JP2005530491A - ＮＦ−κＢ誘導酵素の誘導体、その製法および使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、サイトカインにより制御されるシグナル活性を調節するための、ＮＩＫおよびその関連分子の使用、ならびにそのような新規の分子に関する。

Description

本発明は、サイトカインにより制御されるシグナル活性を調節するための、ＮＩＫおよびその関連分子の使用、ならびにそのような新規の分子に関する。

核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）は、免疫応答、細胞増殖および生存性の制御に関与する真核生物の誘導型転写因子複合体のファミリーである（Ghoshら、1998）。ＮＦ−κＢ因子は、通常、ＩκＢαやその関連タンパク質など、ＩκＢと名づけられた、アンキリンに富む細胞質インヒビターのファミリーとの物理的結合により細胞質区画に隔離されている（Baldwinら、1996）。ＩκＢは、サイトカイン、マイトジェンおよび特定のウイルス遺伝子産物など多様な刺激に応答して、速やかにセリン３２および３６がリン酸化され、ユビキチン化された後、２６Ｓプロテアソームによって分解されるが、それによって、遊離したＮＦ−κＢが核に移行して、標的遺伝子の転写促進に関与することが可能になる（Mercurioら、1999、Pahlら、1999）。最近の分子クロニーング研究において、ＩκＢのシグナル誘導によるリン酸化を仲介する多サブユニットのＩκＢキナーゼが確認された。ＩＫＫは、２種類の触媒性サブユニットであるＩＫＫαおよびＩＫＫβ、ならびに調節サブユニットのＩＫＫγから構成されている。ＩＫＫαおよびＩＫＫβの触媒活性はともに、炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子およびインターロイキン−１、Ｔ細胞レセプター、ならびにＴ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８など、多数の様々なＮＦ−κＢ誘導因子によって活性化させることができる（Karinら、2000）。

ＮＦ−κＢ誘導キナーゼであるＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）は、本出願人らが、1996年に、ＴＮＦレセプター結合アダプタータンパク質ＴＲＡＦ２に結合するタンパク質をスクリーニングしている際に発見した、マイトジェンによって活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）である（国際公開第97/37016号パンフレット）（Rotheら、1994、Takeuchiら、1996）。このタンパク質キナーゼを過剰発現させると、ＮＦ−κＢが顕著に活性化され、また、触媒としては不活性なＮＩＫ変異体を発現させると、さまざまな誘導因子（ＬＭＰ１、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＲＡＮＫ、ｈＴｏｌｌＲ、ＣＤ３／ＣＤ２８、インターロイキン−１Ｒ、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス−１ Ｔａｘ、ＬＰＳなど（Mlininら、1997、Syllaら、1998、Darnayら、1999、Linら、1999、Geleziunasら、1998））に応答してＮＦ−κＢが活性化されるのを効果的に阻害するということは、ＮＩＫが、ＮＦ−κＢの活性化シグナル伝達に関与していることを示唆するものである（Mlininら、1997）。

ＮＩＫ遺伝子を標的とする遺伝子破壊（Yinら、2001）、およびＮＩＫにミスセンス点変異（ｍＮＩＫの８５５番目のコドンがグリシンからアルギニンに）（Shinkauraら、1999）を有する天然のマウス系統の研究によって、リンパ器官の発生におけるＮＩＫの主要な役割が明らかになったため、このマウス変異系統は「リンパ形成不全（ａｌｙ）」マウスと呼ばれている。ａｌｙ／ａｌｙマウスおよびＮＩＫノックアウトマウスとも、全身においてリンパ節およびパイエル板が欠如しており、脾臓および胸腺の構造が無秩序で、また、低い血清Ｉｇ濃度および移植片拒絶を起こさないという点を最も弾力性に富む（resilient）特徴とする免疫不全症を示す（Shinkauraら、1999）。これらの異常は、明らかに、さまざまなレセプターによる異常なシグナル伝達を反映したものである。ＮＩＫ変異マウスの発育不全は、ＬＴβレセプター（ＬＴβＲ）が欠損したマウスに見られる発育不全と類似しており、ＮＩＫが、この特定のレセプターによるシグナル伝達に関与していることを示唆している。ａｌｙ／ａｌｙマウスにおけるＢ細胞増殖能障害は、これらの細胞のＬＰＳおよびＣＤ４０Ｌに対する応答不全と相関していることを示しているかもしれない（Garceauら、2000）。また、そのマウスの腹腔においてＢ１細胞が過剰量存在するのは、二次リンパ組織におけるケモカインレセプターのシグナル伝達が欠失する結果、消化管関連リンパ管組織系への腹膜細胞のホーミングに欠陥があるせいなのかもしれない（Fagarasanら、2000）。

これら、および恐らく他にもある免疫系の発達および機能の制御への寄与以外に、ＮＩＫは、さまざまな非免疫機能の制御にも関与していると思われる。ａｌｙ／ａｌｙマウス（ＮＩＫノックアウトではない）は、乳腺の発達不全を示す（Miyawaki、1994）。さらに、インビトロ研究では、ＮＩＫが、骨格筋細胞の分化をもたらすシグナル伝達（Canicioら、2001）ならびにニューロンの生存性および分化（Foherら、2000）に関係していることを示した。

ＮＦ−κＢ活性化のメディエーターとして示唆されたＮＩＫの役割に符合して、ａｌｙ／ａｌｙマウスおよびＮＩＫ−／−マウス由来の線維芽細胞は、ＬＴβＲの活性化に応答してＮＦ−κＢを活性化することができない。さらに、ＮＦ−κＢ活性化を介して起こる、ＬＴβＲによるＶＣＡＭ−１のアップレギュレーションが、ａｌｙ／ａｌｙマウスの胚線維芽細胞では正常でない（Matsumotoら、1999）。ＩκＢの不充分なリン酸化は、ａｌｙ／ａｌｙ Ｂ−リンパ球のＣＤ４０ライゲーションに対する応答においても注目されている。これに対し、これらのマウスの樹状細胞において、ＩκＢのＣＤ４０誘導リン酸化は正常だと考えられた（Garceauら、1998）。ａｌｙ／ａｌｙの腹膜細胞も、ケモカインＳＬＣにＮＦ−κＢ活性の上昇をもって応答することができない（Fagarasanら、2000）。しかしながら、これまでに調べられた細胞のいずれにおいても、ＮＩＫを変異させることによって、ＮＦ−κＢ活性化に対するＴＮＦまたはＩＬ−１の作用を取り除けるとは認められていない。

ａｌｙ／ａｌｙマウスのリンパ器官におけるＮＦ−κＢ分子種のパターンを評価したところ、Ｒｅｌタンパク質（Ａ＋ｐ５０）およびＩκＢから成るＮＦ−κＢ複合体の制御における役割以外に、ＮＩＫは、他のＮＦ−κＢ分子種の発現／活性化の調節にも関与していることが示された。最も注目すべきは、ａｌｙ／ａｌｙマウスのリンパ球には、不活性型前駆体であるｐ１００（ＮＦ−κＢ２）のタンパク質分解処理によって成熟したＢリンパ球内で特異的に形成されるＮＦ−κＢ分子種の１つであるｐ５２が欠乏していることであり、このことは、ｐ１００−ｐ５２変換に欠損があることを示唆している（Yamadaら、2000）。実際、ＮＩＫは、ｐ１００の部位特異的リン酸化に関与することが明らかになっている。双方、ＩＫＫαのリン酸化により直接的に終わり（Both directly end trough phosphorylation of IKKα）、今度は、ｐ１００をリン酸化する。このリン酸化は、ユビキチン化およびｐ１００を能動的にプロセッシングしてｐ５２を形成させるための分子トリガーとして作用する。このｐ１００のプロセッシング活性は、ａｌｙ変異によって除去できることがわかっている（Xiaoら、2001、Senftlebenら、2001）。

ＭＡＰ３Ｋｓに対するＮＩＫの構造的相同性に鑑みて、ＭＡＰ３Ｋｓが関与することが知られている他の３つの主なタンパク質キナーゼカスケード（ＭＡＰキナーゼカスケード：ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８カスケード）におけるＮＩＫの関与を解明しようとする試みがなされてきた（Akibaら、1998）。ある細胞においては、ＮＩＫはこれらのカスケードのいずれにも関与しないように見えるが、別の細胞（ＰＣ１２）においては、ＮＩＫはＥＲＫカスケードに関与すると考えられている（Fochrら、2000）。ある種の細胞において、ＮＩＫが、ＪＮＫカスケードの下流標的であるＪｕｎのリン酸化シグナル伝達に、この特定のカスケードとは別の方法で関与する可能性を示す証拠も提示されている（Akibaら、1998、Natoliら、1997）。これらの知見を総合すると、ＮＩＫは、実際にＮＦ−κＢ活性化のメディエーターとして作用するが、他の機能も担っている可能性があること、および、これらの機能を細胞特異的態様およびレセプター特異的態様で行なっていることが示されている。

他のＭＡＰ３Ｋ同様、ＮＩＫは、ＮＩＫ分子内の「活性化ループ」をリン酸化した結果として活性化され得る。実際、このループの中にあるリン酸化部位（Ｔｈｒ−５５９）を変異させると、ＮＩＫの過剰発現の際のＮＦ−κＢの活性化が抑制される（Linら、1999）。また、ＮＩＫの活性は、そのキナーゼモチーフの上流および下流にある領域が互いに結合できることによって制御されているようである。ＮＩＫのキナーゼ部分の下流にあるＣ末端領域は、ｐ１００（Xiaoら、2001）やＴＲＡＦ２（Malininら、1997）に対するのと同様、ＩＫＫαに直接結合できることが示されている（Regnierら、1997）。これらの相互作用は、明らかに、ＮＦ−κＢシグナル伝達におけるＮＩＫの機能に必要なものである。ＮＩＫのＮ末端領域は、基本モチーフ（ＢＲ）およびプロリンに富む反復モチーフ（ＰＲＲ）から成る負の制御ドメイン（ＮＲＤ）を含む（Xioaら、2000）。明らかに、Ｎ末端ＮＲＤは、ＮＩＫのＣ末端領域とシスに相互作用して、それによりＮＩＫがその基質（ＩＫＫαおよびｐ１００）に結合するのを阻害する。異所発現させたＮＩＫは、各ＮＩＫ分子におけるＮ末端領域とＣ末端領域とのこれらの結合が明らかに破壊されているオリゴマーを自発的に形成して、高レベルの構造的活性を示すように見える（Linら、1999）。ＮＩＫのＣ末端領域がＴＲＡＦ２（他のＴＲＡＦも同様）に結合すると、ＮＩＫの活性化プロセスに関与する可能性が最も高い。しかしながら、その関与の正確な態様は知られていない。

さらに、ＮＩＫ作用における下流の機序については、まだ予想以上に限られた情報しかない。ＮＩＫは、そのＣ末端領域のＩＫＫαへの結合を介してＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体を活性化することができるという証拠が提示されている。実際に、ＩＫＫαの活性化ループ内のセリン−１７６をリン酸化でき、それによって活性化されることが明らかになっている（Lingら、1998）。このような作用機序と整合するように、ａｌｙ／ａｌｙマウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）においてＬＴβＲによるＮＦ−κＢの活性化が不十分になることの機序の研究結果は、ＮＩＫの変異が、ＩＫＫシグナルソーム（signalsome）の活性化とその結果としてのＩκＢのリン酸化を除去することが示された（Matsushimaら、2001）。しかし、これらの知見は、ＮＩＫ−／−マウス由来のＭＥＦの解析によって裏付けられてはいない。ＮＩＫ欠失ＭＥＦはＬＴβへの応答によるＮＦ−κＢの活性化を明らかに示すことはできないが、ＩκＢのリン酸化と分解については、正常にそれに応答しているように見える（Yinら、2001）。これらの知見によれば、ＮＩＫは、ＬＴβＲによるＩＫＫ複合体の活性化に全く関与せず、むしろＮＦ−κＢ複合体が核に移行した後に、今のところ未知のメカニズムによって、その転写作用を調節することに関与している。また、ＮＩＫがｐ１００のリン酸化とプロセッシングを開始する方法についてはまだ不明な点もある。Ｃ末端領域を介してｐ１００に直接結合してそれをリン酸化するその能力は、ｐ１００が、ＮＩＫの直接の基質として作用することを示唆している（Xiaoら、2000）。それにもかかわらず、最近の研究では、ＮＩＫは、ＩＫＫαをリン酸化して活性化し、次にｐ１００をリン酸化するという間接的な方法でｐ１００のリン酸化をもたらすことが示唆されている（Senftlebenら、2001）。

ヤマモトおよびゲイナー（YamamotoおよびGaynor）が、ヒトの疾患の病因におけるＮＦ−κＢの役割を概説している（YamamotoおよびGaynor、2001）。ＮＦ−κＢ経路の活性化は、喘息、関節リウマチ（TakおよびFirestein、本パースペクティブシリーズ、参考文献のKarinら、2000参照）、および炎症性大腸疾患などの慢性炎症性疾患の病因に関係している。さらに、ＮＦ−κＢ制御の変化は、アテローム性動脈硬化症（CollinsおよびCybulsky、本シリーズ、参考文献のLeonardら、1995参照）およびアルツハイマー病（MattsonおよびCamandola、本シリーズ、参考文献のLinら、1999参照）など、炎症反応が少なくとも部分的に関与する他の疾患に関係する可能性がある。最後に、ＮＦ−κＢ経路の異常は、様々な人間の癌にもしばしば見られる。

いくつかの証拠が、サイトカイン遺伝子のＮＦ−κＢ活性化が、肺における炎症性細胞の浸潤と多くのサイトカインおよびケモカインの脱制御という特徴をもつ喘息の病因への重要な引き金であることを示唆している（Lingら、1998）。同様に、ＮＦ−κＢ経路の活性化も、関節リウマチの病因において役割を担っている可能性が高い。ＴＮＦ−αなど、ＮＦ−κＢを活性化するサイトカインが関節リウマチ患者の滑液中で増加し、これらの患者の関節には慢性の炎症性変化および滑膜の肥厚が見られる（Malininら、1997）。ＴＮＦ−α、またはＴＮＦ−αに結合するＴＮＦ−αレセプターの切断型に対する抗体を投与すると、関節リウマチ患者の症状を顕著に改善することができる。

また、リンパ球およびマクロファージの両方による前炎症性サイトカインの産生の増加も、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性大腸炎の病因に関与するとされている（Matsumotoら、1999）。活動性クローン病および潰瘍性大腸炎の患者から採取した粘膜の生検試料においてＮＦ−κＢ活性化が見られる。ステロイド剤による炎症性大腸炎患者の治療は、生検試料におけるＮＦ−κＢ活性を低下させ、臨床症状を和らげる。これらの結果は、ＮＦ−κＢ経路の刺激が、これらの疾患に伴う炎症反応の促進に関与し得ることを示唆している。

アテローム性動脈硬化症は、損傷を受けた血管壁の内皮および平滑筋に対する多数の傷害によって発症する（Matsushimaら、2001）。内皮細胞、平滑筋、マクロファージおよびリンパ球から放出される多数の成長因子、サイトカインおよびケモカインが、この慢性の炎症性および線維増殖性（fibroproliferative）プロセスに関係している（Matsushimaら、2001）。炎症反応および細胞増殖の調節に関与している遺伝子のＮＦ−κＢ制御が、アテローム性動脈硬化症の発症および進行において重要な役割を果たしている可能性が高い。

最後に、ＮＦ−κＢ経路の制御における異常は、アルツハイマー病の病因に関係している可能性がある。例えば、ＮＦ−κＢの免疫応答性は、主に、アルツハイマー病における早期の老人斑型の中および周辺に見られるが、成熟した老人斑型では、ＮＦ−κＢ活性の大幅な低下を示す（Mercurioら、1999）。このように、ＮＦ−κＢ活性化は、アルツハイマー病の初期段階の間、老人斑および神経細胞のアポトーシスの始動に関係し得る。これらのデータは、ＮＦ−κＢ経路の活性化が、その病因に関係付けられる炎症成分を有する多くの疾患に関与する可能性を示唆している。

宿主の免疫および炎症反応が増加するという特徴をもつ疾患の病因における役割に加えて、ＮＦ−κＢ経路の構成的活性化は、いくつかのヒトの癌の病因にも関係すると言われている。ＮＦ−κＢ経路の制御の異常が、白血病、リンパ腫および固形癌など、ヒトの様々な悪性腫瘍に頻繁に見られる（Miyawakiら、1994）。これらの異常は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌および大腸癌など、様々な腫瘍の核において構成的に高濃度のＮＦ−κＢをもたらす。これらの変化の大部分は、ＮＦ−κＢ経路の活性化を誘導するシグナル伝達経路を活性化する調節タンパク質が変化することによる可能性が高い。しかし、ＮＦ−κＢファミリーのメンバーをコードする遺伝子の増幅および再構成に加えて、ＩκＢタンパク質を不活性化する変異が、いくつかの腫瘍に見られるＮＦ−κＢの核レベルを高めることができる。

ＩＬ−２は、１３３個のアミノ酸からなるタンパク質（１５．４ｋＤａ）で、僅かに塩基性のｐＩをもち、他のいかなる因子に対しても配列相同性を示さない。マウスとヒトのＩＬ−２は約６５％の相同性を示す。ＩＬ−２は、１５３個のアミノ酸からなる前駆タンパク質として合成され、最初の２０個のアミノ末端側アミノ酸は疎水性分泌シグナル配列として機能する。このタンパク質は、生物学的活性に必須の一個のジスルフィド結合（Ｃｙｓ５８／１０５の位置）を含む。

マウスおよびヒトのＩＬ−２はともに、相同種のＴ細胞の増殖を高効率で引き起こす。ヒトＩＬ−２は、同じ濃度でマウスＴ細胞の増殖も促すのに対して、マウスＩＬ−２によるヒトＴ細胞の刺激は、低効率（６倍から１７０倍）である。自己免疫におけるＩＬ−２の関与には異論がある（O'sheaら、2002に概説されている）。ＩＬ−２投与が、免疫性甲状腺炎、関節リウマチおよびその他の関節症など、様々な自己免疫疾患に関連すると認められている。しかし、ＩＬ−２欠損マウスは、抗ＤＮＡ抗体など、多数の自己抗体を産生する。約半数が自己免疫性溶血性貧血で死亡し、生き残ったものは炎症性大腸炎を発症する。重要なのは、外因性ＩＬ−２の投与により病状が正されることである。このことは、末梢性免疫寛容の維持におけるＩＬ−２の役割を示唆している。

ＩＬ２は、Ｔリンパ球のすべての亜集団の成長因子である。ＩＬ２Ｒ−αレセプターサブユニットは、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）において発現される。単離されたばかりの白血病細胞もＩＬ２を分泌し、それに応答するため、ＩＬ２は、ＡＴＬを悪化させることができるこれらの細胞に対して自己分泌増殖調節因子として機能し得る。

また、ＩＬ２は、活性化Ｂ細胞の増殖も促進する。このような活性には、例えばＩＬ−４などの別の因子の存在が必要である。ＩＬ−２は、インビトロで希突起神経膠細胞の増殖も促す。

したがって、ＩＬ−２は、Ｔ細胞およびＢ細胞に対するその作用により、免疫応答における中心的な制御因子となっている。また、造血および腫瘍監視（surveillance）における抗炎症性反応にも関与している。ＩＬ２は、末梢白血球におけるＩＦＮ−γの合成を促進し、また、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの分泌を誘導する。

ＩＬ２の生物学的活性は膜レセプターによって仲介される。異なった形で別個に発現される３種類のＩＬ２レセプターに区別される。高親和性ＩＬ２レセプターが、細胞によって発現されるＩＬ２レセプター全体の約１０パーセントを構成する。このレセプターは、リガンド結合ドメインとして２種類のサブユニット、ＩＬ２Ｒ−αおよびＩＬ２Ｒ−β、ならびにシグナル伝達成分としてのγ鎖からなる膜レセプター複合体である。ＩＬ２Ｒ−βは、休止期のＴリンパ球上、ＮＫ細胞上、およびその他数多くの種類の細胞上で構造的に発現しているが、ＩＬ２Ｒ−αの発現は、通常、細胞が活性化した後にのみ見られる。しかし、ＩＬ２Ｒ−αは、数多くの腫瘍細胞およびＨＴＬＶ−１感染細胞によって構造的に合成されている。

単球のＩＬ２レセプター発現は、これらの細胞が腫瘍細胞障害性になるよう、ＩＦＮγによって誘導される。

このレセプターのマウスおよびヒトのγサブユニットは、ヌクレオチドおよびアミノ酸のレベルにおいて約７０パーセントの配列が一致している。このサブユニットは、高親和性ＩＬ２レセプターおよび中度親和性ＩＬ２レセプターの生成に必要であるが、それ自体がＩＬ２に結合するわけではない。これら２種類のレセプターは、それぞれ、α−β−γヘテロ三量体およびβ−γヘテロ二量体からなる。ＩＬ２レセプターのγサブユニットをコードする遺伝子は、ヒトの染色体Ｘｑ１３の約４．２ｋｂの範囲に位置していて、８個のエクソンを含んでいる。連鎖研究におけるマーカーとの関係によって、この遺伝子と、Ｘ染色体連鎖重症複合型免疫不全症遺伝子であるＳＣＩＤＸ１とが同じ位置にあることが示唆されている。さらに、親族関係にない３人のＸ染色体連鎖ＳＣＩＤ患者において、ＩＬ２Ｒ−γ遺伝子にそれぞれ異なった変異が見られた。

Ｘ染色体連鎖重症複合型免疫不全症（ＸＳＣＩＤ）は、ＩＬ２Ｒ−γ鎖の変異、すなわち、リンパ球の発生と機能に必須な多数のサイトカインレセプターの構成成分であるＩＬ−２Ｒγ鎖をコードする遺伝子の変異が原因で生じる稀ながら死に至る可能性のある疾患である（Noguchiら、1993）。今までのところ、ＸＳＣＩＤを引き起こすＩＬ２ＲＧの異なる変異が１００以上公表されている。最近の遺伝子ノックアウト実験で、リンパ球新生におけるｃγｃの極めて重要な役割が示されている（DiSantoら、1995）。

ＩＬ−２Ｒγ鎖は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１レセプター複合体のサブユニットであり、今では「共通γ鎖」（ｃγｃ）とも呼ばれている。

欧州特許出願0 578 932号明細書は、完全な共通γ鎖、特に、細胞外Ｎ−末端側ドメインに関係している。

自己免疫におけるＩＬ−２の関与に呼応して、該疾患を予防または軽減するためにＩＬ−２活性の調節因子の必要性が存在している。

本発明は、ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体（circularly permutated derivative）もしくは断片（好ましくは、配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片、およびＡｌｙＮＩＫ変異体）の使用、ならびに好ましくは配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片、およびＡｌｙＮＩＫ変異体に関する。

また、本発明は、ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、本発明に係るＮＩＫまたはそのアンチセンスをコードするＤＮＡ、ＮＩＫ特異的抗体、または、コンビナトリアル化学合成法の生成物をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られる低分子の使用に関する。

別の態様において、本発明は、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片（好ましくは配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片、およびＡｌｙＮＩＫ変異体）の使用を提供する。

さらに、本発明は、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療のため、ＩＬ−２ｃγｃによるシグナル伝達を阻害するための、本発明に係るＮＩＫまたはそのアンチセンスをコードするＤＮＡ、ＮＩＫ特異的抗体、または、コンビナトリアル化学合成法の生成物をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られる低分子の使用に関する。

また、本発明は、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン（特にＩＬ−２またはＩＬ−１５）のシグナル伝達が病因に関係している疾患の治療方法であって、治療上有効な量のＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片（好ましくは配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片、およびＡｌｙＮＩＫ変異体）を、必要とする対象に投与することを含む方法も提供する。

さらに、本発明は、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカインのシグナル伝達が病因に関係している疾患の治療方法であって、治療上有効な量の、本発明に係るＮＩＫまたはそのアンチセンスをコードするＤＮＡ、ＮＩＫ特異的抗体、または、コンビナトリアル化学合成法の生成物をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られる低分子を投与することを含む方法に関する。

さらに、本発明は、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片（好ましくは配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片、およびＡｌｙＮＩＫ変異体）を含む医薬組成物であって、ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための医薬組成物であって、サイトカイン刺激性ＩＬ−２ｃγｃシグナル伝達がその病因に関係している、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達がその病因に関係している、またはｃγｃとＮＩＫとの相互作用がその病因に関係している疾患における医薬組成物に関する。

また、本発明は、本発明に係るＮＩＫまたはそのアンチセンスをコードするＤＮＡ、ＮＩＫ特異的抗体、または、コンビナトリー化学合成法の生成物をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られる低分子を含む医薬組成物であって、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達がその病因に関係している疾患の治療のため、ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための医薬組成物であって、サイトカイン刺激性ＩＬ−２ｃγｃシグナル伝達が病因に関係しているかまたはｃγｃとＮＩＫとの相互作用がその病因に関係している疾患における医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用、および好ましくは、配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体との相互作用を調節するための、ＩＬ−２Ｒ共通γ鎖（ｃγｃ）結合ドメインを含むＮＩＫのポリペプチド断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片（好ましくは、配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片、およびＡｌｙＮＩＫ変異体）、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞、および本発明の細胞を培養し、産性されたポリペプチドを回収する本発明のＮＩＫポリペプチド断片の製造方法に関する。

さらに、本発明は、本発明のＮＩＫのポリペプチド断片を特異的に認識して結合する、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、完全ヒト化抗体、抗−抗−Ｉｄ抗体、細胞内発現抗体またはそれらの断片、およびコンビナトリー化学合成法によって製造された分子をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られるＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を阻害することができる低分子を提供する。

また、本発明は、ＮＩＫのポリペプチド断片（好ましくは、配列番号：１９、配列番号：１８に含まれる断片）、その断片またはアンチセンスＤＮＡをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含むベクター、本発明の抗体、またはコンビナトリー化学合成法によって製造された分子をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られるＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を阻害することができる低分子を含む医薬組成物に関する。

ある実施態様において、医薬組成物は、ＮＩＫとｃγｃとの相互作用が病因に関係している疾患の治療のために提供され、一方、別の実施態様では、医薬組成物は、そのレセプターに共通γ鎖を有するサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−１５など）の活性が病因に関係している疾患の治療のために提供される。

本発明はまた、そのレセプターに共通γ鎖を有するサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−１５など）の活性またはＮＩＫとｃγｃとの相互作用が病因に関係している疾患を治療するための医薬の製造における、本発明のＮＩＫのポリペプチド断片の使用を提供する。

別の実施態様において、本発明は、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性大腸炎、喘息、心筋梗塞、アルツハイマー病またはアテローム性動脈硬化症などの過剰な免疫応答が原因で生じる疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用を提供する。

別の実施態様において、本発明は、免疫性甲状腺炎、関節リウマチおよびその他の関節症、自己免疫性溶血性貧血ならびに炎症性大腸炎などの自己免疫疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用を提供する。

さらに、本発明は、そのレセプターに共通γ鎖を有するサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−１５など）の活性化がその病因に関係している疾患の治療および／または予防のための方法であって、治療上有効な量の、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫのポリペプチド断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を、必要とする対象に投与すること含む方法を提供する。

さらなる実施態様において、本発明は、癌、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性大腸炎、喘息、心筋梗塞、アルツハイマー病またはアテローム性動脈硬化症などのＮＦ−κＢ活性化が関係している疾患の治療および／または予防のための方法であって、治療上有効な量の、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含むポリペプチド断片を、それを必要とする宿主に投与すること含む方法を提供する。

さらに、本発明は、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性大腸炎、喘息、心筋梗塞、アルツハイマー病またはアテローム性動脈硬化症などの過剰な免疫応答によって生じる疾患を治療および／または予防する方法であって、治療上有効な量の、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）に相当するＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含むポリペプチドを、それを必要とする宿主に投与することを含む方法を提供する。

本発明は、ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用が関与する病理における該相互作用の調節に関する。

本発明は、ｃγｃとＮＩＫとが相互作用すること、およびこの相互作用がＮＩＫの活性に影響するという知見に基づく。

骨髄ｃＤＮＡライブラリーのツーハイブリッドスクリーニングにおいて、ＮＩＫのＣ末端側断片（６２４〜９４７）をベイトとして使用して、ｃγｃとＮＩＫとの相互作用を検出した。この相互作用は、ＮＩＫおよびｃγｃを発現する哺乳動物細胞の溶解物において実施された免疫共沈降実験、ならびにＮＩＫおよびｃγｃを自然に発現する細胞において実施された免疫共沈降実験により確認した。免疫共沈降実験によって、ｃγｃが、ＮＩＫのＣ末端側断片（６２４〜９４７番目の残基、配列番号：１９）または全長のＮＩＫのいずれかと効率的に共沈降することが明らかになった。

ｃγｃとＮＩＫとの相互作用は、ＮＩＫおよびｃγｃを過剰発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞中だけでなく、内因性のＮＩＫおよびｃγｃをもつ非末梢血単核細胞においても生じることが明らかになった。

ｃγｃおよびＮＩＫ両方の欠失変異体を多数作成して、両タンパク質の結合ドメインを決定した。これらの相互作用を酵母２ハイブリッド試験および／または免疫沈降実験によって試験した（下記実施例参照）。ＮＩＫへの結合に関与するｃγｃのドメインは、４４アミノ酸残基（２８２から３２５番目の残基）を含む、４４ＭＰＤ（配列番号：１７参照）と名づけられたｃγｃの膜近位ドメイン（ＭＰＤ）、および４１アミノ酸残基（３２９から３６９番目の残基）を含む、４１ＭＤＤ（配列番号：２および図１２参照）と名づけられたｃγｃの膜遠位ドメイン（ＭＤＤ）に発見されている。ｃγｃの末端にある１２アミノ酸（ｃγｃの３５８〜３６９番目の残基、図１５、配列番号：３、配列番号：４の塩基配列）をｃγｃの細胞内ドメイン（ｃγｃＩＣＤ）から欠失させると、ＮＩＫへの結合が５０％低下した。これは、これらの残基が結合において主な役割を果たしていることを示している。

また、ＮＩＫと相互作用する特定のアミノ酸を決定するため、４１ＭＤＤの中に位置する残基に変異誘発を行なった。シグナル伝達タンパク質におけるプロリンに富んだモチーフと、それらの同族の（cognate）ドメインとの相互作用については充分に記述されている（Kay BK, Williamson MP, Sudol M, FASEB J、2000年2月、14(2)：231-421）。ｃγｃの膜遠位４１アミノ酸の２０％のアミノ酸はプロリンである。したがって、ｃγｃの膜遠位４１アミノ酸の中にある２つの異なった部位、すなわち１−ＰＰ３３６，３３７ＡＡおよび２−ＰＰ３６０，３６１ＡＡで、２個連続したプロリンをアラニンに変異させて、ツーハイブリッドアッセイ法で、ＮＩＫの結合に対するその変異の効果を試験した。ｃγｃの変異誘導について得られた結果は、３６０および３６１番目の残基であるプロリンがＮＩＫへの結合にとって重要であることを示している。したがって、本発明に係るムテインは、３６０および３６１番目の残基はプロリンのまま保持している。

ｃγｃの結合に関与するＮＩＫのドメインは、ＮＩＫ６４０−７２０と名づけられていて、ＮＩＫのＣ末端から８１個のアミノ酸残基（６４０〜７２０番目の残基）を含む（配列番号：１８参照）。

ｃγｃとＮＩＫとの相互作用が機能的に重要であることが示された。レポーター遺伝子アッセイ法によって、ｃγｃは、ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化を調節することが明らかになった。実験条件下では、ＮＩＫを過剰発現させることによって、ＮＦ−κＢ活性化を誘導することが可能である。ＮＦ−κＢの活性化は、ＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードする構造物（construct）によってトランスフェクトされた細胞において測定することができる。このルシフェラーゼ系を用いて、ＮＩＫを単独、またはさまざまな濃度のｃγｃとともに過剰発現する細胞においてＮＦ−κＢの活性化を測定した（詳細については下記実施例参照）。ＮＦ−κＢの調節は、細胞内におけるＮＩＫ濃度対ｃγｃ濃度（ＮＩＫ／ｃγｃ）に依存することが分かった。例えば、ＮＩＫ／ｃγｃが１よりも大きい場合に、ＮＩＫが介するＮＦ−κＢ活性化の促進が観察され、ＮＩＫ／ｃγｃが約１以下の場合に、ＮＩＫが介するＮＦ−κＢ活性化の阻害が観察された。ＮＩＫのドミナントネガティブ変異体を用いて実施した実験で、ｃγｃのＮＦ−κＢ促進活性は、ＮＩＫを介して特異的に発揮されることが明らかになった。

ＮＩＫ結合ドメイン４１ＭＤＤを含むｃγｃ断片の一つを、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用への干渉、すなわちＮＩＫが介するＮＦ−κＢ活性化の調節について、ルシフェラーゼ系において試験した。この目的で、ルシフェラーゼ発現（またはＮＦ−κＢ活性化）を、ＮＩＫおよびｃγｃを１よりも大きな比率で過剰発現するトランスフェクトされた細胞において測定した。これらの条件下で、ｃγｃは、ＮＩＫによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化を促進する。ＮＩＫ結合領域を含む４１ＭＤＤの効果を、ＮＩＫおよびｃγｃを過剰発現する細胞中で測定した。４１ＭＤＤの過剰発現は、ＮＩＫが介するＮＦ−κＢ活性化を、おそらくｃγｃ−ＮＩＫ相互作用を阻害することによって阻害し得ることが分かった。

あるいは、ｃγｃ結合ドメインを含むＮＩＫのＣ末端（６２４〜９４７番目の残基）をｃγｃおよびＮＩＫとともに過剰発現させると、４１ＭＤＤと同じ効果を示した。

ＮＩＫの活性化には、厳格な構造的要件があると考えられる。ＮＩＫの変異体ＡｌｙＮＩＫ（ヒトでは８６０番目のコドンが、マウスでは８５５番目のコドンがグリシンからアルギニンになる）は、ｃγｃに結合することが分かったが、ＮＩＫが介するＮＦ−κＢ活性化を上昇させることはできなかった。このように、Ａｌｙ−ＮＩＫおよび野生型ＮＩＫの両方が、ｃγｃへの結合および過剰発現の際と同レベルのＮＦ−κＢ活性化を示したとしても、ｃγｃの共発現によって、Ａｌｙ−ＮＩＫによるＮＦ−κＢ活性化が促進されることはなかった。

これらの結果は、ＡｌｙＮＩＫまたはその断片を用いて、ＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を制御できることを示している。

連続的に膜遠位ドメインで欠失させたｃγｃ、１−３５７、１−３４１、１−３２５、１−３０３が、ルシフェラーゼ系において、ＮＩＫに介在されるＮＦ−κＢを調節することができるかを試験した。この目的で、ＮＩＫおよびｃγｃまたはｃγｃ欠失変異体を約１の比率で過剰発現するトランスフェクトされた細胞において、ルシフェラーゼ発現およびＮＦ−κＢの活性化を測定した。これらの条件下で、ｃγｃは、ＮＩＫによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害する。全長ｃγｃおよび断片１−３５７、１−３４１などは、ＮＩＫが介するＮＦ−κＢ活性化を阻害することができるが、一方、断片１−３２５および１−３０３などのＮＩＫ結合ドメインを欠失している変異体は、ＮＩＫが介するＮＦ−κＢ活性化の活性に何の影響も与えないことがわかった。１−３２５および１−３０３が効果を持たないことによって、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用の膜遠位ドメインの関与と、ＮＦ−κＢ調節におけるこの相互作用の役割が確認できる。

前述したように、ＮＩＫおよびｃγｃの相互作用はＮＦ−κＢ活性の調節をもたらす。ｃγｃによるＮＩＫ活性の調節をもたらすメカニズムと考えられるのは、ｃγｃ／ＮＩＫ相互作用に際してＮＩＫのリン酸化が促進されることかもしれない。インビトロでのキナーゼアッセイによって、ＮＩＫの自己リン酸化およびＩＫＫ１のリン酸化がｃγｃによって３倍促進されることが示された。したがって、インビトロでのキナーゼアッセイで得られた結果は、ｃγｃによるＮＩＫ活性の調節とは、ｃγｃ／ＮＩＫ相互作用に際してＮＩＫのリン酸化が促進されることかもしれないという仮説を裏付けるものである。

リンフォトキシンβ（ＬＴβ）レセプターをそのリガンドによって誘導するとＮＦ−κＢの活性化がもたらされる。文献において、ＬＴβレセプターをそのリガンドによって誘導するとＮＩＫが活性化されることが示唆されている。ＬＴβレセプターを誘発することによりＮＦ−κＢが活性化される場合、ｃγｃポリペプチドの細胞内ドメイン（ｃγｃＩＣＤ）またはその４１膜遠位ドメイン（４１ＭＤＤ）の過剰発現の効果を試験した。この活性化が内因性ＮＩＫによって仲介されると考えられる。ＩＣＤｃγｃ発現は、ＬＴβによるＮＦ−κＢの活性化を２．５倍促進し、一方、４１ＭＤＤの発現は、ＬＴβによるＮＦ−κＢの活性化を５０％阻害した。これらの結果は、リンフォトキシンによる刺激およびＮＦ−κＢの調節がｃγｃ−ＮＩＫ相互作用に関係していることを示唆している。これらの結果は、ｃγｃＩＣＤポリペプチドまたは４１ＭＤＤが、ＬＴβレセプターを介して開始されるシグナル伝達を調節することができることを示しており、また、ＩＣＤポリペプチド、またはその断片が、ペプチドに基づく薬剤設計の候補として役立つ可能性があるということを証明している。そのような薬物は、ＮＩＫの作用を調節することができるため、ＮＩＫの作用がその病因に関係する疾患を予防または軽減する上で有用である。ＮＩＫは、ＮＦ−κＢ活性化を誘導することが明らかになっている。従って、本発明に係るｃγｃ断片は、ＮＩＫの作用がその病因に関係する疾患を治療および／または予防するために使用される。

得られた結果から、ｃγｃを介するシグナル伝達は、ＮＩＫ、およびシグナルソームタンパク質の補充、およびその結果として、ＮＦ−κＢの調節に関与していることが明らかになった。したがって、ＮＩＫの断片（例えば、Ｃ−末端（６２４から９４７番目の残基）およびＮＩＫ６４０−７２０のｃγｃ結合ドメインを含む断片など）は、ｃγｃを介するシグナル伝達を調節するために使用できるかもしれない。

上記したように、末梢血の単核細胞において内因性ＮＩＫとｃγｃとの相互作用が明らかになった。単核細胞においては、ＮＩＫが構造的にｃγｃと結合しており、ＩＬ−２誘導の際、シグナルソーム成分であるＩＫＫ−１、ＩＫＫ−２、およびＩＫＫ−３が、ｃγｃを介してＩＬ−２レセプターに補充されることが分かった。ＩＬ−２レセプターの共通γ鎖が、ＩＫＫ−１結合領域以外のさまざまな位置でＮＩＫに結合することが分かった。同様の結果が、ＩＬ−１５で細胞を刺激した際にも得られた。

ＩＬ−２刺激によってｃγｃと共沈降するシグナルソームの成分は、キナーゼアッセイにおいて活性を示すことが明らかになった。すなわち、これらの結果は、生理学的な条件下では、内因性ｃγｃのＮＩＫへの結合が起こるため、この相互作用が、ＮＩＫ活性およびＮＩＫ依存型ＮＦ−κＢ活性化に関与することを示している。したがって、ｃγｃとＮＩＫとの相互作用を阻害すると、ＮＦ−κＢの活性化の阻害を生じる可能性がある。

得られた結果は、ＩＬ−２のシグナル伝達に、ＮＩＫおよびシグナルソーム成分とｃγｃとの相互作用が必要であることを示している。したがって、ｃγｃとＮＩＫとの相互作用を阻害すると、ＩＬ−２シグナルを阻害できる。よって、ＮＩＫのｃγｃ結合ドメインであるＮＩＫ６４０−７２０、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異体もしくは断片がＩＬ−２シグナル伝達を阻害するために使用できる。同様の結果が、ＩＬ−１５で末梢血単核細胞を刺激することによっても得られた。したがって、本発明のポリペプチドは、そのレセプターに共通γ鎖を有するサイトカインの活性化が病因に関係している任意の疾患、またはｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達がその病因に関係している任意の疾患を治療するために使用することができる。

あるいは、本発明のこれらのポリペプチドは、そのレセプターに共通γ鎖を有するサイトカインの活性化により疾患を治療または軽減することができるような任意の疾患を治療するために、サイトカインの活性を促進させる目的で使用し得る。

シグナル伝達にｃγｃを用いるサイトカインの例は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１である。

本発明は、ＮＩＫの使用に関し、またその断片に関し、またそれらの塩、機能的誘導体、前駆体、および活性画分、ならびにその活性型変異体、すなわち、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用および／またはＮＦ−κＢ活性化の調節および／またはｃγｃシグナル伝達などの同一の活性を有するポリペプチドまたはタンパク質を得るために、その構造中の１個以上のアミノ酸を欠失させるか、他のアミノ酸に置換するか、または、１個以上のアミノ酸をその配列に付加した他のタンパク質またはポリペプチドであって、対応する「融合タンパク質」、すなわち、別のタンパク質と融合された該ポリペプチドまたはその変異体を含むポリペプチドも含む他のタンパク質またはポリペプチドにも関する。したがって、該ポリペプチドは、例えばイムノグロブリンなど別のタンパク質に融合することができる。

本明細書において、用語「塩」は、カルボキシル基の塩と、本発明の該ポリペプチドまたはそのムテインのアミノ基の酸付加塩との両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当技術分野において周知の手段によって形成させることができ、無機塩（例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛の塩など）および有機塩基との塩（例えば、トリエタノールアミン、アルギニンもしくはリシンなどのアミン、ピペリジン、プロカインなどと形成される）などがあげられる。酸付加塩には、例えば、塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、および、例えば、酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩などがある。もちろん、このような塩は、本発明の該ポリペプチドまたはそのムテインなどと実質的に同様の活性、例えば、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用および／またはＮＦ−κＢ活性化の調節、および／またはｃγｃシグナル伝達ができるなどの活性をもっていなければならない。

本明細書において使用される「機能的誘導体」の定義は、アミノ酸部分の側鎖上または末端のＮ基もしくはＣ基上に存在する官能基から、周知の方法にしたがって調製することができる誘導体を意味し、薬学的に許容される場合、すなわち、それらがタンパク質の活性を損なわない場合、またはそれらを含む医薬組成物に毒性を付与しない場合には本発明に含まれる。このような誘導体には、例えば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体などがあり、例えばアルカノイル基またはアロイル基などのアシル基を用いて形成される。

本発明において、タンパク質の「断片」は、化合物それ自体のポリペプチドの任意の断片または前駆体単独、または関連分子もしくはそこに結合する残基（たとえば、糖残基もしくはリン酸塩）と組み合せた断片または前駆体、またはポリペプチド分子の集合体であって、このような断片または前駆体が、本発明の該ポリペプチドの活性と同一の活性、例えば、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用および／またはＮＦ−κＢ活性化の調節および／またはｃγｃシグナル伝達ができるなどの活性を示す場合を意味する。

本明細書において使用される用語「円順列変異」は、直鎖分子であって、その両末端を直接またはリンカーを介して結合させて環状分子を作出し、次に、この環状分子を別の位置で開環させて、元の分子の末端とは異なる末端をもつ新しい直鎖分子を作出する直鎖分子を意味する。円順列変異体には、環状化されたのち開環されている分子と同等の構造を持つ分子も含まれる。したがって、円順列変異分子を直鎖分子としてデノボ合成し、環状化と開環段階を経ないことも可能である。分子の具体的な円順列変異は、その間でペプチド結合が除去されているアミノ酸残基を括弧に記入して名前を付ける。円順列変異分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含むが、一本鎖分子で、正常には両末端であるところがしばしばリンカーと融合しており、別の位置が新しい末端となったものを含む。Goldenbergら、J. Mol. Biol., 165: 407-413(1983)、およびPanら、Gene 125: 111-114(1993)を参照。両文献とも参考文献として本明細書に組み入れられる。円順列変異は、直鎖分子を取って、その末端を融合させて環状分子を形成させ、次に、その環状分子を別の位置で切断して、別の末端をもつ新しい直鎖分子を形成させるのと機能的には同じことである。したがって、円順列変異は、さまざまな位置で新しい末端を作出しながらも、タンパク質のアミノ酸の配列と同一性を本質的に保存する作用を有する。

本発明の該「ポリペプチドおよび／またはタンパク質」という用語は互換的であり、ＮＩＫ、およびＣ−末端ドメインおよびＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫを意味する。

また、本発明は、本発明のポリペプチドのムテインに関し、ここで、ムテインは、例えば、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用および／またはＮＦ−κＢ活性化の調節および／またはｃγｃシグナル伝達ができるなどの、本発明の該タンパク質の天然の配列のみを本質的に有する本発明の該タンパク質と同一の生物活性を本質的に保持している。このような「ムテイン」は、ポリペプチドにおいて最高約２５％、好ましくは１２％未満のアミノ酸残基を欠失、付加、または別のアミノ酸残基と置換することができるが、このような改変が、タンパク質それ自体に関して、例えば、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用および／またはＮＦ−κＢ活性化の調節および／またはｃγｃシグナル伝達ができるなど、タンパク質ムテインの生物活性を実質的に変えないように改変されているムテインである。

これらのムテインは、周知の合成法および／または部位特異的変異誘発技術、または他の適当な周知技術によって製造される。

このようなムテインはいずれも、好ましくは基本的なＮＩＫ、および実質的に同様の活性をもつＣ−末端ドメイン（６２４から９４７番目の残基）、ＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片、およびＡｌｙＮＩＫの配列に充分重複するアミノ酸配列を有する。したがって、任意の所定のムテインが、本発明の基本的なタンパク質と実質的に同一の活性を有するか否かは、下記の実施例に記載した生物学的活性試験をそのムテインに対して行なうことを含む、通常の実験によって決定することができる。

本発明にしたがって使用することができるタンパク質のムテイン、またはそれをコードする核酸には、実質的にはＮＩＫ、およびＣ−末端ドメインおよびＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片、およびＡｌｙＮＩＫなどと一致する配列であって、ｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片の有限な組み合わせが、本明細書に提示されている指示および手引きに基づいて、過度な実験を行なうことなく、当業者によって日常的に取得することができる置換されたペプチドまたはポリヌクレオチドとして含まれる。タンパク質の化学と構造の詳細な説明については、Schulz G.E.ら、Principle of Protein Structure, Springer-Verlag、New York, 1978；およびCreighton T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983を参照。これらは参考文献として本明細書に組み入れられる。コドン選択性などのヌクレオチド配列置換の表示については、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995;Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989参照。

本発明によるムテインの好ましい変化には、「保存的」置換として知られるものがある。本発明の該タンパク質の本質的に天然の配列を有するタンパク質におけるそれらの保存的アミノ酸置換には、物理化学的性質が充分に似ているため、そのグループ内のメンバー同士の置換ではその分子の生物学的機能が保存されるグループ内での同義的アミノ酸が含まれる。Grantham, Science, Vol. 185, pp.862-864 (1974)参照。アミノ酸の挿入および欠失も、特に、その挿入または欠失が数個のアミノ酸、例えば、２５％未満、また好ましくは１２％未満のアミノ酸に関するだけで、例えば、システイン残基など、機能的なコンフォメーションにとって重要なアミノ酸を除去または置換するのでなければ、前記記載の配列において、その機能を変えることなく行なうことができることは明らかである（Anfinsen, Principles That Govern The Folding of Protein Chanins, Science, Vol. 181, pp.223-230(1973)）。このような欠失および／または挿入によって作出されたムテインは、本発明の範囲に含まれる。

好ましくは、同義のアミノ酸群は、表Ａに規定される群である。より好ましくは、同義のアミノ酸群は、表Ｂに規定される群である。そして、最も好ましくは、同義のアミノ酸群は、表Ｃに規定される群である。

本発明における使用のためのタンパク質のムテインを得るために使用され得るタンパク質のアミノ酸置換の製造例としては、Markらによる米国特許ＲＥ第33,653号明細書、米国特許第4,959,314号明細書、同第4,588,585号明細書および同第4,737,462号明細書；Kothsらによる同第5,116,943号明細書、Namenらによる同第4,965,195号明細書、Chongらによる同第4,879,111号明細書、Leeらによる同第5,017,691号明細書などに示されたような任意の周知の方法手順；ならびに米国特許第4,904,584号明細書（Shawら）に示されたリジン置換タンパク質を含む。

本発明の別の好適な実施態様において、本発明において使用するための該タンパク質のムテインはいずれも、本発明に係る前記タンパク質、例えば、ＮＩＫおよびＣ−末端ドメインおよびＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫタンパク質、またはその断片などのアミノ酸配列に本質的に一致するアミノ酸配列を有する。「本質的に一致する」という用語は、基本的なタンパク質の配列に、特に、本発明の該タンパク質に対する能力に関する限りにおいて、その基本的な性質に影響を与えない微少な変化を加えたムテインを包含しようする語である。「本質的に一致する」という語に含まれると一般的に考えられる変化の種類は、本発明の該タンパク質をコードするＤＮＡの従来からの変異誘発手法によって生じる変化であって、いくつかの小さな改変をもたらし、例えば、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用および／またはＮＦ−κＢ活性化の調節および／またはｃγｃシグナル伝達ができるなどという所望の活性に対してスクリーニングすることになる。

また、本発明は、本発明の該タンパク質の変異体も含む。好適な変異体は、本発明に係る該タンパク質と少なくとも８０％のアミノ酸が同一である変異体であり、より好適な変異体は、少なくとも９０％のアミノ酸が同一である変異体であり、もっとも好適な変異体は、少なくとも９５％のアミノ酸が同一である変異体である。

本明細書において使用される「配列同一性」という用語は、アミノ酸配列を、ClustalW多重配列整列プログラム（Thompsonら、1994）のウインドウズ用インターフェイスであるClustal-Xプログラムを用いて相同性が低い領域を改良したHanksおよびQuinn（1991）によるアラインメントによって比較することを意味する。Clustal-Xプログラムは、インターネット上のftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/clustalx/で利用可能である。当然ながら、このリンクが切れている場合には、当業者は、過度の試行を要することなく、標準的なインターネット検索技術を用いて別のリンク先でこのプログラムのいくつかのバージョンを発見することができることが理解されるべきである。特段の記載がない限り、本願の有効な出願日におけるものとして、本明細書において言及するプログラムは、最新のバージョンのものが、本発明を実施するために使用されるものである。

「配列同一性」を決定する別法は以下の通りである。配列を、ジェネティック コンピューティング グループ（Genetic Computing Group）のＧＤＡＰ（グローバルアラインメントプログラム）の第９版を用い、ギャップオープンペナルティーが−１２（ギャップの最初の空白に対して）でギャップ拡張ペナルティーが−４（ギャップ中に付加されている連続した空白１個について）のデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリクス（−４から＋１１までの値）を用いて整列させる。整列後、一致した数を、求める配列におけるアミノ酸数に対する割合で表わすことによって同一性の割合を算出する。

本発明に係るムテインには、ストリンジェントな条件下で本発明に係る該タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるもので、例えば、ＮＩＫ、ならびに、Ｃ−末端ドメインおよびＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体をコードする天然の配列のすべてを本質的に含んでいるものが含まれる。

本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖を、塩基対合によって相補鎖と結合させる処理を含むものである（Coombs J, 1994, Dictionary of Biotechnology, Stokton Press, New York, NY）。「増幅」は、核酸配列の追加のコピーを作出することと定義され、通常、当技術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて実施される（Dieffenbach and Dveksler, 1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。

「ストリンジェンシー」は、一般的に、約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度よりも５℃低い）からＴｍよりも約２０℃から２５℃低い温度の範囲に存在する。

「ストリンジェントな条件」という用語は、当業者が従来から「ストリンジェント」と言い習わしてきたハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄の条件を意味する。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995；Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989参照。

本明細書において、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション実験で使用する温度、一価のカチオンのモル濃度、およびハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合の関数である。ある所定の条件の組み合わせに関するストリンジェシーの程度を判定するには、まず、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度Ｔｍで表される、１００％同一のハイブリッドの安定性を決定するためのマインコス（Meinkoth）ら（1984）の下記方程式を使用する。

Ｔｍ＝８１.５Ｃ＋１６.６(LogM)＋０.４１(%GC)−０.６１(%form)−５００／Ｌ

式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のＧおよびＣヌクレオチドの割合、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合、そしてＬは塩基対でのハイブリッドの長さである。１００％同一なハイブリッドについて計算したＴｍからＴｍが１℃低下する毎に、許容されるミスマッチの量が約１％ずつ増加する。したがって、あるハイブリダイゼーション実験のために特定の塩濃度およびホルムアミド濃度で用いられるＴｍが、マインコスの方程式に従って１００％ハイブリッドに対して計算されるＴｍよりも１０度低いと、最高で約１０％のミスマッチがあってもハイブリダイゼーションは起きることになる。

本明細書において、「高度にストリンジェントな条件」とは、前記数式によって計算しても、実際に測定してみても、標的配列と完全な二重鎖を形成させるＴｍよりも１０度以内で低いＴｍを与える条件である。「中度にストリンジェントな条件」とは、前記数式によって計算しても、実際に測定してみても、標的配列と完全な二重鎖を形成させるＴｍよりも２０度以内で低いＴｍを与える条件である。制限はないが、高度にストリンジェントな条件（ハイブリッドの計算または測定Ｔｍよりも５〜１０℃低い）および中度にストリンジェントな条件（ハイブリッドの計算または測定Ｔｍよりも１５〜２０℃低い）の例は、２×ＳＳＣ（標準生理食塩水−クエン酸塩）および０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄溶液を、ハイブリッドの計算Ｔｍよりも低い適当な温度で使用する。条件の最終的なストリンジェンシーは、特に、用いたハイブリダイゼーション条件が、安定性の低いハイブリッドを安定したハイブリッドと一緒に形成できるような条件の場合には、一次的には洗浄条件によって決まる。洗浄条件のストリンジェンシーが高くなるほど、安定性の低いハイブリッドは取り除かれる。前記の高度から中度にストリンジェントな洗浄条件で用いることのできる一般的なハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ（標準生理食塩水−リン酸塩−ＥＤＴＡ））、５×デンハルト試薬（Denhardt's reagent）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡの溶液における、Ｔｍよりも約２０から２５℃低い温度でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合には、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用するのが好ましい（Ausubel, 1987, 1999）。

ＮＩＫ６４０−７２０の断片は、ペプチドに基づく薬剤設計の候補として役立つ可能性がある。これらの結合断片の構造に基づいて、ＮＩＫへのｃγｃの結合を妨害できる有機分子を設計することができる。そのような有機分子は、ＮＩＫの作用を調節することができ、炎症反応や、ＮＩＫとｃγｃとの相互作用が病因に関係している他の疾患の予防に役立つ薬剤として使用することができる。

「細胞内発現抗体」は、細胞中に形質導入されて、ＮＩＫとｃγｃとの相互作用などの望ましくない関連反応を阻害することができる特異的抗体であって、該抗体は、発現されると、望ましくない関連反応に関係する標的分子および／またはリガンドに細胞中で結合し、抗体を発現して、該抗体を該標的レセプターおよび／またはリガンドに結合させる。細胞内発現抗体の使用については、国際公開第99/14353号パンフレットに開示されている。

ＮＩＫの活性がその病因に関係している疾患において、ＮＩＫとｃγｃとの相互作用を阻害するために、ＮＩＫ６４０−７２０に対する抗体を製造し、細胞内に形質導入することができる。

ＮＦ−κＢの活性化は、細胞の核内への移行、および多数の前炎症性遺伝子の活性化を含む。

関節リウマチ（炎症の場合）、骨関節炎、喘息、心筋梗塞、アルツハイマー病、またはアテローム性動脈硬化症などの障害においては、ＮＦ−κＢが正常の範囲を超えて活性化される。ＮＦ−κＢの阻害は細胞増殖抑制療法を補強するために採用されているため、癌治療においても有益である。

真核生物または真核生物発現系において、本発明のポリペプチドを細胞内、周辺質（periplasmic）などで産生することができ、または、培地内に分泌させることも可能である。産生された４１ＭＤＤおよび４４ＭＰＤ、１−３５７および１−３４１などのＮＩＫ、および／またはＮＩＫおよびＣ−末端ドメイン（６２４から９４７番目の残基）、ＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体は、可溶型または不溶型（封入体）として回収することが可能である。

本発明の該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを、原核生物または真核生物の系において該ポリペプチドを発現させるために使用し得る。

例えば、ＮＩＫ、およびＣ−末端ドメイン（６２４から９４７番目の残基）、ＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体をコードするＤＮＡに融合した、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチドのような有効なシグナルペプチドをコードする発現ベクターは、真核生物での発現および分泌に使用することが可能である。

本発明は、炎症性疾患の治療のための医薬を製造するために、ＮＩＫ、およびＣ−末端ドメイン（６２４から９４７番目の残基）、ＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体、それら由来のペプチド、またはそれらのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片、またはその塩を提供する。

これらの手段を治療または研究に関連して使用するには、それらを生きた生物の細胞中に導入する必要がある。そのためには、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させることが望ましい。親油性構造体による誘導体化は、より一層の膜透過性をもつペプチドおよびタンパク質を作出するのに用いることができる。例えば、前記のような周知の膜作用性（membranotropic）ペプチドの配列を、そのペプチドまたはタンパク質の配列に付加することができる。さらに、１個以上の極性基または荷電基で置換されている、前記の炭化水素鎖などの部分的親油性の構造体によってペプチドまたはタンパク質を誘導体化することができる。例えば、ペプチドのラウロイル誘導体がMuranishiら、1991によって記載されている。ペプチドおよびタンパク質のさらなる改変には、Zachariaら、1991に記載されているように、メチオニン残基を酸化し、それによってスルホキシド基を作出することが含まれる。また、Zachariaらは、比較的疎水性のペプチド結合が、そのケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ₂）によって置換されているペプチドまたは誘導体についても記載している。これらの改変法、およびタンパク質およびペプチド化学の技術分野における当業者に周知の他の改変法によって、膜透過性を促進させる。

膜透過性を促進させる別の方法は、ウイルスレセプターなど、細胞表面上にあるレセプターを、ペプチドまたはタンパク質の細胞による取り込みを誘導するために使用することである。このメカニズムは、一定の細胞表面分子に特異的に結合するウイルスによってしばしば使用されている。結合すると、細胞はウイルスをその内側に取り込む。この細胞表面分子はウイルスレセプターと呼ばれている。例えば、インテグリン分子であるＣＡＲおよびＡｄＶが、アデノウイルスに対するウイルスレセプターとして説明されている（Hemmiら、1998、およびその参考文献を参照）。ＣＤ４、ＧＰＲ１、ＧＰＲ１５、およびＳＴＲＬ３３という分子が、ＨＩＶのレセプター／コレセプターであると同定されている（Edingerら、1998およびその参考文献を参照）。

このように、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを、細胞表面レセプターに結合することが知られている分子と連結させると、該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性が促進される。連結体を形成するのに適した基の例は、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質などの分子である。Lowら、米国特許第5,108,921号明細書には、これらの分子を、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を促進する目的で使用すること、および該連結体の製造が記載されている。

さらに、ロウらは、葉酸またはビオチンなどの分子に対するレセプターは豊富かつ非特異的に発現しているため、これらの分子を用いて連結体を生物内の多数の細胞に向かわせることができると記載している。

また、本発明のペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を促進させるための、細胞表面タンパク質の前記使用も、本発明の該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを特定の種類の細胞または組織に向かわせるためにも使用することができる。例えば、癌細胞を標的とすることが望ましい場合には、これらの細胞の表面上により豊富に発現されている細胞表面タンパク質を使用することが好ましい。その例は、葉酸レセプター、ムチン抗原であるＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ＢおよびＭＵＣ７、糖タンパク抗原であるＫＳＡ、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ならびにヒト絨毛性ゴナドトロピン−βなどである。前記Wangら、1998は、癌細胞を標的するための葉酸の使用を記載しており、Zhangら、1998は、前記した他の各抗原が、さまざまな種類の癌細胞、および正常細胞において比較的豊富であることを記載している。

したがって、本発明のタンパク質、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドは、前述の連結法を用いて、所望の特定の種類の細胞に向かわせることができる。例えば、リンパ球系譜の細胞におけるＮＩＫの活性化を阻害したいのであれば、例えば、これらの細胞上で発現しているＭＨＣクラスＩＩ分子を用いて、ＮＩＫ、およびＣ−末端ドメイン（６２４から９４７番目の残基）、ＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体、本発明のムテインおよび誘導体をそのような細胞へ向かわせることができる。このことは、該ＭＨＣクラスＩＩ分子の定常領域に対する抗体、またはその抗原結合部位を、本発明のタンパク質またはペプチドに結合させることによって実現することができる。さらに、さまざまなサイトカイン、および他の細胞間コミュニケーション分子に対する多数の細胞表面レセプターが記載されており、これらの分子の多くが、多かれ少なかれ組織や細胞の種類に制限される方法で発現される。したがって、Ｔ細胞のサブグループを標的とするのが望ましい場合には、本発明の連結体を製造するためにＣＤ４ Ｔ細胞表面分子を使用することができる。ＣＤ４結合分子は、その表面抗原ｇｐ４２がＣＤ４分子に特異的に結合することができるＨＩＶウイルスによって提供される。

本発明のタンパク質、ペプチドおよびアンチセンス配列を、ウイルスベクターを用いて細胞内に導入することができる。この目的でのワクシニアベクターの使用については、分子生物学実験プロトコール第１６章に詳述されている。アデノウイルスベクターの使用については、例えば、Teohら、1998、Narumiら、1998、Pedersonら、1998、Guang-Linら、1998、およびそれらにおける参考文献、Nishidaら、1998、Schwarzenbergerら、1998のすべて、およびCaoら、1998に記載されている。レトロウイルスによるアンチセンス配列の移動については、Danielら、1998に記載されている。

ウイルスをベクターとして使用する場合、通常、ウイルスの表面タンパク質を使用してウイルスを標的する。前記アデノウイルスなど、多くのウイルスは、細胞指向性においてはむしろ非特異的であるため、細胞の種類または組織に特異的なプロモーターを使用して、更なる特異性を付与することが望ましいかもしれない。Griscelliら、1998は、心室特異的な心臓ミオシン軽鎖２プロモーターを、アデノウイルスに仲介されて移動する遺伝子の心臓特異的ターゲティングのために使用することを教示している。

または、ウイルスベクターを改造して、その表面にさらに別のタンパク質を発現させたり、ウイルスベクターの表面タンパク質を変更して、所望のペプチド配列を組み込むことも可能である。このように、ウイルスベクターを改造して、一種類以上の付加的エピトープを発現させることができ、それを使用して、該ウイルスベクターを標的することができる。例えば、サイトカインエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩ−結合ペプチド、またはホーミング分子に由来するエピトープを用い、本発明の教示にしたがって、ウイルスベクターを標的することができる。

本発明は、一種類以上のＮＩＫ、およびＣ−末端ドメイン（６２４から９４７番目の残基）、ＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体、および／またはこれらの配列またはアンチセンスを含むＤＮＡまたはベクターから選択される一種類以上の活性物質を含む医薬組成物を包含する。

本発明は、ＮＩＫ、およびｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片を認識して結合することができる特異的抗体を含む医薬組成物を包含する。

「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、キメラ抗体、可溶型または結合型で標識されうる抗体に対する抗イディオタイプ（抗−ＩＤ）抗体、およびヒト化抗体、ならびに酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術など（これらに限定されるものではない）、周知の手法によって提供されるその断片を含むことを意味する。

モノクローナル抗体は、抗原に特異的な実質的に均一な抗体集団であって、実質的に類似したエピトープ結合部位を含む抗体集団を含む。Mabsは、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、KohlerとMilstein、Nature、256：495-497(1975)；米国特許第4,376,110号明細書；Ausubelら編、HarlowとLane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)；およびColliganら編、Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y. (1992-1996)参照（これらの文献の内容は、その全体が参考文献として本明細書に組み入れられる）。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ、およびそれらのサブクラスなどのイムノグロブリンクラスのものであればよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュー、またはインビボで培養することができる。高力価のＭａｂｓがインビボまたはインサイチューで産生されるため、本方法は、現在のところ好適な産生方法となる。

キメラ抗体は、マウスＭａｂに由来する可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有する抗体のように、異なった部位が異なった動物種に由来する分子である。キメラ抗体は、主に、適用においては免疫原性を低下させ、また産生においては収量を増加させるために用いられる。例えば、マウスＭａｂの方がハイブリドーマからの収率は高いが、ヒトにおける免疫原性が高いという場合に、ヒト／マウスキメラＭａｂを使用する。キメラ抗体、およびそれを産生する方法は、当技術分野において周知されている（Cabillyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277(1984)；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984);Boulianneら、Nature 312:643-646(1984)；Cabillyら、欧州特許出願第125023号明細書（1984年11月14日公開）；Neubergerら、Nature 314:268-270(1985)；Taniguchiら、欧州特許出願第171496号明細書（1985年2月19日公開）；Morrisonら、欧州特許出願第173494号明細書（1986年3月5日公開）；Neubergerら、国際公開第86/01533号パンフレット（1986年3月13日公開）；Kudoら、欧州特許出願第184187号明細書（1986年6月11日公開）；Sahaganら、J. Immunol. 137:1066-1074(1986)；Robinsonら、国際公開第87/02671号パンフレット（1987年5月7日公開）；Liuら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443(1987)；Sunら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218(1987)；Betterら、Science 240:1041-1043(1988)；Riechmannら、Nature 332:323-327、およびHarlowとLane 抗体:実験マニュアル、前掲。これらの文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。

「完全ヒト化抗体」とは、ヒトイムノグロブリンの可変領域と定常領域との両方を含む分子である。完全ヒト化抗体は、自己免疫疾患などの慢性的かつ再発性の疾患に反復治療が必要とされる場合に治療目的で使用できる可能性がある。完全ヒト化抗体の製造方法の１つは、マウス液性免疫システムの「ヒト化」、すなわち、ヒトのイムノグロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を、内因性Ｉｇ遺伝子を不活性化されているマウスに導入して、ヒトＩｇを産生することができるマウス系統（ゼノマウス(Xenomice)）を作出することからなる。Ｉｇ遺伝子座は、物理的構造と遺伝子再配列の両面において、また、広範な免疫応答を最終的に生じさせるのに必要とされる発現過程においても極めて複雑である。抗体の多様性は、主に、Ｉｇ遺伝子座に存在するさまざまなＶ、ＤおよびＪ遺伝子間の組み合わせによる再配列によって生じる。また、これらの遺伝子座にも、調節因子が散在していて、抗体の発現、対立遺伝子排除、クラススイッチ、および親和性成熟（affinity maturation）を調節している。再配列していないヒトＩｇ導入遺伝子をマウスに導入することによって、マウスの組換え装置がヒト遺伝子に適合することが明らかされている。さらに、ゼノマウスを抗原で免疫することによって、様々なアイソタイプの抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマが得られる。

完全ヒト化抗体、およびそれらを作成する方法は、当技術分野において周知である（Mendezら、Nature Genetics 15: 146-156 (1997)；Buggemannら、Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991)；Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:722-727(2000)；国際公開第98/24893号パンフレット）。

抗イディオタイプ（抗−ＩＤ）抗体は、通常、抗体の抗原結合部位と結合するユニークな決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄを調製しているＭａｂの由来源と同じ種および遺伝子型の動物（例えばマウス系統）を免疫することによって調製することができる。免疫された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって、免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識して応答する。例えば、米国特許第4,699,880号参照（この文献は、参考文献として本明細書に組み入れられる）。

また、抗Ｉｄ抗体は、さらに別の動物における免疫応答を誘導して、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生させるための「免疫原」としても使用することができる。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元のＭａｂとエピトープとしては同じであろう。このように、Ｍａｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用して、同一の特異性を有する抗体を発現する別のクローンを同定することができる。

したがって、本発明のＮＩＫ、そのアイソフォーム、類似体、断片または誘導体に対して作成されるＭａｂｓを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスのような適当な動物において抗Ｉｄ抗体を誘導することができる。このように免疫されたマウスの脾臓細胞は、抗Ｉｄ Ｍａｂｓを分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマを作製するために使用される。さらに、抗−Ｉｄ Ｍａｂｓは、キーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合させることができ、さらに別のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫するために使用することができる。これらのマウスの血清は、前記ＮＩＫタンパク質、またはその類似体、断片もしくは誘導体のエピトープに特異的な元のＭａｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含むであろう。

このように、抗Ｉｄ Ｍａｂｓは、検定されているエピトープに構造的に類似した独自のイディオタイプエピトープ、すなわち「イディオトープ」を有する。また、「モノクローナル抗体」という用語は、完全な分子以外に、例えば、抗原に結合できるＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２などの、その断片も含むことを意味している。ＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２断片は、完全な抗体のＦｃ断片を欠いており、循環からより速やかに除去され、完全抗体よりも非特異的組織結合が起きにくいとされる（Wahlら、J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)）。

モノクローナル抗体は、ある分子と特異的に反応して、その分子を抗体に結合することができれば、その分子に「結合できる」と言われる。「エピトープ」という用語は、ある抗体によって結合されうる分子の部位を意味するものであり、同時にその抗体に認識される部位でもある。エピトープ、すなわち「抗原決定基」は、大抵、アミノ酸や糖側鎖など、化学的に活性のある表面分子グループからなり、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。

「抗原」は、抗体が結合できる分子または分子の一部であり、さらに、抗原は、動物を誘導して、その抗原のエピトープに結合できる抗体を産生させることができる。抗原は、１個以上のエピトープを有することができる。前記の特異的反応とは、抗原が、高度に選択的な態様で、対応する抗体上のエピトープとは反応するが、他の抗原によって誘起された他の多数の抗体とは反応しないことを示唆しているものである。

「薬学的に許容し得る」の定義は、有効成分の生物学的活性の有効性を損なわなず、それが投与される宿主に毒性を示さない担体を含むということである。例えば、非経口投与のためには、有効タンパク質を、生理的食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンゲル溶液などのビヒクルに入れて注射用の単位剤形に処方することも可能である。

本発明に係る医薬組成物の有効成分は、さまざまな方法で個体に投与することができる。投薬経路には、皮内、経皮（例えば徐放製剤にして）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所的、および鼻腔内の経路などがある。これら以外の治療上有効な投薬経路、例えば、上皮組織または内皮組織による吸収や、有効成分をコードするＤＮＡ分子を（例えばベクターを介して）患者に投与して、有効成分のインビボでの発現および分泌をもたらす遺伝子治療などを用いることもできる。さらに、本発明に係るタンパク質を、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなど、生物学的活性剤の他の成分とともに投与することもできる。

本発明は、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激シグナル伝達がその病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫおよびｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片を認識して結合することができる特異的抗体の使用に関する。

本発明は、ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカインのシグナル伝達がその病因に関係している疾患を治療する方法であって、ＮＩＫ、またはｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片を認識して結合することができる特異的抗体を治療上有効な量投与することを含む方法に関する。

非経口（例えば静脈内、皮下、筋肉内など）投与のために、活性タンパク質を、溶液、懸濁液、乳化液または凍結乾燥粉末として、薬学的に許容し得る非経口用ビヒクル（例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液など）、および等張性を維持する添加剤（例えばマンにトール）または化学的安定性を維持する添加剤（例えば防腐剤および緩衝剤）とともに処方することができる。この処方剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。

また、ヒトの体内における分子の半減期を延長させる連結処理を用いることによって、例えば、国際公開第92/13095号パンフレットに記載されているように、分子をポリエチレングリコールに連結することによって、本発明に係る活性タンパク質のバイオアベイラビリティーも改善することができる。

本発明は、例えば炎症性疾患および／または癌の患者など、必要性のある患者においてＮＩＫ応答を促進または阻害する方法であって、ＮＩＫ、およびＣ−末端ドメイン（６２４から９４７番目の残基）、ＮＩＫ６４０−７２０などのｃγｃへの結合に関与する領域を含むＮＩＫの断片およびＡｌｙＮＩＫ変異体、それらのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を治療上有効な量投与することを含む方法に関する。

「治療上有効な量」とは、投与した際に、本発明の該ポリペプチドが、ＮＩＫ、ＮＦ−κＢおよび／またはｃγｃのシグナル伝達という生物学的活性の調節をもたらす量である。単回または複数回の用量として各個体に投与される用量は、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、併用される治療、治療頻度、および所望の効果など、さまざまな因子によって決まる。確立された用量範囲の調整および操作は、ＮＩＫ ｃγｃシグナル伝達、およびその断片の活性を測定するインビトロおよびインビボの方法同様、当業者が適宜行い得ることである。

ＮＩＫは、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用を調節する治療上有益な分子の可能性があるものをスクリーニングするためのアッセイ法において使用することができる。ＮＩＫ、ｃγｃ、およびＮＦ−κＢ誘導型プロモーター下に置かれたレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を発現する細胞を個々の低分子で処理する。処理した細胞におけるルシフェラーゼ発現（すなわちＮＦ−κＢ活性化）を対照細胞に対して比較する。ルシフェラーゼ発現（すなわちＮＦ−κＢ活性）を調節することができる候補有機化合物を選択する。試験化合物は、コンビナトリアル化学法だけでなく、他のハイスループット合成法によって得ることもできる。自動化された技術によって、スクリーニングすることができる個別化合物の大集団である分子ライブラリーの迅速な合成が可能になる。より大きくより多様な化合物ライブラリーを作製すれば、そのライブラリー内で有用薬剤が発見される可能性が高くなる。ハイスループットスクリーニングロボットを用いて、数千種類の化合物によるシグナルソーム形成の補充または破壊の阻害を試験することができる。

また、コンビナトリアル化学法によって作製された分子で、ＮＩＫとＩＬ−２γ鎖レセプターとの相互作用を阻害し、ｃγｃの細胞内ドメインを含むポリペプチド、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列変異誘導体もしくは断片を含む分子のスクリーニングであって、タンパク質の一方（例えばＮＩＫまたはＮＩＫ６４０−７２０）を、プレート中に（プレートに結合している特異的抗体によって）コーティングまたは捕捉すること、およびプレートに結合している他のタンパク質（例えば、ｃγｃ、ＩＤｃγｃ、またはこれらの断片）の結合を、有機化合物の存在下または非存在下で特異的抗体により検出することを含むスクリーニング。

本発明を、具体的な実施態様に関連して説明してきたが、当業者には、その代替、改変、変更した態様が明らかである。したがって、そのような代替、改変、変更した態様もすべて、添付した請求の範囲の精神と広い範囲内に包含しようとするものである。本明細書に記載した刊行物、特許および特許出願はすべて、各刊行物、特許および特許出願が具体的かつ個別に参考文献として本明細書に組み入れられると記載してあるのと同程度に、全体が参考文献として本明細書に組み入れられる。また、本出願における文献の引用または確認は、それら文献が、本発明の先行技術として利用できることを認めたものと解釈してはならない。

以下、本発明を下記の非制限的な実施例によって説明する。

ツーハイブリッドシステム法による、ＮＩＫと相互作用するタンパク質の検出
酵母でのツーハイブリッドシステム法は、タンパク質−タンパク質相互作用をインビボで検出するために広く用いられており、これを使用してＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、ＮＩＫと相互作用するタンパク質を見つけ、同定した（詳細については実施例８参照）。リンパ系の発達および機能におけるＮＩＫの極めて重要な役割を示す証拠から、ヒト骨髄ライブラリーを選択した。

ＮＩＫのＮ末端領域は、負の調節ドメイン（ＮＲＤ）（ＮＩＫのＣ末端側領域と相互作用して、それによりＮＩＫのその基質（ＩＫＫαおよびｐ１００）への結合を阻害する）を含む。ＮＩＫのＣ末端領域およびＮ末端領域の間の相互作用は、ＮＩＫのその基質への結合を抑制する。ＮＩＫのＣ末端ドメインが、ＴＲＡＦ−２、ＩＫＫ−１など、いくつかの重要な調節タンパク質およびＰ１００へのＮＩＫの結合に関与していることが発見され、このドメインが、その活性を調節するのに重要な、付加的なタンパク質に結合し得ることを示唆している。したがって、Ｃ末端側ドメインがＮＲＤによって塞がれてしまう可能性があるため、ツーハイブリッドシステムにおいて完全な分子をベイトとして導入するのは望ましくない。そのため、ツーハイブリッドスクリーニングでは、ＮＩＫのＣ末端（６２４〜９４７番目のアミノ酸）をベイトとして使用している（詳細については実施例８参照）。

選択プレート上に５０００個を上回るクローンが出現した。耐性クローンの約半数をα−ゲルアッセイによって解析したところ、青色の強度は様々であったが、それらの約６０％が陽性であることが分かった。８００のコロニーからプラスミドを単離・精製した。８００のうち４００のプラスミド（結合親和性の指標である発色強度によって選抜した）のＤＮＡインサートを、ｃＤＮＡライブラリーでインサートのフランキング配列に対応するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅して、その配列を決定した。検出されたプレイのほとんどは、非特異的であることが明らかになった。例えば、ＤＮＡインサートの８０％は、さまざまな遺伝子の３'側および５'側の非翻訳領域に一致しており、１０％のインサートはイムノグロブリンをコードしていた。残りの１０％が、タンパク質の領域をコードする断片に相当した。陽性コロニーには、播種後４〜８日で青色に変わるもの、約８〜１２日で変わるもの、また、それより遅く、播種後１２〜１６日までに色づくものもあった。陽性コロニーにおける発色のスピードは、タンパク質−タンパク質の相互作用の強さの指標である。すなわち、発色が早いほど、相互作用が強い。

発見されたタンパク質の１つ、ＩＬ−２γ鎖レセプターをさらに解析するために選んだ。ＩＬ−２γ鎖レセプターは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１レセプター複合体のサブユニットであり、そのため、一般的には、「共通γ鎖」（ｃγｃ）と呼ばれている。

哺乳動物環境におけるＩＬ−２γ鎖−ＮＩＫ相互作用の評価
酵母のツーハイブリッドシステムにおける２種類の異なる哺乳動物タンパク質間の特異的相互作用の検出は、本来の哺乳動物環境においてタンパク質間に対応する相互作用が存在することを必ずしも示唆していない。したがって、哺乳動物環境におけるＮＩＫとｃγｃとの相互作用を確認するために、ＮＩＫとｃγｃの免疫共沈降実験を、これらのタンパク質を過剰発現する２９３−Ｔ細胞の溶解物において実施した（詳細については実施例９参照）。

ＮＩＫとｃγｃを過剰発現させるために、等量のＮＩＫおよびｃγｃの発現プラスミド（それぞれ、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ（Ｎ末端にｍｙｃ標識を有する）およびｐｃＤＭＡ３で、両プラスミドとも同様の分子量）で２９３−Ｔ細胞をトランスフェクトした。過剰発現されたタンパク質を、どちらか一方のタンパク質（例えばＮＩＫ）に特異的な抗体で免疫沈降し、ウエスタンブロット解析によって、共沈降するタンパク質（例えばｃγｃ）の存在を検出した。

図２に、免疫沈降物を抗ｃγｃ抗体によって検出したウエスタンブロット解析の結果をまとめた。解析した試料は以下の通りである。１：ｃγｃを過剰発現し、抗ｃγｃにより免疫沈降された細胞溶解物。この試料は、免疫沈降法の陽性対照である。ｃγｃの分子量と一致する強いシグナルが観察された。２：ｃγｃのみを過剰発現し、抗ＮＩＫ抗体により免疫沈降された細胞溶解物。本実験におけるこの試料は、低濃度、かつおそらく不活性型で存在する内因性ＮＩＫタンパク質によるｃγｃの免疫共沈降を確認するためと、抗ＮＩＫ抗体の特異性を確認するために実施した。このブロットにおいて、ｃγｃに相当する分子量をもつタンパク質は検出されなかった。６：ｍｙｃ標識されたＮＩＫおよびｃγｃをともに過剰発現し、抗ｍｙｃ抗体により免疫沈降された細胞の溶解物。ｃγｃがＮＩＫとともに免疫共沈降したことから、ｃγｃ−ＮＩＫ相互作用は本来の環境においても起こることが実証された。３：６と同じであるが、ＮＩＫがＮＩＫのａｌｙ変異体（ヒトにおける変異はＧ８６０Ｒで、マウスＧ８５５Ｒにおけるａｌｙ変異に対応する）に変わっている点が異なっている。ＣγｃはＮＩＫ ａｌｙ変異体とともに免疫共沈降した。これは、この変異体が、野生型ＮＩＫと同じ効率でｃγｃに結合できることを示している。４：ツーハイブリッドシステムにおいてベイトとして使用されたＮＩＫの断片と同じ断片である、ＮＩＫのＣ末端（６２４〜９４７番目のアミノ酸）を過剰発現する細胞の溶解物。Ｃγｃに相当するバンドはブロットで検出されなかった。５：ＮＩＫのＣ末端およびｃγｃをともに過剰発現し、抗ＮＩＫ抗体により免疫沈降された細胞の溶解物。ｃγｃは、ＮＩＫのＣ末端と効率的に共沈降した。

これらの結果は、ｃγｃが、ＮＩＫのＣ末端（ｃγｃを同定したツーハイブリッドシステムにおいてベイトとして使用された）または全長ＮＩＫと効率的に共沈降することを示している。

図３は、抗ＮＩＫ抗体によって検出した免疫沈降物および全細胞溶解物のウエスタンブロット解析結果をまとめたものである。解析した試料は以下の通りである。３：ＮＩＫのみを過剰発現し、抗ＮＩＫ抗体により免疫沈降された細胞の溶解物。この試料は、免疫沈降法の陽性対照である。ＮＩＫに相当する分子量の強いシグナルが見られた。２：ＮＩＫのみを過剰発現し、抗ｃγｃ抗体により免疫沈降された細胞の溶解物。ＮＩＫに相当する分子量をもつタンパク質は検出できなかった。この結果は、ｃγｃ抗体の特異性も実証している。

１：ＮＩＫおよびｃγｃをともに過剰発現し、抗ｃγｃ抗体により免疫沈降された細胞の溶解物。この結果は、ＮＩＫがｃγｃによって効果的に免疫共沈降されることを示している。５はトランスフェクトされていない細胞の溶解物であり、４および６は、免疫沈降の前に、それぞれ、ＮＩＫおよびｃγｃの両方を過剰発現するか、またはＮＩＫのみを過剰発現する細胞の溶解物である。ＮＩＫの分子量に相当する強いバンドがブロットにおいて見られ、これが過剰発現されていることを実証した。

免疫沈降物のウエスタンブロット解析によって得られた結果は、ＮＩＫおよびｃγｃによる双方向的な沈降が生じることを示しており、それらの相互作用が哺乳動物細胞においても起きることを実証した。ＮＩＫのＣ末端ドメイン、全長ＮＩＫおよびＮＩＫａｌｙ変異体（ＮＩＫ−Ｇ８６０Ｒ）のすべてが、ｃγｃによって免疫共沈降された。

ＮＩＫへの結合を担うｃγｃ中の領域のマッピング
ＮＩＫへの結合を担うｃγｃのドメインを決めるために、ｃγｃの欠失変異体を作製し、それらのＮＩＫへの結合を解析した（図１）。

欠失変異体は、１０〜２０アミノ酸の間隔で、ｃγｃの細胞質ドメインに連続的に終止コドンを導入して作製した。ツーハイブリッドアッセイにより、ＳＦＹ５２６異種性（heterologous）酵母株においてＮＩＫへの結合を試験するために、全長ｃγｃ、またはその欠失変異体をコードするＤＮＡをｐＧＡＤＴ７プレイベクター（クローンテック社（Clonetech））に導入した。ＳＦＹ５２６酵母株は、ＴＲＰおよびＬｅｕについて原栄養菌株である。ｐＧＢＫＴプラスミド（ベイトベクター）はＴｒｐ１野生型遺伝子を有し、ｐＧＡＤは、野生型Ｌｅｕ２遺伝子を有する。したがって、二重にトランスフェクトされた酵母だけが、Ｌｅｕ Ｔｒｐ選択培地で増殖することができる。ＧＡＬ４ドメインに融合したキメラタンパク質が相互作用して、ＧＡＬ４の活性化ドメインがＤＮＡ結合ドメインの近傍に位置するようになると、二重にトランスフェクトされた酵母において機能的ＧＡＬ４が回復される。ＬＡＣ−Ｚ発現量が、タンパク質−タンパク質相互作用の強さを示す指標となる。標準β−ｇａｌ／コロニーリフトフィルターアッセイ（クローンテック社、酵母プロトコールハンドブック（Yeast Protocol Hnadbook）、第ＶＩ章）によってＬａｃ−Ｚ活性を測定した。

ベイトであるＮＩＫへのｃγｃおよび変異体の結合を測定するためにこれらをｐＧＡＤＴ７プレイベクターに導入したところ、高い非特異性を示したため、これらの相互作用を逆向きに試験した。すなわち、欠失変異体をベイトベクターにクロニーングし、ＮＩＫまたはＮＩＫのＣ末端（６２４〜９４７番目の残基）をプレイベクターにクロニーングした。表１にまとめたその結果は、いずれの欠失変異体もＮＩＫおよびＮＩＫのＣ末端の両方に強い結合を示さなかったが、ｃγｃの細胞質ドメイン（ＩＣＤ）だけが強い結合を示したことを示している。ＮＩＫおよびＮＩＫのＣ末端の両方に対する、ほとんどのＩＣＤ（近位の膜ドメインから５アミノ酸を欠失している）の結合は、全長ｃγｃ分子の結合よりも強かった。ｃγｃＩＣＤの膜遠位末端側で１２アミノ酸または４４アミノ酸を欠失させると、ＮＩＫへの親和性が５０％低下することが観察された。

様々な欠失変異体によって得られた結果は、ｃγｃの膜遠位ドメインが、ＮＩＫへの結合に関与していることを示している。したがって、３２９〜３６９番目残基に相当するｃγｃの膜遠位ドメインからの４１アミノ酸ポリペプチド（４１ＭＤＤと呼ばれる）の結合を解析した。

全長ＮＩＫまたはＣ末端ＮＩＫへの４１ＭＤＤポリペプチドの結合を両方向で試験した（すなわち、４１ＭＤＤをプレイ、ＮＩＫをベイトとし、その逆も）。得られた結果を表２に示す。ＮＩＫをプレイパートナーとしたときに相互作用が比較的弱くなるが、ＮＩＫをベイトにすると強くなる。４１ＭＤＤの相互作用は、全長ＮＩＫを用いたときよりも、ＮＩＫのＣ末端を用いたときに強くなる。これらの結果から、４１ＭＤＤポリペプチドがＮＩＫへの結合に関与していることが確認された。

同様に、ｃγｃの膜近位ドメイン（ＭＰＤ）の近くに位置する細胞内断片を含む構造物を用いてツーハイブリッド実験を実施した。その結果、２８２〜２３５番目のアミノ酸残基（４４ＭＰＤ）である４４アミノ酸の領域もＮＩＫに結合できることが示唆された。

免疫共沈降実験によってこの結果が確認された。ＧＳＴに融合された４４ＭＰＤとｍｙｃＮＩＫを細胞内で過剰発現させ、細胞を溶解して抗ＧＳＴ抗体で免疫沈降した（実施例９参照）。免疫沈降物をウエスタンブロットで解析した。結合したＮＩＫを抗ｍｙｃ抗体で検出した。その結果、４４ＭＰＤ断片もＮＩＫに結合することが実証された（図はない）。

ＮＩＫと相互作用する特異的アミノ酸を決定するために、ＩＣＤｃγｃにおいて、４１ＭＤＤに位置する残基における変異誘発実験を実施した。シグナル伝達タンパク質のプロリンリッチモチーフと、その同族ドメインとの相互作用については充分に記述されている（Kay BK, Williamson MP, Sudol M. FASEB J、2000年2月、14(2): 231-421）。４１ＭＤＤアミノ酸の２０％のアミノ酸はプロリンである。このため、４１ＭＤＤの内部にある２つの異なった部位にある２つの連続したプロリンをアラニンに変異させた：１−ＰＰ３３６，３３７ＡＡおよび２−ＰＰ３６０，３６１ＡＡ。

この変異は、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施した。

ＰＰ３３６，３３７ＡＡ変異体を作製するために、以下のプライマーを用いた。
5' ctcgtcagtgagattgccgcaaaaggaggggcccttg（配列番号：７）
5' caagggcccctccttttgcggcaatctcactgacgag（配列番号：８）

ＰＰ３６０，３６１ＡＡ変異体を作製するために、以下のプライマーを用いた。
5' gcccctactgggccgccgcatgttacaccctaaag（配列番号：９）
5' ctttagggtgtaacatgcggcggcccagtaggggc（配列番号：１０）

また、４１ＭＤＤにおいて、例えばＫ３３８、Ｅ３４４およびＷ３５８など、プロリン以外の残基においても変異作出を行なった。

Ｋ３３８Ａ変異体を作製するために、以下のプライマーを用いた。
5' gtcagtgagattcccccagcaggaggggcccttggggag（配列番号：１１）
5' ctccccaagggcccctcctgctgggggaatctcactgac（配列番号：１２）

Ｅ３４４Ａ変異体を作製するために、以下のプライマーを用いた。
5' ggaggggcccttggggcggggcctggggcctcc（配列番号：１３）
5' ggaggccccaggccccgccccaagggcccctcc（配列番号：１４）

Ｗ３５８Ａ変異体を作製するために、以下のプライマーを用いた。
5' cagcatagcccctacgcggcccccccatgttac（配列番号：１５）
5' gtaacatgggggggccgcgtaggggctatgctg（配列番号：１６）

ｃγｃＩＣＤの変異型はベイトとして使用し、実施例８に記載されているようにツーハイブリッドシステムでＮＩＫ−Ｃ末端との相互作用を試験した。

これらの結果を表３にまとめる。３６０番目と３６１番目の残基をプロリンからアラニンに置換すると、他の置換では実質的な効果はなかったのに対して、ＮＩＫへの親和性が５０％低下した。

ｃγｃの変異誘発で得られた結果は、４１ＭＤＤ領域の中にある３６０番目と３６１番目の残基のプロリンが、ＮＩＫへの結合に重要であることを明らかにしている。

ＮＩＫの過剰発現によるＮＦ−κＢ誘導に対するｃγｃおよびその欠失変異体の効果
ＮＦ−κＢの活性化を誘導するための実験上の方法の一つは、ＮＩＫを過剰発現することによるものである。

ＮＩＫが介在するＮＦ−κＢの活性化に対するｃγｃの効果を確認するために、ＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）と、ＮＩＫをコードする発現プラスミド（ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ）とのみ、またはｃγｃをコードする発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ）とともに、細胞を一過的に（transiently）トランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーターアッセイでＮＦ−κＢの活性化を測定した（詳細については、実施例１０参照）。

ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼによって、２９３−Ｔ細胞をトランスフェクトした。細胞中に現れるルシフェラーゼ活性を測定することによって間接的にＮＦ−κＢの活性化を測定した。ＮＩＫによるＮＦ−κＢ活性化に対するｃγｃの効果を評価するために、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃをｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼとともに同時トランスフェクトした。いく種類かの同時トランスフェクションを実施して、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼの濃度は一定にし、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃの濃度を変えたときの効果を調べた。細胞をトランスフェクトしてから２４時間後に回収し、溶解した後ルシフェラーゼ活性を測定した。

この実験の結果を図４にまとめる。ＮＩＫの過剰発現だけで、ルシフェラーゼ活性の発現が誘導されたことは、ＮＦ−κＢが活性化されたことを示している。このようなルシフェラーゼ活性の上昇は、空のプラスミドのみ（ｐｃ）またはレポーター遺伝子および空のプラスミド（ｐｃ＋ｌｕｃ）でトランスフェクトされた細胞では見られなかった。ＮＦ−κＢの活性化に対するｃγｃの効果は、ＮＩＫに対するｃγｃの濃度に依存していることが分かった。例えば、ｃγｃがＮＩＫよりも低い濃度で発現された場合には、ＮＩＫの効果を増強する（ＮＩＫが１μｇで、ｃγｃが０．１μｇのプラスミドＤＮＡ）が、同じか、それよりも高い濃度の場合には、ＮＩＫの効果を阻害した（ＮＩＫが１μｇで、ｃγｃが１μｇのプラスミドＤＮＡ）。ｃγｃプラスミドのみのトランスフェクションは、ＮＦ−κＢの活性化をもたらさなかった（図５）。

ＮＩＫのＣ末端（６２４〜９４７番目の残基）は、基質およびｃγｃに結合することができる（実施例２参照）が、触媒作用的には不活性であるため、ドミナントネガティブな変異体（ｄｎＮＩＫ）と見なすことができる。低濃度のｃγｃを発現し、ＮＩＫを過剰発現する細胞において観察されるＮＦ−κＢ活性化の促進に対するｄｎＮＩＫ過剰発現の効果を測定した。その結果を図５にまとめる。既述した通り、ＮＩＫの過剰発現だけで、ルシフェラーゼ活性の上昇によって証明されたように、ＮＦ−κＢの活性化を誘導した。ＮＩＫとともにｄｎＮＩＫを過剰発現させると、このＮＦ−κＢの活性化が阻害された。ｃγｃを低濃度で発現させると、ＮＩＫが介在するＮＦ−κＢの活性化がさらに促進されるのが観察された。しかし、このＮＦ−κＢ活性化の促進は、ｄｎＮＩＫの過剰発現によって遮断された。この結果、ｃγｃによるＮＦ−κＢ誘導効果は、ＮＩＫを介して発揮されることが確認される。

ツーハイブリッド法によって、ヒトのＡｌｙＮＩＫ変異体（ヒトにおける変異はＧ８６０Ｒで、マウスＧ８５５Ｒにおけるａｌｙ変異に対応する）はｃγｃに結合することが明らかになった（実施例２）。この変異体を過剰発現させただけで、野生型ＮＩＫと同じような効率でＮＦ−κＢの活性化を誘導した（図６）。ａｌｙＮＩＫ変異体が介在するＮＦ−κＢ活性化に対するｃγｃの効果を試験した。その結果を図６にまとめる。ｃγｃの発現は、ａｌｙＮＩＫが介在するＮＦ−κＢの誘導を促進しなかった。したがって、ａｌｙＮＩＫ変異体はｃγｃに結合できるにもかかわらず、そのＮＦ−κＢを誘導する活性はｃγｃによって影響を受けない。

前記したように、ＮＩＫの過剰発現によって介在されるＮＦ−κＢ活性化に対する全長ｃγｃの効果は濃度依存的で、例えば、ＮＩＫ介在性ＮＦ−κＢ活性化を阻害するには、ＮＩＫよりも高い濃度か同じ濃度のｃγｃが必要とされる。これに対して、ＮＩＫ介在性ＮＦ−κＢ活性化を促進するには、ＮＩＫよりも低濃度のｃγｃが必要とされる。

ＮＩＫによって誘導され、ｃγｃによって促進されるＮＦ−κＢ活性化に対する、４１ＭＤＤ（ｃγｃの遠位膜ドメインにある４１残基で、ＮＩＫに結合することが分かっている）の過剰発現の効果を試験した。

ウエスタンブロット解析で証明すると、細胞内ｃγｃ、およびその断片をトランスフェクションによって哺乳動物細胞で発現させても、検出可能量のタンパク質を生じさせることができない（図示なし）。これは、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの欠失によって生じた不安定性による可能性がある。細胞内ドメインは、ｃγｃＩＣＤおよびその断片において露出しているかもしれないドメインで、細胞に存在するプロテアーゼとしての傾向をもつＰＥＳＴドメインを含む。この問題を解決するために、４１ＭＤＤのＧＳＴ融合タンパク質を作製して安定させ、ＮＩＫおよびｃγｃによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対する４１ＭＤＤ−ＧＳＴ融合タンパク質の効果を試験した。

６ウェルプレートに１ウェル当たり１５００００個の２９３−Ｔ細胞を播種した。２４時間後に３μｇ／ウェルの総ＤＮＡ濃度（キャリアＤＮＡ ｐｃＤＮＡ）で細胞をトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡｃγｃを５０ｎｇ／ウェルの濃度で用いて、ＮＩＫによるＮＦ−κＢ活性の促進を誘導した。ＰｃＧＳＴ、および、融合タンパク質ＧＳＴ−４１ＭＤＤをコードするプラスミドを２μｇ／ウェルという高濃度で、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼは０．５μｇ／ウェルで用いた。トランスフェクトしてから２４時間後に、抽出バッファー１００μｌ中に細胞を回収し、凍結融解を繰り返して破砕した。遠心分離（微量遠心で１４０００ｒｐｍ、１分間）によって溶解物を予備清澄化（precleared）した。１０μｌの溶解物のルシフェラーゼ活性を、３６０μｌのアッセイ用バッファー中で測定した。結果は図７にまとめる。ＮＩＫの過剰発現およびｃγｃの低発現によって、ＮＦ−κＢ誘導が促進される。しかし、融合タンパク質ＧＳＴ−４１ＭＤＤが、ＮＩＫおよびｃγｃと共発現されている試料では、ＮＦ−κＢの活性化レベルは、以下のＮＩＫのみの過剰発現で観察されるレベルよりも低い。この結果は、全長ｃγｃ同様、４１ＭＤＤも、ＮＩＫよりも高い濃度で存在するときには、ＮＩＫ依存的なＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示している。

ＮＩＫによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対する、ｃγｃ、およびｃγｃのＣ末端で欠失したさまざまな変異体の効果を試験した。ｃγｃおよびｃγｃ変異体をコードするプラスミドの使用濃度は０．５μｇ／ｍｌで、ＮＩＫをコードするプラスミドと同じ濃度であった。このような条件下では、全長ｃγｃは、ＮＩＫが介在するＮＦ−κＢ活性化を阻害する結果になると予想される。

６ウェルプレートに１ウェル当たり１５００００個のＨｅＬａ細胞を播種した。２４時間後に、総ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡをキャリアＤＮＡとして使用した）を常に２μｇ／ウェルに保ちながらトランスフェクションを行なった。全長ｃγｃをコードするプラスミド、およびその欠失変異体をコードするプラスミドはすべて、０．５μｇ／ウェルの濃度で使用した。ＮＩＫおよびルシフェラーゼをコードするプラスミドも０．５μｇ／ウェルで使用した。トランスフェクトしてから２４時間後に、抽出バッファー１００μｌ中に細胞を回収し、凍結融解を繰り返して破砕した。遠心分離（微量遠心で１４０００ｒｐｍ、１分間）によって溶解物を予備清澄化した。溶解物のルシフェラーゼ活性を、３６０μｌのアッセイ用バッファー中で測定した。

結果は図８にまとめる。ＮＩＫと同じ濃度で発現された全長ｃγｃはＮＦ−κＢ活性を阻害する。ＮＩＫへの結合に関与することが明らかにされたドメインである膜遠位ドメイン（図１）に連続的欠失を有するｃγｃを発現させると、ＮＦ−κＢ活性の阻害が同時に低下する結果となった。３２５番目と３０３番目の残基に終止コドンをもつ欠失変異体は、ＮＩＫの活性に影響を与えなかった。

これらの結果、ｃγｃの膜遠位ドメインに存在する残基（３２５番目から３６９番目までの残基）がＮＩＫの結合に関与しており、その活性を調節する上で重要であることが確認される。

ＮＩＫのキナーゼ活性に対するｃγｃの効果
前記実施例において、ｃγｃがＮＩＫに結合して、その活性を調節することが明らかにされている。この調節作用の基礎をなすメカニズムとして考えられるのは、ｃγｃ／ＮＩＫ相互作用に際して生じるＮＩＫのリン酸化促進であろう。

前記仮説を調べるために、ｃγｃを単独で過剰発現する細胞（図９、レーン１）、ＮＩＫを単独で過剰発現する細胞（図９、左から３番目のレーン）、またはｃγｃとともにＮＩＫを過剰発現する細胞（図９、左から２番目のレーン）、またはキナーゼＩＫＫとともにＮＩＫを過剰発現する細胞（図９、左から４番目のレーン）を破砕して、抗ＮＩＫ抗体で免疫沈降した試料について、ＮＩＫのリン酸化をインビトロで測定した（詳細については、実施例１１参照）。

既に記載されているように、５μｃｉγ³²Ｐ−ＡＴＰを用いてキナーゼ反応を行なった（Uhlikら、1998）。図９の結果は、ｃγｃだけではキナーゼ活性を全く示さないことを明らかにしている（図９、左から１番目のレーン）。ｃγｃの存在下では、ＮＩＫの自己リン酸化およびＩＫＫ１によるリン酸化は３倍増加するのが観察された（レーン２とレーン３とを比較されたい）。この結果は、ｃγｃが、そのリン酸化を誘導することによってＮＩＫの活性を調節しうることを示している。

ＬＴβレセプターを介して伝達されるシグナルの調節におけるｃγｃの効果
リガンドによるＬＴβレセプターの誘導はＮＦ−κＢの活性化をもたらす。文献では、ＮＩＫが、ＬＴβレセプターを介するシグナル伝達に関与することが示唆されている。したがって、ＬＴβレセプターが介在するＮＦ−κＢ活性化に対する、全細胞質ｃγｃポリペプチドまたは４１遠位ドメイン（３２９−３６９）の過剰発現の効果を試験した。ルシフェラーゼレポーターアッセイによってＮＦ−κＢの活性化を測定した（詳細については、実施例１０参照）。

ＬＴβレセプターを発現することが一般的に知られているマウス胚線維芽細胞から細胞株を調製した。６ウェルプレートの各ウェルにつき１０⁵個の該細胞株の細胞を播種した。２４時間後に、ＧＳＴに融合されたｃγｃの細胞内ドメイン（ｃγｃＩＣＤ）を発現するプラスミドｐｃＧＳＴ ＩＣｃｇｃにより、またはＧＳＴに融合されたｃγｃの４１遠位ドメインを発現するプラスミドｐｃＧＳＴ４１ＭＤＤにより、ＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼレポータータンパク質をコードする発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）とともにトランスフェクションを行なった（遺伝子ポーター（Gene porter）トランスフェクション試薬、ジーンセラピーシステムズ社（Gene therapy systems））。細胞中に現れるルシフェラーゼ活性を測定することによって間接的にＮＦ−κＢの活性化を測定した。

空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）によって、総ＤＮＡ濃度を２μｇ／ウェルに標準化した。ｐｃＧＳＴ ＩＣｃｇｃおよびｐｃＧＳＴ４１ＭＤＤは、約１μｇ／ウェルの濃度で使用した。トランスフェクトしてから２４時間後に、５０ｎｇ／ｍｌの組換えＬＴβ（カタログ番号：Ｌ−５１６２、シグマ社（Sigma））によって細胞を１時間刺激した。

結果を図１０にまとめる。ｃγｃの細胞内ドメインの発現は、ＬＴβによるＮＦ−κＢ活性化を２．５倍促進したが、膜遠位４１アミノ酸の発現は、ＬＴβによるＮＦ−κＢ活性化を５０％阻害した。

上記結果は、ｃγｃが、ＬＴβレセプターによるシグナル伝達に関与し得ることを示唆している。ｃγｃの４１遠位ドメインはＬＴβレセプターによるシグナル伝達を阻害する。このことは、このポリペプチドまたはその断片が、ペプチドに基づく薬剤設計の候補として役立ち得ることを示している。そのような薬剤はＮＩＫの作用を調節することができ、そのため、炎症性反応を予防または軽減する上で、または変調性免疫調節過程において有益である。

ｃγｃとの相互作用に関係するＮＩＫの領域のマッピング
一連のＮＩＫ欠失変異体とｃγｃとの相互作用を、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて試験することによって、ＮＩＫ内の結合領域を決定した。ＮＩＫの切断型変異体をｐＧＢＴ９ツーハイブリッド用ベイトベクターにクロニーングし、ｃγｃをｐＧＡＤＴ７プレイベクターにクロニーングした。β−ｇａｌアッセイによって、ＳＦＹ５２６異種性酵母株において結合を調べた。

結果は、ＮＩＫにおけるｃγｃ結合領域は、Ｃ末端の１９６アミノ酸（６２４〜８２０番目の残基）中に存在することを示している。

ｃγｃへの結合を担っているＮＩＫのドメインをより正確に定義するため、ＮＩＫのさらなる欠失変異体を作出して、免疫共沈降によってｃγｃへの結合を解析した。ｃγｃとＨｉｓ標識したＮＩＫ欠失変異体とをコードするベクターによって２９３Ｔ細胞をトランスフェクトして、種々の欠失変異体によるｃγｃへの結合を免疫共沈降によって調べた（詳細については、実施例９参照）。ｃγｃに対する抗体を免疫共沈降に使用し、抗Ｈｉｓ抗体を用いて、ウエスタンブロット上の免疫沈降物からＨｉｓ−ＮＩＫ欠失変異体を検出した。結果を表４にまとめる。

これらの結果は、６４０番目と７２０番目のアミノ酸の間に存在する８１個のアミノ酸残基（配列番号：１８）を含むＮＩＫのドメインが、ｃγｃへの結合に関与していることを示している。

ツーハイブリッドシステム法
スクリーニングに使用されたツーハイブリッドシステムは、マッチメーカー（Matchmaker）バージョンＩＩＩ（クローンテック社）であった。このシステムにおいて、ベイト遺伝子（ＮＩＫ遺伝子）は、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）との融合タンパク質として発現され、一方、プレイ遺伝子またはｃＤＮＡライブラリーは、ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）との融合タンパク質として発現される。ＤＮＡ−ＢＤとＡＤが近傍に来ると、４種類のレポーター遺伝子（ＨＩＳ、ＡＤＥ、ｌａｃＺおよびα−ｇａｌをコードする）の転写が活性化される。

リンパ系の発達および機能におけるＮＩＫの極めて重要な役割を示している証拠に基づいて、ヒト骨髄ライブラリー（クローンテック社、カタログ番号：ＨＹ４０５３ＡＨ）をプレイとして選択した。

高度にストリンジェトな条件下のプレート上で、すなわち、ＬＥＵ（ベイトをコードするプラスミドのための選抜マーカー）、ＴＲＰ（プレイをコードするプラスミドのための選抜マーカー）、ＨＩＳおよびＡＤＥを含まないプレートの中で増殖しているクローンに、α−ｇａｌ発現を検出するための基質を染み込ませた。酵母細胞を（界面活性剤および機械的ストレスによって）破砕してから、ＤＮＡのフェノール抽出およびエタノール沈降によって、陽性クローンからプラスミドを精製した。プラスミドの中のｃＤＮＡインサートを、ライブラリーベクターｐＡＣＴ２に特異的なフランキングプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。さらなる生化学的解析を行なうために、各増幅ｃＤＮＡを、哺乳動物用発現ベクターに直接クロニーングした。

免疫沈降法
トランスフェクションのため、１５０万個の２９３−Ｔ細胞を１０ｃｍプレートに播種した。２４時間後、総ＤＮＡ濃度をプレート当たり２０μｇに維持しながら、ｍｙｃ標識したＮＩＫとｃγｃの発現プラスミドにより、リン酸カルシウムを利用した同時トランスフェクション（分子クロニーング（Molecular Cloning）第２版、１５．３３）を実施した。３０時間後、細胞を回収して、１％ＮＰ−４０細胞溶解バッファー（０．５％ＮＰ−４０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶解した。免疫沈降は、ｃγｃのＣ末端またはＮＩＫに対して作製した各抗体（サンタクルス社（Santa Cruz）のウサギポリクローナル抗体）であって、あらかじめプロテインＡスパース（sparse）（ウサギポリクローナル）またはプロテインＧスパース（マウスモノクローナル）に吸着させておいた抗体とともに１６時間インキュベートして実施した。免疫沈降物を細胞溶解バッファーで３回、緩衝食塩水で１回洗浄した。ビーズを４０μｌのレムリ（Laemmli）サンプルバッファーの中で煮沸し、２０μｌを１０％ ＳＤＳ／ＰＡＧＥにロードした。タンパク質を、このゲルからＰＶＤＦ膜にブロットして、抗ｃγｃおよび抗ＮＩＫでプローブし、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ウサギ抗体で処理した。ルミノール（Luminol）（カタログ番号Ａ８５１１、シグマ社）を基質に用いた増強化学発光法（Enhanced Chemi Luminiscence：ＥＣＬ）によってブロットを発色させた。

ＮＩＫを介するＮＦ−κＢ活性化アッセイ
２９３−Ｔ細胞（６ウェルプレートで１ウェル当たり１．５×１０⁵個）を、１ウェル当たり３μｇの総ＤＮＡ量でトランスフェクトした。必要があれば、空のベクターｐｃＤＮＡをキャリアＤＮＡとして用いた。１μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、およびＮＦ−κＢにより上方制御されるプロモーターであるＨＩＶ−ＬＴＲ（ヒト免疫不全ウイルスの長鎖末端反復配列）による調節下でルシフェラーゼを発現するｐｃＤＮＡ３ベクター ０．５μｇにより、実施例９に記載した通りに同時トランスフェクションを実施した。ｃγｃをコードするＤＮＡ（ｐｃＤＮＡｃγｃ）をｐｃＤＮＡに導入し、トランスフェクションの２４時間後に、ＮＩＫ発現ベクターの濃度の１０分の１、２分の１、および１分の１の割合で使用し、１００μｌの抽出バッファー（０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．８、１ｍＭ ＤＴＴ）に細胞を回収し、凍結および融解（液体窒素で１分間。２２℃）を繰り返して破砕した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、微量遠心、１分間）によって溶解物を予備清澄化（precleared）した。５μｌの溶解物のルシフェラーゼ活性を、３６０μｌのバッファー（２０ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭグリシル−グリシン、８．５μＭ硫酸マグネシウム、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、および５μＭ Ｄ−フリフェリン（カタログ番号Ｌ−６８８２、シグマ社）の中で分析した。

キナーゼアッセイ
１０μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよび１０μｇのｐｃＤＮＡｃγｃまたはヒスチジン標識したＩＫＫ１（ｐｓＨＩＳＩＫＫ１）で、空のｐｃＤＮＡをキャリアＤＮＡとして用いて総ＤＮＡ濃度をプレート当たり２０μｇに維持しながら、２９３−Ｔ細胞（１０ｃｍプレート当たり２×１０⁶個）をリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。２４時間後、細胞を回収して、１％ＮＰ−４０細胞溶解バッファー中で破砕し、予めプロテインＡセファロースビーズに吸着させてあるウサギ抗ＮＩＫ抗体によって８時間免疫沈降を行なった。既に記述されているように（Uhlikら、1998）、５μｃｉγ³²Ｐ−ＡＴＰを用いてキナーゼ反応を行なった。

ＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を阻害する非ペプチド低分子の製造とスクリーニング
コンビナトリアル化学合成法によって非ペプチド低分子のライブラリーを製造した。コンビナトリアル化学合成法の設計は、当技術分野において周知のものであり、例えばHermkensら、（1996）によって説明されている。ＮＩＫ、ｃγｃ、およびＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）を発現する細胞を、各合成有機化合物に曝露し、実施例４に記載したように、ＮＦ−κＢ活性化を試験する。

ＮＦ−κＢの活性化を阻害できる化合物を、さらなる試験のために選択する。

または、細胞を、ｃγｃ、およびＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）で一過的にトランスフェクトして、各合成有機化合物に曝露する。合成化合物に曝露した後、対応するレセプターへのリガンド結合によって内因性ＮＩＫが活性化される場合には、実施例６に記載したとおりにＮＦ−κＢ活性化を試験する。

ＮＦ−κＢの活性化を阻害できる化合物を、さらなる試験のために選択する。

内因性ＮＩＫとｃγｃとの相互作用
ＮＩＫとｃγｃとの相互作用を、哺乳動物細胞環境、すなわち、これらのタンパク質を過剰発現する２９３−Ｔ細胞の溶解物においてに明らかにした（実施例４参照）。これらの内因性タンパク質によって、これらタンパク質を天然に発現する細胞において、以下の実験を行なった。すなわち、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）（５００×１０⁶細胞）をＩＬ−２とともにインキュベートして破砕し、抗ｃγｃ抗体によって免疫沈降した（免疫沈降については、実施例９参照）。ｃγｃに結合して免疫共沈降したタンパク質を、関連する抗体を用いたウエスタンブロットで検出した。Ｃγｃとの免疫共沈降を試験された候補タンパク質は、ＮＩＫ、ＩＫＫα（ＩＫＫ１）、ＩＫＫβ（ＩＫＫ２）、ＩＫＫγ（ＮＥＭＯ）など、通常、シグナルソームに存在するタンパク質であった。この免疫共沈降したタンパク質を細胞の溶解物中で試験し、０時間目と、ＩＬ−２とともに４時間インキュベートした後に調べた。図１６Ａにまとめた結果は、ＮＩＫが、ＩＬ−２による刺激を受ける前も後も、ｃγｃにより共沈降されることを示している。したがって、ＮＩＫは、ｃγｃと構造的に結合していることが分かった。微量のＩＫＫ−１が、基礎レベルで見られ、ＩＬ−２とともに４時間インキュベートすると、別のシグナルソーム成分、すなわちＩＫＫ−２およびＮＥＭＯが、ｃγｃを介してＩＬ−２レセプターに補充された。これらの結果は、ＩＬ−２レセプター共通γ鎖が、ＩＫＫ−１結合領域とは別の位置でＮＩＫに結合していることを示している。同様の結果が、ＩＬ−１５で細胞を刺激した場合にも得られた（図１６Ａ、右図）。

ｃγｃによって免疫共沈降したシグナルソームが活性を有するか否かを確認するため、前記免疫沈降物を、ＧＳＴ−ＩＫＢα１−５４のリン酸化を測定するキナーゼアッセイで試験した（実施例１１参照）。図１６Ｂにまとめた結果は、ＩＬ−２によって刺激された細胞からの免疫沈降物だけがＧＳＴ−ＩＫＢα１−５４をリン酸化できることを示した。

したがって、これらの結果は、生理学的条件下において、ＮＩＫはｃγｃと構造的に結合していること、また、この相互作用はＩＬ−２シグナル伝達およびＮＩＫ依存型のＮＦ−κＢ活性化に関係していることを実証している。よって、ｃγｃとＮＩＫとの相互作用を阻害すると、ＩＬ−２のシグナル伝達活性の阻害と、ＮＩＫによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化の阻害という結果がもたらされる。

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ｃγｃドメイン、および欠失変異体を作成するために終止コドンが導入された残基の配置図を示す。Ｌ：リーダー配列１〜２３、ＥＣＤ：細胞外ドメイン、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＩＣＤ：細胞内ドメイン。 免疫沈降アッセイ法により測定した哺乳動物細胞におけるＮＩＫ−ｃγｃ相互作用に関する結果を示す。以下の試料について、ウエスタンブロット解析結果を抗ｃγｃで検出した。１：ｐｃＤＮＡ３ｃγｃによりトランスフェクトされ、抗ｃγｃにより免疫沈降された２９３−Ｔ細胞の溶解物、２：ｐｃＤＮＡ３ｃγｃによりトランスフェクトされ、抗ＮＩＫ抗体により免疫沈降された２９３−Ｔ細胞の溶解物、６：ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ（ｍｙｃ標識されたＮＩＫを発現する）およびｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびＮＩＫによりトランスフェクトされ、抗ｍｙｃ抗体により免疫沈降された２９３−Ｔ細胞の溶解物、４：ｐｃｄｎＮＩＫ（ＮＩＫのＣ末端ドメイン６２４〜９４７番目の残基）によりトランスフェクトされ、抗ｃγｃ抗体により免疫沈降された２９３−Ｔ細胞の溶解物、および５：ｐｃｄｎＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ｃγｃによりトランスフェクトされ、抗ＮＩＫ抗体（３および６のように抗ｍｙｃ抗体ではない）により免疫沈降された２９３−Ｔ細胞の溶解物。 免疫沈降アッセイ法により測定した哺乳動物細胞におけるＮＩＫ−ｃγｃ相互作用に関する結果を示す。免疫沈降物および２９３−Ｔ細胞の全溶解物を抗ＮＩＫ抗体により検出してウエスタンブロット解析した。解析した試料は以下の通りである。３：ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫによりトランスフェクトされ、抗ＮＩＫにより免疫沈降された細胞の溶解物。２：ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫによりトランスフェクトされ、抗ｃγｃ抗体により免疫沈降された細胞の溶解物。１：ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ｃγｃによりトランスフェクトされ、抗ｃγｃ抗体により免疫沈降された細胞の溶解物。５：トランスフェクトされなかった細胞の溶解物。４および６：免疫沈降の前に、それぞれ、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ｃγｃの両方、またはｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ単独によりトランスフェクトされた細胞の溶解物。 ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化に対するｃγｃの濃度依存的作用を示す。ＮＦ−κＢの活性化をルシフェラーゼレポーターアッセイ法（詳細については実施例１０参照）によって測定する。ＮＩＫを過剰発現させて２９３−Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を誘導した。以下のプラスミドによりトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ発現を測定した。空のプラスミド（試料ｐｃ）、空のプラスミドおよびＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ、０．５μｇ／ウェル）（試料ｐｃ＋ｌｕｃ）、１μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ １ｍｃｇ）、１μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、０．１μｇ／ウェルのｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ ０．１ｍｃｇ）、１μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、０．５μｇ／ウェルのｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ ０．５ｍｃｇ）、および１μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫに１μｇ／ウェルのｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ １ｍｃｇ）。 ＮＩＫのドミナントネガティブな変異体（ｄｎＮＩＫ、６２４〜９４７番目の残基）の、ｃγｃにより促進されるＮＦ−κＢ活性化に対する効果を示す。ＮＦ−κＢの活性化は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法によって測定する（詳細については、実施例１０参照）。ＮＩＫを過剰発現させて２９３−Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を誘導した。以下のプラスミドによりトランスフェクトした細胞においてルシフェラーゼ発現を測定した。空のプラスミド（試料ｐｃ）、空のプラスミドおよびＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）（試料ｐｃ＋ｌｕｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＳ３ＭＴｄｎＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｄｎＮＩＫ）、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ｃｇｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ）、ｐｃＳ３ＭＴｄｎＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ｃｇｃ＋ｄｎＮＩＫ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ、ｐｃＳ３ＭＴｄｎＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ＋ｄｎＮＩＫ）。ｐｃＳ３ＭＴｄｎＮＩＫ、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ｃγｃは、それぞれ１、１、および０．１μｇ／ウェルの濃度で使用した。 ＮＩＫａｌｙ変異体によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対するｃγｃの効果を示す。ＮＦ−κＢの活性化は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法によって測定する（詳細については、実施例１０参照）。ＮＩＫを過剰発現させることにより細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を誘導する。以下のプラスミドによりトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞においてルシフェラーゼ発現を測定した。空のプラスミド（試料ｐｃ）、空のプラスミドおよびＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）（試料ｐｃ＋ｌｕｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ）、ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼおよびｐｃＤＮＡ３ｃγｃ（試料ｃｇｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ）、１μｇのｐｃＳ３ＭＴａｌｙＮＩＫ、およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ａｌｙＮＩＫ）、ならびにｐｃＳ３ＭＴａｌｙＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ａｌｙＮＩＫ＋ｃｇｃ）。ｐｃＳ３ＭＴａｌｙＮＩＫ、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ｃγｃは、それぞれ１、１、および０．１μｇ／ウェルの濃度で使用した。 ｃγｃの膜遠位末端（４１ＭＤＤ）に由来する４１個のアミノ酸からなるポリペプチドの、ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化、および全長ｃγｃによる促進に対する効果を示す。ＮＦ−κＢの活性化は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法によって測定する（詳細については、実施例１０参照）。ＮＩＫを過剰発現させることにより２９３−Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を誘導した。ＮＩＫを過剰発現させ、または全長ｃγｃを低濃度で発現させてＮＦ−κＢの誘導を促進させる。以下のプラスミドによりトランスフェクトした細胞においてルシフェラーゼ発現を測定した。空のプラスミド（試料ｐｃ）、空のプラスミドおよびＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）（試料ｐｃ＋ｌｕｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ＧＳＴを発現するプラスミド（ｐＧＳＴ）およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ＧＳＴ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ、ｐｃＧＳＴおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ＧＳＴ＋ｃｇｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ、ｐｃＧＳＴ−４１ＭＤＤおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ＋４１ＧＳＴ）。プラスミドｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ、ｐｃＧＳＴ−４１ＭＤＤおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼは、それぞれ０．５、０．０５、２および０．５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。 ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化に対する、ｃγｃ欠失変異体（タンパク質のＣ末端を欠失させた）の効果を示す。ＮＦ−κＢの活性化は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法によって測定する（詳細については、実施例１０参照）。ＮＩＫを過剰発現させることによりヒーラ（Ｈｅｌａ）細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を誘導した。以下のプラスミドによりトランスフェクトした細胞においてルシフェラーゼ発現を測定した。空のプラスミドおよびＮＦ−κＢ誘導型プロモーターの調節下でルシフェラーゼをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ）（試料ｐｃ＋ｌｕｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋ｃｇｃ）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ３５７およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋１−３５７）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ３４１およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋１−３４１）、ｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ３２５およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋１−３２５）、ならびにｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ３０３およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＮＩＫ＋１−３０３）。プラスミドｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ、ｐｃＤＮＡ３ｃγｃ／欠失型、ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼは、すべて０．５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＤＮＡの全量は、空のプラスミドｐｃＤＮＡ３により標準化した。 ＮＩＫのインビトロでのキナーゼ活性に対するｃγｃの効果を示す。１０μｇのｐｃＤＮＡ３ｃγｃ（レーン１）、１０μｇのｐｃＤＮＡ３ｃγｃおよび１０μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ（レーン２）、１０μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫ（レーン３）、または１０μｇのｐｃＳ３ＭＴＮＩＫおよびキナーゼＩＫＫ１をコードする１０μｇのプラスミド（ｐＩＫＫ１）（レーン４）で２９３−Ｔ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を回収し、溶解してから、予めタンパク質Ａセファロースビーズに吸着させたウサギ抗ＮＩＫ抗体により免疫沈降を実施した。既に記載されているように（Uhlikら、1998）、５μｃｉ ＡＴＰγによりキナーゼ反応を行なった。 全長ＩＣＤｃγｃ、またはその４１アミノ酸からなる膜遠位ドメインの過剰発現の、ＬＴβレセプターを介して誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対する効果を示す。ＮＦ−κＢの活性化は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法によって測定する（詳細については、実施例１０参照）。マウス胚線維芽細胞におけるＮＦ−κＢ活性化をＬＴβによって誘導した。以下のプラスミドによりトランスフェクトした細胞においてルシフェラーゼ発現を測定した。空のプラスミド（試料ｐｃ）、ＧＳＴを発現するプラスミド（ｐｃＧＳＴ）およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ｐｃＧＳＴ＋ｌｕｃ）、ｃγｃの細胞内ドメインとのＧＳＴ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐＧＳＴＩＣｃγｃ）およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＧＳＴＩＣｃｇｃ＋ｌｕｃ）、ならびにｃγｃの膜遠位ドメインの４１アミノ酸からなるポリペプチドとのＧＳＴ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐＧＳＴ４１ＭＤＤ）およびｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼ（試料ＧＳＴ−４１ＭＤＤ＋ｌｕｃ）。プラスミドｐＧＳＴＩＣｃγｃおよびｐＧＳＴ４１ＭＤＤは、１μｇ／ウェルの濃度で使用し、ｐｃＤＮＡ３ルシフェラーゼは０．５μｇ／ウェルの濃度で使用した。空のプラスミド、ｐｃＤＮＡ３は、全量ＤＮＡ濃度を２μｇ／ウェルに標準化するためのキャリアとして使用した。ルシフェラーゼ活性のレベルは、相対的な光ユニット（relative light units）（ＲＬＵ）で表示した。 ｃγｃの細胞内ドメインのアミノ酸配列を示す。 ｃγｃの膜遠位ドメイン（４１ＭＤＤ）の４１アミノ酸からなるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 ｃγｃの細胞内ドメイン（ｃγｃＩＣＤ）のヌクレオチド配列を示す。 ｃγｃの膜遠位ドメイン（４１ＭＤＤ）の４１アミノ酸からなるポリペプチドのヌクレオチド配列を示す。 ＮＩＫへの結合に関与する、ｃγｃのＣ末端側１２アミノ酸の配列を示す。 １６Ａは、内因性ＮＩＫおよびｃγｃの相互作用を示す。末梢血の単核細胞（ＰＭＢＣ）（５００×１０⁶細胞個）をＩＬ−２またはＩＬ−１５の存在下でインキュベートし、溶解して、抗ｃγｃ抗体で免疫沈降（ＩＰ）した（免疫沈降については、実施例９参照）。ｃγｃに結合して免疫共沈降したタンパク質を、関連抗体を用いてウエスタンブロット（ＷＢ）で検出した。ＷＢにおいてｃγｃとの免疫共沈降を検出するために使用した抗体は、ＡＮＴＩ−ＮＩＫ、ＡＮＴＩ−ＩＫＫα（ＩＫＫ−１）、ＡＮＴＩ−ＩＫＫβ（ＩＫＫ２）、およびＡＮＴＩ−ＩＫＫγ（ＮＥＭＯ）であった。免疫共沈降したタンパク質は、ＩＬ−２と０から最長４時間およびＩＬ−１５と０から最長１時間インキュベートした後に試験した細胞の溶解物において検出された。非関連ＩｇＧを免疫沈降（ＩＰ）用の対照として使用した。１６Ｂは、ｃγｃと免疫共沈降したシグナルソーム（signalosome）が活性であることを示す。１６Ａに記載したように調製した免疫沈降物を、リン酸化のための基質としてＧＳＴ−ＩＫＢα１−５４を用いて、キナーゼアッセイ法（詳細については実施例１１参照）で試験した。

Claims (74)

1. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫまたはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用。
2. ＮＩＫの断片がＮＩＫのＣ末端（６２４から９４７番目の残基、配列番号：１９）を含む請求項１記載の使用。
3. ＮＩＫの断片がＮＩＫ６４０−７２０（配列番号：１８）を含む請求項１記載の使用。
4. ＮＩＫの変異体がＡｌｙＮＩＫである請求項１記載の使用。
5. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、円順列変異誘導体もしくは断片をコードするＤＮＡの使用。
6. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片に特異的な抗体の使用。
7. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節することができる低分子の、ｃγｃによるシグナル伝達を調節するための使用であって、該分子が、コンビナトリアル化学合成法の生成物をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られるものである使用。
8. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、円順列変異誘導体もしくは断片のアンチセンスをコードするＤＮＡの使用。
9. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用。
10. サイトカインがＩＬ−１２である請求項９記載の使用。
11. サイトカインがＩＬ−１５である請求項９記載の使用。
12. ＮＩＫの断片がＮＩＫのＣ末端（６２４から９４７番目の残基、配列番号：１９）を含む請求項９記載の使用。
13. ＮＩＫの断片がＮＩＫ６４０−７２０（配列番号：１８）を含む請求項９記載の使用。
14. ＮＩＫの変異体がＡｌｙＮＩＫである請求項９記載の使用。
15. 疾患の治療のための医薬の製造において、ＩＬ−２ｃγｃによるシグナル伝達を阻害するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用。
16. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を認識して結合することができる抗体の使用。
17. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片をコードするＤＮＡの使用。
18. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片のアンチセンスをコードするＤＮＡの使用。
19. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を調節することができる低分子の使用。
20. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカインのシグナル伝達が病因に関係している疾患の治療方法であって、治療上有効な量のＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を、必要とする対象に投与することを含む方法。
21. サイトカインがＩＬ−１２である請求項２０記載の使用。
22. サイトカインがＩＬ−１５である請求項２０記載の使用。
23. ＮＩＫの断片がＮＩＫのＣ末端（６２４から９４７番目の残基、配列番号：１９）を含む請求項２０記載の使用。
24. ＮＩＫの断片がＮＩＫ６４０−７２０（配列番号：１８）を含む請求項２０記載の使用。
25. ＮＩＫの変異体がＡｌｙＮＩＫである請求項２０記載の使用。
26. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療方法であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を認識して結合することができる抗体を治療上有効な量、必要とする対象に投与することを含む方法。
27. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療方法であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片をコードするＤＮＡを治療上有効な量、必要とする対象に投与することを含む方法。
28. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療方法であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片のアンチセンスをコードするＤＮＡを治療上有効な量、必要とする対象に投与することを含む方法。
29. ｃγｃを刺激できるサイトカインが病因に関係している疾患の治療方法であって、ＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を調節することができる低分子を治療上有効な量、必要とする対象に投与することを含む方法。
30. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含む医薬組成物。
31. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片をコードするＤＮＡを含む医薬組成物。
32. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片に特異的な抗体を含む医薬組成物。
33. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節することができる低分子を含む医薬組成物であって、該低分子が、コンビナトリアル化学合成法によって製造された低分子をルシフェラーゼ系でスクリーニングすることにより得られるものである医薬組成物。
34. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）とＮＩＫとの相互作用を調節するための、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片のアンチセンスをコードするＤＮＡを含む医薬組成物。
35. サイトカイン刺激性ＩＬ−２ｃγｃシグナル伝達が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含む医薬組成物。
36. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含む医薬組成物。
37. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を認識して結合することができる抗体を含む医薬組成物。
38. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片をコードするＤＮＡを含む医薬組成物。
39. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片のアンチセンスをコードするＤＮＡを含む医薬組成物。
40. ＩＬ−２ｃγｃによるサイトカイン刺激性シグナル伝達が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、ＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を調節することができる低分子を含む医薬組成物。
41. ＮＩＫとｃγｃとの相互作用が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、ＮＩＫ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を治療上有効な量含有する医薬組成物。
42. ＩＬ−２共通γ鎖（ｃγｃ）結合ドメインを含むＮＩＫのポリペプチド断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片。
43. ＮＩＫのＣ末端（６２４から９４７番目の残基、配列番号：１９）を含む請求項４２記載のＮＩＫのポリペプチド断片。
44. ＮＩＫ６４０−７２０（配列番号：１８）を含む請求項４２記載のＮＩＫのポリペプチド断片。
45. 請求項４２、４３または４４記載のＮＩＫのポリペプチド断片をコードするＤＮＡ。
46. 請求項４５記載のＤＮＡを含むベクター。
47. 請求項４６記載のベクターを含む細胞。
48. 請求項４２、４３または４４記載のＮＩＫポリペプチド断片の製造方法であって、請求項４７記載の細胞を培養し、産生されたポリペプチドを回収することを含む方法。
49. 請求項４２、４３または４４記載のＮＩＫのポリペプチド断片を特異的に認識して結合する、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、完全ヒト化抗体、抗−抗−Ｉｄ抗体、細胞内発現抗体またはそれらの断片。
50. ＮＩＫ−ｃγｃ相互作用を阻害することができる低分子であって、コンビナトリー化学合成法によって製造された分子をルシフェラーゼ系においてスクリーニングして得られる分子。
51. 請求項４２、４３または４４記載のＮＩＫのポリペプチド断片を含む医薬組成物。
52. 請求項４９記載の抗体を含む医薬組成物。
53. 請求項５０記載の低分子を含む医薬組成物。
54. 請求項４７記載のベクターを含む医薬組成物。
55. 請求項４５記載のＤＮＡを含む医薬組成物。
56. ｃγｃによるシグナル伝達を調節するための、請求項５１、５２、５３、５４または５５記載の医薬組成物。
57. ＮＩＫとｃγｃとの相互作用が病因に関係している疾患の治療用医薬組成物であって、請求項４２、４３または４４記載の医薬組成物。
58. レセプターに共通γ鎖を有するサイトカインの活性が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、請求項４２、４３または４４記載のＮＩＫのポリペプチド断片の使用。
59. ＩＬ−２が病因に関係している請求項５８記載の使用。
60. ＩＬ−１５が病院に関係している請求項５８記載の使用。
61. ＮＩＫとｃγｃとの相互作用が病因に関係している疾患の治療のための医薬の製造における、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用。
62. 過剰な免疫応答が原因で生じる疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用。
63. 関節リウマチ、骨関節炎、炎症性大腸炎、喘息、心筋梗塞、アルツハイマー病またはアテローム性動脈硬化症を治療するための請求項６２記載の使用。
64. 自己免疫疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片の使用。
65. 疾患が、免疫性甲状腺炎、関節リウマチおよびその他の関節症、自己免疫性溶血性貧血ならびに炎症性大腸炎から選択される請求項６４記載の使用。
66. レセプターに共通γ鎖を有するサイトカインの活性化が病因に関係している疾患の治療および／または予防のための方法であって、治療上有効な量の、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を、必要とする対象に投与すること含む方法。
67. ＩＬ−２が病因に関係している請求項６６記載の方法。
68. ＩＬ−１５が病因に関係している請求項６６記載の方法。
69. ＮＩＫとｃγｃとの相互作用が病因に関係している疾患の治療および／または予防のための方法であって、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含むポリペプチドを、治療上有効な量、それを必要とする宿主に投与すること含む方法。
70. ＮＦ−κＢ活性化が関係している疾患の治療および／または予防のための方法であって、治療上有効な量の、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）を含むＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含むポリペプチド断片を、それを必要とする宿主に投与すること含む方法。
71. ＮＦ−κＢ活性化が関係している疾患の治療および／または予防のための方法であって、請求項５０記載の低分子を有効量、それを必要とする宿主に投与すること含む方法。
72. 癌の治療のための請求項６９または７０記載の方法。
    関節リウマチ、骨関節炎、炎症性大腸炎、喘息、心筋梗塞、アルツハイマー病またはアテローム性動脈硬化症の治療のための請求項６９または７０記載の方法。
73. 過剰な免疫応答によって生じる疾患を治療および／または予防する方法であって、治療上有効な量の、ｃγｃ結合ドメイン（配列番号：１８）に相当するＮＩＫの断片、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列変異誘導体もしくは断片を含むポリペプチドを、それを必要とする宿主に投与することを含む方法。
74. 関節リウマチ、骨関節炎、炎症性大腸炎、喘息、心筋梗塞、アルツハイマー病またはアテローム性動脈硬化症の治療のための請求項７３記載の方法。

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