CN104897657A - 悬浮电极微孔板电化学发光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以在微孔板底部固定探针并使用悬浮电极的电化学发光检测方法。采用底部透明的标准化尺寸微孔板，并将捕获探针通过物理吸附或化学偶联方式固定在微孔板的反应孔底部；采用悬浮电极结构，将反应电极从上部插入微孔板反应孔，使反应电极直接接触固定有捕获探针的反应孔底部。当固定在反应孔底部的捕获探针捕捉住待检目标分子-电化学发光标记物复合物时，电化学发光反应体系在反应电极表面进行电化学发光反应产生光信号。本发明具有设备制作简单、耗材成本低、操作方便、检测结果重复性好等优点，可以充分发挥电化学发光检测方法灵敏度高、线性范围广、试剂稳定的优势。
Description
技术领域
本发明涉及在生物检测技术领域中使用的一种可以在微孔板底部固定探针并使用悬浮电极的电化学发光检测方法。
背景技术
自然界的分子发光现象通常包括磷光、荧光、和化学发光三种类型。磷光和荧光属于光致发光，需要激发光对发光体进行照射然后产生磷光或荧光。化学发光原理则不同。在化学发光反应过程中，分子由于吸收了化学反应所释放的能量而产生所谓“能量跃迁”，由基态转化为不稳定的激发态。当分子从激发态重新衰变成基态时释放出光子即产生化学发光现象。电化学发光(electrochemiluminescence)是在电化学反应中产生的一种化学发光现象，也可以说电化学发光是利用电化学方法促进或控制化学发光的产物。
电化学发光研究始于上世纪三十年代。1929年Harvey等发现在碱性条件下电解鲁米诺时可在电极上产生发光现象，此后相关研究陆续开展。1963年Kuwana等开展了鲁米诺的电化学动力学和发光机理的研究，随后，伴随着光电技术的进展，由于弱光检测的增强使得其它方式的电化学发光反应也相继被揭示。上世纪八十年代吡啶钌电化学发光体系的出现是该领域一个重大进展。此后电化学发光分析技术开始在免疫分析、核酸分析中得到有效应用。
吡啶钌电化学发光体系中最常用的是三丙胺-吡啶钌电化学发光体系。三丙胺-吡啶钌电化学发光体系的工作原理如下: 化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2
+和电子供体三丙胺(TPA)在阳极表面分别被氧化成[Ru(bpy)3]3 +和TPA+·。TPA+·很不稳定, 很容易失去一个质子(H+) 而形成强还原剂TPA·。当[Ru(bpy)3]3+和TPA·发生氧化还原反应时, [Ru(bpy)3]3+被TPA·还原形成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+·, TPA·被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的[Ru(bpy)3]2+·衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+,
同时发射一个波长为614nm 的光子。在三丙胺-吡啶钌电化学发光体系中，发光分子三联吡啶钌在电极表面周而复始地进行基态-激发态-基态的能量转移, 产生大量光子。
电化学发光检测技术具有灵敏度高、线性范围广的特点。上世纪八十年代开始广泛使用的酶联免疫吸附试验（ELISA）至今依然是最常用的生物、医学检测技术之一，与酶联免疫吸附试验相比，电化学发光免疫检测技术的检测灵敏度和线性范围至少可以提高两个数量级。此外，电化学发光分析技术且具有试剂稳定、可控性强等优点。近年来,电化学发光在生物、医学分析中的应用引起人们极大的研究兴趣。
目前最常用的电化学发光检测设备主要有磁珠捕获法和电极捕获法两类：磁珠捕获法以磁珠为探针载体，磁珠捕获待检目标分子-电化学发光标记物复合物后，利用磁吸附原理将被捕获的目标分子和与之结合的电化学发光标记物固定到反应电极表面进行电化学反应产生光信号；电极捕获法是直接将探针固化在反应电极表面，从而使反应电极直接捕获与电化学发光标记物相结合的待检目标分子，在电极作用下促使电化学发光反应体系进行电化学反应产生光信号。
磁珠捕获法由罗氏公司获得反应池电极材料等相关专利保护，并且要求采购复杂的检测设备和非常昂贵的试剂，因此限制了其应用范围。电极捕获法在国内有较多研究和应用，最常见的电极制备方式包括使用金、银、碳等导电材质，将具有生物相容性的导电材料以等离子溅射、电浆丝印、或电镀等方式固定在微孔反应板底部构成反应电极。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以在微孔板底部固定探针并使用悬浮电极的电化学发光检测设备，其具有设备制作简单、耗材成本低、操作方便、检测结果重复性好等优点，可以充分发挥电化学发光检测方法灵敏度高、线性范围广、试剂稳定的优势。
本发明采用的技术方案为: 采用底部透明的标准化尺寸微孔板，并将捕获探针通过物理吸附或化学偶联方式固定在微孔板的反应孔底部。采用悬浮电极结构，将反应电极（图1（1））从上部插入微孔板（图1（2））反应孔，使反应电极（图1（1））直接接触固定有捕获探针的反应孔底部。当固定在反应孔底部的捕获探针捕捉住待检目标分子-电化学发光标记物复合物时，电化学发光反应体系在反应电极表面进行电化学发光反应产生光信号。所产生的光信号由位于微孔板（图1（2））底部的光电倍增管（PMT）（图1（3））检测。
所述的微孔板包括：标准化尺寸的8孔或12孔条板；标准化尺寸的48孔、96孔或384孔微孔板。
所述的捕获探针分子包括：生物素、亲和素、捕获抗体、肽核酸（Peptide Nucleic Acid）探针或核酸探针。其中核酸探针包括基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针以及寡核苷酸探针。
所述的电化学发光标记物为鲁米诺及其衍生物或三联吡啶钌衍生物。
所述的电化学发光反应体系包括：鲁米诺体系、吡啶钌体系。鲁米诺体系中电化学发光标记物为鲁米诺及其衍生物，缓冲溶液含：1.0 mM〜3.0 mM H2O2，0.05
M Na2CO3-NaHCO3，pH 8〜11。吡啶钌体系中电化学发光标记物为三联吡啶钌衍生物，缓冲溶液含：0.03 mM〜2.0 mM二丁基乙醇胺（DBAE），0.05 M 磷酸缓冲液，pH 6〜9。
本发明的原理如下：现行电化学发光检测设备中，反应电极与电化学发光标记物接触作用的主要方式有两类：一种是将捕获探针固化磁珠上，通过磁珠捕获被标记了电化学发光标记物的目标分子，然后通过电磁力将磁珠吸附到反应电极表面，使电化学发光标记物在反应电极表面进行电至氧化-还原反应；另一种是将捕获探针固化在反应电极表面直接捕获被标记了电化学发光标记物的目标分子，然后在反应电极表面进行电至氧化-还原反应。本发明采用悬浮电极结构，将捕获探针通过物理吸附或化学偶联方式固定在微孔板的反应孔底部，从上部插入反应孔的悬浮式电极紧密接触固定在反应孔底部的捕获探针以及被标记了电化学发光标记物的目标分子，使电化学发光标记物在反应电极表面进行电至氧化-还原反应，进而通过“跃迁-衰变”过程发光。
对于磁珠捕获法，由于磁珠在反应电极表面排列的无序性，大部分电化学发光标记物会被遮盖在磁珠表面之间或背向电极的位置而无法参与电化学发光反应，同时，由于磁珠本身会吸收光信号，从而导致产生的有效光信号降低。并且磁珠捕获法设备构造相对复杂，试剂成本高，不利于应用推广。对于电极直接捕获法，需要在反应池或反应孔中制备电极，成本高且稳定性难以控制。
本发明这种设计的优点是：首先，探针在反应孔底部排列密度大、有序性好，有利于被捕获的目标分子充分与反应电极接触。其次，可单独重复使用昂贵的悬浮式电极，而对于已被污染的反应孔则不必重复使用，既简化了操作，又提高了系统的稳定性。第三，这种设计相对而言结构更简单，不必使用带电极的反应池或反应孔，使得使用成本大大降低。第四，采用标准化尺寸的微孔反应板，易于实验室使用。
附图说明
图1是反应电极(1)和微孔板(2)以及光电倍增管(3)的相对位置示意图。
具体实施方式
具体实施例一
镍钛合金丝悬浮电极制备要求：采用0.02〜0.8毫米温度记忆镍钛合金丝悬浮电极（以下简称镍钛电极），镍钛电极引脚镀银或不镀银，采用焊接或机械紧固方式固定在电极电路板上。每个电极电路板上固定8〜384个镍钛电极（与使用的微孔板孔数相对应）。镍钛电极顶端呈截锥螺旋状，具体参数为：r1=0.5〜5.0毫米，r2=1.0〜5.0毫米，n=1〜30，d=0.02〜0.8毫米，α=0.1〜30，以上r1为锥螺螺旋内圈曲率半径，r2为锥螺螺旋外圈曲率半径，d为镍钛合金丝的直径，n为螺旋圈数，α为螺旋升角。镍钛电极从上部插入反应孔。镍钛电极完全插入反应孔时，顶端的截锥螺旋状电极内外圈均可与反应孔底部平面紧密接触，间隙小于0.1微米。
具体实施例二
电化学发光免疫检测微孔板制备：采用标准尺寸聚苯乙烯材质微孔板，在碱性条件下将捕获探针通过物理吸附固定在微孔板反应孔底部，具体步骤如下：（1）用天平分别秤取Na2CO3 1.5克, NaHCO3 2.93克，用蒸馏水稀释至1000 毫升，配置成0.05 摩尔/升 pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存。（2）用0.05摩尔/升pH9.6碳酸缓冲液稀释捕获抗体, 至终浓度为1～10微克/微升。（3）向反应孔每孔中加入100微升稀释后的抗体溶液，37℃温育1小时，4℃冰箱放置8～12小时。（4）倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留液体，4℃备用。
具体实施例三
电化学发光寡核苷酸探针微孔板制备：采用底部修饰标准尺寸聚苯乙烯材质微孔板，经紫外交联将寡核苷酸探针固定在微孔板反应孔底部，具体步骤如下：（1）探针稀释：将5'端带多聚胸腺嘧啶结构的寡核苷酸探针溶于50%二甲基桠枫缓冲液（寡核苷酸探针终浓度为10～20微摩尔）。（2）向反应孔每孔中加入50微升稀释后的单链寡核苷酸DNA探针溶液，50摄氏度烘干。（3）将烘干的微孔板放入254纳米波长紫外交联设备中反应3～5min进行探针固定。（4）用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留液体，50摄氏度烘干后备用。
具体实施例四
电化学发光亲和素微孔板制备：采用标准尺寸聚苯乙烯材质微孔板，在碱性条件下将亲和素或链霉亲和素通过物理吸附固定在微孔板反应孔底部，具体步骤如下：（1）用天平分别秤取Na2CO3 1.5克, NaHCO3 2.93克，用蒸馏水稀释至1000 毫升，配置成0.05 摩尔/升 pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存。（2）用0.05摩尔/升pH 9.6碳酸缓冲液稀释亲和素或链霉亲和素, 至终浓度为1～10微克/微升。（3）向反应孔每孔中加入100微升稀释后的亲和素或链霉亲和素溶液，37℃温育1小时，4℃冰箱放置8～12小时。（4）倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留液体，4℃备用。
具体实施例五
夹心法电化学发光抗原检测步骤：（1）将待检抗原用0.05摩尔/升pH 7.6磷酸盐缓冲液按1:1稀释。（2）取200微升稀释的待检抗原加入电化学发光免疫检测微孔板反应孔，37℃温育2小时，倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留液体。（3）取200微升联吡啶钌标记的二抗加入微孔板反应孔，37℃温育2小时，倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留液体。（4）每孔加入200微升吡啶钌电化学发光反应体系缓冲溶（0.03 mM〜2.0 mM二丁基乙醇胺，0.05 M 磷酸缓冲液，pH 6〜9），放入采用悬浮式电极的电化学发光检测设备检测检测电化学发光值。
具体实施例六
生物素法电化学发光抗原检测步骤：（1）将待检抗原用0.05摩尔/升pH 7.6磷酸盐缓冲液按1:1稀释。（2）分别取100微升稀释的待检抗原、50微升联吡啶钌标记的二抗、50微升生物素标记的一抗加入电化学发光亲和素微孔板反应孔中，37℃温育2小时，（3）倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留液体。（4）每孔加入200微升吡啶钌电化学发光反应体系缓冲溶（0.03 mM〜2.0 mM二丁基乙醇胺，0.05 M 磷酸缓冲液，pH 6〜9），放入采用悬浮式电极的电化学发光检测设备检测电化学发光值。
具体实施例七
PCR产物的电化学发光检测步骤：
（1）PCR扩增体系：
在0.2mL PCR反应管中加入下列成分至终体积50μL：
10μL 模板DNA
5μL 10×PCR缓冲液
1.5μL 50mM MgCl2
1μL 10mM dNTP混合物
1μL 标记联吡啶钌的上游混合扩增引物（10μM）
1μL 标记联吡啶钌的下游混合扩增引物（10μM）
0.5μl Taq DNA聚合酶（5U/μL）
加灭菌蒸馏水至总体积50μL。
（2）PCR反应条件：
94℃，2min
94℃，25s
30个循环
60℃，25s
30个循环
72℃，40s
30个循环
72℃，5min。
（3）杂交体系：
杂交缓冲液：20×SSC
(3.0M NaCl, 0.3 M柠檬酸钠，pH
7.0〜8.0)。
0.1微摩尔 PCR扩增产物
55µL
20×SSC
25µL
1%
SDS
10µL
总反应体积
100µL
（4）杂交程序：
a. 取电化学发光寡核苷酸探针微孔板，每孔加入上述杂交体系反应液100µL，100℃加热5min，然后快速冷却至室温。58℃保温1hr。
b. 每孔加200µL 0.2×SSC和0.1％SDS，置42℃5min清洗2次。
c. 倒尽板孔中溶液，用纯净水加满反应孔，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上吸干残留液体。
d. 每孔加入200微升吡啶钌电化学发光反应体系缓冲溶（0.03 mM〜2.0 mM二丁基乙醇胺，0.05 M 磷酸缓冲液，pH 6〜9），放入采用悬浮式电极的电化学发光检测设备检测电化学发光值。
Claims (4)
1.本发明涉及在生物检测技术领域中使用的一种可以在微孔板底部固定探针并使用悬浮电极的电化学发光检测方法，其特征在于：采用悬浮电极结构，将电化学发光反应电极从微孔板上部插入其反应孔，使该电极直接接触固定有捕获探针的反应孔底部并启动电化学发光反应。
2.根据权利要求1所述的电化学发光检测方法，其特征在于：所述的悬浮电极顶端呈截锥螺旋状，其螺旋内圈曲率半径r1=0.5〜5.0毫米，其螺旋外圈曲率半径r2=1.0〜5.0毫米，螺旋圈数n=1〜30，螺旋升角α=0.1〜30。
3.根据权利要求1、2所述的电化学发光检测方法，其特征在于：所述的悬浮电极采用直径0.02〜0.8毫米的表面镀膜或未镀膜的镍钛合金丝。
4.根据权利要求1、2所述的电化学发光检测方法，其特征在于：将悬浮电极引脚采用焊接或机械紧固方式固定在电极电路板上，每个电极电路板上按照所使用的微孔板反应孔的数量和位置对应固定8〜384个悬浮电极。
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