JP2005525781A - 高処理能検定システム - Google Patents

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Abstract

本発明はプローブの反復アレイを使用して生物学的検定または化学的検定多数を高処理能に、同時並行的に行うために有用な構成物、装置および方法に関する。本発明のコンビネーションは試験領域複数を有する表面を含む。その試験領域複数の中で少なくとも２個、好適な態様では少なくとも２０個が実質的に同等であり、その試験領域は各々一般的なアンカー分子のアレイを有する。このアンカーは双官能リンカー分子に関連する。この双官能リンカー分子にはアンカー少なくとも１種に特異的な部分と目的とする標的に特異的なプローブである部分とを各々含む。得られるプローブのアレイを使用してそのプローブと特異的に相互作用する標的分子１種またはそれ以上の存在を分析するか、または活性を試験する。好適な態様では、被検サンプルにヌクレアーゼ保護処理を施した後に本発明のコンビネーションと接触させる。

Description

発明の詳細な説明
本出願は１９９９年６月２１日に出願した米国特許出願第０９／３３７３２５号の一部継続出願である。この原出願は１９９８年１２月２２日に出願した米国特許出願第０９／２１８１６６号の一部継続出願である。この原出願は１９９８年７月２日に出願した米国特許出願第０９／１０９０７６号の一部継続出願である。本出願は１９９７年１２月１９日に出願した米国特許予備出願第６０／０６８２９１号の優先権を主張する。
本発明の技術的分野
この発明はプローブの反復するアレイ（array）を使用して多数の生物学的検定または化学的検定を同時並行的に行うために有用な、たとえば構成物、装置および方法などに関する。その複数の領域は各々一連の一般的アンカー分子のアレイを含む。このアンカーは双官能性リンカー分子に会合し、各々アンカーの少なくとも１種に特異的な部分および目的とする標的に特異的なプローブである部分を含む。得られるプローブのアレイはそのプローブと特異的に相互作用する標的分子１種またはそれ以上の存在を分析するために使用する。この発明はこれに限定するものではないが、医薬開発、分子生物学、生化学、薬理学および医学的診断技術を含む分子相互作用の性質によって特徴付けられる広範な分野に関する。
本発明の背景
表面または「チップ」に配置された分子プローブ多数が各種の生物学的および化学的検定に使用されてきた。この検定法は目的とする標的分子と該プローブのいずれかが相互作用するかどうかを判定するために行われる。プローブを所定の条件で標的分子に接触させると、検出装置は標的分子と所与のプローブとが相互作用したかどうかを判定する。
これらのシステムはプローブまたは標的分子のいずれかに関する情報を得るための各種のスクリーニング操作において有用である。例えば、目的とする受容体に結合するペプチドまたは薬剤候補をスクリーニングすること；その他に遺伝子突然変異、母集団中のアレレ変異体、または特定の病原菌または特定の病原菌株の存在を検出するためにサンプルをスクリーニングすること；その他に特定の生理学的条件、発育段階または疾病の病状などに関連する発現を行うｍＲＮＡを確認するために遺伝子発現を研究すること；などのために使用されてきた。
本発明の記載
この発明は複数の生物検定または化学検定を同時並行的に行うための構成物、装置および方法を提供する。これによって、例えば臨床検査で診断用スクリーニングするための多数の患者サンプル、または薬剤発見の方法において試験すべき薬剤または治療剤候補などサンプル多数の高処理能（high throughput）分析が可能になる。また、サンプル内にある標的１種またはそれ以上を検出するために有用なコンビネーション（combination）を提供する。このコンビネーションは複数の空間的に区別された領域を持つ表面を有する。この領域は試験領域とも呼ばれ、ウェルであることができ、その少なくとも２個は実質的に同一である。各表面は少なくとも２個、好ましくは少なくとも２０個またはそれ以上、たとえば少なくとも約２５、５０、９６、８６４または１５３６個の実質的に同一な領域を含む。各試験領域は、標的１種またはそれ以上を含む（または含む可能性がある）サンプルを導入する空間であって、生物学的または化学的なアレイを含む（「標的を含むサンプル」または「サンプル内にある標的を検出すること」のような語句は標的を含まないか標的が検出されないサンプルまたは判定（検出の試み）を排除することは意味しない。一般的観念ではこの発明にはサンプルが標的を実際に含むか、または検出できるかどうかに拘らず、サンプルが標的を含まれているかどうかを判定するためのアレイが含まれる）。このアレイは、各々が双官能性リンカー分子に会合する一般的な「アンカー」を有する。この双官能性リンカー分子はアンカーに特異的な第一部分と標的の少なくとも１種に特異的なプローブを有する第二部分とを有する。この発明のコンビネーションを標的１種またはそれ以上を含むサンプルと接触させ、場合によってはディテクター分子と反応させて、試験領域内の標的分子とプローブとの間の反応を検出して検定結果を表示する検出器が応答する。
この発明は高処理能の生物学的検定のために殊に有用な方法と構成物とを提供するが、本発明は特に好適な態様では、薬剤発見のための高処理能スクリーニングに使用できる。例えば本高処理能検定は一時に多数（例えば１００枚）の９６ウェルマイクロプレートで処理できる。プレートの各ウェルは、たとえばアンカーとリンカーのペア約３６対のアレイを使用することによってその中で異なるテスト３６種を行わせることができる。すなわち、プレート当り９６ウェルのプレート１００枚および各ウェル当り３６種の試験をすれば、全部で３４５０００回の試験が可能であって、例えば９６００個の薬剤候補に３６種の異なるパラメータまたは検定のための試験を同時に実施できる。高処理能検定は一時にパラメータ１個のみを試験する検定よりもはるかに多くの各薬剤候補に関する情報を提供する。例えば、高処理能スクリーニング１回で薬剤候補が選択的であるか、特異的であるかおよび／または非毒性的であるかどうかを判定することが可能である。高処理能でない方法は、目的とする各薬剤候補についてこのようなパラメータを試験するには膨大な追加検定を必要とする。数タイプの高処理能スクリーニング、たとえば実施例１５〜１７などを開示する。各種の広範な生物検定を同時に行う性能および非常に多数の検定を一時に行う性能（すなわち、非常に高い処理能）は本発明の二つの重要な利点である。
例えば一態様では、たとえばアミノ酸または修飾されたオリゴヌクレオチドのような１級アミンを付着させるために誘導体化された表面を持つポリスチレン製９６ウェルＤＮＡバインドプレート（DNA Bind Plate, Corning Costar 社）を使用して、アンカーの役目をさせるために各プレートの各ウェル表面に異なるオリゴヌクレオチド３６種の集合体をスポットすることができる。各アンカーはこの誘導体化されたポリスチレンに共有結合で結合できる。また、同じアンカー３６個を全スクリーニング検定に使用できる。いずれかの特定の検定のために、所与のリンカーの組合せを用いて各ウェルの表面を３６種もの異なる標的または検定タイプに特異的になるようにプログラムでき、また、異なるサンプルを各プレートの９６ウェルの各々に適用することができる。他の目的とする標的および検定のためにウェル表面を再プログラムしてアンカーの同じ組合せを多回使用でき、また、同じリンカーの組合せで多回再使用できる。この柔軟性および再使用可能性は本発明の別な利点である。
本発明の一態様はサンプル内にある標的１種またはそれ以上の検出に有用なコンビネーションであって、サンプル添加前には次のものを含む：
ａ）空間的に区別された領域を多数有し、その領域の少なくとも２個は実質的に同一である表面；ここに各領域は次項を含む：
ｂ）少なくとも８種の異なるオリゴヌクレオチドアンカー；ここに各アンカーは次項と会合している：
ｃ）各々オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第一部分および該標的に特異的なプローブを有する第二部分を有する双官能性リンカー。
本発明の別な態様はサンプル内にある標的１種またはそれ以上の検出に有用なコンビネーションであって、サンプル添加前には次のものを含む：
ａ）空間的に区別された領域を多数有し、その領域少なくとも２個は実質的に同一である表面；ここに各領域は次項を有する：
ｂ）少なくとも８種の異なるアンカー；ここに各アンカーは次項と会合している：
ｃ）アンカーに特異的な第一部分および該標的に特異的なプローブを有する第二部分を有する双官能性リンカー。
本発明の別な態様は標的少なくとも１種を検出するための方法であって、この方法では標的を含むかもしれないサンプルと前記コンビネーションとを標的が該コンビネーションに結合するために有効な条件下に接触させる。別な態様はＲＮＡの発現パターンを判定するための方法である。この方法では標的として少なくとも２個のＲＮＡ分子標的を含むサンプルを前記のコンビネーションとともに、ＲＮＡ標的とプローブとのハイブリッド形成に有効な条件下にインキュベーションする。このコンビネーションのプローブ少なくとも１種はＲＮＡ標的の少なくとも１種に特異的な（すなわち選択的な）核酸（たとえばオリゴヌクレオチド）である。別な態様は、ＲＮＡの発現パターンを調整する薬剤（または条件）を確認する方法である。この方法はＲＮＡの発現パターンを判定するために前記した方法であって、さらに、該薬剤の存在下（または該条件下）のＲＮＡの発現パターンと別な条件との組合せのもとに起きたＲＮＡの発現パターンとを比較することを含む。
例として図１と図２に、本発明のコンビネーションとｍＲＮＡ標的を検出するためにそれを使用する方法とを例示する。図２に示す本発明の表面は同一の試験領域１５個を含み、本発明の殊に好適な態様では各試験領域はマイクロタイタープレートのウェルである。各試験領域は異なるアンカー６種を含むが、ここでは番号１〜６で示す。図１はこのアンカーの１つ、アンカー１を図示する。本発明の最も好適な態様ではアンカー１はオリゴヌクレオチドである。アンカー１にはリンカー分子の一つ（リンカー１）が結合し、このリンカーは二つの部分を有する。アンカーに特異的な第一部分はこの例示ではアンカーと特異的にハイブリッドを形成できるオリゴヌクレオチドである。目的とする標的――この図では標的ｍＲＮＡ１――に特異的なプローブである第二部分は、該標的とハイブリッドを形成できるオリゴヌクレオチドである。この図には示していないが、他のアンカー５個はそのアンカー特異的部分を介してそれ自身のリンカーとハイブリッドを形成でき；各リンカーはｍＲＮＡ１と異なるか（または同一な）ｍＲＮＡに特異的なプローブ部分を含むことができる。この図のコンビネーションはｍＲＮＡ１（またはアレイ内のプローブ５個によって特定（計画）されたｍＲＮＡ標的について）の存在について同時に１５種までの異なるサンプルを検定するために使用できる。この検定を行うためにこの例では独立な細胞系列１５種の１種からのＲＮＡ抽出物であることができる各サンプルを領域またはウェルの１つに少容量添加し、プローブと標的とのハイブリッド形成に有効な条件下にインキュベーションする。ｍＲＮＡ１がサンプル内にあるかどうかを判定するために、パターンを認識できおよび／またはシグナルの存在する核領域内の特定の位置に応答できる検出装置を採用する。細胞系列をそのｍＲＮＡをタグでインビボ標識する条件下にインキュベーションすれば、およびサンプル内にｍＲＮＡ１が存在すれば、検出器はタグの付いたｍＲＮＡから発生するシグナルをアンカー／プローブコンプレックス１で定義される位置から検出する。あるいはこのｍＲＮＡは領域（ウェル）に加える前または後にインビトロで直接標識できる。あるいは、図１に例示するように、プローブにハイブリッド形成させる前または後にタグをｍＲＮＡに間接的に付けることができ、たとえばＲＮＡをプローブが認識するもの以外の配列に相補性のタグ付「ディテクター」オリゴヌクレオチド（標的特異的レポーターオリゴヌクレオチド）とともにインキュベーションする。例示の実施例では、サンプル１５個を同時に分析できる。本発明では少なくとも２０個またはそれ以上、たとえば１５３６個までまたはそれ以上のサンプルを同時に分析できるので、本発明は非常に処理能の高い検定システムである。
本明細書で使用する「標的」はその存在、活性および／または量の判定が所望され、および所与のプローブに親和性を有する物質である。標的は人工または天然起源の物質であることができる。また、標的は不変の状態でまたは他種の標的との集合体として採用できる。標的は共有結合でまたは非共有結合で結合相手に直接的にまたは特定の結合物質を介して付着できる。本発明に使用できる標的の例には、これに限定するものではないが、次のものを含む：受容体（小胞、脂質、細胞膜または他種受容体上の）；特異的受容体に結合するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト；ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗血清であって、特異的抗原性決定基（たとえばウイルス、細胞または他種物質上の）と反応するもの；薬剤；核酸またはポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡ、ＥＳＴ（発現配列タグ；Expressed Sequence Tags）、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物およびそれらの突然変異体、変異体または一時変異体を含む）；蛋白質（神経伝達物質、プロテアーゼ、キナーゼ、その他の切断の原因となるような酵素を含む）；酵素の基質；ペプチド；コファクター；レクチン；糖類；ポリサッカライド；細胞（細胞表面抗原を含むことができる）；細胞膜；オルガネラ；など、ならびにその他の分子またはその他の物質であって、複合体として、共有結合交差結合体などの形で存在できるもの。本明細書で使用する用語である核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核酸およびオリゴヌクレオチドは互換可能である。標的はまた抗プローブとも呼ばれる。
本明細書で使用する「プローブ」は、たとえば特定の標的が特異的に認識する、分子などの物質である。潜在的プローブ／標的または標的／プローブ結合相手のタイプは、受容体／リガンド；リガンド／抗リガンド；核酸（ポリヌクレオチド）間相互作用、たとえばＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）／核酸、酵素、その他の触媒または多種の物質、基質、低分子またはエフェクター分子；その他を含む。本発明が意図するプローブはこれに限定するものではないが次のものを含む：有機および無機の材料またはポリマー、金属、キレート化剤またはその他の化合物であって、金属と特異的に相互作用するもの、プラスチック、細胞膜受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニスト、トキシンおよび蛇毒、ウイルスのエピトープ、ホルモン（たとえば、オピオイドペプチド、ステロイド、その他）、ホルモン受容体、脂質（ホスホリピドを含む）、ペプチド、酵素（たとえばプロテアーゼまたはキナーゼ）、酵素の基質、コファクター、薬剤、レクチン、糖類、核酸（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたは修飾または置換核酸を含む）、オリゴサッカライド、蛋白質、酵素、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、単鎖抗体またはその断片。プローブポリマーは直線状または環状であることができる。プローブは活性または結合の差によって燐酸化蛋白質と非燐酸化蛋白質との差を識別できる。レクチンのようなプローブは糖蛋白質を識別できる。本明細書で用いる用語「核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核酸およびオリゴヌクレオチド」は互換的である。「プローブ」として上記した物質はいずれも「標的」であることができ、この逆も成立する。
この発明には適応性のある表面を使用できる。表面（通常は固体）は有機または無機の各種の材料またはその組合せのいずれかであることができ、単なる例示としてはポリプロピレンまたはポリスチレンのようなプラスチック；セラミック；シリコン；（融合）シリカ；例えばガラス製顕微鏡スライドグラスまたはカバーグラスなどの厚さをもつことができる水晶またはガラス；濾紙のような紙；ジアゾ化セルロース；ニトロセルロース濾紙；ナイロン膜；またはポリアクリルアミドまたはその他の型のゲルパッド、たとえばエアロパッドまたはエアロゲル製エアロビーズ、これらは高度に多孔性の固体であって、フィルムを含み、ゲルを各種常法のいずれかに従って乾燥すれば製造できる。光学的検出を含む検定を行う時には透光性基質は有用である。この表面はたとえば通常の検出法に適合するいかなる厚さまたは不透明度であることができる。例えば、この表面は厚底、透明または不透明なプレートであることができる。好適な態様では、この表面はプラスチック製の多ウェル表面、たとえば２４−、９６−、２５６−、３８４−、８６４−または１５３６−ウェルプレート（たとえば Corning Costar社の DNA Bind Plate のようなもの）などの組織培養皿など、である。アンカーは表面と直接的に会合、たとえば結合をすることができ、または表面の１つのタイプ、たとえばガラスと会合することができ、それを順にプラスチック製マイクロタイター皿の「ウェル」のような第二の表面に配置することもできる。この表面の形は重要ではない。これは例えば四角、長方形、円形などの平らな表面；湾曲表面；またはたとえばビーズ、粒子、ストランド、沈殿、管、球、その他の三次元表面であることができる。
この表面には空間的に区別され、制御可能で識別可能な領域を有する。各領域にはアンカーのセットを有する。各領域が分離されている様式、物理的性質および相互の相対的方向には重要な意味はない。一態様ではこの領域を液体の通過を妨げる物理的境界によって相互に分離することができる。例えば、好適な態様ではこの領域はたとえば２４−、９６−、２５６−、３８４−、８６４−または１５３６−ウェルプレートなどの多ウェル（たとえば組織培養）皿のウェルであることができる。あるいは、たとえばガラス表面のような表面をエッチングして、例えば８６４個または１５３６個の区別された浅いウェルとすることもできる。あるいは、表面は例えば、たとえばプラスチック、ガラスまたは紙の一片などの平らな表面などは境界またはウェルのない領域を有することができ、また各領域はさらに個々の領域の輪郭を構成する構造（たとえばプラスチックまたはガラスの一片）で覆って規定することもできる。所望ならば、表面には個々の領域輪郭を構成する以前に予めリンカーが付いたアンカーのアレイ１個またはそれ以上を配置することもできる。別の態様では各領域内にあるアンカーのアレイは表面上にアンカーのない空白部分によってまたは液滴の拡散を防ぐためのたとえばワックスまたはシリコンのような化学的境界によって相互に分離することもできる。
さらに別の態様では、各領域はチューブまたは、たとえば Beattie et al (1995). Clin. Chem. 4, 700-706 に記載されているようなたとえば通過（flow through）検定のために設計された流体制御回路によって規定することもできる。チューブはたとえば毛細管または孔がもっと大きいチューブなど、どのようなサイズでもよく；液体が流通でき；または部分的にまたは完全にたとえばアガロースまたはポリアクリルアミドなどのゲルで満たされていてもよく、そのゲルを通じて化合物がたとえば電気泳動などで輸送（通過、流通、加圧輸送）されることができ；たとえば Albota et al. (1998). Science 281, 1653-1656; Cumpston et al. (1998). Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 488, 217-225; and/or Cumpston et al. (1999). Nature 398, 51-54. に記載されている線形チャネルなどのチャネルの空間充填マトリックス（space-filling matrix）で満たされることもできる。このような空間充填マトリックスでは、液体および／またはその中の分子はチューブの壁に垂直な方向に流れるばかりでなく、横方向に拡散することもできる。好適な一態様では、チューブをゲルまたは空間充填マトリックスで満たす；このゲルまたは充填マトリックスを活性化してアンカーを結合させ、異なるアンカーを順次に通して、ゲル内に各アンカーのアレイ（たとえば線形アレイ）を形成させ；そしてリンカー、標的、その他を逐次に流す。このアレイは線形、２次元または３次元でありうる。
チューブ１つに複数のアレイを形成できる。例えば、チューブ内にあるアンカーまたはリンカーの会合したアンカーの単一アレイは同一または異なるサンプルの逐次的な検定では再使用できる（たとえば除去後再使用または再設計）。別な一態様では、たとえば目的とするサンプルを異なるアレイを含む複数のチューブで分析するなど、複数のチューブを単一の検定に使用する。チューブ内のアンカーおよびアンカー／リンカー会合体は本明細書に記載するいかなる型のものであってもよい。
表面内または表面上の領域は表面自体の改造によっても規定できる。例えばプラスチック表面に改造または誘導体化したプラスチックでできた部分を有することができ、これを使用してたとえば特定な型のポリマーを加える部位とする（たとえばＰＥＧをポリスチレン表面に付着させることができ、次にそれをカルボキシル基、アミノ基、二重結合、アルデヒド、その他で誘導体化できる）ことができる。あるいは、プラスチック表面にたとえば突起部またはバンプのようなアンカーが付く基盤に用いることができる成型構造を有することができる。別の一態様では、各領域はたとえばポリアクリルアミドゲルパッドまたはエアロパッドのようなゲルパッドであることができ、このゲルパッドはたとえばガラスのような表面上に所望のパターンに従って配置するか、またはたとえばガラス板と水晶板のような二表面間にサンドウィッチすることができる。アンカー、リンカーなどをこのようなパッドの表面に固定化するか、またはパッドの中に埋め込むことができる。表面上のゲルパッドの配置には他に多種あり、当技術分野の熟練者には明白であり、常法によって製造できることになろう。試験領域の相対的方向はどのような形でもよく、これに限定するものではないが、正方形または長方形またはその他の表面内にある平行または垂直のアレイ；または円形その他の表面に放射状に伸張するアレイ；または直線状アレイ；その他を含む。
本発明の空間的に区別された領域には複数のコピーが存在できる。すなわち、少なくとも２個、好ましくは少なくとも２０個、または少なくとも約２４、５０、９６、２５６、３８４、８６４、１５３６、２０２５個またはそれ以上などの実質的に同一な、空間的に区別された（別々の）領域を存在させる。反復領域数の増加はさらに高度な検定処理能を可能にする。本明細書で使用する「実質的に同一な領域」は、アンカーおよび／またはアンカー／リンカー複合体の同一または実質的に同一なアレイを有する領域を示す。本明細書で使用する「実質的に同一」はアレイまたは領域に他のアレイまたは領域とこの発明による標的分析の意味において本質的に同じ機能が意図されていることを意味する。小さなヌクレオチド欠陥（欠失／挿入／置換）またはオリゴ欠陥（表面結合の不足）などに基づいて機能、すなわち標的検出能に検定の正確さの範囲を超えて標的の判定結果に明確に本質的な影響がない相違がある。
勿論、当業者は表面上の全ての領域が相互に実質的に同一である必要はないことを認識するであろう。例えば異なる組合せのアレイ２個を並行して試験するならば、アレイの組合せ両方を一つの表面上に含めるのが有利であろう。例えばアレイの組合せ２種を相互の比較を促進するために交互の縞模様に配置できる。別な一態様では専門家は表面上で他の領域と区別でき、「登録領域」として使用できる領域を含めることを望むかもしれない。例えば登録領域は走査検出装置が表面上の各領域の場所を整列する「出発点」として認識できる蛍光性分子の明瞭なパターンを表示するオリゴヌクレオチドまたはペプチドを有することができる。
試験領域の大きさと物理的な間隔は重要ではない。典型的な領域では面積は約１〜約７００ｍｍ２、好ましくは１〜約４０ｍｍ２であり、間隔は約０.５〜約５ｍｍ離れており、使用する面積に依存して常法によって選択できる。好適な態様では各の領域は約５ｍｍ離れている。例えば各領域はたとえば８行６列の長方形格子を有してもよく、アンカーのスポットは直径約１００μｍのほぼ円形で、５００μｍの間隔を有し、このような領域は面積約２０ｍｍ２を占める。領域面積および間隔の大きいものも小さいものも含まれる。
この領域は領域内のアンカーの一部または全部を隣接するアンカーからたとえばくぼみまたはへこみなどによって物理的に分離されるようにしてさらに分割できる。例えば、領域内の副区分（副領域）は約１０〜約１００個以上またはそれ以下の範囲内にできる。一態様では、１５３６ウェル皿のウェルである領域を、たとえば約４〜９００個、好ましくは約１６〜約３６個の小さなウェルとしてウェル内ウェルの一アレイを形成するようにさらに分割できる。図４参照。このような刻みのある表面は単一アンカー（または一群のアンカー）の各指定位置（locus：ロカス）への物理的配置に必要な許容量を低下させ、またアンカーを含む領域のサイズはより均質になり、そのためプローブに結合した標的の検出が促進される。
本明細書で使用する用語「アンカー」はたとえば分子などの存在または物質を示し、これは表面に会合（たとえば固定化または共有結合的または非共有結合的に付着）するか、またはそのような表面の一部（たとえばプラスチック表面の誘導体化された部分）であって、リンカーまたは本明細書に記載する他の物質と特異的相互作用または会合をすることができる。たとえばリンカー分子に付着するアンカーの部分は直接表面に会合できるか、またはアンカーは中間に「スペーサー」部分を有することができる。このようなスペーサーはたとえば当業界で常用されている各種材料のどのような材料でもよい。一態様では、スペーサーは炭素を５〜２０個、好ましくは炭素を約１２個有する線状の炭素分子である。別な一態様では、このスペーサーは核酸（本明細書に記載するいかなる型のものでもよい）であるが、これはたとえばリンカー分子と特異的な相互作用または会合を行わない。
本明細書に使用する用語「アンカー」は一群の実質的に同一なアンカーを示すこともできる。たとえば図７を参照。この図は多数コピー（「群」）存在するアンカー３種（Ａ、Ｂ、Ｃ）を含む試験領域の図式的に表示である。アンカーの各群の場所を、本明細書では「ロカス」と命名する。当業界でよく知られているように、ロカスに存在する個々のアンカー分子の数はたとえばアンカーのサイズなどによって導入される物理的制約によって限定される。例えば直径約２５〜２００μｍのロカスではアンカー数百万個を含むことができる。
本明細書で使用する「アンカー／リンカー複合体」はアンカーとリンカーが特異的様式の分子会合を介して結合する時に生成する。リンカーとのこの相互作用はある種の共有結合を介するような不可逆的なものでもたとえば核酸のハイブリッド形成を介するような可逆的なものであってもよい。
好適な一態様では、アンカーは核酸であって、いかなる長さ（たとえばオリゴヌクレオチド）またはタイプ（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ分子のＰＣＲ産物など）であることもできる。この核酸には修飾または置換（たとえばイノシンのような非天然起源ヌクレオチド；たとえばスフファメート、スルファミド、ホスホロチオネート、メチルホスホネート、カルバメート、その他のような様々な既知の結合を介して結合しているもの；またはたとえばＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体などのような半合成分子）をすることができる。一本鎖核酸は好適である。
核酸アンカーは本発明に適応するいかなる長さでもよい。例えばこのアンカーは長さが約８個〜約５０個のヌクレオチド、好ましくは約１０、１５、２０、２５または３０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドであることができる。別の一態様では、このアンカーは長さ約５０〜約３００ヌクレオチドまたはそれ以上またはそれ以下、好ましくは約２００〜約２５０ヌクレオチドであることができる。例えばアンカーは前記の約１５０〜約２００ヌクレオチドの「スペーサー」核酸を有することができ、また、スペーサーに隣接してリンカー分子（リンカー特異的配列））と相互作用するように設計された、たとえば長さ約１０、１５、２０、２５または３０ヌクレオチドの短い配列のヌクレオチドを含むことができる。本発明での機能があればこのようなスペーサーの長さまたは型はどのようなものでもよく、いかなる塩基組成でもよい。好適な態様では、ロカスにある各アンカーのスペーサーおよび／または領域の中の異なるロカス内アンカーのスペーサーは実質的に同一であって；アンカーは主としてリンカー特異的配列について相互に異なっている。
スペーサーはパフォーマンス改良を可能にして、アンカーに利点を与えることができる。例えば、そのようなアンカーのこのリンカー特異的部分は表面から離れて存在するので、表面に近い場合よりも物理的拘束が少ないので表面に近い場合よりも立体障害が少ない。これが、例えば所与のロカス内にあるアンカーと、複数の異なる標的特異性を持つ、異なるリンカー（たとえば約２〜約１００）との会合を促進する。以下に詳記するように個々のアンカーは（スペーサーに加えて）、たとえば縦列様式などで配置された複数のリンカー特異的配列を有することができ；これが型の異なるリンカー複数と所与のロカス内にある少なくとも１つのアンカーとの会合を可能にする。また別の方法も以下に詳記するが、この方法では型の異なるリンカー複数と所与ロカス内にあるアンカーとが「混合ロカス」で会合でき、アンカー２種またはそれ以上が各々標的特異性の異なる互いに異なるリンカーと会合する。スペーサーを含むアンカーの物理的柔軟性の故に所与のロカス内にあるアンカーは隣接するアンカー分子に物理的束縛を受けることなしに容易に複数の異なるリンカー分子と結合できる。所与のロカス内で複数のリンカー分子をアンカーに結合させる利点は特定ロカス内にある標的多数の検出が可能になる点にある。一態様では所与のロカス内で結合したリンカー複数が目的とする同一標的核酸の異なる部分（たとえばその核酸内の異なるオリゴヌクレオチド配列）に特異的であるプローブを有する。これで単一プローブによる検出と比較して増幅された標的検出が可能になる。別な一態様では複数のリンカーはたとえば無関係な異なる標的に特異的なプローブを持つ。これにより特定ロカス内の異なる標的複数の検出を可能になる。スペーサーを含むアンカーのさらに別な利点は、たとえば蛋白質のような比較的高分子に会合しおよび／またはたとえば蛋白質、膜または細胞のように比較的大きな標的に結合するリンカーを容易に収容できる点にある。
核酸アンカーの塩基組成には必ずしも拘束されない。アンカーが本発明の目的に機能する限り、どのようなアンカーの塩基組成も許容可能である。例えば領域内のあるロカスまたは異なる複数のロカス内にある一本鎖核酸アンカーは部分的または完全にランダムな配列（例えばＡ、Ｇ、Ｔおよび／またはＣの相対的な量について限定なくランダムに作製した配列）を有することができる。一態様ではこのアンカーは「配列異性体」（たとえば「ランダム配列異性体」）ではない；すなわち、オリゴヌクレオチドがＧ、Ｃ、ＡおよびＴの量は同一であるが相対的順序が異なるものではない。すなわち、例えば一領域の異なるロカスにあるアンカーが等式 Ｇｎ Ｃｎ Ａｍ Ｔｍ［式中、ｎとｍとは整数である］に合致しない。たとえば実施例１に示すランダム配列異性体でないアンカーを参照。本発明のこのアンカーではＧとＣの量は必ずしもほぼ同じではなく、またＡとＴの相対的な量も同じでもない。さらに、Ｇ、Ｃ、ＡおよびＴの相対量の合計にも必ずしも拘束がない。例えば領域内にあるアンカーの塩基組成は比較的ＧＣ豊富（すなわち、５０％Ｇ＋Ｃ以上）から、Ｇ、Ｃ、ＡおよびＴの等量から、相対的にＡＴ豊富（すなわち、５０％Ａ＋Ｔ以上）の範囲内にあることができる。一態様ではこのアンカーはたとえばＧ、Ｃ、ＡおよびＴの相対量に何らの拘束もない様式でランダムに作製される。
核酸スペーサーおよびリンカー特異的部分１個またはそれ以上を有するアンカーは塩基組成の特定の拘束に合致するとは思われない。例えば、ある領域の異なるロカス内にあるアンカーが実質的に同一な（たとえば実質的に同一な２５量体または２００量体）スペーサーを持つが、各アンカーが異なるリンカーに特異的な部分（たとえば２５量体）を持つならば、リンカー特異的部分が特定の要件に合致するとしても（たとえば、ＡとＧの数が大体同じであり；ＴとＣの数が大体同じであり；オリゴが等式Ｇｎ Ｃｎ Ａｍ Ｔｍに合致し；および／またはＧ＋Ｃの含量が特定の要件を満足する）、このアンカーは全体としてこれらの特定の要件を満足しないであろう。同様に、領域内の異なるロカスにあるアンカーのリンカー特異的部分が互いに実質的に異なる（たとえば各リンカー特異的部分が領域の相互にリンカー特異的部分から少なくとも約２０％または５０％または８０％異なる配列を持つ）としても、核酸全長を考えればアンカーの配列全体の同一性ははるかに小さい。例えば、各アンカーが実質的に同一な２５０量体のスペーサーおよび２５量体のリンカー特異的部分とを有し、そのリンカー特異的部分とその領域の別な各リンカー特異的部分とが１００％異なっていれば、そのアンカーは互いに１０％異なることになる。
アンカーはペプチドまたは蛋白質であることもできる。例えばアンカーはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体分子またはその断片、またはその単鎖抗体またはその断片であることができ、これは抗原または抗―抗原分子であるリンカーの一部分に特異的に結合する；表面的にはアンカーはペプチドであることができ、それに結合するリンカーの部分は抗体などであることができる。別な態様では、アンカーは特定の炭水化物に特異的なレクチン（たとえばコンカナバリンＡまたは、たとえばリムルス、ピーナッツ、ヤエナリ、ゴガツササゲ、麦芽、その他のような生物体から得たアグルチニン類）であることができる。別な態様では、アンカーはたとえば特異的なオリゴヌクレオチド固相化学合成の基盤などとして役立つことのできる修飾されまたは誘導体化されたプラスチックポリマーのような有機分子を有することができる。この場合、誘導体化されたプラスチックは製造過程でコンビネーションのプラスチック表面に全体的に形成された区別され、誘導体化されたロカスのアレイとして配置できる。別の態様では、アンカーはたとえばＮｉ、Ｚｎ、Ｃａ、Ｍｇ、その他の金属イオンと特定な蛋白質またはキレート剤との間の特異的または優先的結合を利用できる。例えばアンカーがポリヒスチジン、リンカーのアンカー特異的部分がニッケルであって、リンカーはニッケルキレート化剤を介して標的特異的プローブに付着することができる。あるいはキレート形成剤がアンカー、ポリヒスチジンがプローブ関連部分となることができる。あるいはアンカーは無機物質を含むことができる。例えばカルシウムまたはマグネシウムのような金属を含むことができ、リンカーのアンカー特異的部分は標的特異的プローブに付着するたとえばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのような優先的キレート化剤であることができる。熟練した当業者はたとえばプローブおよび標的に関連して記載した一般型のような広範な他の型の分子をアンカーとして役立てることができることを認識するであろう。
アンカーはたとえば二重鎖ＤＮＡまたは本明細書に記載するいずれかの様式で特異的に相互作用するたとえばＤＮＡと蛋白質などを含む二重鎖のようなハイブリッド構造であることもできる。例えば二重鎖アンカーの「基礎部分」（表面と直接接触する部分）は所望なら加工された一本鎖核酸を含むことができ；好ましくはこの基礎部分もたとえば前記したような線状炭素スペーサーのようなスペーサーを含むことができる。一態様では、第二の一本鎖核酸はこの基礎部分に会合（たとえばハイブリッド形成）して、少なくとも部分的な二重鎖核酸を有するアンカーを形成する。例えばこの基礎部分は一端で表面に付着し、他端で約１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは約２５ヌクレオチドの単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに付着する線状炭素スペーサーを有し；およびこの二重鎖の第二部分は該基礎部分の少なくとも一部に相補的な配列（たとえば末端まで約４０ヌクレオチド）、続いて任意のスペーサー（たとえば約５〜１５、好ましくは約１０ヌクレオチド）、続いてリンカー特異的配列（たとえば長さ約８〜約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５，２０，２５または３０ヌクレオチド、最も好ましくは約２５ヌクレオチドの配列）を有することができる。
アンカー二重鎖の相補性部分とそのリンカー特異的配列との相対的長さおよび塩基組成は検定の必要に適合させて当技術分野で常用の最適化操作を用いて変化させることができる。例えば二重鎖アンカー自体には影響がないような条件下に二重鎖アンカー分子からリンカーを解離（たとえば融解して分離）できるように配列を選択できる。次に所望ならば残存する二重鎖アンカーアレイは同一または異なるリンカー分子とハイブリッド形成させて再使用できる。あるいは、アンカー／リンカーハイブリッドおよび二重鎖アンカーの相補性部分２個を同じ条件下に解離して表面と接触している基礎部分のみを残すように配列を選択することができる。一態様ではある領域の特定のロカスまたは全ロカスにある塩基部分の全てまたは実質的に全てが同一であるか、または実質的に同一である。このような解離後に残る基礎部分のアレイは二重鎖アンカーの相補性部分を最初に戻せば再使用（たとえばリンカー分子にハイブリッドを形成するため）できるが、この操作には二重鎖形成に関与する基礎部分の配列についての知識が必要である。アンカーのアレイを製造する性能は、基礎部分の配列を熟知していない使用者による再使用が出来てもできなくてもそのようなハイブリッドアンカーを採用する利点の一つである。例えば製造者はアレイの未承認再使用を予防できる。そのような再使用防止で例えば使いすぎに起因するパフォーマンス低下および不信頼性の問題を未然に防ぐことができる。
一態様では領域の所与のロカス内にある一群のアンカーは実質的に同一である（たとえばリンカーの一つのタイプにある「アンカー特異的な」部分に特異的であるか、または標的一つのみに特異的である）。図７参照。別な態様では、複数の異なるリンカーおよび／または複数の異なる標的に対して特異的な複数の異なるアンカーを「混合ロカス」と称するロカス内に存在させる。ここにアンカーは、例えば約２から約１００個、例えば少なくとも約２個、少なくとも約４または少なくとも約１０個である。混合ロカスの利点は特定ロカス内にある検出すべき、異なる標的の数を増加できることにある。一態様では各混合ロカスは全てまたは少なくともいくつかのロカスに共通なアンカーを含む。例えば、ロカス１個以上に共通のアンカーを用いて品質の保証および／または制御またはシグナル標準化ができる。
勿論、「混合ロカス」には単一（非反復）領域のみを持つ表面についての利点もある。そのような単一領域の各ロカスにあるアンカーはリンカーまたは目的とする標的と直接に相互作用できる。
試験領域内にあるアンカー（すなわち個々のロカスにあるアンカー群）の数は少なくとも２個、好ましくは約８〜９００個（それ以上またはそれ以下も含む）、より好ましくは約８〜３００個、最も好ましくは約３０〜１００個（たとえば約６４個）である。ある好適な態様では、試験領域（たとえばウェル）９６個を持つ表面に試験領域１個当りアンカー約１６、３６、４５または１００個、または試験領域（たとえばウェル）３８４個を持つ表面に試験領域１個当りアンカー約９、１６または２５個を有する。最も好適な態様では試験領域内の各アンカーは、アレイ内にある他のアンカーとは異なる特異性を持つ。しかしながら、アンカー２個またはそれ以上は同じ特異性を共有することもでき、また、アンカー全てが同一であることもできる。本発明のコンビネーションにおいて多数の被検サンプルを一度に処理するために試験領域の数を非常に大きくした一態様（たとえば約８６４、１５３６個またはそれ以上）では、これらのサンプルをパラメータ少数（たとえば約２、４、６または９個）のみについて試験するのは注目に値する。換言すれば、領域数が非常に大きいコンビネーションでは、領域当りアンカーを約２〜９個にするのが有利であろう。
試験領域内または試験領域中のアンカーの物理的間隔および相対的方向（すなわち各ロカスのアンカー群）は限定的なものではない。典型的にはアンカー間の距離は約０．００３〜約５ｍｍまたはそれ以下、好ましくは約０．０３〜約１ｍｍである。アンカーの間隔（および面積）としてはさらに大きいものも小さいものも含む。アンカーは相互の方向および領域の境界に関していかなる方向にも配置できる。例えばアンカーは二次元方向、たとえば正方形、長方形、六角形、またはその他のアレイにまたは、アンカーを中心から放射線に沿って配置するか同心円に沿って配置する円形のアレイに配置できる。アンカーは一次元線形アレイにも配置できる。例えば、オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ配列に沿った特定の位置でハイブリッドを形成させて分子上アレイを形成するか、または通過ゲル中の線状配置、または通過装置または通過装置内の構造の表面上に配置することができる。あるいはアンカーは「バーコード」様の構成にすることもできる（図６参照）。例えばアンカーを互いに平行な長い線状に構成できる。各長い線の幅または線相互の間隔を通常の方法で変化させて、たとえば第１線および第３線を他の線より２倍の大きさとしたり、線を省略したりして、「バーコード」様の単純な認識可能なパターンとすることもできる。最終線の後に空白の線を置いて試験領域の境界を示すこともでき、また次の試験領域でバーコード模様を反復することもできる。
アンカーのパターンを別々の検定ウェル（試験領域）または別々の検定液滴の位置を示す厳密な設定を記録する必要はない。用語「検定位置」は検定表面上にあり、検定サンプルを加える位置を示すために使用する（これは検定サンプルの別々な液滴の位置としてまたは例えば多ウェルプレート上にある各検定ウェルを規制する壁または障壁の位置として定義できる）。アンカー模様それ自体（たとえばオリゴヌクレオチドアンカーの「バーコード」様の模様）を（丁度、バーコードの各線が他の線との相対的位置によって認識できるように）パターン認識によって各アンカーの位置を定義するために使用する。それ故、最初のアンカーを各検定位置の一端または一隅に置く必要はない。最初のアンカーは検定の位置ではなく、パターン認識によって見出される。各検定位置が使用する面積（例えば液滴の面積またはウェルの面積）がアンカーの反復パターンの全ユニット少なくとも１個を確保する大きさである限り、各検定位置はパターンが検定位置の面積内にあればサンプルパターン（バーコード）が特定する標的全ての検定位置を試験することになる。
各アンカーは各試験領域内に厳密なまたは固定したパターンで配置する必要はない。例えば各アンカーを試験領域内では不規則な位置を想定される粒子、ビーズ、その他に付着させてもよい。各アンカーの位置は、たとえば検出タグを用いて判定できる。例えば、各アンカー型に特異的なリンカー分子は異なる蛍光タグ、発光タグ、その他のタグで標識でき、特定のリンカー／アンカーのペアを含む粒子の位置はたとえば励起スペクトルまたは放射スペクトルなどリンカーから発生するシグナルの性質によって確認できる。熟練した当業者は識別可能なスペクトルを持つ様々なタグが付着したリンカーのセットを製造できる。あるいはアンカーを直接標識できる。例えば各タイプのアンカーは他の型のアンカーとはスペクトルが異なる蛍光を示すタグで標識できる。あるいは、粒子、ビーズ、その他のサイズまたは形を相互に変えることもできる。本明細書に記載する標識方法および検出方法は何れも採用できる。例えば蛍光はＣＣＤ撮像システム、走査蛍光顕微鏡または蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）によって測定できる。
アンカーはリンカー分子の一部（アンカー特異的部分）と特異的に相互作用または会合できる。用語「相互作用」または「会合」は本明細書では物質または化合物２種（たとえばアンカーとリンカーのアンカー特異的部分、プローブとその標的、または標的と標的特異的レポーター）が目的とする検定を行うのに十分な状況で相互に結合（たとえば付着、結合、ハイブリッド形成、接合、アニーリング、共有結合、連結、または会合）することを意味する。用語「特異的な」または「特異的に」は本明細書では２種の成分（たとえばアンカーとリンカーのアンカー特異的領域、プローブとその標的、または標的と標的特異的レポーター）が互いに選択的に結合するが、保護技術不在下には一般には対象とする成分との結合を意図していない他の成分とは結合しないことを意味する。特異的相互作用を達成するために必要なパラメータはたとえば当業界での常法を用いて判定できる。
核酸については、例えば当技術分野の熟練者は核酸（たとえばオリゴヌクレオチドアンカー）と他の核酸（たとえばリンカーのアンカー特異的部分）とのハイブリッド形成を他の物質または分子（たとえば他のオリゴヌクレオチドリンカー）との非特異的ハイブリッド形成を削減するように選択したストリンジェンシー条件下に可能にする特性（たとえば長さ、塩基組成および相補性の程度のような）を実験的に判定できる。典型的にはアンカーのＤＮＡまたは他の核酸配列、リンカーの一部分、またはディテクターオリゴヌクレオチドは、その結合相手と十分な相補性を有し、選択したストリンジェンシーのハイブリッド形成条件下のハイブリッド形成を可能にし、そのＴｍは室温よりも約１０〜２０℃高い（たとえば約３７℃）。一般にオリゴヌクレオチドアンカーは長さ約８〜約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５、２０、２５または３０ヌクレオチドの範囲内にあることができる。本明細書で使用する「高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件」はハイブリッド形成が両核酸間のヌクレオチド相補性（同一性）が少なくとも９５％、好ましくは約９７〜１００％である時に起きる条件のいずれかを意味する。しかし所望の目的に依存して、たとえば約９０％、８５％、７５％、５０％、その他、必要な相補性が低いハイブリッド、形成条件を選択することもできる。変更可能なハイブリッド形成反応パラメータの中には、塩濃度、緩衝液、ｐＨ、温度、インキュベーション時間、たとえばホルムアミドのような変性剤の量と型がある （たとえば Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, New York; Hames et al. (1985). Nucleic acid hybridization, IL Press; Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New Yorkを参照）。例えば、核酸（たとえばリンカーオリゴヌクレオチド）を試験領域（たとえば多ウェルプレートのウェル、好適な態様では９６穴、３８４穴またはそれ以上のウェルプレート）に、約０．１〜約１００μＬまたはそれ以上の範囲の容量（好適な態様では約１〜約５０μＬ、最好適には約４０μＬ）で、約０．０１〜約５μＭ（好適な態様では約０．１μＭ）の範囲の濃度で、例えば６×ＳＳＰＥ−Ｔ（０．９Ｍ−ＮａＣｌ、６０ｍＭ−ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ−ＥＤＴＡおよび０．０５％トリトンＸ−１００）などの緩衝液中で添加し、また約１０分間〜少なくとも約３時間（好適な態様では少なくとも約１５分間）、約４〜約３７℃（好適な態様では約室温）の範囲の温度で結合相手（たとえば表面上のオリゴヌクレオチドアンカー）とハイブリッドを形成させる。高処理能を可能にする条件も選択できる。本発明の一態様では、反応条件を生理的条件に近似させる。
たとえばアンカーまたはリンカーの一部分として役立つ他の型の物質または分子（たとえば、ポリペプチド、レクチン、その他）の設計および結合相手との特異的相互作用を達成するために必要な反応条件は当技術分野では慣例的な常法である（たとえば Niemeyer et al (1994) Nucl. Acids Res. 22, 5530-5539; Fodor et al (1996) U.S. Patent No. 5,510,270; Pirrung et al (1992) U.S. Patent No. 5,143,854の記載など）。インキュベーション用パラメータには、緩衝液、塩濃度、ｐＨ、温度、インキュベーション時間、担体の存在および／または非特異的相互作用削減する試薬または条件、などがある。例えばアンカーとして抗体を入れた試験領域（たとえば、多ウェルプレートのウェル、好適な態様では９６ウェルまたは３８４ウェルまたはそれ以上のプレート）に抗−抗体（たとえば抗原または抗体特異的二次抗体）を、例えば６×ＳＳＰＥ−Ｔ、ＰＢＳまたは生理的食塩水のような緩衝液中、容量約０．１〜約１００μＬまたはそれ以上（好適な態様では約１〜約５０μＬ、最も好ましくは約４０μＬ）の範囲で、濃度約１０ｐＭ〜約１０ｎＭ（好適な態様では約１ｎＭ）の範囲で加え、表面上のアンカーとともに約１０分間〜少なくとも３時間（好適な態様では少なくとも約１５分間）、温度約４〜約４５℃（好適な態様では約４℃）でインキュベーションする。ペプチドアンカーとしては約５〜約２０アミノ酸の長さが好適である。
本発明の態様では、アレイ内の各アンカーと対応するリンカーのアンカー特異的部分とはアレイ内の他種アンカーと実質的に同程度に選択した条件下に相互作用できる。これでアンカーが実質的に均質なリンカーのアレイ、すなわちプローブを特定することを確実にする。
試験領域内にあるアンカー（すなわち個々のロカス内にある一群のアンカー）は「一般的な」セットであることができ、そのアンカーは各々、そのアンカーに特異的な部分を有するが「プローブ部分」が異なる様々なリンカー１個またはそれ以上と相互作用できる；そこで一般的アンカーの一つのアレイを用いてプローブのセットを計画し、規定することができる。このようなアンカーの一般的検定の柔軟性は図１と図２に例示することができる。図２はこの例ではオリゴヌクレオチドでありうる異なるアンカー６個のアレイを含む試験領域１５個の表面を例示する。図１はこの（オリゴヌクレオチド）アンカーであるアンカー１を図式的に説明する。アンカー１はリンカー１と接触しており、リンカー１の一部はアンカー１に特異的な第一部分および標的ｍＲＮＡ１に特異的な第二部分を有する。あるいは、たとえばリンカー１と同様にアンカー１に特異的な部分を有するが、標的ｍＲＮＡ１の代わりに標的ｍＲＮＡ２に特異的な第二部分を有するリンカー２に置換することができる。そこで、アンカー１を用いて標的ｍＲＮＡ２個またはそれ以上の各々に対するプローブを特定（計画、規定または判定）できる。オリゴヌクレオチドまたはペプチドの高解像度なパターン（アレイ）を作製し、付着させる過程は高価で、時間がかかりおよび／または物理的に困難である。アンカーの既製アレイを使用して広範なプローブアレイを計画する能力はこの発明の一利点である。
図２に示す一般的なアンカーはオリゴヌクレオチドプローブのパターンを規定するが、同一のアンカーアレイを用いて例えば受容体蛋白質（図３参照）のような別なプローブのアレイも計画できる。たとえば蛋白質／抗体の組合せのような「サンドウィッチ」または「ピギーバック」プローブなどさらに複雑な層などのアンカー／リンカー相互作用の型の範囲が与えられれば明らかに、多数の変形が可能である。例えば一態様ではアンカーの一般的セットをリンカーのセットと会合（共有結合または非共有結合で）させて以下に詳記するようにして「複合」アンカーの変形アレイを形成することができる。そこで、本発明アンカーの表面自体は新規な利点を提供する。
本発明の一態様では、アンカーは可逆的にリンカーと相互作用し、そこでアンカーの一般的セットを再使用して多種のプローブセットを計画できる。例えばオリゴヌクレオチド２個が解離を起こす加熱工程によってオリゴヌクレオチドアンカーをリンカーのオリゴヌクレオチド部分から分離し、次に第二のリンカーに再結合させることができる。高価で、製造に時間がかかり、および／または製造が物理的に困難なアンカーアレイを再使用できる性能は、本発明の利点の一つである。
アンカーは必ずしもリンカーと相互作用する必要はない。例えばアンカー（直接または間接に）はたとえばフルオロクロームのような検出可能な分子と結合させることができ、そこでたとえば試験表面と検出器との間の設定を記録する目的でグリッド内のスポット位置を検出するために役立てることができる。あるいは、たとえば補正の目的で内部定量マーカーとして役立てるようにアンカーを所定量の検出可能な分子を用いて標識できる。
本明細書で使用する用語「リンカー」は双官能性物質を示すがこの物質は選択（指定）されたアンカーまたはアンカーのサブセットに特異的な（「アンカー特異的」）第一部分（または場所または区分）および目的とする標的に特異的なプローブ（「標的−特異的」）を有する第二部分を有する。リンカーのこの二つの部分は共有結合または非共有結合を介して付着でき、または直接にまたは中間物を介して（たとえばスペーサー）付着できる。
リンカーにあるアンカー特異的部分の化学的性質は勿論アンカーまたはそれが相互作用するアンカーの関数である。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドならば、これと相互作用するリンカーの一部分は例えばオリゴヌクレオチドに特異的に結合するペプチドまたは選択したストリンジェンシーのハイブリッド形成条件下に効果的かつ特異的にハイブリッドを形成する核酸であることができる。この核酸はたとえばオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＰＣＲ産物または置換または修飾核酸（たとえば非天然起源ヌクレオチド、たとえばイノシン；たとえばスルファメート、スルファミド、ホスホロチオネート、メチルホスホネート、カルバメートのような既知の様々な結合を介して結合；またはたとえばＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体のような半合成分子、などを含む）であることができる。一本鎖部分構造は好適である。オリゴヌクレオチドアンカーに特異的なリンカーの部分は長さ約８〜約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５、２０、２５または３０ヌクレオチドの範囲にあることができる。アンカーが抗体であれば、これと相互作用するリンカーの部分はたとえば抗−抗体、抗原またはアンカーと特異的に相互作用するこれら分子の小さな断片であることができる。前記した他の型のアンカーと特異的に相互作用し、またリンカーでアンカー特異的部分としての役目を果たす物質または分子は当技術分野でよく知られており、通常の操作（たとえば前記）を用いて設計することができる。
リンカーの標的特異的部分の化学的性質は勿論それがプローブとして相互作用すべき対象である標的の関数である。例えばこの標的が特定のｍＲＮＡであれば、リンカーの標的特異性部分は選択したハイブリッド形成条件下に特異的に標的に結合するが、妨害するＲＮＡまたはＤＮＡには結合しない、たとえばオリゴヌクレオチドであることができる。当技術分野の熟練者は業界で認められた方法を用いて、非特異的な妨害性ＤＮＡまたはＲＮＡ（たとえば前記）とのハイブリッド形成を最低にしたままで標的と最適にハイブリッド形成すべきオリゴヌクレオチドの特性を実験的に判定できる。一般に大過剰な非標的ＲＮＡバックグラウンド内に存在する標的ｍＲＮＡを識別するために使用するオリゴヌクレオチドプローブは長さ約８〜約５０ヌクレオチド、好ましくは約１８、２０、２２または２５ヌクレオチドの範囲内であることができる。競合する標的のバックグラウンドが大きくない生化学的検定に使用するオリゴヌクレオチドプローブは短くすることができる。業界で認められた操作（たとえばコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ）を用いて配列が相互に無関係であり、既知遺伝子データベースの潜在的に妨害する配列とは類似しないようにオリゴヌクレオチドプローブの配列を選択できる。オリゴヌクレオチドプローブとＲＮＡの特異的なハイブリッド形成を可能にするハイブリッド形成条件の選択は業界で認められている操作（たとえば前記参照）を用いて常法で判定できる。例えば、標的ＲＮＡ［たとえば多ウェルマイクロプレート（たとえば９６〜３８４ウェルまたはそれ以上）のウェルのようにいかなる容器中でもよいが、たとえば増殖した組織または細胞（所望ならば目的とする薬剤で処理）から抽出した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ］をたとえば６×ＳＳＰＥ−Ｔ、その他の緩衝液中、要すれば非特異的結合を削減する試薬（たとえば鰊または鮭分解精子ＤＮＡまたは酵母ＲＮＡ約０.５ｍｇ／ｍＬ）とともにオリゴヌクレオチドプローブアレイ（前記）を含む試験領域に加え、実験的に決めた温度で約１０分間〜少なくとも１８時間の範囲（好適な態様では約３時間）でインキュベーションすることができる。このハイブリッド形成のストリンジェンシーはアンカーとリンカーのアンカー特異的部分とを会合させるために採用したストリンジェンシーと同じまたはそれ以下とすることができる。たとえば前記のように別なタイプのプローブの設計と使用は当業界で常用されているものである。
一態様では、所与ロカス内のアンカーと会合するリンカーの全部または実質的に全部が同一な（または実質的に同一な）プローブを含み、これは単一な目的とする特異的標的に特異的である。別な一態様では、所与ロカス内のアンカーと会合するリンカー１個またはそれ以上は異なるプローブ複数を有し、複数の異なる標的に対して特異的である。これらプローブはリンカー内に分枝構造の一部として存在することができ、または好ましくは線形に並び；同じ材料（たとえば全部が核酸または全部がペプチド配列）であるかまた様々な材料の組合せであることができる。事実、各リンカーにプローブが多数あると、特定のロカス内で検出できる標的の数が増加する。一態様では、所与のリンカー上にある複数のプローブは全て目的とする特定の標的に対して特異的である（たとえばそれらは目的とする単鎖ｍＲＮＡの異なる部分に特異的であるか、またはそのｍＲＮＡの対応する、異なる部分のヌクレアーゼ保護断片に対して特異的である）；その結果標的に対する検定の感度が向上し、たとえばサンプル内存在度の低い標的への使用が可能になる。リンカー上にあるプローブの数はたとえば約２〜５０個、好ましくは約２、４または１０個である。
勿論、異なるプローブ複数を有するリンカーは一重の（非反復）領域のみを含む表面で使用するために有利である。
リンカーのアンカー特異的部分および標的特異的な部分は様々な共有結合または非共有結合のいずれかによって結合（付着、連結）していてもよく、結合の性質は本発明にとって本質的でない。両部分は直接結合しても中間分子を介して結合してもよい。リンカーの両部分がオリゴヌクレオチドである一態様では、両部分がホスホロジエステル結合のような共有結合で結合して単一なコリニア核酸を与える。アンカー特異的部分がオリゴヌクレオチドであり、標的特異的部分が受容体蛋白質のような受容体である他の態様では、両部分はビオチンとストレプトアビジン分子との相互作用を介して結合できる。その例を図３に示す。そのような結合の変種は多数が知られている（たとえば Niemeyer et al (1994) NAR 22, 5530-5539 参照）。あるいはこの両部分は直接結合でき、たとえばオリゴヌクレオチドをアミド化し、次にアミド結合を介してペプチドまたはプロテインと直接結合する（たとえば交差結合）か、またはアミド結合またはリピド付着を介して膜成分に結合させる。そのような共有結合または非共有結合を形成する方法は常用のもので、当業界の熟練者はその方法を容易に最適化できる。スペーサー配列（たとえば核酸）はリンカーのアンカー特異的部分と標的特異的部分との間に介在させることができる。
二物質を会合させて（たとえば核酸２個、蛋白質２個、蛋白質プラス核酸、その他のインキュベーションにより）複合体（たとえばアンカー／リンカー複合体）を形成した後、得られる複合体を、要すれば特異的相互作用を残し、非特異的結合をした材料を除去するための実験的に判定できる条件を用いて処理し（たとえば洗浄）、非結合物質（たとえばリンカー）を除去する。例えば反応混合物を約１回〜１０回またはそれ以上、複合体形成（たとえばアンカー／リンカー複合体）に使用した条件と同一または幾分かストリンジェンシーの高い条件下に洗浄できる。
当業界の熟練者はアンカーとリンカーとの様々なタイプのサンドウィッチ型を作製できることを認識するであろう。例えばアンカーのアレイに（たとえば実質的に同一な配列を持つアンカー）にリンカーの第一のセットを付着させることができ、その各々がアンカーに特異的な第一部分およびリンカーの第二のセットに特異的な第二部分、などを有する。事実、サンドウィッチのこの第二層はアンカーの第一セット（たとえば同一オリゴヌクレオチド）を「複合アンカー」の特異性の異なるセットを持つ別のアレイに変換することを可能にする。リンカーとアンカーとの様々なセットは共有結合または非共有結合によって互いに所望に従って会合する。
この発明のコンビネーションは常法によって通常の技術を用いて製造できる。
本発明で使用する表面のいくつかは商業的に購入できる。好適な態様では、この表面はたとえば Corning Costar 社が販売しているモディファイドプレート（Modified Plate）のような９６−、３８４−または１５３６−ウェルのマイクロタイタープレートである。あるいはウェルを含み、くぼみまたは「へこみ」を含むこの表面は、たとえばアルミニウムまたは鋼のような材料を微細加工して鋳型を作り、次にプラスチックまたは同様な材料を鋳型に微細注入してたとえば図４に図示するような構造とすることができる。あるいはたとえば図４に示すような構造はガラス、プラスチック、セラミック、その他からなり、たとえば図５に示すような次の部品３個から組立てることができる：第一の部品はサンプルウェル間の境界を形成するウェル仕切り（図５ａ）である；第二の部品は各試験ウェル内に副区画またはへこみを形成する副仕切り（図５ｂ）である；第三の部品はプレートの基板を形成し、試験ウェルの底面をなす基板（図５ｃ）である。セパレータは三部品を組立てた時に例えば各孔が試験ウェルの壁を形成するような孔が間隔を置いて全体に配置されたシリコンなどの材料であることができる。副仕切りは例えばシリコンなどの薄い材料であって、網または細かい篩の形に成型される。基板はたとえばガラスのような平らな材料であって、例えば生化学検定に使用する典型的なマイクロプレートの底部を形成するものである。基板の上面は図５ｃに図示するように平らであるか、または各サンプルウェル内の全副区画またはウェルを提供するために副仕切りの形にへこみをつけて配置する。この３部品は例えばシリコンウェファの組立てに使うような標準的操作で組立てることができる。
オリゴヌクレオチドのアンカー、リンカー部分またはディテクターは、たとえば市販のオリゴヌクレオチド合成機を使用するような常用の技術によって合成し、および／またはこうして合成したサブフラクションを連結して合成できる。このような方法で合成しにくい核酸は通常の操作を使用するたとえばＰＣＲのような増幅操作で作製できる。本発明の一態様では、たとえばオリゴヌクレオチドアンカーのような核酸アンカーを試験領域の表面上または表面内に、光リトグラフ、シルクスクリーン化学的付着、インクジェット技術による配置、毛細管、スクリーンまたは液体チャネルチップ、電極アレイを用いる電気化学的パターニング、ピンまたはトゲの接触、またはフィルターの変性と焼結またはＵＶ照射などを含む各種の通常な技術によって配置することができる（たとえば Rava et al (1996). U. S. Patent No. 5,545,531; Fodor et al (1996). U. S. Patent No. 5,510,270; Zanzucchi et al (1997) U.S. Patent No. 5,643,738; Brennan (1995) U.S. Patent No. 5,474,796; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070参照）。アンカーは試験領域の上面に配置するか、またはポリアクリルアミドゲルパッドの場合にはアンカーのいくつかが表面から突き出て、リンカーとの相互作用に利用できるように表面内に埋め込むことができる。好適な態様では、予め作製したオリゴヌクレオチドアンカーの５'−端末を遊離アミノ基で誘導体化し；ほぼ実験的に決めた濃度（たとえば約１μＭ）で、たとえば５０ｍＭ−燐酸緩衝液ｐＨ８.５および１ｍＭ−ＥＤＴＡのような緩衝液に溶解し；ピクサスナノジェットディスペンサー（Pixus nanojet dispenser, Cartesian Technologies 社）を用いて約１０.４ナノリットルの液滴で試験ウェル内の特異的位置に分配する。この上面は新鮮な乾燥 DNA Bind Plate（Corning Costar社)の上面である。オリゴヌクレオチドの付着および蒸発の相対的な速度に依存して製造中はウェル内湿度を調整する必要があるかもしれない。別の態様では、オリゴヌクレオチドアンカーは、たとえば成長オリゴヌクレオチド鎖の光活性化脱保護（たとえば部位指向性「マスク」に関連して）またはナノジェットディスペンサーを用いて不活化化合物のナノリットル液滴の模様形成放出など常法を使用して試験領域表面で直接合成できる。単一ヌクレオチドと結合する成長しつつある配列全部の脱保護を行い、例えば表面を横断してヌクレオチドを加える。別な態様では、オリゴヌクレオチドアンカーをオリゴヌクレオチドの３'−末端に通常の方法を用いて表面に付着させる。
ペプチド、蛋白質、レクチン、キレート化の態様では、常法によってプラスチックその他の型のアンカーまたはリンカー部分を常法により作製し、アンカーを表面上または表面内に配置できる（たとえば Fodor et al (1996) U.S. Patent No. 5,510,270; Pirrung et al (1992) U.S. Patent No. 5,143,854; Zanzucchi et al (1997). U.S. Patent No. 5,643,738; Lowe et al (1985). U.S. Patent No. 4,562,157; Niemeyer et al (1994). NAR 22, 5530-5539参照）。
本発明の一態様では、開示したコンビネーションは種々のスクリーニング操作および／またはプローブまたは標的分子の濃度、活性または構造に関する情報を得るために使用される。このような検定は、ＭＡＰＳ（Multi Array Plate Screen： 多アレイプレートスクリーン）法またはＭＡＰＳ検定と呼ばれる。この検定に用いるアンカーまたは（アンカー＋プローブ）のアレイを有する表面は、ＭＡＰＳアレイまたはＭＡＰＳプレートと呼ばれる。
反応混合物の成分、検定またはスクリーニング操作はどのような順序に組立ててもよい。例えば、アンカー、リンカーおよび標的を逐次的に組立てるか、または標的およびリンカーをレポーター存在下または不在下に溶液内で組立てた後にアンカーに接触させることもできる。
本発明の一態様は少なくとも１個の標的を検出する方法に関し、次の各項を含む：
ａ）該標的を含むかもしれないサンプルとオリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第一部分および該標的に特異的なプローブを持つ第二部分を有する双官能性リンカーとを該標的と該リンカーとの間の第一ハイブリッド形成産物が得られる条件下に、接触させること；
ｂ）該第一ハイブリッド形成産物とコンビネーションとを該第一ハイブリッド形成産物と該コンビネーションとの間の第二ハイブリッド形成産物が得られる条件下に接触させること；ここにこの該コンビネーションは該第一ハイブリッド形成産物を加える前には次項を含む：
１）空間的に区別された多数の領域を有し、その少なくとも２個は実質的に同一である表面；ここにその領域は次項を含む：
２）少なくとも８種の異なるオリゴヌクレオチドアンカー；
ｃ）該第一ハイブリッド形成産物または該第二ハイブリッド形成産物を標識ディテクタープローブと接触させること；および
ｄ）該検出プローブを検出すること。
以下に記載する検定または操作は各々高処理能の様式で行うことができるが、この様式では多数のサンプル（たとえばコンビネーション中の領域数に依存して約８６４、１０３６、１５３６、２０２５個またはそれ以上）が各プレートまたは表面上で迅速かつ同時に検定される。さらにプレートまたは表面多数を一時に操作できる。例えば医薬品の発見法において医薬候補を含む多数のサンプル（たとえばコンビナトリアル化学ライブラリー、各種低分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、その他の物質）を前記コンビネーションの別個の領域に加えるか；または生物学的または生化学的サンプルに加え、これを次にコンビネーションの別個の領域に加え；領域内に存在するプローブアレイとともにインキュベーションするか；して各サンプルについて検定を行う。最近の高密度マイクロプレート、ＤＮＡスポット用具の出現および継続的発展、さらに高密度のマイクロプレートからデータを作製、収集するレーザ技術、ロボット技術、改良されたディスペンサー、洗練された検出系およびデータ管理ソフトウェアなどの方法の出現および継続的発展によって本発明方法は毎日数千、数万もの化合物をスクリーニングまたは分析するために使用できる。
例えば、プローブがオリゴヌクレオチドである態様では、この検定は診断用の核酸またはポリヌクレオチドのサンプル多数に関する遺伝子的変種または欠陥の存否についてのスクリーニング（たとえば結合その他の検定）であることができ、（たとえば、嚢胞性線維症のような疾患に関連する構造多形または特異的突然変異、たとえば Iitia et al (1992) Molecular and Cellular probes 6, 505-512 を参照）；病原生物（たとえば細菌、ウイルス、プロトゾア；宿主はヒトを含む動物または植物）；または特定の生理学的状態または病状を診断するｍＲＮＡ転写パターン；であることができる。ＥＳＴの部分（全長コピーを含む）を含む核酸プローブアレイを用いれば、そのＥＳＴが由来する細胞（または他の細胞）が産生する転写パターンを評価できる。核酸プローブはペプチド、蛋白質または特定の核酸 配列に特異的に結合する蛋白質ドメイン（およびその逆）を検出できる。
同様に、プローブが抗原結合分子（たとえば抗体）である態様では、この検定は特定の生理学的状態または病状に関して診断できる変種蛋白質または蛋白質発現パターンについてのスクリーニングであることができる。たとえば検出できる分子の型を例示する図４０および図４１を参照。
別な態様では本発明のコンビネーションはたとえば蛋白質、核酸、低分子、その他の相互作用のような、例えば抗原と抗体との間の相互作用；または受容体（たとえば精製受容体または細胞膜結合受容体）とそのリガンド、アゴニストまたは拮抗剤；または酵素（たとえばプロテアーゼまたはキナーゼ）およびその基質；の効率または特異性、または基質から産物への変換の増減、ならびにその他多数のような生化学的反応を監視するために使用できる。そのような生化学的検定をプローブまたは標的の性質を決定するためにまたスクリーニング検定に使用することができる。例えば特定プロテアーゼ（たとえば凝血に関連するプロテアーゼＸａおよびＶＩＩａ）の存在についてサンプルをスクリーニングするためにサンプルをコンビネーションで検定することができるが、ここではそのプローブは目的とする各プロテアーゼに特異的な蛍光原性基質である。標的プロテアーゼが基質に結合して切断するならば、通常たとえばエネルギー遷移ペア２個の間の切断と分離の結果として基質は蛍光を発し、このシグナルを検出できる。サンプルを特定キナーゼ（たとえばＳｒｃチロジンキナーゼまたはＺＡＰ７０）の存在についてスクリーニングする別な例では、目的とするキナーゼ１種またはそれ以上を有するサンプルをコンビネーションで検定できる。ここにプローブは目的とするキナーゼの１種で選択的に燐酸化されるペプチドであることができる。業界が認め、情報で決定できる条件を使用して、サンプルを必要なコファクターを加えた適当な緩衝液中で基質のアレイと共に実験的に決めておいた時間インキュベーションすることができる。（検定によっては、たとえば目的キナーゼの活性を制御する因子の生化学的研究では、各基質が同様な速度で燐酸化されるように各キナーゼの濃度を調整する）。キナーゼ除去し、不要な反応成分（要すれば）を除去するために実験的に決定した条件下に各反応物を処理（たとえば洗浄）後、たとえばフルオレセイン標識、抗ホスホチロシンまたは抗ホスホセリン抗体（たとえば濃度約１０ｎＭ以上またはそれ以下）のような検出可能な試薬とインキュベーションし、シグナルを検出することによって燐酸化された基質を検出できる。別の例では結合検定を行うことができる。たとえばＳＨ２ドメイン、たとえばＧＲＢ２−ＳＨ２またはＺＡＰ７０−ＳＨ２のようなものは適当な燐酸化ペプチドのプローブアレイで検定でき；血清は免疫不全の存在について特定受容体のプローブアレイでスクリーニングできる。また、酵素結合検定もそのようなアレイ形式で行える。本発明のコンビネーションは野生型の対応物よりも活性が高いか低い変異体酵素を検出するために、または除草剤または殺虫剤を含む種々な薬剤をスクリーニングするためにも使用できる。
勿論、ＭＡＰＳ検定はサンプル内の活性標的の量を定量（測定、定量化）するためにも使用できる。ただし、プローブが完全には占有されていない、すなわち、利用可能なプローブ部位の約９０％またはそれ以下が標的に占有または結合（または反応またはハイブリッド形成）されているものとする。標的が増えるとさらに多くのプローブが結合するのでこの条件下に標的を定量化できる。一方、利用可能なプローブ部位の約９０％またはそれ以上が結合している条件では、存在する標的はプローブに結合する標的の量を実質的に増加しない。本明細書に記載する標的の型はいずれもこの様式で定量できる。例えば実施例６は、オリゴヌクレオチド標的の定量化を記載する。さらに、標的が大過剰に存在しても（たとえばＭＡＰＳプローブアレイ中の利用可能なプローブの量を飽和するほど大量に存在すれば）、既知量の非標識標的を結合混合物中に加えて反応物の「感度をシフト」させてさらに大量の標的を定量可能にすることが証明されている。
別な態様では、本発明のコンビネーションを用いて標的と所与のプローブとの相互作用を変調する薬剤をスクリーニングできる。ある薬剤はプローブ、標的または標的プラスプローブで形成される複合体のいずれかと直接または間接に相互作用して標的／プローブ相互作用を変調できる。この変調は以下を含む様々な形式を取ることができる。その例はこれに限定するものではないが、次を含む：プローブに対する標的の結合親和性増減；標的とプローブが結合する速度の増減；標的に対するプローブの競合的または非競合的結合阻害；または場合によってはプローブ／標的相互作用の増減を起こすプローブまたは標的の活性増減。このような薬剤は人工物または天然起源の物質であることができる。また、このような薬剤は原型のままで、または他の分子種との凝集物として採用でき、および共有結合または非共有結合で直接的にまたは特異的結合物質を介して結合相手に付着できる。例えば「血液希釈剤」候補または凝血を起こすプロテアーゼカスケードの一つと相互作用する薬剤を確認するためには、目的とするプロテアーゼのカクテルを複数の薬剤候補で試験し、次に前記のようにして活性を試験する。本発明に採用できる薬剤の別な例は非常に広範であって、殺虫剤と除草剤を含む。実施例１６および実施例１７は特異的キナーゼを選択的に阻害する薬剤またはＳＨ２ドメインと燐酸化ペプチドとの間の相互作用を選択的に阻害する薬剤の高処理能検定を記載する。
別な態様では本発明のコンビネーションは遺伝子発現のパターンを変調する薬剤のスクリーニングに使用できる。例えば遺伝子のセット（「相関」遺伝子、ＲＮＡまたは発現パターン）からの発現パターンが特定の生理学的状態または発育段階または病状に関連するｍＲＮＡ種を確認するために、オリゴヌクレオチドのアレイを用いることができる。用語「相関する」または「相関性」はＲＮＡの合成パターンが細胞の生理学的状態に関連することを意味するが、しかし、必ずしも所与ＲＮＡの発現が特定の生理学的状態の原因である必要はない。例えばｍＲＮＡの小さなサブセットを確認できることがあり、このｍＲＮＡは細胞内で発現が上方変調または下方変調されて、特定の病状のモデルとして役立ち；病理的発現型を示さない正常細胞と比べて変化するこの発現パターンが病状を指示する薬剤（「指示薬」遺伝子、ＲＮＡまたは発現パターン）として役立つ。この用語「相関性」および「指示薬」は互換的に用いられる。例えば細胞をたとえばミリスチン酸ホルボールのような腫瘍促進剤で処理すると、初期の腫瘍発症段階に似た遺伝子発現パターンを示すかもしれない。別な腫瘍モデルでは、マウスのインスリノーマ細胞（たとえば細胞系列ＴＧＰ６１）はアデノウイルスに感染すると、たとえばｃ−ＪｕｎおよびＭＩＰ−２の発現増加を示すが、一方、たとえばＧＡＰＤＨおよびＬ３２のようなハウスキーピング遺伝子の発現には実質的に影響がない。
病気モデルからの細胞に直接または間接にインビトロ（たとえば組織培養で）またはインビボで接触すると指示薬発現パターンを変調させる薬剤はその病気に罹患している生物（たとえばヒトなどの動物患者または植物）に対する治療剤または薬剤として作用するかもしれない。核酸とたとえばインビトロ（試験管内）発現システム中で直接に接触することによって発現パターンを変調する薬剤もある。本明細書に使用する「変調」は測定可能な反応に関連する分子、その他の量および／または活性の増減を起こすことを意味する。本発明のコンビネーションはそのような薬剤のスクリーニングに使用できる。例えば一連の細胞（たとえば疾患モデルから）を一連の試薬と接触（たとえば約１０分間〜約４８時間またはそれ以上の時間）させ、常用の業界で認められた方法（たとえば購入可能なキット）を使用して、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ抽出物を製造することができる。ＲＮＡ量の増幅を所望するならば、たとえばＲＴ−ＰＣＲ増幅のような標準的操作を使用できる（たとえば Innis et al eds., (1996) PCR Protocols: A Guide to Methods in Amplification, Academic Press, New Yorkを参照）。この抽出物（またはその増幅産物）を適当な指示薬ＲＮＡに対するプローブを含む複数の実質的に同一なアレイと接触（たとえばインキュベーション）させ、指示薬発現パターンの変化に関連する薬剤を確認することができる。実施例１５は病状に相関する遺伝子の発現を変えるかもしれない化合物をスクリーニングする高処理能検定を記載する。
同様に、特定の生理学的状態または進行段階に関連する発現パターンを変調する薬剤を確認できる。その薬剤は人工のまたは天然起源物質であることができ、環境因子を含み、たとえば胚発育にまたは生理学的反応の制御に関与するような物質、またはたとえば殺虫剤または除草剤のように農業に重要な物質を含む。また、そのような薬剤は未変化のままで、または他の分子種との集合体として適用でき；その薬剤は直接にまたは特異的な結合物質を介して結合相手に共有結合または非共有結合で付着させることができる。
本発明の別の態様はサンプル内にある少なくとも１種の標的を検出するために有用なキットであって、次項を含む：
ａ）少なくとも２個が実質的に同一であり、異なるアンカー（オリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載する他の型の一つ）少なくとも８個を有する空間的に区別された領域を多数有する表面；および
ｂ）アンカー少なくとも１種に特異的な第一部分および標的少なくとも１種に特異的なプローブを有する第二部分を有する双官能性リンカー分子少なくとも１種を入れた容器。
一態様では、前記ａ）の表面およびアンカー少なくとも１種に特異的な第一部分および標的少なくとも１種に特異的なプローブを含む第二部分を有する双官能性リンカー分子と該アンカー少なくとも１種とを付着させるための取扱説明書１組を提供する。取扱説明書には例えば（これに限定するものではないが）表面上の各アンカー、表面に存在するアンカーの数およびアンカーが存在する表面上の位置、およびリンカーをアンカーに特異的に付着(会合、結合、その他)させるためのプロトコルの記載を各々含むことができる。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドであれば、取扱説明書は各アンカーの配列を記載し、専門家はその配列からアンカーと特異的に相互作用（たとえばハイブリッド形成）するようにリンカーの相補性アンカー特異的部分を設計できる；アンカーがペプチドであれば、取扱説明書はたとえばペプチドと特異的に相互作用する抗体に関する情報を伝達できる。取扱説明書はアンカーとリンカーを会合させるためのプロトコル、たとえばハイブリッド形成（または会合の型）のための、たとえばインキュベーション温度および時間のような条件および試薬、非会合分子（たとえば洗浄）除去のための条件および試薬、その他、を含むことができる。さらに、取扱説明書は本明細書に記載する各種タイプのコントロールリンカーの構築と使用に関する情報およびたとえば本コンビネーションで行う検定を定量化、標準化、「微調整」または補正するための方法を含むことができる。取扱説明書は専門家が慣例的に通常操作で行うことのできるこの出願に開示するパラメータ、条件または態様を含むことができる。
この明細書に記載するように、専門家は本発明の表面にアンカーのアレイ（単数または複数）、多種なタイプのリンカー、を付着させ、それによって広範な種類のプローブアレイのいずれかを立案することができる。さらに、専門家は本発明の表面から所定セットのリンカーを除去し、またそれに他種セットのリンカー（最初のセットと同一または相違するリンカー）を加えることができ、それで表面を何度も再使用することを可能になる。この柔軟性と再使用可能性は本発明の利点を構成する。
別な一態様では、本発明のコンビネーションのＥＳＴ（Expressed Sequence Tags；発現配列タグ）をマッピングするために使用できる。すなわち、ＭＡＰＳ検定を使用してＥＳＴのどの基がある遺伝子の異なる部分から作製されるか、またどの部分が独特であるかを判定できる。図１８，１９，２０および２１はこのような検定を例示するが、この例はＥＳＴ１６個のどれが共通の遺伝子に「連結」しているかを判定する検定である。この検定の第一段階（図１８参照）はアレイを集めることであって、このアレイではマッピングすべき各ＥＳＴをそれに対応するオリゴヌクレオチドプローブ少なくとも１種によって示す。マッピングすべきＥＳＴの数に等しい（またはそれより大きい）数のアレイを表面の別々の領域（たとえばウェル）に分散する；図示した例ではコンビネーションの表面は１６ウェルを有し、その各々が番号１〜１６を付けた１６個の異なるＥＳＴ特異的オリゴヌクレオチドのアレイを含む。ＥＳＴ「対応」（「ＥＳＴ特異的」である）オリゴヌクレオチドとは、そのオリゴヌクレオチドがＥＳＴに対して特異的にハイブリッドを形成するが無関係なＥＳＴとはハイブリッド形成をしないように選択したストリンジェンシーのハイブリッド形成条件下にＥＳＴに対して十分に相補性を持つものである。この型のＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドは、ＥＳＴが最初に作製された遺伝子から合成されたｃＤＮＡのコード鎖または非コード鎖に、またはＥＳＴが最初に作製された遺伝子から合成されたｍＲＮＡに、特異的に（最適条件下に）結合できる。オリゴヌクレオチドの設計および特異的ハイブリッド形成を達成するために最適化すべきハイブリッド形成パラメータの設計において考慮すべき因子はこの明細書に記載する。アレイを集めるためにリンカー分子を作製するが、そのリンカーは各々一般的アレイのアンカー少なくとも１種に対して特異的な部分とマッピングすべきＥＳＴの１種に対応するオリゴヌクレオチドプローブを有する部分とを有する；この明細書に記載するようにしてこのリンカーをアンカーに付着させる。次の段階では、オリゴヌクレオチドプローブ１種またはそれ以上に対して相補性である配列を含むかもしれない核酸（たとえばｍＲＮＡまたは単鎖または変性ｃＤＮＡ）の混合物を含むサンプル適量をプローブアレイを有する各領域（ウェル）に加える；次に混合物を情報で判定された最適条件下にインキュベーションし、それによって核酸を相補性プローブに結合させることが可能になる。ＥＳＴ特異的プローブのいくつかが単一核酸の異なる部分と相補性があるならば、その核酸はプローブの一つが存在するアレイの中の各ロカスに結合する。
次の段階では、異なるディテクターオリゴヌクレオチド（図示する例ではディテクター＃１〜＃１６）を各領域（ウェル）（図１９参照）に加える。ディテクターオリゴヌクレオチドはマッピングすべきＥＳＴの各々に対して設計する。各ＥＳＴ特異的ディテクターはプローブオリゴヌクレオチドではなくてＥＳＴの異なる（少なくとも部分的には非重複）部分に対応するのでプローブとディテクターオリゴヌクレオチドが相互に妨害しない。例えば図１８〜２０のＥＳＴ１、２および６に対応する図２１に記載のＥＳＴを考えて見る。図２１はＥＳＴ＃１および＃２の双方が遺伝子Ｘから得られ（両者は「連結」している）、一方ＥＳＴ＃６は異なる無関係な遺伝子から得られたことを示す。遺伝子Ｘから作製されたものを含むｍＲＮＡの混合物を含むサンプルの適量を図１８〜２０に示すプローブアレイとインキュベーションすれば、遺伝子ＸのｍＲＮＡは最適条件下にプローブ１および２のあるロカスにハイブリッドを形成するが、プローブ６のあるロカスには形成しない。（勿論、各ｍＲＮＡはハイブリッドを形成できるプローブの総計を越えてモル過剰に加えなければならない）。ディテクターオリゴヌクレオチド１を領域（ウェル）１に加えれば、プローブアレイのロカス１およびロカス２に結合する遺伝子ＸのｍＲＮＡとハイブリッド形成するが、ロカス６では形成しない。同様に、ディテクターオリゴヌクレオチド２を別なウェル、たとえばウェル＃２に加えれば、これもロカス１およびロカス２に結合するが、ロカス６には結合しない。この様にして、どのＥＳＴが連結しているか、すなわち同じ遺伝子の部分をコードしているかおよびどのＥＳＴが特有であるかを高い処理能で決定できる。図２０に示す仮説的な例では、最初のＥＳＴ３個は同じ遺伝子の複数部分をコードし、最後のＥＳＴ５個は別な遺伝子の複数部分をコードし、残りのＥＳＴは連結がないことを示す。ハイブリッド形成、任意的洗浄段階、検出法、その他の条件はＭＡＰＳ検定に関連して本明細書に記載する。ＭＡＰＳ検定で得た連結データを確認するために、ＥＳＴ特異的オリゴヌクレオチドプローブのペアをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーに使用してＰＣＲ反応を行うことができる。連結したＥＳＴの各ペアがＰＣＲ産物を与える。注目すべきことは、このペア様式のＰＣＲ試験を行って連結ＭＡＰＳ検定を用いずに直接に連結を判定することもできるが；しかしながら、多数の反応が必要であり、また各ＥＳＴプライマーをセンス鎖およびアンチセンス鎖として合成しなければならない点にある。図示した例ではここに必要な反応は１８０回にもなる。
一面では、本発明は複数あるＥＳＴのどれが所与の核酸に相補的であるかを判定する方法に関し、この方法は次の各項を含む：
ａ）該オリゴヌクレオチドプローブと該核酸との間のハイブリッド形成産物を得るために、少なくとも１個が該ＥＳＴに対応する固定化したオリゴヌクレオチドプローブのアレイを所与の核酸を含有するかもしれない被検サンプルとともにインキュベーションすること；
ｂ）該ハイブリッド形成産物とディテクターオリゴヌクレオチドとをインキュベーションすること（このディテクターオリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドプローブの一つが対応するＥＳＴに対応するが、該オリゴヌクレオチドプローブよりもＥＳＴの異なる部分に特異的である）；および
ｃ）該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレオチドで標識されているかを検出すること。
但しここに、オリゴヌクレオチドプローブのアレイはコンビネーションの一領域に固定化されているものとする；その該コンビネーションは次の各項を含む：
１）多数の空間的に区別された、研究すべきＥＳＴの数に等しい数の実質的に同一な領域を有する表面；ここに各領域は次項を有する：
２）研究すべきＥＳＴの数に等しい数の異なるアンカー；ここに各アンカーは次の各項と会合している：
３）アンカーに特異的な第一部分および該ＥＳＴ少なくとも１個に対応するオリゴヌクレオチドプローブを有する第二部分を有する双官能性リンカー。
別な一側面では、本発明は前記方法であってそこでは該ＥＳＴは該核酸に相補性であってもよく；各ＥＳＴはオリゴヌクレオチド配列２個、すなわち該ＥＳＴに対応するオリゴヌクレオチドプローブを規定する第一配列および該ＥＳＴに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを規定する第二配列を有するが、その方法は次の各項を含む：
ａ）該核酸の分子を含むサンプルと、該領域はオリゴヌクレオチドプローブのアレイを含み、そのプローブの少なくとも１個は該ＥＳＴに対応するコンビネーションの領域少なくとも１個と、を接触させること；
ｂ）該核酸分子を該核酸の部分に相補的な該ＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドプローブに結合させるために、該サンプルと該領域とをインキュベーションすること；
ｃ）ディテクターオリゴヌクレオチドを該所与のオリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸分子または該核酸に相補性の別なオリゴヌクレオチドプローブに結合させるために、該ＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドプローブ１個またはそれ以上に結合する該核酸分子を含む該領域と、所与のオリゴヌクレオチドプローブアレイの一つが対応するＥＳＴに対応するディテクターオリゴヌクレオチドとをインキュベーションすること；
ｄ）該アレイのどのＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドプローブが、所与のオリゴヌクレオチドＥＳＴ対応プローブに結合する核酸の一部分に相補性であるかを確認し、どのＥＳＴが所与の核酸に相補性であるかを確認するために、該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出すること；
ここに該オリゴヌクレオチドプローブのアレイはコンビネーションの領域に固定化されており、またここに、該コンビネーションは次の各項を含むものとする：
１）研究するＥＳＴの数と同じ数の空間的に区別された、実質的に同一な領域を含む表面；ここに各領域は次の各項を有する：
２）研究するＥＳＴの数と同じ数の異なるアンカー；ここに各アンカーは次項のものと会合している：
３）アンカーに特異的な第一部分および該ＥＳＴ少なくとも１個に対応するオリゴヌクレオチドプローブを有する第二部分を含む双官能性リンカー。
ＥＳＴマッピング検定の各要素はいかなる順番で混合することもできる。例えば、アンカー、リンカーおよびＥＳＴを順番に混合することもでき、またはリンカーとＥＳＴとをレポーターの存在または不在下に溶液中で混合し、次にアンカーに添加することもできる。
別な一側面では本発明は複数のＥＳＴのどれが所与の核酸に相補性であるかを判定する方法に関し、次の各項を含む：
ａ）該オリゴヌクレオチドプローブと該核酸との間の第一ハイブリッド形成産物を得るために、所与の核酸を含むかもしれない被検サンプルと、各々がＥＳＴの少なくとも１個に対応するプローブである第一部分およびアンカーオリゴヌクレオチドに特異的な第二部分を有する双官能性オリゴヌクレオチドリンカー分子の集合と、をインキュベーションすること；
ｂ）該アンカー、該オリゴヌクレオチドプローブおよび核酸を含む第二のハイブリッド形成産物を形成させるために、該第一のハイブリッド形成産物とアンカーオリゴヌクレオチドの固定化アレイとをインキュベーションすること、ここに各アンカーオリゴヌクレオチドは該リンカー分子の少なくとも１個のアンカー特異的部分に対応する；
ｃ）該第一または第二ハイブリッド形成産物のいずれかと、該オリゴヌクレオチドプローブの一つが対応するＥＳＴに対応するがオリゴヌクレオチドプローブよりもＥＳＴの別な部分に特異的なディテクターオリゴヌクレオチドと、をインキュベーションすること；および
ｄ）該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレオチドで標識されたか検出すること。
ここに、アンカーオリゴヌクレオチドの該アレイはコンビネーションの領域に固定化される。ここにこのコンビネーションは次の各項を有する：
１）研究すべきＥＳＴの数に等しい数の空間的に区別された実質的に同一な領域を有する表面；ここに各領域は次を含む：
２）研究すべきＥＳＴの数に等しい数の様々なアンカー。
勿論、ＥＳＴをマッピングする前記方法は目的核酸上に被験配列（たとえばポリヌクレオチド）をマッピングするためにも使用できる。たとえば、クローニングしたＤＮＡ断片またはｃＤＮＡの２個またはそれ以上を同じゲノムＤＮＡにマッピングできるかどうか判定できる。このような操作は例えば長く複雑な遺伝子の構造決定に役立つ。同様にして、スプライシングされた配列またはコード配列１個またはそれ以上を、同じゲノムＤＮＡにマッピングできるか判定できる。このような判定を用いて例えば臨床検査でスプライシングパターンの相違で特徴付けられる正常状態と疾病状態とを判別できる。本マッピング方法の他の応用多数は当技術分野の熟練者には明白である。
別な一側面では、本発明は多数のポリヌクレオチドの中でどれが所与の核酸と相補的であるかを判定する方法に関する。ここにポリヌクレオチド１種またはそれ以上が該核酸に相補性であってもよく、またここに各ポリヌクレオチドは別々のオリゴヌクレオチド配列２種を有するが、その第一は該ポリヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドプローブを定義し、その第二は該ポリヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを定義する。この方法は次の各項を含む：
ａ）該核酸分子を有するサンプルとコンビネーションの領域少なくとも１個とを接触させること；ここに該領域はオリゴヌクレオチドプローブのアレイを有し、少なくともプローブの一つが各ポリヌクレオチドに対応するものとする；
ｂ）該核酸分子を該核酸の一部に相補性のポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブに結合させるために、該サンプルと該領域とをインキュベーションすること；
ｃ）ディテクターオリゴヌクレオチドを所与の該オリゴヌクレオチドプローブに結合したまたは該核酸に相補性の他のオリゴヌクレオチドプローブに結合した核酸分子に結合するために、ポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブ１種またはそれ以上に結合した該核酸分子を含む該領域と、所与の該アレイのオリゴヌクレオチドプローブ一つが対応するポリヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドとを、インキュベーションすること；
ｄ）該アレイのどのポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブが核酸（所与の該オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド対応プローブに結合する）の部分に相補性であるかを確認するために、どのポリヌクレオチドが所与の核酸に相補性であるかを確認するために、該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出すること、
ここに、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイはコンビネーションの領域に固定化されており、またここに該コンビネーションは次の各項を含む：
１）研究すべきポリヌクレオチドの数と等しい数の空間的に区別され、実質的に同一な領域を有する表面；ここに各領域は次項を含む：
２）研究すべきポリヌクレオチドの数と等しい数の様々なアンカー；ここに各アンカーは次項と会合している：
３）アンカーに特異的な第一部分および該ポリヌクレオチドの少なくとも１種に対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第二部分を有する双官能性リンカー。
本発明の別な側面ではＥＳＴまたはその他のポリヌクレオチドをマッピングするための前記方法はさらに一つまたはそれ以上の段階の間にサンプルの非結合部分を除去する工程を含む。
本発明の別な態様では、目的とするＲＮＡ標的（たとえばｍＲＮＡまたはその他の型のＲＮＡ）１種またはそれ以上を逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換し、次にこのｃＤＮＡをプローブアレイにハイブリッド形成させる。この型の検定を図８に図式的に例示する。ＲＮＡ抽出物（または精製ｍＲＮＡ）は本明細書に記載する細胞または組織から製造できる。目的ＲＮＡに特異的な逆転写酵素およびオリゴヌクレオチドプライマーを次にＲＮＡサンプルに加え、業界で認められ、常法により決定でき、最適化できる条件および操作を用いてｃＤＮＡの第一鎖を作製する。用語「特異的」プライマーは目的とするｍＲＮＡに十分な相補性があって選択したストリンジェンシーのハイブリッド形成条件下に結合し、逆転写酵素に認識されるが、望まない核酸には結合しないプライマーを示す（特異的ハイブリッド形成を達成するために適当な反応条件については前記を参照）。残余ＲＮＡ（特異的なプライマーによって認識されないｍＲＮＡおよび／または他の型のＲＮＡ抽出物中にある夾雑ＲＮＡであって、たとえばｔＲＮＡまたはｒＲＮＡのようなもの）は様々なリボヌクレアーゼのいずれかによって、またはたとえばアルカリ処理のような化学的操作によって除去し、そこで単鎖ｃＤＮＡを残すことができ、続いてこれをＭＡＰＳプローブアレイと接触させる。この方法における逆転写酵素の使用は、ヌクレアーゼによる分解に感受性で扱い難いＲＮＡの広範な操作の必要性を最小にする。さらに、特異的逆転写酵素プライマーによって生じる追加的特異性が本検定の特異性に追加される。
要すれば、前記ｃＤＮＡはプローブアレイとハイブリッド形成する前に増幅してシグナル強度を増加させることができる。前記オリゴヌクレオチド逆転写酵素プライマーはその５'−末端にＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ２ポリメラーゼその他）の開始位置を特定する配列（長さ約２２〜２７ヌクレオチドであることができる）を有することができる。図８に示す例では、Ｔ７プロモーター配列を逆転写酵素プライマーに加えた。ポリメラーゼ認識部位はｃＤＮＡに組み込まれ、適当なＲＮＡポリメラーゼ（インビトロ転写またはＩＶＴ）により多数の転写をするための認識部位として役立つことができる。要すれば、そのようにして作製したｍＲＮＡはＰＣＲおよび適当なプライマーを使用してさらに増幅でき、またはｃＤＮＡそれ自体もそのようにして増幅できる。転写およびＰＣＲの操作は当業界でよく知られている。
ＰＣＲの柔軟性は本発明方法に多数の変種を可能にする。一態様では、標的増幅に使用するＰＣＲプライマーの一方または双方にＰＣＲ産物に固体支持体への特異的または非特異的な付着を可能にする化学的修飾を含めることができる。このような化学修飾には、例えば Costar社の DNA Bind Plates（例えばＮ−オキシサクシンイミドエステルまたは無水マレイン酸被覆で修飾されたプレート、たとえば Reacti-Bind Plates（Pierce社, Rockford, IL）のような表面への結合を可能にする５'−アミド化を含む。そのような化学修飾を有するオリゴヌクレオチドを作製する方法は、当業界では常用の平凡なものである。そのような修飾プライマーを含むＰＣＲ産物は固体支持体、たとえばマイクロタイターウェルの内壁、ビーズ（たとえば非磁性または磁性のビーズ）、または本明細書記載の型のいずれかに属する表面を含む所望の産物に付着させることができる。勿論、ＰＣＲ反応を開始する前にＰＣＲプライマーを支持体に付着させることもできる。洗浄なしにＰＣＲを数サイクル反復することもできるが、結合するプライマーが過剰なら得られるＰＣＲ産物は支持体に付着したまま残留する。増幅した標的配列の支持体への付着は、アンカーおよび／またはリンカーを有する表面と接触させる（たとえばハイブリッド形成）前または表面に接触させ、そこから離脱させた後のいずれかにおける標的の洗浄（または精製）を促進できる。
別の態様では、標的の増幅に使用したＰＣＲプライマーの一方または双方に制限酵素部位１個またはそれ以上を含ませることができ、目的とする標的配列の両端のいずれかに隣接してまたは接触して制限部位の導入が可能になる。制限部位はアンカーおよび／またはリンカーを含む表面と接触する（たとえばハイブリッド形成）前か後のいずれかに増幅した標的にＰＣＲによって加えることができる。こうして導入した制限部位は例えば標的配列に接触するクローニング部位を提供して増幅した標的のクローニングを促進することができる。制限部位は増幅した配列の精製も促進する。例えばＰＣＲプライマーの標的特異的配列と支持体への付着を可能にする化学修飾との間に制限部位１個またはそれ以上を導入できる。修飾ＰＣＲプライマーを用いて標的をＰＣＲ増幅し、化学修飾を介して支持体に結合させた後に、それを洗浄し、次に標的配列に隣接する制限部位で切断すれば、きれいな標的が得られる。たとえば図２３参照。
勿論、制限酵素部位以外の切断可能な部位も前記本方法で使用できる：たとえば特異的プロテアーゼで切断できるペプチド、または物理的、化学的またはその他の手段で切断および／または放出できるその他の成分などがある。
別な態様では、標的を増幅するために使ったＰＣＲプライマーの一方または双方が、たとえば標的に特異的なレポーターまたは検出リンカーなどに特異的な配列（必ずしも標的に含まれていなくてもよい）を有することができる。
勿論、前記各プライマー修飾はいかなる組合せにおいても使用でき、検定のどの段階ででも増幅産物に加えることができる。実施例２１および実施例２２は前記プライマー修飾のいくつかを標的増幅に組み込んだプロトコルを説明する。
ｍＲＮＡ標的を逆転写酵素でｃＤＮＡに変換するか、および／またはＭＡＰＳプレート上での検定前にＰＣＲで増幅するか、である前記方法は、前記のＲＮＡに基づく検定のいずれかに対する標準的ＭＡＰＳ検定操作の代わりに使用することができる。
本発明の方法で使用する核酸、たとえば標的、標的の検出に関与するオリゴヌクレオチド、またはヌクレアーゼ保護断片（本明細書に記載）などはＰＣＲ反応およびリガーゼ反応を含む通常の平凡な酵素的操作の様々な変形のいずれかによって増幅できる。かかる増幅法の一つは転写が仲介する増幅である（例えば Abe et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31, 3270-3274を参照）。実施例３２および図３６〜３９および図４２も参照。
本発明の別な態様では、目的とする核酸標的１種またはそれ以上を特異的ポリヌクレオチド保護断片にハイブリッド形成させ、ヌクレアーゼ保護操作を行い、目的とする標的とハイブリッド形成した保護断片をＭＡＰＳプレート上で検定する。勿論、このような「ＭＡＰＳプレート」はリンカーに関連のないアンカー（たとえば目的とする標的またはヌクレアーゼ保護断片と直接会合できるもの）を含むことができる；いずれかの型のプローブアレイとともに使用するヌクレアーゼ保護の利点は本明細書およびその先行者から当業界の熟練者には明白になる。目的とする標的がＲＮＡであり、保護断片がＤＮＡであれば、ヌクレアーゼ保護／ＭＡＰＳ検定（ＮＰＡ−ＭＡＰＳ）は夾雑ヌクレアーゼによる分解に感受性で取扱が難しいＲＮＡの長大な処理の必要性を軽減できる。ヌクレアーゼ保護操作によるサンプルの処理もサンプルの粘度を低下させる。サンプルのヌクレアーゼ保護で検定の感度と再現性とを向上できる。たとえば実施例３０を参照。この例はサンプルをヌクレアーゼ保護操作で処理する典型的検定の感度と再現性を例示する。本発明の利点の一つはこの検定が十分に感度が高いために、シグナル検出のために標的の増幅（たとえばＰＣＲによる）を必ずしも必要としない点にある。ＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定ではプローブアレイ中のプローブは目的とする核酸標的と同じ鎖状構造を持つオリゴヌクレオチドであって、標準的ＭＡＰＳ検定のようにそれらに対する相補性ではない。図９にＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定の一例を図式的に示す。
ＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定では目的とする標的はたとえばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸断片、修飾核酸、合成核酸、その他など、いかなる核酸でもよい。本発明の好適な態様ではこの操作を使用して組織または細胞のＲＮＡ抽出物中に存在するｍＲＮＡ標的１種またはそれ以上について検定する。目的とする標的を含むサンプルを先ず選択したストリンジェンシー条件下にハイブリッドを形成させて（特異的ハイブリッド形成を達成する適当な反応条件については前記検討を参照）特異的保護断片１個またはそれ以上の過剰とする。保護断片はポリヌクレオチドであって、たとえばＲＮＡ、ＤＮＡ（ＰＣＲ産物も含む）、ＰＮＡまたは修飾または置換核酸であることができ、これらは目的とする核酸標的の一部に特異的である。「特異的」保護断片とは、選択したストリンジェンシー条件下にその結合相手と結合するに十分な相補性があるが、望まない核酸には結合しないポリヌクレオチドを意味する。保護断片の長さは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは５０〜１００ヌクレオチドまたは全長ｃＤＮＡとほぼ同じながさである。好適な態様では、保護断片は単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。標的１００個またはそれ以上に特異的な保護断片を単一のハイブリッド形成反応に含めることができる。ハイブリッド形成後、サンプルをヌクレアーゼ１種またはそれ以上のカクテルで処理して保護断片以外の核酸を破壊し、保護断片を目的とする核酸および（場合によっては）核酸標的の一部とハイブリッドを形成させ、これらをハイブリッド形成によってヌクレアーゼ保護操作（二重鎖ハイブリッド）中のヌクレアーゼ消化から保護する。例えば、サンプルが細胞抽出物を含むならば、目的とする核酸以外の望まない核酸、たとえばゲノムＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡなどはこの段階で実質的に破壊できる。ハイブリッド形成複合体とサンプル内に存在する望ましくない核酸との性質に依存して例えば膵臓ＲＮＡｓｅ、ヤエナリヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ−Ａ、リボヌクレアーゼＴ１、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＲＮＡｓｅ−ＣＬＢ、ＲＮＡｓｅ−ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ−Ｕ２、その他を含む様々なヌクレアーゼをいずれも使用できる。ＲＮＡｓｅ−ＨはＤＮＡ保護断片に結合した残余ＲＮＡを消化するために特に有用である。これら酵素の反応条件は当業界でよく知られており、実験的に最適化できる。また、たとえばＲＮＡのアルカリ加水分解のような化学的操作も使用できる。必要なら、サンプルを当業界でよく知られた操作によってさらに処理してハイブリッドを形成しない物質を除去し、および／または残余酵素を不活性化または除去する（たとえばフェノール抽出、沈殿、カラム濾過、など）ことができる。ハイブリッド形成、それに続くヌクレアーゼ消化および（要すれば）化学分解のプロセスはヌクレアーゼ保護操作と呼ばれる；様々なヌクレアーゼ保護操作が報告されている（たとえば Lee et al (1987) Meth. Enzymol. 152, 633-648; Zinn et al. (1983). Cell 34, 865-879 を参照）。ヌクレアーゼ保護処理し、これに続いて（要すれば）ヌクレアーゼ不活性化操作を行ったサンプルはＭＡＰＳプローブアレイに接触させ、さらに通常のＭＡＰＳ検定を行う。結合した保護断片はたとえば標準的ＭＡＰＳ検定法について本明細書に記載する標識した標的特異的レポーターとのハイブリッド形成によって、または保護断片それ自体は検出可能な分子とを共有結合的にまたは非共有結合的に結合し、標識して検出できる。
所望なら、ＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定を標準化するために、コントロールを１個またはそれ以上含めることができる。例えば、一連のサンプルに実質的に同一量存在すると期待される核酸（たとえば構成的に産生したｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡの一部分、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ）に対応する保護断片１個またはそれ以上を使用することができる。様々な量で存在する核酸（たとえば、ｍＲＮＡ）を測定するための検定において、たとえばゲノムＤＮＡなどの内部補正コントロールを検出し定量する性能は、本検定の保護断片を使用する利点の一つである。
補正基準の量は発現される目的とするｍＲＮＡの量よりも少ないかもしれないので、検定では発現した遺伝子に対応するシグナルが補正基準に対応するシグナルを埋没させないように調整してもよい。シグナル強度を調整する方法は平凡で常用のものであって、当業界の熟練者には明白である。例えば、本明細書に記載するシグナル強度をバランスさせる、いかなる方法（たとえばシグナル減衰、微調整）も使用できる（たとえばブロックしたリンカーを使用すること；ｍＲＮＡを検出するために設計した水準よりも強く補正基準を検出するように設計したシグナル部分を標識すること；補正基準の検出を指定したロカスに補正核酸の異なる部分に対してまたは核酸の異なる部分に対応する保護断片に対して特異的なリンカー複数を配置すること；など）。たとえば本明細書に記載する方法によって補正基準および目的とする核酸標的（たとえばｍＲＮＡ）を同時または順次に検出することもできる。実施例２８および図２９は内部ＤＮＡ補正基準を用いてｍＲＮＡ検定を行う典型的な実験を例示する。
好適な態様では保護断片を、たとえば標的特異的レポーターとハイブリッド形成させるよりも、直接的に標識する。例えばレポーターは、たとえばストレプトアビジン酵素複合体をビオチン化オリゴヌクレオチドに加えるなど、リガンド−アンチリガンド相互作用を介して保護断片に結合させる。別な例では、この保護断片を化学的に修飾（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または蛍光色素との直接結合によって）し、この化学修飾を保護断片の核酸部分を使用するかまたは使用しないで（たとえば酵素的または化学的処理によって修飾を切除した後に）検出する。前記方法のいずれにおいても、保護断片は対応するリンカー分子とハイブリッドを形成する前または後に標識できる。
ヌクレアーゼ保護操作の妥当な進行、すなわち非ハイブリッド形成核酸が所望のように消化されること、を制御するために、操作が妥当に進行すればヌクレアーゼにより切断されるオーバーハング（非ハイブリッド形成）セグメントを含む保護断片１種またはそれ以上を設計することができる。オーバーハング断片の存否は相補性の標識検出プローブとハイブリッド形成させて判定するかまたは保護断片自体のオーバーハング部分を検出可能な分子を共有結合または非共有結合させて標識することもできる。この制御はサンプルをプローブアレイと接触する前にまたはＭＡＰＳ検定自体の一部としても実行できる。このようなコントロール検定の例を実施例１５に記載する。勿論、異なる標識は容易に区別できるので（たとえば異なる吸収スペクトルを持つ Fluors ）、標識の異なる数種のオリゴヌクレオチドを一つの検定に含めることができる。さらにゲル電気泳動で分析する標準的ヌクレアーゼ保護検定を検定開発の間に使用すればその保護断片が期待通りに操作されることを検証できる。
ヌクレアーゼ消化を補正するためのその他のコントロールは、当業界の熟練者には明白になる。例えばその検定にサンプル内にある核酸のいずれにも特異的でないことが知られているヌクレアーゼ保護断片を含めることができる（たとえば植物核酸の検定では、植物にはないことが知られている動物遺伝子に特異的な保護断片を含める）。
標的の検出後、検出プローブ（たとえばＨＲＰ標識）シグナルを除去（たとえば、変性、分解、消滅、抑制、遮断）し、プレートを洗浄して、次工程を妨害するかもしれない残留する試薬、薬剤または緩衝液（たとえば変性剤）を除き、次にオーバーハングを別な検出プローブ（たとえばＨＲＰ標識）で検出することができる。あるシグナル発生部分にシグナルを変性し、それに続いて別な検出プローブを加える操作は、検定の様々な段階で使用できる。変性またはシグナル遮断なしに２種の異なるプローブおよび二重の呈色検出の利用を用いることもできる。
本発明の一態様では前記のように、オリゴヌクレオチドプローブ構造多形１種またはそれ以上を含む核酸のスクリーニングをするために使用できる。好適な態様では、核酸（たとえばゲノムＤＮＡのようなＤＮＡまたはたとえばｍＲＮＡのようなＲＮＡ）はＳＮＰ１種またはそれ以上を含む。業界で認められた定例的な操作を使用してこの操作を実行できる。例えば既知のＳＮＰを有するＤＮＡまたはそのようなＤＮＡから発現されたｍＲＮＡをスクリーニングするために「ＳＮＰ特異的な」保護断片をこのＳＮＰを含むかもしれない核酸を含むサンプルにハイブリッド形成させる。ここでは「ＳＮＰ特異的な」保護断片とはＳＮＰの変化した塩基を有する保護断片またはｍＲＮＡを分析するならばその配列の逆相補体を有する保護断片を意味する。このサンプルを次に適当なヌクレアーゼ１種またはそれ以上で処理し、実験的に決定できる適当な条件下に非ハイブリッド形成一重鎖核酸を消化して、二重鎖核酸（たとえばＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、その他）をミスマッチ部位（たとえば単一塩基ミスマッチ）で切断する。適当なヌクレアーゼにはたとえばＳ１またはＲＨＡｓｅ−Ｈを含む。ＳＮＰを含む核酸がサンプル内に存在し、ＳＮＰ特異的保護断片とハイブリッドを形成するならば、その保護断片は消化操作に耐えて無傷のまま残存するので、ＭＡＰＳ検定に付し、検出プローブまたは保護断片の配列に特異的な検出オリゴヌクレオチドによって検出することができる。ＳＮＰを含まない核酸はＳＮＰ特異的保護断片と対応するその核酸にある野生型配列との間のミスマッチ部位で切断されることになる。所望ならば切断部位からどちらかの遠位または隣接位にある保護断片の部分は常法を使用して除去できる（たとえば熱変性、酵素的切断など）。切断した分子（またはその一部）がリンカーに結合しないように、またはその切断した分子の一部がリンカーに結合するとしてもその分子が適切に設計された検出プローブまたは検出オリゴヌクレオチドによって検出されないように設計できる。実施例２９、図３０、図３１は本発明の検定法が発現したＳＮＰにある単一塩基ミスマッチを検出できることを例示する。実施例３２（図４１）にはたとえばゲノムＤＮＡ中のＳＮＰ検出などに適用できる、ＳＮＰを検出するための検定を例示する。
ＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定はサンプル内にある標的の量を定量するために使用できる。ハイブリッド形成反応を完了させるために標的よりも大過剰モルの保護断片を加えるならば、ヌクレアーゼ保護工程後に残留する保護断片の量はサンプル内に存在する標的の量を反映する。そのような定量反応の一例を実施例１２および１３に記載する。
本発明の一態様では、サンプル内にある種々の型の標的、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞内蛋白質および分泌蛋白質などの様々な組合せをプローブアレイ１個で検定できる。例えば図４０、図４１を参照。
標準的ＭＡＰＳ検定を使用する前記方法はいずれもＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定を使用して実行することもできる。
好適な態様では、ポリヌクレオチド保護断片はＭＡＰＳプレートではなくてマススペクトルで測定する。最も好適な態様では、ハイブリッド形成工程またはヌクレアーゼ消化工程の間はポリヌクレオチドを固体表面に結合（付着）させない。ハイブリッド形成後、ハイブリッドを形成した標的をたとえばヌクレアーゼまたは化学処理で分解して標的にハイブリッド形成した断片の量に直接的に比例する量の保護断片を得ることができる。あるいは、さらに分析すべき、ハイブリッドを形成した標的の部分（一本鎖）またはハイブリッドを形成した標的と保護断片とが形成する二重鎖が得られるようにサンプルを処理することができる。分析すべきサンプルは、残留するハイブリッド形成／ヌクレアーゼ混合物から分離（例えばエタノール沈殿または吸着または親和性クロマトグラフなどによる）し、溶離または可溶化し、高処理能ループインジェクションによって質量分析器に注入する。好適な態様では、分析すべきサンプル（たとえば保護断片）を表面に吸着し、当技術分野でよく知られた方法を用いてレーザー脱着で分析する。最高感度フーリエ変換マススペクトル（ＦＴＭＳ）（または他の同様な進歩的技術）を使用すれば各保護断片をフェムトモルまたはそれ以下まで検出できる。
サンプル１個（またはそれ以上）内にある検出すべき保護断片は、使用する質量分析器に特有なシグナルを与えるように設計できる。一態様では、ハイブリッド形成およびヌクレアーゼ処理の後に各保護断片は独特な分子量を持ち、その分子量および特徴的なイオン化および断片化のパターンはその濃度測定のために十分なものとなろう。感度を高めるためまたは複雑な混合物の分析に役立てるために明瞭な独特のシグナルが得られるように設計した化学基で保護断片を修飾（たとえば誘導体化）してもよい。例えば各保護断片はオリゴヌクレオチド鎖にそのハイブリッド形成部分に沿った位置１個またはそれ以上でアミド結合を介して付着する各種天然または非天然アミノ酸で誘導体化できる。適当なエネルギーの質量分析器を用いるとアミド結合でフラグメンテーションが起きて特徴的な比率のアミノ酸が放出される。質量分析タグとして中庸なサイズ（およそ分子量８０〜２００）の化学基を用いるこの種の手法は、このサイズの分子は一般に検出しやすいので、望ましい。別な例ではこの化学修飾は、たとえばアミノ酸などの他の分子を誘導体化できるたとえばテトラアルキルアンモニウム基のように特徴的なマススペクトルシグナルを示す有機分子である。別な例では、陽イオンまたは陰イオンのシグナルを各種試薬のいずれかとの反応によって強化する。例えば陽イオン検出を強化するために、ピリリウム塩（たとえば２−４−ジテニル、６−エチル−ピリリウム−テトラフルオロボレート、その他多数）をアミンと反応させてピリジニウム塩を形成することができる；多数ある強化剤のいずれかを使用して他の陽性に帯電した官能基を形成してもよい（たとえば Quirke et al (1994) Analytical Chemistry 66, 1302-1315参照）。同様に、業界で認められている試薬多数のいずれかを反応させて陰イオンが強化された分子種を形成することができる。勿論、この化学修飾は核酸から切断後にまたは核酸と会合している間に検出することもできる。各保護断片を識別できる様式で確認できるようにすることによって、さらに多数の様々な標的（たとえば２、６、１０、１６個またはそれ以上の標的）を、１回の検定で分析すること（たとえばスクリーニング）が可能である。そのような検定は、迅速かつ容易に実行できる。そのような検定または検定のセットは、本明細書に定義する高処理能で行うことができる。
オリゴヌクレオチドがその質量によって直接検出されるかどうかに拘らず、または独特の分子タグを使用するかどうかに拘らず、検出すべき各分子のシグナルは既知濃度の純粋な製品で完全に判断することができる。これでシグナルの正確な定量（測定、定量化）が可能になる。質量分析で検出すべき分子の強度とプロファイルはいずれについても正確な予測は不可能である。分子のイオン化傾向、分子内でフラグメンテーションする化学結合の感度、各断片が一価または多価に荷電する程度、は複雑すぎて予測不能である。しかし、固定されたエネルギーと固定されたサンプル操作特性を持つ装置が与えられれば、シグナルの強度とプロファイルは再現性が非常に高い。それ故、各プローブについてシグナルを純粋な標準品で特徴付け、実験的シグナルを定量的に正確に翻訳する。
一側面では、本発明は目的とする核酸を含むサンプルを保護断片１種またはそれ以上を用いるヌクレアーゼ保護反応に付し、ハイブリッドを形成した二重鎖分子または保護された核酸または保護断片を質量分析で検出することを含む、目的とする核酸１種またはそれ以上を検出する方法に関する。
核酸を質量分析で分析する方法は、当業界でよく知られている。たとえば Alper et al (1998) Science 279, 2044-2045 and Koster, U.S. Pat. No. 5,605,798を参照。
前記の各種の高処理能検定法に加えて、他に多くの方法が当業界の熟練者には明らかになろう。
多プローブ検定を用いる利点の一つは多数の「コントロール」プローブを各プローブアレイに含めて、実際の実験プローブと同じ反応条件に付すことができる性能にある。たとえばアレイの各領域は陽性コントロールおよび／または陰性コントロールを有することができる。本明細書で使用する用語「陽性コントロールプローブ」は、たとえば実質的に標的と相互作用することが知られているか、または既知の様式で標的と定量的または定性的に相互作用することが知られており、それによってプローブ／標的相互作用の（内部）基準の役目をするコントロールプローブを意味する。このようなプローブは例えばハイブリッド形成効率についてコントロールできる。本明細書で使用する用語「陰性コントロールプローブ」は、標的とは実質的に相互作用しないことが知られているコントロールプローブを意味し、例えばハイブリッド形成特異性についてコントロールできる。採用できる型のコントロールの例として、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いてある疾患に対する相関遺伝子セットの発現を変調する薬剤についてスクリーニングする検定を考える。たとえば各サンプルについて溶解した細胞の数、回収ｍＲＮＡまたはハイブリッド形成効率のような変数の内部基準コントロールとして、プローブアレイにはたとえば遺伝子の発現が試験対象の薬剤で変調されるとは期待されない構造遺伝子（たとえばアクチン、チューブリン、その他）またはＤＮＡ結合蛋白質（たとえば転写制御因子、その他）のような１種またはそれ以上の基礎濃度または構成的ハウスキーピング遺伝子に特異的なプローブを有することができる。さらに、試験すべき薬剤がたとえば細胞死または細胞毒性のような望ましくない副作用を起こすかどうかを判定するために、プローブアレイにはアポトーシス（プログラムされた細胞死）過程の一部で誘導されるか、細胞障害の状況下（たとえば心臓発作蛋白質）または細胞毒性の状況下（たとえばｐ４５０遺伝子）に誘導されることが知られている遺伝子に特異的なプローブを含めることができる。
他のコントロールプローブも検定の感度を「微調整」するためにアレイに導入できる。例えば特定の病状に関連するｍＲＮＡの産生を変調する薬剤の検定を考える。予備実験分析がこのセットの相関性ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ−Ａ）の一つが他と比べて大量に産生されてそのシグナルが他のｍＲＮＡシグナルを埋没してしまうことを示したらば、リンカーを調整してシグナル強度を等化するように検定を「微調整」することができる。ｍＲＮＡ−Ａ標的を指向するが、プローブ特異的配列を有しないアンカー特異的オリゴヌクレオチド配列を有する「ブロックされたリンカー」を加えて標的特異的なリンカーのプールを希釈して、ｍＲＮＡ検定の感度を低下させることができる。当業界の熟練者は遮断されたおよび遮断されていないリンカーの適当な比率を平凡な常法で判定できる。
不活性要素を用いる活性要素の希釈による特定標的に対する検定の「微調整」は、本検定の別な段階でも実行できる。例えば、標識した標的特異的なレポーターを、たとえば同じ標的特異的な部分（たとえばオリゴヌクレオチド配列）を持つが、シグナル発生部分を持たないか、またはシグナル発生部が不活性化されたか、不活性型である「不活性」で標的特異的なレポーターで希釈することによって検出のレベルで行うことができる。本明細書で使用する用語「シグナル発生部分」は標識、タグ、分子またはその他の検出シグナルを放射する物質、または本明細書に記載するシグナルを発生できる物質（例えば蛍光性分子、発光酵素または様々なシグナル発生部分）を示す。特に好適な態様では、この「微調整」は標的含有複合体と検出リンカーとを接触させる段階で行うことができる。（検出リンカーはたとえばサンドウィッチ型複合体検出法などに関連して以下の部分で説明する：実施例２３および図２４）。たとえば検出において各標的の感度を微調整するために検出リンカーのセットを設計できる。例えば特定の標的がサンプル内に非常に高い濃度で存在することが知られていれば、その標的に対する検出リンカーを実験的に判定した量の「ブロックされた検出リンカー」、すなわち標的特異的部分（たとえばオリゴヌクレオチド配列）を有するが、レポーター剤（reporter reagent.）に特異的な部分がないものか、または標的特異的な部分とレポーター剤特異的な部分を有するが、これを予め不活性化レポーター剤に結合したもの、で希釈できる。すなわち、レポーター剤に特異的な部分を有する代わりに、その部分が不在であるか、またはレポーター剤との相互作用（たとえばハイブッリッド形成）を阻止（たとえばブロック）されたものである。このような微調整を本明細書ではシグナルの「減衰」と称する。図２８はそのようなシグナル減衰を行った実験を示す。
本発明の検定で試験するサンプルは前記標的またはその他のいずれかを有することができる。検定すべき液体サンプルは試験領域のサイズに適する約１００ナノリットル〜１００μＬまでの範囲のいかなる容量であってもよい。好適な態様では、約１μＬの液滴を１５３６ウェルマイクロタイター皿の各ウェルに加える。サンプルは、たとえばピペッティング、インクジェットに基づく分配または反復ピンツールの使用など高処理能分析に適する様々の方法のいずれかによってプローブアレイに接触させることができる。サンプルをプローブと標的との結合を達成するためまたはその他の安定な相互作用のために有効な条件下（たとえば前記の塩類濃度、ｐＨ、温度、インキュベーション時間など）にインキュベーションする。これらの条件は常法で決定できる。インキュベーション後、サンプルを要すれば処理（たとえば洗浄）して特異的な相互作用はそのまま残るが非特異的に結合した材料は除去する実験的に判定した条件を使用して非結合標的を除去する。例えば、サンプルをプローブ／標的結合に使用したものと比べて同一またはややストリンジェンシーの高い条件下に約１回〜１０回またはそれ以上の範囲で洗浄する。
標的ＲＮＡ、たとえばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは全ＲＮＡを含むサンプルは、様々な操作法のいずれかによって調製できる。例えば、ｍＲＮＡを抽出すべきインビトロ細胞培養物をたとえばマイクロタイタープレートの各ウェルのような表面の領域上に塗布する。要すればこの細胞は、所望の細胞密度に達した後に、たとえば細胞に添加できる促進剤または治療剤候補のような目的とする薬剤を、たとえば反復ピンツール（Beckman 社から購入できる９６または３８４ピンツールのような）によって、ピペッティングによって、またはインクジェット分配によってなど、様々な手段のいずれかによって細胞に加えて処理し、さらに検査法に依存して約１５分間から約４８時間の適当な時間にわたって細胞とインキュベーションすることができる。インビトロまたはインビボ起源の組織または細胞から得た全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の抽出物は常用の業界で認められた方法（たとえば市販のキット）を使用して調製できる。
一態様において、ヌクレアーゼ保護断片の存在または不在下に細胞を溶解（または浸透可能化）し、粗製溶解物をたとえば他の細胞成分などからそれ以上精製せずに（たとえばマイクロタイタープレートのウェル中で）直接使用する。細胞をヌクレアーゼ保護断片不在下に溶解すれば、後で保護断片を細胞溶解物に加えることもできる。
たとえばヌクレアーゼ保護断片を検出するなどの好適な態様では目的とする細胞（たとえばマイクロタイタープレートのウェル表面上の細胞、組織または全生物サンプル中の細胞、その他）を界面活性剤または洗剤（たとえば約０.０１〜約０.５％ｗ／ｖのＳＤＳ）および単独でまたは他の試薬１種またはそれ以上と組合せるとカオトロープ剤として作用する試薬（たとえばホルムアミド（たとえば約８〜約６０％、ｖ／ｖ）、塩酸グアニジン（たとえば約０．１〜約６Ｍ）、イソチオシアン酸グアニジウム（たとえば約０．０５〜約８Ｍ）または尿素（たとえば約４０〜４６％ｗ／ｖまたは約７Ｍ））を添加した水性媒体（細胞溶解溶液）と接触させることによってサンプルを製造する。この水性媒体はいずれの標準的緩衝液で緩衝化してもよい。好適な態様では、この緩衝液は約０．５〜６×ＳＳＣ、より好ましくは約３×ＳＳＣである。要すれば水性媒体にはさらにｔＲＮＡを適当な濃度、たとえば約０.１〜２.０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０.５ｍｇ／ｍＬで加えることができる。ヌクレアーゼ保護断片は細胞に加える前の水性媒体に添加してもよい。各保護断片の最適濃度は常法に従って実験的に判定できる。好適な態様では、各保護断片の濃度は約３〜約３００ｐＭ、より好ましくは約３０ｐＭである。
水性溶液中で細胞が浸透性になり、および／または溶解して、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡが細胞から液体培地に放出されるまで細胞をインキュベーションする。細胞は水性媒体中で実験的に判定できる時間にわたって（たとえば約１〜６０分間）、実験的に判定できる最適温度（たとえば約３７℃〜約１１５℃、好ましくは約９０℃〜約１１５℃）でインキュベーションする。
例えば、ＤＮＡとＲＮＡの双方を保護断片と結合できる変性された形で細胞から放出させる一態様では、細胞を約１〜約６０分間、好ましくは約５〜約２０分間水性媒体中で約９０℃〜約１１５℃、好ましくは約１０５℃でインキュベーションする。たとえばＲＮＡ不在下にＤＮＡの検定を所望するときは、インキュベーション混合物に様々な通常のリボヌクレアーゼのいずれかを添加できる。適当なリボヌクレアーゼの選択および消化条件の最適化は平凡な常用のものであって、熟練した業者は容易に判断できる。
別な態様では、ｍＲＮＡは細胞を約５〜約２０分間、好ましくは約１０分間、水性媒体中で約９０〜約１００℃、好ましくは約９５℃で、要すれば保護断片１種またはそれ以上の存在下にインキュベーションすることによって調製できる。この場合、ｍＲＮＡは細胞から保護断片に結合できる変性された形で実質的に放出されるが、ＤＮＡは実質的に細胞内部に残留するか、細胞に付着して残留するか、または二重鎖の性質のためにプローブへの取込がないか、または細胞から放出されるが保護断片に結合できない形（たとえば未変性）にある。いかなる特定の機序に拘束されようとは思わないが、核酸が溶解／浸透可能化された細胞から放出されると十分に変性されて保護断片への結合が可能になって安定な二重鎖を形成するように思われる。この安定な二重鎖は内在性または外来性の薬剤または酵素による分解に抵抗性であって細胞内蛋白質は（たとえばヌクレアーゼ）は変性され、および／または不活性化される。
前記操作による目的とする核酸の製造に続いて、水性媒体が外因性に添加された、たとえばヌクレアーゼ（たとえばＳ１ヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ（たとえばＰＣＲ反応に必要なポリメラーゼ）または結合蛋白質（たとえばストレプトアビジン）のような蛋白質の機能を阻害しないようにサンプルを適当な容積に希釈することができる。前記のような希釈の量および水溶液中で使用すべき成分の本質および量は常法を用いて実験的に判定できる。
この発明のいずれの方法でも、当業界でよく知られている様々な操作法および／または本明細書に記載する操作法（たとえばヌクレアーゼ保護断片の検出について）のいずれによっても標的に標識（タグ）をつけることができる。例えば、標的分子は検出用シグナルを提供する、たとえば化学発光分子または化学発光分子の産生を触媒する酵素、またはフルオレセイン分子またはｃｙ５のような蛍光性分子、またはキレート化ランタニド金属など時間分解能（time resolved.）蛍光分子または放射性化合物のような化学基と直接または間接に結合できる。あるいは標的は、標的特異的なレポーター（たとえば抗生物質、図１に示すオリゴヌクレオチド、またはプローブおよび標的に関して前記した一般型分子のいずれか）１種またはそれ以上によってプローブと反応した後に標識できる。
蛍光分子の一つの型は、「上方変換（upconverting）燐光物質」、すなわち、長波長の光（たとえばＩＲ）を吸収し、励起され、次に短波長の光（たとえば可視光）を放射するFluor である。上方変換燐光物質は分析すべき典型的なサンプル内に存在する妨害性が予想されるほとんどの物質よりも長波長で吸収するので、上方変換燐光物質は長波長を吸収する燐光物質よりもサンプル内物質に由来する妨害を低減する可能性がある。殆どの上方変換燐光物質の放射スペクトルは狭いので、多数の上方変換燐光物質の同時検出が可能である。上方変換燐光物質は当業界でよく知られており、平凡なものであってたとえば：たとえば希土類金属イオンたとえばイッテルビウム（Ｙｂ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）およびプラセオジミウム（Ｐｒ）、特にオキシスルフィド塩の形のもの、などを含む。８０種またはそれ以上の独立して検出可能な上方変換燐光物質が報告されている（たとえばBiological Agent Detection and Identification, April 27-30, 1999, DARPA, Biological Warfare Defense, Defense Sciences Officeを参照）。燐光物質は要すればたとえばマイクロスフェアまたはラテックスビーズなど、いかなる表面にも付着できる。その他の蛍光性標識と同様に、上方変換燐光物質は十分に近接したリンカー、標的またはレポーター上の標識へのエネルギー遷移（または変調）によって検出可能である。さらに本明細書に開示する他種シグナル発生物と同様に、上方変換燐光物質を用いて標的の量を定量でき、また本明細書に記載する様々な操作のいずれかを用いてたとえばヌクレアーゼ保護断片を検出することもできる。
勿論、上方変換燐光物質はいかなる様式で表面に分布していてもよい標的（ヌクレアーゼ保護断片を含む）、たとえば表面に直接結合する標的、表面上の様々なオリゴヌクレオチドアレイに直接結合する標的、またはアンカー（相違するかまたは実質的に同一な）に双官能性リンカーを介して結合している標的を検出するために使用できる。これは実質的に均等にまたは表面にいかなる所望の系統または模様で分布していてもよい。たとえば通過系またはたとえばビーズのような固体表面など、どのような表面も使用できる。本発明の検定のいずれかで使用するビーズはたとえばいかなる材料の、磁性および／または非磁性の、いかなる型のものでもよく；一つの検定に使用するビーズは実質的に同一または異なるサイズおよび／または形であってもよい。
複雑なサンドウィッチ型の様々な検出操作も採用できる。例えば、標的と標的に特異的な第一部分および共通の（すなわち同一な）レポーター剤たとえば標識ポリヌクレオチド、抗体、その他によって認識される第二部分を含む双官能性分子とのハイブリッドを形成する。この双官能性分子は任意な所望数の共通レポーターを各検定で使用できるように設計できる。
本発明のいずれの方法についても、標的に標識（タグ）を付けるために様々の複雑なサンドウィッチ型複合体検出操作を採用することができる。例えば標的を、標的に特異的な第一部分および「レポーター剤」に特異的な第二部分を持つ双官能性（または多官能性）分子（「検出リンカー」）と、たとえばハイブリッド形成などで相互作用させることができる。用語「に特異的」は本明細書では、たとえばプローブと標的などとの相互作用に関する意味を持つ。本明細書で使用する用語「レポーター剤」は本明細書では標識されたポリヌクレオチド、抗体または本明細書にプローブと標的に関連して記述した一般型の分子いずれかを示す。検出リンカーのこの部分２箇所はたとえばプローブと標的に関連して前記したいずれかの様式で各々の結合相手を認識（相互作用または会合）できる。検出リンカーも他種の配列、たとえば標的に特異的であるが、対応するアンカー結合リンカーの標的特異的な部分とは異なる配列（非重複）を有することができる。検出リンカーに存在するいかなる配列も検出プローブまたはレポーター剤のための認識部位としても役立つ。好適な態様では、検出リンカーはポリヌクレオチドである。
検出リンカーは所望数の共通レポーター剤を検定に使用できるように設計できる。例えば検出リンカーのセットは各検出リンカーが異なる標的に特異的であるが、少数なレポーター剤の一つに同一（共通）の結合部位を持つように設計することもできる。１回の検定で様々な標的を標識するために少数（たとえば１個）のレポーター剤を使える性能は費用低下およびバックグラウンド値低減の利点を提供する。勿論、検出リンカー／レポーター剤の組合せは上方変換燐光物質が検出できる標的配置型についてたとえば前記したように表面にいずれかの様式で分布している標的を検出するために使用できる。
最も好適な態様では、ヌクレアーゼ保護操作（たとえば実施例１５に記載）の間に対照の「オーバーハング」配列からヌクレアーゼで切断した保護断片が優先的に標識されるようにヌクレアーゼ保護断片を検出するための検出リンカーを設計できる。図２４にこの型の検出操作を図式的に例示する。この態様では検出リンカーは標的に特異的な第一部分および共通コントロールオーバーハング配列に特異的な第二部分を有し、好適な態様では、実質的に全てのヌクレアーゼ保護断片上に検定開始の時点で存在する。所望であれば、コントロールオーバーハング配列がヌクレアーゼ保護反応の間にヌクレアーゼ保護断片から切断されれば、検出リンカーの標的特異的部分は切断された保護断片とハイブリッドを形成するが、検出リンカーのコントロールオーバーハング特異的部分は非結合のままで、さらなるハイブリッド形成を受けうる。他方、コントロールオーバーハング特異的配列は保護断片から切断されない。たとえばヌクレアーゼ保護操作の間のヌクレアーゼ消化が不完全なために、検出リンカーの標的特異的部分およびコントロールオーバーハング特異的部分の両方が保護断片にハイブリッド形成してそれ以上のハイブリッド形成を起こさない。好適な態様では、ヌクレアーゼ保護断片および結合した検出リンカーを含む複合体は次にレポーター剤へのさらなる工程でハイブリッドを形成する。このレポーター剤はシグナル発生部分（たとえば前記のようなフルオロクローム、ハプテン、酵素、または検出可能なシグナルまたはシグナル作製部分を有する他の分子）および特異的な検出リンカーのコントロールオーバーハング特異的部分に特異的な部分（例えばオリゴヌクレオチド）を有する。レポーター剤は優先的に複合体に結合し、複合体を標識する。この複合体ではヌクレアーゼ保護断片のコントロールオーバーハング配列が切断される（すなわち検出リンカーのコントロールオーバーハング特異的部分がレポーター剤へのハイブリッド形成にさらに利用できる複合体）。
サンドウィッチ検出操作の無数の変種は、当業界の熟練者には明白である。
標的を結合またはその他の安定な相互作用を達成するために有効な条件下に標的特異的レポーターまたは標的／検出リンカー複合体をレポーター剤とインキュベーションする方法は慣例的に判定できる（前記）。例えば蛍光オリゴヌクレオチドレポーター（濃度約１０ｎＭ〜約１μＭまたはそれ以上、より好ましくは約３０ｎＭ、６×ＳＳＰＥ−Ｔ、その他の緩衝液中）を、結合した標的と共に約１５分間から２時間またはそれ以上の間（好ましくは約３０〜６０分間）、約１５〜約４５℃の温度（好ましくは約室温）でインキュベーションすることができる。インキュベーション後、所望ならサンプルを処理（たとえば洗浄）して実験的に決定できる条件を用いて非結合標的特異的レポーターを除去し、特異的相互作用産物はそのまま残し、非特異的結合した物質を除去する。例えば, サンプルは約１回から約１０回またはそれ以上の間で標的／レポーター結合を達成するに用いたものと同一またはやや強いストリンジェンシー条件で洗浄できる。
標的特異的レポーターによるタグ付けは、たとえば標的特異的オリゴヌクレオチドレポーターをプローブオリゴヌクレオチドよりも標的核酸の配列の様々な部分に指向させる場合、またはプローブおよびレポーター抗体が標的抗原の様々なエピトープを認識する場合など、最初のハイブリッド形成反応に別の特異性を追加的に提供することができる。さらに標的特異的レポーターによるタグ付けは、反応の感度「調整」を可能にする。例えば相関発現パターンの一部である標的ｍＲＮＡが非常に低い水準で発現されるならば、結合した標的を数個（たとえば約２〜約５個またはそれ以上）の各々標的ｍＲＮＡの異なる部分に特異的にハイブリッド形成する標的特異的オリゴヌクレオチドレポーターとハイブリッドを形成させることによってシグナルのレベルを強化できる（シグナル増幅）。
２個の標識を独立に検出する性能はＭＡＰＳ検定に別なタイプのコントロールを可能にする。特定のアンカーロカス（図７は典型的なアンカーロカス３個を示し、各々が実質的に同一な複数のアンカー（Ａ、ＢまたはＣ）を有する）を指定するリンカーの一部（たとえば約１０〜約１００％）の一端に標識（たとえば Fluor）を付着することができる。例えばリンカーの５'末端にローダミンまたはＣｙ５−Fluorを付着させることができる。このような修飾リンカーを「コントロールリンカー」と称する。リンカーとコントロールリンカーとの混合物をアンカーと会合させ、得られるプローブアレイと標的含有サンプルとをインキュベーションした後、異なる Fluor（たとえばフルオレセインまたはその他のたとえば化学発光体のような検出ラベル）を有する標的特異的レポーターを用いることができ（または標的をFluor またはその他の検出標識で直接的に標識できる）；シグナル２個の比率を判定できる。コントロールリンカーの存在は試験領域内および試験領域間にある機能的（たとえばリンカーとの相互作用可能性など）アンカー数の補正（すなわちシグナル標準化の目的で行うアレイの各ロカスが標的に結合する容量のテスト）を可能にし、結合した標的の定量化の根拠を提供し、アンカーロカスの特定を促進し、および／またはたとえばサンプルに標的不在のためシグナルがない場合のためなどにポジティブコントロールを提供する。本発明の一態様において、異なる標識２種（たとえば発蛍光団）も標的分子の２種の異なる母集団を検出するために使用できる；しかし、シグナルの空間的解像によって標的の存在を認識する性能は異なる標的分子に対して１タイプの標識の使用を可能にする。
標識を独立に検出する性能（たとえばフルオレセイン、ローダミンのように識別可能な波長を放射する蛍光標識または異なる上方変換燐光物質、その他）は本発明方法にさらに追加的な柔軟性を与える。例えば２個またはそれ以上の標的それ自体の独特に検出可能な標識で直接的または間接的に標識できる。これが、たとえば表面に位置する標的の場所確認または標的が存在するビーズの大きさによる確認などに加えて（またはこれらの確認の代わりに）標識に特異的な特徴（たとえば放射の色）に基づく標的の検出を可能にする。本発明の別な態様では、領域内の単一ロカスにおいて多数の標的を独立に検出できる。例えば標的２個またはそれ以上（たとえば２、３、４、５、６個またはそれ以上）を一群の（実質的に同一な）アンカーで定義される単一ロカス内で検出できる。すなわち、各々が同一のアンカーに特異的なアンカー特異的部分プラス異なる標的に特異的な標的特異的な部分を持つ、リンカーのセットを使用できる。そのようなリンカーたとえば４個のセットを使えば、４個とも１個のロカス内のアンカー群に結合でき、そのロカスでは異なる標的４個の結合が可能になる。これらの各標的を区別可能な異なる標識で（直接または間接に）標識すれば、研究者はそのロカス内にある標的４種各々の存在を独立に判定できる。それ故、一領域内のアンカーたとえば５個（アンカー群）のアレイを用いて前記シナリオにより２０個までの標的を検出できる。このような検定を実施例２４および図２５に例示する。同様に、一形式のアンカーがたとえばビーズまたは通過装置のような固体表面上に分布している時には、単一ロカス内でなく均一にまたは所望の様式で複数（たとえば８０個までまたはそれ以上）の標的を独立に検出できる；たとえばビーズのサイズまたは散布度のような別種の側面を用いて標的の同一性または標的群に関する情報を取得できる。
標的特異性の異なるリンカー多数（たとえば約２〜約５０個またはそれ以上の範囲）と所与のロカス（実質的に同一なアンカー群または「混合ロカス」）内のアンカーとの会合を本明細書は時々「混合リンカー」記載し、本発明の別な態様の根拠を形成するが、これは当業界の熟練者には明白になる。例えば所与ロカス内でアンカーは様々な保護断片複数に特異的なリンカーの混合物に結合でき、この各保護断片は目的とする核酸（たとえばｍＲＮＡ）の異なる部分に対応する（特異性を持つ）。あるロカス内の様々なリンカー複数の存在は、たとえばサンプル内に、低い存在度で含まれる目的とする標的（たとえばｍＲＮＡ）の検出感度をかなり向上させる。ｍＲＮＡの様々な部分に対応するリンカーのそのロカスを指定する数がサンプル内ｍＲＮＡの存在度に反比例するように（実験的に判定できる様式で）各ロカスを設計できる。例えば、予備実験で目的とするｍＲＮＡ１個がサンプル内に第二の目的とするｍＲＮＡよりも大過剰に存在することが判明すれば、このｍＲＮＡ２種の様々な部分に対応するリンカーの相対的な数を各ｍＲＮＡに対応する相対的シグナル強度が実質的に同一になるように調整できる。すなわち、第一のｍＲＮＡに対応するシグナルに第二のｍＲＮＡに対応するシグナルが埋没しないようにシグナル強度を調整できる。このようにして、サンプル内に存在する量が極めて異なる各ｍＲＮＡに対応するシグナル強度をバランスさせて複数ｍＲＮＡの同時検出が可能になるように検定を調整できる。
本発明の別な態様では、前記のように、所与のロカスは無関係なまたは相違する複数の標的または保護断片に特異的なリンカーを有することができ、これでアンカーの単一なアレイを用いる非常に多数の標的または保護断片の検出が可能になる。例えば３５０アンカーのアレイを持つ各ロカスが異なる標的１０個に特異的なリンカーを有すれば、このアレイを用いて３５００個までの標的を検出できる。実際、このような脚色で低密度の標的を検出できるアレイを高密度の標的を検出できるものに変換できるようになる。
単一ロカスに結合した多数の分子（たとえば保護断片）はたとえば本明細書に記載する検出方法を使用して順次または逐次に検出できる。（「検出リンカー」および「レポーター剤」に関しては複合体サンドウィッチ型の検出法に関する前記の記載を参照）。一態様において、所与のロカスにあるたとえば第一の検出システム（たとえば検出リンカー／レポーター剤またはそれに特異的な検出プローブ）で第一の標的（たとえば保護断片）を検出する；次に第一の検出リンカー／レポーター剤またはプローブを通常の操作を用いて除去または不活性化する（たとえば化学発光シグナルを発生する酵素を含むレポーター剤をｐＨを変えて不活性化する）；および同じロカスにある第二の検出リンカー／レポーター剤または第二の標的に特異的な検出プローブを使用して第二の標的を検出する；および同様に所望の回数反復する。別な態様では、第一の検出リンカー／レポーター剤または検出プローブを前記のようなコンビネーションに加えるが、これは第二の検出リンカー／レポーター剤または検出プローブを加える前には除去または不活性化しない。この態様では、第二の標的に対応するシグナルの量は第一の標的に対応するシグナルの量を引算して判定する。別な態様では、第一および第二の検出リンカー／レポーター剤または検出プローブを前記のようなコンビネーションに実質的に同時に加え、たとえば個別に検出可能な本明細書に記載する標識を用いて個々に検出する。本明細書に記載する検出法のいずれにおいても、検出リンカーは同一または異なるレポーター剤に特異的な部分を有することができる。例えば所与のロカス内で標的４個がリンカーに会合していれば、各標的４個に特異的な検出リンカーは異なるレポーター剤に特異的な部分を有することができる。それ故、検出リンカー全４種のセットを標的にハイブリッド形成させた後、前記のように異なるレポーター剤４種を使用して標的を順次または同時に検出できる。その他の検出法ならびに前記方法の組合せは当業界の熟練者には明白になろう。
勿論、「混合リンカー」は単一の (非反復) 領域を含む表面での使用にも有利である。
本発明の別な態様では目的とする標的に特異的な「アンカー」は、リンカーとは会合しないが、標的に直接的に会合する；この標的は要すれば今度は検出リンカーまたは検出プローブと相互作用できる。
標識されていてもいなくても標的は当業界では常用的で平凡な様々な操作のいずれによっても検出できる。（たとえば Fodor et al (1996) U.S. Pat. No. 5,510,270; Pirrung et al (1992) U.S. Pat. No. 5,143,854; Koster (1997) U.S. Pat. No. 5,605,798; Hollis et al (1997) U.S. Pat. No. 5,653,939; Heller (1996) U.S. Pat. No. 5,565,322; Eggers et al (1997) U.S. Pat. No. 5,670,322; Lipshutz et al (1995) BioTechniques 19, 442-447; Southern (1996) Trends in Genetics 12, 110-115を参照）。検出法には、酵素に基づく検出、比色法、ＳＰＡ、オートラジオグラフィー、質量分析、電気的方法、吸光度または発光度の検出（化学発光または電気発光を含む）およびタグとして用いる顕微鏡的粒子からの光散乱の検出を含む。また、蛍光標識はたとえば電荷結合装置（ＣＣＤ）または蛍光顕微鏡（たとえば走査または共焦点蛍光顕微鏡）によって撮影することによって；または走査システムをＣＣＤアレイまたは光増倍管と結合することによって；またはアレイに基づく検出技術（たとえば、試験領域の各１０ミクロン部分の表面電位が検出できるか；または解像度を十分に高く維持できれば表面プラズモン共鳴を使用できる）を使用することによって検出できる。あるいは、アレイは標識（たとえばフルオレセインおよびローダミンのような、たとえばエネルギー転送プローブのペア一つ）を有することができ、これがリンカー、標的またはレポーター上の標識へのエネルギー転送（またはそれによる変調）によって検出される。蛍光に基づく検出システムのホストの中には、蛍光強度、蛍光偏光（ＦＰ）、時間分解能（time-resolved）蛍光、蛍光共鳴エネルギー転送および均一時間放出蛍光（ＨＴＲＦ）がある。バーコード認識装置および一次元または二次元アレイを分析するコンピュータソフトウェアは常法により作製され、および／または購入できる（たとえばRava et al (1996) U.S. Patent No. 5,545,531を参照）。
検出に使用できる別の方法の一つは二光子蛍光であって、これにはアレイの表面近くに結合することによってアレイ表面に結合する成分の内在性または複合フルオロクロームがアレイの表面近くへの結合、例えばアレイを形成する基質の近くでの存在またはアンカーまたはリンカーまたは結合複合体に含まれるもののごく近くでの存在、によって蛍光を強化する応用を含む。別な蛍光法または利用法にはライフタイム蛍光、偏光、エネルギー転移、その他を含む。例えば、そのような方法で同じロカス内にある標的多数の同時並行的検出および識別が可能になる；場合によっては結合した標識と非結合標識とを弁別でき、アレイからの非結合標識洗浄除去が不要になるために、迅速に可逆的なまたは弱い相互作用のアレイによる測定を加速する。
この発明のアレイを製造・使用する方法は、たとえば本明細書に記載するような表面または領域の製造；たとえば本明細書に記載するようなアンカー、リンカー、プローブおよびディテクタープローブのような物質の合成または精製および付着または会合；および本明細書に記載するような標識またはタグを付けた物質の検出および分析；を含むが、これらはよく知られており、通常の技術である。前記文献に記載された方法に加えて、たとえば、Affymax, Affymetrix, Nanogen, Protogene, Spectragen, Millipore, Beckman（これら各社から本発明に使用する製品を購入できる）に譲渡された特許；前記引用のものを含む分子生物学および蛋白質科学の標準的教科書；および Cozette et al (1991) U.S. Pat. 5,063,081; Southern (1996) Current Opinion in Biotechnology 7, 85-88; Chee et al (1996) Science 274, 610-614; and Fodor et al (1993) Nature 364, 555-556 を参照。
（図面の簡単な説明）
（図１） 図１は、オリゴヌクレオチドの設計図を示す。ここではリンカー１はアンカー１に対して特異的な部分および標的ｍＲＮＡ１に特異的な他の部分（プローブ）を含む；およびここでは標識した検出プローブ１は標的ｍＲＮＡの配列に特異的であるが、この配列はリンカーの標的特異的部分の配列とは異なる。
（図２） 図２は、各々アンカーオリゴヌクレオチド６個のアレイを有する試験領域１５個を有する表面を示す。
（図３） 図３は、受容体結合検定についてリンカーの設計を示す。ここではリンカーのアンカー特異的部分がプローブ部分（受容体蛋白質）にビオチンおよびストレプトアビジン分子を介して会合する；およびここでは受容体に対して特異的なリガンドを蛍光標識分子で標識する。図中、Ｂ：ビオチン。ＳＡ：ストレプトアビジン。Ｒｅｃ：受容体蛋白質。Ｌｉｇａｎｄ：受容体への天然または合成リガンド。*：リガンドに付着した蛍光標識分子；である。
（図４） 図４は、各々さらに副領域１６個（くぼみ、へこみ）に副分割された試験領域２１個を有する表面を示す。
（図５） 図５ａ、図５ｂおよび図５ｃは、図４に示すような表面を組立てるための部品３個を示す。図５ａはウェルの仕切りを示し；図５ｂは副仕切りを示し；図５ｃは基板を示す。
（図６） 図６は、試験領域２個を示す。ここではその各々が「バーコード」様構成のプローブ（またはアンカー）の線状アレイである。
（図７） 図７は、アンカー３種（Ａ、ＢおよびＣ）を有する試験領域を図式的に示す。ここでは各アンカーは多数コピー（「一群」）存在する。各群アンカーの位置を「ロカス」と称する。
（図８） 図８は、特異的逆転写酵素によって作製されたｃＤＮＡをＭＡＰＳプレート上で検定する検定法を示す。
（図９） 図９は、ヌクレアーゼ保護操作を用いる検定（ＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定）を示す。サンプルＲＮＡは細胞または組織から調製され、ここでは細い波線で表す。このＲＮＡサンプルに一群のポリヌクレオチド保護断片を加えるが、これは太線、黒線および白線で描く。保護断片の黒い部分は特異的ＲＮＡ標的に相補性のセグメントを示し、これが標的にハイブリッド形成する。白い区分はオーバーハング部分を示し、この配列は相補性配列に近接しているが、標的には相補性がない。保護断片は過剰に加える。可能な標的全部を保護断片にハイブリッド形成させた後、サンプルをヌクレアーゼの適当なカクテルで処理し、化学的に処理して望まない非ハイブリッド形成ＲＮＡおよび非ハイブリッド形成ポリヌクレオチドを分解する。例えばＳ１ヌクレアーゼは存在する単一鎖をいずれも分解できる。それ故、過剰な保護断片は結合した保護断片のオーバーハングしている非ハイブリッド形成部分と同様に加水分解される。ＲＮＡはリボヌクレアーゼＨを含むリボヌクレアーゼの添加および／またはサンプルを塩基中での加熱で加水分解することができる。残りは切断された保護断片の集合であって、これらはサンプル内に存在した各標的ＲＮＡを反映する。この残留保護断片をＭＡＰＳハイブリッド形成検定で測定する。
（図１０） 図１０は、ＭＡＰＳ検定におけるハイブリッド形成特異性を示す。
（図１１） 図１１は、アンカー対リンカーの結合反応速度論を示す。
（図１２） 図１２は、オリゴヌクレオチド標的２個のＭＡＰＳ検定を示す。
（図１３） 図１３は、感度シフトの定量値を示す。
（図１４） 図１４は、オリゴヌクレオチドリンカー／アンカーの組合せ４種の溶融温度を示す。
（図１５） 図１５は、ＮＰＡ―ＭＡＰＳによるｍＲＮＡ検定を示す。
（図１６） 図１６は、ＮＰＡ―ＭＡＰＳによる希釈曲線を示す。
（図１７） 図１７は、ホスホチロシン残基を含むペプチドを検出する検定を示す。
（図１８） 図１８は、ＥＳＴをマッピングするための検定での第一段階を図示する：ＭＡＰＳプレート上の一般的なアンカーのアレイにマッピングすべきＥＳＴの各々に対応するリンカーを集合させる。異なるオリゴヌクレオチドプローブ１６個を有するリンカーを４×４マトリックスに配置してマイクロプレートのウェル１６個の各表面に付着させる。第一ロカスはオリゴ１を持ち、これは第一ＥＳＴ配列の一部に相補性である；などなど、試験すべきＥＳＴ１６個各々について行う。
ＥＳＴを製造した遺伝子から作製したｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを１６個のウェル全部に加え、適当な条件下にハイブリッド形成させる。それ故、ＥＳＴ配列１６個の一つを含むｃＤＮＡまたはｍＲＮＡは相補性プローブを入れたロカスに集合する。
（図１９） 図１９は、ＭＡＰＳプレートにディテクターオリゴヌクレオチドを加えてＥＳＴをマッピングする検定の次段階を図示する：プレートの各ウェルにマッピングすべきＥＳＴの一つに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを入れる。検出法が蛍光映像法であるならば、各ディテクターオリゴヌクレオチドはたとえばフルオレセインなど検出に使用する分子を結合したオリゴヌクレオチドである。各ディテクターオリゴヌクレオチドはＥＳＴ一つに相補性であるが、ＥＳＴ特異的プローブとは異なるので、プローブと一つのＥＳＴに相補性のディテクターオリゴヌクレオチドとの両方が同時に結合できる。洗浄後、図に記載した番号に従って単一ディテクターオリゴヌクレオチドを各ウェルに加える。すなわち、第一ＥＳＴに相補性の配列を持つディテクターオリゴヌクレオチドを第一のウェルに加える、などそれぞれを反復する。
（図２０） 図２０ａおよび図２０ｂは、図１８および図１９に示すＥＳＴをマッピングする検定の結果を示す。ディテクターオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成および適当なストリンジェンシー条件での洗浄後、マイクロプレートのウェル１６個を例えばＣＣＤ蛍光撮像器で撮影する。例えば２０ａは様式化した結果を示す。各ＥＳＴ特異的ディテクターオリゴヌクレオチドは対応するＥＳＴ特異的プローブによって保持されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを標識することが期待される。例えば, プローブ５は第５のＥＳＴ配列を含むｃＤＮＡまたはｍＲＮＡをこのロカスに集合させ、そこで第５ディテクターオリゴヌクレオチドは同じロカスにあるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリッドを形成するはずである。これは各検出オリゴヌクレオチドに合致するプローブを標識する様式化したデータのケースである。それに加え、最初のディテクターオリゴヌクレオチド３個は各々最初の３個のプローブが保持するｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを標識してこれらの配列が同じ遺伝子上にあることを示す。同様に、最後のＥＳＴ５個は結合していると思われる。これらのデータから割当てられた連関を図２０ｂに図式的に示す。
（図２１） 図２１は、図１８〜図２０に示すプローブ、ディテクターオリゴヌクレオチド、およびＥＳＴ＃１、＃２および＃６との関係を示す。
（図２２） 図２２は、高処理能検定を示す。
（図２３） 図２３は、増幅された標的の製法を示す。
（図２４） 図２４は、検出リンカーおよびレポーター剤による検定を図示する。
（図２５） 図２５は、Flour多数の使用を示す。
（図２６） 図２６は、高処理能検定を示す。
（図２７） 図２７は、ＴＨＰ−１細胞に対する遺伝子の空間的配置をサンプル細胞２種のデータ（図２６から選択）とともに示す。
（図２８） 図２８は、シグナル減衰による検定を示す。
（図２９） 図２９は、たとえばゲノムＤＮＡを標準化コントロールとして役立てるなど、ゲノムＤＮＡと発現したＲＮＡが同じウェルの同じサンプルから測定する検定を示す。左図はＤＮＡ単独の測定を示す；右図はＤＮＡとＧＡＰＤＨ−ＲＮＡとの双方の測定を示す（アレイの各隅で測定）。
（図３０） 図３０は、発現されたＳＮＰの検出を示す。
（図３１） 図３１は、発現されたＳＮＰの検出を示す。
（図３２） 図３２は、検定の感度および再現性を示す。
（図３３） 図３３は、検定の感度および再現性を示す。
（図３４） 図３４は、検定の感度および再現性を示す。
（図３５） 図３５は、検定の感度および再現性を示す。
（図３６） 図３６は、本発明に含まれる検定法の構成の型をいくつか示す。
（図３７） 図３７は、ＰＣＲによるヌクレアーゼ保護断片の増幅を示す。
（図３８） 図３８は、リガーゼによるヌクレアーゼ保護断片の増幅を示す。
（図３９） 図３９は、ヌクレアーゼ保護によるヌクレアーゼ保護断片の増幅を示す。
（図４０） 図４０は、例えば同じサンプルから蛋白質とｍＲＮＡとを一緒に検定するなどの検出法を示す。
（図４１） 図４１は、例えば同じサンプルから蛋白質とｍＲＮＡとを一緒に検定するなどの検出法を示す。
（図４２） 図４２は、ポリメラーゼによるヌクレアーゼ保護断片の増幅を示す。ＳＮＰ検出への応用を図示する。
実施例
実施例１ ハイブリッド形成の特異性（図１０参照）
一般的なＭＡＰＳプレートはピクサス（Pixus system, Cartesian Technologies 社, Irvine, CA）のインクジェットディスペンサーを使用してマイクロタイタープレートの各ウェル内にＤＮＡの同じ格子模様を形成して製造した。オリゴヌクレオチドは全てBiosource International 社（Camarillo, CA）から購入した。このプレートに異なるオリゴヌクレオチドアンカー７種をキー（左側の図）に示すパターンで各ウェル内に吹き付けた。各オリゴヌクレオチドは１０ナノリットル液滴としてスポット２個づつに５００ｍＭ−燐酸ナトリウムｐＨ８．５と１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む２μＭ溶液として DNA Bind plate（Corning Costar 社）のウェルに付け、乾燥させた。付着後、ウェルを５０ｍＭ−トリスｐＨ８でブロックし、表面に共有結合しなかったオリゴヌクレオチドを０．１％ＳＤＳ／５×ＳＳＰ緩衝液で洗って除去した。
洗浄したプレートに蛍光標識したリンカーオリゴヌクレオチドを加え、０．１％トリトンＸ−１００含有６×ＳＳＰＥ中で３０分間、室温でハイブリッド形成させた。これはリンカー付着のために好適なプロトコルである。合成の間に、各リンカーオリゴヌクレオチドをｃｙ５で誘導体化したが、これは特異的にアンカーするオリゴヌクレオチドに対して２５塩基対セグメントとして相補性である。リンカーとアンカー７種の配列は次の通りである（全て５'→３'）。





























Figure 2005525781
 *アンカーは５'−末端のアミドでＣ１２スペーサーを使って合成した。
**リンカーは５'−末端に付着するＣｙ５を使って合成した。
***ディテクターオリゴヌクレオチドは５'−末端に付着するビオチンを使って合成した。
リンカーまたはリンカー混合物（図に示すように）のいずれかを、ウェルごとに加えた（「ａｌｌ」印のウェルには全リンカー７個の混合物を加えた）。インキュベーションおよび５×ＳＳＰで３回洗浄した後、右図に示す蛍光写真を Tundra imager（IRI 社, St. Catherines, Ontario）で撮影した。明らかなようにその相補的アンカーに特異的に会合することによってリンカーが表面に自動的に集合した。
各ウェルに異なるアンカー８個を付け、および続いてそれらにリンカーを優先的に会合させることを除いて、この操作を反復する。２４、９６、３８４、８６４または１５３６ウェル−プレートの各ウェルで異なるアンカー３６種、６４種などを用いて全過程を反復する。
実施例２ 結合反応機構（図１１参照）
様々なリンカー濃度におけるＣｙ５−誘導体化リンカーＮｏ．１とその相補的に付着するアンカーとのハイブリッド形成速度を示す。各ウェル当りスポット４個にアンカー１を付着させる以外は、一般的ＭＡＰＳプレートを図１と同様にして調製した。０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０添加５×ＳＳＰ中室温でインキュベーションを行い、各ウェルを５×ＳＳＰで３回洗浄し、結合した蛍光を測定した。プレートの蛍光写真を Tundra で撮影し、バックグラウンド値を差引き、各ウェル内の各スポットの積分強度を Tundra ソフトウェアで算出した。２個の各複製ウェル２個内にあるスポット４個の積分強度について平均値と標準偏差とをプロットする。
実施例３ 蛍光リンカー
一般的ＭＡＰＳプレートは前記方法に従って、アンカー結合オリゴヌクレオチド１つをウェル当り１スポット（上２列）、ウェル当り４スポット（次の４列）またはウェル当り１６スポット（下２列）のいずれかにスポットして製造する。各ウェルに相補的、蛍光的に標識したリンカーを実施例１に記載の好適なプロトコルによって付着させる。洗浄後、プレートの蛍光写真を Tundra で撮影する。各スポットにおける蛍光の量は標的へのハイブリッド形成を起こす機能的リンカーの量を示す。反復スポットで検出されるシグナルの量は再現性が高い。
実施例４ 結合曲線
実施例３で調製したプレートに様々な濃度の標的オリゴヌクレオチドを加える。会合したリンカーは標的の一部に相補的な２５量体配列を含む。標的を全容量３０または１００μＬの０.０５％ＳＤＳ添加５×ＳＳＣに加え、プレートをカバーし、一夜５０℃でインキュベーションする。標的が付着リンカーとハイブリッドを形成した後、化学発光を用いる好適なプロトコルによって標的を可視化する。標的の別の部分（リンカー相補性部分とは異なる部分）に相補性の２５量体配列を含むビオチン化ディテクターオリゴヌクレオチドを３０ｎＭに加える。ビオチン化検出剤は付着しなかった過剰の標的を洗い去ってから３０分間後に加えるか、または標的とともに一夜にわたるハイブリッド形成反応に加えてもよい。検出剤の付着に続いて、表面を５×ＳＳＣで２回および０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０添加および１％ＰＥＧ（ＳＳＰＴＰ）添加１×ＳＳＰで１回洗浄し、１：５００００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ２５０μｇ／ｍＬストレプトアビジン複合体（ＨＲＰ：ＳＡ、Pierce 社, Rockford, Ill）を室温で５時間ＳＳＰＴＰに加える。ウェルをＳＳＰＴＰで４回洗い、１回洗い、次にSuper Signal Ultra reagent（Pierce 社）とインキュベーションする。数分後に、発光の写真を Tundra 撮影機で撮影するが、たとえばＣＣＤアレイに５分間蓄積して撮影することもできる。ウェル内の低濃度な標的は標的濃度〜５×１０−１３ Ｍで可視化できるが；シグナルの量は一般に標的濃度〜１０−１０Ｍで飽和する。反復スポットに検出されるシグナルの量は高度に再現性がある。
実施例５ オリゴヌクレオチド２種の検定（図１２）
２種の異なる標的オリゴヌクレオチドについて前記プロトコルを使用するＭＡＰＳハイブリッド形成検定を示す結合曲線を示す。アンカーオリゴヌクレオチド４種を用いて各ウェルに４回スポットして一般的ＭＡＰＳプレートを調製した。第２および第４のアンカーについて、相補性リンカーオリゴヌクレオチドは記載のように自動的に表面に集合した。標的２種を記載のように各ウェルに図面記載濃度の４０μＬとして加えて、５０℃で一夜インキュベーションした。標的に付着した量は各標的に特異的なビオチン化検出オリゴヌクレオチドを付着させることによって可視化し、続いて前記のようにＨＲＰ：ＳＡおよび化学発光撮影を行った。下図で映像の強度を定量化する。Tundra Imager package の一部であるソフトウェアを用いて映像の強度を上図に示す矢印の間に示す線に沿って走査した。標的の最低濃度１.１ｐＭで走査した映像は各スポットで良好なガウス型のピークを示す一方、標的濃度ゼロの最左端サンプルには認識可能なバックグラウンドのピークは見られない。
実施例６ 感度のシフト（図１３）
ＭＡＰＳハイブリッド形成検定を用いてオリゴヌクレオチドのセットの濃度をそれらを表面に結合し、標識することによって測定できる。この方法は中濃度または低濃度のオリゴヌクレオチドで良好に作動する。サンプル内オリゴヌクレオチドが多くて結合が多い場合、サンプル２種は区別できる。一方、標的とするオリゴヌクレオチドの濃度が表面を飽和（すなわち結合部位全てを占拠）すれば、濃度が上がってもそれ以上の結合はできず、その量は測定できない。しかし、標的の結合曲線は非標識競合リガンドを加えることによってシフトすることができる。
異なるオリゴヌクレオチド標的４種について結合データを得たが、その全てはおよそ３ｎＭで表面を飽和（すなわち最大結合に達する）する。非標識競合標的を全ウェルに加えることによって、標識オリゴヌクレオチドの結合をシフトさせ、こうして低濃度で結合が少ないほど飽和レベルが高くなる。競合的なオリゴヌクレオチドを標的１および標的３を加えるが、標的２および標的４はしない。これで標的１および標的３に対する検定の感度のみをシフトする。こうして期待されるオリゴヌクレオチドの相対的な量が知られていれば、濃度が大幅に異なるオリゴヌクレオチド標的を検定ウェル１個内で測定できる。
このデータは前記説明のようにオリゴヌクレオチド標的１種の結合を定量化できる。図１３はこの検定に含まれる競合的オリゴヌクレオチドがこの標的の検定に使用する結合曲線を高濃度側にシフトすることを定量的に示す。
実施例７ プローブ４個の溶融温度（図１４）
アンカーオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリッドを形成した蛍光標識リンカーオリゴヌクレオチド４種のＭＡＰＳ検定による量を温度上昇に応じてプロットする。このオリゴヌクレオチド４種を最初に５０℃で１時間、３００ｎＭでハイブリッド形成させる。次にプローブ不含のＳＳＣでウェルを洗浄し、結合した量を前記のようにして蛍光（５０℃）によって測定する。次に表面を５５℃で３０分間インキュベーションし、結合した蛍光を測定する。これを記載する温度すべてについて行う。
実施例８ 検出法
検出法２種を直接比較できる。各ウェル当りスポット４個に付着したオリゴヌクレオチドアンカーを持つＭＡＰＳプレートに共に共有結合で付着したｃｙ５部分を含むかまたは共にビオチン基を含む各ウェル内にオリゴヌクレオチド２種を加える。蛍光リンカーの観測と測定を行うために記載の通りにエピ蛍光測定を行う。化学発光測定はＭＡＰＳ検定について記載したようにして後続するＨＲＰ：ＳＡおよび化学発光基質の添加を使用して行う。発生するシグナルの大きさはおよそ同規模である。しかしながら、各ウェルを仕切る壁を有するマイクロプレートの構造および偶発的な液の泡または流体のメニスカスのためにエピ蛍光画像での反射がデータ翻訳に妨害を与えることがある。
実施例９ 化学発光産物
西洋ワサビペルオキシダーゼの化学発光基質として入手可能な産物２種をＭＡＰＳ検定に対する検出操作として比較できる。ＭＡＰＳプレートを実施例８のように調製し、ビオチン化リンカーオリゴヌクレオチドとともにインキュベーションする。次にストレプトアビジン（ＡｌｋＰｈｏｓ：ＳＡ）に結合したアルカリホスファターゼまたはＨＲＰ：ＳＡを加え、続いて洗浄し、CDP-Star（Tropix 社）をＡｌｋＰｈｏｓ：ＳＡ入りのウェルに加えるか、あるいは ECL-Plus をＨＲＰ：ＳＡ入りのウェルに加える。ＳＡ誘導体化酵素および基質を用いる標識はウェスタンブロットの標識での使用を製造社が推薦するものである。この二方法（ならびに他の利用可能な基質）は共にＭＡＰＳプレートへのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を評価するために使用できる。
実施例１０ ０.６ｍｍでの解像度
ウェル当り４種の異なるオリゴヌクレオチドアンカーを各ウェルにピッチ０.６ｍｍ（中心−中心間隔）で４回スポットしてＭＡＰＳプレートを製造することによって、ＭＡＰＳ検定のための本システムの解像度をテストする。次にｃｙ５−誘導体化リンカーまたはビオチン化リンカーのいずれかに前記の通りにハイブリッドを形成させ、検出し、走査する。このエピ蛍光測定では解像度はさらに高くできる（ピッチも減少できる）ようである。この化学発光検出操作では隣接するスポットを完全に分離されなかったが この間隔では個々のピークはコンピュータ曲線解析で明確に解像できるかもしれない。
実施例１１ ヌクレアーゼ保護プロトコルの試験
ヌクレアーゼ保護プロトコルに対するハイブリッド形成およびヌクレアーゼ処理の最適条件をテストする検定において、Ambion 社（Austin, Texas）の Nuclease Protection Assay kit を使用して条件、緩衝液および酵素を提供する。緩衝液３種の１種を用いてサンプル８個を調製する。Ｈｙｂ−Ｂｕｆｆ−１は１００％ hybridization Buffer（Ambion社）であり；Ｈｙｂ−Ｂｕｆｆ−２は７５％ Hybridization Buffer と２５％Hybridization Dilution Buffer（Ambion 社）の混液であり；Ｈｙｂ−Ｂｕｆｆ−３は各５０％の混合液である。被検ｍＲＮＡに相補的な６０残基を含む７０量体オリゴヌクレオチドを合成（Biosource International 社, Camarillo, CA）し、これを Ambion 社がプソラレンビオチンの標識について指示するプロトコルに従ってプソラレンフルオレセイン（Schleicher and Schuell 社, Keene, NH）で標識する。略述すれば、保護断片をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ−トリス、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ ８）２０μＬで５０μｇ／ｍＬまで希釈し、１０分間煮沸し、氷水で急冷する。プソラレンフルオレセイン１３０μｇ／１ｍＬＤＭＦを４μＬ加え、手持ち長波長紫外線灯でサンプルを４５分間４０℃で照射する。遊離プソラレンフルオレセインを飽和ブタノール抽出によって除去する。使用するｍＲＮＡはＧＡＰＤＨ−アンチセンスｍＲＮＡであって、アンチセンスプラスミド（Ambion 社のｐＴＲＩ−ＧＡＰＤＨ−マウスアンチセンスコントロールテンプレート）からＴ７プロモーターおよび MaxiScript kit（Ambion 社）を用いて製造する。短い方の保護断片は別途に合成し、同様に標識した６０量体の相補性部分である。この保護断片の配列は以下の通りである：
Figure 2005525781
 ハイブリッド形成は２０ｎＭの保護断片と６０ｎＭのＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡを最終容積１０μＬ中で２２℃または３７℃で２時間混合して行う。ハイブリッド形成に続いてヌクレアーゼ混合物２００μＬを製造社（Ambion Nuclease Protection Kit;ヌクレアーゼ混合物１：２００希釈）の指示に従って加え、同温で３０分間再びインキュベーションする。ハイブリッド形成阻害緩衝液（Ambion 社）で加水分解を停止し、オリゴヌクレオチドをペレットにし、エタノールで洗う。１×ゲル負荷緩衝液（Ambion 社）１０μＬを加え、オリゴヌクレオチドを１５％ＴＢＥ−尿素ゲルで分離する。緩衝液を流しながらゲルを３０分間ふり回し、プラスチックプレート上に載せ、励起波長と放射波長を選択するためにフルオレセインフィルターを用いて Tundraで撮影する。この画像をＣＣＤアレイに２分間蓄積する。最適条件はＨｙｂ−Ｂｕｆｆ−２中で３７℃または Ｈｙｂ−Ｂｕｆｆ−３中で２２℃でのインキュベーションしたサンプルである。これらのサンプルには検出可能な全長保護断片が残存せず、全長保護断片の部分はかなりの量が見掛け上では短い保護断片と同程度のサイズになって見られる。
実施例１２ ＮＰＡ−ＭＡＰＳによるｍＲＮＡの検定（図１５）
完全ＮＰＡ−ＭＡＰＳプロトコルを実施例１１に記載したものと同様なハイブリッド形成およびヌクレアーゼ処理条件で使用した。サンプル１０個をこの検定に付した。全てが同量の７０量体オリゴヌクレオチド保護断片および様々な量のＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡを含んでいた。ハイブリッド形成サンプルを酵母ＲＮＡ（Ambion 社）０.０８ｍｇ／ｍＬを含有するハイブリッド形成緩衝液５０％：希釈緩衝液５０％の１０μＬに溶解し、これを９０℃に６分間加熱し、簡単に遠心分離し、７０℃に５分間加熱し、１９℃まで冷却し、１９時間インキュベーションした。次にヌクレアーゼ混合物２００μＬを各サンプルに１９℃で３０分間加えた。各サンプルから６０μＬを採取してＭＡＰＳ検定を行った。１０Ｎ−ＮａＯＨ２μＬおよび０.５Ｍ−ＥＤＴＡ２μＬを加え、サンプルを９０℃に１５分間、３７℃に１５分間加熱し、室温に２０分間放置した。次にサンプルを２μＬの１０Ｍ−ＨＣｌで中和し、２Ｍ−ＨＥＰＥＳｐＨ７.５添加および保護断片特異的２００ｎＭ−ビオチン化ディテクターオリゴヌクレオチド添加２０×ＳＳＣ１２μＬを１μＬの１０％ＳＤＳとともに加えた。サンプルを混合し、５分間８０℃に加熱し、各サンプル３５μＬづつ２個をＭＡＰＳプレート（各サンプルは２分し、ＭＡＰＳプレートでは重複処理した）のウェル２個にピペットで加えた。すでに付着している保護断片に特異的な自動的に集合したＣｙ５誘導体化リンカーを有するプレートは標準的ＭＡＰＳプロトコルで調製する。このＭＡＰＳプレートをカバーし、５０℃で一夜インキュベーションし、前記のようにして検出および発光試験を行った。最後のサンプルには検定の間ヌクレアーゼを加えず、保護断片単独がＭＡＰＳでどのように検出されるかを可視化するためのコントロールとした。図の下部には上列に示すウェルの光強度走査を示す（イメージャで分析したもの）。サンプルに存在するＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡの量（すなわちＭＡＰＳプレートに取り出した後の各重複ウェル内の量）を図内に記載する。
ＭＡＰＳプレートに用いたオリゴヌクレオチドは次の通り：
Figure 2005525781
 *アンカーは５'−末端のアミドでＣ１２スペーサーを使って合成した。
**リンカーは５'−末端に付着するＣｙ５を使って合成した。
***ディテクターオリゴヌクレオチドは５'−末端に付着するビオチンを使って合成した。
実施例１３ 希釈曲線、ＮＰＡ−ＭＡＰＳ（図１６）
実施例１２および図１５に記載のデータを定量化して希釈曲線をプロットする。重複ウェル２個のスポット合計８個の平均および標準偏差を各ｍＲＮＡ濃度に対してプロットする。結合曲線を次式に重ね合わせる：
結合率 ＝ 最大結合 * １／（１＋ＩＣ５０ ／Ｌ）
［式中、最大結合は飽和時の最大結合である；結合率はリガンド濃度Ｌでの結合量である；ＩＣ５０は結合率が最大結合の半分である時のリガンド濃度である］この曲線は図に赤点で示し、図示した最良適合値ＩＣ５０＝４.２フェムトモルで描いた。
実施例１４ マウス肝臓ＲＮＡ抽出物内ＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡのＮＰＡ−ＭＡＰＳ検定
マウス肝臓全ＲＮＡ抽出物をＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡについてＮＰＡ−ＭＡＰＳで検定し、希釈曲線を作成する。マウス肝臓からの全ＲＮＡはQiagen kitを用いて調製する。ＲＮＡを０.５Ｍ−酢酸マグネシウム含有７０％エタノールで沈殿させ、０.０５％ＳＤＳ含有１.８ｎＭ−保護断片含有５×ＳＳＣ１０μＬに再懸濁する。ここに添加する保護断片は長さ７０塩基のオリゴヌクレオチドで、その６０塩基はマウスＧＡＰＤＨに相補性である。マウスＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡに相補的な断片（「保護断片」）またはその配列の相補鎖をネガティブコントロールとして（「アンチセンス断片」）のどちらかを使用する。
保護断片を含むＲＮＡサンプルを５分間９０℃に加熱し、サンプルを７０℃としてハイブリッド形成を行い、一夜かけて室温まで徐々に冷却する。Ｓ１ヌクレアーゼ（Promega社）１：１０希釈液を１×Ｓ１ヌクレアーゼ緩衝液（Promega社）３０μＬに１９℃で３０分間加え、１０Ｎ−ＮａＯＨ１６μＬと０.５Ｍ−ＥＤＴＡ２.７μＬで反応を停止する。サンプルを１５分間９０℃、次に１５分間３７℃に加熱してＲＮＡを変性、分解し、１.６μＬの１０Ｍ−ＨＣｌで中和し、次に２００ｍＭ−ＨＥＰＥＳｐＨ７.５添加３０ｎＭ―ビオチン化検出オリゴヌクレオチド添加０.０５％ＳＤＳ含有５×ＳＳＣ中、ＭＡＰＳプレート上で一夜インキュベーションする。洗浄とＳＡ−ＨＲＰによる可視化は記載のように行う。シグナルの量はマウスＲＮＡ量の減少と平行して減少する（各サンプルには５００、１７０、５０、５または０．５μｇの全マウスＲＮＡを含む）。Ｓ１ヌクレアーゼを加えないコントロールサンプル２個を含める。シグナルは相補性保護断片にのみ認められる。
使用するオリゴヌクレオチド：
アンチセンスコントロール（実施例１２と同じオリゴヌクレオチド）：
Figure 2005525781
 *アンカーは５'−末端のアミドでＣ１２スペーサーを使って合成した。
**リンカーは５'−末端に付着するＣｙ５を使って合成した。
***プローブは５'−末端に付着するビオチンを使って合成した。
実施例１５ コントロール付きヌクレアーゼ保護ＭＡＰＳ検定
マウス肝臓からｍＲＮＡを抽出し、ＧＡＤＰＨ特異的保護断片は６０ヌクレオチドを含み、マウスＧＡＰＤＨに相補的であり；それに続く断片の３'末端にある１５個の「オーバーハング」ヌクレオチドは標的に相補性がないものとする以外は本質的に実施例１４の記載と同様にしてヌクレアーゼ保護を行う。ハイブリッド形成およびヌクレアーゼ消化後、残留する保護断片を本実施例では異なるオリゴヌクレオチド検出断片２個を用いて固定化保護断片を検出する以外は実施例１４に示すようにしてＭＡＰＳプレートにハイブリッド形成させる。両検出断片の一方は保護断片のＧＡＰＤＨ特異的部分に相補性であり、他方はコントロールであって、保護断片の１５塩基オーバーハング部分に相補性である。各検出断片は異なる複製サンプル（すなわち異なるウェル）上で使用し、両検出断片が同じ検出分子で標識できるようにする。本実施例では両断片をＨＲＰで標識する。ヌクレアーゼを加えなければ、両検出断片からシグナルが観測されるが、ヌクレアーゼ消化を行うとＧＡＰＤＨ配列に対応するシグナルのみを検出できる。ＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡの量と比較して保護断片を過剰に加えるので、ＧＡＰＤＨ特異的シグナルの量はヌクレアーゼ消化の不在下に観測される量よりも減少する。これがＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡの量が保護ハイブリッド形成を限定することを可能にし、それで、形成した二重鎖ハイブリッドの量（それ故ヌクレアーゼから保護された保護断片の量）がｍＲＮＡの量を反映するようにできる。反応混合物にｍＲＮＡが入っていなければ、ヌクレアーゼを加えた時にはいずれのシグナルも検出できない。前記発見は、本検定のハイブリッド形成と消化の工程が所望のように起きることを証明する。
様々な標的に対応する保護断片を所与の検定に含める時には、同じ１５塩基オーバーハング部分を各保護断片に含ませることができる。これで一つの検出断片を使って全サンプルについて残留するオーバーハングのテストに使用することが可能になる。
実施例１６ 病状関連遺伝子の発現を変化させうる化合物の転写検定スクリーニング
ヒト腫瘍由来細胞系列を使用する。これは３０遺伝子を正常細胞と比べて高レベルで発現することが認められている。（すなわちこれら３０遺伝子は正常細胞でよりも余計にその遺伝子が指示するｍＲＮＡを造り、蛋白質を造るために使われる。転写検定はある遺伝子に対するｍＲＮＡの量を測定して、その遺伝子の使用量を測定するものである）。ＭＡＰＳプレート（ＮＰＡ−ＭＡＰＳ）上でのヌクレアーゼ保護検定を用いて化学的化合物８８００個をテストして、ある化合物の存在下に細胞が増殖すると（構成的「ハウスキーピング」）遺伝子６個の発現には影響を与えないが関連遺伝子３０個のいずれかで発現が減少するかどうかを観察する。この効果を示す化合物はいずれもこの種の腫瘍を処置するための薬剤を将来開発するために有用になるかもしれない。
細胞約１００００〜１０００００個を９６ウェルポリスチレンプレート１００枚の各ウェルに加え、細胞が各ウェルの表面を覆いつくすまで２日間培養する。各プレートのウェル８個では何も加えずに細胞を増殖させる。各プレートの残りのウェル８８個には様々な化合物を加えてその単独での効果を試験する。一度にプレート１００枚を使用すれば、化合物８８００個を試験し、スクリーニングできる。化合物存在下に細胞を２４時間培養し、次に細胞を収集して検定を行う。各プレートの細胞を９６ウェルプレートから作製したサンプル中のＲＮＡを調製する方法の取扱説明書（例えば Qiagen社 RNeasy 96 kit）に従って処理する。ＲＮＡ調製後、各ｍＲＮＡ３６種の量を、関連遺伝子３０個と正常「ハウスキーピング」遺伝子６個とを含むＮＰＡ−ＭＡＰＳ手法で定量する。各々目的とする遺伝子の一つに対応するＤＮＡオリゴヌクレオチド保護断片３６個を各ウェルに加え、それらの標的ｍＲＮＡ配列に選択したストリンジェンシー条件下ハイブリッド形成させる。次にＳ１ヌクレアーゼを加えて過剰なハイブリッドを形成しなかったＤＮＡを分解し、サンプルを化学的に処理してＲＮＡも同様に分解する。各サンプルについて、処理した細胞内に存在するｍＲＮＡの量に比例する量の各遺伝子３６個のためのオリゴヌクレオチド保護断片が残留する。
各ウェル内に異なるアンカーオリゴヌクレオチド３６個のアレイを有する９６ウェルプレート１００枚を各ウェルに異なるリンカーオリゴヌクレオチド３６種を加えて調製する。リンカーは各ウェルの表面に自動的に集合し、一般プレートをオリゴヌクレオチド保護断片３６種各々に対する特異的プローブを有するＭＡＰＳプレートに変換する。各リンカーはアンカー３６個の一つに特異的な部分と保護オリゴヌクレオチド３６個の一つの一部とに特異的な部分を持つ。サンプルプレート１００枚の各ウェルから得たオリゴヌクレオチドサンプルをＭＡＰＳプレート１００枚の対応するウェルに加える。ハイブリッドを選択したストリンジェンシー条件下に形成させた後、各標的に対する検出オリゴヌクレオチドに化学発光酵素を付着させて加えれば、サンプル内に存在するｍＲＮＡの量に比例して各ウェルの各特異的スポットがライトアップされる。関連遺伝子の量は減少するが、ハウスキーピング遺伝子６個に影響を与えないウェルは注目に値する。このサンプルの細胞に加えた化合物は抗腫瘍剤開発の出発点となる可能性がある。
実施例１７ 誘導遺伝子および構成的遺伝子の発現
本質的に実施例１４に記載したようにして、アデノウイルスに無感染マウス（「コントロール」）またはアデノウイルス感染後１時間のマウス（「感染」）の肝臓からＲＮＡを調製した。各サンプルに肝臓ＲＮＡ６０μｇを用い、サンプルは二重に複製した。各検定ウェルは上記遺伝子３個に対応する複製ロカスを３セット有した。各ロカスはこの遺伝子３個の一つに対応する保護断片に相補的なプローブを含むリンカーに結合するアンカーを有していた。本質的に図１２に記載するようにしてヌクレアーゼ保護ＭＡＰＳ検定を行い、上記のように映像を集め、走査した。収集した原画像データおよび各ｍＲＮＡ標的３個の各々に対する複製ウェルの強度走査を示す。走査線上の数字は各条件（ｎ＝４）での強度積分値および標準偏差である。変化を期待されないハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨは感染サンプルでは１.３倍と穏やかな増加を示したが、統計的に有意ではなかった。ＭＩＰ−２およびｃ−ｊｕｎの転写は各々４倍および６倍増加した。この知見は２個の遺伝子ＭＩＰ−２とｃ−ｊｕｎとがアデノウイルス感染に応答して対照である構成的発現遺伝子ＧＡＰＤＨと比較して、発現強化を示すことを証明する。
実施例１８ チロシンキナーゼまたはセリンキナーゼを選択的に阻害する化合物の酵素検定スクリーニング（図１７）
キナーゼはホスフェートを蛋白質に付着させる酵素である。その多くが正常細胞および新生物細胞の増殖を刺激することが証明されている。それ故、特定のキナーゼ（キナーゼ全部でなく）を阻害する化合物は、そのキナーゼが病理に関与するかどうか、および関与があれば医薬開発の出発点として役立てるテストに使用できる。例えば、細胞増殖刺激または炎症反応制御に関与するチロシンキナーゼ５種にはｓｒｃ、ｌｃｋ、ｆｙｎ、Ｚａｐ７０およびｙｅｓを含む。各キナーゼはチロジンを含む短いペプチドとして部分的に確認された基質を持つ。いくつかのキナーゼ特異性は重複しているため、異なるキナーゼはある種のペプチドを同様に燐酸化するが、他種のペプチドは優先的に燐酸化する。キナーゼ５種について特定的特異性および重複的特異性のスペクトルを示すペプチド基質３６種を選択する。
９６ウェルプレート１００枚を使用する；各ウェルは一般的オリゴヌクレオチドアンカー３６個を有する。リンカー３６個を、一般的オリゴヌクレオチドアレイ（アンカーのみを有する）をペプチド基質を含むアレイに変換するために調製する。ペプチド基質３６種を合成し、各々を共有結合でアミド結合を介して、例えば５'−末端アミノ基を有するオリゴヌクレオチドに付着させる。このオリゴヌクレオチドはアンカーと特異的にハイブリッドを形成する配列を含む。ペプチド／オリゴリンカーをＭＡＰＳプレートの全ウェルに加えると表面に自動的に集合する。
スクリーニングのために、各ウェルには試験すべき化合物８８００個の一つとともに適当な濃度の（基質の燐酸化速度をできるだけバランスさせるように）キナーゼ５種を加える。分離した酵素を直接阻害する性能について各化合物をテストする。チロジンが燐酸化されたペプチドのみに結合する標識抗体を加えることによって各アレイにしたペプチドの燐酸化量を検出する。ホスホチロシンスポットの全部ではなく、その一部が減少したウェルは注目に値する。このようなウェルに加えた化合物は、試験したキナーゼのどれかの選択的阻害剤としてさらに可能性を試験することができる。
この検定の様式を図１７の上図に示す。アンカーの１つに相補的な２５塩基対オリゴヌクレオチドがチロジンホスホキナーゼ酵素のペプチド基質に交差結合しているキメラリンカー分子を調製する。このキメラオリゴペプチド基質をオリゴヌクレオチドアンカーのアレイ上に自動的に集合させ；キナーゼ酵素を使用してキメラのペプチド部分を燐酸化し；酵素反応を進行させた後；検出蛍光原基または酵素が付着させた抗ホスホチロジン抗体または抗ホスホセリン抗体によってペプチドの燐酸化量を測定する。
検定結果を下側の図に示す。ホモ双官能性クロスリンカー、DSS（Pierce社）を用いてオリゴヌクレオチドリンカーの５'−アミノ基を、燐酸化チロシンを用いて合成したペプチドのＮ−末端に付着させた。このペプチドの配列は１文字標記法によれば：ＴＳＥＰＱｐＹＱＰＧＥＮＬ（配列番号３２）であって、ここにｐＹはホスホチロジンを示す。このキメラは直接使用するか、あるいはチロジンから燐酸基を部分的に加水分解するために最初に６０分間ｐＨ１４にした後に使用した。燐酸化キメラ分子または部分的脱燐酸化キメラ分子は記載濃度で１時間に自動的にＭＡＰＳプレート内の相補性アンカー分子に集合した。ウェルをＳＳＰＴＰ中０.３％ＢＳＡ添加ＳＳＰＴＰで洗浄してブロックした後、ＳＳＰＴＰ中に１：３０００希釈したＨＲＰ交差結合抗ホスホチロジン抗体（抗体 4G10, Upstate Biotechnology社, Lake Placid, NY）を１時間加え、付着した抗体の量を化学発光基質 Super Signal Blazeで検出した。掲載した画像はＣＣＤアレイに１分間蓄積したものである。予期した通り、オリゴペプチドに付着したホスフェートの量には差異が見られた。この差異は様々な阻害剤候補で処理した時にある系列のキナーゼがどの位活性であるかを測定する検定の基礎となる。
実施例１９ ＳＨ２ドメインと燐酸化ペプチドとの間の相互作用の選択的阻害剤を検出するための結合検定
ＳＨ２ドメインは増殖制御蛋白質のサブユニットを結合するために役立つ。このドメインは不完全な特異性を持つ蛋白質またはペプチドを含むホスホチロジンに結合する。すなわち、ホスホチロジンペプチドのいくつかは１個または数個のＳＨ２蛋白質に特異的に結合するが、他のものは多数のＳＨ２蛋白質に広範に結合する。
この検定ではリンカーはオリゴヌクレオチドに共有結合で付着した燐酸化ペプチドである。ペプチド部分を選択したＳＨ２蛋白質の群に結合する性能について選択する。リンカーは一般的ＭＡＰＳプレートをＳＨ２蛋白質の群に特異的なリガンドを持つプレートに変換する。リガンドを有する９６ウェルＭＡＰＳプレート１００枚を作製する。蛋白質を分離し、たとえばｃｙ５蛍光分子で標識する。
ＳＨ２ドメイン／ホスホペプチド相互作用の阻害剤をスクリーニングするために、標識ＳＨ２蛋白質の一群を９６ウェルＭＡＰＳプレート１００枚の各ウェルに加え、各ウェルに別々の化合物を加える。そこで、ＳＨ２蛋白質とそのホスホペプチドリガンドとの相互作用に対する各化合物の効果を試験する。この検定は各表面結合ペプチドリンカーに会合で結合したＳＨ２蛋白質の蛍光を測定するものである。全部のスポットで蛍光が減少する訳ではないが、いくつかのスポットで蛍光が減少するウェルは、そこに添加した化合物をさらに推測上の選択的ＳＨ２連結阻害剤として試験することができる。
実施例２０ 高処理能スクリーニング（図２２）
１回の実験で９６ウェルからのシグナル検出を証明する高処理能ＭＡＰＳプレートを示す。同じオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成を８０ウェル中の複製１６個で測定した。図示の通り、ハイブリッド形成検定１２８０個の再現性は非常に高かった。左端および右端の列は様々な濃度のオリゴヌクレオチドのシグナルを補正するコントロールの役目をする。
同様にして異なるオリゴヌクレオチド１６個を各ウェルでテストできるが、そのテストは該プレートのウェル８０個で反復できる。勿論さらに多数の様々なオリゴヌクレオチドまたはその他のプローブ（たとえばヌクレオチドプローブ１００個）を各ウェル中で検定でき、また同時に多数のプレート（たとえば９６ウェルマイクロタイタープレート１００枚）を試験できる。各サンプルに多数の検定（たとえば後者の場合約１００種の検定）ができ、多数のサンプル（たとえば後者の場合約９６×１００または９８００個のサンプル）を同時に検定できることは非常に高い処理能を提供する。
実施例２１ 増幅された標的の製造（図２３）
ＰＣＲプライマー（プライマー１）をプライマーオリゴヌクレオチドの５'−端末に導入した化学的修飾を介して固体支持体（たとえばビーズまたは反応容器）に付着させる。このプライマーは５'−から３'−方向に化学修飾、制限酵素部位、および目的とする標的に相補性の配列（たとえば目的とするｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー）を含む。この標的をプライマー１＋プライマー２が付着したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲで増幅する。ただしこのプライマーは５'−から３'−方向にディテクターオリゴヌクレオチドに特異的な配列および標的のプライマー１とは異なる部分に相補的な配列を有する。ＰＣＲ増幅に続いて増幅した標的ＤＮＡを洗浄して過剰の反応材料を除去し、プライマー１の制限部位に特異的な制限酵素で切断して固体支持体から取り出す。増幅されたプライマーはこうして液相に放出される。制限酵素は温度および／または化学的操作を用いて不活化し、二重鎖ＤＮＡ産物を変性できる。次に放出された一重鎖ＤＮＡ標的分子をアンカーおよび／またはリンカーを有する表面と接触させ、プライマー２の配列に特異的な検出剤と相補的なディテクターオリゴヌクレオチドを用いて標的を検出する。
実施例２２ 増幅標的の製造
ＰＣＲプライマー（プライマー１）をプライマーオリゴヌクレオチドの５'−末端に導入した化学修飾を介して固体支持体（たとえばビーズまたは反応容器）に付着させる。このプライマーは５'−から３'−方向に化学修飾、プロテアーゼで切断されるペプチド配列および目的とする標的（たとえば目的とするｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー）に相補的な配列を含む。ペプチドの代わりに特異的に切断できればいかなる構造でも使用できる。たとえば実施例２１に記載したようなＰＣＲ増幅の後、まだ固体支持体に付着しているＰＣＲ産物を変性し、洗浄（任意に）して支持体に結合している一本鎖分子を得る。洗浄した、付着している分子を次に切断および放出（たとえば適当なプロテアーゼ処理によって）させ、アンカーおよび／またはリンカーを有する表面と接触させることができる。あるいは、変性後に放出させた増幅した標的の鎖をアンカーおよび／またはリンカーを有する表面と接触させることができる。どちらの場合も増幅した標的の一鎖のみをリンカーと接触（たとえばハイブリッド形成）させるので増幅した標的の反対鎖によるハイブリッド形成競合がなく、バックグラウンドが低下する。リンカーは増幅した標的鎖の一方または双方に特異的であるように設計できる。
実施例２３ 検出リンカーおよびレポーター剤を用いる検定（図２４）
目的とするｍＲＮＡを含むサンプルを、標的特異的部分およびｍＲＮＡに相補性のないコントロールオーバーハング部分を有するオリゴヌクレオチドを保護断片として使用するヌクレアーゼ保護操作に付す。ヌクレアーゼ消化の後、所望ならば図の左部分に示すようにコントロールオーバーハング部分を切除できる；またはオーバーハングは図の右部分に示すように消化されないことがある。得られるヌクレアーゼ保護断片は検出リンカーにハイブリッド形成するが、これは標的特異的部分およびコントロールオーバーハング部分に特異的な部分を有する。図の左側に示す検定では、検出リンカーのコントロールオーバーハング部分はハイブリッドを形成しない；対照的に図の右側に示す検定では、検出リンカーのコントロールオーバーハング部分は保護断片のコントロールオーバーハング配列の残余部分とハイブリッドを形成する。検定の次の工程では検出リンカーのコントロールオーバーハング特異的部分と相互作用できる部分を有するレポーター剤を複合体と相互作用させる。図の左側に示す検定ではレポーター剤は検出リンカーのハイブリッド形成能のあるコントロールオーバーハング特異的部分とハイブリッドを形成し、レポーター剤のシグナル発生部分によって複合体を検出できる。対照的に図の右側に示す検定では、相補性配列がハイブリッド形成出来ないのでレポーター剤は複合体と結合できず、シグナルは複合体と関連しない。
この発明の多くの検定では、コントロールオーバーハング特異的配列に限定されずにレポーター剤は検出リンカー内に存在するどの配列と相互作用することができる。
実施例２４ 複数の Fluors（図２５）
Ａ〜Ｅで示すロカス５個を有する領域を図２５に示す。各ロカスは実質的に同一なアンカーであるアンカーＡ〜Ｅの異なる群を有する。ロカスＡにあるアンカーにはそれぞれアンカーＡに特異的な部分を含むが互いに異なる４種の型のリンカーがハイブリッドを形成している。しかし、各アンカーは標的１、２、３または４に対する異なる標的特異的部分を有する。それ故、標的がアンカー／リンカー複合体にハイブリッド形成した後には、標的１、２、３および４は皆ロカスＡに局在できる。同様に異なる４種の型のリンカーはロカスＢにハイブリッド形成する。各リンカーはアンカーＢに特異的な部分を含むが標的特異的部分は標的５、６、７または８に特異的である。同様にして、標的９〜１２はロカスＣに、標的１３〜１６はロカスＤに、標的１７〜２０はロカスＥに会合する。これら標的の各々がたとえばアップコンバージョン可能な燐光物質のような異なる独立に検出できるFluor で直接的または間接的に標識されれば、指定した５個のロカスで２０個の標的を独立に検出できる。
実施例２５ 高処理能検定
この実施例では、高処理能スクリーニングに使用できる構成で本発明の転写検定を用いて遺伝子発現パターンの変化を検出し、定量化する。この検定の全工程はロボット的に行う。常用的洗浄工程は明示的記載をしない。反応は全て、当業界で知られているかおよび／または本明細書に記載する常用の操作で行う。
ヒト単球ＴＨＰ−１を９６ウェルＶ底マイクロタイタープレート中、５００００または１５００００細胞／ウェルで培養する。細胞は未処置であるか、またはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で４８時間処理し、続いてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で４時間活性化して分化させたものである。処理に続いて細胞をグアニジウムイソチオシアネートで溶解し、使用まで凍結する。ビオチン−ポリｄＴを結合したストレプトアビジン−反磁性粒子を用いてｍＲＮＡを得る。あるいは tri-reagent（Sigma Chemical 社, St. Louis, MO）で抽出して全ＲＮＡを得る。ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡのいずれかを有するサンプルをＤＮＡ保護断片として６０量体単鎖オリゴヌクレオチド１３個の混合物を用いてヌクレアーゼ保護操作に付す：このオリゴヌクレオチドは各々５'−から３'−の方向に次の配列を含む：目的とする標的１３種の一つに特異的な２５量体（ＧＡＰＤＨ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、カテプシンＧ、コックス−２、サイクリン−２、ビメンチン、ＬＤ７８−β、ＨＭＧ−１７、オステオポンチン、β−トロンボグロブリン、アンジオテンシンまたはアクチン）；スペーサー１０量体；共通のオリゴヌクレオチド検出剤プローブに特異的な２５量体；および共通コントロールオーバーハング配列１５量体。それによってｍＲＮＡを本検定で検出される化学量論的な量の「対応するＤＮＡ保護断片」に変換する。これらの対応するＤＮＡ保護断片をコントロールオーバーハング配列に特異的なプローブとともにインキュベーションするコントロール実験は、実質的に目的とする標的のｍＲＮＡに特異的な配列のみが対応する保護断片に存在することを示す。この結果はヌクレアーゼ消化が所望通りに起きていれば予期されるものである。
表面は本発明の方法に従って製造する。９６ウェル DNA Bind Plateの各ウェルに異なる２５量体オリゴヌクレオチドアンカー１６種のアレイを置く。異なるアンカー分子種１４種を使用する。アンカー１種をアレイの四隅に用い、他のアンカー１３種をアレイの残りの場所に一つづつ用いる。次にアンカーを一定の直交模様で６０量体オリゴヌクレオチドリンカーにハイブリッド形成させるが、その各リンカーは５'−から３'−方向に、目的とする標的１３種の一つに対応する２５量体；スペーサー１０量体；およびアンカーの一つに特異的な２５量体を有する。そこで多数に反復する１６スポットのアレイでは各々標的に特異的なリンカー１３種各々をアレイの所定の位置（ロカス）に局在させる。図１８はこのような直交アレイを図示する。ＧＡＰＤＨに対応するリンカー、内部基準コントロールとして役立つ構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子は、各アレイ内のロカス３ヶ所に示される。対照実験は、この実験に使用するリンカーならびに保護断片およびディテクターオリゴヌクレオチドが所望の特異性を示すことを証明する。
前記のように調製した対応する保護断片の混合物を含むサンプルはアンカー／リンカーアレイにハイブリッド形成する。未処置または誘導培養物から誘導したサンプルを使用する。次に各ロカス内でハイブリッドを形成した保護断片の存在と量を標識したディテクターオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって検出する。各ロカスのシグナルの量を基準化するために、ディテクターオリゴヌクレオチドを本明細書に記載するようにしてブロックしたオリゴマー適量で希釈する。各ロカスのシグナル量を処理してコントロールＧＡＰＤＨシグナルに対して補正する。得られるデータは８個の重複サンプルならびに別の日に行った独立した３回の実験で調製したサンプルにおいて再現性がある。一回の実験で転写物１３種の相対的存在度の一覧を次表に示す。








相対強度（１０５ 細胞／ウェル）
Figure 2005525781
実施例２６ 多重アレイプレートデータ定量化のためのコンピュータアルゴリズム
好適なアルゴリズムは、ＭＡＰＳプレートでの全スポットの位置を判別し、各データ位置に対するシグナル強度の最良適合推測値を自動的に算出する。好ましくは、このアルゴリズムはコンピュータプログラムで実行する。
１）試験すべき最初のウェルを含む画像から各ピクセル（画素）の強度値を含むイメージデータの小部分、４０×４０ボックスを選択する。
２）未知数１６個を用いて各画素位置で期待される強度を算出する関数を決定する。未知数は次の通り：
異なるマイクロアレイスポット１３個の強度（すなわちＤＮＡアレイの各位置における実際のシグナルの明るさ）。スポット１６個のいくつかは同じ標的の同一物(duplicate)なので、各ウェル内には４×４（＝１６）スポットに１３個ある。
特定ウェル内のスポット４×４アレイの正確な位置を決定するＸオフセットとＹオフセット。
ウェル内画像のバックグラウンド強度。
各画素位置に対する関数が画素と各スポットの距離を算出し、各スポットがその画素で観察される強度に対し形成するコントリビューションをスポットの強度に所定距離に対するインパルス反応関数を乗じて合計する。インパルス反応関数に用いる映像については適当な（一定の）半径のガウス関数およびロレンツィアン関数の合計で決定する。
３）現ウェルについてパラメータの値を速やかに推測して適合を開始する。そのためにはスポットの存在が期待される画像の１６領域の平均画像強度を算出する。これら平均１６個からオフセットを差し引き、相違を一定のファクターで測定する。オフセットと測定定数は実験的に定める。結果を再配置して１３の強度を有する１６スポットとマッチさせる。バックグラウンドとオフセットには小さい数を用いる。
４）適合値を曲線適合によって（未知数１６個について）最適化する。特に、適合関数を線形化するためにMarquadtによる非線形最小二乗法アルゴリズムを使用して未知数１６個を等式４０×４０＝１６００個に適合させる。（勿論、全等式が線形的に独立ではないが）。
５）現在のウェルに適合するＸオフセット／Ｙオフセットを使用して、マイクロプレートの次ウェルの格子位置を改良された精度で推測する。隣接ウェルから９ｍｍの軸値が期待される（画像システムの拡大率によってピクセル数を距離に変換する）。ウェル間の距離はプレートサイズに比べて小さいので、位置の部分的推測は非常に正確である。
６）位置推測値の改良により、３０×３０画素移動して次のウェルに対してさらに小さな画像のボックスを決定する。これで適合が迅速に行われる。
段階２に戻り、各ウェルについて反復する。
実施例２７ 高処理能スクリーニング（図２６および図２７）
図２６は検出リンカーと単一レポーター剤を使用する検定に対する元のイメージデータを示す。この検定は細胞サンプル９６個からの天然ｍＲＮＡ１３種の発現をテストする。９６ウェルプレートの各ウェルは未処置（図の左半分）またはＰＭＡおよびＬＰＳで単球に誘導した（図の右半分）ＴＨＰ−１細胞１０５個を含む。
発現のパターンは安定的に変化する。ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ビメンチン、ＬＤ７８、オステオポンチンおよびベータートロンボグロブリンは誘導される。カテプシン−Ｇ、サイクリン−ｂ、ＨＭＧ−１７およびアンジオテンシンは減少する。ＧＡＰＤＨおよびアクチンは変化しない。
図２７はＴＨＰ−１細胞遺伝子の空間的配置と共にサンプルウェル２個のデータ（図２６から選択）を示す。
この実験に使用したオリゴを下に列挙する。ある標的では、シグナル強度は保護断片に相補性の２５塩基を含むがレポーター剤に相補性の配列は含まない不完全検出リンカーオリゴヌクレオチドで検出リンカーを希釈することによって低下する。この不完全オリゴを「減衰因子」と称する。
表１は上記の原データの定量化を示す。このスクリーニング検定は高処理の様式で行う。細胞は平均１０５細胞／ウェルの９６ウェルプレートで増殖し、処理する。この細胞数ではマイクロプレートで好都合に処理できる。遺伝子１３個の発現パターンは小さな細胞サンプルから高処理の形式で測定される。表１に示すように、検定を用いて得た結果は文献報告を確証し、敷衍する。この検定は細胞当り１コピー以下も検出できる。参考文献はたとえばＵ−９３７細胞のような様々な関連細胞型から蓄積された観察を反映する。コントロールおよび誘導条件との間に見られる大きな相違はわれわれの測定ではバックグラウンドシグナルが非常に低いことの結果である。検出リンカーの使用はレポーター剤１種のみを可能にしてこの検定のバックグラウンドを低下させるのに役立つ。その理由はＨＲＰ−含有レポーター剤の全濃度が非常に低いからである。
表１. 相対的存在度 (細胞当りＲＮＡ分子＋)
ＭＡＰＳ９６〜１６形式、１０５細胞／ウェル
Figure 2005525781
 ＋ 推測値：ＧＡＰＤＨを３０／細胞と仮定。
％ＣＶ （％：標準偏差／平均） （ｎ＝４８）。
＊＊ｎｄ ＝ 検出不能。
実施例２７で検出リンカーおよびシングルプローブと共に用いたオリゴは次の通り：
Figure 2005525781
Figure 2005525781
Figure 2005525781
Figure 2005525781
Figure 2005525781
Figure 2005525781
Figure 2005525781
Figure 2005525781
 標的＃１６；（このスポットは使用しない）
実施例２８ ＤＮＡおよびＲＮＡの同時検出（図２９）
ヒト単球ＴＨＰ−１を９６ウェルＶ底マイクロタイタープレート中、３００００〜１５００００細胞／ウェルで増殖させる。ＰＭＡで分化されずまたはＬＰＳで活性化されていないコントロール細胞を使用する。その理由はある種の遺伝子に対するＲＮＡ（たとえばＩＬ−２、Ｃｏｘ−２、ＬＤ７８、オステオポンチンおよびトロンボグロブリン）はこれら細胞には存在せず、それ故ＤＮＡのみがこの検定で測定でき；一方ＧＡＰＤＨに対するＤＮＡおよびＲＮＡは存在するので測定できるからである。細胞を水性媒体（溶解緩衝液）中で１０５℃に加熱し、溶解物に目的とする標的に特異的なヌクレアーゼ保護断片を加える。高温溶解はＤＮＡを測定可能な形でＲＮＡと同様に放出する。ＤＮＡ測定のために添加したヌクレアーゼ保護断片はＩＬ−１、Ｃｏｘ−２、ＬＤ７８、オステオポンチンおよびトロンボグロブリン用のものである。ＤＮＡおよびＲＮＡ両方の測定のために、前記ヌクレアーゼ保護断片ならびにＧＡＰＤＨに特異的な保護断片を加える。ヌクレアーゼ保護反応は本明細書に記載するようにしてウェル内で行う。
アレイを形成し、本質的に実施例２７に記載したようにして保護断片のハイブリッド形成を行う。ＤＮＡ対ＤＮＡ＋ＲＮＡの検出は検出リンカーの逐次的ハイブリッド形成によって行う。逐次的ハイブリッド形成はＲＮＡおよびＤＮＡ標的からのシグナルをバランスさせるためにここで（下記のように）行う；逐次的ハイブリッド形成は勿論、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的を共に検出する検定の要件ではない。第一回にＩＬ−２、Ｃｏｘ−２、ＬＤ７８、オステオポンチンおよびトロンボブロブリンに対する検出リンカーを加える。第二回にＧＡＰＤＨに対する検出リンカーを加える。逐次的ハイブリッド形成はコピー数がずっと少なくてＲＮＡシグナルよりもずっと弱いＤＮＡシグナルを撮影するために長時間行ってシグナル強度が高くなるまで蓄積する。
結果を図２９に示す。左図はゲノムＤＮＡ単独を試験する時は、試験したゲノム配列−ＩＬ−１、Ｃｏｘ−２、ＬＤ７８、オステオポンチンおよびトロンボグロブリン−は全て適切なロカスに検出でき、ほぼ同量で存在することを示す。測定するゲノムＤＮＡを表１に示すが、そのようなコントロール細胞ではこれら遺伝子に対するＲＮＡは検出できないことを示す。ＤＮＡおよびＲＮＡの双方を測定するがＤＮＡシグナルが左図よりも弱いので撮影の露光時間はずっと短い右図では、ＤＮＡおよびＲＮＡを一緒に試験する時には内部基準としてコントロールゲノム配列を前記のように検出できることおよび発現された遺伝子―ＧＡＰＤＨ―はコントロールよりもずっと高水準で存在することを示す。コントロールと発現されたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡとの相対的シグナル量を定量化することによって、細胞当りの発現ｍＲＮＡ量を算出できる。
実施例２９ 発現されたＳＮＰの検出（図３０および図３１）
図３０は発現されたＳＮＰを検出する方法の一タイプを図式的に示す。ここに、ヌクレアーゼ保護断片はヌクレアーゼ保護断片がミスマッチ塩基（ここではＳＮＰ）があるＲＮＡにハイブリッド形成すればその酵素はヌクレアーゼ保護断片を切断する様式で適当な酵素（たとえばＲＮＡｓｅＨ）を添加する時にはＳＮＰを含むＲＮＡの領域にハイブリッド形成するように設計する。本例では得られる切断断片はアレイにハイブリッド形成できない（たとえば使用する温度のようなハイブリッド形成条件のために）。他の態様では、アレイへのハイブリッド形成は起きるが、検出リンカーは切断された保護断片（たとえば使用する温度のようなハイブリッド形成条件のために）に結合できないか；または切断された保護断片がアレイにおよび検出リンカーに同時にハイブリッド形成できないような切断が起きる。
図３１は本明細書に記載する常法によって行ったこの検定の結果を示す。内部コントロールとして野生型アクチンを使用され、また加工ＳＮＰを含むＧＡＰＤＨに対応する保護断片は野生型ＧＡＰＤＨに対応する保護断片から識別される。図３１は野生型ＧＡＰＤＨおよび野生型アクチン（左列および図の左部分）のいずれかを含むか、またはＳＮＰ・ＧＡＰＤＨおよび野生型アクチン（右列および図の右部分）を含む多数のサンプルの測定を描く。中央図はアレイのレイアウトを示す。
実施例３０ 高処理能スクリーニング（図３２〜３５）
アンカーを DNA Bind Plate でなく、照射したプレート上に結合する以外は本質的に実施例２８に記載したようにして転写検定を行う。実施例２７に記載してあるものと同じアンカーを使用するが、アレイ中のある標的は変更する；すなわちアンカー１個のみを用いてＧＡＰＤＨを測定し、およびチューブリン、アクチンおよびＬＤＨを加える。測定した他の標的はＩＬ―１、ＴＮＦ−ａ、カテプシン−Ｇ、Ｃｏｘ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＳＴ−Ｐｉ１、ＨＭＧ−１７、サイクロフィリン、ｂ−トロンボグロブリン、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９である。このアレイを図３２に示し、リンカーおよびヌクレアーゼ保護断片の配列を以下に示す。ウェル当り約３００００細胞（処理した細胞のＰＭＡおよびＬＤＨ処理中の対照細胞の継続増殖については未補正）を使用する。
配列：
標的＃１：ＧＡＰＤＨ（実施例２７の標的＃１と同じ）。
標的＃２：ＩＬ−１β（実施例２７の標的＃２と同じ）。
標的＃３：ＴＮＦ−α（実施例２７の標的＃３と同じ）。
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 図３３は本検定の再現性が高く、３００００細胞を分析する時には％ＣＶの範囲は約３〜１３％の範囲内であることを示す。
図３４は、たとえば１０００細胞またはそれ以下と小さなサンプルからのＲＮＡを検定する時もＧＡＰＤＨに対する標的ｍＲＮＡを検出できるなど、本検定の感度が高いことを示す。
本質的に実施例２５のプロトコルおよび実施例２７のアレイと標的とを使用して行った図３５は１０００細胞またはそれ以下と小さいサンプルからのＲＮＡを検定する時も試験した標的ｍＲＮＡの多くが検出できることおよびＲＮＡが細胞１００００個またはそれ以下である時も低存在度で発現されるものでも標的全てが検出できることを示す。
実施例３１ オリゴヌクレオチド試薬の選択（図３６）
図３６は本発明方法に使用できる型のオリゴヌクレオチド試薬数タイプを図式的に示す。この図はオリゴヌクレオチドアンカーをその５'−末端またはその３'−末端（「逆転」）のいずれかを介して表面に付着させ、およびオリゴヌクレオチドが互いに隣接する（「短縮」）か、または核酸スペーサーで分離されているかの認識部分２個を有する検定方式を示す。各ボックスは５ヌクレオチドを示す。
実施例３２ ヌクレアーゼ保護断片の増幅法（図３７〜３９および図４２）
図３７はＰＣＲによるヌクレアーゼ保護断片の増幅を示す。
図３８はリガーゼによるヌクレアーゼ保護断片の増幅を示す。連結したａ'−ａがアレイに結合する２５塩基から１２塩基配列としてａ'を選択することによってａ'−ａ分子の連結した２５塩基配列のみが結合可能なハイブリッド形成条件を選択できる。ａ'およびａのリンカー結合領域の各部分で修飾ヌクレオチドを使用することによって識別を改善できる。加熱解離のサイクルがリガーゼを分解するならば各サイクルで再添加できる。
図３９はヌクレアーゼ保護によるヌクレアーゼ保護断片の増幅を示す。（ヌクレアーゼ保護断片ｂ）に相補性の（ＤＮＡａ）鎖は（ＲＮＡａ）よりも低温でハイブリッド形成する修飾された塩基を含むことができ、または（ＤＮＡａ）を加える前に（ＲＮＡａ）を分解することができる。同様に、特に溶液中のＤＮＡ鎖が希薄で、実質的に無限に高濃度の（リンカーＡ）を通過することを実験的に配慮する時には（リンカーａ）／（ＤＮＡａ）ハイブリッドが２５塩基であって、（ＤＮＡａ）／（ヌクレアーゼ保護断片ｂ）が５０塩基ハイブリッドであるとしても、（ＤＮＡａ）に対する（リンカーａ）は（ヌクレアーゼ保護断片ｂ）よりも低温でハイブリッド形成が可能な修飾ヌクレオチドを含むことができる。通過装置を捕捉のためのアレイを有するプレートに置き換えることができる。線形アレイは二次元または三次元アレイに置き換えることができる。
図４２はヌクレアーゼ保護断片のポリメラーゼによる増幅を示す。
ヌクレアーゼ保護反応が完了し、ヌクレアーゼ保護断片がＲＮＡから解離した後、ＲＮＡポリメラーゼ（たとえばＴ７ポリメラーゼ）のための二重鎖プロモーターおよびヌクレアーゼ保護断片テンプレートに沿ったエクステンション（たとえばＲＮＡまたはＤＮＡの複写のための逆転写酵素（ＲＴ）によるエクステンションまたはＤＮＡの複写のためのＴａｑポリメラーゼによるエクステンション）のためのプライマーを含むプライマー（ａ'）を添加する。これによってヌクレアーゼ保護断片（たとえばＲＴまたはＴａｑポリメラーゼ）への結合後、ヌクレアーゼ保護断片配列の末端に結合する二重鎖プロモーター領域とともに二重鎖ＤＮＡ複合体を形成するための鋳型に使用する。
第一塩基がＳＮＰにミスマッチのためヌクレアーゼ保護反応の間にＳ１が未保護塩基から離れていなければ、リガーゼを添加するとヌクレアーゼ保護断片鎖のプロモーターの第二鎖を連結する。リガーゼは塩基のスキップのためにプロモーターをヌクレアーゼ保護断片に連結しないであろう。連結の場合、ｂ鎖はこの際ポリメラーゼプロモーターを取り込んで伸長ｂ’’鎖に変換され、増幅はポリメラーゼを用いて進行し、ＲＴプライマー（ｂ’）の添加後にも継続することができる。ヌクレアーゼ保護断片のプロモーター／エクステンション末端をアレイにまたは検出リンカーにまたは検出プローブに結合するために使用される。ＳＮＰ検出のために、このハイブリッド形成をＳＮＰ部位がアレイ（検出リンカーまたは検出プローブなど）にハイブリッド形成するために使用する配列のほぼ中央になるように調整する。エクステンションしたヌクレアーゼ保護プローブのアレイ（検出リンカーまたは検出プローブ）のハイブリッド形成領域は必ずしも全塩基を末端に含む必要はない（エクステンションヌクレアーゼ保護プローブの末端にある塩基のいくつかはリンカー中の相補性ハイブリッド形成配列を持たないオーバーハングすることもできる、など）。図示しなかった変形では、ポリメラーゼ（たとえばＴ７）を使用する前に連結する必要はない；それ故、ＳＮＰの検出はａ'にハイブリッド形成する配列の中央にＳＮＰを配置する配列を選択し、本明細書記載のＳＮＰ検出プロトコルを用いて行う。ａ'鎖をエクステンションする必要はないが、その代わりにＲＮＡポリメラーゼは単鎖ヌクレアーゼ保護断片にハイブリッド形成したプロモーターをＲＮＡ産生のために使用することができる（指摘したＲＴエクステンションまたは別なＴａｑポリメラーゼエクステンション工程は省略）。
前記記載から当技術分野の熟練者はこの発明の本質的特性を容易に確認し、その本質と範囲を逸脱することなしに、様々な使用および条件に適合させるために本発明の変更および修正を行うことができる。
これ以上の詳述なしに、当技術分野の熟練者は前記記載を用いて本発明をその完全な程度に利用できるものと信ずる。前記の好適な特異的態様は、それゆえ、単に例示的なものであって、いかなる意味でも他の記載をどれであれ限定するものではない。
前記の出願、特許および刊行物の全記載および図面は参考のために本明細書に引用するものである。

Claims (18)

  1. 核酸標的少なくとも１個を検出する方法であって、以下の各項を含む方法：
    ａ）標的を含んでいるかもしれないサンプルを標的に特異的で標的と結合するヌクレアーゼ保護断片に接触させること；該サンプルを、残留する一本鎖核酸を有効に消化するヌクレアーゼと接触させること；および得られるサンプルを、線状アレイに配置されたアンカーの異なるロカス少なくとも２個を内部に含む多数のチューブであって、該チューブの少なくとも２個が実質的に同一であるコンビネーションと接触させること；ここに、
    各ロカスにあるアンカーは、アンカーに特異的な第一部分および該ヌクレアーゼ保護断片の一つに特異的なプローブを有する第二部分を有する双官能性リンカーと会合しており；
    該ヌクレアーゼ保護断片が該コンビネーションに結合するために有効な条件下；および
    ｂ）該結合した保護断片を検出すること。
  2. 該チューブが毛細管であり、該アンカーが該毛細管の表面に結合している、請求項１に記載の方法。
  3. 該チューブが毛細管であり、該アンカーが該毛細管内に位置する物質に結合している、請求項２に記載の方法。
  4. 該物質がアガロースまたはポリアクリルアミドである、請求項３に記載の方法。
  5. 核酸標的少なくとも１種を検出する方法であって、以下の各項を含む方法：
    ａ）該標的を含んでいるかもしれないサンプルを該標的に特異的で標的と結合するヌクレアーゼ保護断片と接触させること；該サンプルを残留する一本鎖核酸を有効に消化するヌクレアーゼと接触させること；および得られるサンプルをコンビネーションと接触させること；ここに該コンビネーションは［サンプル添加前は］次の各項を有する：
    ｉ）空間的に区別された、少なくともその２個が実質的に同一な領域を多数有する表面；ここにその各領域は次項を含む：
    ｉｉ）アンカーの異なるロカス少なくとも２個；ここにそのロカスにあるアンカーは次項と会合している：
    ｉｉｉ）アンカーに特異的な第一部分および該ヌクレアーゼ保護断片の一つに特異的なプローブを有する第二部分を有する双官能性リンカー；
    該ヌクレアーゼ保護断片が該コンビネーションに結合するために有効な条件下；
    ここに、領域の第一ロカスに存在するアンカー２個またはそれ以上が様々な標的特異性を持つ様々な双官能性リンカーと会合している；および
    ｂ）該結合した保護断片を検出すること。
  6. 該第一ロカスにある該様々な双官能性リンカーの少なくとも２個が、同じ目的とする第一の核酸の異なる部分に特異的なヌクレアーゼ保護断片に特異的である、請求項５に記載の方法。
  7. さらに、結合した保護断片を特異的検出リンカーおよび／または検出プローブにハイブリッド形成させ、それによって該核酸各々に対応するシグナルを発生させることを含む、請求項５に記載の方法。
  8. サンプル内のＳＮＰを有する核酸を検出する方法であって、以下の各項を含む方法：
    ａ）サンプルとＳＮＰ特異的保護断片とを該保護断片と該核酸とのハイブリッド形成に有効な条件下にインキュベーションすること；
    ｂ）該サンプルを、目的の核酸にハイブリッド形成した保護断片およびハイブリッド形成された核酸部分以外のポリヌクレオチド実質的に全部を有効に消化し、およびミスマッチ部位で二重鎖核酸を有効に切断するヌクレアーゼ１種またはそれ以上による処理に付すこと；
    ｃ）標的としてＳＮＰ特異的保護断片またはその一部を含むサンプルを提供するために、該ハイブリッド形成保護断片および要すればハイブリッドを形成している核酸の少なくとも一部分以外の実質的に全てのポリヌクレオチドを除去すること；および
    ｄ）該標的を含む該サンプルをコンビネーションと接触させること；
    ここにこのコンビネーションは、サンプル添加の前には次項を含む：
    ｉ）空間的に区別された領域を多数有し、少なくともその２個が実質的に同一である表面；ここに各領域は次項を有する：
    ｉｉ）少なくとも２種の異なるオリゴヌクレオチドアンカー；ここに各アンカーは次項と会合している：
    ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第一部分および該標的に特異的なプローブを有する第二部分を持つ双官能性リンカー；
    該標的が該コンビネーションに結合するために有効な条件下。
  9. 核酸標的少なくとも２種を検出する方法の中で、
    ここに第一の標的は目的とするｍＲＮＡであり、第二の標的はサンプル内に実質的に一定量存在すると期待される核酸である方法であって、以下の各項を含む方法：
    ａ）標的を有するかもしれないサンプルを標的に特異的で標的と結合するヌクレアーゼ保護断片と接触させること；該サンプルを残留する一本鎖核酸を有効に消化するヌクレアーゼと接触させること；および得られる該ヌクレアーゼ保護断片を有するサンプルをコンビネーションと接触させること；ここに、このコンビネーションは次項を有する：
    ｉ）空間的に区別された領域を多数有し、少なくともその２個が実質的に同一である表面；ここに各領域は次項を有する：
    ｉｉ）アンカーの少なくとも２個の異なるロカス；各ロカスにあるアンカーは各々次項と会合している：
    ｉｉｉ）アンカーに特異的な第一部分および該ヌクレアーゼ保護断片の一つに特異的なプローブを有する第二部分を有する双官能性リンカー；
    該ヌクレアーゼ保護断片が該コンビネーションに結合するために有効な条件下；
    ここに、該ｍＲＮＡに対して特異的な第一ヌクレアーゼ保護断片および該核酸（サンプル内に実質的に一定量存在すると予期される）に対して特異的な第二ヌクレアーゼ保護断片が該コンビネーションの同じ領域にある、異なるロカスに結合している、および
    ｂ）結合した該ヌクレアーゼ保護断片を検出すること。
  10. 該リンカーの１個またはそれ以上が異なる標的に特異的な複数のプローブを有する、請求項５に記載の方法。
  11. 該リンカーの１個またはそれ以上が異なる標的に特異的な複数のプローブを有する請求項１に記載の方法。
  12. 核酸標的少なくとも一つを検出する方法であって、以下の各項を含む方法：
    ａ）該標的を有するかもしれないサンプルを標的に特異的で標的と結合するヌクレアーゼ保護断片と接触させること；該サンプルを残留する一本鎖核酸を有効に消化するヌクレアーゼと接触させること；および得られるサンプルをコンビネーションと接触させること；ここにそのコンビネーションは以下の各項を有する：
    ｉ）区別された、少なくともその２個が実質的に同一な多数の領域；ここに各領域は次項を有する：
    ｉｉ）アンカーの異なるロカス少なくとも２個；ここに各ロカスにおける各アンカーは次項と会合している：
    ｉｉｉ）アンカーに特異的な第一部分およびヌクレアーゼ保護断片の一つに特異的なプローブを有する第二部分を持つ双官能性リンカー；
    該ヌクレアーゼ保護断片が該コンビネーションに結合するために有効な条件下；
    ここに、該領域はチューブであり、アンカーの該ロカスは該チューブ内の線状アレイに配置されているものとする；および
    ｂ）結合した該保護断片を検出すること。
  13. 該物質が線形チャネルの空間充填マトリックスである、請求項３に記載の方法。
  14. 目的とする細胞をホルムアミドを１０〜３０％およびヌクレアーゼ保護断片の１種またはそれ以上を７５〜１１０ｐＭ有する水性溶液中でインキュベーションしてサンプルを調製する、請求項５に記載の方法。
  15. 該水性溶液がさらに０.５〜２×ＳＳＣおよびｔＲＮＡ１〜２μｇを含み、インキュベーションを９０〜１１５℃で行う、請求項１４に記載の方法。
  16. 該領域の少なくとも一つにあるロカス少なくとも一つに、各々が異なる双官能性リンカーに特異性を有する、異なるアンカーを複数有する、請求項５に記載の方法。
  17. 該コンビネーションの各領域が次の各項を有する請求項５に記載の方法：
    ｉｉ）少なくとも２個の異なるオリゴヌクレオチドアンカー；ここにその各アンカーは次項と会合している：
    ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第一部分および第二の双官能性リンカーに特異的な第二部分を有する第一双官能性リンカー；および
    ｉｖ）第一双官能性リンカーに特異的な第一部分および該標的に特異的なプローブを有する第二部分を有する第二双官能性リンカー。
  18. 核酸標的少なくとも一つを検出する方法であって、次の各項を含む方法：
    該標的を有するかもしれないサンプルを該標的に特異的で標的と結合するヌクレアーゼ保護断片と接触させること；
    該サンプルを一本鎖核酸を有効に消化するヌクレアーゼと接触させること；および
    得られるサンプルをコンビネーションと接触させること；
    ここにそのコンビネーションは該サンプルを添加する前には以下の各項を有する：
    ｉ）空間的に区別された、少なくともその２個が実質的に同一な領域を多数有する表面；ここに各領域は次項を有する：
    ｉｉ）オリゴヌクレオチドアンカーの異なるロカス少なくとも２個；ここに各アンカーは次項と会合している：
    ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第一部分および該ヌクレアーゼ保護断片に特異的なプローブを有する第二部分を持つ双官能性リンカー；
    該ヌクレアーゼ保護断片が該コンビネーションに結合するために有効な条件下；
    ；ここに、該領域少なくとも１個にあるロカス少なくとも１個は各々が異なる双官能性リンカーに特異性を有する、異なるアンカー約２〜約４種を有し、「混合ロカス」であるものとする；および
    ここに、該混合ロカス内に存在する該異なるアンカー２種またはそれ以上は各々異なる標的特異性を持つ、異なる双官能性リンカー約２種〜約４種と会合しているものとする；
    該結合した保護断片を特異的な検出リンカーとハイブリッドを形成させること；ここに該検出リンカーの少なくとも１種は「ブロックされた」検出リンカーであるものとし、およびここに該検出リンカーの少なくとも１種は、該約２〜約４種の異なる双官能性リンカー第１のものに会合する第一の保護断片に特異的であるものとする；
    化学発光シグナルを発生する酵素を有する特異的レポーター剤で該検出リンカーを検出すること；
    反応混合物のｐＨを調整して該シグナルを停止させること；
    該結合した保護断片を特異的検出リンカーとハイブリッド形成させること；ここに該検出リンカーの少なくとも一つが「ブロック」された検出リンカーであり、またここに該検出リンカーの少なくとも一つが該約２〜約４種の異なる第二の双官能性リンカーに会合する第二の保護断片に特異的であるものとすること；および
    化学発光シグナルを発生する酵素を有する特異的レポーター剤のある該検出リンカーを検出すること。
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