたは複数の受容体サンプル中の活性化受容体数の増減が含まれる。
さらに、本発明によれば、「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化の調整」は、親糖質コルチコイドリガンドと同一または類似の条件下での同一または類似の受容体サンプルと比較して、１つまたは複数の５α還元代謝産物に対する受容体サンプルの親和性の相違（増加、減少、またはその他）によって媒介することができる。すなわち、本明細書中に記載の１つまたは複数の５α還元代謝産物は、同一の１つまたは複数の受容体に結合した糖質コルチコイドリガンドと比較して、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に対する親和性が増大または減少し得る。
あるいはまたはさらに、「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化の調整」を、同一または類似の条件下で本明細書中に定義の機能効果を得るために糖質コルチコイドリガンドに結合した同一または類似の糖質コルチコイド受容体サンプルと比較した場合、本明細書中に定義の５α還元代謝産物結合糖質コルチコイド受容体の本明細書中に記載の「機能効果」を得る能力の相違（増加、減少、またはその他）によって達成することができる。
当業者は、５α還元代謝産物により本明細書中に定義の糖質コルチコイド受容体の活性化を調整することができる他の機構を承知している。
糖質コルチコイド受容体活性化の適切な調整技術は、糖質コルチコイド受容体がインビボまたはインビトロのいずれで処理されるかに依存する。有利には、糖質コルチコイド受容体の調整は、受容体活性化の減少を含む。適切なインビボでの受容体活性化の減少方法を、以下からなる群から選択することができる。
・５α−レダクターゼ活性の減少による５α還元代謝産物産生の阻害。５α−レダクターゼ酵素活性を阻害するか５α−レダクターゼタンパク質レベルを減少させる薬剤によってこれを行うことができる。
・５α−ジヒドロ化合物の５α−テトラヒドロ代謝産物への変換の減少。例えば、３α−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼ活性を阻害するか３α−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼタンパク質レベルを減少させる薬剤によってこれを行うことができる。
・本明細書中に定義の５α還元代謝産物は、細胞膜を通過して細胞質に能動輸送される(Lackner et al 1998)。この輸送の阻害により、５α還元ステロイドの細胞質核ホルモン受容体へのアクセスが減少する。
・５α還元代謝産物レベルを低下させるための他の経路（例えば、５β−レダクターゼ）による糖質コルチコイド不活化の促進。これに関して、本発明が５β還元糖質コルチコイド代謝産物が糖質コルチコイド受容体に対して結合も活性化もしないことを示すことに留意することが重要である。
・本明細書中で定義のように、糖質コルチコイド受容体に機能的に近接した５α還元代謝産物のレベルが、同一の薬剤で処置していない糖質コルチコイド受容体の類似のサンプルと比較して、減少するように、５α還元糖質コルチコイド代謝産物の抱合を増強する薬剤を使用することができる。
本発明のこの態様の別の実施形態では、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性が増加する。本発明によれば、本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物を１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に結合接触させることによって、１つまたは複数の受容体を活性化させることができる。インビボ環境下で受容体活性化を行う場合、有利には、処置すべき１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体への１つまたは複数の５α還元糖質コルチコイド代謝産物のサンプル（１つを超える分子である）の投与によって受容体を活性化させることができる。
あるいはまたはさらに、インビボ糖質コルチコイド受容体を、５α還元代謝産物の内因性レベルを増加させる１つまたは複数の薬剤で処置することができる。このような薬剤には、Ａ環レダクターゼ酵素および／または５α還元代謝産物の内因性生成に関与する他の酵素もしくは分子が含まれるが、これらに限定されない。このような薬剤および／または５α還元代謝産物および／またはこれらをコードする核酸を、当業者に公知の方法（トランスフェクション法、微量注入、およびリポソーム投与が含まれる）を使用してインビボ環境に移入することができる。当業者は、このリストは網羅的であることを意図しないことを認識する。
さらなる態様では、本発明は、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の機能活性を調整する方法であって、１つまたは複数の受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整するステップを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の機能活性を調整するため薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーターの使用を提供する。
本発明によれば、用語「糖質コルチコイド受容体の機能活性の調整」は、受容体の機能活性の増加、減少、あるいは変化を意味する。
糖質コルチコイド受容体の「機能活性」は、受容体の機能効果を得る能力をいう。同様に、用語「受容体の機能活性の調整」は、受容体の機能効果を得る能力の変化（増加、減少、またはその他）をいう。一般に、受容体の活性化を引き起こす受容体と特異的リガンドの結合によって、このような機能効果が達成される。例えば、リガンド結合時に受容体内で起こり、受容体の機能活性化が起こる高次構造の変化によってこれを行うことができる。すなわち、受容体と特異的リガンドの結合により受容体が機能効果が得られるような形態になる。当業者は、糖質コルチコイド受容体の「機能活性」を生物内のその環境によって変化させることができることを認識する。すなわち、脂肪組織内に位置付けられたこのような受容体は、異なる組織内に位置付けられた場合に、同一の受容体と異なる範囲の機能効果を有し得る。
このような機能効果には、糖質コルチコイド受容体調節標的遺伝子発現の転写の増減および／または活性化糖質コルチコイド受容体に結合して制御される他の分子（例えば、タンパク質）の機能活性の調整が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、糖質コルチコイドのその１つまたは複数の特異的受容体への結合後に起こり得る他の機能効果を承知している。
いかなる疑いも回避するために、上記のように、リガンドのその１つまたは複数の受容体への用語「特異的結合」は、天然に起こるリガンド／受容体対の機能的結合を複製または模倣し、２つまたはそれ以上の潜在的なリガンド／受容体対合を区別する能力を有する様式でのリガンド／受容体対の結合をいう。他方では、非特異的結合は、生物学的機能相互作用を行う能力を有さず、且つ一般に区別されないリガンドと受容体との間の一般的結合を意味する。当業者は、任意の所与の受容体が１つまたは１つを超えるリガンドと特異的に結合することができることを認識する。さらに、任意の所与のリガンドを、１つを超える受容体によって特異的に結合させることができる。さらに、２つの異なるリガンドの結合部位は、任意の所与の受容体内の同一の部位または異なる部位に存在し得る。
本発明によれば、１つまたは複数の５α還元代謝産物の用語「機能活性」は、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に結合して活性化する１つまたは複数の代謝産物の能力を示す。
本明細書中に定義の５α還元代謝産物レベルを測定する技術は、当業者に周知である。技術の選択は、代謝産物レベルがインビトロまたはインビボのいずれで測定されるかに依存する。適切な方法には、免疫アッセイおよびクロマトグラフィ測定（薄層クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、およびガスクロマトグラフィ／質量分析）が含まれる(Andrew et al 1998;Livingstone et al 2000)。当業者は、このリストは網羅的であることを意図しないことを認識する。
本発明の方法を使用して、インビボまたはインビトロ環境における糖質コルチコイド受容体の活性化および／または機能活性を調整することができる。有利には、本発明の方法を使用して、インビボ環境内での糖質コルチコイド受容体の活性化および／または活性を調整する。
本発明の方法および使用によれば、糖質コルチコイド受容体は、コルチコステロイド受容体２型(Bamberger et al 1996)、低親和性糖質コルチコイド結合部位(Lopez-Guerra et al 1997)、および膜受容体(Lackner et al 1998)からなる群から選択される任意の受容体であり得る。当業者は、このリストは網羅的であることを意図しないことを認識する。
本発明者らは、ＨＰＡ軸活性の代償的変化により正常なコルチゾール濃度が維持されるため、５α還元代謝産物のレベルの調整は糖質コルチコイド受容体結合の内因性コルチゾールの利用可能性に影響を与えないので、本発明の方法が特に有利であることを示した。
本発明の方法は、５α−レダクターゼが発現する生物の組織（肝臓、皮膚、脂肪組織、脳、および前立腺(Russell & Wilson 1994)、および卵巣が含まれる）で有効である。したがって、これらにより、これらの組織｛肝臓（糖質コルチコイド依存性の、糖新生の促進、インスリン抵抗性、肝臓内脂肪蓄積、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、および高脂血症の防止）、脂肪（糖質コルチコイド依存性の、脂肪蓄積の増加、インスリン抵抗性、およびグルコース取り込みの阻害の防止）、脳（糖質コルチコイド関連の認知機能低下および気分障害の防止）、および皮膚（糖質コルチコイド誘導性の皮膚薄化(skin thinning)、挫傷(bruising)、多毛症、および座瘡の防止）が含まれる｝における糖質コルチコイド効果が減少する。これらの酵素が共に発現する部位（肝臓、脳、および前立腺が含まれる）において５α−レダクターゼと３α−ＨＳＤとの間の相互作用を利用することができる(Jin & Penning 2001;Steckelbroeck et al 2001)。当業者は、このリストは網羅的であることを意図しないことを認識する。
さらに、本発明者らは、Ａ環レダクターゼの操作によるコルチゾールの不活化率の低下のさらなる利点は、副腎皮質のＡＣＴＨ刺激の減少の結果としての副腎アンドロゲン排出の減少であることを見出した。これにより、皮膚（多毛症および座瘡、脱毛）および再生機構（不規則な月経周期および無排卵性不妊症）に対するアンドロゲン効果の減少が予想される。
本発明によれば、内因性５α還元糖質コルチコイド代謝産物濃度低下の有用性は、内因性５α還元代謝産物が高濃度で存在する環境でさらに増大する。糖質コルチコイドの５α還元代謝産物が増大する場合にこれが起こる（ヒトの特発性肥満症(Andrew et al 1998)、多嚢胞性卵巣症候群（Stewart et al 1990)、および本態性高血圧症(Soro et al 1995 ;Walker et al 1998)が含まれ、任意の原因によってコルチゾール産生が増大する場合、クッシング症候群(Phillipou 1982)が含まれる）。
したがって、本発明のさらなる態様は、患者の１つまたは複数の組織において１つまたは複数の糖質コルチコイドに媒介される効果を阻害する方法であって、前記効果が、肝臓（糖質コルチコイド依存性の、肝臓における糖新生の促進、肝臓におけるインスリン抵抗性、肝臓内脂肪蓄積、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、および高脂血症）、脂肪（糖質コルチコイド依存性の、脂肪蓄積の増加、インスリン抵抗性、およびグルコース取り込みの阻害）、脳（糖質コルチコイド関連の認知機能低下および気分障害）、および皮膚（糖質コルチコイド誘導性の皮膚薄化、挫傷、多毛症、および座瘡の防止）におけるものからなる群から選択され、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を阻害するステップを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、肝臓（糖質コルチコイド依存性の、肝臓における糖新生の促進、肝臓におけるインスリン抵抗性、肝臓内脂肪蓄積、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、および高脂血症）、脂肪（糖質コルチコイド依存性の、脂肪蓄積の増加、インスリン抵抗性、およびグルコース取り込みの阻害）、脳（糖質コルチコイド関連の認知機能低下および気分障害）、および皮膚（糖質コルチコイド誘導性の皮膚薄化、挫傷、多毛症、および座瘡の防止）におけるものからなる群から選択される病態の予防または治療のための薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のインヒビターの使用を提供する。
本発明の上記態様の好ましい方法または使用では、病態または糖質コルチコイドに媒介される効果は、肥満症、インスリン抵抗性、多嚢胞性卵巣症候群、真性糖尿病、皮膚障害（多毛症、座瘡）、認識障害、および糖質コルチコイド関連気分障害からなる群から選択される任意のものである。
上記のように、（病態または糖質コルチコイドに媒介される効果）の用語「阻害」は、（本発明の方法または使用にしたがって処置していない同一の効果または病態と比較した場合の、病態または糖質コルチコイドに媒介される効果の）部分的阻害も、その範囲内に含む。好ましくは、（本発明の方法または使用にしたがって処置していない同一の効果または病態と比較した場合の、病態または糖質コルチコイドに媒介される効果の）阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％である。さらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％、または９０％である。最も好ましくは、（本発明の方法または使用にしたがって処置していない同一の効果または病態と比較した場合の、病態または糖質コルチコイドに媒介される効果の）阻害は、１００％である。さらに、本発明によれば、用語「阻害」は、上記概説の上記効果の「防止」または「有意に防止」も、その範囲内に含む。
同様に、本明細書中に定義の「１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のインヒビター」には、本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物の本明細書中に定義のように１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体を結合して活性化する能力を上記のように阻害し（部分的阻害を含む）、そして／または上記のように防止する任意の分子が含まれる。
５α−レダクターゼ活性を阻害するか部分的に阻害する薬物は、当分野で公知であり、フィナステリド、ＧＩ１９８７４５(Hirsch et al 1993;Guarna et al 1998;Bartsch et al 2000)、およびＬＹ１９１７０４が含まれる。
さらに、本明細書中で使用される、用語「１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のインヒビター」には、その範囲内に、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を阻害または一部阻害する任意の方法または手順が含まれる。このような方法は、以前に概説されており、以下が含まれる。
・５α−レダクターゼ活性の減少による５α還元代謝産物産生の阻害。５α−レダクターゼ酵素活性を阻害するか５α−レダクターゼタンパク質レベルを減少させる薬剤によってこれを行うことができる。
・５α−ジヒドロ化合物の５α−テトラヒドロ代謝産物への変換の減少。例えば、３α−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼ活性を阻害するか３α−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼタンパク質レベルを減少させる薬剤によってこれを行うことができる。
・本明細書中に定義の５α還元代謝産物は、細胞膜を通過して細胞質に能動輸送される(Lackner et al 1998)。この輸送の阻害により、５α還元ステロイドの細胞質核ホルモン受容体へのアクセスが減少する。
・５α還元代謝産物レベルを低下させるための他の経路（例えば、５β−レダクターゼ）による糖質コルチコイド不活化の促進。これに関して、本発明が５β還元糖質コルチコイド代謝産物が糖質コルチコイド受容体に対して結合も活性化もしないことを示すことに留意することが重要である。
・本明細書中で定義のように、糖質コルチコイド受容体に機能的に近接した５α還元代謝産物のレベルが、同一の薬剤で処置していない糖質コルチコイド受容体の類似のサンプルと比較して、減少するように、５α還元糖質コルチコイド代謝産物の抱合を増強する薬剤を使用することができる。
好ましくは、インビボ環境下で本発明の方法を行う。有利には、インビボ環境はヒトである。
さらに驚いたことに、本発明者らは、５αレダクターゼ（Ａ環レダクターゼ）の活性の減少により、副腎皮質のＡＣＴＨ刺激の減少の結果として副腎アンドロゲン排出が減少することを見出した。
従って、さらなる態様では、本発明は、多毛症、座瘡、脱毛、不規則な月経周期、および無排卵性不妊症からなる群から選択される病態を予防および／または治療する方法であって、１つまたは複数の受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を阻害するステップを含む方法を提供する。
好ましくは、インビボ環境下で本発明の方法を行う。有利には、インビボ環境はヒトである。
さらに、本発明の研究は、５α還元糖質コルチコイド代謝産物の医学的投与により、炎症性疾患の予防または治療に有用な糖質コルチコイド作用が得られることを示す。「親」化合物（すなわち、５α酸化された従来の糖質コルチコイドホルモン）の投与を超える利点は、５α還元ステロイドがグルクロニドと迅速に抱合して肝臓で硫酸化し、それにより全身循環から非常に迅速に除去されることである。抱合体は不活性であり、迅速に尿中に排泄される。これに関して、５α還元糖質コルチコイドをその「親」糖質コルチコイドホルモンに変換する公知の経路は存在しないことを留意すべきである。したがって、５α還元糖質コルチコイド代謝産物の皮膚（例えば、局所投与による）、肺（例えば、吸入による）、結腸（例えば、坐剤または浣腸剤による）、関節（例えば、関節内注射による）、または肝臓（例えば、経口（全身循環へのアクセスを防止する非常に有効な第１の通過抱合(pass conjugation)））への投与により、糖質コルチコイド作用を所望の組織にターゲティングしながら、糖質コルチコイドの全身副作用が制限または防止される。
このような糖質コルチコイド媒介副作用には、ＨＰＡ軸の抑制、骨減少症、骨粗鬆症、免疫無防備状態、気分障害、不眠症、ならびに代謝副作用（高血糖症、高脂血症、肥満）および心血管副作用（高血圧、体液鬱滞）が含まれる。
したがって、さらなる態様では、本発明は、１つまたは複数の５α還元代謝産物と、生理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、患者の１つまたは複数の炎症病態を治療する方法であって、患者の１つまたは複数の炎症部位中で１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を増大させるステップを含む方法を提供する。
なおさらなる態様では、本発明は、患者の１つまたは複数の炎症病態の予防または治療のための薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のアクチベーターの使用を提供する。
本明細書中に記載される、「１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のアクチベーター」には、本明細書中に定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物の本明細書中に定義の１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に結合して活性化する能力を増大させる任意の分子または手順が含まれる。
本発明の上記態様によれば、有利には、１つまたは複数の５α還元糖質コルチコイド代謝産物の機能活性を、治療を必要とする患者に治療有効量の１つまたは複数の５α還元代謝産物を投与するステップ、５αレダクターゼ活性を増大させるステップ、コルチゾールの不活化経路を還元するステップ(reducing pathways of inactivation of cortisol)、５α還元代謝産物の抱合体を還元するステップ(reducing the conjugation of 5α reduced metabolites)、および５α−ジヒドロ還元代謝産物化合物をより活性な５α−テトラヒドロ還元代謝産物化合物に変換するステップからなる群から選択される任意の手順によって増大させる。最も有利には、１つまたは複数の５α還元糖質コルチコイド代謝産物の機能活性を、治療を必要とする患者への治療有効量の１つまたは複数の５α還元代謝産物の投与するステップによって増加させる。
本発明の上記態様によれば、好ましくは、５α還元代謝産物は、５α−ジヒドロコルチゾール、５α−テトラヒドロコルチゾール、５α−ジヒドロコルチコステロン、および５α−テトラヒドロコルチコステロンからなる群から選択される１つまたは複数のものである。
５α還元代謝産物を使用した内因性糖質コルチコイド受容体の活性化による炎症または他の疾患の治療における特定の利点は、このような受容体が組織全体に普遍的に発現され、その結果受容体が通常活性化されない組織中で活性化することができることである。当業者は、組織への５α還元代謝産物（その代謝および／またはこれらをコードする核酸に影響を与える薬剤）の適切な投与経路を承知している。発明の詳細な説明で、例も示す。
本発明者らは、驚いたことに、５α還元代謝産物が血管形成(angiogenesis)を阻害することも見出した。詳細には、本発明者らは、発達した血管組織（大動脈環状組織）における血管形成が、５α−テトラヒドロコルチコステロンによって阻害されることを見出した。詳細を実施例８に示す。
従って、さらなる態様では、本発明は、細胞集団内で血管形成を調整する方法であって、細胞集団内で本発明の１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整するステップを含む方法を提供する。
なおさらなる態様では、本発明は、細胞集団内で血管形成を調整する薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のモジュレーターの使用を提供する。
本明細書中で使用される、用語「血管形成」は、周辺細胞からの血管の形成をいう。例えば、組織修復時、創傷治癒時、子宮内膜中、虚血時（例えば、糖尿病性網膜症）、管腔内損傷に応答した血管壁中、卵胞中、および／または腫瘍の侵襲性成長時にこれが起こり得る。本発明の上記態様によれば、用語「血管形成の調整」は、適切なコントロール中で産生された血管数と比較した血管形成プロセス時に作製された血管数の増減をいう。本明細書中で定義の用語「血管形成の調整」には、その範囲内に、本明細書中に記載の血管形成調整薬または手順の存在下での血管形成パターンの任意の変化も含まれる。有利には、本発明の上記態様の「血管形成の調整」は、血管形成の阻害である。最も有利には、本明細書中に記載のように、血管形成の調整を、調整薬の使用によって達成する。
５α還元代謝産物の機能活性の適切なモジュレーターは、本明細書中、特に発明の詳細な説明に記載されている。本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物の本明細書中で定義の機能活性のモジュレーターは、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を活性化するか、機能活性を阻害することができる。本発明の上記態様の好ましい実施形態では、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のモジュレーターは１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のアクチベーターであり、本明細書中で定義の血管形成の調整は血管形成の阻害を含む。
本発明によれば、本発明の１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーターを使用した血管形成の調整をインビボまたはインビトロで行うことができる。本発明の上記態様の好ましい実施形態では、インビボで調整する。
本発明者らは、本発明の５α還元代謝産物を使用した血管形成の調整を創傷治癒、損傷後の血管再狭窄、癌および腫瘍の成長、虚血もしくは梗塞後の副行循環、脳卒中、糖尿病性網膜症、血管腫、濾胞性卵巣破裂、および月経過多を伴うか伴わない子宮内膜増殖症からなる群から選択される任意の病態を含む多種多様な病態の予防および／または治療で使用することを考慮する。当業者は、このリストは網羅的であることを意図しないことを認識する。
本明細書中に記載の本発明によれば、１つまたは複数の５α還元代謝産物および／またはこれらを含む組成物の作用の組織特異性を、その組織特異的投与によって達成することができる。あるいはまたはさらに、代謝産物作用の組織特異性を、あまり強力でない５αジヒドロ化合物のより活性な５α−テトラヒドロ化合物への選択的変換によって達成することができる。例えば、３α−ＨＳＤのアイソザイムの１つの基質であるリガンドのデザインによってこれを達成することができる(Jin & Penning 2001)。これらのアイソザイムの組織分布が異なるので、５α−テトラヒドロ代謝産物を副作用を制限する組織特異的様式で活性化することができる。
さらに、本発明により、局所５α還元糖質コルチコイド代謝産物を産生するために通常発現されない部位に５α−レダクターゼが移入され、それにより局所的抗炎症効果または他の効果が得られる。これは、例えば、任意の炎症組織における遺伝子治療の使用または酵素を含むリポソームのマクロファージへの送達に望ましい。
本明細書中で報告した研究は、肝臓、脂肪、前立腺、または皮膚における内因性糖質コルチコイド作用を増強するために、炎症性病態がこれらの組織に影響を与える場合、内因性５α還元代謝産物の濃度の増加が望ましいことを示す。しかし、当業者は、前に記載のように、本発明の方法および組成物を生物の多数の組織（５α還元糖質コルチコイド代謝産物が通常発現しない組織が含まれる）での炎症の治療で使用されることを認識する。
好ましくは、ヒトの１つまたは複数の炎症性病態を治療する。
有利には、１つまたは複数の５α還元糖質コルチコイド代謝産物は、５α−ジヒドロコルチゾール、５α−テトラヒドロコルチゾール、５α−ジヒドロコルチコステロン、および５α−テトラヒドロコルチコステロンからなる群から選択される。最も有利には、少なくとも１つの５α還元代謝産物は５α−テトラヒドロコルチコステロンである。
［定義］
用語「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化」は、１つまたは複数の受容体が本明細書中で定義の１つまたは複数の「機能効果」を得ることができるような１つまたは複数の受容体のリガンド結合およびその後の結合依存性の形態の変化をいう。このようなリガンド結合依存性の形態の変化は、リガンド結合時に起こる受容体の高次構造の変化によって起こり得る。あるいはまたはさらに、受容体によって一旦結合したリガンド自体により、エフェクター機能を得ることができる。
本発明によれば、「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化の調整」には、その範囲内に、同一または類似の条件下で本明細書中に定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物と結合接触させていない受容体の同一または類似のサンプルと比較した場合、本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物と結合接触した１つまたは複数の受容体サンプル中の活性化受容体数の増減が含まれる。
さらに、本発明によれば、「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化の調整」を、親糖質コルチコイドリガンドと同一または類似の条件下での同一または類似の受容体サンプルと比較して、１つまたは複数の５α還元代謝産物に対する受容体サンプルの親和性の相違（増加、減少、またはその他）によって媒介することができる。すなわち、本明細書中に記載の１つまたは複数の５α還元代謝産物は、同一の１つまたは複数の受容体に結合した糖質コルチコイドリガンドと比較して、１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に対する親和性が増大または減少し得る。
あるいはまたはさらに、「１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化の調整」を、同一または類似の条件下で本明細書中に定義の機能効果を得るために糖質コルチコイドリガンドに結合した同一または類似の糖質コルチコイド受容体サンプルと比較した場合、本明細書中に定義の５α還元代謝産物結合糖質コルチコイド受容体の本明細書中に記載の「機能効果」を得る能力の相違（増加、減少、またはその他）によって達成することができる。
糖質コルチコイド受容体に媒介される「機能効果」には、糖質コルチコイド受容体調節標的遺伝子発現の転写の増減および／または活性化糖質コルチコイド受容体に結合して制御する他の分子（例えば、タンパク質）の機能活性の調整が含まれるが、これらに限定されない。
用語「５α還元代謝産物」は、５α−レダクターゼ酵素による内因性糖質コルチコイドの崩壊の結果として産生された１つまたは複数の産物をいう。有利には、本発明の５α還元代謝産物は、５α−ジヒドロコルチコステロン、５α−テトラヒドロコルチコステロン、５α−ジヒドロコルチゾール、および５α−テトラヒドロコルチコールからなる群から選択される。
用語「１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーター」は、本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を変化させる（増加、減少、その他）任意の薬剤、方法、または手順を意味する。
（病態または糖質コルチコイドに媒介される効果）の用語「阻害」は、（本発明の方法または使用にしたがって処置していない同一の効果または病態と比較した場合の、病態または糖質コルチコイドに媒介される効果の）部分的阻害も、その範囲内に含む。好ましくは、（本発明の方法または使用にしたがって処置していない同一の効果または病態と比較した場合の、病態または糖質コルチコイドに媒介される効果の）阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％である。さらにより好ましくは、少なくとも７０％、８０％、または９０％である。最も好ましくは、（本発明の方法または使用にしたがって処置していない同一の効果または病態と比較した場合の、病態または糖質コルチコイドに媒介される効果の）阻害は、１００％である。さらに、本発明によれば、用語「阻害」は、上記概説の上記効果の「防止」または「有意に防止」も、その範囲内に含む。
同様に、本明細書中に定義の「１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のインヒビター」には、本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物の本明細書中に定義のように１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体を結合して活性化する能力を上記のように阻害し（部分的阻害を含む）、そして／または上記のように防止する任意の分子が含まれる。
本明細書中に記載される、「１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のアクチベーター」には、本明細書中に定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物の本明細書中に定義の１つまたは複数の糖質コルチコイド受容体に結合して活性化する能力を増大させる任意の分子または手順が含まれる。
本明細書中で使用される、用語「血管形成」は、周辺細胞からの血管の形成をいう。例えば、組織修復時および／または腫瘍の侵襲性成長時にこれが起こり得る。本発明の上記態様によれば、用語「血管形成の調整」は、適切なコントロール中で産生された血管数と比較した血管形成プロセス時に作製された血管数の増減をいう。本明細書中で定義の用語「血管形成の調整」には、その範囲内に、本明細書中に記載の血管形成調整薬または手順の存在下での血管形成パターンの任意の変化も含まれる。有利には、本発明の上記態様の「血管形成の調整」は、血管形成の阻害である。最も有利には、本明細書中に記載のように、血管形成の調整を、調整薬の使用によって達成する。
［一般的技術］
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリッド形成技術、および生化学分野）に一般的に理解されている意味と同一である。分子、遺伝子、および生化学的方法（一般に、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.およびAusubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th Ed,John Wiley & Sons,Inc.（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと）ならびに化学的方法について標準的技術を使用する。さらに、標準的な免疫学的技術については、Harlow & Lane.,A Laboratory Manual Cold Spring Harbor,N.Yを参照する。
［５α還元糖質コルチコイド代謝産物］
本明細書中に記載の５α還元代謝産物には、任意の以下のものが含まれるが、これらに限定されない。５α−ジヒドロコルチゾール、５α−テトラヒドロコルチゾール、５α−ジヒドロコルチコステロン、および５α−テトラヒドロコルチコステロン。
５α酸化糖質コルチコイドホルモンの崩壊によって代謝産物のインビボ調製を行うことができる。これらのステロイドの単離および／または調製方法は、当業者に周知である。
［５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーター］
本明細書中の発明の要約に記載されるように、本明細書中で定義の５α還元代謝産物の機能活性を、多数の方法によって調整することができる。調整方法は、還元代謝産物レベルの調整がインビボとインビトロのいずれで行われるかどうかに依存する。還元代謝産物レベルの調整をインビボで行う場合、以下の技術を使用することができる。調整すべき１つまたは複数の組織への５α還元代謝産物の投与、調整すべき１つまたは複数の組織への１つまたは複数の５α還元代謝産物の活性を調整し、そして／または５α還元代謝産物代謝に関与する１つまたは複数の酵素および／またはタンパク質の発現を調整し、５α還元代謝産物代謝に関与する適切な酵素および／またはタンパク質の遺伝子発現を調整する（例えば、５αレダクターゼ酵素の遺伝子発現の阻害、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの遺伝子発現の阻害）１つまたは複数の小分子またはタンパク質ベースの薬剤の投与。
［（ａ）小分子またはタンパク質ベースの薬剤］
小分子薬は、合成することができるか天然に存在し、フィナステリド、ＧＩ１９８７４５(Hirsch et al,1993;Guarna et al 1998;Bartsch et al 2000)、インドメタシン(Hu et al 2000;Kleinwachter et al 2001;Jin & Penning,2001)、およびＬＹ１９１７０４(Hirsch et al)を含む。
別の小分子薬を、従来のスクリーニング技術（コンビナトリアル・ケミストリーアプローチが含まれる）によってこのような薬剤のライブラリーから選択することができる。有利な実施形態では、糖質コルチコイド受容体の生物活性をモニターする細胞ベースのアッセイを使用して、スクリーニングアッセイの試験系を得ることができる。蛍光または他の読み出し（高処理適用が含まれる）を使用することができる。
薬剤は、タンパク質ベースまたは核酸ベースであり得る。ＳＥＬＥＸなどの技術によって任意の所望の受容体に結合させるためのタンパク質および核酸（特に、ＲＮＡ、アプタマー）を選択することができる。ＳＥＬＥＸは、標的分子に非常に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化法である。例えば、米国特許第5,654,151号、同第5,503,978号、同第5,567,588号、および同第5,270,163号ならびにＰＣＴ公開WO 96/38579号（それぞれ具体的に本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。
ＳＥＬＥＸ法は、オリゴヌクレオチドライブラリーからの核酸アプタマー（所望の標的に結合することができる一本鎖核酸）の選択を含む。好ましくは無作為化配列のセグメントを含む核酸ライブラリーから出発し、ＳＥＬＥＸ法は、結合に好ましい条件下でライブラリーを標的に接触させるステップと、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分配するステップと、核酸−標的複合体を分離するステップと、核酸−標的複合体から分離した核酸を増幅させて核酸のリガンド富化ライブラリーを得るステップと、標的分子に対する非常に特異的で高親和性の核酸リガンドを得るために所望のサイクル数で結合、分配、分離、および増幅ステップを繰り返すステップとを含む。
ＳＥＬＥＸは、非常に多数の可能な配列および構造を含む核酸ライブラリー内に所与の標的に対して広範な結合親和性が存在するという原理に基づく。例えば、２０ヌクレオチドの無作為化セグメントを含む核酸ライブラリーは、４20種の構造を有する可能性がある。標的に対してより高い親和性定数を有する構造が、結合する可能性が最も高いと考えられる。分配、分離、および増幅プロセスにより、より結合親和性の高い候補が富化した第２の核酸ライブラリーが得られる。得られたライブラリーが主に１種のみまたは数種の配列から構成されるまで、さらなる選択ラウンドにより段階的に最良のリガンドが優先される。次いで、これらをクローン化し、配列決定し、それぞれ純粋なリガンドとして結合親和性について試験することができる。
所望の目的が達成されるまで、選択および増幅サイクルを繰り返す。最も一般的な場合、サイクルの繰り返しによって結合強度が有意に改良されなくまで選択／増幅を継続する。反復選択／増幅法は、少なくとも１０4個の配列を含むライブラリー中の１つの配列変異型を単離できるほど感度が高い。原則的に、この方法を使用して、約１０8個もの異なる核酸種をサンプリングすることができた。ライブラリーの核酸は、好ましくは、無作為化配列部分および有効な増幅に必要な保存配列を含む。多数の方法（無作為化核酸配列の合成および無作為に切断した細胞核酸からのサイズ選択が含まれる）で核酸配列変異型を産生することができる。可変配列部分は、完全または部分的に無作為な配列を含むことができ、無作為化配列と共に組み込まれた保存配列のサブポーションもまた含み得る。試験核酸の配列のばらつきを、選択／増幅の繰り返し前またはその間の変異誘発およびクローン化アプタマーの特異的修飾によって移入または増加させることができる。
タンパク質ベースの薬剤には、さらに、任意の１つまたは複数の５α還元代謝産物および／または５α還元代謝産物代謝に関与する１つまたは複数の分子（例えば、５αレダクターゼ酵素、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ）に対して惹起した抗体が含まれる。当業者は、このリストは網羅的であることを意図しないことを認識する。
本明細書中で使用される、「抗体」は、選択された標的に結合することができる完全な抗体または抗体フラグメントをいい、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）2、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、操作した抗体（キメラ抗体、ＣＤＲグラフティング抗体、およびヒト化抗体が含まれる）、およびファージディスプレイまたは別の技術を使用して産生された人為的に選択された抗体が含まれる。小フラグメント（ＦｖおよびｓｃＦｖなど）は、その小さなサイズおよびそれによる優れた組織分布のために診断および治療に適用するための有利な特性を有する。
本発明の抗体は、特に、診断および治療への適用が示唆される。従って、これらは毒素または標識などのエフェクタータンパク質を含む変化した抗体であり得る。インビボで抗体分布を画像化することができる標識が特に好ましい。このような標識は、患者の体内で容易に視覚化することができる放射性標識または放射性不透明標識（金属粒子など）であり得る。さらに、標識は、蛍光標識または患者から取り出した組織サンプルで視覚化することができる他の標識であり得る。
組換えＤＮＡテクノロジーを使用して、本発明の抗体を改良することができる。したがって、診断または治療への適用においてその免疫原性を減少させるためのキメラ抗体を構築することができる。さらに、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第0239400号(Winter)を参照のこと）および任意選択的にフレームワーク修飾（欧州特許第0239400号（国際特許出願WO90/07861号(Protein Design Labs)に概説））による抗体のヒト化によって免疫原性を減少させることができる。
本発明の抗体を、動物の血清から得るか、モノクローナル抗体またはそのフラグメントの場合、細胞培養で産生することができる。確立された手順にしたがって組換えＤＮＡ技術を使用して、細菌または好ましくは哺乳動物細胞培養において抗体を産生することができる。選択された細胞培養系は、好ましくは、抗体産物を分泌する。
したがって、本発明は、タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列に適切な読み取り枠で連結されたシグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換された宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞）を培養するステップと、前記タンパク質を単離するステップとを含む本発明の抗体の産生プロセスを含む。
任意選択的に、哺乳動物血清（例えば、ウシ胎児血清）または微量元素および成長を維持する補助物質（例えば、正常なマウス腹腔滲出細胞などの支持細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）を捕捉した習慣的に標準的な培養培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地）である適切な培養培地にてインビトロでハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞を増殖させる。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖も、当分野で公知の適切な培養培地（例えば、細菌については、ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ ｘ ＹＴ、またはＭ９最少培地培地、酵母については、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最少培地、または完全最少ドロップアウト(dropout)培地）で同様に行う。
インビトロ産生により、比較的純度の高い抗体調製物が得られ、大量の所望の抗体を得るためにスケールアップすることが可能である。細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞の培養技術は当分野で公知であり、例えば、エアリフトリアクターまたは連続撹拌リアクターにおける均一な懸濁培養または例えば、中空糸膜、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、またはセラミックカートリッジにおける固定化もしくは捕獲細胞培養が含まれる。
インビボで哺乳動物細胞の増殖によって、大量の所望の抗体を得ることもできる。この目的のために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、組織適合哺乳動物に注射して抗体産生腫瘍を成長させる。任意選択的に、注射前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱物油で動物を感作する。１〜３週間後、これらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、適切な骨髄腫細胞とＢａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生脾臓細胞との融合によってハイブリドーマ細胞を得るか、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０由来のトランスフェクション細胞を、任意選択的にプリスタンで前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、１〜２週間後、この動物から腹水を採取する。
上記および他の技術は、例えば、Kohler and Milstein,(1975)Nature 256:495-497;米国特許第4,376,110号;Harlow and Lane,Antibodies:a Laboratory Manual,(1988)Cold Spring Harbor（本明細書中で参考として組み込まれる）で考察されている。組換え抗体分子の調製技術は、上記引例および例えば欧州特許第0623679号；欧州特許第0368684号、および欧州特許第0436597号（本明細書中で参考として組み込まれる）にも記載されている。
細胞培養上清を、好ましくは免疫ブロッティングによる所望の抗体を発現する細胞の免疫蛍光染色、酵素免疫アッセイ（例えば、サンドイッチアッセイまたはドットアッセイ）、または放射性免疫アッセイによって所望の抗体についてスクリーニングする。
抗体単離のために、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウムでの沈殿、ポリエチレングリコールなどの含水材料に対する透析、または選択膜による濾過などによって濃縮することができる。必要および／または所望する場合、慣習的なクロマトグラフィ法（例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−セルロースによるクロマトグラフィ、および／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィ（例えば、１１β−ＨＳＤ１分子またはプロテインＡを使用したアフィニティクロマトグラフィ））によって抗体を精製する。
本発明者らはまた、細胞内での５α還元糖質コルチコイド代謝産物の機能活性の調節のために細胞内で操作することができる細胞内抗体を提供する。細胞内抗体は、当分野で公知のように、発現ベクターから細胞内で発現するｓｃＦｖ抗体であることが有利である。
高等生物細胞において抗原認識で機能するための細胞内抗体または細胞内発現抗体(intrabody)が証明されている(A.& Biocca,S.(1997)Intracellular Antibodies.Development and Applications.Landes and Springer-Verlagで概説)。この相互作用は、細胞質、核、または分泌経路で首尾よく阻害された細胞タンパク質の機能に影響を与えることができる。この有効性は、植物生物工学におけるウイルス耐性で証明されており(Tavladoraki,P.,et al.(1993)Nature 366:469-472)、ＨＩＶウイルスタンパク質(Mhashilkar,A.M.,et al.(1995)EMBO J 14:1542-51;Duan,L.& Pomerantz,R.J.(1994)Nucleic Acids Res 22:5433-8;Maciejewski,J.P.,et al.(1995)Nat Med 1:667-73;Levy-Mintz,P.,et al.(1996)J Virol.70:8821-8832)および癌遺伝子産物(Biocca,S.,Pierandrei-Amaldi,P.& Cattaneo,A.(1993)Biochem Biophys Res Commun 197:422-7;Biocca,S.,Pierandrei-Amaldi,P.,Campioni,N.& Cattaneo,A.(1994)Biotechnology(NY)12:396-9;Cochet,O,et al.(1998)Cancer Res 58:1170-6)への細胞内抗体結合へのいくつかの適用が報告されている。
［（ｂ）遺伝子発現の調整による５α還元代謝産物機能活性の調整］
遺伝子発現の調整は、多数のインビボおよびインビトロ法において達成可能であることが当業者に公知である。アンチセンス技術および直接遺伝子操作は、遺伝子発現の調整での使用で公知である。したがって、本発明は、天然もしくは修飾ヌクレオチドまたはその両方を組み込むことができるアンチセンス核酸、リボザイム（ハンマーヘッドリボザイムが含まれる）、相同組換えおよび遺伝子発現レベルの他の低下技術などによる遺伝子ノックアウトの使用を含む。
当分野で公知の技術に従って、核酸薬を産生および発現することができる。操作および発現のために、所望の薬剤をコードする核酸をベクターに組み込むことができる。本明細書中で使用される、ベクター（またはプラスミド）は、その発現用または複製用の細胞への異種ＤＮＡを移入するために使用される個別のエレメントをいう。このような送達体の選択および使用は十分に当業者の範囲内である。多くのベクターを利用可能であり、適切なベクターの選択は、意図するベクターの使用に依存する（すなわち、ＤＮＡ複製またはＤＮＡ発現、ベクターに挿入されるＤＮＡのサイズ、およびベクターで形質転換される宿主細胞のいずれに使用されるかどうか）。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの複製またはＤＮＡの発現）および共用される宿主細胞に依存した種々の組成物を含む。ベクター成分は、一般に、１つまたは複数の以下のものが含まれるが、これらに限定されない。複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列、およびシグナル配列。
発現ベクターおよびクローニングベクターは共に、一般に、ベクターが１つまたは複数の選択された宿主細胞中で複製することができる核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡと独立して複製することができ、複製起点または自立複製配列を含む配列である。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、２ｍプラスミド起点は酵母に適切であり、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、高レベルのＤＮＡ複製にコンピテントな哺乳動物細胞（ＣＯＳ細胞など）に使用されない限り哺乳動物発現ベクターには必要ない。
ほとんどの発現ベクターはシャトルベクター（すなわち、少なくとも１つの生物クラスで複製することができるだけでなく、発現用のために別のクラスの生物にトランスフェクトすることができる）である。例えば、ベクターをＥ．ｃｏｌｉでクローン化し、宿主細胞染色体と独立して複製できないにもかかわらず、このベクターを酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトする。ＤＮＡを、宿主ゲノムへの挿入によって複製することもできる。
有利には、発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、選択培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）への耐性、相補的栄養要求性の欠損を付与するか、天然培地からは利用不可能な重要栄養素を提供するタンパク質をコードする。
酵母に適切な選択遺伝子マーカーに関しては、マーカー遺伝子の表現型発現による形質転換体の選択を容易にする任意のマーカー遺伝子を使用することができる。酵母に適切なマーカーは、例えば、抗生物質Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはブレオマイシン耐性を付与するか、栄養要求性酵母変異体（例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、またはＨＩＳ３遺伝子）に原栄養性を提供するマーカーである。
ベクターの複製はＥ．ｃｏｌｉで都合よく行われるので、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉ複製起点を含むことが有利である。これらを、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点およびアンピシリンなどの抗生物質への耐性を付与するＥ．ｃｏｌｉ遺伝子マーカーを含むｐＢＲ３２２などのＥ．ｃｏｌｉプラスミド、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商品名）ベクター、またはｐＵＣプラスミド（例えば、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９）から得ることができる。
哺乳動物細胞用の適切な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、またはＧ４１８もしくはハイグロマイシンに耐性を付与する遺伝子などの問題の核酸で形質転換された細胞を同定することができるマーカーである。哺乳動物細胞の形質転換体を、マーカーを取り込んで発現する形質転換体のみが固有に生存に適合するする淘汰圧下に置く。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）マーカーの場合、淘汰圧の漸増によって選択遺伝子および結合ＤＮＡの両方を（その染色体取り込み部位で）増幅させる条件下での形質転換体の培養によって、淘汰圧を課すことができる。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、所望の核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。このようなプロモーターは、誘導または構成プロモーターであり得る。元のＤＮＡからのプロモーターの取り出し（例えば、制限酵素消化）およびベクターへの単離プロモーター配列の挿入によってプロモーターを問題の核酸に作動可能に連結させることができる。用語「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図する様式で機能する関係にある近位をいう。コード配列に「作動可能に連結された」調節配列を、コード配列の発現が調節配列と競合する条件下で達成されるような方法でライゲートする。
原核宿主との使用に適切なプロモーターには、例えば、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。これらのヌクレオチド配列が公開されているので、当業者はこれらを任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを用いて必要に応じてベクターに作動可能にライゲートすることができる。細菌系用のプロモーターはまた、一般に、シャイン−ダルカルノ配列を含む。
好ましい発現ベクターは、細菌中で機能することができるｐｈａｇｅｘまたはＴ７などのバクテリオファージのプロモーターを含む細菌発現ベクターである。最も広く一般的に使用されている発現系の１つでは、融合タンパク質をコードする核酸を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってベクターから転写することができる（７３）。ｐＥＴベクターと共に使用されるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主株では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを宿主細菌中のλリソゲンＤＥ３から産生させ、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃ ＵＶ５プロモーターの調節下で発現させる。この系は、多数のタンパク質の過剰産生に首尾よく使用されている。あるいは、市販のＣＥ６ファージ(Novagen,Madison,USA)などのｉｎｔ−ファージでの感染によってλファージにポリメラーゼ遺伝子を移入することができる。他のベクターには、ＰＬＥＸ(Invitrogen,NL)などのλＰＬプロモーターを含むベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓＴｍ(Invitrogen)またはｐＴｒｃ９９(Pharmacia Biotech,SE)などのｔｒｃプロモーターを含むべくター、またはｐＫＫ２２３−３(Pharmacia Biotech)またはＰＭＡＬ(new England Biolabs,MA,USA)などのｔａｃプロモーターを含むベクターが含まれる。
酵母宿主との使用に適切なプロモーター配列を制御するか構成性であることができ、これは、好ましくは、高度に発現する酵母遺伝子、特にSaccharomyces cerevisiae遺伝子由来である。したがって、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子、ａもしくはα因子をコードする酵母交配フェロモン遺伝子のプロモーターもしくは解糖酵素をコードする遺伝子由来のプロモーター（エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、またはグルコキナーゼの遺伝子、S.cereviae ＧＡＬ４遺伝子、S.pombe ｎｍｔ１遺伝子のプロモーターなど）、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子由来のプロモーターを使用することができる。さらに、ある酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）および別の酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター（例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳおよび酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーターエレメントを含むハイプリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター））を使用可能である。適切な構成性ＰＨ０５プロモーターは、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７３から始まりヌクレオチド−９で終わるＰＨ０５（−１７３）プロモーターエレメントなどの上流調節エレメント（ＵＡＳ）を欠く短縮酸性ホスファターゼＰＨ０５プロモーターである。
哺乳動物宿主におけるベクターからの遺伝子転写を、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、およびサルウイルスＳ４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノム由来のプロモーター、アクチンプロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターもしくは非常に強力なプロモーター（例えば、リボゾームタンパク質プロモーター）によって調節することができる。
高等真核生物による核酸の転写を、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加させることができる。エンハンサーは、比較的方向および位置依存性である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列（例えば、エラスターゼおよびグロビン）が公知である。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０塩基対）およびＣＭＶ初期プロモーターのエンハンサーが含まれる。エンハンサーを、コード配列の５’または３’位でベクターにスプライシングすることができるが、プロモーターから５’側に存在するのが好ましい。
有利には、真核生物発現ベクターは、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）を含み得る。ＬＣＲは、宿主細胞クロマチンに取り込まれた導入遺伝子の発現に依存する高レベルの取り込み部位を指示することができ、これは遺伝子治療用またはトランスジェニック動物用にデザインされたベクター中で、ベクターの染色体取り込みが起こる恒常的にトランスフェクトされた真核細胞株の範囲で遺伝子が発現される場合特に重要である。
真核生物発現ベクターはまた、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ｍＲＮＡの非翻訳部分中で、ポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
発現ベクターには、このようなＤＮＡを発現することができるプロモーター領域などの調節配列と作動可能に連結される核酸を発現することができる任意のベクターが含まれる。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞への移入の際にクローン化ＤＮＡが発現される組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物（プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターなど）をいう。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、これには、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能な発現ベクターおよびエピソームが残存した発現ベクター、または宿主細胞ゲノムに取り込まれる発現ベクターが含まれる。
本発明のベクターの構築には、従来のライゲーション技術を使用する。単離プラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、所望の形態に切断、構成変更、および再ライゲーションして必要なプラスミドを作製する。所望ならば、公知の様式で、構築したプラスミドが正確な配列であるかを確認するための分析を行う。適切な発現ベクターの構築法、インビトロ転写物の調製法、宿主細胞へのＤＮＡの移入法、ならびに発現および機能を評価する分析は、当業者に公知である。サンプル中の遺伝子の存在、増幅および／または発現を、例えば、本明細書中の配列に基づき得る適切に標識したプローブを使用した従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはインサイチューハイブリッド形成によって測定することができる。当業者は、所望ならば、これらの方法を容易に修正ことができる方法を認識する。
上記のベクターを、遺伝子治療技術に使用し、疾患の治療に適用することができる。例えば、本発明のアンチセンス分子をコードする核酸配列を、エキソビボまたはインビボでの患者の細胞への核酸の送達のためにデザインされたウイルスまたは非ウイルスベクターに挿入することができる。
ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターが含まれる。非ウイルスベクターの例には、裸のＤＮＡ、凝縮ＤＮＡ粒子、ターゲティング部分、妥当な場合、ウイルス由来のエスケープペプチド、抗体などのターゲティング部分と複合体形成したＤＮＡ、または好ましくはターゲティング細胞によって内在化された細胞表面リガンドを含み得るリポソーム型ベクターが含まれる。
［（ｃ）他の方法］
１つまたは複数の５α還元糖質コルチコイド代謝産物の機能活性を減少する他の方法には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・５α−レダクターゼ活性の減少による５α還元代謝産物産生の阻害。５α−レダクターゼ酵素活性を阻害するか５α−レダクターゼタンパク質レベルを減少させる薬剤によってこれを行うことができる。
・５α−ジヒドロ化合物の５α−テトラヒドロ代謝産物への変換の減少。例えば、３α−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼ活性を阻害するか３α−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼタンパク質レベルを減少させる薬剤によってこれを行うことができる。
・本明細書中に定義の５α還元代謝産物は、細胞膜を通過して細胞質に能動輸送される(Lackner et al 1998)。この輸送の阻害により、５α還元ステロイドの細胞質核ホルモン受容体へのアクセスが減少する。
・５α還元代謝産物レベルを低下させるための他の経路（例えば、５β−レダクターゼ）による糖質コルチコイド不活化の促進。これに関して、本発明が５β還元糖質コルチコイド代謝産物が糖質コルチコイド受容体に対して結合も活性化もしないことを示すことに留意することが重要である。
同一の薬剤で処置していない糖質コルチコイド受容体の類似のサンプルと比較して、糖質コルチコイド受容体に結合することができる５α還元代謝産物レベルが減少するように５α還元糖質コルチコイド代謝産物の抱合を増強する薬剤を使用することができる。
５α還元代謝産物の機能活性の増加に適切な技術は、発明の要約に詳述されている。
［５α還元代謝産物、その組成物、およびその機能活性を調整する薬剤の投与］
本発明の薬剤を、薬学的組成物の形態で従来の医学的アプローチによって送達することができる。本発明の薬学的組成物は、有効成分として少なくとも１つまたは複数の５α還元代謝産物または１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーターを含む物質の組成物である。本発明の薬学的組成物の有効成分は、例えば、心血管疾患の緩和において優れた治療活性を示すことが意図される。適切な治療応答を得るために投薬計画を調整することができる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与することができるか、治療状況に必要な要件によって示されるように、容量を比例的に減少させることができる。
活性化合物を、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、または直腸経路または移植（例えば、徐放性分子の使用）などによって従来の様式で投与することができる。投与経路に依存して、有効成分は、酵素、酸、および有効成分を不活化し得る他の天然の条件の作用から有効成分を保護するための材料でコーティングする必要があり得る。
非経口投与以外によって組み合わせ物を投与するために、その不活化を防止する物質でコーティングするか同時に投与する。例えば、組み合わせ物をアジュバント中で投与するか、酵素インヒビターと同時投与するか、リポソーム中で投与することができる。アジュバントをその最も広い意味で使用し、インターフェロンなどの任意の免疫刺激化合物が含まれる。本明細書中で意図されるアジュバントには、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルなど）が含まれる。酵素インヒビターには、膵臓トリプシンが含まれる。
リポソームには、水−油−水型ＣＧＦ乳濁液および従来のリポソームが含まれる。
活性化合物を、非経口または腹腔内に投与することもできる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物または油の分散液を調製することもできる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。
注射に適切な薬学的形態には、滅菌水溶液（水溶液である場合）または分散液および滅菌注射液または分散物の即席の調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合で、形態は滅菌されていなければならず、シリンジで容易に投与できる範囲までの流動物でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリプロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散液であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤(superfactant)の使用によって適切な流動性を維持することができる。
種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびシルメロサル(thirmerosal)など）によって微生物作用を予防することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物での使用によって注射用組成物の吸収を延長することができる。
上記の種々の他の成分を含む適切な溶媒中の必要量の活性化合物の組み込みおよび必要に応じてその後の濾過滅菌によって滅菌注射液を調製する。一般に、基本的な分散媒および上記の必要とする他の成分を含む滅菌媒介物への滅菌有効成分の組み込みによって分散物を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末およびその予め濾過滅菌した溶液由来の任意のさらなる所望の成分が得られる真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
ポリペプチドの組み合わせ物が上記のように適切に保護される場合、組み合わせ物を、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができるか、硬質または軟質ゼラチンカプセル中に封入することができるか、打錠することができるか、食品に直接組み込むことができる。治療的経口投与のために、活性化合物を賦形剤と共に組み込むか、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、およびウエハースなどの形態で使用することができる。このような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が得られるような量である。
錠剤、トローチ、丸薬、およびカプセルなどはまた、以下を含み得る。トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、およびアルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリーフレーバーなどの香料を添加することができる。単位投薬形態がカプセルである場合、上記型の材料に加えて、液体担体を含むことができる。
コーティングとしてまたは投薬単位の物理的形態を改変するために種々の他の材料が存在し得る。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルを、シェラック、糖、またはその両方でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、およびチェリーまたはオレンジフレーバーなどの香料を含み得る。勿論、任意の単位投薬形態の調製で使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用量で実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物を、徐放性調製物および処方物に組み込むことができる。
本明細書中で使用される、「薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤」には、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗生物質、および抗真菌薬、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は、当分野で周知である。任意の従来の媒質または薬剤が有効成分と不適合である以外は、治療組成物でのその使用が意図される。補足的有効成分を組成物に組み込むこともできる。
投与を容易にし且つ投薬量を均一にするために単位投薬形態の非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書中で使用される、「単位投薬形態」は、治療すべき哺乳動物被験体のための単回用量として適合した物理的に個別の単位をいう；各単位は、必要な薬学的担体と組み合わせた所望の治療効果を得るために計算された所定量の活性材料を含む。本発明の新規の単位投薬形態の仕様は、以下によって予想され、且つ直接依存する。（ａ）活性材料の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果および（ｂ）身体の健康が損なわれる罹患状態の生きた被験体の疾患の治療のための活性材料などの混合分野特有の制限。
便利且つ有効な投与のために、単位投与形態で有効量の有効主成分を適切な薬学的に許容可能な担体と混合する。補助的な有効成分を含む組成物の場合、前記成分の常用量および投与様式の基準によって投薬量を決定する。
［本発明の５α還元代謝産物およびその組成物の調整のための治療ストラテジー］
糖質コルチコイドは、副腎皮質ステロイドホルモン群であり、その代謝効果には、糖新生の刺激、タンパク質異化の増加、および遊離脂肪酸の動員が含まれ、炎症反応（アレルギー反応）の強力なインヒビターとしても公知である。ほとんどの哺乳動物における大部分の糖質コルチコイド活性はコルチゾール（ヒドロコルチゾンとしても公知）に由来する。コルチコステロンは、げっ歯類における主な糖質コルチコイドであり、ヒトにおいても原形質中のコルチゾール濃度の約１０％存在する。デキサメタゾンなどの合成糖質コルチコイドも公知である。コルチゾールは細胞質中の糖質コルチコイド受容体に結合し、次いで、ホルモン−受容体は核に移動し、そのＤＮＡ応答エレメントに結合して関連遺伝子の転写を調整する。
糖質コルチコイド受容体は普遍的に存在し、その結果としてこれらのステロイドホルモンは生理系に対して非常に多くの効果を有する。最も公知且つ研究されている糖質コルチコイドの効果は、炭水化物代謝および免疫機能に対するものである。実際、糖質コルチコイドという名称は、これらのホルモンがグルコース代謝に関与するという初期の所見に由来する。絶食状態では、コルチゾールは血液中の正常なグルコース濃度を増大および維持するために集合的に作用するいくつかのプロセスを刺激する。
糖質コルチコイドは、強力な抗炎症性および免疫抑制性を有することが公知である。これは、特に、薬理学的用量で投与した場合に明らかであるが、正常な免疫応答でも重要である。結果として、糖質コルチコイドは、慢性（必ずしも持続性である必要はない）炎症病態（関節炎、腎炎、喘息、または皮膚炎など）の治療薬および自己免疫疾患などの病態のための付加治療として広範に使用されている。
抗炎症を目的とするいくつかの局所投与用ステロイド薬には、βメタゾン（Ｄｉｐｒｏｌｅｎｅ（登録商標）ｃｒｅａｍ）、クロベタゾール（Ｔｅｍｏｖａｔｅ（登録商標））、デノシド（Ｄｅｓｏｗｅｎ（登録商標））、フルオシノロン（Ｄｅｒｍａ−Ｓｍｏｏｔｈｅ／ＦＳ（登録商標））、フルオシノニド（Ｌｉｄｅｘ（登録商標））、ヒドロコルチゾン（Ａｎｕｓｏｌ（登録商標）、Ｃｏｒｔａｉｄ（登録商標）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｏｎｅ（登録商標））、モメタゾン（Ｅｌｏｃｏｎ（登録商標））、およびトリアムシノロン（Ａｒｉｓｔｏｃｏｒｔ（登録商標）、Ｋｎａｌｏｇ（登録商標））が含まれる。現在、糖質コルチコイドの抗炎症性は炎症遺伝子を調節するか細胞アポトーシスを調整する能力に起因すると考えられている。
ステロイド薬の使用には、本発明で取り組もうとする多数の欠点が存在する。例えば、親糖質コルチコイドと対照的な５α還元糖質コルチコイド代謝産物の投与における特定の利点は、５α還元ステロイドがグルクロニドと迅速に抱合して肝臓で硫酸化し、それにより全身循環から非常に迅速に除去されることである。これらの抱合体は不活性であり、迅速に系から尿中に排泄される。これに関して、５α還元糖質コルチコイドをその「親」糖質コルチコイドホルモンに変換する公知の経路は存在しないと考えることが重要である。
非常に有効な第１の通過抱合を有する５α還元代謝産物の特性により、代謝産物の組織特異的投与が促進される。例えば、非常に有効な第１の通過抱合を使用した５α還元糖質コルチコイド代謝産物の皮膚（例えば、局所投与による）、肺（例えば、関節内注射による）、または肝臓（例えば、経口）への投与により、５α還元糖質コルチコイド代謝を所望の組織にターゲティングしながら、糖質コルチコイドの全身副作用が制限される。このような糖質コルチコイドに媒介される副作用には、ＨＰＡ軸の抑制、骨減少症、骨粗鬆症、免疫無防備状態、気分障害、不眠症、ならびに代謝副作用（高血糖症、高脂血症、肥満）および心血管副作用（高血圧、体液鬱滞）が含まれる。
３α−ＨＳＤ（５α還元代謝産物代謝に関与する酵素）(Jin & Penning,2001)の組織特異的分布を使用して、５α還元代謝産物の機能活性の組織特異的調整を行うこともできる。したがって、上に詳述するように、組織特異的様式で５α−テトラヒドロ代謝産物を活性化し、それにより糖質コルチコイド処置に関連する副作用を最小にすることができる。
特に、５α還元糖質コルチコイド機能活性の局所的調整が必要な場合、本発明の５α代謝産物が使用される。特に、炎症性病態の予防または治療において５α還元代謝産物機能活性の局所的増加を使用し、炎症の親糖質コルチコイド治療と比較して副作用を減少させることができる。さらに、５α還元代謝産物の機能活性の局所的減少は、肥満症、インスリン抵抗性、多嚢胞性卵巣症候群、真性糖尿病、皮膚障害（多毛症、座瘡）、認識障害、および糖質コルチコイド関連気分障害の治療で有効であり、親糖質コルチコイドを使用したこれらの病態の治療と比較して副作用が減少する。
５α還元代謝産物を通常発現しない部位に移入することができることも本発明で意図される（異所性投与）。例えば、このような移入／投与は、局所的炎症および／または血管新生抑制効果を示し得る。例えば、遺伝子治療またはリポソームのマクロファージへの送達を使用して、５α還元代謝産物のこのような送達を行うことができる。当業者は、本明細書中に記載の本発明による還元代謝産物の異所性投与のための他の適切な方法を承知している。
当業者は、５α還元代謝産物の組織特異的調整能力および／または局所的調整能力により複数の調整ストラテジー（例えば、ある組織での増加および他の組織での減少）を操作することが可能であると認識する。これは特に複数または複雑な障害で有用である。
［本発明の５α還元代謝産物を使用した血管形成の阻害方法］
さらなる態様では、本発明は、細胞集団内で本発明の１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整するステップを含む、細胞集団内で血管形成を調整する方法を提供する。
なおさらなる態様では、本発明は、細胞集団内で血管形成を調整する薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のモジュレーターの使用を提供する。
本明細書中で使用される、用語「血管形成」は、周辺細胞からの血管の形成をいう。例えば、組織修復時および／または腫瘍の侵襲性成長時にこれが起こり得る。本発明の上記態様によれば、用語「血管形成の調整」は、適切なコントロール中で産生された血管数と比較した血管形成プロセス時に作製された血管数の増減をいう。本明細書中で定義の用語「血管形成の調整」には、その範囲内に、本明細書中に記載の血管形成調整薬または手順の存在下での血管形成パターンの任意の変化も含まれる。有利には、本発明の上記態様の「血管形成の調整」は、血管形成の阻害である。最も有利には、本明細書中に記載のように、血管形成の調整を、調整薬の使用によって達成する。
本明細書中で定義の１つまたは複数の５α還元代謝産物の本明細書中で定義の機能活性のモジュレーターは、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を活性化するか、機能活性を阻害することができる。本発明の上記態様の好ましい実施形態では、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のモジュレーターは１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のアクチベーターであり、本明細書中で定義の血管形成の調整は血管形成の阻害を含む。
本発明によれば、本発明の１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーターを使用した血管形成の調整をインビボまたはインビトロで行うことができる。本発明の上記態様の好ましい実施形態では、インビボで調整する。
いくつかの研究により、糖質コルチコイドは血管形成の調整で役割を果たすことが示唆された；Folkman et al(1983).Science,Aug 19;221(4612);719-25;J Ingber DE,Annals of Surgery(1987);2-6(3);374-383;Jung SP et al(2001);4(3);175-86。さらなる研究により、糖質コルチコイドを使用して血管腫を治療することができることが示された（Hasan et al.(2000).Pediatrics,Jan;105(lPt 1);117-20。他の研究により、管腔損傷後の血管再狭窄（脈管の脈管における血管形成によって増幅することが提案されているプロセス）の阻害で糖質コルチコイドを使用することができるという証拠が得られている(Immunosuppressive therapy for the prevention of restenosis after coronory artery stent implantation;Versaci,F et al(2002),Study.J.Am Coll.Cardiol.Dec 4;40(11);1935-42)。さらに、本発明者らは、最近、ＲＵ３８４８６での１１ＨＳＤ１のアンタゴニストの拮抗または糖質コルチコイド受容体の拮抗によって防止される血管新生抑制効果を発揮するために、１１−デヒドロコルチコステロンについて酵素１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（１１ＨＳＤ１）による血管壁内の１１デヒドロ−コルチコステロンからのコルチコステロンの再生が必要であることを示した。
本発明者らは、本発明の５α還元代謝産物は糖質コルチコイド受容体の活性化における内因性糖質コルチコイド（１１ＨＳＤ１によって再生されるものが含まれる）の作用を模倣すると考える。したがって本発明者らは、上記適用において、本発明の５α還元代謝産物を糖質コルチコイドの使用と置き換えることができると考える。
したがって、本発明者らは、本発明の１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整する５α還元代謝産物および／または薬剤を使用した血管形成の調整は、創傷治癒、損傷後の血管再狭窄、癌および腫瘍の成長、虚血もしくは梗塞後の副行循環、脳卒中、糖尿病性網膜症、血管腫、濾胞性卵巣破裂、および月経過多を伴うか伴わない子宮内膜増殖症からなる群から選択される任意の病態が含まれる多種多様な病態の予防および／または治療で使用されると考える。当業者は、このリストは網羅的であることを意図しないことを認識する。
当業者は、５α還元代謝産物および／または薬剤の投与方法および／またはその機能活性を調整する手順および本明細書中に記載の治療ストラテジーが本明細書中に記載の５α還元代謝産物の他の治療での役割に関して血管形成の調整に等しく適用されることを認識する。
本発明者らは、細胞集団内で血管形成の阻害が必要であり、この細胞集団内で１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性が阻害されることが有利であると考える。より有利には、これらの方法は、１つまたは複数の以下のステップを含む。細胞集団を含む１つまたは複数の血管内または血管付近の１つまたは複数の５α還元代謝産物のレベルを増大させるステップ、細胞集団を含む１つまたは複数の血管内または血管付近の５α還元代謝産物に変換することができる基質のレベルを増大させるステップ、および細胞集団を含む１つまたは複数の血管内または血管付近の５α還元代謝産物の機能活性を増加させる１つまたは複数の酵素の機能活性を増大させるステップ（特に、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび／または５α−レダクターゼタンパク質レベルの活性化または増加）。
本明細書で定義の５α還元代謝産物の機能活性を調整する薬剤および／または５α還元代謝産物の血管内または血管付近の部位への適切な投与方法は、当業者に周知である。特に、このような分子の有利な投与方法には、任意の１つまたは複数の以下が含まれる。管腔内または管腔外経路を介した血管への局所投与。特に、このような管腔内局所投与は、塞栓または注入および／またはステントへの組み込みを含む。有利には、このような管腔外局所投与は、ゲルカラーまたは他の局所調製物を含む。
本発明を例示目的で以下の実施例にさらに記載する。
［糖質コルチコイド受容体への糖質コルチコイド代謝産物の結合］
データは、５α−テトラヒドロコルチコステロン（５αＴＨＢ）が、肝細胞中で糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）に対してコルチコステロン（Ｂ）と等価の結合親和性を有し（ｐ＞０．０５）、５α−ジヒドロコルチコステロン（５αＤＨＢ）および５β還元代謝産物の結合親和性はより低い（ｐ＜０．０５）ことを示す。肝細胞を、3Ｈ−デキサメタゾンおよび０．６３２ｎＭ〜２００μＭの濃度範囲の漸増濃度のデキサメタゾンの存在下にて２４℃で１時間インキュベートした。細胞を回収し、β−シンチレーションカウンティングによって結合放射能を決定した。*＝Ｂに対してｐ＜０．００１。結果を図１に示す。
［５α還元糖質コルチコイド代謝産物による遺伝子転写の糖質コルチコイド受容体活性化を示すためのトランスフェクション実験］
有効性の比較。ＧＲＥおよびＭＭＴＶプロモーターの調節下でＧＲおよびルシフェラーゼでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞のＧＲ活性化の結果としてのルシフェラーゼ活性の誘導倍率（ｎ＝３）。全ステロイドは１μＭである。Ｄｅｘ＝デキサメタゾン、Ｂ＝コルチコステロン、αＤＨＢ＝５α−ジヒドロコルチコステロン、αＴＨＢ＝５α−テトラヒドロコルチコステロン、βＤＨＢ＝５β−ジヒドロコルチコステロン、βＴＨＢ＝５β−テトラヒドロコルチコステロン。コルチコステロンと比較して、*はｐ＜０．０５を示し、***はｐ＜０．００１を示す。コルチコステロンの５α還元代謝産物は、コルチコステロン（Ｂ）と類似の有効性で糖質コルチコイド受容体を活性化する。５α−テトラヒドロコルチコステロンは、５α−ジヒドロコルチコステロンよりも強力である。５β還元代謝産物は効果がない。結果を図２に示す。
用量応答。ＧＲＥおよびＭＭＴＶプロモーターの調節下でＧＲおよびルシフェラーゼでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞のＧＲ活性化の結果としてのルシフェラーゼ活性の誘導倍率（ｎ＝３）。両ステロイドは、糖質コルチコイド受容体依存性応答を活性化する。反復測定ＡＮＯＶＡによる統計分析は、２つのステロイドのＧＲを活性化する効率で有意差（ｐ＜０．０５）が認められ、５α−テトラヒドロコルチコステロン（５α−ＴＨＢ）はコルチコステロン（Ｂ）よりも効果が低い。結果を図３に示す。
［糖質コルチコイド受容体の存在に対する５α還元糖質コルチコイド代謝産物による糖質コルチコイド受容体活性化の依存性］
結果を図４に示す。
図４は、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）の糖質コルチコイド活性化に応答したルシフェラーゼ誘導を示す。コルチコステロン（Ｂ）および５α−テトラヒドロコルチコステロン（５αＴＨＢ）または賦形剤（ＬＴＲ）を、ＭＭＴＶ糖質コルチコイド応答プロモーター（灰色のバー）の調節下でＧＲおよびルシフェラーゼを発現するプラスミドでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞およびルシフェラーゼを含むがＧＲを含まないトランスフェクト細胞（白抜きのバー）の培地（最終ステロイド濃度は１μｍｏｌ／ｌ）に添加した。両ステロイドによりＧＲが活性化され、これらの応答は、トランスフェクトした受容体の非存在下で停止した。
［糖質コルチコイド受容体に対する５α−テトラヒドロコルチコステロンの部分的アゴニスト活性よりもむしろ全アゴニスト活性］
結果を図５に示す。
Ｈｅｌａ細胞を、糖質コルチコイド感受性受容体として糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）およびＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ（ＬＴＲ）でトランスフェクトした。コルチコステロン（Ｂ）を用いるか用いない５α−テトラヒドロコルチコステロン（５α−ＴＨＢ）の添加に応答したルシフェラーゼの誘導を測定した。データ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）は、各ステロイドに対する応答、予想されるさらなる応答（Ｓｕｍ）、および観察された応答（Ａｃｔｕａｌ）を示す。観察と予想の間に相違がない場合、５α−ＴＨＢがＧＲの部分的アゴニストよりもむしろ全アゴニストであることを示す。
［ヒト糖質コルチコイドの５α還元代謝産物であるコルチゾールもまた糖質コルチコイド受容体を活性化する］
結果を図６に示す。
Ｈｅｌａ細胞を、糖質コルチコイド感受性受容体として糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）およびＭＭＴＶ−ルシフェラーゼ（ＬＴＲ）でトランスフェクトした。１μｍｏｌ／ｌの濃度のコルチコステロン（Ｂ）、コルチゾール（Ｆ）、５α−ジヒドロコルチゾール（ＤＨＦ５ａ）、および５α−テトラヒドロコルチゾール（ＴＨＦ５ａ）の添加に応答したルシフェラーゼの誘導を測定した。これら全てのステロイドによって有意なＧＲ活性化が誘導された。
［５α還元糖質コルチコイド代謝産物は内因性糖質コルチコイド受容体を発現する細胞中の糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）アゴニストである］
結果を図７に示す。
コルチコステロン（Ｂ、１μｏｌ／ｌ）または５α−テトラヒドロコルチコステロン（５α−ＴＨＢ、１μｍｏｌ／ｌ）、または賦形剤の存在下でインキュベートしたＨ４ｉｉＥ細胞におけるノーザンブロットによって糖質コルチコイド応答性酵素チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）ｍＲＮＡの誘導を測定した。両ステロイドによってＴＡＴ ｍＲＮＡ転写が誘導され（Ｕ１によって補正したノーザンブロットによって決定）、糖質コルチコイド受容体アンタゴニストＲＵ４８６（白抜きのバーのみで示す）によってこれが遮断された。
［５α−テトラヒドロコルチコステロンはインビボでの糖質コルチコイド受容体アゴニストである］
結果を図８に示す。
約９週齢の雄lean Zuckerラットの副腎を摘出した。３週間後、賦形剤、コルチコステロン（Ｂ、５ｍｇ／ｋｇ体重）、または５α−テトラヒドロコルチコステロン（ＴＨＢ５ａ、５ｍｇ／ｋｇ体重）のいずれかの腹腔内注射前または３時間後の尾の切り込みによってサンプルを得た。注射２時間後の賦形剤との比較により、免疫アッセイで測定したところ、コルチコステロンおよび５α−テトラヒドロコルチコステロンの両方でＡＣＴＨレベルが有意に抑制された。これは、視床下部−下垂体−副腎軸（主に、下垂体、視床下部、および海馬）のフィードバック抑制を担う部位での糖質コルチコイド受容体の活性化と一致する。
［５α還元代謝産物は血管組織中の血管形成を阻害する］
結果を図９に示す。詳細には、図９は、５α−テトラヒドロコルチコステロンがインタクトな単離組織調製物における糖質コルチコイド受容体アゴニストであることを示す。
このバイオアッセイでは、マトリゲル中に包埋したマウス大動脈環中の新規の血管形成数を７日間にわたり測定する。ここに示すように、コルチコステロン（Ｂ、６００ｎｍｏｌ／ｌ）は、賦形剤（ｖｅｈ）と比較して血管形成を阻害し、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）アンタゴニストＲＵ４８６によってこれが遮断される。５α−テトラヒドロコルチコステロン（５α−ＴＨＢ、１０００ｎｍｏｌ／ｌ）もまた血管形成を防止し、これもＲＵ４８６によって遮断される。ＲＵ４８６単独では効果は無かった。
上記明細書に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として組み込まれる。本発明の記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に自明である。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載しているが、特許請求の範囲に記載の発明はこのような特定の実施形態に過度に制限されないと理解すべきである。実際、生化学、分子生物学、および生物工学または関連分野の当業者に明らかな記載の発明実施の形態の種々の修正形態が、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
［参考文献］
Figure 2005533785
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糖質コルチコイド受容体への糖質コルチコイド代謝産物の結合を示す図である。 ５α還元糖質コルチコイド代謝産物による遺伝子転写の糖質コルチコイド受容体活性化を証明するためのトランスフェクション実験を示す図である。 有効性の比較。ＧＲＥおよびＭＭＴＶプロモーターの調節下でＧＲおよびルシフェラーゼでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞のＧＲ活性化の結果としてのルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す図である（ｎ＝３）。全ステロイドは１μＭである。Ｄｅｘ＝デキサメタゾン、Ｂ＝コルチコステロン、αＤＨＢ＝５α−ジヒドロコルチコステロン、αＴＨＢ＝５α−テトラヒドロコルチコステロン、βＤＨＢ＝５β−ジヒドロコルチコステロン、βＴＨＢ＝５β−テトラヒドロコルチコステロン。コルチコステロンと比較して、*はｐ＜０．０５を示し、***はｐ＜０．００１を示す。コルチコステロンの５α還元代謝産物は、コルチコステロンと類似の有効性で糖質コルチコイド受容体を活性化する。５α−テトラヒドロコルチコステロンは、５α−ジヒドロコルチコステロンよりも強力である。５β還元代謝産物は効果がない。 ５α還元糖質コルチコイド代謝産物による遺伝子転写の糖質コルチコイド受容体活性化を証明するためのトランスフェクション実験を示す図である。 用量応答。ＧＲＥおよびＭＭＴＶプロモーターの調節下でＧＲおよびルシフェラーゼでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞のＧＲ活性化の結果としてのルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す図である（ｎ＝３）。両ステロイドは、糖質コルチコイド受容体依存性応答を活性化する。反復測定ＡＮＯＶＡによる統計分析は、２つのステロイドのＧＲを活性化する効率で有意差（ｐ＜０．０５）が認められ、５α−テトラヒドロコルチコステロン（５α−ＴＨＢ）はコルチコステロン（Ｂ）よりも効果が低い。 ５α還元糖質コルチコイド代謝産物による受容体遺伝子誘導の糖質コルチコイド受容体の存在に対する依存性を示す図である。 ５α−テトラヒドロコルチコステロンの部分的アゴニストよりもむしろ全アゴニストの糖質コルチコイド受容体に対する活性を示す図である。 ヒト糖質コルチコイドの５α還元代謝産物であるコルチゾールもまた糖質コルチコイド受容体を活性化することを示す図である。 ５α還元糖質コルチコイド代謝産物が内因性糖質コルチコイド受容体を発現する細胞中の糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）アゴニストであることを示す図である。 ５α−テトラヒドロコルチコステロンがインビボでの糖質コルチコイド受容体アゴニストであることを示す図である。 ５α還元代謝産物が血管形成のインヒビターであることを示す図である。詳細には、５α−テトラヒドロコルチコステロンがインタクトな単離組織調製物における糖質コルチコイド受容体アゴニストであることを示す。

Claims (29)

  1. １つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化を調整する方法であって、１つまたは複数の受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整するステップを含む方法。
  2. １つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の機能活性を調整する方法であって、１つまたは複数の受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整するステップを含む方法。
  3. 前記１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を、フィナステリド、Ｇ１１０８７４５、インドメタシン、およびＬＹ１９１７０４からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を使用して調整する、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 患者の１つまたは複数の組織において糖質コルチコイドに媒介される１つまたは複数の効果を阻害する方法であって、前記効果が、肝臓（糖質コルチコイド依存性の、肝臓における糖新生の促進、肝臓におけるインスリン抵抗性、肝臓内脂肪蓄積、肝臓における非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、および高脂血症）、脂肪（糖質コルチコイド依存性の、脂肪蓄積の増加、インスリン抵抗性、およびグルコース取り込みの阻害）、脳（糖質コルチコイド関連の、認知機能低下および気分障害）、および皮膚（糖質コルチコイド誘導性の、皮膚薄化、挫傷、多毛症、および座瘡の防止）におけるものからなる群から選択され、１つまたは複数の受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を阻害するステップを含む方法。
  5. 前記効果または病態が、肥満症、インスリン抵抗性、多嚢胞性卵巣症候群、真性糖尿病、皮膚障害（多毛症、座瘡）、認識障害、および糖質コルチコイド関連気分障害からなる群から選択される１つまたは複数の効果または病態である、請求項４に記載の糖質コルチコイドに媒介される１つまたは複数の効果または病態を阻害する方法。
  6. 前記１つまたは複数の受容体に結合することができる１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を、フィナステリド、ＧＩ１９８７４５、インドメタシン、およびＬＹ１９１７０４からなる群から選択される薬剤を使用して阻害する、請求項４または請求項５に記載の糖質コルチコイドに媒介される１つまたは複数の効果または病態を阻害する方法。
  7. 患者の１つまたは複数の炎症病態を治療する方法であって、患者の１つまたは複数の炎症部位において１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を増大させるステップを含む方法。
  8. 前記１つまたは複数の５α還元糖質コルチコイド代謝産物の機能活性を、治療を必要とする患者に治療有効量の１つまたは複数の５α還元代謝産物を投与するステップ、５αレダクターゼ活性を増大させるステップ、コルチゾールの不活化経路を還元するステップ、５α還元代謝産物の抱合体を還元するステップ、および５α−ジヒドロ還元代謝産物化合物を５α−テトラヒドロ還元代謝産物化合物に変換するステップからなる群から選択される任意の手順によって増大させる、請求項７に記載の方法。
  9. 前記１つまたは複数の５α還元糖質コルチコイド代謝産物の機能活性を、治療を必要とする患者への治療有効量の１つまたは複数の５α還元代謝産物の投与するステップによって増加させる、請求項８に記載の方法。
  10. 少なくとも１つの５α還元代謝産物が、５α−ジヒドロコルチゾール、５α−テトラヒドロコルチゾール、５α−ジヒドロコルチコステロン、および５α−テトラヒドロコルチコステロンからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  11. 少なくとも１つの５α還元代謝産物が５α−テトラヒドロコルチコステロンである、請求項１０に記載の方法。
  12. １つまたは複数の５α還元代謝産物と、生理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物。
  13. １つまたは複数の５α還元代謝産物が、５α−ジヒドロコルチゾール、５α−テトラヒドロコルチゾール、５α−ジヒドロコルチコステロン、および５α−テトラヒドロコルチコステロンからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
  14. １つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の活性化を調整するため薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のモジュレーターの使用。
  15. １つまたは複数の糖質コルチコイド受容体の機能活性を調整するため薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のモジュレーターの使用。
  16. 少なくとも１つのモジュレーターが、フィナステリド、ＧＩ１０８７４５、インドメタシン、およびＬＹ１９１７０４からなる群から選択される、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
  17. 肝臓（肝臓における糖新生、肝臓におけるインスリン抵抗性、肝臓内脂肪蓄積、肝臓における非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、および高脂血症）、脂肪（糖質コルチコイド依存性の、脂肪蓄積の増加、インスリン抵抗性、およびグルコース取り込みの阻害）、脳（糖質コルチコイド関連の、認知機能低下および気分障害）、および皮膚（糖質コルチコイド誘導性の、皮膚薄化、挫傷、多毛症、および座瘡の防止）におけるものの糖質コルチコイド依存性促進からなる群から選択される病態の予防または治療のための薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のインヒビターの使用。
  18. 少なくとも１つのインヒビターが、フィナステリド、ＧＩ１９８７４５、ＬＹ１９１７０４、Ｇ１１０８７４５、およびインドメタシンからなる群から選択される薬剤である、請求項１７に記載の使用。
  19. 患者の１つまたは複数の炎症病態の予防または治療のための薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のアクチベーターの使用。
  20. ５α還元代謝産物の機能活性の少なくとも１つのアクチベーターが、５α還元糖質コルチコイド代謝産物である、請求項１９に記載の使用。
  21. １つまたは複数の５α還元代謝産物が、５α−ジヒドロコルチゾール、５α−テトラヒドロコルチゾール、５α−ジヒドロコルチコステロン、および５α−テトラヒドロコルチコステロンからなる群から選択される、請求項１９または請求項２０のいずれか１項に記載の使用。
  22. 少なくとも１つの５α還元代謝産物が５α−テトラヒドロコルチコステロンである、請求項２１に記載の方法。
  23. 細胞集団内での血管形成を調整する方法であって、該細胞集団内で請求項２１に記載の１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性を調整するステップを含む方法。
  24. 細胞集団内で血管形成を調整する薬物の調製における、１つまたは複数の５α還元代謝産物の機能活性の１つまたは複数のモジュレーターの使用。
  25. 前記１つまたは複数の５α還元代謝産物が請求項２１に記載の任意の１つまたは複数の代謝産物を含む、請求項２４に記載の使用。
  26. 前記５α還元代謝産物の機能活性のモジュレーターが、前記代謝産物の機能活性のアクチベーターである、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法または使用。
  27. 前記代謝産物の機能活性を、前記細胞集団を含む１つまたは複数の血管の中または付近において１つまたは複数の５α還元代謝産物のレベルを増大させるステップ、前記細胞集団を含む１つまたは複数の血管の中または付近において５α還元代謝産物に変換することができる基質のレベルを増大させるステップ、ならびに、前記細胞集団を含む１つまたは複数の血管の中または付近において３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび／または５αレダクターゼタンパク質を活性化またはこれらのレベルを増大させるステップの１つまたは複数のステップによって活性化する、請求項２６に記載の方法または使用。
  28. 血管形成が阻害される、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法または使用。
  29. 前記細胞集団内の血管形成の阻害がインビボで起こる、請求項２８に記載の方法または使用。
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