KR20230118112A - 알츠하이머병의 치료를 위한 다중 표적 치료제로서 나프탈렌 유도체의 약학적 조성물 - Google Patents

알츠하이머병의 치료를 위한 다중 표적 치료제로서 나프탈렌 유도체의 약학적 조성물 Download PDF

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로베르토 메넨더즈 소토 델 발레
알베토 벤코모 마르티네즈
소치틸 리베라 마레로
로라 가르시아 푸포
레오노라 곤잘레즈 메사
사밀리아 리온 차비아노
아드리아나 아길라 코르도바
캐슬린 카스트로-팔로미노 안텔라
지젤 펜톤 롤
로라 오타노 타마요
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마젤 세르반테스 라노스
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Abstract

본 발명은 약물 화학에 대한 것이고, 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)에서 영향 받는 콜린성, 글루탐산성 및 미토콘드리아 시스템에 대해 다중 표적 작용을 나타내는 화합물의 약학적 조성물에 관한 것으로, 그것의 화학식 I은,

여기서, 치환기 R1 및 R2는 상세한 설명 및 청구항에서 설명된다.
이 화합물의 제제는 경구, 설하, 비경구, 경피 및 비강 투여를 통해 효율성 및 포용력을 증가시킨다. 그것들은 그 자체로, 현재 AD에 대해 쓰이는 다중 치료법을 대체하여 단일 치료법으로 쓰일 수 있다.
AD 치료를 위한 활성 성분으로서 이 화합물, 그것의 염, 수화물, 거울상 이성질체, 이성질체, 대사체, 프로드럭의 인간 투여를 위한 제제는 생동성, 활성 성분의 체류 시간 및 적절한 배출을 증가시켜, 그것이 치료에 대한 효율성, 생물안전성, 치료 충실성(adherence) 및 수용도를 증가시킨다.

Description

알츠하이머병의 치료를 위한 다중 표적 치료제로서 나프탈렌 유도체의 약학적 조성물
본 발명은 약물 화학에 대한 것이고, 화학식 1의 화합물의 약학적 조성물에 대한 것인데, 그것은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)에 의해 영향받는 콜린성, 글루탐산성 및 미토콘드리아 시스템의 서로 다른 기전에 다중-표적 작용을 나타낸다. 이 화합물의 제제는 그것의 경구, 설하, 비경구, 경피 및 비강 투여를 통한 효율성과 수용력이 증가된다.
본 발명은 특히 AD의 치료를 위한 활성 성분 또는 주요 성분으로서 여겨지는 화학식 1의 화합물, 그것들의 염, 수화물, 거울상 이성질체, 이성질체, 대사체, 및 프로드럭의 인간 투여를 위한 효율적인 제제를 제공하는 데 특히 유용하다.
세계 인구의 기대 수명의 증가와 함께, 주로 노인성 치매와 연관된 신경 퇴행성 질병이 증가해왔다. 특히, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)이 60세가 넘는 연령층의 인구에서 높은 발병율을 가진다(50%~60% 사이). 이 질병은 기억 상실 사건, 지남력 상실(disorientation), 실행 및 인지 기능 장애, 환각, 우울 및 불안의 발생을 특징으로 하는 진행성 치매로 이어진다.
현재, 복잡한 병인론의 이 질병을 일으키는 정확한 기전은 여전히 논쟁 중이다. 실험적 증거에 따르면, 아밀로이드 캐스케이드 가설 및 타우 단백질의 인산화 가설이 그것의 기원에서 중요한 역할을 한다 (Hardy JA, et al. in Science, 1992; 256: 184-5; Haass C. et al. in Cold Spring Harb Perspect Med. 2012; 2: a006270; Mucke L et al. in Cold Spring Harb Perspect Med. 2012; 2: a006338). 그러나, 미토콘드리아 활성의 변형, 신경 염증 가설 및 대사의 역할에 대한 가설(콜레스테롤 및 인슐린과 관련된) 및 수지상 세포 가설과 같이 과학적 발견에 기반한 다른 대안적인 가설들도 있다 (Castello MA et al. in Aging Res Rev. 2013; 12: 282-8; Castello MA et al. in Aging Res Rev. 2014; 13: 10-2; Drachman DA. in Alzheimers Dement 2014; 10: 372-80; Ferreira ST et al. in Alzheimers Dement 2014; 10 (1 Suppl): S76-83; De Felice FG, et al. in Diabetes 2014; 63: 2262-72; De Felice FG in J Clin Invest. 2013; 123: 531-9; Cochran JN et al. in Brain Res Bull. 2014; 103: 18-28).
일반적으로, AD의 신경병리는 그 자체로 염증 면역 반응으로 나타나는데, 그것이 두뇌에서의 타고난 그리고 적응된 면역 시스템의 활성화와 연관되고, 그것이 베타 아밀로이드 펩타이드(βA) 및 타우 단백질의 응집과 관련된 신경화학적 캐스케이드로 이어진다. 아밀로이드 섬유 또는 플라크의 존재가 순차적으로 보체, 소교세포, 사이토카인(케모카인) 분비 활성을 일으키고, 마지막으로 신경 독성을 퍼뜨린다 (Reitz C. in International Journal of Alzheimer's disease. 2012 Jan; 2012: 369808; Rodrigue K. in Neuropsychol Rev. 2009 December; 19 (4): 436-450. Doi: 10.1007 / s11065-009-9118-x; Bateman, RJ et al. In Alzheimer's disease. N. Engl. J Med. 367, 795-804, 2012; Karran, E., et al. in Nat. Rev. Drug Discov. 10, 698-712, 2011). 한편, Science (2016, doi: 10.1126 / science.aad8373)에서 홍소연(Soyon Hong) 등은 βA가 침착되기 전에 보체와 소교세포에 의해, 특히 C1q 단백질의 증가에 의해 매개되는 이른 시냅스 손실이 있는 무증상 AD의 초기 단계를 설명했다. 또한, βA 펩타이드 공격의 초기 단계에서 그펩타이드의 참여가 C1q의 과발현에 결정적이다. 뇌 안의 면역 반응과 같은 만성 염증이 많은 퇴행성 질병에서의 진행성 신경 괴사에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 침투된 대식구와 단핵구로 이루어진 식세포 시스템이 기존에 있는 소교세포에 달라붙어, 종양 괴사 인자 α(TNF α), 인터루킨 1(IL1)과 같은 과량의 사이토카인 뿐 아니라 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 질소종(RNS)를 생산하는데, 그것들이 AD에 관여한다. 주어진 자극에 대한 이러한 반응 세트가 국소화된 아교세포에 의해 지지되는 공격의 악순환을 촉진하고, 그것이 뉴런을 비가역적으로 망가뜨리는 식세포 공격을 유발한다(Malm TM, in Neurotherapeutics 2015, 12: 81-93; ElAli A. et al. in Brain, Behavior, and Immunity, 2015, doi: 10.1016 / j.bbi.2015.07.021; Michaud J.-P. et al., in Neuron, 85, 4, 450-2, 2015).
미토콘드리아 기능장애는 AD 병태생리학에서 초기 사건으로 설명되는데, AD 환자 및 형질전환 마우스에서 βA 침착 및 기억력 감퇴 전에 나타난다 (Maurer, I., et al. in Neurobiol. Aging 2000, 21, 455-462; Caspersen, C. et al. in FASEB J. 2005, 19, 2040-2041; Mosconi, L et al. in Ann. NY Acad. Sci. 2008, 1147, 180-195). AD 발병 동안, βA 올리고머가 미토콘드리아에 쌓여 에너지 대사를 망가뜨리게 되고, 산화 스트레스(oxidative stress, OS) 및 아포토시스를 증가시킨다(Lustbader, et al. in Science 2004, 304, 448 -0452; Caspersen, C. et al. In FASEB J. 2005, 19, 2040-2041; Manczak, et al. in Hum. Mol. Genet. 2006, 15, 1437-1449). AD 환자 및 형질전환 마우스에서 수행된 연구에서, 크렙스 회로(tricarboxylic acid cycle)의 효소 및 사이토크롬 C 산화효소의 활성이 지속적으로 감소됨이 보고되었다 (Yates, et al. in J. Neurochem 1990, 55, 1624-1630; Maurer, I., et al. in Neurobiol Aging 2000, 21, 455-462; Caspersen, C. et al. in FASEB J. 2005, 19, 2040-2041; Leuner, et al. in Mol. Neurobiol. 2012, 46, 186-193). 형질전환 마우스의 뇌로부터 분리된 미토콘드리아와 βA 올리고머에 노출된 분리된 미토콘드리아에서의 유사한 점으로 OS의 증가가 발견되었고, AD 생리에서 핵심 요소이다 (Casley, et al., in Neurobiol. Dis. 2002a. 10, 258-267; Aleardi, AM, et al., in J. Bioenerg. Biomembr. 2005, 37, 207-225; Caspersen, C. et al. in FASEB J. 2005, 19, 2040-2041; Clementi, ME et al. in FEBS Lett. 2005, 579, 2913-2918; Leuner, et al. in Mol. Neurobiol. 2012, 46, 186-193; Smith, MA, et al. in Nature 1996, 382, 120-121; Leuner, et al. in Mol. Neurobiol. 2012, 46, 186-193).
미토콘드리아 기능장애의 가능성 있는 기전은 미토콘드리아 투과 전이공(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)이 열리는 것과 관련되는데, 그것은 Ca2+ 및 OS 과부하에 의해 촉발될 수 있고(Kroemer, G. and Reed, JC in Nat. Med. 2000, 6, 513-519) 그것이 mPTP의 형성에 기여하는 프로아포틱 단백질 백스(Bax)와 같은 전-아포토시스 인자의 분비를 유도한다 (Jurgensmeier, JM, et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 4997-5002; March, I., et al. in Science 1998, 281, 2027-2031; Narita, M., et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 14681-14686). 결과적으로, 사이토크롬 c가 아포토시스 프로테아제 활성 인자(apoptosis protease activating factor, APAf-1)에 결합함으로써 분비되고 그것이 아포토시스를 촉진시키며, "아포토좀"이라 알려진 복합체를 형성한다 (Liu, X., et al. in Cell 1996, 86, 147-157; Yang, J., et al. in Science 1997, 275, 1129-1132).
또한, βA와 관련된 미토콘드리아 바이오에너지 기능장애가 글루탐산성 흥분독성을 촉진하고 그럼으로써 세포 사멸을 시킨다고 알려져 있다. 세포 에너지 저장을 줄임으로써, 세포질막 전위가 영향을 받고, 그것이 N-메틸-D-아스파르트산염(NMDA) 수용체의 Mg2+ 차단을 제거한다. 이것이 내재 글루탐산에 의한 지속적인 활성화를 가능하게 하고 세포로의 Ca2+ 이온의 유입을 증가하도록 해서 그것이 AD의 특징인 기억력 문제와 관련된 사건인 뉴런에서 흥분독성을 일으키는 것으로 여겨진다 (Zadori D. in Journal of Alzheimer's Disease, 2018, 62, 523-547). 이러한 가설을 뒷받침하는 것은 글루탐산 길항제가 미토콘드리아 독소 유도 신경 사멸을 줄인다는 증명된 사실이다. 이것과 다른 후속 증거들은 전자 전달 사슬에서 및/또는 글루탐산 수용체의 활성과 연관되는 세포 내 경로에서 생성되는 ROS가 뉴런의 퇴화의 원인일 수 있다고 암시한다 (Villegas S. in Medicina Clnica, 2015, 145, 2, 76-83).
AD의 신경 병리의 복잡성은 그것이 다중 인자 질병이라는 것을 가리키지만, 치료의 관점에서 그것은 지금까지 접근되지 않은 길이다.
규제 당국에 의해 승인된 오직 4개의 약이 있다. 이것들은 2개의 모둠에 속한다: 아세틸콜린 에스테라제 억제제(acetylcholinesterase inhibitors, AChEI) 및 N-메틸-D-아스파르트산 수용체 길항제(NMDAr) (Chiang K et al. in Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2014; 54: 381- 405; Francis PT et al. in Trends Pharmacol Sci. 2005; 26: 104-11; Huang Y. et al. In Cell. 2012; 148: 1204-22.)
AChEI은 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine) 및 갈란타민(galantamine)이다. 그것의 작용 기전은 시냅스 틈에서 아세틸콜린에스테라제를 억제함으로써 콜린성 전달을 증가시키고, 그리하여 그것들이 AD 환자의 인지 능력을 향상시킬 수 있게 하는 것이다. AChEI는 정제, 캡슐 및 용액과 같은 즉시 방출 형태뿐 아니라, 경구 투여를 위한 조절 방출 형태 등을 포함하는 다양한 제제로 이용가능하다 (Villegas S. in Medicina Clnica, 2015, 145, 2, 76-83). 그러나, 이러한 AChEI는 이 약물들이 안전성과 수용성에 대해 그것의 최대 용량으로 투여되었을 때조차, 일부 환자에 대해 오직 약한 임상적 이익을 줄 뿐이다. 또한, 이 화합물들은 식욕부진, 오심, 구토, 설사, 복통 및 체중 감소를 포함하는 부작용을 일으킨다 (in Physicians Desk Reference 2008, Thomson PDR et al. in Clinical Geriatrics: Volume 2011, 19, 1; Ali T. et al. in PLOS ONE, 2015, 7, 1-10; Tsoi KKF in JAMDA, 1-7, 2015, doi: 10.1016 / j.jamda.2015.08.007).
한편, NMDAr은 신경 시냅스 가소성 및 기억에서 핵심적인 성분으로 작용하는 신경 전달물질인 글루탐산에 대한 이온수용(ionotropic) 수용체이다. 이 수용체의 길항제인 메만틴(memantine)은 중등도 내지 중증 AD에 대해 지시된 신경 보호 효과를 위해 임상 현장에서 사용된다(National Institute for Clinical Excellence. Technology appraisal guidance 217. Donepezil, galantamine, rivastigmine and memantine for the treatment of Alzheimer's disease at www.nice.org.uk/guidance/TA217; O'Brien JT, et al. in J Psychopharmacol Oxf Engl. 2011; 25: 997-1019; Francis PT et al. in Trends Pharmacol Sci. 2005; 26: 104-11; Huang Y et al. in Cell. 2012; 148: 1204-22). 메만틴의 부작용을 줄이기 위해서, 조절 방출 제제가 개발되어 왔고, 그것은 2상의 시간대에 약물이 방출되도록 하거나(US 5,382,601), 및/또는 하루 1번 용량으로 투여된다(US 2006/0051416). 그러나, 이 치료 또한 이 질병의 진행을 막지 못하고, 일부 단계 동안에만 이로운 효과를 가지며, 그 효과도 환자에 따라 변이가 크다.
현재, 이 질병에 대한 효과적인 치료법이 없기 때문에, 이 복잡한 병인론의 다른 표적을 찾는 것을 목표로 하는 다음과 같은 다른 치료 전략의 개발을 정당화한다:
· ACh 수용체 길항제 (Home-ClinicalTrials.gov [2016.3.21 접속]. 다음 주소에서 접속가능: http://www.cli-nicaltrials.gov/. Zawieja P, et al. in Geriatr Gerontol. Int. 2012; 12: 365 -71 Frolich L, et al. in J Alzheimers Dis. 2011; 24: 363-74
· βA 응집 억제제 (Aisen PS, et al. In Arch Med Sci. 2011; 7: 102-11. Caltagirone C, et al. in Alzheimers Dis. 2010; 20: 509-16. Salloway S, et al in Neurology. 2011; 77: 1253-62. Home-ClinicalTrials.gov [2016. 3.21 접속]. 다음 주소에서 접속가능: http://www.cli-nicaltrials.gov/)
· 프로테아제 억제제/작용제 (Yan R, et al.. in Lancet Neurol. 2014; 13: 319-29. Vellas B, et al. in Curr Alzheimer Res. 2011; 8: 203-12. Xia W, and co. in J Alzheimers Dis. 2012; 31: 685-96.)
· 스타틴류와 같은 지질 감소 약물 (Home-ClinicalTrials.gov [2016. 3.21 접속]. 다음 주소에서 접속가능: http://www.cli-nicaltrials.gov/. Wong WB. et al. in Pharmacoepidemiol Drug Saf. 2013; 22: 345 -58; Frolich L, et al. in J Alzheimers Dis. 2011; 24: 363-74.)
· 능동 면역 치료 (Panza F. et al. in Expert Rev Clin Immunol. 2014; 10: 405-19; Ryan R. JM et al. in J Alzheimers Dis. 2009; 17: 243; Winblad B. et al. in Lancet Neurol. 2012; 11: 597-604; Schneeberger A. et al. in N Engl J Med. 2014; 370: 322-33.)
· 수동 면역치료 (Home-ClinicalTrials.gov [2016. 3.21 접속]. 다음 주소에서 접속가능: http://www.cli- nicaltrials.gov/. Panza F. et al. in Expert Rev Clin Immunol. 2014; 10: 405- 19; Salloway S. et al. in N Engl J Med. 2014; 370: 322-33; Doody RS. et al. in N. Engl J Med. 2014; 370: 311-21; Ostrowitzki S. et al. in Arch Neurol. 2012; 69: 198-207).
이러한 치료 전략 중 어느 것도 인간에 대한 사용이 승인되지 않았으며, 지금까지 그것의 효과가 증명되지 못했고, 심지어 거의 대부분이 부정적인 또는 반대되는 결과를 가졌다. 이러한 전략의 개발 중 어디에서도 AD로 고통받는 대상체의 대뇌 대사에서 병에 걸린 서로 다른 표적에서 긍정적으로 상호작용할 수 있는 화합물을 개발한다는 개념은 없었다.
카라자나 등(Carrazana et al., WO2010118706 A4)은 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 통과하여 아밀로이드 플라크에 달라붙을 수 있는, 그리고 이 구조를 가시화함으로써 SPECT, PET 및 MRI 기술을 통해 진단제로 사용되는 새로운 중성, 지용성 저분자량 화합물의 합성을 선언했다. 이 발명에서, 이 화합물들이 알츠하이머 및 파킨슨병에 대한 치료제로 쓰일 수 있다고 기술되었다. 한편, 이 저자들은 WO2014131374 A1에서, 이 화합물들의 이 질병의 치료제로서의 용도를 언급했는데 왜냐하면 그것들이 아밀로이드 플라크 뿐만 아니라 가용성 올리고머, 전미소섬유(prefibrillar) 구조, 원시 미소섬유(protofibril) 및 아밀로이드 형성 섬유를 억제하고, 줄이고, 다시 접고, 분해할 수 있기 때문이다. 그러나, 이 특허들은 이 화합물들의 항콜린성, 항산화성, 항글루탐산성 및 항 염증 작용과, AD 치료에 있어서 지금까지 존재했던 난제를 극복할 수 있는 새로운 단일치료법의 개발을 가능하게 하는 그들의 다중-표적 표적 치료제로서의 발견 및 개념에 대해 선언하지 않았다. 어떤 것도 AD 치료를 위한 활성 성분 또는 주성분으로서 화학식 1의 화합물, 그것들의 염, 수화물, 거울상 이성질체, 이성질체, 대사체, 프로드럭의 인간 투여를 위한 효과적인 투여 제제를 주장하지 않았다.
최근, 조절 방출 약물 형태의 개발은 생물약학 분야에서 매우 정확한 세목을 가지는 중합체 물질의 사용과 실용적으로 관련 된다. 이 덕분에, 그것들은 단일 투여량을 사용하여 약물 농도를 치료적 정점에 유지시킬 수 있고, 정해진 시간에 연속적으로 그것을 방출시킬 수 있다 (Rodriguez, IC; Cerezo, A.; Salem, in II Bioadhesive delivery systems. Ars Pharmaceutica, 2000, 41, 1, 115-128; Vintiloiu, A., Leroux, JC in Organogels and their use in drug delivery. Journal of Controlled Release, 2008, 125, 179-192). 매트릭스 시스템에서, 활성 성분은 현탁액으로서든 용액으로서든 중합체 안에 균일하게 분포되고, 그것의 방출역학은 매트릭스의 구조 및 사용된 물질의 화학적 성질에 따른다 (Frenkel, J., in Rubber Chemistry and Technology, 1940, 13, 264-274; Tanaka et al. In Encyclopedia of Polymer Science, 1986, 2nd ed. 6, 514; Fyfe, CA, Blazer, AI, in Journal of Controlled Release, 1998, 52, 221-225). 매트릭스 정제를 제조하기 위해 사용되는 지연 또는 변형 작용 부형제는 불용성이거나 또는 불활성 중합체 매트릭스, 지질 또는 수-불용성 매트릭스 또는 친수성 매트릭스일 수 있다.
친수성 매트릭스는 활성 성분을 친수성 중합체와 혼합함으로써 그것이 중합체 매트릭스를 이뤄서 얻을 수 있다. 셀룰로오스 에테르는 조절 방출 시스템 개발에 널리 사용되는 친수성 중합체로, 생물학적으로 적합하고 무독성이다. 우리가 아는 것들은 다음의 것들이다: 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(CMC Na), 메틸셀룰로오스(MC), 에틸셀룰로오스(EC) 및 미세결정 셀룰로오스 다당류 및 그 유도체, 폴리에틸렌 글리신 산화물, 폴리에틸렌 글리콘 키토산, 폴리 [비닐 알코올], 잔탄검, 무수 말레산 공중합체, 폴리 [비닐 피롤리돈], 전분 및 전분 기반 중합체, 말토덱스트린, 폴리 [2-에틸-2-옥사졸린], 폴리 [에틸렌이민], 하이드로겔 폴리우레탄, 가교 폴리아크릴산 및 그것들의 유도체. 다른 적절한 부형제들과 함께 이 매트릭스가 사용되는 조제 시, 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐을 제조하는 것이 가능하다 (Dabbagh, MA, et al. In International. Journal of Pharmaceutics, 1996, 140, 85-95).
최근에, 고분자량 약물의 투여를 가능하게 하는 비강 상피의 높은 투과성 때문에, 그리고 종종 정맥 내 주사와 거의 동등한 혈장 농도 프로파일을 가지고 빠른 속도로 약물이 흡수되기 때문에 뇌로 약물을 전달하기 위한 비강 내 경로를 탐색하는데 많은 관심이 모아지고 있다 (Michael IU, et al. in J Pharm Pharmacol 2001; 53: 3-22). 이 경로의 다른 장점은: 큰 약물 흡수 표면적, 환자에 의한 치료에의 더 나은 충실도(adherence), 혈중 치료 농도의 빠른 도달, 공격적인 상태를 나타내지 않는 것 그리고 초회 간 통과 효과를 피할 수 있다는 것이다.
문헌에서, 비강 점막으로부터 뇌로의 약물 섭취는 주로 3개의 다른 경로를 통해 일어난다고 설명되어 있다(Illum L. in Eur J Pharm Sci 2000; 11: 1-18; Frey WH II. in Drug Deliv Tech 2002; 2: 46-49. Vyas TK, et al. in Curr Drug Deliv 2005; 2 (2): 164-175). 하나는 전신 경로로, 여기서는 약물이 전신 순환계에 의해 흡수되고 이어서 BBB를 통과함으로써 뇌에 도달하게 된다. 다른 2개의 직접적인 경로는 후각 경로 및 삼차신경 경로로, 그를 통해 약물은 비강으로부터의 일부가 뇌척수액(CSF) 및 뇌 조직으로 이동한다(Thorne RG, et al. in Neuroscience 2004; 127: 481-496). CNS로 약물 전달이 되기 위해, 약물은 비강 점막을 효율적으로 빠르게 통과해야만 한다. 따라서, 비강 내 투여 후의 약물 동력학 및 생체이용률에 있어 제형의 설계가 핵심적인 역할을 한다. 흡수 부위에서의 약물의 체류 및 밀접 접촉은 제제화에서 고려해야 하는 두 가지 중요한 요소이다. 제제의 점도가 높아질수록 비강 내 제제의 체류 시간이 증가하고, 그래서 흡수의 가능성도 높아진다는 것이 알려져 있다 (Pires, A, et al. In J Pharm. Pharmaceut Sci. 2009; 12 (3): 288-311). 한편, 비강 점막 및 점액층은 다양한 종류의 효소를 포함하고 있는데, 그에 대해서 프로테아제 및 펩티다제 저해제를 사용하는 것을 포함하는 효소 분해를 막기 위핸 여러 가지 기술들이 시도되어 왔다(Pires, A , et al. in J Pharm. Pharmaceut Sci. 2009; 12 (3): 288-311). 또한, 상피 장벽을 가역적으로 변화시키거나 지질막을 변형함으로써 이 장벽의 투과성을 증가시키거나, 그것의 유동성을 증가시키거나 또는 세포 사이 이동을 늘리는 세포 간 공간을 여는 흡수 촉진제가 있다. 이런 화합물들은 조직 손상의 증가에 연루되지만, 그러나 키토산, 사이클로덱스트린 및 몇몇 인지질 유도체와 같은 일부 화합물은 흡수 및 생물이용성을 증가시키는 것으로 보이고, 그것은 점막의 변형으로부터 생기는 임의의 부정적 효과보다 우세하다(Pires, A. et al. in J Pharm. Pharmaceut Sci. 2009; 12 (3): 288-311; Casettari, L. and Illum, L. in J. Control. Release 2014, 190, 189-200).
점막부착성 화합물은 약제 형태가 점막층에 달라붙도록 하는데, 그것은 점막과 약물 사이의 접촉 시간을 늘리고 흡수에 도움이 된다. 이것은 아가로즈, 키토산, 젤라틴, 카라기난, 펙틴, 셀룰로오스 유도체, 폴리아크릴레이트, PEG, 메타크릴레이트, 아크릴산, PVA 아미노덱스트란, 키토산-EDTA, PAC, 알긴산염, 카르복시메틸셀룰로오스 및 그것의 나트륨염 형태(CMC 및 Na-CMC), 히드록시에틸화 전분, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 티올화 중합체, 폴리아크릴산을 포함한다 (Mansuri, S. et al. in React. Funct. Polym. 100 (2016) 151 -172).
비강 내 경로는 저분자량(1000 Da 미만) 약물의 전달에 쓰일 수 있다(Behl CR, et al. in Adv Drug Del Rev 1998; 29 (1): 89-116). 다양한 특허가 이러한 저분자의 CNS로의 전달에 대한 여러 가지 접근법을 청구한다.
퀘이(Quay, S.C.) 등은 미국 특허공개 US20030225031A1(2003) 및 US20060003989A1(2006)에서 아세틸콜린에스테라제 저해제(도네페질, 타크린, 리바스티그민, 갈란타민 등)에 의한 치매, AD, 학습장애, 니코틴 금단 증후군의 치료를 위한 약학적 조성물을 청구하는데, 그것은 약물의 비강 투여를 위한 액상 용액, 겔 또는 분말, 및 비강 내 투여를 통해 CSF에서 약물이 점막을 통과하여 흡수될 수 있도록 하는 투과 촉진제를 포함한다.
웬트(Went G.T.) 등은 미국 특허 공개 US20050245617A1(2005)에서 N-메틸-D-아스파르트산염 수용체 길항제(메만틴), 모노아민 옥시다제(MAO) 저해제 또는 GADPH 저해제(셀레길린(selegiline)); 및 약학적으로 허용가능한 담체의 약학적 조성물을 청구하는데, 그 조성물은 파킨슨병, 다발성경화증 및 AD와 같은 CNS-관련 증상의 치료를 위해 경구, 국소 상피 통과, 피하, 정맥 내, 비강 내, 또는 흡입 투여를 위한 서방출 약물 형태로서 투여된다. 이 저자들은 미국 특허 공개 US20060252788A1(2006)에서 메만틴과 도네페질을 결합한 조성물을 청구하고, 미국 특허 공개 US20060189694A1(2006)에서 그들은 아미노아다만틴 유도체(메만틴, 리만타딘(rimantadine), 아만타딘(amantadine)) 및 데카르복실라제 저해제(레보도파, 카르비도파(Carbidopa)) 또는 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제 저해제(탈카폰(talcapone), 엔타카폰(entacapone))를 담체와 함께 지연 방출 약물 형태 내에 포함하는 다양한 신경퇴행성 상태의 치료를 위한 조성물을 개시한다.
커밍스(Cummings, C.J.) 등은 미국 특허 공개 US20070037800A1(2007)에서 헌팅턴병 또는 AD과 같은 신경계 질병을 클로트리마졸과 그것의 유도체를 사용하여 치료하는 비강 방법을 주장한다. 한편, 타오(Tao, T.) 등은 중국 특허 공개 CN1621039(2005)에서 후페르진-A(Huperzine-A) 및 그것의 유도체 또는 염의 생체이용가능한 제제를 개시하는데, 그것은 노인성 치매의 예방 및 치료, 그리고 기억력 향상 및 청소년의 학습능력 향상을 위해 비강으로 투여된다.
본 발명은 약물화학에 대한 것이고, 화학식 I의 화합물의 약학적 조성물에 대한 것인데, 그것은 알츠하이머병(AD)에서 영향을 받는 콜린성, 글루탐산성 및 미토콘트리아 시스템에 다중-표적 표적 작용을 나타낸다. 이 화합물의 제제는 그것의 경구, 설하, 비경구, 경피 및 비강 투여를 통해 효능 및 수용성을 높인다.
여기서,
R1: -알킬레닐-C(O)NH-알킬레닐-R3, -알킬레닐-C(O)O-R4;
R3: -COOH, -OH, -SH, -NH2, -NH-알킬-, -NH-알킬레닐-NH2, -NH-알킬레닐-NH-C(O)-알킬레닐-S-R5, -NH-디티오카르바메이트-알킬, -N-알킬-디티오카르바메이트 알칼리토금속염; 또는 앞서 언급된 치환기의 약학적으로 허용가능한 염,
R4: 숙시니미딜기;
R5: -H, -C(O)-알킬, -C(O)-C6H5; 및
R2: -H, -알킬.
"알킬"이라는 용어는 포화 탄소 원자 및 수소 원자의 선형 또는 가지형 지방족 사슬인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 메틸 또는 에틸이다. "알킬레닐"이라는 용어는 선형 또는 가지형 알킬기의 2가 유사체를 가리키는 것으로, 바람직하게는 메틸레닐(-CH2-), 에틸레닐(-CH2CH2-), 또는 프로필레닐(-CH2CH2CH2-)이다.
구체적으로, 화학식 1의 제제화된 화합물은 현재 쓰이는, AD의 증상을 개선시키기 위해 여러 활성 성분을 조합하여 사용하는 다중약물-치료법을 대체하여 단독으로 사용될 수 있다. 화학식 1의 화합물은 각자 항콜린성, 항산화, 항글루탐산성 및 항염증 활성을 나타내고, 이것이 그 물질들을 AD의 단일 약물 치료에 대해 잠재력 있는 활성 성분으로 만든다. 또한, 그것들은 아밀로이드 형성 펩타이드 응집 및 플라크 형성을 억제할 수 있다(WO2010118706 A4). 이것으로, 환자는 단일약물 치료를 받고, 그것이 AD로 고통받는 대상체의 임상 증상 및 뇌에서 나타나는 생물학적 변형을 상당히 개선시킨다.
화학식 1의 화합물, 그것의 염, 수화물, 거울상 이성질체, 이성질체, 대사체, 프로드럭을 AD 치료를 위한 활성 성분 또는 주성분으로서 인간에게 투여하기 위한 본 발명의 제제는, 경구, 설하, 비경구, 경피 및 비강 투여를 통해, 치료에 대한 효능, 생물안전성, 충실도 및 수용도를 증가시키는 생물이용도, 활성 성분의 체류 시간, 및 적절한 배출을 향상시킬 수 있다.
화학식 1의 화합물은 쿠바 특허 번호 2009-57, PCT-CU2010-000001에 설명된 바와 같이 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명에서, 화학식 1의 화합물들은 예상치 못하게 미토콘드리아-보호 특성을 나타낸다. 도 2(비제한적 실시예 1로부터의)는 전자 전달 사슬(electron transport chain, ETC)의 단백질 복합체를 통한 전자의 흐름에 관여하는 미토콘드리아 막전위 (ΔΨ) 소실에 대한 화합물 1의 영향을 나타낸다. 에틸렌-비스(옥시에틸렌니트릴) 테트라아세트산(ethylene-bis(oxyethylenenitrile) tetraacetic acid, EGTA)으로 처리한 미토콘드리아는, 실험의 대조 모둠에서 이러한 것처럼 최소한의 미토콘드리아 전위 소실을 보인다. 이 경우, EGTA가 반응 배지에서 Ca2+ 오염물질의 킬레이터로서 작용하여, 미토콘드리아가 그것의 최선의 상태에 있게 하고 그것의 전위를 최대로 유지하게 한다. EGTA + 3-클로로페닐히드라존 카르보닐 시아나이드(chlorophenylhydrazone carbonyl cyanide, CCCP) 대조군은 미토콘드리아 손상이 일어난 모둠인데, CCCP가 산화적 인산화 언커플러로서 작용함으로써 ΔΨ를 소실시키기 때문이다. 농도 범위 0.1 μmol/L 내지 100 μmol/L의 화합물 1은 대조 모둠(EGTA)과 유사한 전위 소실값을 보인다. 이 결과에 따르면, 화합물 1은 실험한 용량 범위에서 전위 소실에 대한 감수성을 줄인다.
도 3은 50 μmol/L의 Ca2+ 및 2 mmol/L의 무기 인산염((Pi)으로 유도된 미토콘드리아 종창의 평가 결과를 나타내는데, 그것을 540 nm에서의 흡광도 감소로부터 분광광도계로 측정했다. 이 경우, 최대 종창의 측정값으로서 대조 모둠(Ca2+의 존재 중)에서 최대 흡광도가 관찰되었다. 한편, EGTA (Ca2+의 킬레이터)로 처리한 시료는 낮은 흡광도를 나타냈고(p <0.001), 이것은 손상되지 않은 대조 모둠에서와 같다. CCCP로 처리한 모둠도 또한 낮은 흡광도값(p <0.001)을 보였는데, 짝지음 해제시 그것이 Ca2+ 이온의 유입을 막고, 따라서 미토콘드리아 종창을 막기 때문이다. 비슷한 농도에서 화합물 1이 Ca2+-유도 부종의 효과를 반전시켰고, 이와 같이 그것이 미토콘드리아 온전성 및 기능성의 보호제로서 여겨질 수 있다. 이러한 효과는 미토콘드리아 막 전위 소실에 대해 관찰된 효과와 부합한다.
과산화수소(H2O2) 생산에 대한 화합물 1의 효과도 평가되었는데, 그것은 미토콘드리아 막 전위(ΔΨ)의 보존 상태와 직접적으로 관련이 있다. 기저 상태에서, 미토콘드리아는 EGTA로 처리한 대조 모둠에서 확증된 바와 같이, 많은 양의 반응종을 생산한다. CCCP로 처리했을 때, 비슷한 양상이 관찰되었다(도 4, 비제한적 실시예 1로부터). 그러나 이 경우 반응종의 생성이 미토콘드리아 ATP아제에 의한 ATP의 생산이 아닌 CCCP가 유도하는 짝지음 해제와 연관되는 것, 즉, 미토콘드리아 기능의 최적의 상태임이 추정된다. 화합물 1로 처리하면 실험한 용량 범위에서 H2O2 생산에 대해 보호한다.
요컨대, 우리의 결과는, 미토콘드리아가 막 전위의 소실에 덜 취약해졌고 그것이 부종과 반응성 산소종의 생성을 줄이기 때문에, 이 화합물이 미토콘드리아의 기능에 대해 보호제로 작용함을 암시한다.
가상(in silico) 연구에 따르면, 화학식 1의 화합물이 도네페질과 유사한 방식으로 효소 AChE와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 아미노산 Trp 84, Trp 279 및 Phe 330와 소수성이다. 동일한 방식으로, 이 화합물들은 아세틸콜린과의 반응에 연관된 공동에서의 모든 세린 잔기와 리간드/효소 결합에 안정성을 주는 세 개의 수소 결합을 형성함으로써 상호작용하고, 이 화합물들이 효소 작용을 차단할 것임 을 암시한다. 스코폴라민-유도 기억상실(ESC) 모델은 치매 및 노령과 연관된 인지 결핍증을 유도하기 위해 널리 사용되는 것 중 하나이다(Bajo R, et al. in Scientific reports 2015, 5: 9748; Gilles C and Ertle S. in Dialogues Clin. Neurosci. 2000, 2 (3): 247-255; Haider S et al. in Brain Res. Bull. 2016, 127 (Supplement C): 234-247). 이 경쟁적 비-선택적 무스카린 콜린성 수용체 길항제의 사용은 콜린성 신경 전달을 차단하는 효과적인 방법이고 이와 같이 치매를 유도한다. 또한, ESC는 효소 아세틸콜린 에스테라제 AChE의 활성을 증가시켜서, 그것이 수용체의 차단과 함께 콜린성 신경 전달의 결함에 기여한다. 이 모델은 도네페질과 같은 효소 활성의 저해제들의 생체(in vivo) 실험에서 사용된다(Shin CY, et al. in Biomolecules & Therapeutics 2018, 26 (3): 274-281). 이런 효과와 함께, OS 유도, 신경 염증, 미토콘드리아 기능이상, cAMP의 인산화 감소, 및 NFDB(뇌에서 유래된 향신경성 인자)와 신경교세포 미소섬유 산성 단백질(glia fibrillar acidic protein, GFAP)의 음성 조절과 같은 다른 기전도 관찰된다(Haider et al., in Brain Research Bulletin 2016, 127, 234-247; Jung et al., in Biol. Pharm. Bull. 2009, 32 (2), 242 -246; Konar et al., in PLOS ONE, 2011, 6, 11, e27265; Lee et al., in Scientific reports, 2015, 5, 9651 .; Wong-Guerra et al., in Neurol Res. 2017; 39 (7), 649-659). 이 모든 것이 이 모델에서 관찰되는 인지 기능장애에 기여한다.
Y-미로의 "공간 버전"을 사용하여 급성 ESC 모델에서 행동 평가를 수행했는데, 그것은 단기 공간 기억을 평가하고, 미로 안에 있는 새로운 공간을 저절로 자각하는 동물의 능력에 기초한다 (McGaugh JL, in Science, 153 (1966) 1351). 이 프로토콜에서 평가되는 기억력은 해마의 기능과 관련 있다(Csiszar A., et al. in Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (2013), 305 H1120-1130; Olton DS and Paras BC, in Neuropsychologia, 17 (1979) 669-682.).
도 5(비제한적 실시예 2)는 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트(3)의 ESC 모델에서 평가한 Y-미로에서의 행동 시험 결과를 나타낸다. 이 실험에서, 대조 모둠 동물들이 새로운 가지에 대해 선호를 갖는 것이 관찰되었는데, 그것은 두 개의 익숙한 가지에서 보낸 시간의 상당한 감소로 확인되었다(p <0.001). 이러한 선호 행동 프로파일은 훈련 30분 전 ESC를 투여했을 때는 재현되지 않았다. 이 경우, 새로운 가지에서 보낸 시간은 줄었고, 다른 두 개의 가지에서 관찰된 것과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 보이지 않았다. 반면에, 화합물 3이 투여된 모둠(0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 용량)에서는, ESC에 의해 유도된 기억 상실이 상당히 반전되었다(p <0.001). 예를 들어, 동물들은 대조 모둠의 선호 행동 프로파일과 유사한, 익숙한 가지에 비해 새로운 가지에서의 지속 시간이 상당히 증가하는 것을 특징으로 하는 프로파일을 나타냈다. 이 실험에서, 실험 30분 전에 도네페질을 투여하면(양성 대조 모둠, 용량: 1 mg/kg, ip) 역시 ESC에 의해 유도되는 기억력 결핍을 반전시켰는데, 그것은 다른 저자들과, 그리고 이 약의 항콜린성 효과와 일치한다(Lee JS, et al. in Scientific reports 2015, 5: 9651; Riedel G, et al. in Behav. Brain Res. 2009, 204 (1): 217-225). 이와 같이, 우리의 결과는 화합물 3이 훈련 30분 전에 0.1 내지 10 mg/kg 범위의 단일 용량이 투여되었을 때, 놀랍게도 ESC의 투여에 의해 유도되는 기억 상실 효과를 예방한다는 것을 가리킨다. 여러 실험 모둠의 새로운 가지에서의 체류 시간을 비교했다(도 6, 비제한적 실시예 2). 여기서, 대조 모둠과 ESC 모둠의 시간은 후자 모둠에서 또렷한 감소를 보이고(대조 모둠: 133.8±9.3초; ESC: 98.8±4.2초), 그것은 통계적으로 유의하다(p <0.001). 화합물 3으로 처치한 모둠의 동물들의 행동은 투여된 농도에 따랐다. 위로 1 mg/kg 용량까지 탐색 시간이 점진적으로 늘었고, ESC 모둠과는 유의적으로 달랐다(p <0.01). 최고 용량에서, 이 변수의 감소가 관찰되었다. 도네페질 처치 모둠의 경우는 체류시간이 예상대로 ESC 모둠보다 훨씬 길었다. 요약하면, 이 실험에서 화합물 3의 1 mg/kg 용량이 최대 효과를 나타내는 용량으로 작용했다.
장기 기억력 연구를 위해(McGaugh JL, in Science, 153 (1966) 1351) "물 미로"가 개발되었다(모리스의 수중미로(Morris's Water Maze, MWM)로 불림; Morris R, in Journal of Neuroscience Methods 1984, 11 (1): 47-6). 이 행동 모델은 해마 의존성 공간 항해 및 참고 기억력을 측정하는 데 유효한 것으로 보인다. 이를 위해, 2일의 MWM 프로토콜이 보고되었는데, 그것은 보이는 플랫폼을 가지고 하는 훈련 실험의 초기 시리즈와, 이후 24시간 뒤의 숨겨진 플랫폼을 가지고 하는 기억력 실험에 기초한다(Gulinello M., M. Gertner et al. in Behav. Brain Res., 196 (2009) 220-227). 이 프로토콜은 나이 든(15-18개월) 3중 유전자 변형(3xTG) 마우스에서 검증되었다. 평가되는 기준은 탈출 지연시간의 차이 및/또는 비율이다: 보이는 플랫폼으로 훈련하는 마지막 실험의 것과 숨겨진 플랫폼으로 하는 첫 번째 실험(24시간 뒤)의 것. 여기서, 올바른 공간 전략을 발달시킨 동물들은 숨겨진 플랫폼 영역을 향해 빠르게 움직이는데 그들의 장기 기억 능력을 온전히 유지하고 있음을 가리킨다. 반면에, 숨겨진 플랫폼을 찾는 데 시간이 걸리는 동물들은 더 높은 탈출 지연시간의 장기 공간 기억의 부족함을 가진다.
도 7(비제한적 실시예 2)은 급성 ESC 모델에서 MWM을 이용한 화합물 3의 행동 평가의 결과를 나타낸다. 결과는 ESC를 투여받은 마우스가 장기 공간 기억력 결핍을 갖지만, 화합물 3으로 처치한 동물들에서는 그렇지 않음을 나타낸다. 보이는 플랫폼으로 훈련한 마지막 시험의 지연 시간과 숨겨진 플랫폼을 가지고 한 첫 시험의 것의 비율 뿐만 아니라 수치적 차이는 화합물 3으로 처치한 모둠이 ESC로 처치한 모둠과 유의적으로 다르다는 것을 보여준다. 이런 식으로, 이 실험의 결과는 단기 공간 기억력에 대한 이전의 실험에서 얻어진 결과를 확증한다.
이 동물들에서, AChE 활성(μmol/L/min/mg의 단백질)을 뇌 균질현탁액 (homogenate)의 수용성 분획의 시료에서 ex vivo 측정했다(도 8, 비제한적 실시예 3). 결과는 ESC 처치 모둠에서 대조 모둠에 비해 AChE 활성에서의 유의적 증가(p <0.001)가 있음을 보여준다. 그러나, AChE 활성은 놀랍게도 화합물 3 처치 모둠에서 도네페질 처치 동물에서 기대되는 것과 같이(p <0.01) ESC 모둠에 비해 유의적으로 줄었다(p <0.05).
만성 ESC 모델이 최근 AD의 치료를 위한 새로운 약물을 실험적으로 평가하기 위한 또 다른 대안으로 떠올랐다(Klinkenberg I and Blokland A, in Neurosci Biobehav Rev 2010, 34 (8): 1307-1350). 설치류에서, 인지 장애는 ESC(i.p.)를 10일 연속으로 하루 한 번의 비율로 연속 투여함으로써 유도된다. 이 모델에서, 급성증에서 나타나는 일부 특징이 유지되고, AD와 더 연관되는 다른 특징들이 나타난다. 예를 들어, 다음과 같이 콜린성 시스템의 퇴화가 일어난다: 아세틸콜린에스테라제의 활성/발현의 증가, 합성 효소 콜린아세틸트랜스퍼라제의 활성/발현 감소 및 전-시냅스 말단 수준에서의 콜린의 능동 소모 결손(Haider, S. et al. in Brain research bulletin, 2016, 127, 234-247). 또한 아밀로이드 전구체 단백질(AβPP)의 발현이 증가하고 βA 응집체 및 과인산화 타우가 존재한다(Bihaqi SW, et al. in Indian J. Pharmacol. 2012, 44 (5): 593-598; Ramandeep K, et al. in Int J Prev Med Res. 2015. Vol. 1, No. 2, pp. 45-64).
도 9 (비제한적 실시예 4)는 만성 ESC 모델(일일 용량 1.5 mg/kg, 2주)에서의 화합물 3에 대한 장기 기억 행동 평가의 결과를 나타낸다. 화합물 3을 ESC 투여 3일 전부터 다음 2주간 ESC 투여하는 동안 투약했다. MWM의 결과는 ESC를 투여받은 마우스의 기억 상실을 나타낸다. 한편, 화합물 3을 투여받은 모둠의 경우에는(1 및 10 mg/kg) 숨겨진 플랫폼을 가지고 한 시험(T7)에서의 첫 번째 탈출 지연 시간 및 보이는 플랫폼을 가지고 한 마지막 시험(T6)의 탈출 지연 시간의 비율이 ESC 모둠에 비해 유의적으로 감소했다. 이 결과는 1 mg/kg 용량이 최대 효과 용량으로 작용함을 나타냈다. 요컨대, 결과들은 이 모델에서 MWM에서의 장기 공간 기억력의 훼손으로 증명되는 콜린성 시스템의 퇴화가 유도되고, 그것이 화합물 3의 사용으로 예방되는 것을 나타낸다.
글루탐산 수용체-매개 흥분독성이 AD 및 파킨슨병(PD)을 포함하는 다수의 신경 이상의 병태생리의 기저를 이룰 수 있음이 인식되었다. 글루탐산은 정상적인 생리적 상태에서 신경발달, 전달 및 시냅스 가소성에서 중요한 역할을 한다. 또한, 이 신경전달물질은 기억 및 학습 과정에 관여한다. 저산소성-허혈증과 같은 급성 세포 독성 사건 또는 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 만성 신경퇴행성 질병에서, 여러 병독에 대한 반응으로 뇌 조직에서 글루탐산 농도가 올라가고, 특히 세포 내 Ca2+ 농도 증가로 인해 이 현상이 신경 사멸을 촉발한다. 화학식 1의 화합물들이 놀랍게도, 실시예 5 및 도 10에 비제한적인 방식으로 보여지는 바와 같이 in vitro 실험에서 글루탐산-유도 흥분독성 손상에 대해 신경 보호 효과를 가지는 것이 발견되었다. 여기서, SH 세포-SY5Y를 화합물 3으로 24시간 동안 전처리했고(1.8-60 μmol/L), 이어서, 동일 농도의 화합물 3과 60 mmol/L의 글루탐산과 함께 공배양했다(24시간). 화합물 3은 7.5 및 15 μmol/L 농도에서 신경 괴사를 유의적으로 줄였다(p<0.05). 이 결과들은 신경 보호가 별도로 미토콘드리아 기전을 조절할 수 있을 것임을 암시한다.
흥분독성 세포 괴사는 또한 글루탐산성 시스템에 있는 다른 수용체에 의해서 영향을 받는다. 예를 들어, 둘 다 강력한 글루탐산 작용제인 카인산(kainic acid, KA) 또는 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로피온산(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, AMPA)을 투여함으로써 실험적으로 손상을 유도할 수 있다(Wang Q, et al. in Mol Neurobiol. 2005, 31: 3-16). KA을 설치류에 투여하면 반복되는 발작, 행동 변화, 및 뒤이어 뉴런의, 특히 해마의 CA1 및 CA3 구역에서의 퇴화를 유도한다고 알려졌다(Wang Q, et al. In Mol Neurobiol. 2005, 31: 3-16). KA에 의해 유도되는 뉴런 괴사는 소교세포 및 성상세포의 활성 증가를 수반하고, 염증성 사이토카인 생성을 증가시킨다(Chen, Z. et al. In J. Neurobiol., 2005, 62 (2), 207-218). 또한, KA 수용체의 활성화는 미토콘드리아 막의 탈분극을 일으켜서, 결과적으로, 세포 내 Ca2+ 농도의 변화를 일으킨다 (Brorson, JR et al. in J. Neurosci., 1994, 14 (1), 187-197). 따라서, 미토콘드리아 기능에 손상이 유도되며(Wang, Q. et al. in Mol. Neurobiol., 2005, 31 (1-3), 3-16) ROS 및 RNS의 생성이 늘어나 OS 및 질화 스트레스(nitrosative stress, NS)를 일으켜, 그것들의 유해한 신경 작용을 통해 세포 괴사를 유도한다(Ueda, Y. et al. in Exp. Brain Res. 2002, 147 (2), 219-226).
우리의 실험에서, KA 대조 모둠의 동물들에서, KA 주사 후 10 내지 20분 내에 입의 움직임의 고정(immobility) 및 무표정, 그리고 경직된 자세가 관찰되었고, 일부의 경우 중등 강도의 강직성-간대성 발작이 있었다. 그 다음 20-60분 동안, 고개를 끄덕이고, 반복적으로 이동하며, 몸을 일으켰다가 떨어지는 것이 관찰되었고, 이어서, 최종적으로 좀 더 심한 강직성-간대성 발작이 일어날 때까지 계속 몸을 일으켰다가 떨어졌다. 그러나 놀랍게도, 화합물 3으로 처치한 모둠에서는(용량: 5 및 50 mg/kg) 이러한 효과가 더 낮은 빈도와 강도로 나타났다(도 11, 비제한적 실시예 6). 도 11은 화합물 3(5 및 50 mg/kg)으로 처치한 모둠의 전체 점수(0-120분)가 유의적으로 줄었고, 50 mg/kg 용량일 때 효과가 가장 큼을 나타낸다.
화학식 1의 화합물들은 지금까지 제제화되지 않았고, 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 이 화합물들의 생리-화학적 특성과 상기 조성물에서의 상기 성분들의 중량비를 고려하면 두드러진 방식으로 독특하다. 예를 들어, 본 발명의 제제는 항-콜린성, 항산화성, 항글루탐산성 및 항염 작용을 가지는 다중-표적 치료제의 특성을 보장한다. 이 제제들은 활성 성분의 유효 혈장 농도를 오랜 시간 지속하는 용량을 가능하게 하고, 그것이 지금까지 밝혀지지 않았던 약효를 보장하고, 그것의 경구, 설하, 비경구, 경피 및 비강 투여를 통해 충실도(adherence) 및 수용성(tolerance)을 향상시킨다.
화합물 1의 화합물, 그것의 염, 수화물, 거울상 이성질체, 이성질체, 대사체, 프로드럭의 인간에게 투여하기 위한 본 발명의 약학적 제제는 적합한 부형제를 포함하고, 정제, 캡슐, 현탁제, 유제, 비경구용 용액, 경피 패치, 비강용 용액, 점막 접착제 등과 같은 고형, 반고형, 젤리형 또는 액상형 제제일 수 있다. 전형적으로, 상기 제제는 0.1 내지 99%의, 바람직하게는 1 내지 80% 활성 화합물을 담체나 제제의 성분들과 함께 포함한다. 부형제는 액체, 고체, 또는 반고형 보조 성분으로, 유기 또는 무기성의, 천연 또는 합성 유래의 화합물이고, 생리적으로 허용가능하고 활성 성분들의 제제화에서 통상 사용되는 것이다.
본 발명에서 선택한 약학적 제형은 정제로서, 그것은 하루에 적어도 한 번 투여되고, 화학식 1의 화합물의 모둠으로부터 선택되는 치료 활성 성분 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염, 및 고형, 반-고형, 젤리형 또는 액상 중합체 매트릭스의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명의 제형은 상기 제형이 수용액에 노출될 때 2 내지 24시간 사이에 치료 활성 약물의 방출을 지속시킨다. 상기 제제를 투여한 후에, 활성 성분의 용해율은 6 내지 18시간 사이에 80%가 넘고, 상기 약물의 유효 혈장 농도가 24시간 동안 유지된다. 상기 활성 성분은 제제 당 약 1 내지 100 mg의 용량으로 존재한다.
본 발명에서, 정제는 특히 중합체로서 다음을 사용한다: 폴리에틸렌 산화물, 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 카르복시메틸셀룰로스 나트륨(CMC Na), 셀룰로스 유도체, 유드라짓 RS PO, 폴리비닐피롤리돈 또는 그것들의 조합. 24시간 변형 방출 제제에, 중합체는 5% w/w 내지 80% w/w 범위의 용량으로, 바람직하게는 10% 내지 70% w/w의 용량으로 존재한다. 12시간 변형 방출 제제에, 중합체는 바람직하게 5% w/w 내지 50% w/w로 존재한다. 본 제제는 문헌에 설명된 바와 같은 전통적인 방식으로 만들어진다.
도 12, 13 및 14는 3가지 정제 제제의 조절 방출 프로파일을 나타내는데(실시예 7, 8, 및 9), 그것이 본 발명을 제한하는 것으로 여겨져서는 안되며, 다음 활성 성분의 정제들에서 얻어졌다: (N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 ), 6-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}헥산산)( 2 ) 및 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 ). 이 제제들은 10 mg의 활성성분과, 결합제로서 전분, 붕해제로서 미결정셀룰로스, 희석제로서 유당, 활택제로서 이산화규소 및 윤활제로서 스테아린산 마그네슘과 같은 다른 첨가제를 여러 비율로 포함하고 중합체 매트릭스로서는 다음이 사용되었다: HMPC, HPC 및 유드라짓 RS PO. 도 12, 13 및 14는 이 세 가지 제제에서 매질의 pH에 따라 2상으로 방출됨을 나타낸다. 예를 들어, 정제(HMPC, HPC 및 유드라짓 RS PO)를 비-효소성 산 매질에 노출시키고 60분 후에는, 매트릭스로부터의 활성 성분의 방출이 대단치 않고, 주성분의 1% 미만이 방출되었다. 한편, 3가지 조제식의 정제가 pH 7.5의 완충 용액에 노출되었을 때, 활성 성분의 방출 과정이 점차 늘어나서, 24시간 동안 매질로 96%를 초과하는 거의 완전한 전달을 이뤘다. 이러한 방출은 예시적이지만 제한하지 않는 3가지 활성성분에 대해 나타났다.
본 발명의 본질을 제한하지 않으며 나타낸 3가지 제제의 이러한 방출 프로파일은 pH 변화가 있을 때 용해 곡선에서의 기울기에서의 증가가 있음을 명확하게 나타내고, 그것은 활성 성분이 오랜 시간 지속 방출됨을 의미한다. 인간 사용에서의 이러한 방출 양상이 함축하는 바는 혈액 속에서 상기 활성 성분의 농도가 점진적으로 부드럽게 증가하는 2단계로 방출이 일어나며, 따라서 원하지 않는 부작용을 줄임을 암시한다. 위장에서 활성 성분 함량의 오직 약 1%만이 방출되기 때문에 이것은 잠재적인 위장 부작용을 피하는 데 특히 효과적이다. 이 외에도, 전반적으로 긴 투약 간격에서의 믿을 만한 서방출은 환자에서의 약학적 효과를 개선시키고 그에 따라 치료에 대한 충실성 및 수용도를 높인다.
요약하면, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 정제 제제는 최적의 방출 프로파일을 가진다. 그것은 상기 정제가 생리학적으로 양립할 수 있는 성분을 영입하여 간단하고 경제적인 방식으로 생산될 수 있도록 접근가능한 중합체 매트릭스를 사용하고, 그것이 2상의 지연 방출 조성물을 제공하고, 그것은 부작용을 일으킴 없이 투약을 용이하게 한다.
본 발명에서 개발된 경피 시스템은 다음의 연속적인 층으로 만들어진다: a) 친유성 보호 외곽층; b) 겔, 현탁제, 유제 등의 형태인 화학식 1의 활성 성분 함유층으로서, 여기서 화합물은 매트릭스(아크릴일 수 있음) 안으로 들어가며 매트릭스가 그것의 효율적인 저장을 보장함; c) 활성 성분을 방출하는 양면 조절막; d) 방출 모듈로서, 활성 약물 저장소 및 약물 방출 조절 시스템을 포함하고, 전체적으로중합체 물질로 만들어짐(카르복시메틸셀룰로스(CMC), 에틸셀룰로스, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 전분 등; 합성 엘라스토머: 폴리부타디엔, 폴리이소프렌, 네오프렌, 폴리실록산 등; 합성 중합체: 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등); e) 저-알러지유발 접착층으로서, 그것은 압력에 의해 패치가 고정될 수 있게 하며, 아크릴류, 저자극성 실리콘, 수지, 광물유, 폴리이소부티렌 등의 중합체를 포함함; 및 f) 내부 보호 필름으로서, 이것은 피부에 상기 시스템을 적용하기 전에 제거됨. 이런 경피 패치의 코팅은 부작용 없이 피부에서 혈류로의 연속적이고 부드러운 약물 방출을 보장한다. 그것의 크기 및 약물 용량에 따라 두 종류의 패치를 공표한다. 하나는 5 cm2 면적에 활성성분 5 mg의 용량이며, 화합물을 4 mg/일로 방출한다. 다른 것은 2배의 비율 및 용량을 가진다. 치료는 더 작은 패치의 일일 용량으로 시작하고, 좋은 수용성을 보이고 최소 4주 후에, 더 큰 패치(10 cm2, 10 mg/24 h)를 적용한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물, 그것의 염, 수화물, 거울상 이성질체, 이성질체, 대사체, 프로드럭의 인간 투여를 위한 비강용 조성물은 용매, 생체접착제, 보존제, 항산화제 및 계면활성제/습윤제로서 기능하는 여러 가지 성분들을 이용한다. 비제한적 생체 접착 부형제는 다음일 수 있다: 히드록시프로필메틸셀룰로스(HMPC), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 메틸셀룰로오스(MC), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)로서 그것들 모두 0.5 내지 7%의 농도로, 그리고 폴리아크릴산 유도체(카르볼)는 0.01 내지 1.5% 농도로. PEG가 활성 성분에 대한 용매로 사용된다. 생체 접착 중합체는 비-한정적인 방식으로, 비강 내에서의 체류 시간을 늘리기 위한 목적으로 10 내지 60 mPas의 점성을 갖는다. 항미생물 보존제로서, 염화 벤잘코늄을0.005 내지 0.5%, 또는 EDTA 나트륨과 조합하여 농도 범위 0.002 내지 0.2%로, 그리고 0.005 내지 0.05%의 프로필 파라벤이 바람직하게 쓰인다. pH는 인산염 또는 구연산 완충 등장 용액을 사용하여 6 내지 7.5로 맞췄다. 등장화제는: 염화나트륨, 만니톨, 솔비톨, 포도당 등일 수 있다. 바람직하게 사용되는 항산화제는 0.05 내지 2%의 토코페롤이다. 3 내지 6%의 글리세롤과 0.1 내지 0.4%의 트윈 80이 습윤제로 쓰여서 투과성이 향상될 수 있게 한다. 사용되는 용매는 모든 경우에 주사용수였다.
비강 내 투여는 치료제를 중추신경계(CNS)에 전달하는 방법으로 여겨진다. 약물 방출은, 약물이 아무런 수용체나 축삭 전달 시스템에 결합할 필요 없는 세포 외 경로인, 후각 및 삼차 신경 경로를 따라 몇 분 내에 일어난다(Thorne, RG et al. in Neuroscience. 2002, 127, 481-496).
도 15는 ESC의 급성 투여로 유도된 기억상실에 대한 화합물 3의 비강 제제 투여 효과의 행동 평가(Y-미로 시험)의 결과를 나타낸다. 보여지다시피, 대조 모둠 간에는 차이가 없는데, 그것은 사용된 제제가 Y-미로 시험에서는 동물들의 성과에 영향을 끼치지 않음을 나타낸다. 예상대로, ESC-처치 동물들의 새로운 가지에서의 탐색 시간은 양 대조 모둠에 비해 상당히 감소했다(p<0.001). 그러나, 화합물 3으로 처치한 모둠의 동물들은 대조 모둠(식염수 및 담체)의 것과 유사한 값을 보여서, 화합물 3이 ESC-유도 기억상실을 예방함을 가리킨다. 도 16은 사물 구별 시험(Object Discrimination Test, ODT) 결과를 보여준다. 대조 모둠과 화합물 3 처치 모둠 사이에서 새로운 사물의 구별 지수(discrimination index, DI)의 유의적 차이가 관찰되지 않았다. 한편, ESC를 투여받은 모둠에서는 DI의 급격한 감소가 관찰되었다(p<0.001).
이 실험의 결과는 다른 저자들에 의해 관찰된 바와 유사하게 ESC의 급성 투여가 Y-미로 모델 및 ODT 양쪽에서 인지 장애를 유도함을 보여준다 (de Bruin N, et al., J Neurodegener Dis . 2015; 2015: 242505. Doi: 10.1155 / 2015/242505). 이와 함께, 화합물 3을 비강 내 투여하자 양 모델에서 인지 장애를 예방했고, 그것은 이 화합물을 급성 및 만성 ESC 모델에서 경구 투여했을 때의 이전 결과와 일맥상통한다. 화합물 3의 비강 내 투여는 경구 경로로 그것을 사용했을 때보다 더 낮은 용량에서 ESC의 기억 상실 효과를 예방할 수 있게 한다.
다음의 실시예 및 도면은 어떤 방식으로든 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안되며, 화학식 1의 화합물, 그것의 염, 수화물, 거울상 이성질체, 이성질체, 대사체, 및 프로드럭의 인간 투여를 위한 약학적 제제가 콜린성, 글루탐산성 및 미토콘드리아 시스템의 여러 기전에 다중-표적 표적 작용하는 것을 설명한다.
도 1: 화학식 1의 화합물 중 본 발명의 비제한적 실시예를 위해 선택된 일부의 구조 및 물리화학적 특성.
도 2: 화학식 1의 화합물 (N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 )의 래트의 간에서 분리된 미토콘드리아의 막 전위에 미치는 영향.
도 3: 화학식 1의 화합물 (N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 )의 래트의 간에서 분리된 미토콘드리아의 종창에 미치는 영향. *** p <0.001. 대조 모둠과의 비교는 스튜던츠 t-검정법으로 했고, p<0.05이면 통계적으로 유의한 차이로 보았다.
도 4: 화학식 1의 화합물 (N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 )의 래트의 간에서 분리된 미토콘드리아의 반응성 산소종 생산에 미치는 영향. *** p<0.001. EGTA 모둠과의 비교는 스튜던츠 t-검정법으로 했고, p<0.05이면 통계적으로 유의한 차이로 보았다.
도 5: 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 스코폴라민(ESC)의 급성 투여로 유도된 기억 상실 모델에서의 항콜린성 조절 효과. 대조 모둠, ESC 및 화합물 3 단일 용량(0.1, 1, 10 및 20 mg/kg, i.p.) 처치 모둠의 학습 세션 이후의 Y-미로에서의 단기 공간 기억력. * p<0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. 편차를 일방향 분석하고 그 다음 투키스 사후(post-hoc) 검정했다.
도 6: 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 스코폴라민(ESC)의 급성 투여로 유도된 기억 상실 모델에서의 항콜린성 조절 효과. 대조 모둠, ESC, 및 0.1, 1, 10 및 20 mg/kg의 화합물 3 처치 모둠의 훈련 세션 이후 새로운 가지에서 머문 시간. * p<0.05, 대조 모둠과의 비교. p <0.05, ESC와의 비교. 편차를 일방향 분석하고 그 다음 투키스 사후(post-hoc) 검정했다.
도 7: 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 스코폴라민(ESC)의 급성 투여로 유도된 기억 상실 모델에서의 항콜린성 조절 효과. 상단: 서로 다른 실험 모둠의 2일 프로토콜의 MWM에서의 성과. 하단: 장기 공간 기억력으로서, 보이는 플랫폼으로 한 마지막 실험에서의 탈출 지연 시간(D1T4); 보이는 플랫폼으로 한 첫 실험에서의 탈출 지연 시간 (D2T1). ** p<0.01, *** p<0.001, ESC 모둠과의 비교. p<0.05, 대조 모둠과의 비교. 편차를 일방향 분석하고 그 다음 투키스 사후(post-hoc) 검정했다.
도 8: 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 스코폴라민(ESC)의 급성 투여로 유도된 기억 상실 모델에서의 항콜린성 조절 효과. 대조 모둠, ESC-처치 모둠, 및 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 ) 및 도네페질 처치 모둠의 급성 ESC 모델로부터의 동물의 뇌 균질현탁액의 수용성 분획에서의 항콜린에스테라제 활성. 막대는 평균값±SEM에 해당한다. n = 10 마리/모둠. *** p<0.001, 대조 모둠과의 비교. p <0.05, p <0.01, ESC 모둠과의 비교. p<0.05를 통계적으로 유의한 차이로 간주했다. 사용된 통계 검정법: 일방향 편차 분석 후 투키스 사후(post-hoc) 검정.
도 9: 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 스코폴라민의 만성 사용으로 유도된 기억 상실 모델에서의 항콜린성 조절 효과. *** p <0.001, 대조 모둠과의 비교. p<0.05, p<0.01, ESC 모둠과의 비교. 일방향 편차 분석 후 투키스 사후(post-hoc) 검정.
도 10: 세포주 SH-SY5Y에서의 글루탐산으로 유도된 흥분 독성에 대한 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 신경 보호 효과. SH-SY5Y 세포는 여러 농도의 화합물 3(1.8-60 μmol/L)으로 24시간 동안 처리하고 그 다음 배지를 다시 상기 화합물 및 글루탐산 60 mmol/L을 함유하는 새로운 배지로 교체했다. 대조 모둠: 처치하지 않은 세포(NT) 및 글루탐산 (Glut). 생존성은 MTT 시험으로 측정했다. 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트는 7.5 및 15 μmol/L 농도에서 글루탐산에 의해 유발되는 세포 사멸을 유의적으로 줄였다. 각 막대는 평균값±SEM을 가리킨다. n = 3. p<0.05일 때 통계적으로 유의한 차이로 간주했다.
도 11: 여러 모둠의 동물들의 최종 점수(0-120분)로 나타낸, 카인산의 icv( intraceverbrventricular) 투여에 의해 유도된 발작에 대한 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 신경 보호 효과. 막대는 평균값±SEM을 가리키고, 모둠 당 n = 7이다. * p<0.05; ** p <= .001. 대조 모둠과의 비교. 일방향 편차 분석 후 투키스 사후(post-hoc) 검정. p<0.05의 값을 통계적으로 유의한 차이로 간주했다.
도 12: 효소 없이 pH 1.2, pH 7.5, 그리고 18시간 동안 pH 1.2에서 7.5로 변화시키면서의 화합물: (N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 ) 및 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 제제 1 정제의 방출 프로파일.
도 13: 효소 없이 pH 1.2, pH 7.5, 그리고 18시간 동안 pH 1.2에서 7.5로 변화시키면서의 화합물: 6-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}헥산산)( 2 ) 및 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 제제 2 정제의 방출 프로파일.
도 14: 효소 없이 pH 1.2, pH 7.5, 그리고 18시간 동안 pH 1.2에서 7.5로 변화시키면서의 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 제제 3 정제의 방출 프로파일.
도 15: 스코폴라민의 급성 투여(1.5 mg/kg, ip)로 유도된 기억상실에 대한 Y-미로 시험에서의 화합물 3 단일 용량(7.2 mg/kg) 비강 내 투여의 영향. 막대는 새로운 가지에서 보낸 시간의 평균값±SEM을 나타내고, n=10마리/모둠이다. *** p <0.001; 식염수 대조 모둠 및 담체 모둠과의 비교. p <0.01, ESC 모둠과의 비교. 단순 ANOVA 검정 후 투키스 다중 비교 검정.
도 16: 스코폴라민의 급성 투여(1.5 mg/kg, ip)로 유도된 기억상실에 대한 사물 구별 시험에서의 화합물 3 단일 용량(74 μg/kg) 비강 내 투여의 영향. 막대는 분별 지수의 평균값±SEM을 나타내고, n=10마리/모둠이다. *** p <0.001; 식염수 대조 모둠 및 담체 모둠과의 비교. p <0.001. 스코폴라민 모둠과의 비교. 단순 ANOVA 검정 후 후 투키스 다중 비교 검정.
하기 실시예는 화학식 1의 화합물 3개에 대해 만들어졌으며, 그것은 어떤 방식으로든 본 발명을 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다.
실시예 1: 제제 1의 화합물 (N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌(( 1 )의 래트 간으로부터 분리된 미토콘드리아에서의 막 전위, 종창 및 반응성 산소종의 생산에 대한 영향 평가
래트 미토콘드리아 분리: 수컷 위스타 래트의 간을 차등 원심분리하는 전통적인 방법으로 미토콘드리아를 분리했다(Mirandola SR, et al., in J Neurosci Res 2010; 88: 630-39).
배양 공정: 30℃에서, 125 mmol/L의 자당, 65 mmol/L의 KCl 및 10 mmol/L의 HEPES-KOH를 함유하는 pH 7.4의 표준배양 배지에서 미토콘드리아에 5 mmol/L의 숙신산칼륨염(추가로 2.5 μmol/L 로테논)으로 동력을 공급했다.
미토콘드리아 분석
미토콘드리아 막 전위 및 ROS를 형광 프로브로서 각각 사프라닌(safranin)(10μmol/L)(Zanotti A., and Azzone GF in Archives of Biochemistry and Biophysics 1980, 201 (1), 255-265) 및 암플렉스 레드(Amplex Red)(Molecular Probes, OR, Eugene)를 사용하여 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)(1IU/mL)(Votyakova and Reynolds, in J Neurochem. 2001, 79 (2), 266-77)의 존재 하에 분광광도법으로 측정했다. 히타치 형광 분광광도계, 모델 F-4500 (Tokyo, Japan)로 λexc 495 /λem 586 nm (사프라닌) 및 λexc 563/λem 587 nm(암플렉스 레드)에서 측정했다. 이 실험은 0.1 mmol/L의 EGTA의 존재 하에 수행되었고, 평가 화합물은 0.1 내지 100 μmol/L 농도 범위의 N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 )이었다. 미토콘드리아 종창은 히타치 분광광도계 모델 U-2910(Japan)을 이용하여 540 nm에서의 흡광도 감소로부터 분광 광도법으로 측정하였다.
데이터 분석: 모든 경우에, 데이터의 편차의 정상 분포 및 균일성을 콜모고로프 스미르노프 및 레벤 검정법(Kolmogorov Smirnov and Levene tests)을 각각 사용하여 평가했다. 미토콘드리아 기능성 변수의 비교는 스튜던츠 t-검정법을 이용하여 수행했다. 우리는 유의성 수준 0.05으로 작업하였고, Statistica 8.0 프로그램(StatSoft Ink)을 데이터 분석에 사용했다. 결과의 그래프 도식화는 GraphPad Prism 5.0 프로그램(GraphPad Software, California, USA)로 작업했다.
실시예 2. 스코폴라민의 급성 사용으로 유도된 기억 상실 모델에서의 화합물 메틸(2-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 항콜린성 조절 효과의 평가
동물
실험 동물 생산 국립센터(National Center for the Laboratory Animals Production)(CENPALAB, Cuba)에서 공급받은 어린 수컷 OF-1 마우스(20-25 g)를 이용했다. 실험 전에, 동물들을 실험실 환경에 7일간 적응시켰다(조절 온도 25±2℃, 상대습도 60±10% 및 12시간의 낮/밤 주기). 이 기간 동안 그리고 실험하는 동안, 동물들은 임의접근 가능한(ad libintum) 식수 및 센팔랩(CENPALAB)으로부터 공급받은 설치류용 표준 사료를 제공받았다. 모든 과정은 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 유럽 연합 가이드라인을 따라 수행되었고, 연구 동물 관리 위원회의 승인을 받았다. 일관된 데이터를 얻기 위해 필요한 최소한의 수의 동물과 관찰 기간을 이용했다.
실험 설계
적응 기간의 마지막에, 동물들을 그들의 체중에 따라 모둠 당 12마리인 다섯 모둠으로 무작위로 배정했다. 스코폴라민 브롬화수소산 수화물(ESC)(Sigma Aldrich)을 인지 상실을 유도하기 위해 사용하였는데, 그것을 생리식염수에 녹여 실험 30분 전에 1.5 mg/kg의 용량으로 복강 내(ip) 투여했다 (Miranda HF et al. in. J. Biomed. Sci., 2014 21 (1): 62-62). 사용된 화합물 3의 용량은 체중에 대해 0.1, 1, 10 및 20 mg/kg였다. 상기 화합물은 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 제제화했다. 투여 계획은 다음과 같이 설계되었다:
모둠 1(음성 대조 모둠)은 정상 인지 기능을 가짐. 30분 간격으로 2회 투여했는데, 각각 담체(5% CMC)를 경구투여하고, i.p. 경로로 식염수 용액을 투여.
모둠 2(양성 대조 모둠)는 인지 장애가 있음. 30분 간격으로 2회 투여했는데 첫 번째는 담체(5% CMC)로, 두 번째는 ESC 1 mg/kg을 투여.
모둠 3, 4, 5 및 6은 화합물 3을 처치함(0.1, 1, 10 및 20 mg/kg). 30분 간격으로 2회 투여했는데, 첫 번째는 각 모둠에 대응하는 용량으로 화합물 3을 투여했고, 두 번째는 ESC 1 mg/kg을 투여. 이 두 번째 투여 30분 후에 행동 평가를 수행했다.
행동 실험
Y 미로
미로 주변에 미로 밖(extra-labyrinthine) 길이 있는 Y-미로 행동 패러다임(길이 40cm x 너비 9cm x 높이 16 cm)을 이용하여, 새로운 공간에 대한 선호를 연구함으로써 단기 공간 기억력 연구를 수행했다. 실험은 2시간의 간격으로 구분된 2차의 시도로 구성된다. 첫 번째 훈련 시험(학습)에서, 마우스는 임의적으로 선택되는 가지(arm) 중 하나의 끝을 마주 보게 미로 가운데 놓였다. 자리에 놓인 뒤에, 그들은 가지 하나(새로운 가지)가 닫힌 미로를 10분 간 탐색할 수 있게 되었다. 이 실험의 마지막에, 마우스들은 두 번째 실험까지 그들의 원래의 우리로 돌아갔고(회복), 두 번째 실험에서 그들은 미로의 세 가지를 5분간 자유로이 탐색할 수 있었다. 비디오 녹화물로부터 각 가지에서 보낸 총 체류 시간(탐색)을 측정하고 분석했다. 가지로의 입장은 상기 가지로 동물의 네 다리가 들어갔을 때로 정했다. 학습된 과업의 회복 시험 동안 각 가지에서의 체류 시간(초)을 통계 분석에서 사용했다. 미로는 각 회차 사이에 70% 에탄올로 세척했다. 모든 마우스는 시험 최소 1일 전에 그들의 원래 우리의 행동 시험방으로 옮겨졌다. 실험은 8:00 am 및 12:30 pm 사이에 수행되었다.
모리스 물 미로 (Morris Water Maze, MWM)
실험은 2일간 진행되었다: 첫 날은 훈련, 둘째날은 시험. 모든 마우스는 실험 최소 1일 전에 그들의 원래 우리에서 행동 시험방으로 이동되었고, 시험은 8:00 am 및 12:30 pm 사이에 진행되었다. 동물들은 지름 120 cm, 깊이 51 cm에 물 온도 24±2 ℃인 풀에 방 안 각 사분면 벽과 외부 표지에 고-대비 시각 신호가 있는 1일차(D1)의 보이는 플랫폼에서 일련의 시험에서의 기준에 따라 훈련되었다. 훈련기는 보이는 플랫폼을 가지고 하는 4개의 시험(V1-V4)으로 구성되고, 마지막 시험이 습관화 후의 각자의 기본 탈출 지연 시간으로 간주되었다. 이것을 D1V4 (1일차, 보이는 플랫폼 시험 4회차)로 지칭했다. 동물의 훈련은 각 마우스들이 실험 사이에 동일한 간격을 가지도록, 즉 각 실험 사이가 30 ± 10분이도록 시차를 두었고, 각 시간에 무작위로 선택된 미로에서의 여러 위치로부터 시작했다. 보이는 플랫폼을 만들기 위해서, 탱크의 바닥에 대해 고-대비인 물체로 알아보게 했다. 1분 내에 탈출하지 못하는 동물들은 플랫폼으로 수동으로 인도했고, 치워지기 전 5-10초 동안 거기 머무르게 했다. 이어서, 그들을 말리고, 저체온증을 막기 위해 백열등으로 밝혀진 그들의 각 우리에 두었다. 마지막 보이는 플랫폼 실험 24시간 후에(D2), 이 동물들을 숨겨진 플랫폼을 가지고 하는 일련의 3번의 시험(T1-T3)에서 평가했다. 시험은 매 30분마다 수행되었으며, 각 시험의 기간은 최대 1분이었다. 모든 실험에서 플랫폼은 같은 자리에 있었다.
통계 분석
모든 데이터는 평균±평균의 표준오차(SEM)로 나타냈다. 모리스 물 미로 데이터는 두 가지로 분석했다. 훈련기의 보이는 플랫폼에서의 탈출 지연 시간은 2변수 ANOVA(처치 x 시도)를 이용하여 분석했다. 장기 기억력을 연구하기 위해, 보이는 플랫폼으로 한 훈련기의 마지막 탈출 지연 시간값(D1V4) 및 24시간 후에 수행된 숨겨진 플랫폼으로 한 시험의 첫 번째 값(D2T1)을 사용했다. 온전한 장기 기억력을 가진 마우스는 첫 번째 시험에서 빠르게 숨겨진 플랫폼에 닿을 것이다. D2T1-D1V4의 차이 및 D2T1/D1V4 비율을 가지고 점수 시스템을 만들었다. 성공한 개체에 대한 D2T1-D1V4 점수는 0에 가까워야 하며, D2T1/D1V4 점수는 약 1 또는 그 미만이어야 한다. 값이 더 높으면 24시간 후의 탈출 지연 시간이 더 길다는 것을 의미하며, 그것은 그 동물의 공간 수행력의 결함을 의미한다. 이 비교는 편차의 일방향 분석을 이용하고, 그 다음 투키스 사후(post-hoc) 검정법을 이용하여 이루어졌다. Y-미로 데이터의 분석도 또한 상기와 동일한 검정법으로 수행했다. p<0.05이면 통계적으로 유의한 차이로 간주했다. 통계 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPadPrism) 버전 5(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)를 이용해서 진행했다.
실시예 3. 스코폴라민의 급성 사용으로 유도된 기억 상실 모델에서의 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 전체 뇌 균질현탁액 내의 AChE 활성을 통한 항콜린성 조절 효과 평가
엘만(Ellman) 등에 의한 비색 분석법(Ellman GL, et al. In Biochem Pharmacol., 1961; 7: 88-95)에 따라 마우스 뇌의 AChE 활성을 측정하고 뇌 균질 현탁액 상층액에서의 효소 활성을 결정하도록 변용시켰다. 요약하면 그 과정은 다음과 같다: 행동 실험 끝에, 마우스들을 마취하고 머리를 잘라 빠르게 뇌를 적출하여, 그것을 얼음처럼 차가운 판 위에 두었다. 그것들을 무게를 재고, 160 mmol/L의 수크로스를 함유하는 pH 7.2의 차가운 10 mmol/L 트리스-HCl 완충액에서 균질화시켰다(1/10, w/v). 균질화물을 4℃에서 10,000 XG로 10분간 원심분리하고 결과로 나온 맑은 상층액을 효소원으로 사용했는데, 그것을 분배하고(모둠 당 n = 10) -20℃에서 보관했다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 엘만 시약(DTNB 10 mmol/L), 50 μL 균질 현탁액 및 10 μL 아세틸콜린 요오드화물(AChI, 20 mmol/L)을 이용하여 분석을 수행했다(최종 부피 200 μL). 5-티오-2-니트로벤조산 2가 음이온의 노란 가수 분해물(몰 흡광 계수 : 13,700 mol/L-1cm-1)의 흡광도를 412 nm에서 20분간 1분 간격으로 측정했다. AChE 활성 측정은 세 번씩 수행됐고, 단백질 mg 당 분당 가수분해 AchI의 nmol로 나타냈다. 단백질 농도는 변형 로우리(Lowry) 법으로 측정했다(Markwell MAK et al. In Anal. Biochem. 1978, 87 (1): 206-210).
통계 분석
모든 데이터는 평균±평균의 표준오차(SEM)로 나타냈다. 콜린에스테라제 활성값의 비교는 편차의 일방향 분석 후 투키스 사후 검정으로 수행했다. 통계 분석은 그래프패드프리즘 버전 5(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)를 사용해서 했다.
실시예 4. 스코폴라민 만성 사용에 의해 유도된 기억 상실 모델에서의 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 항콜린성 조절 효과의 평가
동물:
실험 동물 생산 국립센터(CENPALAB, Cuba)에서 공급받은 수컷 C57BL/6 마우스(20-25 g)를 사용했다. 실험하는 동안, 동물들은 임의 접근 가능한 식수 및 CENPALAB에서 공급받은 표준 사료를 급여받았다. 모든 과정은 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 유럽 연합 가이드라인에 따라 수행했고, 연구 동물 관리 위원회로부터 승인 받았다. 일관된 데이터를 얻기 위해 필요한 최소한의 수의 동물과 관찰 기간을 이용했다.
실험 설계
적응 기간의 끝에, 동물들을 그것의 체중에 따라 모둠 당 12마리씩 무작위로 5개의 실험 모둠으로 나눴다. 인지 결핍을 유도하기 위해 ESC(Sigma Aldrich)가 사용되었고, 그것을 생리식염수에 녹여 2주 동안 오전에 1.5 mg/kg의 용량으로 매일 복강 내(ip) 투여했다(Park JH, et al. In J Mol Neurosci. 2016; 59 (4): 579-589). 화합물 3을 0.5% 수용성 전분 용액(Merck Millipore)에 현탁액으로 준비하고, 위내 카눌라로 일일 용량을 체중의 0.1, 1, 10 mg/kg(0.01 mL/kg)으로 경구 투여했다. 실험 모둠은 다음과 같다:
모둠 1(음성 대조 모둠)은 정상 인지 기능을 가짐. 2주간 담체:0.5% 전분액 (경구) 및 생리식염수(i.p.)를 매일 투여.
모둠 2(양성 대조 모둠)은 인지 장애를 가짐. 2주간 ESC 1.5 mg/kg 및 담체(0.5% 전분액, 경구)를 매일 투여.
모둠 3, 4, 5는 ESC 투여 시작 4일 전에 화합물 3의 투여를 시작했다. 각 모둠의 동물들은 각각 0.1, 1 및 10 mg/kg 용량의 화합물 3을 경구 투여 처치했다. 2주 동안 매일 ESC(1.5 mg/kg)를 투여했다. 이 처치의 종결 시, 행동 평가를 시작했다.
모리스 물 미로(MWM): 실시예 2와 유사하게, 장기 공간 기억력을 평가하기 위해 2일의 MWM 시험을 이용했다. 이 경우에는 지름 1.35 m의 탱크가 사용되었기 때문에, 훈련기 동안 6회의 시험을 수행했고(D1V1에서 D1V6), 24시간 후에 세 번의 시험을 수행했다(D2T1 내지 D2T3). 이런 식으로 장기 공간 기억력을 D2T1/D1V6의 탈출 지연 시간값 비율로 결정했다.
통계 분석
장기 기억력 데이터 분석을 위해, 비제한적 실시예 2에 사용된 것과 유사한 통계적 절차를 그래프패드프리즘 버전 5 프로그램(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)의 도움을 받아 수행했다.
실시예 5. 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노) -4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 세포주 SH-SY5Y에서 글루탐산에 의해 유도되는 흥분 독성 손상에 대한 신경 보호 효과
화합물 3을 DMSO에 100 mmol/L의 농도로 녹이고, 이어서 분배하고 -20℃에서 보관했다. HEPES 완충액(25 mmol/L) 및 L-글루타민(2 mmol/L)를 함유하는 RPMI 1640 (1X) + 글루타맥스(GlutaMax) 배지(Gibco Laboratorios Life Technologies, Inc.; Rockville, MD, USA)에 10 % 우태혈청(FBS), 1% 피루브산 나트륨(100 mmol/L), 1% 페니실린 항생제 혼합물(10,000 U/mL), 스트렙토마이신(10 mg/mL), 1% 겐타마이신(10 mg/mL), 트립신-EDTA (0.25%) 및 인산염 완충 식염수(1X DPBS)를 보충했다. 3-(4,5-디메틸-2-티아조일)-2,5-디페닐테트라졸(MTT) 브롬화물, 디메틸설폭시드(DMSO) 및 글루탐산은 시그마사(Sigma Chemical Co.)(St. Louis, MO, USA) 제공.
세포 배양 : SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포(ATCC CRL-2266)를 HEPES 완충액(25 mmol/L) 및 L-글루타민(2 mmol/L)을 함유하고 10% 우태혈청(FBS)을 보충했으며, 미리 열로 불활성화하고, 1 mmol/L 피루브산 나트륨, 벤질페니실린 항생제 혼합물(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 들어간 RPMI 1640 배양 배지로 T-75 cm2 플라스크에서 키웠다. 추가로 겐타마이신(100 μg/mL)이 첨가되었고, 이후 완전 배지(CM)로 불렀다. 배양물을 5% CO2, 95% 공기 및 37℃ 온도의 습한 대기에서 배양했다. 매 2일마다 배지를 갈아주었고, 실험 작업 및/또는 이후 사용을 위한 새로운 세대의 세포의 2차 배양을 위해 트립신 처리를 통해 매 5일마다 4-5 x 106 세포/75 cm2 플라스크의 밀도로 세포를 2차 배양했다.
메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 ) 세포독성: SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포를 RPMI 1640 (CM) 배지에서 CO2 5% 및 공기 95%의 대기 하에서 37℃에서 배양했다. 그것들이 80-90% 사이의 군집이 되었을 때, 세포들을 떼어내기 위해 그것들을 0.25% 트립신 EDTA 혼합액(1mL/25cm2)으로 2-3분간 트립신화했다. 그 다음, 이 현탁액을 동일한 분량의 CM으로 중화시켰다. 이어서, 그것들을 112 X G로 8분간 원심분리하고, 상층액을 기울여서(decantation) 제거하고 침전물은 혈구계산기에서 셀 수 있도록 1 mL의 완전 배지에 재현탁시켰다.
일단 세포 밀도를 알게 된 후에, 그것들을 96-웰 배양 플레이트(각 웰 당 200 μL)에 80 x 104 세포/웰의 농도로 심고 24시간 배양한 후에, 각 웰로부터 100 μL의 상층액을 제거하고 이어서 여러 농도(0.93, 1.87, 3.75, 7.5, 15, 30, 60 및 100μmol/L)로 화합물 3이 CM 내에 마련된 100 μL을 첨가하고, 5% CO2, 95% 공기의 37℃ 조건에서 24시간 다시 배양했다. 배양 시간이 끝난 후에, 세포 생존율을 MTT 분석법으로 측정했다.
메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}} 에틸)디티오카바메이트의 글루탐산-유도 신경 괴사에 대한 신경 보호: 화합물 3의 신경 보호 효과를 평가하기 위해서, 세포주 SH-SY5Y를 군집화가 80-90% 사이에 이를 때까지 배양했고, 세포들을 트립신 처리하고 이어서 혈구계산기에서 수를 셌다. 세포 밀도를 알게 된 후에, 그것들을 80 x 104 세포/웰의 농도로 96-웰 배양 플레이트(각 웰 당 200 μL)에 심었다. 이어서, 5% CO2의 습한 환경에서 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에, 100 μL의 상층액을 각 웰에서 제거하고 완전 배지에 준비된 여러 농도의(0.93; 1.87; 3.75; 7.5; 15; 30; 60 μmol/L) 100 μL의 화합물 3을 첨가해서 5% CO2, 95% 공기의 조건에서 37℃에서 24시간 동안 다시 배양했다. 배양 시간이 종료된 후에, 100 μL의 상층액을 각 웰에서 제거하고 100 μL의 새로 준비된 화합물 3의 혼합물을 전날과 동일한 농도로 첨가하고 완전 배지 내에 새로 준비된 60 mmol/L의 글루탐산을 넣은 후에 5% CO2, 95% 공기의 조건에서 37℃에서 24시간 동안 다시 배양했다. 배양 시간 후에, 세포 생존율을 MTT 분석으로 결정했다.
세포 생존율 MTT 분석: 세포 생존율은 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H 테트라졸리움 브로마이드)의 효소 전환에서 생기는 포르마잔 청색 산물로 측정하는데, 그 효소는 살아있는 세포에서만 활성이 있다. 96-웰 플레이트에서 분석이 진행되었고, 세포들은 스트레스 유발자로서 글루탐산, 화합물 3 또는 둘 다에 여러 시간 및 농도로 노출되었다. 여러 가지 처리를 한 후에, 50 μL/웰의 MTT를 첨가해서(CM에 5 mg/mL로 새로 준비됨) 5% CO2, 95% 공기의 대기하에서 37℃에서 4시간 동안 배양했다. 그 다음 100 μL의 이소부틸알코올(SDS 10%, 2-부탄올 50%, 0.25 μL HCl 2 mmol/L)을 각 웰에 넣어 포르마잔 결정을 녹이고, 30분 내에 각 웰의 광학 밀도를 570 nm에서 클라리오스타(Clariostar) 분광광도계(BMG Labtech)로 측정했다. 690 nm에서 OD 값을 보정했다. 각 실험을 3번씩 반복했다. 글루탐산으로 처리하지 않은 세포 모둠에서 얻어진 광학 밀도 대비 각 실험 대상체들의 광학 밀도의 퍼센티지로 결과를 나타냈다.
실시예 6. 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 카인산의 icv 투여에 의해 유도된 발작에 대한 신경 보호 효과
실험 동물 및 모둠
실험 동물 생산 국립 센터(CENPALAB, Cuba)로부터 공급받은 어린 수컷 OF-1 마우스(20-25 g)를 사용했다. 실험을 수행하기 전까지의 동물들의 적응 및 유지는 비제한적 실시예 2에서 발전시킨 것과 유사하다. 마우스들을 5개의 실험 모둠(모둠 당 7마리)로 나누었고 다음과 같이 분포시켰다: 대조 모둠 (PBS 2 μL, icv), 발작 대조 모둠 (KA 2 μL, icv) 그리고 1, 5, 50 mg/kg의 용량으로 화합물 3(0.01 mL/kg)을 위 카눌라로 경구 투여 처치하고 KA 2 μL를 icv 투여한 3개 처치 모둠. 화합물 3은 5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 담체 내 현탁액으로 제조되었다. 화합물 3 및 대조 모둠에서의 담체 투여는 KA의 icv 주입 1시간 전에 수행했다. 모든 동물들은 0.5 mg/mL 농도로 PBS 내에 제조된 KA (Sigma Aldrich)를 투여받았다.
KA icv(intracerebroventricular) 투여
KA의 icv 투여를 위해, 마우스를 685.71 mg/kg의 클로랄 수화물(i.p.)로 마취하고, 이중 조작기에 두었다. 정위(stereotaxic) 구도로 하고 두개골을 노출시켰다. 외측 뇌실에 대한 정위 좌표를 다음과 같이 정확하게 측정했다: 전정(bregma) 및 배쪽 경막(ventral dura)에 대해 0 mmol/L에서 톱니 막대(tooth bar)를 가지고 전후 -0.8 mmol/L, 외측 ± 1.0 mmol/L 및 복배 -3.0 mmol/L. 두피 구멍(burr hole)을 정위 장치의 팔에 부착된 자동 미세천공기로 두개골에 뚫었다. 정위 장치의 다른 팔에 부착된 10 μL 28-게이지 해밀턴® 주사기를 이 구멍을 통과하여 넣고, 주사기의 피스톤을 수동으로 오른쪽 외측 뇌실로 낮추고, 그것의 내용물을 3분간 비워냈다.
행동 관찰
다음의 측정 기준을 사용하여 라신 등급에 따른(R.J. Racine, in Clin. Neurophysiol. 1972, 32 281-294) 발작 점수를 매겼다: (1) 입과 얼굴의 움직임 부동; (2) 앞다리 신전 및/또는 꼬리 신전, 강직 자세; (3) 반복적인 움직임, 머리 흔들기; (4) 일어섬(steepness) 및 떨어짐; (5) 지속적인 섰다가 떨어짐; (6) 중증의 강직-간헐(간대성) 경련 발작; (7) 사망. 각 동물은 2명의 독립적인 관찰자가 관찰했고, 행동은 2시간 동안 정량 평가했다. 이 시간 간격 동안 각 동물에 대해 누적된 점수의 합을 통계 분석에서 사용했다.
통계 분석
모든 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)으로 나타냈고, 차이의 일방향 분석 후 투키스 사후 검정을 이용하여 분석했다. 모둠 간의 비교를 위해서 카인산 icv 투여 2시간 후의 각 실험 모둠에 대해 누적된 점수의 평균을 사용했다. p<0.05를 통계적으로 유의한 차이로 간주했다. 통계 분석은 그래프패드프리즘 버전 5(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA) 이용하여 진행했다.
실시예 7. 활성 성분 N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 ) 및 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC) 정제를 제조하기 위한 조제식 1
조제식에서 필요한 양에 따라 모든 성분의 무게를 달았다. 활성 성분 및 중합체 매트릭스는 40번 메시 체로 체질하고, 이어서 30 rpm으로 5분간 혼합했다. 그 다음, 매 15분마다 나머지 성분들을 균질한 혼합물이 생성될 때까지 50 rpm의 속도로 첨가했다. 그 다음 혼합물을 편평하고, 모서리가 경사지고, 홈이 패이지 않은 틀을 이용하여 고속 회전 기계에서 압착하였다.
만들어진 정제는 매끄럽고 일정하며, 중량 편차는 1% 미만, 적당한 강도(4.51 ± 0.37 kgf), 좋은 내마모성, 적당한 붕해 시간을 가지고, 활성 성분의 함량은 90 내지 110%로 확인되었다.
연구 중 친수성 매트릭스로부터의 활성 성분의 방출 프로파일의 통계적 처리는 95%의 신뢰도로 오리진 5.0 소프트웨어를 가지고 수행했다.
정제 당 제조 조제식 1:
성분 중량 (mg) %
활성 성분 10 10
HPMC 25 25
유당 수화물 9 9
전분 21 21
미결정 셀룰로오스 32 32
이산화규소 1.5 1.5
스테아린산 마그네슘 1.5 1.5
정제 중량(mg) 100 100
실시예 8. 활성 성분 N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 ) 및 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트(( 3 )의 히드록시프로필셀룰로오스(HPC)의 정제를 제조하기 위한 조제식 2
조제식에서 필요한 양에 따라 모든 성분의 무게를 달았다. 활성 성분 및 중합체 매트릭스는 40번 메시 체로 체질하고, 이어서 30 rpm으로 5분간 혼합했다. 그 다음, 매 15분마다 나머지 성분들을 균질한 혼합물이 생성될 때까지 50 rpm의 속도로 첨가했다. 그 다음 혼합물을 편평하고, 모서리가 경사지고, 홈이 패이지 않은 틀을 이용하여 고속 회전 기계에서 압착하였다.
만들어진 정제는 매끄럽고 균일한 형태에, 중량 편차는 1% 미만, 적당한 강도(4.51 ± 0.37 kgf), 좋은 내마모성, 적당한 붕해 시간을 가지고, 활성 성분의 함량은 90 내지 110%로 확인되었다.
연구 중 친수성 매트릭스로부터의 활성 성분의 방출 프로파일의 통계적 처리는 95%의 신뢰도로 오리진 5.0 소프트웨어를 가지고 수행했다.
정제 당 제조 조제식 2:
성분 중량 (mg) %
활성성분 10 10
히드록시프로필셀룰로오스 (HPC) 30 30
유당 수화물 8 8
전분 20 20
미결정 셀룰로오스 30 30
이산화규소 1 1
스테아린산 마그네슘 1 1
정제 중량 (mg) 100 100
실시예 9: 활성 성분 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 유드라짓 및 유당 정제를 제조하기 위한 조제식 3
조제식에서 필요한 양에 따라 모든 성분의 무게를 달았다. 활성 성분 및 중합체 매트릭스는 20번 메시 체로 체질하고, 이어서 30 rpm으로 5분간 혼합했다. 그 다음, 매 15분마다 나머지 성분들을 균질한 혼합물이 생성될 때까지 50 rpm의 속도로 첨가했다. 그 다음 혼합물을 편평하고, 모서리가 경사지고, 홈이 패이지 않은 틀을 이용하여 고속 회전 기계에서 압착하였다.
만들어진 정제는 매끄럽고 균일한 형태에, 중량 편차는 1% 미만, 적당한 강도(5.01 ± 0.68 kgf), 좋은 내마모성, 적당한 붕해 시간을 가지고, 활성 성분의 함량은 90 내지 110%였다.
연구 중 친수성 매트릭스로부터의 활성 성분의 방출 프로파일의 통계적 처리는 95%의 신뢰도로 오리진 5.0 소프트웨어를 가지고 수행했다.
정제 당 제조 조제식 3:
성분 중량 (mg) %
활성 성분 10 10
유드라짓 RS PO 39 39
유당 수화물 40 40
미결정 셀룰로오스 9 9
이산화규소 1 1
스테아린산 마그네슘 1 1
정제 중량 (mg) 100
실시예 10: 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )의 비강용 제제
A 용액: 화합물 3이 PEG 400, 토코페롤 및 글리세롤에 용해되었다.
B 용액: HPMC를 물의 40%에 재현탁하여 전체적으로 완전히 녹을 때까지 저어주고 열(80℃)을 가한다.
C 용액: 물의 60%에, 염화 벤잘코늄, NaH2PO4, Na2HPO4, NaCl, EDTA, 및 트윈 80을 녹인다. pH가 6.3으로 유지되는지 확인한다.
B 용액 및 C 용액을 그 다음 합쳐서 균질한 용액이 될 때까지 저어준다. 그 다음 A 용액을 천천히 이 용액에 넣고 저어주며, 마지막으로 0.2 μmol/L 막으로 여과한다.
성분 농도(mg/mL)
활성성분(화합물 3) 6
PEG 400 3
HPMC 5
염화 벤잘코늄 0.2
NaH2PO4 2
Na2HPO4 0.7
NaCl 7.4
트윈 80 0.25
EDTA 0.15
글리세롤 5
물 최종 부피 1 mL로 맞춤
실시예 11: N-[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]-β-알라닌( 1 )의 비강용 제제
A 용액: 화합물 1을 PEG 400, 토코페롤, 및 글리세롤에 녹인다.
B 용액: HPMC를 물의 40%에 재현탁하여 전체적으로 완전히 녹을 때까지 저어주고 열(80℃)을 가한다.
C 용액: 60%의 물에, 염화 벤잘코늄, NaH2PO4, Na2HPO4, NaCl, EDTA, 및 트윈 80을 녹인다. pH가 6.3으로 유지되는지 확인한다.
B 용액 및 C 용액을 그 다음 합쳐서 균질한 용액이 될 때까지 저어준다. 그 다음 A 용액을 천천히 이 용액에 넣고 저어주며, 마지막으로 0.2 μmol/L 막으로 여과한다.
성분 농도 (mg/mL)
활성성분 화합물 1 6
PEG 400 3
CMC 5
염화벤잘코늄 0.2
NaH2PO4 2
Na2HPO4 0.7
NaCl 7.4
토코페롤 0.1
트윈 80 0.2
EDTA 0.1
글리세롤 5
물 최종 부피 1 mL로 맞춤
실시예 12: 조제된 제제 1, 2, 3의 용해 프로파일 연구
쿠바 표준(CECMED: Validation of Analytical Methods. Regulation No. 41. Havana: CECMED; 2007) 및 미국 약전(USP 36, Rockville: Mack Printing, New York 2013, p 3220- 3221)의 내용을 감안하여 용해 연구를 수행했다.
조제식의(실시예 7, 8, 9) 각 배치에서 20개의 정제의 중량을 확인했다. 그것들 모두 허용된 정제의 중량값 범위 내에 있었고, 그것들에 대해 선택한 매트릭스의 약물 방출 프로파일을 초기 조제식과 관련된 오류 없이 측정했다.
방출 프로파일 측정의 수단:
매질 1 - 효소 없는 모조 위액 pH 1.2 ± 0.05
2 g의 NaCl(분석용으로 정제됨)을 무게를 달고 1000 mL 플라스크에서 7 mL의 HCl에 녹인다. 플라스크에 표시선까지 증류수를 채운다. 용액의 pH는 1.2이다.
매질 2 - 효소 없는 모조 장액 pH 7.5 ± 0.1
6.8 g의 일염기 칼륨 인산염의 무게를 달고 1000 mL 부피 측정 플라스크로 옮긴다. 그 다음, 250 mL의 물을 넣어 고체를 녹이고, 190 mL의 0.2 N NaOH 용액과 400 mL의 2차 증류수를 넣는다. 마지막으로, 2차 증류수로 1000 mL까지 맞춘다. 용액의 pH를 0.2 N NaOH을 이용하여 7.5 ± 0.1의 pH로 조정한다.
과정:
각 정제를 용해 장치(Distek, Evolution 6100 모델)에 600 mL의 용해 매질-1과 함께 넣고, 37±0.5℃에서 60분간 30 rpm으로 교반한다. 실험 매질의 일부를 실험 5, 15, 30 및 50분에 즉시 0.45 μmol/L 필터로 여과했다.
이어서, 용해 매질-1을 용해 장치로부터 빼내고, 600 mL의 용해 매질-2로 교체하여 추가적인 8시간 동안 37±0.5℃의 온도에서 30 rpm으로 교반했다.
5 내지 1080분에 시료 채취를 하고, 시료는 즉시 0.45 μmol/L 필터로 지시된 시간에 여과했다.
각 용해 매질 내의 시료 용액의 흡광도 값을 정해진 최대 흡광 파장에서 구했다. 제제화된 화합물을 정량하기 위해서, UV-Vis 분광 광도 표준화 곡선(λmax)을 농도 범위 0.025 내지 0.150 mg/mL에서 만들었고, 조정 공백(용해 매질)을 사용했다.
얻어진 데이터의 분석에 따르면, 사용된 방법론은 분석 방법론이 요구하는 직선성의 변수(R> 0.999), 정밀성(재현성 및 반복성) 및 정확성과 부합하여, 이 연구에서 사용된 농도 범위 및 실험 조건에서 정확하고 확실한 결과를 얻을 수 있게 한다.
실시예 13. 스코폴라민의 만성 사용에 의해 유도된 기억 상실 모델에서의 비강으로 투여된 화합물 메틸(2-{[4-(1-나프틸아미노)-4-옥소부타노일]아미노}에틸)디티오카르바메이트( 3 )(실시예 10에 따른 제제)의 항콜린성 조절 효과 평가
동물
실험 동물 생산 국립 센터(CENPALAB, Cuba)에서 공급받은 수컷 C57BL/6 마우스(20-25g)를 사용했다. 실험을 진행하기 전까지 동물을 적응시키고 관리한 조건은 비제한적 실시예 4에서 발전시킨 것과 유사했다.
실험 설계
적응 기간의 마지막에, 동물들을 각 10마리씩 4개의 실험 모둠으로 체중에 따라 무작위로 배정했다: 2개의 건강한 대조 모둠은, 하나는 비강 경로로 담체를 투여(G1), 다른 하나는 ip로 식염수를 투여(G2); 아픈 대조 모둠은 비강으로 식염수를 투여한 후에 식염수에 녹인 ESC를 투여(1.5 mg/kg, ip)(G3); 그리고 처치 모둠은, 비제한적 실시예 10의 제조법에 따라 준비된 화합물 3을 투여받고 15분 후에 ESC를 투여(1.5 mg/kg, ip)(G4). 이 실험은 두 개의 행동 모델: 숨겨진 가지 양상의 Y-미로 및 사물 구별 모델에서의 화합물 3의 비강 제제의 효과를 연구하기 위해 앞서 설명된 것과 동일한 조건에서 2개의 실험을 수행했다. 여기서, 총 60마리의 동물들이 사용되었다.
비강 투여를 위해서, 이전에 설명된 방법론을 따랐다(Hanson, L.R., et al. inJ. Vis. Exp. 2013 (74), e4440, doi: 10.3791 / 4440). 요약하면, 오른손으로 목을 늘이고 반듯하게 누운 자세로 마우스 머리를 고정하고, 이어서 자동 피펫에 6 μL의 약물 또는 담체를 장전했다. 피펫의 팁을 왼쪽 콧구멍 가까이 두고 약 3 μL의 피펫 내용물을 방출시켰다. 2-3초 뒤에, 동일한 과정을 동일한 콧구멍에 반복했다. 이 과정의 끝에, 동물을 누운 자세로 유지시키고, 이번에는 동일한 과정을 오른쪽 콧구멍에서 반복했다. 완료되면, 마우스를 그의 우리에 넣고, 2분 뒤에, 양 콧구멍에 추가 도포 했다. 이 시스템에서, 동물들은 세 번 고정되고, 총 부피 30 μL가 도포되는데, 체중에 대해 7.2 mg/kg의 용량의 화합물 3에 해당한다. 마지막 투여가 끝나고 15분 후에, 각 동물은 i.p.로 1.5 mg/kg의 ESC 또는 그것의 담체(식염수)를 투여받았고, 30분 후에 행동 실험을 수행했다.
행동 실험
Y 미로
팀 주변에 미로 밖 길이 있는 Y-미로 행동 패러다임(길이 40 cm x 너비 9 cm x 높이 16 cm)을 사용하여, 해마에 의존하는 공간 기억의 인지를 평가하기 위해, 새로운 공간에 대한 선호도 연구를 통해 단기 공간 기억력 연구를 수행했다. 실험은 비제한적 실시예 2에서 설명된 것과 동일한 프로토콜을 따라 진행했다. 실험은 오전 8시 및 오후 12시30분 사이에 진행되었다.
사물 구분
사물 인지 시험(Object Recognition Test, ORT)은 CNS 질병의 설치류 모델에서 학습 및 기억력, 특히 인지 기억력의 다양한 측면을 조사하기 위해 널리 사용되는 행동 실험이다. 사용되는 프로토콜은 3상으로 구성된다: 첫 번째 습관화상(1일), 두 번째 친숙화상(2일), 그리고 마지막으로 시험상(3일). 모든 상은 5분간 지속되고 연속 3일간 수행된다. 첫 번째 상에서 동물들은 플렉시글라스 상자(25 cm x 25 cm x 25 cm) 안에 놓였다. 비디오 카메라를 이용하여 동물들의 행동을 녹화했다. 이 첫 번째 날, 환경에 익숙해지도록 실험 30분 전에 동물들을 실험방으로 데려다 두었다. 마우스들은 그 다음 5분간 물체 없는 상자를 자유로이 탐색할 수 있었다. 두 번째 날에는 각 마우스가 훈련 시험을 거치는데, 거기서 동일한 시간에 가장 가까운 모서리로부터 동일한 거리의 상자 안 2개의 반대 위치에 2개의 동일한 물체가 놓였다. 이 상 동안, 마우스들은 똑같은 물체들을 5분간 탐색할 수 있었으며, 그 다음 그들의 쉼터 우리로 돌아왔다. 시험상 동안(3일차) 동물들은 동일한 상자 안에 다시 놓이는데, 거기에서 두 개의 익숙해진 물체 중 하나가 이 상 전에 새로운 것으로 바뀌었다. 이 연구에서 사용된 모든 물체는 모양과 색이 다르고 크기는 같았다. 그것은 이동을 막기 위해 상자 바닥에 고정되었다. 후각 신호의 존재를 피하기 위해, 전체 상자 및 물체는 각 실험 후에 늘 70% 알코올로 닦아냈다. 유사한 것으로부터 새로운 물체를 구분하는 능력은 물체를 탐색하기 위해 필요한 시간을 통해 관찰되었다. 사물 탐색 시간은 동물이 사물로부터 2cm의 거리에서 그의 코를 사물로 향하거나, 냄새를 맡거나 또는 그것을 차는 기간으로 정의했다. 사물 위에 앉거나 서는 것은 탐색으로 간주하지 않았다. 탐색 시간은 스마트 비디오 소프트웨어를 이용하여 수동으로 분석했다. 분별지수(ID)를 다음과 같이 계산했다.
ID = 새로운 물체 탐색 시간/새로운 물체 탐색 시간 + 친숙한 물체 탐색 시간.
통계 분석
모든 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 나타냈고, 변이의 일방향 분석 후 투키스 사후 검정법을 사용하여 분석했다. p<0.05를 통계적으로 유의한 차이로 간주했다. 통계 분석은 그래프패드프리즘 버전 5(GraphPad Software, Inc., San Diego, USA)를 사용하여 수행했다.

Claims (10)

  1. a. 화학식 1의 다중 표적 화합물,
    [화학식 1]

    여기서:
    R1: -알킬레닐-C(O)NH-알킬레닐- R3, -알킬레닐-C(O)O-R4;
    R3: -COOH, -OH, -SH, -NH2, -NH-알킬-, -NH-알킬레닐-NH2, -NH-알킬레닐-NH-C(O)-알킬레닐-S-R5, -NH-디티오카르바메이트-알킬, -N-알킬-디티오카르바메이트 알칼리토금속염; 또는 앞서 언급된 그룹의 약학적으로 허용가능한 염;
    R4: 숙시니미딜기;
    R5: -H, -C(O)-알킬, -C(O)-C6H5; 및
    R2: -H,-알킬이고,
    여기서 "알킬"이라는 용어는 포화 탄소 원자 및 수소 원자의 선형 또는 가지형 지방족 사슬인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 메틸 또는 에틸임; "알킬레닐"이라는 용어는 선형 또는 가지형 알킬기의 2가 유사체를 가리키며, 바람직하게는 메틸레닐(-CH2-), 에틸레닐(-CH2CH2-) 또는 프로필레닐(-CH2CH2CH2-)임; 및
    b. 화학식 1의 활성 성분을 조절방출하기 위해 실질적으로 작용하는 중합체매트릭스;를 포함하는 조절 방출 경구용 약학 조성물로서,
    상기 조성물은 그것의 사용 환경에서 활성 성분의 방출을 2시간 내지 24시간 동안 유지하고; 6 내지 18시간 사이의 용해율이 80%이며, 24시간 내에 90% 넘게 용해되는 것인 조절 방출 경구용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 1 mg 내지 100 mg의 활성 성분이 5% w/w 내지 80% w/w 비율인, 바람직하게는 10% w/w 내지 70% w/w 비율인 중합체 매트릭스 내에 함유된 정제로서 상기 중합체는 폴리에틸렌 산화물, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(CCNa), 셀룰로오스 유도체, 유드라짓 RS PO 및 폴리비닐피롤리돈, 또는 그것들의 조합의 모둠으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조절 방출 경구용 약학 조성물.
  3. a. 화학식 1의 다중 표적 화합물
    [화학식 1]

    여기서:
    R1: -알킬레닐-C(O)NH-알킬레닐-R3, -알킬레닐-C(O)O-R4;
    R3: -COOH, -OH, -SH, -NH2, -NH-알킬-, -NH-알킬레닐-NH2, -NH-알킬레닐-NH-C(O)-알킬레닐-S-R5, -NH-디티오카르바메이트-알킬, -N-알킬-디티오카르바메이트 알칼리토금속염; 또는 앞서 언급된 모둠의 약학적으로 허용가능한 염;
    R4: 숙시니미딜기;
    R5: -H, -C(O)-알킬, -C(O)-C6H5; 및
    R2: -H,-알킬이고,
    여기서 "알킬"이라는 용어는 포화 탄소 원자 및 수소 원자의 선형 또는 가지형 지방족 사슬인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 메틸 또는 에틸임; "알킬레닐"이라는 용어는 선형 또는 가지형 알킬기의 2가 유사체를 가리키며, 바람직하게는 메틸레닐(-CH2-), 에틸레닐(-CH2CH2-) 또는 프로필레닐(-CH2CH2CH2-)임; 및
    b. 화학식 1의 활성 성분의 비강 내 체류 시간을 증가시키는 데 실질적으로 기여하는 생체 접착성 중합체;
    를 포함하는 비강용 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 제형이 약물의 신경 경로로의 효율적인 접근을 보장하는 것인 비강용 약학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 1회 용량 당 0.1 mg 내지 25 mg의 활성 성분을 함유하며; 상기 성분은 부형제에 0.05 내지 6%의 비율로 제제화되며; 상기 부형제는 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 메틸셀룰로오스(MC), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 폴리아크릴산의 유도체(카르볼), 또는 그것들의 조합의 모둠으로부터 선택되고; 그리고 10 내지 60 mPas의 점성을 가지는 것을 특징으로 하는 비강용 약학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 0.09 내지 1.8% 농도의 PEG; 0.05 내지 0.7% 농도의 CMC; 0.08 내지 1% 농도의 토코페롤; 0.007 내지 0.47% 농도의 염화 벤잘코늄, 0.003 내지 0.19% 농도의 EDTA 나트륨, 0.005 내지 0.04% 농도의 프로필파라벤, 또는 이들의 조합의 모둠으로부터 선택되는 항미생물 보존제: 및 3.5 내지 5.5% 농도의 글리세롤 및 0.17 내지 0.38% 농도의 트윈 80의 모둠으로부터 선택되는 습윤제: 또는 그것들의 조합을 포함하고, pH는 인산염 완충액으로 조정되어 5.5 내지 6.5 사이이며, 바람직하게는 6.3인 것을 특징으로 하는 비강용 약학적 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 0.09 내지 1.8% 농도의 PEG; 0.05 내지 0.7% 농도의 CMC; 0.08 내지 1% 농도의 토코페롤; 0.007 내지 0.47% 농도의 염화 벤잘코늄, 0.003 내지 0.19% 농도의 EDTA 나트륨, 0.005 내지 0.04% 농도의 프로필파라벤, 또는 이들의 조합의 모둠으로부터 선택되는 항미생물 보존제: 및 3.5 내지 5.5% 농도의 글리세롤 및 0.17 내지 0.38% 농도의 트윈 80의 모둠으로부터 선택되는 습윤제: 또는 그것들의 조합을 포함하고, pH는 인산염 완충액으로 조정되어 5.5 내지 6.5 사이이며, 바람직하게는 6.3인 것을 특징으로 하는 비강용 약학적 조성물.
  7. AD(Alzheimer's disease)에 존재하는 콜린성, 글루타민성 시스템, 미토콘드리아의 불균형 및 염증성 산화환원 시스템의 이상(disorder)에 대해 사용되기 위한 다중 표적 화합물의 약학적 조성물로서,
    상기 화합물은 화학식 1의 화합물들의 모둠으로부터 선택되고,
    [화학식 1]

    여기서:
    R1: -알킬레닐-C(O)NH-알킬레닐-R3, -알킬레닐-C(O)O-R4;
    R3: -COOH, -OH, -SH, -NH2, -NH-알킬-, -NH-알킬레닐-NH2, -NH-알킬레닐-NH-C(O)-알킬레닐-S-R5, -NH-디티오카르바메이트-알킬, -N-알킬-디티오카르바메이트 알칼리토금속염; 또는 앞서 언급된 모둠의 약학적으로 허용가능한 염;
    R4: 숙시니미딜기;
    R5: -H, -C(O)-알킬, -C(O)-C6H5; 및
    R2: -H,-알킬이고,
    여기서 "알킬"이라는 용어는 포화 탄소 원자 및 수소 원자의 선형 또는 가지형 지방족 사슬이고, 바람직하게는 메틸 또는 에틸임; "알킬레닐"이라는 용어는 선형 또는 가지형 알킬기의 2가 유사체를 가리키며, 바람직하게는 메틸레닐(-CH2-), 에틸레닐(-CH2CH2-) 또는 프로필레닐(-CH2CH2CH2-)이고, 여기서 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 표적 화합물의 약학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 1 mg 내지 100 mg의 활성 성분이, 5% w/w 내지 80% w/w 비율인, 바람직하게는 10% w/w 내지 70% w/w 비율인 중합체 매트릭스 내에 함유된 정제이고, 상기 중합체는 폴리에틸렌 산화물, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(CCNa), 셀룰로오스 유도체, 유드라짓 RS PO 및 폴리비닐피롤리돈, 또는 그것들의 조합의 모둠으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    AD(Alzheimer's disease)에 존재하는 콜린성, 글루타민성 시스템, 미토콘드리아의 불균형 및 염증성 산화환원 시스템의 이상에 대해 사용되기 위한 다중 표적 화합물의 약학적 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 1회 용량 당 0.1 mg 내지 25 mg의 활성 성분을 함유하고; 상기 성분은 부형제에 0.05 내지 6%의 비율로 제제화되며; 상기 부형제는 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시프로필셀룰로오스(HPC), 메틸셀룰로오스(MC), 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 폴리아크릴산의 유도체(카르볼), 또는 그것들의 조합의 모둠으로부터 선택되고; 10 내지 60 mPas의 점성을 가지는 비강용 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는
    AD(Alzheimer's disease)에 존재하는 콜린성, 글루타민성 시스템, 미토콘드리아의 불균형 및 염증성 산화환원 시스템의 이상에 대해 사용되기 위한 다중 표적 화합물의 약학적 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 0.09 내지 1.8% 농도의 PEG; 0.05 내지 0.7% 농도의 CMC; 0.08 내지 1% 농도의 토코페롤; 0.007 내지 0.47% 농도의 염화 벤잘코늄, 0.003 내지 0.19% 농도의 EDTA 나트륨, 0.005 내지 0.04% 농도의 프로필파라벤, 또는 이들의 조합의 모둠으로부터 선택되는 항미생물 보존제; 및 3.5 내지 5.5% 농도의 글리세롤 및 0.17 내지 0.38% 농도의 트윈 80의 모둠으로부터 선택되는 습윤제: 또는 그것들의 조합을 포함하고, pH는 인산염 완충액으로 조정되어 5.5 내지 6.5 사이이며, 바람직하게는 6.3인 것을 특징으로 하는
    AD(Alzheimer's disease)에 존재하는 콜린성, 글루타민성 시스템, 미토콘드리아의 불균형 및 염증성 산화환원 시스템의 이상에 대해 사용되기 위한 다중 표적 화합물의 약학적 조성물.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4225730C2 (de) 1992-08-04 2003-04-30 Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa Verfahren zur Herstellung von festen Arzneiformkörpern mit protrahierter 2-Stufen-Freisetzung
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US20040254146A1 (en) 2002-05-21 2004-12-16 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Carboxylate salts of galantamine and their pharmaceutical use
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CA2554959A1 (en) 2004-01-29 2005-08-11 Neuromolecular, Inc. Combination of a nmda receptor antagonist and a mao-inhibitor or a gadpf-inhibitor for the treatment of central nervous system-related conditions
US8039009B2 (en) 2004-06-17 2011-10-18 Forest Laboratories Holdings Limited Modified release formulations of memantine oral dosage forms
CA2588296A1 (en) 2004-11-24 2006-06-01 Neuromolecular Pharmaceuticals, Inc. Composition comprising an nmda receptor antagonist and levodopa and use thereof for treating neurological disease
WO2006121560A2 (en) 2005-04-06 2006-11-16 Adamas Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treatment of cns disorders
WO2007002497A1 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Envivo Pharmaceuticals, Inc. Method of treating neurological disorders using clotrimazole and derivatives thereof
CU23844B1 (es) 2009-04-17 2012-10-15 Ct De Neurociencias De Cuba Procedimiento de obtención de nuevos derivados de naftaleno para el diagnóstico in vivo de la enfermedad de alzheimer
CU20130027A7 (es) * 2013-02-28 2014-10-30 Ct De Neurociencias De Cuba Chaperoninas químicas como nuevos moduladores moleculares de la beta agregación proteica presente en las enfermedades conformacionales
CU24583B1 (es) * 2018-11-06 2022-02-04 Centro De Neurociencias De Cuba Nanopartículas de óxido metálicos conjugados con derivados de naftaleno como agentes de contrastes para la detección de placas amiloides por resonancia magnética (mri)

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