JP2005521707A - 神経保護方法、組成物、およびそのスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳動物神経系を損傷から保護する方法、および神経変性疾患を処置または改善する方法に関する。本発明はさらに、神経毒性化合物、フリーラジカル、または神経変性疾患に起因する損傷から上記中枢神経系を保護することを、単独でかまたは他の神経保護因子と組み合わせて補助する神経保護因子をスクリーニングすることに関する。本発明はさらに、Ｌ−エルゴチオネインまたは他の新規に同定された化合物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、神経保護が必要な哺乳動物に対して投与するための薬学的組成物に関する。

Description

（関連出願の引用）
本願は、２００２年３月２８日出願の米国特許仮出願番号６０／３６７、８４５に対する優先権を主張する。この米国特許仮出願の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。本出願には、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での本出願の利益を主張する。

（発明の分野）
本発明は、一般的に神経保護の方法に関し、さらに詳しくは、中枢神経系の細胞に対する損傷を防止するための方法、および神経変性疾患の処置のための方法に関する。さらに、本発明は、神経保護因子として作用可能な化合物のスクリーニング方法、および神経変性疾患の処置に有用な薬学的組成物を提供する。

アルツハイマー病、多発性硬化症、発作、外傷性脳損傷、脊髄損傷および他の中枢神経系障害の結果としての神経変性は、その高い発生率および長期間にわたる後遺症の頻度から、巨大な医学的および公衆衛生的な問題である。動物実験ならびに臨床試験は、アミノ酸伝達物質（特にグルタミン酸）、酸化的ストレスおよび炎症反応が、これらの状態における細胞死に強く寄与することを示した。

損傷または虚血性損傷の際に、損傷を受けたニューロンは、周囲のニューロンに対して興奮毒性である神経伝達物質であるグルタミン酸を大量に放出する（Ｃｈｏｉら，（１９８８），Ｎｅｕｒｏｎ １：６２３−６３４；Ｒｏｔｈｍａｎら，（１９８４），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１８８４−１８９１；ＣｈｏｉおよびＲｏｔｈｍａｎ，（１９９０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１７１−１８２；Ｄａｖｉｄら，（１９９８），Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．４６：６５７−６６２；Ｄｒｅｊｅｒら，（１９８５），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４５：１４５−１５１。また、米国特許第５，１３５，９５６号および米国特許第５，３９５，８２２号を参照（これらは、その全体が参考として本出願中において援用される。））。いくつかの研究は、ハンチントン病（ＨＤ）（ＣｏｙｌｅおよびＳｃｈｗａｒｃｚ，（１９７６）、Ｎａｔｕｒｅ ２６３：２４４−２４６）、アルツハイマー病（ＡＤ）（Ｍａｒａｇｏｓら，（１９８７），ＴＩＮＳ １０：６５−６８）、癲癇（Ｎａｄｌｅｒら，（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ ２７１：６７６−６７７）、ラチリスム（Ｓｐｅｎｃｅｒら、（１９８６）、Ｌａｎｃｅｔ ２３９：１０６６−１０６７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびグアムのパーキンソン症候群痴呆（Ｃａｌｎｅら（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ ２：１０６７−１０７０）の病態生理、ならびに発作、虚血、再灌流に関係する神経病理（Ｄｙｋｅｎｓら、（１９８７）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４９：１２２２−１２２８）の両方におけるグルタミン酸の関与を示した。

従って、ニューロンに対する損傷は、グルタミン酸およびアスパラギン酸を含む興奮性アミノ酸によるレセプターの過剰刺激により、引き起こされ得る（Ｌｉｐｔｏｎら，（１９９４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：６１３−６２１）。実際、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）サブタイプのグルタミン酸レセプターは、正常な脳機能において多くの重要な役割（シナプス伝達、学習および記憶、およびニューロン発達を包含する）を有していることが示唆される（Ｌｉｐｓｔｏｎら（１９９４）前出；Ｍｅｌｄｒｕｍら（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１１：３７９−３８７）。しかし、ＮＭＤＡサブタイプのグルタミン酸レセプターの過剰刺激は、フリーラジカル生成の増加およびニューロン細胞死をもたらし、これは、抗酸化剤により調節され得る（Ｈｅｒｉｎら（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７８：１３０７−１３１４；Ｒｏｓｓａｔｏら（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１８：１３７−１４０）。

さらに、炎症および酸化的ストレスは、アルツハイマー病（ＡＤ）を含む多くの慢性的神経変性状態の病理の重要な構成要素である。アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経原線維変化および老人性斑の蓄積、ならびに脳におけるニューロンの広範囲な進行性の変性により、特徴付けられる。老人性斑は、第２１番染色体に位置するＡＰＰ遺伝子によりコードされている、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に富んでいる。ＡＤの基礎となる病理についての一般的に認められている仮説は、ＡＰＰの異常なタンパク質分解性切断が、ニューロンにとって毒性であることが示されているβアミロイド（Ａβ）ペプチドの過剰な細胞外蓄積を導くというものである（Ｓｅｌｋｏｅら，（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４８７〜４９８；Ｑｕｉｎｎら，（２００１），Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６８：２０３〜２１２；Ｍａｔｔｓｏｎら，（１９９７），Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓ．Ｒｅｖ．１２：１〜１４；Ｆａｋｕｙａｍａら，（１９９４），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６６７：２６９〜２７２）。

パーキンソン病（ＰＤ）は、運動不能、硬直、振せん、および体位の異常からなる動作の機能障害によって特徴付けられる、進行性神経変性疾患である。この疾患は、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるドーパミン作動性ニューロンの実質的な喪失（Ｐａｋｋｅｎｂｅｒｇら（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．５４：３０−３３）、および線条体におけるドーパミンのシナプシス輸送体および小胞輸送体含量の減少（例えば、Ｇｕｔｔｍａｎら（１９９７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４８：１５７８−１５８３を参照）により証明されるように、黒質線状体のドーパミン作動性ニューロンの完全性および機能の喪失と関連付けられてきた。ドーパミン作動性ニューロンの喪失についての正確な機構としては、家族性ＰＤの部分集団におけるα−シヌクレイン変異（Ｇｏｌｂｅ（１９９９）Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｃｏｒｄ １４：６〜９）、ＭＡＯ−Ｂ変異（Ｍｅｌｌｉｃｋら（１９９９）Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｃｏｒｄ １４：２１９〜２２４）およびＣＹＰ２Ｄ６変異（Ｓａｂｂａｇｈら（１９９９）Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｃｏｒｄ １４：２３０〜２３６）、散発性ＰＤ症例における環境因子（Ｇｏｒｅｌｌら（１９９８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５０：１３４６〜１３５０）、およびより一般的な特発性ＰＤにおける酸化的ストレス（例えば、Ｏｌａｎｏｗら（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１２３〜１４４を参照のこと）が挙げられる。酸化的ストレスの関与についての特徴としては、鉄沈着（例えば、Ｓｏｆｉｃら（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：９７８〜９８２を参照）、脂質過酸化（Ｄｅｘｔｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５２：３８１−３８９）、タンパク質酸化（Ａｌａｍら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１３２６〜１３２９）、ＤＮＡ損傷（例えば、Ａｌａｍら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１１９６〜１２０３を参照）、グルタチオン（ＧＳＨ）レベルの減少（例えば、Ｓｉａｎら（１９９４）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：３５６−３６１を参照）、スーパーオキシドジスムターゼレベルの上昇（例えば、Ｙｏｒｉｔａｋａら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１４８：１８１〜１８６を参照）、およびビタミンＣおよびビタミンＥのような抗酸化剤の関連する低レベル（ｄｅ Ｒｉｊｋら（１９９７）．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５４：７６２−７６５）（これは、神経変性障害における抗酸化剤予防について強く主張する）が挙げられる。

Ｌ−エルゴチオネオイン（２−メルカプトヒスチジン トリメチルベタイン）（「エルゴチオネオイン」）（図１）は、微生物において、ヒスチジン、メチオニンおよびシステインから、ヘルシニンを介して形成されるイオウ含有アミノ酸である。Ｌ−エルゴチオネオインは、動物では生合成されず、従って、食餌からだけ得られる。調査したほとんど全ての種におけるエルゴチオネオインの血液濃度は、ほぼミリモルの範囲内にある（表１）。ヒトにおけるＬ−エルゴチオネオイン濃度は、４６μＭから１８３μＭの範囲にあると推定される。

（表１．種々の動物におけるＬ−エルゴチオネインの血液濃度）

（発明の要旨）
Ｌ−エルゴチオネオイン（ＥＧＴ）は、放射線保護性、抗変異原性であり、一重項酸素、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、ヒドロキシルラジカル、ならびにペルオキシラジカルを除去する（Ｈａｒｔｍａｎ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５９：３１０〜３１８；Ａｋａｎｍｕら（１９９１）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８８：１０〜１６）。Ｌ−エルゴチオネオインは、アミノ酸であるチロシンとＤＮＡとの過酸化亜硝酸依存性窒素化を阻害し、Ｎ−アセチルシステイン／過酸化水素の混合物でチャンレンジされたニューロン細胞において、細胞恒常性を与える（Ａｒｕｏｍａら（１９９９）Ｆｄ．Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３７：１０４３〜１０５３）。Ｌ−エルゴチオネオインはまた、尿酸（キサンチンの酸化産物）の過剰産生により特徴付けられる状態である痛風のような炎症状態に対する多くの関連を持ち得る、キサンチンおよびヒポキサンチンの形成も阻害する（Ａｒｕｏｍａら（１９９９），Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ３７：１０４３〜１０５３）。しかし、ＥＧＴの化学的保護効果の基礎となる分子的機構は、大部分が解明されないままである。

本発明の１つの局面は、グルタミン酸アゴニストであるＮ−メチル−Ｄーアスパラギン酸の損傷効果を防止するための、ニューロン細胞への外因性投与の際のＬ−エルゴチオネオインの神経保護効果に関する。さらに、ラットの硝子体へのグルタミン酸アゴニストであるＮ−メチル−Ｄーアスパラギン酸（ＮＭＤＡ）の注射が網膜での多くの形態変化を引き起こすことを確立する、以下に示す研究結果に、本発明は一部分、基礎を置いている。最も明らかなのは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の免疫反応性および神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の免疫反応性の減少を伴う、ニューロンの密度およびサイズの劇的な減少であった。しかし、Ｌ−エルゴチオネオインで処理された動物では、細胞損失は有意に減少した。従って、これらの結果は、Ｌ−エルゴチオネオインが、ニューロン細胞を損傷から保護する能力を有することを確立する。

Ｌ−エルゴチオネオインの神経保護効果のさらなる証拠が、本発明で示されている。Ｌ−エルゴチオネオインの神経保護効果は、パーキンソン病（ＰＤ）の６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）損傷ラットモデルにおいて実証されている。以下の実施例で示すように、ビヒクル処理したラットにおける黒質中のチロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋）細胞の数および線状体ドーパミン含量は、有意に減少した。６−ＯＨＤＡ損傷前のＬ−エルゴチオネオインによるラットの処理は、ＴＨ＋細胞と線状体ドーパミン含量との両者の損失を顕著に減少させた。これらのデータは、Ｌ−エルゴチオネオインが、血液脳関門を通過する能力、ならびに線状体黒質完全性および線状体黒質系の機能の有意な保護を提供する能力を、支持する。

従って、第１の局面において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞を損傷から保護する方法を特徴付ける。この方法は、治療上有効な量のＬ−エルゴチオネオインを、その必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する。より具体的な実施形態では、その哺乳動物ＣＮＳ細胞は、ニューロン細胞であり、ＣＮＳ細胞としては、神経節細胞および非神経節細胞が挙げられ、これは、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびＧＡＢＡ（γーアミノ酪酸）作動性ニューロンのような、生化学的に定義されたニューロン集団すべてを包含する。より具体的な実施形態では、ドーパミン作動性細胞は、黒質のチロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋)細胞である。１つの実施形態において、被験体は、哺乳動物である；具体的な実施形態では、哺乳動物は、ヒト被験体である。

さらなる具体的な実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、（ｉ）神経毒性化合物（例えば、グルタミン酸またはグルタミン酸アナログ）（他の神経毒性化合物としては、特定の抗癌合物が挙げられる）への曝露、（ｉｉ）１種類以上のフリーラジカルおよび酸化剤（例えば、一重項酸素、ヒドロキシラジカル、ペルオキシラジカル、過酸化亜硝酸、過酸化水素、一酸化窒素、次亜塩素酸（および他の次亜ハロゲン酸）および／または金属酵素）への曝露、により引き起こされる神経損傷に対して保護する。

なおさらなる実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、特定の癌（特定の脳腫瘍を包含する）の処置のための放射線治療の使用により引き起こされる神経損傷に対して保護し得、この放射線治療は、細胞に対する損傷ならびにフリーラジカルの放出および酸化剤の放出を引き起こす。

別の実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脳および脊髄のような神経組織に対する外傷性損傷、黄斑変性、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ならびに視神経障害および網膜症）の存在により引き起こされる神経損傷に対して保護し得る。

本発明の方法は、目的の任意の哺乳動物に関しても有用である。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態は、外傷性損傷を罹患した家畜動物または非家畜動物の処置における獣医学的使用のためである。

さらなる実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、神経毒性化合物からの保護を提供するために有効な量で、栄養補助食品として投与される。より具体的な実施形態において、その栄養補助食品は、経口カプセル、または錠剤の形態である。なおさらなる実施形態では、Ｌ−エルゴチオネオインは、舌下投与または経頬（ｂｕｃｃａｌｌｙ）投与され得る。

さらなる実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、損傷細胞および損傷組織からのフリーラジカルおよび酸化剤の放出に起因する損傷を阻害するために有効な量で、損傷部位に直接投与される。脳および脊髄損傷のような外傷性損傷の場合、Ｌ−エルゴチオネオインは、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）送達、脳室内送達、または頭蓋内送達され得る。

関連した第２の局面において、本発明は、神経変性から哺乳動物神経細胞を保護する方法を特徴付ける。この方法は、治療上有効な量のＬ−エルゴチオネオインを、その必要がある哺乳動物へ投与する工程を包含する。１つの具体的な実施形態においては、Ｌ−エルゴチオネオインと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物の投与によって、哺乳動物のニューロン細胞を神経変性から保護する方法を包含する。このような薬学的組成物は、経口送達、静脈内送達、筋内送達、皮下送達、髄腔内送達または脳室内送達のために設計され得る。特定の実施形態は、Ｌ−エルゴチオネオインの血液脳関門通過を助ける特定のキャリア分子を含み得る。

以下で説明する実験において、網膜アッセイが、Ｌ−エルゴチオネオイン神経保護能力決定のためのインビボ動物モデルとして使用された。網膜−硝子体（ｒｅｔｉｎａｌ−ｖｉｔｒｅａｌ）モデルは、神経毒性の評価のたけ、および神経細胞を損傷から保護可能な化合物を同定するために、有用である。本発明のスクリーニング法により同定される化合物は、神経変性状態および神経変性因子から細胞を保護するのに有用である。例えば、神経変性付随疾患状態（例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脳および脊髄を含む外傷性損傷、黄斑変性、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、視神経障害および網膜症）の処置および改善のための使用を含んでいる。Ｌ−エルゴチオネオインの神経保護効果の裏付けもまた、以下で説明するように、パーキンソン病の６−ＯＨＤＡ動物モデルにより実証された。

従って、第３の局面において、本発明は、中枢神経系細胞を損傷から保護可能な化合物を同定するためのスクリーニング法を特徴付ける。この方法は、（ａ）網膜ニューロンを、試験化合物による処理とともにかまたは試験化合物による処理なしで、神経毒性因子に曝露（処理）する工程；および（ｂ）網膜ニューロン集団に対するその試験化合物の効果を決定する工程を包含し、神経完全性を増加可能な試験化合物は、神経保護因子として同定される。さらなる実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞を損傷から保護可能な化合物を同定するスクリーニング法を包含し、この方法は、（ａ）インビトロまたはインビボで、試験化合物による処理とともにかまたは試験化合物による処理なしで、ドーパミン作動性ニューロンを６−ＯＨＤＡで処理する工程；および（ｂ）試験化合物のドーパミン作動性ニューロン集団における効果を決定する工程を包含し、細胞の生存を増加可能な試験化合物が、神経保護因子として同定される。

ＣＮＳ細胞を、神経毒性物質への曝露、神経毒性物質を誘発する条件への曝露、および神経変性を引き起こす疾患状態の結果として生じる神経変性および細胞死から保護する方法が、本発明のさらなる目的であり、この方法は、神経保護量のＬ−エルゴチオネオインを、単独でか、またはニューロン細胞の保護を補助する１種類以上の因子、もしくは、細胞増殖および組織再生を補助する因子と組み合わせて提供することによる。これらの他の因子は、小さな合成有機化合物、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、アンチセンスヌクレオチド、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、または、損傷から神経系の細胞を保護する際に作用する他の因子であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、上記組成物は、少なくとも１種類のＲＯＳスカベンジャーをさらに含み得る。適切なＲＯＳスカベンジャーとしては，コエンザイムＱ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ピルビン酸、メラトニン、ナイアシンアミド、Ｎ−アセチルシステイン、ＧＳＨ、およびニトロンが挙げられる。そのように記載される上記他の因子は、ニューロン細胞および／または組織の成長因子であり得る。これら他の因子は、結合の際に組織再生または細胞増殖を刺激する、特定の神経細胞レセプターのリガンドであり得る。本発明の方法による併用治療の使用は、特定のニューロン状態およびこのような状態を導く原因因子により指示される。さらに、Ｌ−エルゴチオネオインは、ニューロンの髄鞘形成および／または再生を増強することが公知である第２の因子と共に投与され得る。エルゴチオネオインおよび第２の因子の特定用量力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を確立するための方法は、当業者にとって公知である。

本発明のさらなる別の局面において、急性ニューロン組織損傷または慢性ニューロン組織損傷に関連した細胞死を防止するための方法が提供される。この方法は、抗酸化剤カクテルの治療上有効な量の抗酸化剤カクテルの投与を包含し、このカクテルの少なくとも１種類のメンバーは、Ｌ−エルゴチオネオインである。

他の目的および利点は、以下の例示的図面とともに、以下に続く詳細な説明を吟味することから明らかになる。

（本発明の詳細な説明）
本方法および組成物が記述される前に、本発明は、記載される特定の方法、組成物、および実験条件に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、そのような方法および組成物は、変化し得るからである。また、本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するだけのためのものであり、限定するためのものでないことが理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他の様に示さない限り、複数形の言及を包含する。従って、例えば、「ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓｙ」に対する言及は、１つ以上のアッセイを含み、「ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ」または「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ」に対する言及は、１つ以上の処方物、方法および／または本明細書中で記載される型の工程、および／または本開示を読むことにより当業者には明らかとなる工程を包含する。

他のように定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書中で記載されるものと同様または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書中で記載される全ての刊行物は、その刊行物が引用される方法および／または材料を開示または記載するために、本明細書中で援用されている。

（定義）
「抗体」は、抗体および、特定のエピトープに結合するＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２のような抗体フラグメントを含む、任意の免疫グロブリンである。この用語は、特に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を含む。最後のものは、米国特許第４，８１６，３９７号および米国特許第４，８１６，５６７号においてさらに詳細に記述されている。この用語はまた、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を含む。調製物中の個々の免疫グロブリン分子の少なくとも一部が抗原を認識する（すなわち、結合する）場合、その抗体調製物は、その特定の抗原に対して反応性である。調製物中の個々の免疫グロブリン分子の抗原への結合が一般的に使用される方法によって検出されない場合、その抗体調製物は、その抗原について非反応性である。

用語「実質的に純粋」とは、ポリペプチドを指している場合、通常は会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を、少なくとも６０重量％含まないポリペプチドを意味する。実質的に純粋なＬ−エルゴチオネオインの組成は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、また最も好ましくは、少なくとも９９重量％のＬ−エルゴチオネオインである。

Ｌ−エルゴチオネオインは、例えば、化学合成によって、または天然供給源からの分離によって、入手され得る。純度は、任意の適切な方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析、およびキラル法）により測定され得る。キラル純度は、重要であり、キラルクロマトグラフィーまたは旋光度を包含する、既知の方法によりアッセイされ得る。

「処置」とは、予防のためかまたは虚弱質の処置もしくは患者が罹患している場合にはその疾患の処置のいずれかのための、患者に対して薬を投与することまたは患者に対する医学的手順を指す。

「治療上有効な量」または、「有効な量（有効量）」とは、所望する処置効果を達成するのに充分な試薬の量である。「神経保護に有効な量」は、ニューロン喪失に対して保護するのに充分なＬ−エルゴチオネオインの量である。この用途のために有効な量は、その状態の重篤度、患者の全身状態、投与の経路、および当業者には公知の他の要因に依存する。例えば、Ｌ−エルゴチオネオインの用量、またはニューロン細胞死に対して保護する本発明の方法により同定される他の化合物の用量は、疾患の重篤度および処置の詳細、ならびにその化合物が、細胞増殖もしくは組織再生、細胞生存またはニューロンプロセスの成長を促進するために別の化合物と組み合わせて投与されるか否かに依存して、一日当たり１０ｍｇ〜１０ｇの範囲に及び得る。

用語「栄養性（ｔｒｏｐｈｉｃ）効果」は、本発明の「神経栄養因子」が、神経組織において存在するニューロンの生存、成長、成熟および再生に寄与するする特定の神経要素に対して選択的影響を有することを意味する。

「粘膜の」とは、体内の粘液を分泌する組織を指す；従って、直腸、膣、ならびに、口腔（鼻、咽喉、口）、消化管（腸を含む）を包含する。

「経粘膜（ｔｒａｎｓｕｍｕｃｏｓａｌ）」とは、粘膜を通る物質の通路を指す。

「舌下（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ）」とは、舌の下の領域を指す。

「舌下送達」は、口底にある粘膜を通しての、薬または他の因子の全身的送達を指す。

「経頬（ｂｕｃｃａｌ）］とは、口内の頬の領域を指す。

「経頬送達」は、頬にある粘膜（頬粘膜）を通しての、薬または他の因子の全身的送達を指す。

（本発明の一般的局面）
ニューロン細胞を毒性物質の影響から保護する手段を発見することは、明らかに医学的に重要である。細胞をとりまく環境に存在する多くの物質は、細胞死または細胞の生存に影響することが、公知である。特に、細胞死は、活性酸素種（ＲＯＳ）および活性窒素種（ＲＮＳ）と、グルタミン酸、補体、腫瘍壊死因子α、γインターフェロン、または他のサイトカインとによって、引き起こされる。これらの毒性化合物などは、細胞が死ぬ多様な状態に関係しており、このような細胞死は、深刻な臨床的な結果を招く。それは、神経系に影響する多くの状態の場合である。従って、そのような細胞死を防止し、そして臨床的場面で適用可能であり得る、治療化合物またはその組合せを同定することは、重要な問題である。さらに、急性神経損傷または慢性神経損傷（例えば、外傷性脳損傷または外傷性脊髄損傷）のようなそのような神経保護活性が所望される多様な場面において神経保護因子として働く因子を同定することは、最大限に重要である。さらに、神経保護因子として働く因子の同定は、慢性的変性疾患から急性損傷のような範囲の多くの臨床的用途において重要な利用を見出す。例えば、急性再発の間の多発性硬化症患者の処置は、おそらく、これらの患者の病変で起こる稀突起神経膠細胞の破壊を減少させ得る。またさらに、本発明の因子の使用は、単独でか、あるいは発作、またはアルツハイマー病、またはパーキンソン病のような状態（進行するニューロン細胞死がこれらに障害を有する患者のさらなる機能損失を引き起こす）の１種以上のさらなる疾患レジメンと組み合わせて使用される場合に、非常に有益であり得る。

さらに、多くの疾患プロセスは、フリーラジカルおよび活性化酸種（ＲＯＳ）および活性化窒素種（ＲＮＳ）（例えば、超酸化物、過酸化水素、一重項酸素、過酸化亜硝酸、ヒドロキシラジカル、次亜塩素酸（および他の次亜ハロゲン酸）ならびに一酸化窒素）のレベル上昇の存在に起因することが、一般的に認識されている。眼において、白内障、黄斑変性、および変性網膜損傷は、ＲＯＳにより引き起こされる。他の器官およびそのＲＯＳ関連疾患としては：タバコ酸化産物およびアスベストにより引き起こされる、肺癌；加齢の促進およびその徴候（皮膚損傷を包含する）；虚血および再灌流損傷、神経系の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症；パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、多発性硬化症）；気腫および気管支肺形成異常を包含する、肺疾患；ヘモクロマトーシスおよびサラセミアを包含する、鉄過剰疾患；膵炎；腎臓疾患（自己免疫ネフローゼ症候群および重金属誘導性腎毒性を包含する）；ならびに放射線損傷が挙げられる。アドリアマイシンおよびブレオマイシンのような特定の抗腫瘍薬は、特に心臓への深刻な酸化的損傷を引き起こし、その薬へのその患者の曝露を限定する。鉄のような酸化還元活性金属は、組織への酸化的損傷を誘導する；産業的化学物質およびエタノールは、曝露および消費により、心筋症および肝臓損傷のような一群の酸化的損傷関連損傷を誘導する。オゾン、一酸化窒素、放射性粒子、およびハロゲン化炭化水素のような、空気中に生じる産業汚染物質および石油化学ベースの汚染物質は、肺、消化管、および他の器官への酸化的損傷を誘導する。原子炉からの漏れおよび核兵器への被爆を包含する、産業を出所とした放射能中毒は、放射線およびラジカル損傷の他の原因である。暴露の他の経路は、電磁放射線源（例えば、発電所および高電圧送電線、Ｘ線機器、粒子加速器、レーダーアンテナ、ラジオアンテナ）の近くでの生活または勤務、ならびに携帯電話、テレビ、およびコンピュ−ターのモニターのような、電磁放射線を放つ電気製品および電気機械デバイスの使用によって、起き得る。

本発明は、Ｌ−エルゴチオネオインおよび適切なキャリアを含む組成物の適用または投与によって、哺乳動物の身体のニューロン細胞を神経毒性物質による損傷から特に保護する方法を提供する。神経毒性物質は、グルタミン酸またはグルタミン酸アナログであり得る。また、それらは、抗癌因子または神経系障害以外の状態を処置するのに有用な他の因子であり得る。Ｌ−エルゴチオネオインは、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子αまたはγンターフェロン）または、１種以上のフリーラジカルおよび酸化剤（例えば、一重項酸素、ヒドロキシラジカル、ペルオキシラジカル、過酸化亜硝酸、過酸化水素、一酸化窒素、次亜塩素酸（および他の次亜ハロゲン酸）、および／または金属酵素）に曝露した結果生じる神経損傷に対して、保護し得る。放射線治療または、脳損傷、発作、もしくは脊髄損傷のような損傷後の細胞からの神経細胞へのフリーラジカルの放出の結果、Ｌ−エルゴチオネオインが有益であり得る他の神経毒性効果が、引き起こされる。別の実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、黄斑変性、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ならびに視神経障害および網膜症）の存在により引き起こされる神経損傷に対して保護し得る。

その多機能性から、Ｌ−エルゴチオネオインは、パーキンソン病（ＰＤ）のような状態におけるその治療用使用の調査のための候補となる。本発明の１局面は、ＰＤの片側６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）損傷ラットモデルにおいて、Ｌ−エルゴチオネオインについて観察された神経保護的性質に一部、基づく。完全性（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する免疫染色により推定された黒質におけるドーパミン作動性細胞体の数、および黒質ドーパミン作動性系のＨＰＬＣにより推定された線状体ドーパミンレベルの機能性）が研究された。ＴＨは、ドーパミン合成において律速酵素である。

さらに、Ｌ−エルゴチオネオインがパーキンソン病における利用への候補となるその同じ多機能性は、Ｌ−エルゴチオネオインを、アルツハイマー病処置における利用に適用可能にする。上記ように、アルツハイマー病（ＡＤ）は、慢性的神経変性障害であり、脳における、神経原線維変化および老人性斑の蓄積、ならびにニューロンの広範囲進行性変性により特徴付けられる。老人性斑は、第２１番染色体に位置するＡＰＰ遺伝子によりコードされているアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が豊富である。ＡＤの基礎的病理についての一般的に受け入れられている仮説は、ＡＰＰの異常なタンパク質分解性切断が、βアミロイド（Ａβ）の過剰な細胞外蓄積（ニューロンにとって毒性であると示されている）を引き起こすというものである（Ｓｅｌｋｏｅら，（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４８７−４９８；Ｑｕｉｎｎら，（２００１），Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６８：２０３−２１２；Ｍａｔｔｓｏｎら，（１９９７），Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓ．Ｒｅｖ．１２：１−１４；Ｆａｋｕｙａｍａら，（１９９４），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６６７：２６９−２７２）。

神経毒（例えば、凝集したβーアミロイドペプチド）のラット硝子体への注射は、網膜におけるニューロンの深刻な変性を引き起こす。これらの効果は、抗酸化剤であるビタミンＥの１回の注射との同時処置によって、ある程度、改善され得る（Ｊｅｎら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９２：１４０−１４１）。これは、酸化ストレスは、インビボにおいて、網膜におけるニューロンの変性を引き起こす役割を担うことを示唆する。哺乳動物の網膜は、中枢神経系の不可欠な部分であるが、表面に位置しているので、実験的に極めて便利である。網膜は、生化学的かつ構造的に定義された神経膠集団およびニューロン集団を含む、組織された構造を持つ。さらに、網膜は、閉鎖系であり、神経保護性または神経毒性であることが知られている特定の化合物の効果を評価するのに望ましい方法である。

本出願で示されるように、凝集したβーアミロイドペプチド（Ａβ_{２５−３５}（Ａβ））のラット硝子体への注射は、網膜におけるニューロンの深刻な変性を引き起こした。さらに、本出願では、Ｌ−エルゴチオネオインの有益な効果を支持するデータ、およびＬ−エルゴチオネオインのアルツハイマー病における独立した処置としての利用についての可能性を示唆するデータ、またはアルツハイマー病の進行を弱める他の因子もしくはレジメンと組み合わせての利用についての可能性を示唆するデータが、提示されている。

本発明の方法は、目的の任意の哺乳動物に有用である。好ましい実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。さらなる実施形態は、外傷性損傷を罹患している家畜動物および非家畜動物の処置における獣医学的使用のためである。

さらなる実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、神経毒性化合物からの保護を提供するのに有効な量で、栄養補助食品として投与される。さらに具体的な実施形態において、この栄養補助食品は、経口カプセル、または錠剤、または液体懸濁物である。他の実施形態は、舌下送達または経頬送達に適切な形態のＬ−エルゴチオネオイン投与を包含する。さらなる実施形態は、坐剤形態のＬ−エルゴチオネオイン送達を包含する。なおさらなる実施形態は、髄腔内送達、脳室内送達、頭蓋内送達に適切なＬ−エルゴチオネオインの処方物を包含する。利用される特定の実施形態は、処置される患者の状態によって決定される。発作の後のような特定の状態においては、患者が飲み込む能力は損なわれており、従って、Ｌ−エルゴチオネオインまたは本発明の方法により同定される他の活性化合物を、飲み込みを含まない経路により送達する必要がある。

さらなる実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、損傷部位に直接的に、損傷細胞および損傷組織からのフリーラジカルおよび酸化剤の放出から引き起こされる損傷を抑制するのに有効な量で、投与される。脳損傷または急性脊髄損傷もしくは慢性脊髄損傷のような外傷性損傷の場合、Ｌ−エルゴチオネオインは、髄腔内送達、頭蓋内送達、または脳室内送達され得る。

関連する第２の局面では、本発明は、哺乳動物の神経細胞を神経変性から保護する方法を特徴とし、この方法は、治療上有効な量のＬ−エルゴチオネオインを、その必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する。１つの具体的実施形態は、Ｌ−エルゴチオネオインと薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的化合物の投与によって、神経変性から哺乳動物神経細胞を保護する方法を包含する。このような薬学的化合物は、経口送達、静脈内送達、筋内送達、皮下送達、髄腔内送達または脳室内送達のために設計され得る。特定の実施形態は、エルゴチオネオインの血液脳関門通過を助ける特定のキャリア分子含み得る。

神経毒性物質への曝露、神経毒性物質を生じる状態への曝露、および神経変性を引き起こす疾患状態の結果としての変性および細胞死から、ＣＮＳ細胞を保護するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的であり、この方法は、神経保護量のＬ−エルゴチオネオインを、単独でか、またはニューロン細胞の保護を助ける１種以上の他の因子、もしくは細胞増殖および組織再生を補助する因子と組み合わせて、投与することによる。これらの他の因子は、低分子合成有機化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得るか、損傷から神経系の細胞を保護する働きをする他のそのような因子、または、細胞増殖および／もしくは組織再生および／もしくは髄鞘形成を促す他のそのような因子であり得る。

本発明のいくつの実施形態において、上記組成物は、少なくとも一種のＲＯＳスカベンジャーをさらに含み得る。適切なスカベンジャーとしては、コエンザイムＱ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ピルビン酸、メラトニン、ナイアシンアミド、Ｎ−アセチルシトシン、ＧＳＨおよびニトロンが挙げられる。そのように記載される他の因子は、ニューロン細胞および／または組織の成長因子であり得る。これらは、結合の際に、組織再生または細胞増殖を刺激する、ニューロン細胞の特定のレセプターに対するリガンドであり得る。

本発明による併用治療の使用は、特定の神経状態と、そのような状態を引き起こす原因因子とにより決定づけられる。さらに、Ｌ−エルゴチオネオインは、髄鞘形成およびニューロンの再生を増強することが知られる第２の因子と共に、投与され得る。Ｌ−エルゴチオネオインおよび第２の因子の特定の用量力価（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を確立する方法は、当業者に公知である
本研究のなお別の局面において、急性ニューロン組織損傷または慢性ニューロン組織損傷に関係した細胞死を防ぐための方法が提供され、その方法は、治療上有効な量の抗酸化剤のカクテルを投与する工程を包含し、そのカクテルのうちの少なくとも１つのメンバーは、Ｌ−エルゴチオネオインである。第２の抗酸化剤は、例えば、ビタミンＣまたはビタミンＥであり得る。

Ｌ−エルゴチオネオインとの併用治療において有益なタンパク質は、神経栄養因子であり得る。神経栄養因子は、ニューロンとその標的細胞との相互作用を促進することによって、脊椎動物の神経系の発達に関与するものとしてもともと同定された分子の種類である。そのような標的細胞に対するニューロン間での競合が起こること、そしてそのような相互作用に成功したニューロンだけが生存することが、観察されている（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：１４９；Ｈｏｈｎら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４４；３３９）。従って、このような神経栄養因子は、神経細胞または神経膠細胞の生存および機能的活性を促進する。上記の状態から生じる神経細胞死または神経膠細胞死または神経細胞機能不全または神経膠細胞機能不全を防止するための処置として、有用である（Ａｐｐｅｌ、１９８１、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１０：４９９；Ａｐｐｅｌに対する米国特許番号４，６９９，８７５号および同第４，７０１，４０７；Ａｐｐｅｌらに対する米国特許第４，９２３，６９６号）。

このような神経栄養因子で最も特徴付けられているのは、神経成長因子（ＮＧＦ）である。ＮＧＦは、アルツハイマー病の間および加齢とともに死ぬ、前脳のコリン作動性神経細胞のための神経栄養因子であることが示されている。アルツハイマー病および加齢に関係する認識喪失の多くは、これらの神経細胞の損失が、原因であると、一般的に考えられている。

動物における実験は、ＮＧＦが、外傷性損傷後の前脳コリン作動性ニューロン細胞の死を阻止すること、およびＮＧＦは、加齢と共に起こる認識喪失を逆転し得ることを、示す（Ｈｅｆｔｉ および Ｗｅｉｎｅｒ，１９８６，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０：２７５；Ｆｉｓｃｈｅｒら，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：６５）。これらの結果は、疾患、損傷または加齢を通して前脳コリン作動性神経細胞死から生じる認識喪失の処置において、ヒトにおけるこの神経栄養因子の臨床的有用性の可能性を示唆する。

他の神経栄養因子が、単離され、特徴付けられており、それらには、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら，前出）；海馬由来神経栄養因子と名付けられた改変体（ＨＤＮＦ）（Ｅｒｎｆｏｒｓら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５４５４）；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）（Ｈｏｈｎら，前出；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４４６；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら，１９９０，Ｎｅｕｒｏｎ，４：７６７）；および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔａｇａ，Ｔ．，およびＡｋｉｒａ，Ｓ．Ｃｅｌｌ，７６：２５２〜２６２、１９９４；Ｓｔａｈｌ，Ｎ．およびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０、１９９４）がある。上記した全ての物は、参考として本明細書中に援用されている。

Ｌ−エルゴチオネオインと組み合わせてか、または本発明の方法により同定される新しい因子と組み合わせて使用され得る他の因子は、細胞増殖および細胞生存を刺激するリガンドであり得る。例えば、これらのリガンドは、プロテインキナーゼレセプター、およびチロシンキナーゼに関連するレセプターと、結合しそれらを活性化するリガンドを含み得る（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｒｒ，Ｐ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．およびＬｉｎｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２５１−３３７，１９９４）。それらは、インテグリンに対するアゴニストリガンドであり得る（Ｃｈｏｔｈｉｓ，Ｃ．およびＪｏｎｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：８２３−８６２，１９９７）。このような分子は、軸索の成長を促進することが当該分野で公知であるラミニンを含み得る（Ｂａｔｅｓ，Ｃ．Ａ．およびＭｅｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８１：９１−１０１，１９９７）。他の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに由来し得る（Ｗａｌｓｈ，Ｆ．Ｓ．およびＤｏｈｅｒｔｙ，Ｐ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：４２５−４５６，１９９７）。ネイティブのアゴニストリガンドと同じ特性を示すレセプター模倣物として作用する分子を開発することも、可能である。上記の全ては、Ｌ−エルゴチオネオインと組み合わせてか、または本発明の方法により同定される新しい神経栄養因子と組み合わせての、利用に適し得る。

以下で提示する実験は、食餌性のＬ−エルゴチオネオインは、網膜ニューロンを保護するのに有効であったこと、ならびにその神経保護効果は、非神経節細胞集団に比べて神経節細胞集団に対してより顕著であったことを示している。非注入網膜において、細胞密度および／または総合的なニューロン集団の変性のわずかな減少があった。このことは、神経毒性化合物の片側注入の非特異的で体系的な効果を示唆した。

しかし、これらの実験は、エルゴチオネオインの腹腔内注入は、実験的に誘導したＮＭＤＡ毒性に起因する変性または喪失からニューロンを保護したことを示し、故にまた、エルゴチオネオインが血液脳関門を通過する能力を実証している。さらに、哺乳動物の網膜系は、ニューロンの発達、機能、または生存に影響する因子を研究するための有用なインビボ実験モデルであることが示されている。

（薬学的組成物および投与の方法）
本発明はまた、本発明の方法で使用する薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療上有効な量のＬ−エルゴチオネオインと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む。特定の実施形態において、用語「薬学的に受容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」とは、動物（より特には、ヒト）における利用のために、連邦政府または州政府の管理機関によって承認されているか、または米国薬局方および一般的に認識されている他の薬局方により列挙されていることを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤がと共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的キャリアは、滅菌した液体（例えば、水および油（石油起源の油、動物起源の油、野菜起源の油または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など）））であり得る。上記薬学的組成物が静脈内に投与される場合、水は、好ましいキャリアである。生理食塩水、デキストロース水溶液およびグリセロ−ル水溶液もまた、特に注射可能な溶液のための、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロ−ルモノセアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、水、エタノールなどが挙げられる。もし望むならば、この組成物は、微量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤もまた、含み得る。

これらの組成物は、溶液、懸濁物、乳濁物、錠剤、ピル、カプセル、散剤、徐放製剤などの形態をとり得る。この組成物は、トリグリセリドのような伝統的な結合剤およびキャリアを用いて、坐剤として、処方され得る。経口処方物は、標準的なキャリア（例えば、薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」で記述されている。このような組成物は、治療上有効な量の化合物（好ましくは精製形態）を適切量のキャリアと共に含み、被験体への適切な投与のための形態を提供する。

本発明の化合物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離なアミノ基（例えば、塩酸に由来するもの、リン酸に由来するもの、酢酸に由来するもの、シュウ酸に由来するもの、酒石酸に由来するもの）と形成されるもの、ならびに遊離カルボキシル基（例えば、ナトリウムに由来するもの、カリウムに由来するもの、アンモニウムに由来するもの、カルシウムに由来するもの、水酸化第２鉄に由来するもの、イソプロピルアミンに由来するもの、トリエチルアミンに由来するもの、２−エチルアミノエタノールに由来するもの、ヒスチジンに由来するもの、プロカインに由来するものなど）と形成されるものが挙げられる。

損傷の部位、標的細胞、標的組織または標的器官へのＬ−エルゴチオネオインの投与は、ピルおよびカプセル、または液体処方物および懸濁液として、経口投与によってであり得る。この投与は、経粘膜経路、舌下経路、鼻経路、直腸経路または経皮経路を介しての投与であり得る。非経口的な投与はまた、静脈内注射、または動脈内投与、筋内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与および頭蓋骨内投与であり得る。例えば、直接本発明の組成物は、即時梗塞領域外に位置し、血流停止の間に死滅しなかったが、血流の回復時に広範なＲＯＳ媒介性損傷を経験した、虚血半影の細胞内中のミトコンドリアを保護するために、梗塞を経験した組織または器官（例えば、発作および心臓発作の後の脳または心臓）に、本発明の組成物は、直接注入され得る。本発明が考慮されている神経疾患または神経状態の性質に起因して、投与の経路は、坐剤を介する送達もまた含み得る。このことは、発作のような、患者が飲み込む能力が損なわれている状態において特に当てはまる。

Ｌ−エルゴチオネオインは、リポソーム処方物として提供され得る。リポソーム送達は、種々の適用のための他の化合物のための薬学的送達系として利用されてきた。例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら（１９８９）ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編集），Ｌｉｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）を参照のこと。多くの適切なリポソームの処方物が、当業者に公知であり、本発明の目的のために使用され得る。例えば、米国特許第５，１９０，７６２号を参照のこと。

さらなる局面において、Ｌ−エルゴチオネオインリポソームは、血液脳関門を通過し得、このことは、静脈内投与または経口投与を可能にする。血液脳関門通過のために、多くの戦略が利用できる。その戦略としては、分子の疎水性を上昇させる；血液脳関門中のレセプターを標的としたキャリア（例えば、トランスフェリン）への結合体として分子を導入することなどが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、上記分子は、頭蓋内投与、より好ましくは、脳室内投与され得る。なお別の実施形態において、Ｌ−エルゴチオネオインは、血液脳関門を標的としたリポソーム中にて投与され得る。

リポソーム処方物または遊離Ｌ−エルゴチオネオインのいずれかとしての、Ｌ−エルゴチオネオインの経皮送達もまた、企図されている。種々のそして多数の方法が、薬物の経皮投与（例えば、経皮パッチを介する）のために、当該分野で公知である。経皮投与経路は、皮膚浸透増強剤の使用により高められる得ることが、容易に認識され得る。

制御放出経口処方物が、本発明の神経保護方法を実行する場合に望まれ得る。その薬物は、ガムのような、拡散機構または浸出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリックスに組み込まれ得る。ゆっくりと分解するマトリックスもまた、処方物中に組み込まれ得る。いくつかの腸溶性コーティングもまた、遅延放出効果を有する。この治療剤の制御放出の他の形態は、Ｏｒｏｓ処置系（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法による（すなわち、浸透圧効果に起因して１つの小さな穴を通して水が入って薬物を押し出すのを可能にする、半透膜中にその薬物を封入する）。

Ｌ−エルゴチオネオインの肺送達もまた、処置のために使用され得る。本発明の実施における利用のために企図されるのは、処置産物の肺送達のために設計された広範囲の機械デバイス（例えば、噴霧器、定量（ｍｅｔｅｒｅｄ）用量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるが、これらに限定されない）であり、これらはすべてが、当業者が精通している。送達デバイスの構成については、当該分野で公知の任意のエアゾール化形態（例えば、液体処方物のスプレーボトル、噴霧化、微粒化、またはポンプエアゾール化、ならびに乾燥粉末処方物のエアゾール化が挙げられるが、これらに限定されない）が、本発明の実施において利用され得る。

Ｌ−エルゴチオネオインの眼送達または鼻送達が、本発明の方法において使用され得る。鼻送達は、肺で治療産物を沈着する必要なく、鼻への治療産物投与の直後に、本発明の薬学的組成物の血流への通過を許容する。鼻送達のための処方物は、デキストランまたはシクロデキストランを含む処方物を包含する。鼻投与のため、有用なデバイスは、測定用量スプレーが付いた小さく硬いボトルである。１実施形態において、本発明の薬学的組成物の溶液を、規定容量のチェンバー中に引き込むことにより、定量的（ｍｅｔｅｒｅｄ）用量が送達される。このチャンバーは、チェンバー内の液体が圧縮された場合に噴霧を形成することにより、エアロゾル処方物をエアロゾル化する寸法である開口部を有する。本発明の薬学的組成物を投与するために、チェンバーは、圧縮される。特定の実施形態において、チェンバーはピストン配置をとる。このようなデバイスは市販されている。

本発明の組成物および処方物は、Ｌ−エルゴチオネオインの経粘膜送達のために適切である。特に、この組成物および処方物は、高まった酵素活性を有する胃液または他の体液中に存在するタンパク質分解酵素による分解に感受性である因子の、舌下送達、経頬送達、または直腸送達に適している。さらに、経粘膜送達系は、低い経口バイオアベイラビリティを有する因子のために利用し得る。本発明の組成物は、溶媒、必要に応じたヒドロゲル、および粘膜を通る輸送を高める因子を含むキャリア中に、溶解または分散させたＬ−エルゴチオネオインを含む。この溶媒は、本発明のこのような処方物において有用であることが当該分野で公知である。この溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、ステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および同じような溶解特徴を持つ他の溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の他のこのような溶媒は、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎにより出版されたｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９８６）およびＲ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ ＣＯ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８０）により編集されたｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕｍｓａｎｄ Ｒｅｓｉｎｓにおいて見つけられ得る。

本発明の成分または薬学的に受容可能な塩の投与に適切な、経粘膜調製物が、使用され得る。特に、この混合物は、当該分野で周知の任意の従来の技術を使用して処方され得る、口腔、鼻腔または直腸腔において使用できる任意の調製物である。好ましい調製物は、口腔、鼻腔または直腸腔で使用可能な調製物である。例えば、この調製物は、経頬錠剤、舌下錠剤、または、患者の口に薬物を送達すると溶解または崩壊する同様の調製物である。スプレーまたはドロップが、鼻腔へこの薬物を送達するために使用され得る。坐剤が、直腸粘膜にこの混合物を送達するために、使用され得る。この調製物は、徐放形態で薬物を送達し得ても良いし、そうでなくても良い。

本発明の成分の送達のための具体的な実施形態は、粘膜付着調製物である。粘膜付着調製物は、無傷の粘膜に触れた際に、所望の治療効果または栄養効果を誘導するために充分な時間、その粘膜に付着する調製物である。この調製物は、例えばＷＯ９６／０９８２９で記載されているような、半固体組成物であり得る。この調製物は、例えば、ＷＯ９６／３００１３で記載されているような、粘膜付着性マトリックスを含む、錠剤、粉末、ゲルまたはフィルムであり得る。この混合物は、粘膜に付着するシロップとして調製され得る。

適切な粘膜付着物としては、好ましくは、約４５０，０００から約４，０００，０００の分子量を持つポリアクリル酸（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ^ＴＭ９３４Ｐ）；カルボキシルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、または、例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ．ＴＭ。 Ｋ１００およびヒドロキシプロピルセルロースのような、当業者に周知なものが挙げられる。

本発明の組成物の送達はまた、本発明の構成要素を含み粘膜に付着する、絆創膏、パッチ、デバイス、および同じようなデバイスを用いることにより達成され得る。適切な経粘膜パッチは、例えば、参考文献として援用しているＷＯ９３／２３０１１および米国特許第５，１２２，１２７号で記述されている。このパッチは、この混合物を、薬物／粘膜境界面の大きさに応じて送達するよう設計されている。それゆえ、送達速度は、接触領域の大きさを変化させて調節され得る。本発明の組成物の送達に最も適し得るパッチは、本発明の組成物がそのパッチから損失する防壁として働く、裏打ち（ｂａｃｋｉｎｇ）を含み得る。その裏打ちは、そのようなパッチに使用される任意の従来材料（ポリエチレン、エチル−ビニルアセテートコポリマー、ポリウレタン、などが挙げられるがこれらに限定されない）であり得る。それ自体は粘膜付着性でないマトリックスから作製されたパッチにおいて、本発明の成分を含むマトリックスは、粘膜付着性成分（例えば、上記した粘膜付着物）と結合され得、その結果、そのパッチは、粘膜表面上に保持され得る。このようなパッチは、当業者に周知の方法により調製され得る。

本発明に従って使用できる調製物は、他の成分（例えば、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、可溶化ビヒクル、矯味矯臭剤、色素）を含み得る。粘膜浸透増強剤を、調製物に組み込むことが、望ましい場合があり得る。適切な浸透増強剤としては、陰イオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム）、陽イオン性界面活性剤（例えば、塩化パルミトイルＤＬカミチン、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル、モノラウリル酸グリセリル、ポリオキシアルキレン、ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、脂質（例えば、オレイン酸）、胆汁酸塩（例えば、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム）および関連化合物が挙げられる。

本発明の化合物の投与は、単独であっても、または本発明によって企図される種々の医学的状態を処置するのに有効な他の化合物と組み合わせてであっても、よい。また、本発明の組成物および処方物は、処置の間の患者の安らぎを高めるために、種々の鎮痛剤、麻酔薬、または抗不安薬と共に投与され得る。

本明細書に記載されている本発明の組成物は、液体の形態であり得る。この液体は、スプレー、ペースト、ゲル、または液滴として送達され得る。所望される粘性は、１種類以上のヒドロゲル（水を吸収して多様な粘度の物質を生成する物質）を加えることにより、達成される。使用に適切なヒドロゲルは、当該分野で周知である。例えば、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８６）により出版されたＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓおよびＲ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ ＣＯ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８０）により編集されたｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｎｓを参照のこと。

本組成物における使用のために適切なヒドロゲルとしては、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピリメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびポリアクリル酸が挙げられるが、これらに限定しない。本組成物おいて使用されるヒドロキシセルロースの濃度は、使用する特定の粘度の等級および最終産物で所望される粘度に依存する。多数の他のヒドロゲルが、当該分野で公知であり、当業者は、本発明における使用のために最も適切なヒドロゲルを、容易に突き止め得る。

本発明とともに有用な粘膜輸送増強因子は、本願発明における因子が、患者の粘膜および血流を通過することを容易にする。この粘膜輸送増強因子もまた、本明細書で参考文献として援用している米国特許第５，２８４，６５７号で記述されているように、当該分野で公知である。これらの因子は、精油または揮発油の群から、または非毒性の薬学的に受容可能な無機酸もしく有機酸から選択され得る。精油または揮発油としては、ペパーミント油、スペアミント油、メントール、ユーカリ油、シナモン油、ショウガ油、フェンネル油、イノンド油などが挙げられる。本発明のために有用な適切な無機酸または有機酸としては、塩酸、リン酸、芳香族および脂肪族のモノカルボン酸またはジカルボン酸（例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、安息香酸、サリチル酸、および同じような特徴をもつ他の酸など）が挙げられるが、これらに限定されない。用語「芳香族」酸は、ベンゼンの特徴である６員環系を有する酸を意味する。一方、用語「脂肪族」は、直鎖または分枝鎖の、飽和炭化水素または不飽和炭化水素の骨格を有する、任意の酸を指す。

他の適切な輸送増強因子としては、陰イオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム）、陽イオン性界面活性剤（例えば、塩化パルミトイルＤＬカミチン、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル、モノラウリル酸グリセリル、ポリオキシアルキレン、ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、脂質（例えば、オレイン酸）、胆汁酸塩（例えば、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム）ならびに関連化合物が挙げられる。

本発明の組成物および処方物は、口腔粘膜（好ましいｐＨは、ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲であるべき）へと、当該分野で公知の薬学的に受容可能な非毒性緩衝液系を使用して作製された任意の必要なアジュバントと共に、投与されるべきである。

局所送達のためには、Ｌ−エルゴチオネオイン水溶液、緩衝化水溶液中のＬ−エルゴチオネオインまた薬学的に受容可能なキャリア中のＬ−エルゴチオネオイン、またはヒドロゲルローション中のＬ−エルゴチオネオインもしくはクリーム中のＬ−エルゴチオネオインが、５０μＭ〜５ｍＭの間の濃度の水層および疎水層の乳濁液を含んで、使用される。好ましい濃度は、約１ｍＭである。審美的に受容可能な処方物を生成するために、アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸塩または他の成分あるいはそれらの組み合わせが、ここへ加えられ得る。金属は、最低限に留められるべきである。これは、経口投与、非経口投与、また好ましくは局所投与のために、好ましくはリポソームへの封入により処方され得る。

本発明は、神経保護有効量のＬ−エルゴチオネオインを、被験体に投与する工程を包含する処置方法を提供する。１つの実施形態において、上記化合物は、実質的に精製されている（例えば、その効果を限定するかまたは望ましくない副作用を起こす物質を、実質的に含まない）。被験体は、好ましくは、動物（ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるが、これらに限定されない）。そして被験体は、好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳動物が、この被験体である。別の特定の実施形態において、ヒト哺乳動物が、被験体である。

損傷からニューロン細胞を保護するのに最適なＬ−エルゴチオネオインの量は、本明細書に基づいて、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイが、最適な投与範囲を同定するのを助けるのに、場合によって使用され得る。処方物中で使用される詳細な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度にも依存し、実施者の判断および被験体それぞれの状況に従って、決定されるべきである。有効な用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系に由来する、用量−応答曲線から外挿され得る。

（処置群）
Ｌ−エルゴチオネオインの投与が神経保護のための有効な治療レジメンである被験体は、好ましくはヒトであるが、任意の動物でもあり得る。従って、当業者によって容易に認識され得るように、本発明の方法および薬学的組成物は、任意の動物への投与、特に哺乳動物（例えば、家畜（例えば、ネコ被験体またはイヌ被験体）、牧場動物（例えば、ウシ被験体、ウマ被験体、ヤギ被験体、ヒツジ被験体、ブタ被験体が挙げられるが、これらに限定されない）、野生動物（野生にいようと動物園にいようと）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなど）、鳥類種（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽）などが挙げられるがこれらに限定しない）への投与、すなわち獣医学的使用に、適している。

神経毒性物質または神経毒性状態による損傷からのニューロン細胞の保護は、このような神経毒性物質および神経毒性状態への曝露する以前に可能な場合に、考えられるべきである。神経毒性物質および神経毒性状態への曝露は、神経変性を引き起こすことが公知である疾患および障害の存在下で（例えば、アルツハイマー病の存在下で）考慮され得る。さらに、神経毒、汚染物質、放射線（例えば、太陽放射線、電磁放射線または核放射線）への曝露、ならびに活性酸素種および他のラジカルを産生することが知られている薬剤への曝露は、ＣＮＳの細胞にとって潜在的に有害であると認識されている。本発明の神経保護方法は、ニューロン損傷を減少または防止するために、神経毒性物質または神経毒性状態への曝露前に使用され得る。さらに、Ｌ−エルゴチオネオインの投与は、損傷または神経毒性物質への曝露の時点、またはその後に、単独でか、または神経保護せいであることが知られている因子、または神経組織の修復もしくは再生を刺激するのに有益であることが知られている因子、またはニューロン細胞増殖を助けることが知られている因子、または髄鞘形成に有用な因子と組み合わせて与えられる。

（神経保護因子のスクリーニング）
第３の局面において、本発明は、損傷から中枢神経系細胞を保護可能な化合物を同定するためのスクリーニング方法を特徴付けている。この方法は、（ａ）試験化合物による処置と共にかまたはそのような処置なしで、網膜細胞を神経毒性因子に曝露（処置）する工程；および（ｂ）網膜ニューロン集団に対するその試験化合物の効果を決定する工程を包含し、ニューロンの完全性を増加可能であるかまたはニューロン細胞の数を維持可能である試験化合物が、神経保護因子として同定される。さらなる実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞を損傷から保護可能である化合物を同定するためのスクリーニング方法を包含する。この方法は、（ａ）試験化合物を用いた処置と共にかまたはそのような処置なしで、ドーパミン作動性ニューロンを、インビトロまたはインビボで６−ＯＨＤＡで処理する工程；おｙび（ｂ）ドーパミン作動性ニューロン集団に対するその試験化合物の効果を決定する工程を包含し、細胞の生存を増加可能である試験化合物が、神経保護因子として同定される。なおさらなる実施形態は、上記方法を使用し、そして、Ｌ−エルゴチオネオインを効力の標準物またはポジティブコントロールとしてそのアッセイで使用して、中枢神経系細胞を損傷から保護可能である新しい化合物についてのスクリーニングである。

（Ｌ−エルゴチオネオインの特異的な神経保護効果）
（ＮＭＤＡの硝子体内注射およびＬ−エルゴチオネオインによる神経保護）
本発明のこの局面に従って、Ｌ−エルゴチオネオイン投与なしで、ＮＭＤＡを硝子体内注射したラットは、神経節細胞におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対する免疫染色の減少を示した（図２）。同じように、ＮＭＤＡ注入した網膜の星状細胞（主に網膜の硝子体表面に位置する）における神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の免疫染色の減少もまた、検出された（図３）。クレシルバイオレット染色された組織学的切片において、ＮＭＤＡを２４時間注入したラットの網膜組織は、正常網膜または注入されていない網膜に比べて、健康的でなく、変性または壊死して見えた（図４）。

正常網膜において、細胞密度の総合平均は、６３９４細胞／ｍｍ^２である。細胞体の直径に基づいて、これらのうち、６１％は、非神経節細胞であり、３９％は、神経節細胞であると考えられる。これらの図面は、これまでの研究（例えば、Ｐｅｒｒｙ（１９８１）（前出）を参照）に一致しており、神経節細胞層におけるニューロン集団全体の半分より多くが、神経節細胞に比べて小さい細胞体を有する置換アマクリン細胞であることを示している。

ＮＭＤＡの硝子体内注射を受け、ＰＢＳにより処理された動物においては、網膜における総細胞数の５８％の減少があった。この減少は、８１％の神経節細胞の損失と４３％の非神経節細胞減少を伴い、大きな細胞で特に明らかであった。対照的に、注射されていない網膜においては、たった１５％の神経節細胞および８％の非神経節細胞の損失であった（図４〜５）。Ｌ−エルゴチオネオイン処理した動物においては、４４％の神経節細胞および３１％の小細胞すなわち非神経節細胞の損失があった。これらの動物由来の注射していないコントロールの眼は、これらの集団の７％および４％の損失を示した（図５）。

ＮＭＤＡは、ニューロンに対して興奮性である。ＮＭＤＡの硝子体内注射が実際に網膜におけるニューロンの喪失をもたらし、そのニューロンの萎縮をもたらすのではないことを確かめるために、以前の研究で報告された時点（Ｌａａｂｉｃｈら（２０００）Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８５：３２−４０）より長い時点である、ＮＭＤＡの注入６週間後の網膜全封入物（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）において、細胞係数およびサイズ測定を実施した。結果は、今までの研究と一致し、網膜ニューロンにおけるＮＭＤＡの神経毒性の効果を示す（Ｋｉｄｏら（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８８４：５９−６７；Ｌａａｂｉｃｈら（２０００）前出）。

本発明は、神経節細胞層における神経節細胞と、置き代わったアマクリン細胞との両者の有意な変性および喪失を引き起こす、ＮＭＤＡのインビボでの効果の証拠を提供する。ＮＭＤＡの細胞毒性効果は、主にグルタミン酸作動性として知られている神経節細胞集団（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（２０００）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４２０：９８−１１２）においてより重篤であるように見える。これは、神経節細胞におけるＡＰＰの減少という本発明者らの観察と一致する。主に非神経節細胞である、置き換わったアマクリン細胞が減少したという事実は、ＮＭＤＡの細胞毒性効果が、神経節層細胞集団に特異的でも限定されることもないかもしれないことを、示唆している。これは、アマクリン細胞／置換アマクリン細胞の部分集団は、ＮＭＤＡレセプターを発現し得、そのため、興奮毒性に対し脆弱性であり得るという示唆と調和し得る（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（２０００）前出）。

しかし、ＮＭＤＡ注入後の星状細胞におけるＧＦＡＰ免疫反応性の減少は、グルタミン酸作動性ニューロン、またはＮＭＤＡレセプターを発現しないニューロンに対する、神経膠細胞の機能障害を介した、ＮＭＤＡ処理の間接的な有害な影響もまた存在し得ることを暗示する。実際、網膜神経膠細胞は、網膜ニューロンの正常な機能および生存において重要な役割を担うことが知られている。これらの細胞の機能障害は、異なる性質の損傷によってチャレンジされた網膜における細胞変性の沈着（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ）因子であり得る（例えば、細胞毒性β−アミロイドペプチド）（Ｊｅｎら（１９９８）前出；Ａｒｕｏｍａら（１９９９）前出）。

ＮＭＤＡの硝子体内注射の６週間後の大きな神経節細胞の減少に加えて、細胞体の直径が６μｍ未満の小さな細胞集団の観察される減少は、その大きい方の細胞の損失ではなく、むしろ神経節細胞層におけるニューロン集団の実質的な損失があることを示す。この損失はおそらく永久的であり、細胞体の収縮によって示されるように可逆的変性の可能性を排除する。

（Ｐ１２細胞のＡβ細胞毒性に対するＬ−エルゴチオネオインの効果）
β−アミロイドペプチドは、老人性斑の主な構成要素であり、アルツハイマー病（ＡＤ）の発症および進行において原因的役割を持つと考えられている。本出願において、Ａβ誘導性酸化的細胞死の防止に対するＬ−エルゴチオネオインの正の効果を示す結果が、示される。ラットのクロム親和性細胞腫（ＰＣ１２）細胞が、Ａβへの曝露後の細胞死からの保護に対するＬ−エルゴチオネオインの効果を試験するために使用された。ＰＣ１２細胞は、ニューロン細胞死研究用および変性研究用のよく定義されたインビトロモデルである（Ｆｕｊｉｔａら（１９８９），Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．８０：１２７−１４２；Ｌｅｃｌｅｒｃら（１９９５），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２０１：１０３−１０６）。これらの細胞は、副腎クロム親和性細胞および交感神経の表現型特徴を保持している（Ｇｒｅｅｎら（１９７６），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ７３：２４２４−２４２８）。Ａβで処理された細胞は、インサイチュ末端標識（ｉｎ ｓｉｔｕ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）（ＴＵＮＥＬ ｓｔａｉｎｉｎｇ）陽性、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の減少、プロアポトーシスＢａｘ 対 アンチアポトーシスＢｃｌ−Ｘ_Ｌの比の増加、およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断によって決定される、アポトーシス死を経験した。Ｌ−エルゴチオネオインでの処理は、ＰＣ１２細胞におけるＡβ誘導性アポトーシスと脂質過酸化とを弱めた。一酸化窒素ドナーであるニトロプルシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）（ＳＮＰ）と、過酸化亜硝酸産生３−モルフォリノシドノニミンクロルヒドレート（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓｙｄｎｏｎｉｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｈｙｄｒａｔｅ）（ＳＩＮ−１）により誘導される細胞毒性に対する、Ｌ−エルゴチオネオインの効果が比較された。Ｌ−エルゴチオネオインは、ＳＩＮ−１依存的細胞死の濃度依存性保護を示したが、ＳＮＰにより媒介される細胞死は保護しなかった。これは、Ｌ−エルゴチオネオインは、過酸化亜硝酸の強力なスカベンジャーであることを示唆する。ｂｃｌ−２を用いるＰＣ１２細胞のトランスフェクションは、Ａβにより誘導されるアポトーシス死からこれらの細胞のＬ−エルゴチオネオイン依存的救出を増幅させた。これらの結果（下の実施例２に示す）は、Ｌ−エルゴチオネオインが、Ａβにより引き起こされる酸化的ニューロン細胞死および／またはニトロソ化ニューロン細胞死を調節し得、そしてＡＤに対する予防的能力または治療的能力を有し得ることを、示唆する。

（６−ヒドロキシドーパミン（ＯＨＤＡ）損傷モデルおよびＬ−エルゴチオネオインの効果）
多くの注目が、植物由来の抗酸化剤のインビトロでの特徴付けに集められてきた。インビボで考慮するため、抗酸化剤成分の代謝産物のバイオアベイラビリティおよび最終結果という問題が、考えられなければならない。従って、抗酸化剤の活性に基づいた進行的ニューロン損失を防止するための治療的戦略を開発するため、その抗酸化剤は、液脳関門を通過可能でなくてはならず、そして神経保護のためそれぞれの脳領域に存在しなければならない。

以下の実施例３は、Ｌ−エルゴチオネオインが、６−ＯＨＤＡ損傷ラットモデルにおいて、６−ＯＨＤＡ損傷後のＴＨ＋細胞の喪失を減少させたことの証明を提供する、最初の研究を報告する。６−ＯＨＤＡ損傷ラットモデルは、パーキンソン病の構成妥当性を満たす。それは、このモデルが、同じような生化学的特徴を共有し、ＴＨ＋細胞の損失は、進行性でありかつ用量依存的であるという点である（Ｐｅｒｅｓｅら（１９８９）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４９４：２８５−２９３）。６−ＯＨＤＡに起因するニューロン損失の詳細な機構は、未だ明らかにされていない。しかし、ニューロン内での６−ＯＨＤＡ依存的な酸化的ストレスが、細胞死を引き起こし得るという示唆が存在する（Ｆｅｒｂｅｒら（２００１ａ）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ１２：１１５５−１１５９およびＦｅｒｂｅｒら（２００１ｂ）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７８：５０９−５１４（両者とも、その全体が本明細書において参考として援用されている））。６−ＯＨＤＡ誘導性ニューロン死は、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）および細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を含み得る（Ｄｕｌｚｅｎ（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．２９：３８７−３９９，Ｃｈｏｉら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｅｃｅ５７：（８６−９４），およびＫｕｌｉｃｈら（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：１０５８−１０６６（それぞれ、その全体が本明細書中に参考として援用されている））。この研究で見られる８μｇの６−ＯＨＤＡの後のＴＨ＋細胞数の減少は、我々の以前の研究に一致して匹敵した（Ｄａｔｌａら（２００１），Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ１２：３８７１）。Ｌ−エルゴチオネオインの前処置は、ＴＨ＋細胞の損失から保護した。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように生成して使用するかについての完全な開示および記述を当業者に提供するために示されており、本発明者らが発明と見なしているものの範囲を限定することを意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確保するための努力がなされた。しかし、いくつかの実験誤差および偏差が、計上されるべきである。他のように指示していない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、そして圧力は、大気圧または大気圧付近である。

（実施例１．ＮＭＤＡ網膜モデルにおけるＬ−エルゴチオネオインの効果の評価）
（材料および方法）
Ｌ−エルゴチオネオインは、Ｏｘｉｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から入手した。ＮＭＤＡおよび他の生化学的物質は、入手し得る最も高純度のものであり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＫから購入した。

若い成体の雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、本実験では使用した。この動物は、Ｈａｒｌａｎ（Ｅｎｇｌａｎｄ）から提供された。これを、Ｃｈａｒｉｎｇ Ｃｒｏｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃａｍｐｕｓ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ ＣｏｌｌｅｇｅにおけるＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔにおいて維持した。使用した動物手順は、英国内務省の規制に従った。この動物を、４つの群に分割した。第１の群は、処置を受けなかった正常ラット６匹からなる。さらなる９匹の動物を、Ｈｙｐｎｏｒｍ^ＴＭ（０．０２ｍｇのクエン酸フェンタニルおよび０．５４ｍｇのフルアニソン／１００ｇの体重）で麻酔し、そして５μｌの４ｍＭ ＮＭＤＡの片側硝子体内注入を左目の硝子体に与える前に、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ^ＴＭ（０．２７ｍｇのミダゾラム／１００ｇの体重）により麻酔した。注射されていない右目は、コントロールとして役立った。ＮＭＤＡを注射した実験動物のうち６匹には、さらなる０．２ｍｌの７０ｍｇ／ｍｌ Ｌ−エルゴチオネオインの腹腔内注射を与えた（ｎ＝３）か、ＮＭＤＡ注射の２４時間前および３０分前にビヒクルコントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の腹腔内注射を与えた。

さらなるＬ−エルゴチオネオインまたはＰＢＳの腹腔内注射を、１時間、２４時間、４８時間、および７２時間の時点で行い、１週間当たり３回の注射を、その後３週間行った。ＮＭＤＡ注射の６週間後、すべての動物を、再び深く麻酔し、生理食塩水、続いてリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで潅流した。目玉を、同じ固定液に集め、ＰＢＳ中で網膜を解剖する前に、さらに３０分間、後固定した。それぞれの網膜に対して、網膜を、ゼラチンコートしたスライド上に平らに封入する前に、４つの半径方向状切断を行い、湿室中で２〜３日間ゆっくりと風乾した。

それから、網膜の全封入物（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）を、クレシルバイオレットで染色し、カバーガラスで覆った。分析を、カメラルシダー引き込みチューブを備えたＷｉｌｄ顕微鏡の下で行った。４つの網膜四分円の中心部分、中間部分、末梢部分における１５０×１５０μｍの領域において、網膜神経節細胞層における網膜ニューロンの数を、倍率３００×で計数し、細胞の大きさを測定した。数えたニューロンは、細胞体（ｓｏｍａｔａ）の直径が６μｍより小さいもの、または６μｍ以上のものの、２つの群に分割した。大きいニューロンのほとんどが、網膜神経節細胞である。一方、小さな細胞体は、主に非神経節細胞であるか、または、置き換わったアマクリン細胞である（Ｐｅｒｒｙ（１９８１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ６：９３１〜９４４）。細胞の数を、個々の網膜の合計１２個の視野において数え、統計的に分析した。データを、平均値±平均標準偏差として表現する。値間の差異は、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比べた。

別個の一連の実験において、３匹の正常ラット、および、ＮＭＤＡの硝子体内注射２４時間後の３匹のラットから得た眼球を、４％のパラホルムアルデヒドでの潅流後に解剖し、３０％スクロース中で凍結保護し、それから厚さ２０μｍにｃｒｙｏｓｔａｔ上で切断した。代替切片を、ゼラチンで覆われたスライドの上に集め、網膜の細胞構造を明らかにするためにクレシルバイオレットで染色するか、または、アミドロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対する免疫細胞学的に反応させ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ１：８００）、アビジン−ビオチン複合体法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）を使用して可視化した。

（結果）
ＮＭＤＡの硝子体内注入を与え、その後、リン酸緩衝化生理食塩水で処理した動物（ＰＢＳコントロール群）の網膜中で、総細胞数の５８％の減少があった。神経節細胞の８１％の損失および非神経節細胞の４３％の減少を伴うこの減少は、特に、大きい方の細胞で明らかであった。対照的に、注射されていない網膜においては、たった１５％の神経節細胞および８％の非神経節細胞の損失しかなかった（図４〜５）。Ｌ−エルゴチオネオイン処理した動物において、４４％の神経節細胞および３１％の小さな細胞すなわち非神経節細胞の損失があった。これらの動物由来の注入していないコントロールの眼は、これらの集団の７％および４％の損失を示した（図５）。これらの結果は、Ｌ−エルゴチオネオインの有意な神経保護効果を示す。

（実施例２．ＰＣ１２細胞においてβ−アミロイドにより誘導される細胞毒性およびアポトーシス細胞死に対する、Ｌ−エルゴチオネオインの効果の評価）
（Ａ．ＰＣ１２細胞のβ−アミロイド細胞毒性に対するＬ−エルゴチオネオインの効果）
（材料）
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）と、ニトロプルシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）（ＳＮＰ）とを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。βアミロイドペプチド（Ａβ_{２５−３５}）は、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。Ａβ_{２５−３５}を、脱イオン蒸留水に濃度１ｍＭで溶かし、使用まで−２０℃で保存した。ストック溶液を、使用する直前に望ましい濃度に薄め、エージング手順なしで培養培地に加えた。新鮮なＡβ_{２５−３５}調製物およびエージングしたＡβ_{２５−３５}調製物の両方が、ＰＣ１２細胞において同じような細胞毒性効果を持つことを、本発明者らは注目する。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清、ウマ血清、栄養混合物Ｈａｍ’ｓＦ−１２およびＮ−２補充物は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から提供された。３−モルホリノシドノニミンクロルヒドレート（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓｙｄｏｎｉｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｈｙｄｒａｔｅ）（ＳＩＮ−１）は、Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）の製品であった。テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）によって、そしてジヒドロローダミン（ＤＨＲ）１２３は、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｎＨ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって、それぞれ、供給された。合成ＥＧＴは、ＯＸＩＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から入手した。

（細胞培養物）
ＰＣ１２細胞を、１０％熱非働体化ウマ血清および５％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭにおいて、１０％ＣＯ_２／９０％空気の加湿大気中で３７℃にて維持した。すべての細胞を、ポリ−Ｄ−リジンで覆われた培養皿において培養した。培地を、隔日交換し、細胞を、それぞれの実験規模に合わせて、適切な濃度でプレートした。２４時間の継代培養の後、細胞を、処理のために、血清を含まないＮ−２規定培地に移した。細胞生存度決定のために、ＰＣ１２細胞を、最初、４×１０^４細胞／３００μｌの密度で４８ウェルプレートにプレートし、細胞生存率を、以下に記述するように、従来のＭＴＴ減少および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイによって決定した。

（ＭＴＴ色素減少アッセイ）
このＭＴＴアッセイは、細胞の通常の代謝状態（特に、早期の細胞酸化還元反応を反映する、ミトコンドリアの代謝状態）の感度の高い測定である。インキュベーションの後、細胞を、ＭＴＴ溶液（最終濃度、１ｍｇ／ｍｌ）で２時間、処理した。インタクトな細胞において形成される暗青色のホルマザン結晶を、ＤＭＳＯに溶かし、マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は、コントロール細胞の吸光度を１００％として、ＭＴＴ減少のパーセンテージ（％）で表されている。

（ＬＤＨ放出アッセイ）
このアッセイは、細胞溶解に起因する細胞外培地への可溶性細胞質ＬＤＨ酵素の漏れを測定する。ＰＣ１２細胞は、上で記述したＭＴＴアッセイと同じ濃度でプレートした。ＬＤＨの存在下で、ＮＡＤ^＋によるＬ−乳酸からピルビン酸への酸化をモニターすることにより、乳酸の量を測定した。その培養培地を、９６−ウェルプレートに移し、ピルビン酸基質溶液中の１ｍｇ／ｍｌ β−ＮＡＤ^＋と共に、３７℃で３０分間、インキュベートした。呈色試薬（２，４−ジニトロフェニルヒドラジン）と共に室温でさらに２０分間インキュベートした後、０．４ＮのＮａＯＨを加えて、反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度の変化を、分光光度マイクロプレートリーダーにより決定した。

（結果）
Ａβの細胞毒性は、最初、漸増濃度のＡβ_{２５−３５}と共に３６時間、ＰＣ１２細胞をインキュベートした後のＭＴＴ減少のパーセンテージ（％）決定によって、従来のＭＴＴにより評価した。Ａβ_{２５−３５}は、細胞の生存率を濃度依存的に減少させ、Ａβ_{２５−３５}の細胞毒性効果は、１ｍＭのＥＧＴにより抑制された（図６Ａ）。ＭＴＴ減少活性を、細胞死およびその後のＥＧＴによる保護と関連付けるために、細胞損傷を、ＥＧＴ存在下およびＥＧＴ非存在下での培地中へのＬＤＨ放出量により、定量的に評価した。ＥＧＴの細胞保護効果は、Ａβ_{２５−３５}処理したＰＣ１２細胞におけるＬＤＨ放出をＥＧＴが減少させる能力によって、検証された（図６Ｂ）。

（Ｂ．ＰＣ１２細胞におけるβ−アミロイド誘導性アポトーシスに対するＬ−エルゴチオネオインの効果）
（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ）（ＴＵＮＥＬ）手順）
市販のインサイチュ死検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＤＮＡ断片化の検出のために利用した。ＰＣ１２細胞（チェンバースライドにおいて５×１０^５細胞／１．５ｍｌ）を、１０％中性緩衝化ホルマリン溶液中に室温にて３０分間固定した。内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中０．３％（ｖ／ｖ）の過酸化水素とともに室温で３０分間インキュベートすることによって不活性化し、さらに透過化溶液（０．１％クエン酸ナトリウムおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の中で４℃で２分間、インキュベートした。この細胞を、ＴＵＮＥＬ反応混合物と共に、３７℃で６０分間インキュベーションし、その後、さらに３０分間、ペルオキシダーゼ結合体化抗フルオレセイン抗ヤギ抗体（Ｆａｂフラグメント）で標識することにより、その細胞を標識した。ジアミノベンジジンにより１０分間染色した後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、５０％グリセロールを用いて封入した。

（ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の測定）
ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を測定するために、親油性陽イオン性プローブであるＴＭＲＥを使用した。ＥＧＴの存在下またはＥＧＴの非存在下で、Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）で２４時間処理した後、細胞（４ウェルチェンバー中で１×１０^４細胞／１ｍｌ）を、ＰＢＳでリンスし、ＴＭＲＥ（１５０ｎＭ）をローディングした。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞を、共焦点顕微鏡（ＬＥＩＣＡ ＴＣＳ ＳＰ）下で調べた。ＴＭＲＥは、ミトコンドリア内で電位依存的な蓄積を示す。この蓄積は、４８８ｎｍでの蛍光励起および５９０ｎｍでの放出によって、検出可能であった。

（ウェスタンブロット分析）
処理後、細胞（１００φ皿中で１×１０^７細胞／７ｍｌ）を集め、ＰＢＳで洗った。遠心分離後、細胞溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ−４０， ０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５０ｍＭグリセロホスフェート，２０ｍＭ ＮａＦ，２０ｍＭ ＥＧＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４およびタンパク質分解酵素阻害剤）内で１５分間、強く浸透することによって、４℃にて行った。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上清を分離し、使用まで−７０℃で保存した。タンパク質濃度を、ビシンクリン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して決定した。サンプルローディング緩衝液を加えた後、タンパク質サンプルを、１２．５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。タンパク質を、ポリピリニデンジフルオライドブロットに、３００ｍＡで３時間トランスファーした。そのブロットを、室温で１時間、新しいブロッキング緩衝液（ｐＨ７．４で５％脱脂粉乳を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中にある、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックした。一次抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、抗Ｂｃｌ−Ｘ１抗体および抗Ｂａｘ抗体の希釈物（１：１０００）を、３％脱脂粉乳を含むＰＢＳ中で作成した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）での３回の洗浄の後、そのブロットを、３％脱脂粉乳を含むＰＢＳ中にある西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。そのブロットを、再び、ＰＢＳＴ緩衝液中で３度洗浄し、トランスファーされたタンパク質を、ＥＣＬ基質溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）とともに、製造業者の指示書に従って１分間インキュベートし、Ｘ線フィルムにより可視化した。

（結果）
２５μＭ Ａβで処理されたＰＣ１２細胞は、インサイチュにおいてＤＮＡ断片化を検出する、陽性末端標識（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）により決定した場合、アポトーシスを経験した。この組織学的分析において、強く染色された核の出現は、アポトーシス核に由来する断片化されたＤＮＡの３’末端への標識ｄＵＴＰの末端組み込みを示す。０．５ｍＭまたは、１ｍＭのＥＧＴは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を低下させた（図７Ａ）。核ＤＮＡ断片化に加えて、より最近、ミトコンドリアは、アポトーシスにおいて重要な段階であると認識されている。細胞死の古典的な徴候が明らかになる前に、ミトコンドリアは、膜完全性の大きな変化を経験する。これらの変化は、ミトコンドリア内膜および外膜の両方を含み、これは、膜貫通電位の散逸および／または透過性の変化を引き起こす。この透過性の変化により、外膜を通して可溶性膜間タンパク質が放出される。ＰＣ１２細胞がＡβ_{２５−３５}（２５μＭ）に曝露された場合、電位感受性色素であるＴＭＲＥを用いての赤色蛍光の減少により示されるように（図７Ｂ）、ミトコンドリア膜貫通電位（ΔΨｍ）は、急激に減少した。Ａβ_{２５−３５}誘導性ΔΨｍ散逸は、ＥＧＴの前処置により有意に遮断された（図７Ｂ）。Ａβ_{２５−３５}誘導性アポトーシス細胞死は、ＰＡＲＰの切断を調べることにより、確認された。ＰＡＲＰは、１１６ｋＤａの核タンパク質であり、活性カスパーゼ−３によって８５ｋＤａのアポトーシス断片へと特異的に切断される。２５μＭ Ａβ_{２５−３５}での処理は、ＰＡＲＰの切断を引き起こした。この切断は、ＥＧＴにより抑制された（図８Ａ）。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の発現もまた、調べた。プロ−アポトーシスＢａｘおよびアンチアポトーシスＢｃｌ−２の比は、細胞の生存／死を決定する分子加減抵抗器（ｒｈｅｏｓｔａｔ）と考えられている。ＰＣ１２細胞において、Ｂｃｌ−２はほとんど検出されないので、本発明者らは、代替として、構造的および機能的にＢｃｌ−２に類似するＢｃｌ−Ｘ_Ｌのレベルを測定した。図８Ｂに示されているように、Ａβ処理は、プロアポトーシスＢａｘの発現上昇を、アンチーアポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌのレベルにおける減少と同時に引き起こした。ＥＧＴ処理は、Ｂａｘ 対 Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ比を、大幅に低下させた。

（Ｃ．ＰＣ１２細胞におけるβ−アミロイド誘導性ニトロソ化損傷に対する、Ｌ−エルゴチオネオインの効果）
（細胞内過酸化亜硝酸形成の測定）
細胞内過酸化亜硝酸の形成をモニターするために、蛍光プローブＤＨＲ１２３を使用した。ＤＨＲ１２３は、親油性であり、細胞膜を通して容易に拡散する。ＤＨＲから蛍光ローダミンへの酸化の際に、２つの共有結合アミノ基のうち１つは、荷電イミノに互変異性化し、有効にローダミンを細胞内に捕捉する。ＤＨＲは、一酸化窒素（ＮＯ）により酸化されないが、過酸化亜硝酸は、有効にＤＨＲを酸化する。Ｌ−エルゴチオネオイン存在下または非存在下で、Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）で３６時間処理した後、細胞（４ウェルチェンバースライドにおいて１×１０^４細胞／１ｍｌ）を、生理食塩水Ａを用いてリンスし、５％ウシ胎仔血清を含む生理食塩水Ａ中の１０μＭ ＤＨＲをローディングした。３７℃で２０分間インキュベートした後、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ；２００ｍＷ）を備えている共焦点顕微鏡下で、細胞を調べた。Ａβ_{２５−３５}に応答した過酸化亜硝酸の産生を定量化するために、総過酸化亜硝酸の産生（基礎＋上昇）を、基礎過酸化亜硝酸の産生で除算した。蛍光強度における変化は、コントロールのパーセンテージとして表現されている。

（脂質過酸化の評価）
Ａβ_{２５−３５}処理されたＰＣ１２細胞における脂質過酸化の程度を、市販されている比色アッセイキットであるＢＩＯＸＹＴＥＣＨ ＬＰＯ−５８６（ＯＸＩＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して評価した。Ｌ−エルゴチオネオインの存在下または非存在下で５０μＭ Ａβ_{２５−３５}に３７℃で２時間曝露した後、ＰＣ１２細胞を、収集し、サンプルの酸化を防ぐために、０．５ｍＭブチル化ヒドロキシトルエンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。遠心分離後、３．２５容量の希釈Ｒ１試薬（アセトニトリル中１０．３ｍＭ Ｎ−メチル−２−フェニルインドール）を、この上清に加え、続いて優しくボルテックスして混合した。０．７５ｍｌの３７％（ｖ／ｖ）ＨＣｌの添加に続いて、混合液を、４５℃で６０分インキュベートした。冷まして遠心分離した後、５９０ｎｍにて、清澄な上清の吸光度を読み取った。そのタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して決定した。

（結果）
Ａβ誘導性細胞内過酸化亜硝酸の産生に対するＬ−エルゴチオネオインの効果を、過酸化亜硝酸により急激に蛍光ローダミンへと酸化されるＤＨＲ染色を使用して、測定した。２５μＭ Ａβ_{２５−３５}で処理されたＰＣ１２細胞は、ＤＨＲでの染色後、強烈な蛍光を示し、そして、Ｌ−エルゴチオネオインが培地中に存在している場合、Ａβ_{２５−３５}処理から生じる細胞内過酸化亜硝酸の形成は、有意に減少した（図９Ａ）。Ａβ_{２５−３５}は、活性窒素種（ＲＮＳ）の産生、および、ニューロン細胞のリン脂質二重膜の破壊を招く酸化還元感受性シグナルの調節を通して、ニトロソ化損傷を引き起こし得る。Ａβ_{２５−３５}処理されたＰＣ１２細胞は、脂質過酸化物のレベル上昇を引き起こす脂質二重膜の過酸化を経験した（図９Ｂ）。３０分間のＬ−エルゴチオネオインでの前処理は、濃度依存的な脂質過酸化の抑制を生じた（図９Ｂ）。さらに、Ｌ−エルゴチオネオインは、過酸化亜硝酸放出化合物であるＳＩＮ−１により誘導される細胞毒性に対し、選択的に保護した（図１０Ｂ）。一方、Ｌ−エルゴチオネオインは、ＮＯドナーであるＳＮＰを介した細胞死の減衰はしなかった（図１０Ａ）。このことは、Ｌ−エルゴチオネオインは、過酸化亜硝酸の有効なスカベンジャーであることを示す。

（Ｄ．βーアミロイド誘導性ＮＦ−κＢ活性化に対するＬ−エルゴチオネオイン効果の評価）
（核抽出物の調製）
Ａβ_{２５−３５}誘導ニトロソ化細胞死に対するＬ−エルゴチオネオイン保護効果の根底にある分子機構を探るために、ＮＦ−κＢの活性化を、コンセンサスκＢ結合エレメントを含むオリゴヌクレオチドを使用したＥＭＳＡによって、評価した。Ｌ−エルゴチオネオイン非存在下または存在下で１時間の２５μＭ Ａβ_{２５−３５}を用いた処理の後、ＰＣ１２細胞（直径１００φの皿において１×１０^７細胞／７ｍｌ）を、ＰＢＳで洗い、遠心分離し、氷冷等張緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ＫＣｌ，０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ））中に、再懸濁した。氷浴中で１０分間インキュベートした後、細胞を再び遠心分離し、そして氷冷２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），２０％グリセロール、４２０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ ＤＴＴおよび０．２ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液Ｃ中に再懸濁し、続いて０℃で２０分間インキュベートした。ボルテックスで混合した後、結果として生じる溶液を、遠心分離して、上清を、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合アッセイのために−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して決定した。

（ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性決定のための電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
ＮＦ−κＢ結合領域を含む合成二本鎖オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰにより標識し、ニックスピンカラム（Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｊｏｒｋｇａｔａｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するゲル濾過により組込まれていない［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰから分離した。放射線標識オリゴヌクレオチド（１００，０００ｃｐｍ）の添加前に、１０μｇの核抽出物を、ゲルシフト結合緩衝液（４％ グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．５）および０．１ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ）中で、氷上で１５分間保持した。ＤＮＡ−タンパク質複合体を、６％非変性ポリアクリルアミドゲルによって、２００Ｖにて２時間分離し、その後にてオートラジオグラフィーを行った。

（ｐ６５の免疫細胞化学）
免疫細胞化学のため、ＰＣ１２細胞（チェンバースライドにおいて１０^５細胞／８００μｌ）を、１０％の中性緩衝化ホルマリン溶液中に、室温にて３０分間固定した。その細胞を、新しいブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ中５．５％正常ヤギ血清）中において、室温で１時間ブロックした。１次抗ニトロチロシン抗体の希釈物（１：１００）を、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で生成した。ＴＢＳＴで３回洗った後、細胞を、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ中のＦＩＴＣ結合体化二次抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。細胞を、再びＴＢＳＴ緩衝液で３回洗い、核染色のため、ヨウ化プロピジウムと共に１０分間インキュベートした。細胞をＴＢＳでリンスし、共焦点顕微鏡下で調べた。

（統計的分析）
データは、平均±標準偏差として表現されており、単一の比較のための統計分析を、スチューデントｔ検定により実施した。統計的有意性の判定基準は、Ｐ＜０．０５であった。

（結果）
Ａβ_{２５−３５}でのＰＣ１２細胞の処理は、ＥＧＴ前処理により抑制されるＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合における一過性の上昇を、引き起こした（図１１Ａ）。Ａβ_{２５−３５}誘導性ＮＦ−κＢ活性化に対するＥＧＴの阻害効果をさらに確かめるために、本発明者らは、ＰＣ１２細胞におけるＮＦ−κＢの機能的活性サブユニットであるｐ６５の核移行を、抗ｐ６５抗体およびヨウ化プロピジウムを使用した免疫細胞学により、測定した（図１１Ｂ）。

ＰＣ１２細胞におけるβ−アミロイド誘導性損傷に対するＬ−エルゴチオネオインの神経保護効果を評価する際に、以下の結果が観察された。ニトロソ化ストレスを介するＰＣ１２細胞のＡβ誘導性アポトーシス死は、Ｌ−エルゴチオネオインでの処理により抑制された。従来のＭＴＴ減少アッセイによるＡβ誘導性細胞毒性を、この評価において使用した。Ａβは、ＰＣ１２細胞におけるＭＴＴ減少の低下を引き起こし、これは、ＥＧＴの存在下で一部回復された。Ａβ_{２５−３５}誘導性細胞毒性に対するＬ−エルゴチオネオインの保護効果を、ＬＤＨ放出アッセイを使用して確認した。

さらに、Ｌ−エルゴチオネオインで前処理された細胞におけるＤＨＲ蛍光染色の分布の減少により明らかにされたように、Ａβ誘導性細胞内過酸化亜硝酸の形成は、Ｌ−エルゴチオネオインにより弱められた。さらに、ＥＧＴは、ＳＩＮ−１依存性細胞死の濃度依存的な保護を示したが、ＳＮＰ媒介性細胞毒性に対して保護を示さなかった。これは、Ｌ−エルゴチオネオインは、過酸化亜硝酸の強力なスカベンジャーであることを示唆している。ＳＩＮ−１は、超酸化物および一酸化窒素の連続的な放出、ならびにそれらの拡散律速反応を通して、過酸化亜硝酸を産生するだけである。従って、Ｌ−エルゴチオネオインが神経保護効果を示す一手段は、過酸化亜硝酸の産生に対する阻害効果によるものであり得る。

さらに、Ａβ_{２５−３５}処理は、ミトコンドリア膜電位の減損、アンチアポトーシスＢｃｌ−Ｘ_Ｌ／プロアポトーシスＢａｘ比の減少、およびＰＡＲＰの切断を引き起こした。Ｌ−エルゴチオネオインでの細胞の前処理は、Ａβ誘導性アポトーシスと関連するこれらの生化学的変化を弱めた。

Ａβ_{２５−３５}処理はまた、ＰＣ１２細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を引き起こす。これは、Ｌ−エルゴチオネオイン前処置により弱められ得る。Ｌ−エルゴチオネオインの神経保護効果について提唱される機構が、図１２で示されている。

（実施例３：６−ＯＨＤＡモデルにおけるＬ−エルゴチオネオインの神経保護効果の評価）
開始体重が２２５±２５ｇである雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、食物と水への自由なアクセス、制御された温度（２１℃±１℃）、１２時間の明／暗サイクル（０７．００時間の光）の下で、３つの群で収容した。すべての科学的手順は、英国内務省の承認を受けて行った。ラットに、７０ｍｇ／ｋｇのエルゴチオネオインまたはビヒクル（滅菌蒸留水）を４日間毎日、チューブによって投与した（１群当たりｎ＝６）。４日目、Ｌ−エルゴチオネオインまたはビヒクルの投与の１時間後、ラットに、小動物Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）（０．０４ｍｌ／ラット、筋肉内）で麻酔し、さらに６−ＯＨＤＡ（０．１％アスコルビン酸／生理食塩水４μｌ中に５μｇ溶かした）を、前脳線維束の中央（定位的な座標：ブレグマから２．２ｍｍ前方、＋１．５側方および、切歯稜の５ｍｍ下の耳稜と硬膜へ−７．９腹側（Ｄａｔｌａら（２００１）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ １２：３８７１（これはその全体が参考として本明細書中に援用される））に注射した。６−ＯＨＤＡ損傷の１週間後、ラットを、頚椎脱臼により屠殺し、直ぐに脳を解剖した。冠状切片を、視床下部および前脳のレベルで作製し、後脳部分を分離した。後脳を、７日間、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、それから３０％スクロース溶液中で２〜３日間低温保護し、Ｄａｌｔａら（２００１）（前出）によって記述されたように、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫染色に使用した。簡単に述べると、ＴＨは、ポリクローナルウサギ抗ＴＨ（１：３０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｕ．Ｋ．）と共に、２０μｍの固定された冠状浮動性切片をインキュベートし、その後、ビオチン化抗ウサギＩｇＧとアビジン／ビオチン化合物（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ，Ｕ．Ｋ．）とともにインキュベートすることによって、免疫染色した。ＴＨ免疫複合体を、それから、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＨ_２Ｏ_２により可視化した。ＴＨ陽性細胞（ＴＨ＋細胞）の画像を、Ｘｉｌｌｉｘ ＣＣＤデジタルカメラによりキャプチャーし、自動的に数えた（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｐｌｕｓ，Ｄａｔａｃｅｌｌ，Ｕ．Ｋ．）。コントロール側の黒質におけるＴＨ＋細胞の数を、５つの異なるレベルにおいて細胞を平均化することによって、損傷をうけた側と比較した（Ｄａｔｌａら（２００１）前出）。前脳から、損傷した線条体およびコントロール線条体を切り離し、ＨＰＬＣ−電気化学的検出により、ＤＡと、その代謝産物であるＤＯＰＡＣおよびＨＶＡについて、分析した（Ｄａｔｌａら（２００１）前出）。

（結果）
Ｌ−エルゴチオネオインの経口投与および６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の注射の２８日後、６−ＯＨＤＡ損傷ＰＤモデルにおける黒質−線条体のドーパミン作動性経路の完全性および機能性を、評価した。黒質におけるドーパミン作動性細胞の数は、チロシンヒドロキシラーゼについての免疫染色、および、線条体におけるドーパミンレベルをＨＰＬＣにより測定することによって、決定した。

ビヒクル処理された群およびＬ−エルゴチオネオイン処理された群の両方の脳のコントロール側におけるＴＨ＋細胞の数は、匹敵した。ＴＨ＋細胞に対する損傷およびＬ−エルゴチオネオイン処理の全体的な効果は、被験因子内および被験因子間のＬ−エルゴチオネオイン処理として、損傷とともにＡＮＯＶＡにより分析した。損傷の有意な効果（データ＜０．００１）および損傷によるＬ−エルゴチオネオインの有意な効果（データｐ＜０．０１）が存在した。ビヒクル処理群およびＬ−エルゴチオネオイン処理群の両方において、スチューデントｔ検定による個々の群の比較は、損傷が有意にＴＨ＋細胞を減少させたことを示した。（Ｐ＜０．００５；両側スチューデントｔ検定）。しかし、ビヒクル処理群でのＴＨ＋細胞の数における減少（６３％減少）は、Ｌ−エルゴチオネオイン処理群（４６％減少）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０００５；片側スチューデントｔ検定）。従って、Ｌ−エルゴチオネオインは、コントロールに対して、神経保護という点において有意な改善（およそ２０％）を示した。

図１は、Ｌ−エルゴチオネオインの構造を示す。 図２は、左目に片側ＮＭＤＡ注射を受けた動物の右網膜（Ａ）、および左網膜（Ｂ）のＡＰＰ免疫反応性を示す顕微鏡写真である。ＡＰＰ免疫染色の減少が、ＮＭＤＡ注射した網膜の神経節細胞層において観察可能なことに、注目されたい。ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＮＬ：内核層；ＯＮＬ：外核層。目盛り棒：１００μｍ。 図３は、左目に片側ＮＭＤＡ注射を受けた動物の右網膜（Ａ）、および左網膜（Ｂ）におけるＧＦＡＰ免疫反応性を示す顕微鏡写真である。網膜切片は、クレシルバイオレットで軽く対比染色された。ＮＭＤＡ注射した網膜の硝子体表面に主に位置する星状細胞（矢印）において、ＧＦＡＰ免疫染色の減少が観察可能なことに注目されたい。略語は、図２の説明文と同じ。目盛り棒：１００μｍ。 図４は、左目に片側硝子体内ＮＭＤＡ注射を受け、そして腹腔内にＬ−エルゴチオネオインの注射を受けた動物（Ａ，Ｂ）、または腹腔内にＰＢＳの注射を受けた動物（Ｃ）からの、クレシルバイオレットで染色された網膜全封入物（ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ）における網膜神経節細胞層中の細胞を示す顕微鏡写真である。ＡおよびＢは、Ｌ−エルゴチオネオイン処理された動物の右網膜（Ａ）および左網膜（Ｂ）であり、ＣはＰＢＳで処理されたラットの左網膜である。ＢおよびＣにおける網膜神経節細胞層のニューロンの有意な損失、およびＢに比べてＣにおいて網膜は非健康的であることに注目されたい。目盛り棒：１００μｍ。 図５は、ＮＭＤＡ処理の効果およびＬ−エルゴチオネオインによるその保護を示すグラフである。数えたニューロンは、細胞体の直径が６μｍより小さいもの、または６μｍ以上のものの２つの群に分けられた。７６μｍより大きなニューロンの大多数は、網膜神経節細胞である。より小さな細胞体をもつニューロンは、主に非神経節細胞または、置換アマクリン細胞である（^＊ＰＢＳと比較して、＝ｐ＜０．００１）。 図６は、ＰＣ１２細胞におけるＡβ_{２５−３５}誘導性細胞毒性に対するＥＧＴの保護効果を示す。Ａ．ＰＣ１２細胞は、１ｍＭ ＥＧＴの非存在下（塗りつぶした円）または存在下（中抜きの円）で、示した量のＡβ_{２５−３５}で、３７℃で３６時間、処理された。ＭＴＴ減少アッセイを使用して、生細胞が決定された。ＥＧＴは、Ａβ_{２５−３５}処理の３０分前に培地に加えられた。Ｂ．示された濃度のＥＧＴの非存在下または存在下での２５μＭ Ａβ_{２５−３５}処理後のＬＤＨ放出による、ＰＣ１２細胞の生存度の決定。値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。群間で、有意な差があった（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。 図７は、Ａβ_{２５−３５}誘導性細胞アポトーシスに対するＥＧＴの保護効果を示す。Ａ．ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニックおよび標識（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）（ＴＵＮＥＬ）に対するエルゴチオネオインの効果。ａ，処理なし、ｂ，２５μＭのＡβ_{２５−３５}に３６時間曝露したＰＣ１２細胞；ｃ，Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）＋ＥＧＴ（０．５ｍＭ）；ｄ，Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）＋ＥＧＴ（１ｍＭ）。群間で、有意な差があった（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。Ｂ．ミトコンドリア膜電位に対するＥＧＴの効果。上記の（材料および方法）に記載されるように、ΔΨｍは、ＴＭＲＥ蛍光で評価された。ａ，処理なし、ｂ，２５μＭのＡβ_{２５−３５}に３６時間曝露したＰＣ１２細胞；ｃ，Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）＋ＥＧＴ（０．５ｍＭ）；ｄ，Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）＋ＥＧＴ（１ｍＭ）。 図８は、Ａβ_{２５−３５}誘導性アポトーシスシグナル経路に対するＥＧＴの効果を示す。ＰＣ１２細胞は、示した濃度のＥＧＴ存在下または非存在下で、２５μＭのＡβ_{２５−３５}と３６時間インキュベートされ、ウェスタンブロット分析のために収集された。Ａ．抗ＰＡＲＰ抗体の使用により決定したように、ＥＧＴは、Ａβ_{２５−３５}により誘導されるＰＡＲＰの切断を減弱させた（上図）。同量のタンパク質ローディングを確かめるために、アクチンレベルが測定された（下図）。Ｂ．Ｂａｘ（上図）およびＢｃｌ−Ｘ_Ｌ（下図）のレベルに対するＥＧＴの効果。群間で、有意な差があった（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。 図９は、Ａβ２５−３５誘導性過酸化亜硝酸形成および過酸化脂質形成に対するＥＧＴの効果。Ａ．左図：Ａβ_{２５−３５}単独にかまたはＥＧＴとの組み合わせに曝露した、ＰＣ１２細胞におけるＤＨＲ由来の蛍光の代表的な共焦点顕微鏡写真。照明および画像獲得条件は、（材料および方法）において示されている。右図：ＥＧＴ非存在下またはＥＧＴ存在下における、Ａβ_{２５−３５}で処理した後のＤＨＲ蛍光の強度の定量的分析。Ｂ．ＰＣ１２細胞における脂質過酸化に対するＥＧＴの効果。ＰＣ１２細胞は、示した濃度のＥＧＴ存在下または非存在下で、２５μＭのＡβ_{２５−３５}に３６時間、曝露した。脂質過酸化は、形成したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベル測定により決定された。未処理のコントロール細胞におけるＭＤＡの平均量は、２．０１ｎｍｏｌｅ／ｍｇタンパク質であった。群間で、有意な差があった（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。 図１０は、ＮＯ放出化合物であるＳＮＰ（Ａ）、および過酸化亜硝酸産生ＳＩＮ−１（Ｂ）によって誘導される細胞死に対する、ＥＧＴの効果を示す。ＥＧＴは、ＳＩＮ−１媒介性細胞死の濃度依存的な保護を発揮したが、ＳＮＰによる細胞死には、保護を発揮しなかった。生細胞は、ＭＴＴ減少アッセイにより決定された。値は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。群間で、有意な差があった（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。 Ａ．Ａβ_{２５−３５}誘導性ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性に対するＥＧＴの阻害効果を示す。種々の濃度のＥＧＴ非存在下または存在下において、１時間Ａβ_{２５−３５}で処理したＰＣ１２細胞からの核抽出物が、ＥＭＳＡに供された。レーン１、ＤＭＳＯコントロール；レーン２、Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）単独；レーン３、Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）＋ＥＧＴ（０．５ｍＭ）；レーン４、Ａβ_{２５−３５}（２５μＭ）＋ＥＧＴ（１ｍＭ）。Ｂ．ｐ６５のＡβ_{２５−３５}誘導性核移行に対するＥＧＴの阻害効果。１時間Ａβ_{２５−３５}で処理したＰＣ１２細胞が、中性緩衝化１０％ホルマリン溶液で固定され、（材料および方法）で説明するように、抗ｐ６５抗体免疫化学と共にインキュベートされた。 図１２Ａは、Ａβが誘導するニトロソ化細胞死に対するＥＧＴの保護効果について提唱される分子機構を示す。

Claims (40)

1. 哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）細胞を損傷から保護する方法であって、治療上有効な量のＬ−エルゴチオネオインを、その必要がある哺乳動物に投与する工程
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記ＣＮＳ細胞は、ニューロン細胞である、方法。
3. 請求項２に記載の方法であって、前記ニューロン細胞が、神経節細胞および非神経節細胞である、方法。
4. 請求項２に記載の方法であって、前記ニューロン細胞が、１種類以上のコリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびＧＡＢＡ作動性ニューロンである、方法。
5. 請求項２に記載の方法であって、前記ニューロン細胞が、ドーパミン作動性ニューロンである、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記ドーパミン作動性ニューロンが、黒質のチロシンヒドロキシナーゼ陽性（ＴＨ＋）細胞である、方法。
7. 請求項１に記載の方法であって、前記損傷が、酸化剤への曝露から生じる、方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記酸化剤が、一重項酸素、過酸化水素、酸化窒素、次亜塩素酸、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、および金属酵素からなる群から選択される、方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、前記損傷が、サイトカインへの曝露から生じる、方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記サイトカインが、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）またはγインターフェロンである、方法。
11. 請求項１の方法であって、前記損傷は、神経毒性化合物への曝露から生じる、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記神経毒性化合物が、グルタミン酸、グルタミン酸アナログ、および抗癌化合物からなる群から選択される、方法。
13. 請求項１に記載の方法であって、前記損傷が、神経変性疾患の存在から生じる、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、多発性硬化症、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、外傷性脳損傷、急性脊髄損傷および慢性脊髄損傷、黄斑変性、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、視神経障害および網膜症からなる群から選択される、方法。
15. 請求項１に記載の方法であって、前記哺乳動物が、ヒトである、方法。
16. 請求項目１に記載の方法であって、前記Ｌ−エルゴチオネオインが、栄養補助食品として投与される、方法。
17. 請求項１６に記載の方法であって、前記栄養補助食品が、経口カプセル、錠剤、または懸濁液の形態をとる、方法。
18. 請求項１に記載の方法であって、Ｌ−エルゴチオネオインが、第２の抗酸化剤と組み合わせて投与される、方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、前記第２の抗酸化剤が、ビタミンＣまたはビタミンＥである、方法。
20. 請求項１に記載の方法であって、Ｌ−エルゴチオネオインが、ニューロン細胞の保護を補助する物質と組み合わせて、または細胞増殖および／もしくは組織の再生および／もしくは髄鞘形成を補助する物質と組み合わせて、投与される、方法。
21. 請求項２０の方法であって、前記ニューロン細胞の保護を補助する物質、または前記細胞増殖および／もしくは組織の再生および／もしくは髄鞘形成を補助する物質が、小さな合成有機化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および抗体からなる群から選択される、方法。
22. 請求項２０に記載の方法であって、前記物質が、コエンザイムＱ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ピルビン酸、メラトニン、ナイアシンアミド、アセチルシステイン、ＧＳＨ、およびニトロンからなる群から選択されるＲＯＳスカベンジャーである、方法。
23. 請求項２０に記載の方法であって、前記物質が、神経栄養因子、レセプタープロテインキナーゼに結合して該レセプタープロテインキナーゼを活性化するリガンド、インテグリンレセプターのアゴニストリガンド、レセプター模倣物、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーおよび髄鞘形成抗体からなる群から選択される、方法。
24. 神経変性疾患からの哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）細胞への損傷を、処置または改善する方法であって、治療上有効な量のＬ−エルゴチオネオインを、その必要がある哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
25. 請求項２４に記載の方法であって、Ｌ−エルゴチオネオインの投与が、長期にわたる、方法。
26. 請求項２４に記載の方法であって、前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、多発性硬化症、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、外傷性脳損傷、急性脊髄損傷または慢性脊髄損傷、黄斑変性、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、視神経障害および網膜症からなる群から選択される、方法。
27. 請求項２４に記載の方法であって、前記ＣＮＳが、ニューロン細胞である、方法。
28. 請求項２７に記載の方法であって、前記ニューロン細胞が、神経節細胞および非神経節細胞である、方法。
29. 請求項２７に記載の方法であって、前記ニューロン細胞が、１種類以上のコリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびＧＡＢＡ作動性ニューロンである、方法。
30. 請求項２７に記載の方法であって、前記ニューロン細胞が、ドーパミン作動性ニューロンである、方法。
31. 請求項３０に記載の方法であって、前記ドーパミン作動性ニューロンが、黒質のチロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋）細胞である、方法。
32. 中枢神経系（ＣＮＳ）細胞を損傷から保護可能な化合物を同定するスクリーニング法であって、
    （ａ）網膜ニューロンを、試験化合物での処理と共にかまたは試験化合物での処理なしで、神経毒性因子で処理する工程；および
    （ｂ）網膜ニューロン集団に対する該試験化合物の効果を決定する工程であって、細胞生存を増加可能な試験化合物を、神経保護因子として同定する工程、
    を包含する、
    方法。
33. 中枢神経系（ＣＮＳ）細胞を損傷から保護可能な化合物を同定するためのスクリーニング法であって、
    （ａ）ドーパミン作動性ニューロンを、試験化合物での処理と共にかまたは試験化合物の処理なしで、６−ＯＨＡで処理する工程；および
    （ｂ）ドーパミン作動性ニューロン集団に対する該試験化合物の効果を決定する工程であって、細胞生存を増加な試験化合物を、神経保護因子として同定する工程、
    を包含する、
    方法。
34. 請求項１に記載の方法であって、前記投与が経口投与によるか、または硝子体内注射、筋内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、脳室内注射、もしくは頭蓋内注射による、方法。
35. 薬学的組成物であって、治療上有効な量のＬ−エルゴチオネオインおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
36. 請求項３５に記載の薬学的組成物は、治療上有効な量の、ニューロン細胞の保護を補助する物質、または細胞増殖および／もしくは組織再生および／もしくは髄鞘形成を補助する物質をさらに含む、組成物。
37. 請求項３６に記載の薬学的組成物であって、前記物質が、小さな合成有機化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および抗体からなる群から選択される、組成物。
38. 請求項３７に記載の薬学的組成物であって、前記物質が、活性酸素種（ＲＯＳ）スカベンジャーまたは活性窒素種（ＲＮＳ）スカベンジャーである、組成物。
39. 請求項３８に記載の薬学的組成物であって、前記ＲＯＳスカベンジャーが、コエンザイムＱ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ピルビン酸、メラトニン、ナイアシンアミド、Ｎ−アセチルシステイン、ＧＳＨ、およびニトロンからなる群から選択される、組成物。
40. 請求項３７に記載の薬学的組成物であって、前記物質が、神経栄養因子、レセプタープロテインキナーゼに結合して該レセプタープロテインキナーゼを活性化するリガンド、インテグリンレセプターのアゴニストリガンド、レセプター模倣物、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーおよび髄鞘形成抗体からなる群から選択される、組成物。

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