JP2005520570A - プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びエーテルアセテートの酵素分割 - Google Patents

プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びエーテルアセテートの酵素分割 Download PDF

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Abstract

グリコールエーテルアセテート、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートを、高い基質濃度においてヒドロラーゼを用いたエナンチオ選択的加水分解によって酵素分割することができ；いくつかの実施態様においてヒドロラーゼはリパーゼである。グリコールーエーテル、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルを、高い基質濃度においてアシル供与体の存在下でヒドロラーゼを用いたエナンチオ選択的エステル交換によって酵素分割でき；いくつかの実施態様においてヒドロラーゼはリパーゼである。

Description

本発明は生体触媒反応の分野である。本発明は、グリコールエーテル及びグリコールエーテルアセテートの酵素分割、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートの酵素分割に関する。
対掌体は、異なる空間配置を有する２つの異なる異性体の形態で存在できる不斉分子である。対称面を有さないので、対掌体はそれ自体の鏡像とは一致しない。２つの対掌体の形態で存在する分子はキラルであり、これは、それらが「左」手の形態と「右」手の形態で存在すると考えることができることを意味する。有機分子におけるキラリティの最大の原因は、４つの異なる置換基又は基に結合した四面体炭素の存在である。このような炭素はキラル中心、又は不斉中心と称される。不斉中心における原子の三次元配置（又は立体配置）を示す方法は、優先順位の最も低い基を仮想上の観察者から離して配向させた時の、基の優先順位の配列を見ることである。残りの３つの基の、優先順位の高いものから低いものへの配列が時計回りであれば、不斉中心は「Ｒ」（又は「Ｄ」）配置を有し；配列が反時計回りであれば、不斉中心は「Ｓ」（又は「Ｌ」）配置を有する。
対掌体は同じ実験式を有し、反応においては一般に化学的に同一である。しかし、対掌体は他の不斉化合物に対しては異なる化学反応性を示し、非対称な物理的障害に対しても異なる反応を示す。最も一般的な非対称障害は偏光である。
対掌体は、平面偏光を回転することができ；従って、対掌体は光学活性である。同一化合物の２つの異なる対掌体は平面偏光を反対方向に回転させる。従って、光は仮想上の観察者にとって左に、即ち反時計回りに回転されることができる（これは左旋性若しくは「ｌ」、又はマイナス若しくは「−」である）か、あるいは右、即ち時計回りに回転されることができる（これは右旋性若しくは「ｄ」、又はプラス若しくは「＋」である）。旋光性の記号（＋）又は（−）は、Ｒ、Ｓ記号表示に関連しない。２つのキラル対掌体の等量混合物はラセミ混合物又はラセミ体と称し、記号（＋／−）又は接頭語「ｄ，ｌ」によって右旋性の形態と左旋性の形態との混合物であることが表示される。ラセミ混合物は、等量の（＋）型及び（−）型が存在するので、ゼロの旋光性を示す。しかし、一般に、単一の対掌体の存在は光を一方向にのみ回転させ；従って、単一対掌体は光学的に純粋であると言われる。
光学的に純粋な化合物は、キラル出発原料として興味深い。１つの理由は、生体中の不斉分子は通常はそれらの可能なキラル型の一方の型だけで存在する。これに対して、キラル有機化合物を実験室で合成する場合には、合成反応（不斉触媒の不存在下における）は一般に両方のキラル型が等しい速度で生成され、生成物異性体の等モル混合物、即ちラセミ混合物が得られる。ラセミ混合物を２つの成分対掌体に分離することを分割と称するが、ラセミ混合物の分離はきわめて困難である（１つの方法は、ラセミ体と標準不斉化合物とを反応させ、異なる物理的性質を有する得られた生成物（ジアステレオマー）を分離し、次いで標準不斉化合物を除去することによる）。しかし、生体分子の三次元形状、即ち空間的配置はそれらの生物学的機能に極めて重要である。更に、同じ構造の対掌体は非常に異なる生物学的作用を有する場合がある。一例として、薬物サリドマイドはラセミ体として合成され、投与されたが、一方の対掌体のみが有効な制吐剤であり、他方の対掌体は催奇形物質として効力があった。悲劇的にも、このことは妊婦にラセミ体が投与された後にわかった。
従って、生物学的機能に関する分子（例えば薬物）の合成は、望ましい生物活性生成物を生じるであろう単一の対掌体から行うのが好ましい。例えば、キラル１，２−プロパンジオールは、心臓血管薬、抗ウィルス薬及び対掌体として純粋なクラウンエーテルの製造において有用である（非特許文献１）。これらの及び関連したキラル化合物はまた、キラルポリマーの出発原料、クロマトグラフィーマトリックスとして、又はＬＣ若しくはＮＭＲによるキラル酸の立体化学分析用の誘導体化試薬として役立つことができる。医薬及び農業への使用の他に、光学活性第二アルコール、特に不斉炭素含有フルオロアルキル基（例えば、トリフルオロメチル−）を有する光学活性第二アルコールは強誘電性及び反強誘電性液晶において興味深い材料である（特許文献１；特許文献２）。
光学的に純粋な化合物は化学的に合成できるが、不斉化学合成は、高価で且つ／又は環境に有害な触媒を必要とすることが多く；更に、このような合成は典型的には多工程であり、しばしば、所定の化学的性質の構造要件を含む基質に限定される。典型的な化学合成から得られる異性体又は対掌体の混合物は、化学的又は酵素的に分割される（即ち純粋な対掌体に分離される）ことができる。ラセミ体の化学的分割は前述の通りである。ラセミ体の酵素的分割は、基質としてのラセミ体の一方の異性体に対する、酵素の優先性及び選択性に依存する。その結果、主に、好ましい基質から生成物が形成され、好ましくない基質はほとんど元の異性体のまま残される。ラセミ体の一方の異性体に対する酵素の優先性は、エナンチオ選択性として知られる。対掌体混合物の速度論的分割を実施するためにエステラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼを使用することは公知である。しかし、対掌体の混合物のエナンチオ選択的分割は、酵素の選択のみならず、酵素基質の化学構造にも非常に左右される。従って、所定の基質又は一連の関連基質を分割するための酵素の最適な選択は、容易には予測されないが、可能性のある基質の化学構造を変えながら、種々の酵素を綿密にスクリーニングすることを必要とする。
いくつかのプロピレングリコールエーテル及び関連誘導体の酵素触媒分割のいくつかの例が、科学文献及び特許文献に記載されている。（±）−１−メトキシ−２−プロパノールの酢酸エステル及び酪酸エステルを含む、分割の困難な基質のエナンチオ選択的加水分解のためのスクリーニングが、最近文献記載された（非特許文献２）。著者らは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａからのリパーゼ・フラクションＢ（ＣＡＬ−Ｂ）が（Ｒ）−１−メトキシ−２−プロパノールアセテートのエナンチオ選択的加水分解を触媒し、９９％ｅｅ超の対応する（Ｓ）−アセテート及び（Ｒ）−アルコールを最大収率（５０％）で生成することを報告した。製造用規模の反応が、５．２８％（ｗ／ｖ）１−メトキシ−２−プロパノールアセテート（基質２０ミリモル、１．０ｍｇ／ｍｌの酵素５０ｍｇに基づいて計算）を用いて５０ｍｌの規模で実施されたらしい。アシル供与体として酢酸ビニルを用いた、ヘキサン中における２．７％（ｗ／ｖ）（±）−１−メトキシ−１−プロパノールのエナンチオ選択的アシル化は、（Ｒ）−１−メトキシ−２−プロパノールアセテートを９８％ｅｅ及び基質転化収率２０％で生成することが報告された（非特許文献２）。
ＣＡＬ−Ｂリパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ４３５）を用いた光学分割の別の例は、プロピオン酸ビニルを用いた４−イソプロピルオキシブタン−２−オールのエナンチオ選択的エステル交換による触媒反応であり、（Ｒ）−（＋）−４−イソプロピルオキシブタン−２−プロピオネートが生成される（特許文献１及び２）。エステルの化学的加水分解は、対応する（Ｒ）−アルコールを９５％ｅｅ超で生成した。
個々のプロピレングリコ−ルエーテル（例えば、プロピレングリコールフェニルエーテル又は１−フェノキシ−２−プロパノール）及びそれらの対応する酢酸エステル（例えば、プロピレングリコールフェニルエーテルアセテート又は１−フェノキシ−２−プロピルアセテート）は、多くのグループによる生体触媒分割の対象であった。３つの日本国特許文献が、細胞全体、それらの製剤、それらに由来するリパーゼによるラセミ体酢酸エステルの処理によって，（Ｒ）−及び（Ｓ）−１−アリールオキシ−２−アルカノールの両者を製造することを記載している（特許文献３、４及び５）。これらの特許に記載された研究の多くは後で出版された（非特許文献３）。更に、１−フェノキシ−２−プロパノールのブタン酸エステルの加水分解分割がＣＡＬ−Ｂ及び他のリパーゼを用いて研究された（非特許文献１）。１−フェノキシ−２−プロパノールの２−クロロエチルブタノエート及び他のアシル供与体によるエステル交換が、生体触媒分割における対掌体比及び平衡定数の計算用のコンピュータープログラムの開発に使用されている（非特許文献４及び５）。１−フェノキシ−２−プロパノール（約３％ｗ／ｖ）のエステル交換もまた、アシル供与体としてプロピオン酸ビニルを用いて、ポリマー活性化型の豚肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）によって示されている（非特許文献６）。
米国特許第６，２３９，３１６号 欧州特許出願公用第９９１１５１５４．９号 特開平３−２６２３７７号 特開平３−２６２３７８号 特開平３−２６２３７９号
Ｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ７：３１８１〜３１８６ Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ １１：４７８１−４７９０ Ｙａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１３３４〜１３３７） Ａｎｔｈｏｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ６：３０１５〜３０２２ Ｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ７：３１８７〜３１９２ Ｇａｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：３３８４〜３３９６。
しかし、酵素による加水分解又はアシル化によるエナンチオ選択的分割は、関連プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びそれらの対応する酢酸エステルのラセミ体に関しては報告されていない（これらの関連グリコールエーテルの代表的構成員としては以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：プロピレングリコールエチルエーテル、プロピレングリコ−ルｎ−プロピルエーテル、プロピレングリコールイソプロピルエーテル、プロピレングリコールｎ−ブチルエーテル、プロピレングリコールｔ−ブチルエーテル、及びそれらの対応する酢酸エステル）。プロピレングリコールメチルエーテル若しくはプロピレングリコールフェニルエーテル又は対応する酢酸エステルを高基質濃度で加水分解あるいはアシル化して、生成物を高エナンチオ純度及び高収率で形成することについては反応条件も記載されていない。
グリコールエーテル及びそれらの対応する酢酸エステル、詳細には、プロピレングリコール（又はアリール）エーテル及びそれらの対応する酢酸エステルは、商業的に実現可能な方法で分割することが特に困難であった。従って、酵素的であって、高収率で高分離度が得られ且つ迅速で経済的な、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びそれらの対応する酢酸エステルのラセミ混合物の分割方法を開発できれば有用であろう。
定義及び略語
本発明の理解を容易にするために、本明細書において使用した多数の略語、用語及びフレーズを以下に定義する。
「Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢ」は、ＣＡＬＢ又はＣＡＬ−Ｂと略す。
「酵素活性単位」は、Ｕと略す。
「対掌体過剰」は、ｅｅと略す。
「エナンチオ選択率」は、Ｅと略す。
「プロピレングリコールメチルエーテル」（１−メトキシ−２−プロパノール）は、ＰＭと略す。
「プロピレングリコールメチルエーテルアセテート」（１−メトキシ−２−プロパノールアセテート）は、ＰＭＡと略す。
「プロピレングリコールエチルエーテル」（１−エトキシ−２−プロパノール）は、ＰＥと略す。
「プロピレングリコールエチルエーテルアセテート」（１−エトキシ−２−プロパノールアセテート）は、ＰＥＡと略す。
「プロピレングリコールｎ−プロピルエーテル」（１−ｎ−プロピルオキシ−２−プロパノール）は、ＰｎＰと略す。
「プロピレングリコールｎ−プロピルエーテルアセテート」（１−ｎ−プロピルオキシ−２−プロパノールアセテート）は、ＰｎＰＡと略す。
「プロピレングリコールイソプロピルエーテル」（１−イソプロピルオキシ−２−プロパノール）は、ＰｉＰと略す。
「プロピレングリコールイソプロピルエーテルアセテート」（１−イソプロピルオキシ−２−プロパノールアセテート）は、ＰｉＰＡと略す。
「プロピレングリコールｎ−ブチルエーテル」（１−ｎ−ブチルオキシ−２−プロパノール）は、ＰｎＢと略す。
「プロピレングリコールｎ−ブチルエーテルアセテート」（１−ｎ−ブチルオキシ−２−プロパノールアセテート）は、ＰｎＢＡと略す。
「プロピレングリコールｔｅｒｔ−ブチルエーテル」（１−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−２−プロパノール）は、ＰｔＢと略す。
「プロピレングリコールｔｅｒｔ−ブチルエーテルアセテート」（１−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−２−プロパノールアセテート）は、ＰｔＢＡと略す。
「プロピレングリコールフェニルエーテル」（１−フェノキシ−２−プロパノール）は、ＰＰｈと略す。
「プロピレングリコールフェニルエーテルアセテート」（１−フェノキシ−２−プロパノールアセテート）は、ＰＰｈＡと略す。
「プロピレン系グリコールエーテル」又は「Ｐ系グリコールエーテル」又は「Ｐ系基質」は、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルを意味し、その例としては、前記化合物、ＰＭ、ＰＥ、ＰｎＰ、ＰｉＰ、ＰｎＰ、ＰｔＢ及びＰＰｈがあげられるがこれらに限定されない。この種の化合物は一般に、プロピレンオキシドを塩基性条件下でアルコール官能基を含む化合物と反応させることによって製造されるすべてのグリコールエーテルを含む。
「プロピレン系グリコールエーテルアセテート」又は「Ｐ系グリコールエーテルアセテート」又は「Ｐ系酢酸エステル基質」は、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートを意味し、その例としては、前記化合物、ＰＭＡ、ＰＥＡ、ＰｎＰＡ、ＰｉＰＡ、ＰｎＢＡ、ＰｔＢＡ及びＰＰｈＡがあげられるがこれらに限定されない。この種の化合物は一般に、主に、前に定義した「２−プロパノールの１−置換エーテル」化合物のＣ−２ヒドロキシル位における酢酸エステル誘導体を含む。
「プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル」は、ＰＧＡＥと略す。
「プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテート」は、ＰＧＡＥＡと略す。
「アシル化プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル」はアシル−ＰＧＡＥと略し、ＰＧＡＥＡを含む。
「酢酸ブチル」は、ＢＡと略す。
「酢酸４−エチルフェニル」は、ＥＰＡと略す。
「酢酸エチル」は、ＥｔＡと略す。
「トリクロロ酢酸エチル」は、ＥｔＣＡと略す。
「トリフルオロ酢酸エチル」は、ＥｔＦＡと略す。
「酢酸イソプロペニル」は、ＩＰＡと略す。
「酢酸ビニル」は、ＶＡと略す。
「メトキシ酢酸エチル」は、ＥＭＡと略す。
「酪酸２，２，２−トリフルオロエチル」は、ＴｆＥＢと略す。
「ジケテン」は、ＤＫと略す。
「プロピオン酸ビニル」は、ＶＰと略す。
「ラクチド」は、３，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２．５−ジオンである。
比「ｖ／ｖ」は、容量／容量である。
用語「異性体（ｉｓｏｍｅｒ）」は、分子式は同一であるが構造が異なる化合物を意味する。立体配置及び／又は立体配座のみが異なる異性体は、「立体異性体」と称する。用語「異性体」はまた、対掌体を意味するのにも用いる。
用語「対掌体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）」は、互いに鏡像の関係にあり且つ重ね合わせできない１つの分子異性体の１つを記載するのに用いる。対掌体を表す又は意味するのに使用する他の用語としては、「立体異性体」（キラル中心の回りの配置、即ち空間的配置が異なるため；対掌体はすべて立体異性体であるが、立体異性体は必ずしも全てが対掌体ではない）又は「光学異性体」（純粋な対掌体は光学活性（光学活性は、異なる純粋な対掌体が平面偏光を異なる方向に回転させる能力である）であるため）が挙げられる。対掌体は一般に、融点及び沸点のような物理的性質が同一であり、また分光特性も同一である。対掌体は、平面偏光との相互作用に関して及び生物活性に関して互いに異なる可能性がある。
記号表示「Ｒ」及び「Ｓ」は、キラル中心周囲の分子の絶対配置を示すのに用いる。この記号表示は、接頭語又は接尾語として表示することができ；それらは、ハイフンによって異性体から分離してもしなくてもよく；ハイフンでつないでもつながなくてもよく；それらは丸括弧で囲んでも囲まなくてもよい。
記号表示又は接頭語「（＋）及び（−）」は、化合物による平面偏光の回転の印を示すのに用い、（−）は、化合物が左旋性（左に回転）であることを意味する。（＋）が前につけられた化合物は右旋性（右に回転）である。
用語「ラセミ混合物」、「ラセミ化合物」又は「ラセミ体」は、１つの化合物の２つの対掌体の混合物を意味する。理想的なラセミ混合物は、（＋）対掌体の旋光性が（−）対掌体の旋光性を相殺するように、１つの化合物の両対掌体の５０：５０混合物であるものである。
用語「分割する」又は「分割」は、ラセミ混合物に関して使用する場合には、ラセミ体を２つの対掌体型（即ち（＋）及び（−）；（Ｒ）及び（Ｓ）型）に分離することを意味する。これらの用語はまた、ラセミ体の一方の異性体を生成物にエナンチオ選択的に転化することを意味することができる。
用語「対掌体過剰」又は「ｅｅ」は、一方の対掌体が他方の対掌体より多く生成された反応生成物を意味し、（＋）−及び（−）−対掌体の混合物に関して定義し、対掌体混合物の組成は、モル又は重量若しくは体積分率Ｆ(+)及びＦ(-)（Ｆ(+)及びＦ(-)の和＝１）として示す。対掌体過剰は、＊Ｆ(+)−Ｆ(-)＊として定義し、対掌体過剰％は１００×＊Ｆ(+)−Ｆ(-)＊によって定義する。対掌体の「純度」は、そのｅｅ又はｅｅパーセント値（％ｅｅ）によって記載される。
「精製対掌体」又は「純粋な対掌体」又は「分割（された）対掌体」又は「対掌体過剰の化合物」のいずれで表されても、これらの用語は、一方の対掌体の量が他方の対掌体の量より多いことを示すものである。従って、対掌体製剤に関しては、多い方の対掌体のパーセント（例えば、モル％又は重量％又は容量％）及び多い方の対掌体の対掌体過剰％の両方（又はいずれか）は、製剤が精製対掌体製剤であるかを判定するのに使用することができる。
異性体の「対掌体純度」は、精製対掌体の定性的又は定量的指標を意味し；典型的には、測定値はｅｅ又は対掌体過剰に基づいて表す。
用語「実質的に精製された対掌体」、「実質的に分割された対掌体」、「実質的に精製された対掌体製剤」は、一方の対掌体が他方の対掌体よりも多く含まれる製剤（例えば、光学活性でない出発原料、基質又は中間体に由来するもの）、より好ましくは、他方の対掌体が、対掌体又は対掌体製剤の２０％未満、より好ましくは１０％未満、更に好ましくは５％未満、更に好ましくは２％未満に相当する製剤を示すものとする。
用語「精製された対掌体」、「分割された対掌体」及び「精製された対掌体製剤」は、一方の対掌体（例えば、Ｒ−対掌体）が他方の対掌体よりも多く含まれる製剤（例えば、光学活性でない出発原料、基質又は中間体に由来するもの）、より好ましくは、他方の対掌体（例えば、Ｓ−対掌体）が製剤の３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満（例えば、この場合には、Ｒ−対掌体はＳ−対掌体を実質的に含まない）、更に好ましくは５％未満、更にいっそう好ましくは２％未満に相当する製剤を示すものとする。精製対掌体は他方の対掌体を実質的に含まずに合成でき、あるいは精製対掌体は立体的に好ましい方法で合成した後に分離工程を行うこともできるし、あるいは精製対掌体はラセミ混合物から得ることもできる。
用語「エナンチオ選択率」は、対掌体比とも称され、記号「Ｅ」で示され、酵素が、生成物ラセミ混合物中において他方の対掌体に比べて一方の対掌体をラセミ基質から生成する選択的能力を意味する。即ちエナンチオ選択率は、酵素が２つの対掌体を区別するの能力の尺度である。非選択的反応はＥが１であるが、Ｅが２０超の分割は一般に合成又は分割に有用であると考えられる。エナンチオ選択性は、当該対掌体間の転化速度の差に存在する。反応生成物は、対掌体の一方が濃縮された形で得られ；逆に、残留基質は他方の対掌体が濃縮されている。実際的には、対掌体の一方が大過剰で得られることが一般に望ましい。これは、ある程度の転化率で転化プロセスを終了させることによって達成される。
Ｅの計算は、３つの変数：出発原料の対掌体純度（ｅｅs）、生成物の対掌体純度（ｅｅp）、及び転化度（ｃ）のうち２つを測定することに基づく。次に、以下の３つの等式のうち１つを用いることができる（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ，ＵＴ ａｎｄ Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ，ＲＪ（１９９９）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｓｅｃｔｉｏｎ３．１．１；及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：７２９４〜７２９９（１９８２）から）：
Ｅ＝ｌｎ［１−ｃ（１＋ｅｅp）］／ｌｎ［１−ｃ（１−ｅｅp）］
Ｅ＝ｌｎ［（１−ｃ）（１−ｅｅs）］／ｌｎ［（１−ｃ）（１＋ｅｅs）］
Ｅ＝ｌｎ｛（１−ｅｅx）／［１＋（ｅｅs／ｅｅp）］｝／ｌｎ｛（１＋ｅｅx）／［１＋（ｅｅs／ｅｅp）］｝
用語「アシル供与体」は、酵素触媒及び基質の存在下においてエステルの形成を引き起こす、適当に反応する化合物を意味する。本発明において、基質はグリコールエーテル、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルであり、酵素触媒はヒドロラーゼ、好ましくはリパーゼ、更に好ましくはＣＡＬ−Ｂである。アシル供与体は、非活性化又は活性化アシル供与体を含む。非活性化アシル供与体の非限定的例としては、以下のものが挙げられる：プロピレングリコールメチルエーテルアセテート（ＰＭＡ）、プロピレングリコールエチルエーテルアセテート（ＰＥＡ）、プロピレングリコールｎ−プロピルエーテルアセテート（ＰｎＰＡ）、酢酸エチル（ＥＡ）、酢酸ブチル（ＢＡ）及びエチルフェニルアセテート（ＥＰＡ）。活性化アシル供与体の非限定的例は、活性化エステル（その例としては酪酸トリフルオロエチル、Ｓ−エチルチオ−オクタノエート、及びビアセチルモノ−オキシムアセテートが挙げられるがこれらに限定されない）、エノールエステル（酢酸ビニル、酢酸イソプロペニル及び酢酸１−エトキシビニル及びジケテンが挙げられるがこれらに限定されない）、及び無水物（無水酢酸、ラクチド及びコハク酸無水物）である。アシル供与体の非限定的例としては、酢酸ブチル（ＢＡ）、酢酸エチルフェニル（ＥＰＡ）、酢酸エチル（ＥｔＡ）、トリクロロ酢酸エチル（ＥｔＣＡ）、トリフルオロ酢酸エチル（ＥｔＦＡ）、酢酸イソプロペニル（ＩＰＡ）、酢酸ビニル（ＶＡ）、エチルメトキシアセテート（ＥＭＡ）、酪酸２，２，２−トリフルオロエチル（ＴｆＥＢ）、ジケテン（ＤＫ）、プロピオン酸ビニル（ＶＰ）、ＰＭＡ及びＰｎＰＡが挙げられる。
用語「収率」は、酵素触媒反応における生成物の製造を記載するのに用いる場合には、その反応において生成物に転化された基質の量を意味する。収率は、反応混合物中にもともと存在する基質の量に基づき、生成物に転化された基質のパーセント（％）である。用語「収率」は、酵素触媒反応において残留未転化基質の量を記載するのにも使用する。
用語「転化率」は、酵素触媒反応における生成物の製造を記載するのに使用する場合には、反応において生成物に転化された基質の割合又はパーセントを意味する。
用語「反応混合物」は、酵素が基質を生成物に転化させる反応を触媒する、酵素触媒と基質との組合せを意味し；２種以上の基質（例えば、ＰＧＡＥ及びアシル供与体）又は２種以上の生成物（例えば、ＰＧＡＥＡ及びＰＧＡＥ）が存在することもできる。追加成分も反応混合物中に存在できる。
用語「反応マトリックス」は、酵素触媒の存在を含まない反応混合物を意味し；従って、マトリックスは、酵素触媒が除かれた反応混合物であることができ、又は酵素触媒以外の反応混合物成分の組合せであることができる。
用語「反応媒体」は、酵素触媒及び少なくとも１種の基質が混ぜ合わされた（例えば、溶解又は懸濁又は混合された）溶液を意味する。媒体は、水性であることができ（好ましくは緩衝化されている）、又は水の他に溶媒を含むか、本質的に水の代わりの溶媒を含むこともできる。この溶媒は水中に可溶性でも不溶性でもよい。溶媒は、単一化合物でもよいし、いくつかの化合物の組合せでもよい。反応媒体中の溶媒の量は、ゼロ〜媒体の約１００％であることができる。
用語「二相反応媒体」は、水相と、水相とは不混和性で且つ基質（それ自体が溶媒である）に加えて存在する溶媒を含んでなる反応媒体を意味し；従って、二相反応媒体は、２相に分離する２種の不混和性溶媒を含んでなる。典型的には、このような反応媒体は、水相（一般には緩衝化されている）及び水相への溶解性が限られた有機溶媒を含んでなる。水相は極めて少なくすることができる（総反応混合物容量の約３％よりわずかに多く含むだけでよい）。
用語「非プロトン性］又は「非水」は、反応媒体に関して使用する場合には、水相を実質的に含まず（水相が総反応混合物容量の約３％又はそれ以下であるような）、且つ好ましくは無極性である少なくとも１種の溶媒（好ましくは、このような溶媒は有機溶媒である）を含んでなる反応混合物を意味する。
反応媒体に関して使用する用語「補助溶媒］は、基質及び生成物それら自体が溶媒である場合には、非基質溶媒及び非生成物溶媒を意味する。
用語「酵素触媒」は、基質を生成物に転化できる酵素を意味する。基質はエナンチオ選択的に生成物に転化されるのが好ましい。
用語「有効量」は、酵素に関して使用する場合には、基質が適度な時間内に適度なレベルで生成物に転化されるように反応を触媒する、反応混合物中に存在する酵素の量を意味する。ラセミ混合物に関する、生成物へのエナンチオ選択的基質転化の適度なレベルは、生成物又は残留生成物の目的収率及び目的純度によって決定されるであろう。典型的には、収率は目的生成物の約３０〜５０％の範囲であり（反応転化率が基質の８０％に近い場合でさえ）、純度は約７５％ｅｅ〜ｅｅ９９％ｅｅ超の範囲である。適度な時間は、商業的に決定され；ラセミ混合物に関する生成物へのエナンチオ選択的基質転化については、時間は典型的に約１〜約８０時間であり、時間は回分法の場合にはバッチ（回分）反応期間であり、連続法の場合には、液体充填反応器容量を液体体積流量で割ったもので表される液体滞留時間である。
用語「再循還」は、酵素触媒に関して使用する場合には、２又はそれ以上のバッチの反応混合物中の酵素触媒の回収及び再利用、又は連続反応法における再利用による容積生産性の増大を意味する。用語［高生産性」は、酵素触媒に関して用いる場合、触媒が、回分又は連続操作モードにおいて、活性をほとんど低下させず、触媒単位重量当たり多量の液体供給材料を処理するのに使用できることを意味する。
本発明は、反応混合物中で、式Ｉ：
Figure 2005520570
［式中、Ｒはアルキル又はアリール基から選ばれる］
のプロピレングリコールエーテルアセテートラセミ体を有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと接触させることによってラセミ体の対掌体（Ｒ又はＳ）を対応するプロピレングリコールエーテルにエナンチオ選択的に加水分解することを含む方法を提供する。
前記式Ｉ中のＲの非限定的例は、ＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3及びＣ6Ｈ5である。
本発明において使用するのに適当なヒドロラーゼ（加水分解酵素、ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）はリパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ及びプロテアーゼからなる群から選ばれる。好ましいヒドロラーゼはリパーゼ及びエステラーゼである。最も好ましいヒドロラーゼはリパーゼであり；特に好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼフラクションＢ、リパーゼＬＰ‘Ｓ’、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼからなる群から選ばれる。最も好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢである。好ましいエステラーゼとしては、Ｅ００１、Ｅ００２及びＥ００３（Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎ Ｉｎｃ．から販売されている）及び豚肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）が挙げられる。反応混合物中のラセミ体の濃度は約１０％ｖ／ｖ超、好ましくは約２０％ｖ／ｖ超である。いくつかの実施態様においては、加水分解は水性反応媒体中で実施し；別の実施態様においては、加水分解は二相反応媒体中で実施する。別の実施態様において、ラセミ体の約３０％〜約５０％を加水分解する。更に別の実施態様においては、加水分解されたラセミ体の対掌体純度は少なくとも７０％ｅｅである。他の実施態様において、本発明の方法は更に、反応混合物からＲ−プロピレングリコールエーテルを回収することを含んでなる。更に他の実施態様において、本発明の方法は更に、反応混合物から未反応Ｓ−対掌体基質を回収し、そして化学的加水分解又はエステル交換のような方法によってＳ−対掌体基質を転化して、対応するＳ−プロピレングリコールエーテルを得ることを含んでなる。更に他の実施態様において、本発明の方法は、酵素触媒を再循還することを更に含んでなる。
別の側面において、本発明は、ラセミ混合物（更にアシル供与体を含んでなる）中で、式ＩＩ：
Figure 2005520570
［式中、Ｒはアルキル又はアリール基から選ばれる］
のプロピレングリコールエーテルラセミ体（ラセミ体は少なくとも約５％ｖ／ｖの濃度である）を、有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと接触させ、それによってラセミ体のＲ−対掌体を対応するＲ−アシル化プロピレングリコールエーテルにエナンチオ選択的にエステル交換することを含む方法を提供する。
前記式ＩＩ中のＲの非限定的例は、ＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3及びＣ6Ｈ5である。アシル供与体は、非活性化又は活性化アシル供与体であることができる。活性化アシル供与体は、活性化エステル、エノールエステル及び無水物から選ばれる。適当な活性化アシル供与体の非限定的例は、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酢酸２，２，２−トリクロロエチル、酢酸２，２，２−トリフルオロエチル、酢酸ブチル、酢酸エチルフェニル、酢酸イソプロペニル、メトキシ酢酸エチル、酢酸１−エトキシビニル、ジケテン、酪酸トリフルオロエチル、無水酢酸、ラクチド及びコハク酸無水物である。好ましい活性化アシル供与体は酢酸ビニル及び酢酸イソプロペニルである。適当な非活性化アシル供与体の非限定的例は、酢酸エチル、並びにキラルアシル供与体化合物、例えば、ラセミ体１−メトキシー２−プロパノールアセテート（ＰＭＡ）、プロピレングリコールエチルエーテルアセテート（ＰＥＡ）、プロピレングリコールｎ−プロピルエーテルアセテート（ＰｎＰＡ）、酢酸エチル（ＥＡ）、酢酸ブチル（ＢＡ）及びエチルフェニルアセテート（ＥＰＡ）である。本発明において使用するのに適当なヒドロラーゼは、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ及びプロテアーゼからなる群から選ばれる。好ましいヒドロラーゼはリパーゼ及びエステラーゼである。最も好ましいヒドロラーゼはリパーゼであり；特に好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢ、リパーゼＬＰ‘Ｓ’、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼからなる群から選ばれる。最も好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼフラクションＢである。好ましいエステラーゼは、ポリマー活性化−豚肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）である。ラセミ体及びアシル供与体は、ラセミ混合物を約１００％ｖ／ｖ含んでなることができる。いくつかの実施態様において、ラセミ体及びアシル供与体は、アシル化プロピレングリコールエーテルへのラセミ体の転化率を約５０％とするような比で存在する。いくつかの実施態様において、ラセミ体の約３０％〜約５０％がエステル交換され、アシル化プロピレングリコールエーテルの対掌体純度は少なくとも約７０％ｅｅである。
他の実施態様において、本発明の方法は更に、反応混合物からＲ−アシル化プロピレングリコールアルキルエーテルを回収し、そしてＲ−アシル化プロピレングリコールアルキルエーテルを転化して対応するＲ−プロピレングリコールアルキルエーテルを得ることを含む。
更に他の実施態様において、本発明の方法は更に、反応混合物から未反応Ｓ−対掌体を回収することを含む。更に別の実施態様において、本発明の方法は更に、酵素触媒を再循還することを含む。
別の側面において、本発明は、第１基質プロピレングリコールエーテルを第二基質アシル供与体でエステル交換するエステル交換によるプロピレングリコールエーテルのラセミ混合物の分割方法において、基質転化度を制御する方法であって、（ａ）転化基質の目的対掌体収率（典型的には、約３０％〜約５０％）並びに転化及び／又は未転化基質の目的純度（典型的に、転化率は約３０％〜約７０％、純度は９９％ｅｅ超）を決定し；（ｂ）目的収率及び純度を達成するための、第１基質と第二基質のモル比を計算し；（ｃ）前記モル比に基づいて目的収率及び純度を理論的に達成するための、第１基質及び第二基質の量を計算し；そして（ｄ）反応混合物中で、式ＩＩ：
Figure 2005520570
［式中、Ｒはアルキル、アリール、アリール置換アルキル、アリル又はアセタール基から選ばれる］
のプロピレングリコールエーテルのラセミ混合物を含む第１基質の第１計算量並びに活性化エステル、非活性化エステル、エノールエステル及び無水物からなる群から選ばれたアシル供与体を含んでなる第２基質の第２計算量を、有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと合し、それによってラセミ体の第１対掌体を対応する第１対掌体アシル化プロピレングリコールエーテルにエナンチオ選択的にエステル交換させることを含む方法をを提供する。
いくつかの実施態様において、第１基質の第１計算量は、第１の容量であり、第２基質の計算量は第２の容量である。いくつかの実施態様において、第１基質の第１計算量及び第２基質の第２計算量は、反応混合物の反応マトリックスの約１００％を構成する。適当なアシル供与体は、非活性化又は活性化アシル供与体であることができる。活性化アシル供与体は、活性化エステル、エノールエステル及び無水物からなる群から選ばれる。好ましい活性化アシル供与体の非限定的例は、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酢酸２，２，２−トリクロロエチル、酢酸２，２，２−トリフルオロエチル、酢酸ブチル、酢酸エチルフェニル、酢酸イソプロペニル、メトキシ酢酸エチル、酢酸１−エトキシビニル、ジケテン、酪酸トリフルオロエチル、無水酢酸、ラクチド及びコハク酸無水物である。好ましい活性化アシル供与体は酢酸ビニル及び酢酸イソプロペニルである。適当な非活性化アシル供与体の非限定的例は、酢酸エチル、並びにキラルアシル供与体化合物、例えば、ラセミ体１−メトキシ−２−プロパノールアセテート（ＰＭＡ）、酢酸ブチル（ＢＡ）、酢酸エチルフェニル（ＥＰＡ）、酢酸エチル（ＥｔＡ）及びＰｎＰＡである。前記式ＩＩ中のＲの非限定的例は、ＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3、Ｃ6Ｈ5、Ｃ（ＣＨ3）3、Ｃ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、Ｃ（ＣＨ3）（Ｃ6Ｈ5）2、Ｃ（Ｃ6Ｈ5）3、Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3及びＣＨ2ＯＣＨ3である。
本発明において使用するのに適当なヒドロラーゼは、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ及びプロテアーゼからなる群から選ばれる。好ましいヒドロラーゼは、リパーゼ及びエステラーゼである。最も好ましいヒドロラーゼはリパーゼであり；特に好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢ、リパーゼＬＰ‘Ｓ’、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼからなる群から選ばれる。最も好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢである。好ましいエステラーゼは、ポリマー活性化豚肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）である。いくつかの実施態様において、ラセミ体の（Ｒ）−対掌体は対応する（Ｒ）−対掌体アシル化プロピレングリコールエーテルにエナンチオ選択的にエステル交換する。
他の実施態様において、本発明の方法は更に、反応体混合物から第１対掌体アシル化プロピレングリコールアルキルエーテル生成物を回収し、そして加水分解又はエステル交換のような適当な方法によって生成物を転化して、対応する第１対掌体プロピレングリコールアルキルエーテルを得ることを含む。
更に他の実施態様において、本発明の方法は更に、反応混合物から未反応の第２対掌体プロピレングリコールアルキルエーテルを回収することを含む。更に他の実施態様において、本発明の方法は更に、酵素触媒を再循還させることを含む。他の実施態様において、本発明の方法は更に、アシル化プロピレングリコールエーテルの収率及びアシル化又は非アシル化プロピレングリコールエーテルの対掌体純度を監視し、そして目的収率及び純度を得るために第１基質対第２基質の比を調整することを含んでなる。他の実施態様において、ラセミ体グリコールエーテルアセテートのアシル供与体としての使用を含む本発明の方法は更に、反応混合物からの副生成物アルコールの除去による、試薬の転化率の増加及び同一反応における４種以下のキラル化合物の生成を含む。
別の側面において、本発明は、Ｒ又はＳ配置の式ＩＩＩ：
Figure 2005520570
のキラル化合物の製造方法であって、前記方法が
（ａ）約４〜約８０℃の温度において反応混合物（更に、活性化エステル、非活性化エステル、エノールエステル及び無水物からなる群から選ばれたアシル供与体を含む）中で式ＩＩ：
Figure 2005520570
［式中、Ｒはアルキル、アリール置換アルキル、アリル又はアセタール基である］
のプロピレングリコールエーテルラセミ体を有効量の酵素触媒、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ及びプロテアーゼからなる群から選ばれたヒドロラーゼと接触させ、それによって（Ｓ）−１−アルコキシ−２−プロパノール及び（Ｒ）−１−アルコキシ−２−プロパノールアシレートを得；
（ｂ）適当な分離法、例えば、蒸留又は抽出を用いて、工程（ａ）において形成された（Ｒ）−１−アルコキシ−２−プロパノールアシレートから（Ｓ）−１−アルコキシ−２−プロパノールを分離し；
（ｃ）緩和な反応条件下で、約５〜１５重量％、好ましくは５〜１０重量％の量の酸触媒、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸又はスルホン化イオン交換樹脂の存在下において、工程（ｂ）で分離された（Ｓ）−１−アルコキシ−２−プロパノールを脱アルコキシル化して、（Ｓ）−１，２−プロパンジオールを得；そして
（ｄ）適当な分離方法、例えば、抽出及び／又は蒸留によって、工程（ｃ）で得られた（Ｓ）−１，２−プロパンジオールを単離し；そして場合によっては更に
（ｅ）緩和な反応条件下で、約５〜１５重量％、好ましくは５〜１０重量％の酸触媒、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸又はスルホン化イオン交換樹脂の存在下において、工程（ｂ）で分離された（Ｒ）−１−アルコキシ−２−プロパノールアシレートを脱アルコキシル化して、（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを得；そして
（ｆ）適当な方法、例えば、抽出及び／又は蒸留によって、工程（ｅ）において得られた（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを単離する
工程を含む方法を提供する。
前記式ＩＩ中のＲの非限定的例は、Ｃ（ＣＨ3）3、Ｃ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、Ｃ（ＣＨ3）（Ｃ6Ｈ5）2、Ｃ（Ｃ6Ｈ5）3、Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3及びＣＨ2ＯＣＨ3である。アシル供与体は、非活性化又は活性化アシル供与体であることができる。活性化アシル供与体は、活性化エステル、エノールエステル及び無水物から選ばれる。適当な活性化アシル供与体の非限定的例は、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酢酸２，２，２−トリクロロエチル、酢酸２，２，２−トリフルオロエチル、酢酸ブチル、酢酸エチルフェニル、酢酸イソプロペニル、メトキシ酢酸エチル、酢酸１−エトキシビニル、ジケテン、酪酸トリフルオロエチル、無水酢酸、ラクチド及びコハク酸無水物である。好ましい活性化アシル供与体は酢酸ビニル及び酢酸イソプロペニルである。適当な非活性化アシル供与体の非限定的例は、酢酸エチル、並びにキラルアシル供与体化合物、例えば、ラセミ体１−メトキシ−２−プロパノールアセテート（ＰＭＡ）、プロピレングリコールエチルエーテルアセテート（ＰＥＡ）、プロピレングリコールｎ−プロピルエーテルアセテート（ＰｎＰＡ）、酢酸エチル（ＥＡ）、酢酸ブチル（ＢＡ）及び酢酸エチルフェニル（ＥＰＡ）である。
本発明において使用するのに適当なヒドロラーゼは、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ及びプロテアーゼからなる群から選ばれる。好ましいヒドロラーゼはリパーゼ及びエステラーゼである。最も好ましいヒドロラーゼはリパーゼであり；特に好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢ、リパーゼＬＰ‘Ｓ’、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼからなる群から選ばれる。最も好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢである。
適当な脱アルコキシル化触媒の非限定的例は、ｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−ＴＳＡ）、ＤＯＷＥＸ ＤＲ−２０３０イオン交換樹脂、ＤＯＷＥＸ ＭＳＣ−１Ｈ＋イオン交換樹脂、酸性白土、Ｎａｆｉｏｎ Ｈ＋触媒及び無機酸、例えば、硫酸である。ＤＯＷＥＸは、ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙの商標である。ＮａｆｉｏｎはＤｕＰｏｎｔの商標である。脱アルコキシル化工程は、約４０〜約１３０℃、好ましくは約８０〜約１００℃の温度で実施するのが都合よい。前述のラセミ混合物の都合のよい速度論的分割は、どちらの対掌体生成物の理論最大収量も５０％であるという不利点を有する。ラセミ基質中に存在する単一対掌体の完全変換は、動的速度論的分割によって達成できる。この方策は、基質のリパーゼ触媒アシル化とルテニウム触媒ラセミ化とを組合せて、高収率及び高光学純度で生成物を形成できる。動的速度論的分割において、基質の非反応性対掌体（リパーゼと反応しないか、ゆくっりとしか反応しないもの）が連続的にラセミ化され、生成物は理論的に、１００％の収率で光学的に純粋な形態で得られる。このアプローチの例は、第２アルコール（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．１９９７．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６：１２１１〜１２１２； Ｋｉｍ，Ｍ．−Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：４７３６〜４７３８）、ジオール（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：５２３７〜５２４９）、及びα−ヒドロキシ酸エステル（Ｈｕｅｒｔａ，Ｆ．Ｆ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｏｒｇ．，Ｌｅｔｔ．２：１０３７〜１０４０）に関して示されている。実際、約６％（ｗ／ｖ）１−フェノキシ−２−プロパノールのルテニウム−及び酵素−触媒動的速度論的分割は、アシル供与体として酢酸４−クロロフェニルを用いてＣＡＬ−Ｂによって示されており（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１６４５〜１６５０）；Ｒ−１−フェノキシ−２−プロパノールが生成物として収率８８％及び％ｅｅ＞９９％で報告された−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルのエステル交換に基づく分割へのこのアプローチの適用は、それから誘導される目的アシル化キラル生成物又は物質の収率を増大できるであろう。
図面の説明
図１は、一連のプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びそれらの対応する酢酸エステルを示す。
図２は、ＧＣ／ＦＩＤによって分析された反応混合物からの（Ｓ）−ＰＭＡの分割を示す。反応混合物は、水性媒体中にＣＡＬ−Ｂ（１．０ｍｇ／ｍｌ Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）及び２５％（ｖ／ｖ）ＰＭＡを含んでいた（リン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２）。保持時間：ラセミ体ＰＭ，２．８１分；ＰＭＡ−Ｓ，４．１０分；ＰＭＡ−Ｒ，４．２４分。
図３は、ＣＡＬ−Ｂ酵素濃度の関数としての（Ｓ）−ＰＭＡの分割を示す。水性反応混合物は、ＰＭＡを２５％（ｖ／ｖ）で及びＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．を０．１ｍｇ／ｍｌ（黒□）、０．５ｍｇ／ｍｌ（●）、１．０ｍｇ／ｍｌ（□）及び２．０ｍｇ／ｍｌ（○）で含んでいた。
図４は、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２装填量の関数として測定した、（ａ）（±）−１−メトキシ−３−プロパノール（ＰＭ）及び（ｂ）（±）−１−フェノキシ−２−プロパノール（ＰＰｈ）のエステル交換を示す。（Ｒ）−ＰＭ及び（Ｒ）−ＰＰｈＡの対掌体過剰（％ｅｅ）及び転化率％は、理論転化率をそれぞれ３５及び４５％に限定するＰＭ／ＶＡ（７５：２５，％ｖ／ｖ）及びＰＰｈ／ＶＡ（８０：２０，％ｖ／ｖ）の比を含む反応混合物において求めた。記号解説中の数字は、反応におけるＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２の濃度をｍｇ／ｍｌで示す。
図５は、ＣＡＬ−Ｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む反応混合物中における酢酸ビニル３０％（ｖ／ｖ）によるＰＰｈ７０％（ｖ／ｖ）のエナンチオ選択的アシル化を示す。
図６は、ＰＥＡ加水分解に関する酵素再循還を示す。ＰＥＡの分割（％ｅｅで表す）は、３つの異なる濃度のＣＡＬ−Ｂに関する酵素サイクルの関数として示し；サイクル時間は、サイクル３（４８時間）並びにサイクル８及び１３（６０時間）を除いて、２４時間であった。
図７は、スケールアップ条件下におけるＰＥＡ加水分解に関する酵素再循還を示す。ＰＥＡの分割（％ｅｅで表す）は、インキュベーション時間の関数として示す。各サイクルは、反応過程において、サンプルを除去し且つ分析することによって監視し；各サイクルの長さは約２時間〜約９時間であった。反応混合物は１．５ ｌであり、ＰＥＡは２０％ｖ／ｖで存在し、酵素、固定化ＣＡＬ−Ｂは反応器中に保持し、使用された反応混合物をサイクルの最後に反応器から除去し、新しい反応混合物を添加して新しいサイクルを開始した。反応がサイクル８、１０、１６及び２５において減速したときに、新しい酵素（最初の装填量の１０％）を添加した。
図８は、３２サイクルまでのスケールアップ条件下におけるＰＥＡ加水分解に関する酵素再循還を示す。（Ｓ）−ＰＥＡ及び（Ｒ）−ＰＥの両者の分割（％ｅｅとして表す）及び総転化率（％として表す）をサイクル番号の関数として示す。反応混合物は１．５ ｌであり、ＰＥＡは２０％ｖ／ｖで存在し、酵素、固定化ＣＡＬ−Ｂは反応器中に保持し、使用された又は分割された反応混合物をサイクルの最後に反応器から除去し、新しいサイクルを開始するために新しい反応混合物を添加した。各サイクルを反応過程（図７に示した反応と同様）において監視し、最後のサンプルを用いて、分割及び転化率を計算した。
本発明は、グリコールエーテル及びグリコールエーテルアセテートの酵素分割方法、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートの酵素分割に関する。
本発明は、グリコールエーテル及びグリコールエーテルアセテートの、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートの酵素分割方法を提供する。
代表的なグリコールエーテルアセテートは以下の化学構造を有する：
Figure 2005520570
［式中、Ｒはアルキル又はアリール基から選ばれる］。前記式ＩＩにおいてＲで表されるアルキル及びアリール基の非限定的例は、ＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3及びＣ6Ｈ5である。
代表的なグリコールエーテルは以下の化学構造を有する：
Figure 2005520570
［式中、Ｒはアルキル又はアリール基から選ばれる］。前記式ＩＩにおいてＲで表されるアルキル及びアリールの非限定的例は、ＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3及びＣ6Ｈ5である。
前記式Ｉで表されるプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテート及び前記式ＩＩで表されるプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルの非限定的例は、図1に示してある。
ラセミ体プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートの酵素分割のための酵素触媒は、ラセミ混合物中に存在する２つの対掌体の一方の酢酸エステルのみを、高いラセミ混合物転化率（例えば、いくつかの実施態様においては約４０％、他の実施態様においては約５０％の転化率）でにおいて高いエナンチオ選択率（例えば、いくつかの実施態様においては残留基質が約９０％超、他の実施態様においては約９５％超の対掌体過剰（ｅｅ））で加水分解し、それによって残留プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテート混合物を高分割する（例えば、いくつかの場合においては混合物はＳ−異性体約９７．５％超及びＲ−異性体約２．５％未満を含んでなり；他の実施態様においては、混合物はＲ−異性体約９７．５％超及びＳ−異性体約２．５％未満を含んでなる）するものである。分割（Ｓ）−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）アセテートを生じる、Ｒ−異性体のエナンチオ選択的加水分解の利点は，（Ｓ）−グリコールエーテルアセテートが比較的容易に対応する（Ｓ）−グリコールエーテルに化学的に転化されることである。
キラル化合物のラセミ混合物の酵素分割における転化に関するｅｅ及びエナンチオ選択率（Ｅ）の計算は文献記載されている（米国特許第５，５４１，０８０号）。
本発明の開発過程において、１１０種超の市販ヒドロラーゼ（リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ及びプロテアーゼ）を最初に、試験グリコールアルキルエーテルアセテート、（±）−ＰＭＡ［（±）−１−メトキシ−２−プロパノールアセテート］のラセミ混合物のエナンチオ選択的加水分解を触媒する能力に関してスクリーニングした。酵素スクリーニングは、０．５％（ｖ／ｖ）ＰＭＡを含む水性反応条件下で実施した。β−ＤＥＸ３２５によるキラル・キャピラリー・ガスクロマトグラフィーを用いて、酢酸エステル基質の対掌体組成及びアルコール生成物である１−メトキシ−２−プロパノール（ＰＭ）の形成を監視した。最初のスクリーニングの間に高いエナンチオ選択率を示した酵素の１つを、酵素バイオプロセスの開発を容易にするための、種々のパラメーター（即ち高基質濃度、二相条件、温度など）におけるその性能に関する次の試験のために選択した。同じ酵素はまた、別の関連プロピレングリコールアルキル又はアリールエーテルアセテートのエナンチオ選択的加水分解を触媒できた（実施例５参照）。
１１０種超の市販ヒドロラーゼのスクリーニングに基づく結果は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ型（ＣＡＬ−Ｂ）が、ＰＭＡ［（±）−１−メトキシ−２−プロパノールアセテート］の（Ｒ）−対掌体のエナンチオ選択的加水分解を触媒して、このグリコールエーテルアルキルアセテートの（Ｓ）−対掌体を分割する（９９％ｅｅ超）ことを示した（実施例３参照）。同じ酵素、ＣＡＬ−Ｂはまた、非プロトン性又は非水条件下におけるアシル供与体によるＰＭのラセミ混合物のエナンチオ選択的アシル化（エステル交換）を触媒して、対掌体として濃縮された（Ｒ）−ＰＭＡと未反応（Ｓ）−ＰＭを生成することがわかった（実施例６参照）。次いで、ＣＡＬ−Ｂ又は同様なリパーゼを使用することによって、光学活性ＰＭＡ又はＰＭを生体触媒法において高収率で分割するための一般的条件を割り出した。分割された光学活性種（グリコールエーテルアセテート及びグリコールエーテル）は共に多数の方法によって反応混合物から回収及び単離できる。このような方法としては、液液抽出、熱活性化分離、蒸留、固相抽出法、液固吸着、又はそれらの組合せが挙げられる。好ましい実施態様においては、分割された光学活性種は蒸留される。回収された光学活性グリコールエーテルアセテートの化学的加水分解及びエステル交換のような方法は、対応するキラルグリコールエーテルを純粋な形態で容易に生成する。
１１０種超の市販ヒドロラーゼのパネルも、追加の関連グリコールエーテルアセテートのエナンチオ選択的加水分解に関してスクリーニングした。代表的な基質としては以下のものが挙げられる：（±）−１−エトキシ−２−プロパノールアセテート（ＰＥＡ）、（±）−１−ｎ−プロピルオキシ−２−プロパノールアセテート（ＰｎＰＡ）、（±）−１−イソプロピルオキシ−２−プロパノールアセテート（ＰｉＰＡ）、（±）−１−ｎ−ブチルオキシ−２−プロパノールアセテート（ＰｎＢＡ）、及び（±）−１−フェノキシ−２−プロパノールアセテート（ＰＰｈＡ）（ＰＭＡと共に、これらの基質をＰ系基質と総称する）。スクリーニングされたＰ系基質に関しては、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）が最もエナンチオ選択的な酵素であった（例は表Ｉ〜Ｖに示す）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ（ＰＳＬ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＡ（ＣＡＬ−Ａ）及びＣａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａリパーゼ（ＣＲＬ）を含む他のヒドロラーゼも、いくつかの基質のエナンチオ選択的加水分解を触媒した。
更に、リパーゼＣＡＬ−Ｂはまた、種々のアシル供与体（例えば酢酸エチル及び酢酸ビニルが挙げられるがこれらに限定されない）と共に有機溶媒中におけるＰＥ、ＰｎＰ、ＰｉＰ、ＰｎＢ、ＰｔＢ及びＰＰｈのエステル交換に基づく分割に使用した。基質転化度に応じて、対応するグリコールエーテルアセテートの（Ｒ）−対掌体が高光学純度で生成物として形成され；これまた、残留未転化（Ｓ）−対掌体を高光学純度で存在させるであろう。
従って、本発明は、２つの異なる型の基質、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートの酵素分割方法を提供する。酵素触媒はヒドロラーゼであり、好ましくは可逆的にエステルの加水分解を触媒する。従って、酵素触媒、ヒドロラーゼはまた、エステル交換を触媒する。本発明の異なる実施態様において、どのようなラセミ体が基質であるか、また、適当な反応条件によって、酵素は２つの異なる反応のうち１つを触媒する。
いくつかの実施態様において、触媒される反応は加水分解反応であり、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートがプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルに加水分解され、アセテート基を酢酸として遊離する。加水分解反応において、酵素は一方の異性体をエナンチオ選択的に加水分解し；その結果、この異性体の加水分解生成物が濃縮される。基質はもう一方の異性体の形で濃縮され、それほど急速には生成物に転化されない。従って、詳細な実施態様において、酵素がＣＡＬ−Ｂであり且つ基質がプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートのラセミ体である場合には、本発明の方法は、主にＲ型を生成物に転化するので、基質をＳ−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートの形で濃縮し、また、Ｓ型をそれほど急速には生成物に転化しないので、生成物をＲ−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルの形で濃縮する。従って、これらの実施態様において、加水分解反応の最後には、２つの主な対掌体はＳ−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテート及びＲ−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルである。
他の実施態様において、触媒される反応はエステル交換であり、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルはアシル基でエステル化される。エステル交換反応において、酵素はまた、一方の異性体をエナンチオ選択的にアシル化し、この結果、この異性体のアシル化生成物が濃縮され、また、基質はもう一方の異性体の形で濃縮され、これはそれほど急速には生成物に転化されない。詳細な実施態様において、酵素がＣＡＬ−Ｂであり且つ基質がプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びアシル供与体である場合には、本発明の方法は、主にＲ型を生成物に転化するので、基質をＳ−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルの形で濃縮し、また、Ｓ型をそれほど急速には生成物に転化しないので、生成物をＲ−アシルプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルの形で濃縮する。従って、エステル交換反応の最後には、２つの主な対掌体は、Ｓ−プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びＲ−アシルプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルである。
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートのラセミ体の反応混合物中で有効量の酵素触媒ヒドロラーゼを接触させ、それによってラセミ体の一方の異性体を対応するプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルにエナンチオ選択的に加水分解することを含んでなる、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートのラセミ混合物の分割方法を提供する。いくつかの実施態様において、酵素触媒はリパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）である。酵素触媒加水分解によってプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートのラセミ混合物を分割するための本発明の方法の詳細で好ましい実施態様についての追加情報は以下に記載する。
他の実施態様において、本発明は、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルのラセミ体とアシル供与体との反応混合物中で有効量の酵素触媒ヒドロラーゼを接触させ、それによってラセミ体の一方の異性体を対応するプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアシレートにエナンチオ選択的にエステル化することを含んでなる、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルのラセミ混合物の分割方法を提供する。アシル供与体は他の適当に反応する化合物と交換すると、他のエステルを形成できるので、用語「アシル供与体」は総称的に用いられ；非限定的例としては、プロピオン酸ビニルの存在下におけるエステル交換ではプロピオニルエステルが形成される。いくつかの実施態様において、酵素触媒はリパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）である。酵素触媒エステル交換によってプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルのラセミ混合物を分割するための本発明の方法の詳細で好ましい実施態様についての追加情報は以下に記載する。
前記及び下記の加水分解又はエステル交換によるラセミ体の分割において、反応、即ち基質の生成物への転化は、多数の公知手段によって監視できる。好ましい方法としては反応体及び生成物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分析が挙げられ、それらのうちいくつかの異なる方法を実施例に記載してある（実施例１参照）。生成物の収率は、生成物に転化された基質の百分率として表し；この百分率は典型的にはモル基準で表すが、重量基準又は容量基準で表すこともできる。理想的ラセミ混合物中の任意の１つの特定の異性体に関しては、理論最大収率は５０％（モル基準で表される場合）であり；これは、一方の異性体が全て生成物に転化され、他方は全く転化されなかったのに相当する。しかし、任意の特定の反応に関してはいずれも、理論最大収率は、基質の全てが生成物に転化される１００％である。反応の特定の点における生成物又は残留基質の純度は、対掌体過剰、即ち、ｅｅとして表す。ｅｅは、生成物又は基質の対掌体濃縮に相当し、理論最大は１００％である。反応条件は、効率よく且つ低コストで基質転化を行いながら、その対掌体に関して理論最大収率及びｅｅに近づくように最適化する。最適反応条件は、５０％の転化率を可能にし、エナンチオ純粋な生成物（９９％ｅｅ超）を形成するであろう。４０〜５０％の転化率及び高エナンチオ純度でどちらか一方の生成物の分割を可能にする条件もまた、望ましい。どちらか一方の対掌体が濃縮されているがホモキラルでない回収生成物は、所望のエナンチオ純度を得るための引き続く分割のために基質として使用できる。
以下の説明は、本発明の詳細で好ましい実施態様についての追加情報を提供する。
酵素触媒
プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートのラセミ体の分割方法を提供する本発明のいくつかの実施態様において、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートのラセミ体を分割するための酵素触媒は、ラセミ体の一方の異性体をエナンチオ選択的に加水分解するヒドロラーゼであり；エナンチオ選択的加水分解は、高対掌体純度の生成物又は出発原料を生じるのが好ましい。典型的に、生成物の高対掌体純度は、基質の生成物への転化率５０％未満で得られるのに対し、基質の高対掌体純度は５０％超の転化率で得られる。好ましくは、グリコールエーテル生成物の対掌体純度は約５５％ｅｅ超であり、より好ましくは約７０％ｅｅ超、更に好ましくは約８０％ｅｅ又は８５％ｅｅ超、最も好ましくは約９５％ｅｅ又は９８％ｅｅ超である。好ましい実施態様において、酵素触媒はＲ−異性体酢酸エステルを加水分解する。
ヒドロラーゼはリパーゼ又はエステラーゼである。リパーゼ及びエステラーゼは共に、特にカルボン酸エステラーゼがエステルの加水分解を触媒する。代表的なヒドロラーゼは表Ｉ〜Ｖに記載してあり、その例としては以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼ及びエステラーゼ。いくつかの好ましい実施態様においては、ヒドロラーゼは、水不溶性エステルの加水分解を優先的に触媒するリパーゼである。
プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルのラセミ体の分割方法を提供する本発明の他の実施態様において、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルのラセミ体を分割するための酵素触媒は、アシル供与体の存在下でラセミ体の一方の異性体をエナンチオ選択的にエステル交換するヒドロラーゼであり；エナンチオ選択的エステル交換は高対掌体純度の生成物又は出発原料を生じるのが好ましい。典型的には、生成物の高対掌体純度は、基質の生成物への転化（又はグリコールエーテルのエステル化）率５０％未満で得られるのに対し、基質の高対掌体純度は５０％超の転化率で得られる。好ましくは、グリコールエーテルアシレート生成物の対掌体純度は約５５％ｅｅ超であり、より好ましくは約７０％ｅｅ超、更に好ましくは約８０％ｅｅ又は８５％ｅｅ超、最も好ましくは約９５％ｅｅ又は９８％ｅｅ超である。好ましい実施態様において、酵素触媒はＲ−異性体エーテルをエステル交換する。
ヒドロラーゼはリパーゼ又はエステラーゼである。リパーゼ及びエステラーゼは共に、特にカルボン酸エステラーゼがエステルの加水分解を触媒する。代表的なヒドロラーゼは表Ｉ〜Ｖに記載してあり、その例としては以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼ及びエステラーゼ。いくつかの好ましい実施態様においては、ヒドロラーゼは、水不溶性エステルの加水分解を優先的に触媒するリパーゼである。
本発明の種々の実施態様において同一酵素を使用することは必要ではない。従って、ある１つの酵素をエナンチオ選択的加水分解によるグリコ−ルエーテルアセテートのラセミ体の分割に使用し、それとは異なる酵素をエナンチオ選択的エステル交換によるグリコールエーテルのラセミ体の分割には使用することができる。本発明のいくつかの実施態様において、酵素触媒はリパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）である。本発明の異なる実施態様において、この酵素は加水分解及びエステル交換の両方に使用する。
Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬ−Ｂ）は、文献記載された方法（Ｐａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｄ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，Ｓｅｃｔ．Ｂ ３２Ｂ：７６〜８０）に従って、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ細胞から単離することもできるし、あるいは商業的供給源から入手し（例えば、ＮＯＶＯ ＮｏｒｄｉｓｋからＳＰ ５２５；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからＣＨＩＲＡＺＹＭＥ．ＲＴＭ．Ｌ−２．ｌｙｏ）且つ前処理せずに触媒として使用することもできる。ＣＡＬ−Ｂはまた、ポリマーマトリックス中で可溶性若しくは不溶性有機担体（例えば、Ｎｏｖｏ ＮｏｒｄｉｓｋからのＮＯＶＯＺＹＭ．ＲＴＭ．４３５；ＲｏｃｈｅからのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．ｌｙｏ（キャリア１）；ＲｏｃｈｅからのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．ｆ．，Ｃ２（キャリア２））、又は再利用のための触媒回収を単純にする無機担体上に固定化することもできる。これらの固定化方法は広範に報告されており、当業者にはよく知られている。反応混合物からの可溶性酵素の膜分離も使用できる。
遺伝子改変ＣＡＬ−Ｂを含む、ＣＡＬ−Ｂと同様な基質活性及びエナンチオ特異性を有するリパーゼも本発明に使用できる。他の実施態様において、酵素触媒は、ＣＡＬ−Ｂ又は他の適当なリパーゼ若しくはエステラーゼを発現する遺伝子組み換え全細胞形質転換体から、あるいは公知の方法によってこのような形質転換体から得られる製剤から得られる。
加水分解による分割
グリコールエーテル、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートのラセミ体を分割するための加水分解反応の種々のパラメーターは、評価し、最適化できる（実施例３〜５参照）。加水分解反応は、酵素触媒とラセミ基質との組合せである反応混合物中で起こり、酵素がエナンチオ選択的加水分解反応を触媒して基質を生成物に転化する。２種以上の基質又は２種以上の生成物も存在できる。追加成分も反応混合物中に存在できる。反応条件は、種々の反応パラメーターの相対的重要性及び反応の間に到達すべき種々のパラメーターの目的値に応じて最適化する。種々のパラメーターの非限定的例としては、分割すべき対掌体の種類、収率及び純度の程度、分割すべきラセミ体の量又は分割される対掌体の目的量、所望の反応時間、及び添加すべき酵素触媒の量が挙げられる。従って、いくつかの実施態様においては、ＰＭＡのラセミ体のエナンチオ選択的加水分解の最適条件又は最適に近い条件を用いて高基質装填量を実現することによって、低濃度の酵素を用いて高純度の分割対掌体が得られる。「基質装填量］とは、反応混合物中に存在する基質の最初の量又は濃度を意味する。典型的には、転化率は約３０〜約５０％、加水分解生成物の対掌体純度は少なくとも約７０％ｅｅ、好ましくは少なくとも約８０％ｅｅ、より好ましくは少なくとも約９０％ｅｅ、更に好ましくは少なくとも約９５％ｅｅである。ＣＡＬ−Ｂが高選択性を示す理想的な場合には、望ましい条件は５０％の収率並びに９９％ｅｅ超の分割基質及び生成物を可能にする。基質の対掌体純度も高いが、一般には生成物の対掌体純度ほど高くないことが多く；対掌体純度が比較的高い基質は典型的に５０％超の転化率で得られる。本発明の反応条件下において、加水分解は可逆的反応ではないこと；即ち加水分解生成物は圧倒的に水性の条件下では（又は水が約１０％超の条件下でさえ）エステル交換を受けないことに留意されたい。残留プロピレングリコールアルキル（又はアリール）グリコールアセテート（未転化基質）は、加水分解グリコールエーテル生成物のアシル供与体としては働かない。
いくつかの実施態様において、加水分解反応によって分割されるラセミ体はグリコールエーテルアセテート、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートであり；代表的なグリコールエーテルは前記式Ｉで表される。プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートの非限定的例は図1に示してある。他の実施態様において、分割されるラセミ体はグリコールエーテルブチレート、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）ブチレート、及びグリコールエーテルプロピオネート、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）プロピオネートである。
種々の実施態様において、基質ラセミ体の濃度は約０．５〜約５０％ｖ／ｖであり；好ましくは、基質の濃度は約１０％ｖ／ｖである。任意の特定のアシル化プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル（例えば、ＰＧＡＥＡ）の最も有効な濃度は、反応混合物の他の条件に応じて、並びに反応の最後における生成物又は残留基質の望ましい最終転化率及び純度に応じて異なるであろう。しかし、以下の濃度が有効であることがわかっている（％ｖ／ｖとして表す）：ＰＭＡ，水性反応において約２５〜約４０％、好ましくは約２５％、及び二相反応において約１０％；ＰＥＡ−水性反応において約０．５〜約５０％、好ましくは約２０〜約２５％；ＰＰｈＡ−水性反応において約１５〜約５０％、好ましくは約１０〜約２５％；ＰｎＰＡ、ＰｉＰＡ、ＰｎＢＡ−水性反応において約０．５〜約５０％、好ましくは約１０〜約２５％。
反応混合物中の酵素触媒製剤（非固定化又は固定化）の量（ｍｇ／ｍｌ）は、所望の反応速度が得られるように選択され、酵素触媒の製剤の比活性によって異なる。いくつかの実施態様において、本発明の加水分解反応における非固定化ＣＡＬ−Ｂ（精製タンパク質ではなく、粗製酵素製剤として）の量は、反応混合物の約０．００１〜約５ｍｇ／ｍｌであることができるが、典型的には総反応容量ｍｌ当たりＣＡＬ−Ｂ約０．５〜約２ｍｇ、最も好ましくは約１〜約２ｍｇである。
他の実施態様において、本発明の加水分解反応における固定化ＣＡＬ−Ｂ（精製タンパク質ではなく、粗製酵素製剤として）の量は、反応混合物の約０．１ｍｇ〜約１ｇ／ｍｌであることができるが、典型的には反応容量ｍｌ当たり固定化ＣＡＬ−Ｂ約０．５ｍｇ〜約０．５ｇ、好ましくは約１〜約２００ｍｇである。固定化ＣＡＬ−Ｂの場合には、反応器（例えば、ネジ蓋付き反応バイアル又は反応器）中で反応混合物に酵素を添加することによって分割を実施できる。分割はまた、ラセミ基質を含む反応混合物を、固定化酵素を含むカラムに通すことによって、又は保持酵素による反応混合物の拡散を可能にする膜反応器を用いて達成できる。固定化酵素はまた、以下に詳述するように、多数の反応に使用するために再循還することもできる。
いくつかの実施態様において、反応媒体、又は酵素触媒と少なくとも１種の基質が一緒にされた溶液は水性であり；他の実施態様においては、反応媒体は二相性である。水性反応媒体又は二相媒体の水性成分は緩衝化するのが好ましい。反応混合物の最初のｐＨの維持は、反応混合物の所望のｐＨの約１ｐＨ単位内のｐＫａを有する適当な緩衝剤を充分な濃度で含ませることによって達成できる。反応ｐＨ５．０、６．０及び７．０に関しては、酢酸、クエン酸−リン酸及びリン酸緩衝液をそれぞれ使用でき；緩衝液の選択はこれらの例に限定されない。反応の間、反応混合物のｐＨを監視するか又は酸若しくは塩基を添加して反応混合物のｐＨを所望の値に保持する場合には、反応は添加緩衝液を添加せずに実施することもできる。緩衝液の濃度は様々であることもできるが、約２５〜約２００ｍＭの値が典型的である。反応のｐＨは約３〜８．５であることができるが；好ましくは、ｐＨは約７である。
二相反応媒体は、水相（前述の通り）及び水相と不混和性であり且つ基質（それ自体が溶媒である）の他に存在する溶媒を含む。従って、二相反応混合物は、２相に分離する２種の不混和性溶媒を含んでなる。反応混合物の基礎をなすメカニズムを理解することは必要ではないが、また、本発明を以下の仮説によって限定するつもりはないが、最初は水相が溶解された酵素を含むが、酵素は水相と不混和性基質含有有機相との界面で活性であると考えら得る。反応はまた、加水分解反応及び酵素活性の維持の両方に必要な水の少なくとも最小量が添加された有機溶媒から主になる反応混合物中で実施できる。更に、反応はまた、水及び水と混和性の極性有機溶媒を含んでなる単相水性混合物を用いて実施することもできる。
二相反応には種々の溶媒を使用でき；その例としてはヘキサン及びトルエンが挙げられるがこれらに限定されない。これらの溶媒の濃度はまた、例えば、２５から６５％（ｖ／ｖ）のように変化させることができる。好ましくは、溶媒は約４０〜約５０％（ｖ／ｖ）で存在する。メタノール、ジオキサン又はアセトンのような極性有機溶媒も比較的低濃度（例えば、０．２５〜１０％（ｖ／ｖ）で使用して、エナンチオ選択性を増大させることができる。
好ましくは、反応混合物は水性である。水性混合物の１つの利点は、加水分解が好都合らしいことである。
ほとんどの実施態様において、加水分解反応の温度は、反応速度、酵素触媒活性の安定性、酵素のエナンチオ選択性及び基質の安定性を最適にするように選択する。例えば、インキュベーション温度の影響は、２５％（ｖ／ｖ）ＰＭＡ並びに１．０及び０．５ｍｇ／ｍｌ ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ）を含む水性反応混合物中において３０〜５０℃において（５℃刻みで増加させて）調べた。これらの条件下において、ＰＭＡの加水分解は４０℃において最も早く、最終エナンチオ純度はこの温度において影響を受けなかった。しかし、より低い酵素濃度を用いて３５℃でインキュベートした反応は、４０℃でインキュベートした反応に比べて長い時間持続できる触媒反応を示し、それより高い（Ｓ）−ＰＭＡエナンチオ純度を生じた。５０℃におけるインキュベーションは５時間以内に酵素を不活性化した。測定された速度が基質溶解度の温度による差とは独立していたと仮定すれば、この結果はＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ）に最適な温度は約４０℃であったことを示すが、水性反応混合物中では３５℃においてより高い酵素安定性が観測された。従って、好ましい温度は約３５〜４０℃であり、約３７℃の温度を典型的に使用する。
ほとんどの実施態様において、反応混合物は撹拌しながらインキュベートし；このような撹拌を実施するための手段としては、回転振盪、機械的撹拌又は羽根車による撹拌が挙げられる。
所定の操作温度においては、反応速度は、反応中に存在するリパーゼの量に左右される。従って、反応時間は添加されるリパーゼの量に左右される。このため、例えば、ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ，１２０Ｕ／ｍｇ ｌｙｏ超）を１．０、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度で含む反応混合物を用いて、５０％へキサンを含む二相条件下において１０％（ｖ／ｖ）ＰＭＡのエナンチオ選択的加水分解を行うのに必要な最小活性単位を求めた。２時間後、１．０及び０．５ｍｇ／ｍｌの酵素装填量を含む反応は、ほぼ理論収率で９８％ｅｅ超までＰＭＡの（Ｓ）−対掌体を分割した。７２時間までに、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌの酵素装填量を含む反応は９９．５％ｅｅ超で（Ｓ）−ＰＭＡを分割した。しかし、インキュベーションの延長により、残留（Ｓ）−ＰＭＡ基質が更に加水分解され、０．５及び１．０ｍｇ／ｍｌで酵素を含む反応における（Ｓ）−ＰＭＡの収率はそれぞれ約２５および１０％まで（５０％の最大理論収率に基づく）低下した。
同様な実験において、エナンチオ選択的加水分解を、２５％（ｖ／ｖ）ＰＭＡを含む水性反応混合物中における酵素濃度の関数として調べた。結果は、２．０、１．０及び０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）はそれぞれ、４、６及び２４時間内に（Ｓ）−ＰＭＡを９９％ｅｅ超まで完全に分割することを示した（実施例４参照）。これに対して、０．１ｍｇ／ｍｌのＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）を含む反応混合物は３０時間以内に（Ｓ）−ＰＭＡ（６０％ｅｅ未満）を部分分割した。
従って、ほとんどの実施例において、反応時間は約２〜約７２時間であるが、約４〜約２４時間が好ましい。ＰＭＡに関しては、反応時間は約４〜約６時間がより好ましいが、ＰＥＡに関しては、反応時間は約８〜約１０時間がより好ましい。
いくつかの実施態様において、加水分解反応は単一バッチ反応において実施し；他の実施態様においては、加水分解反応は連続法において実施する。
エステル交換による分割
グリコールエーテル、詳細にはプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルのラセミ体の分割のためのエステル交換又はアシル化反応の種々のパラメーターを評価し、最適化することができる（実施例６〜７及び１１参照）。エステル交換反応は、酵素触媒及びラセミ基質の組合せである反応混合物中で起こり、酵素はエステル交換反応を触媒して、基質をアシル化生成物に転化する。２種以上の基質又は２種以上の生成物も存在できる。追加成分も反応混合物中に存在できる。反応条件は、種々の反応パラメーターの相対的重要性及び反応の間に到達すべき種々のパラメーターの目的値に応じて最適化する。種々のパラメーターの非限定的例としては、分割すべき対掌体の種類、収率及び純度の程度、分割すべきラセミ体の量又は分割対掌体の目的量、所望の反応時間、及び添加される酵素触媒の量が挙げられる。典型的に、収率は約３０〜約５０％、アシル化生成物の対掌体純度は典型的には約８０％ｅｅ超、より好ましくは約９０％ｅｅ超、更に好ましくは約９５％ｅｅ超である。基質の対掌体純度も高いが、典型的には生成物の対掌体純度ほど高くないことが多く；対掌体純度が比較的高い基質は典型的には約５０％超の転化率で得られる。しかし、収率及び純度は共に、分割される対掌体の種類及び反応条件に左右される。これは一つには、形成される生成物に加水分解又はアルコール分解が起こり得るためである。即ちエステル交換生成物、プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルアセテートは、ヒドロラーゼ触媒によって対応するプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルに加水分解又は脱エステル化される可能性があり、それらが再び、エステル交換反応の基質となる（しかし、これは基質の利用可能性によって制限されるであろう）。従って、可逆反応が残留出発原料の対掌体純度を低下させ、それによって分割効率が低下するであろう。収率及び純度の相互作用については以下に更に詳述する。
反応混合物中の酵素触媒製剤（非固定化又は固定化）の量（ｍｇ／ｍｌ）は、所望の反応速度が得られるように選択され、酵素触媒製剤の比活性によって異なる。いくつかの実施態様において、本発明のエステル交換反応における非固定化ＣＡＬ−Ｂ（精製タンパク質ではなく、粗製酵素製剤として）の量は、約０．００１〜約５０ｍｇ／ｍｌ（総反応容量）であることができるが、典型的には約０．５〜約２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１〜約２ｍｇ／ｍｌである。要するに、酵素装填量の調整は、反応工学によって生成物の光学純度を増加させる有効な方法であることが示された。
他の実施態様において、本発明のエステル交換反応における固定化ＣＡＬ−Ｂ（精製タンパク質ではなく、粗製酵素製剤として）の量は、約０．１ｍｇ〜約１ｇ／ｍｌ（反応混合物）であることができるが、典型的には約１ｍｇ〜約０．５ｇ／ｍｌ（反応混合物）、好ましくは約２．５〜約２００ｍｇ／ｍｌ（反応混合物）である。固定化ＣＡＬ−Ｂの場合には、分割は、回分式で反応を実施することによって、例えば反応器（例えばネジ蓋付き反応バイアル又は反応器）中で反応混合物に酵素を添加することによって、又は酵素の保持に膜を用いることによって達成できる。分割は、ラセミ基質を含む反応混合物を、固定化酵素を含むカラムに通すことによって連続式でも達成できる。回分式で使用する場合には、固定化酵素は、以下に詳述するように再循還することができる。
エステル交換用の反応媒体は好ましくは非プロトン性又は非水であり；従って、種々の実施態様において、媒体は少なくとも１種の溶媒又はイオン液体を含んでなり、好ましくは無極性である少なくとも１種の有機溶媒を含んでなるのが好ましく、少なくとも１種の有機溶媒はより好ましくは１つの有機溶媒である。このような有機溶媒の例としては、トルエン及びヘキサン並びにイオン液体が挙げられるがこれらに限定されない。溶媒のその他の例は、基質プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル（それら自体が有機溶媒であるため）、及び生成物が形成されたときには生成物である対応するアシル化プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル（これも有機溶媒である）である。非基質及び非生成物溶媒は補助溶媒と称される。イオン液体としては以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：１−エチル−３−メチルイミダゾリウム（例えば、［ＥＭＩＭ］−［ＢＦ４］）及び１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム（例えば、［ＢＭＩＭ］−［ＰＦ６］（ＢＦ４及びＰＦ６は対イオンとして、特に陰イオン成分として働く）。（Ｋｉｍ，Ｋ．−Ｗ．，ｅｔ ａｌ． ２００１． Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ： ｍａｒｋｅｄｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ． Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３：１５０７〜１５０９）及び（Ｌａｕ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２：４１８９）。
他の実施態様（実施例９〜１１参照）において、（±）−１−メトキシ−２−プロパノールアセテート（ＰＭＡ）を、酵素エステル交換による分割法においてエナンチオ選択的アシル化のためのアシル供与体して使用する。ラセミ体キラルグリコールエーテルをアシル供与体として使用すると、アシル化剤と分割アセテート及びアルコール又はアミン対掌体基質とが同時分割され得る。従って、酵素によって分割される基質の他に、アシル供与体の副生成物もまた、分割キラルグリコールエーテル及びグリコールエーテルアセテート化合物となる。酵素エステル交換による分割法におけるエナンチオ選択的アシル化のためのアシル供与体としての、ＰＭＡ及び他の非活性化ＰＧＡＥＡ化合物の有用性は、ＰＭＡを非活性化アシル供与体として用いた反応−ストリッピング実験によって示された。
エステル交換反応によって分割される基質は、グリコールエーテル、詳細にはプロピレングリコールエーテルアルキル（又はアリール）エーテルのラセミ混合物及びアシル供与体であり：代表的なグリコールエーテルアセテートは前記式Ｉによって示される。プロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルの非限定的例は図１に示してある。アシル供与体としては以下のものが挙げられる：活性化アシル供与体、例えば、活性化エステル（例としては、酪酸トリフルオロエチル、Ｓ−エチル＝チオ−オクタノエート、ビアセチル＝モノ−オキシムアセテートが挙げられるがこれらに限定されない）、エノールエステル（例としては、酢酸ビニル、酢酸イソプロペニル、及び酢酸１−エトキシビニル、並びにジケテンが挙げられるがこれらに限定されない）及び無水物（無水酢酸、ラクチド及びコハク酸無水物）。アシル供与体としてエノールエステル及び酸無水物を使用すると、実質的に不可逆性のアシル化が起こる。可逆反応は残留出発原料の対掌体純度を低下させるので、これはアルコールの分割に特に有用である。いくつかの実施態様において、アシル供与体としては以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酢酸２，２，２−トリクロロエチル、酢酸２，２，２−トリフルオロエチル、酢酸ブチル、酢酸エチルフェニル、酢酸イソプロペニル、メトキシ酢酸エチル、酢酸１−エトキシビニル、ジケテン、酪酸トリフルオロエチル、無水酢酸、ラクチド及びコハク酸無水物。最初の実験は、記載した最初の２つのアシル供与体に関しては、試験した全てのプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテルの転化がアシル化供与体としての酢酸ビニルを用いた場合に最も速いことを示した。本発明を実施するためのメカニズムを理解する必要はなく、また、本発明は基礎を成すメカニズムによって制限されないが、この速い反応の理由は、これらのエステル化剤がエノールエステルであり、その生成物であるアルコールがカルボニル化合物に互変異性化し、それが反応を推進し且つアルコール分解によって起こり得る生成物の阻害を排除することであると考えられる。アシル供与体はまた、非活性化アシル供与体、例えば酢酸エチル及びラセミ体キラル化合物、例えばラセミ体１−メトキシ−２−プロパノールアセテート（ＰＭＡ）を含む。非活性化アシル供与体の他の非限定的例としては、酢酸ブチル（ＢＡ）、酢酸エチルフェニル（ＥＰＡ）、酢酸エチル（ＥｔＡ）及びＰｎＰＡが挙げられる。この場合、反応混合物から副生成物アルコールを除去して、反応を推進し且つ試薬の転化を増大させるのが有利である。本発明者らは、副生成物アルコールが除去されなければ、正反応と逆反応の反応速度が本質的に同じになるように反応が平衡化される可能性があり、転化率は極限値に達することを発見した。
副生成物の例としては、酢酸エチルからのエタノール及びそれらの対応するキラル酢酸エステルから形成される一般的なキラル第二アルコールが挙げられる。反応器は、反応器からの蒸気の定期的除去による副生成物アルコールの除去を含む半回分式で操作できる。操作はまた、蒸気流中において除去された試薬を補充するために、試薬を定期的に添加することを含むことができる。本発明はまた、連続的に実施できる。これは、反応器からの蒸気の連続的除去及び試薬の連続的添加を含む。反応はまた、蒸留塔と組合せて実施できる。これは、転化を促進するために反応器に試薬を供給し、次いで蒸留塔までそれを進めて、副生成物を除去し且つアルコールの少ない試薬流を反応器に戻すことを含む。蒸気の除去又は蒸留を反応と組合せることによって、反応混合物から副生成物アルコールがストリップされて、副生成物アルコールを除去しない場合に可能な転化レベルよりも高い転化レベルまで反応を進めることが可能になる。
また、非反応性ストリッピング剤は、副生成物アルコールの除去を促進するために反応混合物に添加できる。例えば、窒素又はｎ−ヘキサンのようなストリッピング剤の使用は、所定の運転圧力で反応混合物の沸点より低い温度において蒸気の除去を可能にすることによって、反応全体にとって有益になり得る。ストリッピング剤を使用することが有益であるか否か、また、ストリッピング剤の最も適切な選択は、反応混合物の組成、副生成物アルコールの揮発性、並びに触媒の感熱性又は処理装置をどの程度低い圧力で運転可能であるかに関する実用限界による運転温度及び圧力への制約によるであろう。液体供給材料からの軽質成分の除去を促進するためのストリッピング剤の一般的使用は公知である。
種々の実施態様において、基質ラセミ体の濃度は約０．５〜約８５％ｖ／ｖ超であり；好ましくは、基質濃度は約５％超であり、最も好ましくは基質濃度は、可能な限り高いが、目的の転化度を達成するのに必要な充分な量のアシル供与体を収容できるものである。本発明者らは、アシル受容体（例えばプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びアシル供与体を含む反応媒体は約１００％（ｖ／ｖ）が基質であることができることを発見した。これは、これらの基質自体が有機溶媒であるため、また、反応媒体が非プロトン性であるのが好ましいためであると考えられる。例えば、アシル受容体（プロピレングリコールエーテルアルキル（又はアリール）エーテル）の濃度は約３０〜約７０％（ｖ／ｖ）であって、約１００％の総反応混合物容量までの残りの容量（即ち約７０〜約３０％（ｖ／ｖ））はアシル供与体（例えば酢酸ビニル）であることができる。この発見は、エステル交換反応を実施するための新しいアプローチを提供する。このアプローチにはまた、いくつかの利点がある。１つは、反応が極めて高い基質濃度で行われることができ、生成物が極めて高い濃度で生成されることである。もう１つは、分割対掌体（生成物及び基質）はそれ自体が有機溶媒であるので抽出の必要がないことである。従って、反応混合物からの固定化生体触媒の分離後に、分割対掌体を残りの反応混合物（又は反応マトリックス）から直接蒸留することによって分割対掌体をより迅速に回収できるため、より効率的であまり費用がかからない。
反応混合物中の水の存在（例えば混合物に約１〜約３％ｖ／ｖ添加された場合）は、反応速度を遅くするようである。しかし、水の効果は、反応の程度を制御する有用な方法である場合がある。他方、反応混合物中における水の存在は、競合する酵素反応である、アシル化生成物の加水分解を活性化するようである。従って、反応混合物中の水の不在は、アシル化生成物の加水分解の可能性を著しく減少させるようである。リパーゼが働くには水が必要であると考えられているが、ほとんどの市販有機溶媒又はほとんどの市販酵素製剤中には充分な量の水が存在するようであり、従って、反応混合物への追加の水の添加は通常は必要ない。
また、本発明者らは、基質溶媒のみの反応媒体中でエステル交換を行うことによって、また、反応の２種の基質、アシル受容体又はＰＧＡＥ及びアシル供与体の比を制御することによって、生成物の収率及び分割対掌体の純度を制御できることを発見した。従って、本発明はまた、基質溶媒のみの反応媒体中で酵素触媒エステル交換を制約することによって、また、反応の２種の基質、アシル受容体又はＰＧＡＥ及びアシル供与体の比を制御することによって生成物の収率及び分割対掌体の純度を制御する方法を提供する。この目的は、アシル供与体（例えば酢酸ビニル）の濃度を制限することなく、アシル受容体（例えばＰＧＡＥ）の出発濃度をできだけ高くすることである。この目的を達成することによって、分割アシル化生成物又は残留基質の実現可能な最高量が得られるであろう。この制御は、以下の仮定に基づく。基質はラセミ混合物であるので、いずれか一方の対掌体のその対応する生成物（アシル化ＰＧＡＥ）への理論最大転化率は５０％である。しかし、触媒であるヒドロラーゼ（好ましくは、リパーゼ又はエステラーゼ）は、両方の対掌体を基質としてアシル化すると考えられるが、一方の対掌体を優先的にアシル化する（即ちそれは一方の対掌体をエナンチオ選択的にアシル化する、例えば、ＣＡＬ−ＢはＲ−異性体をエナンチオ選択的にアシル化する）。従って、５０％の総基質転化率において、生成物の少なくとも一部の少量部分は他方の異性体である可能性が高く、これが第１の異性体生成物の純度を低下させる。従って、これよりわずかに低い（５０％よりわずかに低い、例えば、約４５％の）基質転化率では、より少ない割合の第２の異性体生成物が形成されるため、より高い純度の第１の異性体生成物が、それでもなお高い収率で生成される。その反面、５０％の総基質転化率では、少ないがことによると無視できない量の第１異性体基質が転化されなかった。従って、わずかに高い基質転化率（５０％よりわずかに高い、例えば約５５％の）基質転化率では、第１異性体基質はあまり残っていないので、より高純度の第２基質が、それでもなお高収率で存在する。従って、本発明のいくつかの実施態様において、ラセミ基質の転化度は、２種の基質、アシル受容体（即ちラセミ基質）及びアシル供与体の比によって制御できる。例えば、アシル供与体（例えば酢酸ビニル）に対するアシル受容体（例えばＰＧＡＥ）のモル比が２：１である場合には理論的に約５０％の総基質転化率が得られ；アシル供与体に対するアシル受容体の比は、１モルのアシル供与体が２モルのアシル受容体のうち１モル、即ちラセミ基質のちょうど約半分と選択的に反応できるように選択する。この比を変えることによって、基質転化度を制御でき、従って、第１異性体の生成物又は第２異性体の残留基質のいずれかを高収率で高純度に濃縮できる。例えば、目的ラセミ体（生成物又は残留基質のいずれか一方）の約９０％ｅｅ超の純度が約３５〜約６５％の基質転化率で達成できるであろう。
完全に選択的なエステル交換を仮定すれば、基質（グリコールエーテル及びアシル供与体）の分子量及び密度を用いることによって、目的とする転化度（最適収率）及びエナンチオ純度を達成するように計算された種々のモル比を達成するのに必要な容量を計算することができる。この時、これらの最適収率及び理論対掌体純度は予想値である。次に、計算容量の基質を、標準反応条件（以下に詳述する）下で酵素触媒と合し、基質転化度及び第１異性体生成物又は残留第２異性体基質の相対純度を監視する。実験又は実際観測収率及び純度は、予想値とは異なることがある。例えば、ＣＡＬ−Ｂの存在下におけるＰＰｈと酢酸ビニルとの反応において、７０／３０（ｖ／ｖ）の比は約７５％の基質転化率をもたらす予想される。しかし、典型的には実際には約４５％の転化率が、それぞれ約８０％ｅｅ〜約９８．５％ｅｅ超の（Ｓ）−ＰＰｈ及び（Ｒ）−ＰＰｈＡ純度と共に観察される。基質比を７６／２４（ｖ／ｖ）に変化させると、約５５％の基質転化率が得られると予想される。しかし、典型的には、実際には約４０％の転化率が、約９８％ｅｅの（Ｒ）−ＰＰｈＡ純度及び約６０％ｅｅの（Ｓ）−ＰＰｈ純度と共に観察される。要約すると、本発明は、高％ｅｅで目的生成物を生成するために、アシル供与体の量を制限することによって基質転化度を制御する有効な方法を提供する。
従って、いくつかの実施態様において、基質転化率の制御方法は、最初に、キラルＧＣ又はＨＰＬＣ分析（例えば、実施例中に記載されたようにして）によって評価しながら、転化（又はアシル化）基質の最適収率及び転化又は未転化基質の対掌体純度を求め、次いで、これらの収率を達成する（例えば、転化率を４５％又は５５％に限定する量のアシル供与体を提供する）基質の適当なモル比を決定し、次に、これらのモル比を達成するための基質の容量を、基質の分子量及び密度に基づいて計算し、次にこれらの計算基質容量を酵素触媒と合し、そして得られた反応混合物を標準反応条件下でインキュベートするものである。生成物の収率及び対掌体の純度を監視し、必要に応じて、観察された収率及び対掌体純度に基づいて基質の比を調整して、目的転化度（収率）及び最適対掌体純度を達成する。
従って、種々の実施態様において、基質濃度は約１０〜約９０％（ｖ／ｖ）であることができ、この場合にはアシル受容体とアシル供与体の百分率を合わせると総反応混合物の約１００％（ｖ／ｖ）になる。あるいは、他の実施態様において、基質濃度は約２０〜約８０％（ｖ／ｖ）であり、この場合にはアシル受容体とアシル供与体の百分率を合わせると約１００％（ｖ／ｖ）未満になる。この場合、残りの容量は有機溶媒として供給される。
エステル交換反応の温度は、反応速度、エナンチオ選択性、酵素触媒の安定性及び基質安定性を最適化するように選択する。例えば、反応温度を低下させると、エステル交換によるＰＭの分割に関してはリパーゼＣＡＬ−Ｂのエナンチオ選択性が増加する。従って、分割速度は遅くなったが、反応温度の低下は生成物の光学純度を増加させる有効な方法であった。この効果は、−２０℃〜３０℃の範囲の温度において示された。従って、種々の実施態様において、好ましい温度は、個々の基質によって異なるであろう。ＰＰｈのエステル化に関しては、好ましい反応温度は約２０〜３０℃であり、約２５℃の温度を典型的に使用した。
反応は撹拌しながら実施する。このような撹拌を実施するための手段としては、回転振盪又は羽根車による撹拌が挙げられる。
反応速度は、反応中に存在するリパーゼの量によって異なる。従って、反応時間は、リパーゼの添加量によって異なる。エステル交換に関しては、反応時間は約２〜約９６時間であるが、好ましくは約４〜約７２時間、より好ましくは約４〜約４８時間である。
エステル交換反応は、単一バッチ反応で実施することもできるし、連続法で実施することもできる。例えば、膜を有する反応器を使用して、固定化酵素を効率よく保持することができる。
グリコールエーテル分割に関して前述したエステル交換反応にはいくつかの利点がある。１つは、リパーゼ触媒アシル化の場合、比較的長鎖のアルキル及びアリールで置換されたグリコールエーテル及びそれらの酢酸エステルは加水分解分割条件下では限られた水溶性を有することである。更に、有機溶媒／基質中におけるリパーゼによるアシル化は極めて高い基質装填量で進行し、高い容量生産性を提供すると共に、蒸留及び生成物単離前の反応物質の抽出の必要性をなくす。
生体触媒の再循還
加水分解反応及びエステル交換反応の両者に使用された酵素触媒は再循還できる。これは、触媒反応が完了した混合物から酵素を回収して、新しい反応混合物に添加できることを意味する。酵素の回収及び再利用を酵素再循還と称する。従って、再循還は、反応体、生成物及び反応混合物の他の成分から生体触媒を分離する。酵素の再循還はいくつかの点で、例えば、サイクル当たりの反応コストの低下において有利である。
酵素の再循還は、水性反応混合物を濾過し、それによって酵素を濾過器上に保持することによって達成できる。あるいは又は更に、再循還は好ましくは固定化酵素を使用する。次いで、固定化酵素は、遠心分離、濾過を含む（これらに限定されない）多数の手段によって反応混合物から分離することもできるし、あるいは沈澱、反応器からの残留反応混合物の排出のような重量による沈降によって反応器中に保持することによって分離してから、新しい反応マトリックス（酵素触媒を含まない反応混合物である）を添加することもできる。
例えば、固定型のＣＡＬ−Ｂ、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｃ．−ｆ．Ｃ２ ｌｙｏ．（Ｒｏｃｈｅ）は、プロピレングリコールエーテルアセテート基質のそれぞれを２５％以下の基質装填量で分割することができた。固定化ＣＡＬ−Ｂはまた、ＰＰｈＡのエナンチオ選択的加水分解を調べるのに使用した。ＰＰｈＡに関するエナンチオ選択性は優れており、２５％ｖ／ｖのＰＰｈＡ装填量において（Ｓ）−ＰＰｈＡ及び（Ｒ）−ＰＰｈを９９％ｅｅ超及び約５０％の基質転化率で分割した。分割は、５０％以下の基質装填量で示され、２４時間の基質転化率は４５％であり、（Ｒ）−ＰＰｈ純度は９９％ｅｅ超及び（Ｓ）−ＰＰｈＡ純度は７５％ｅｅであった。しかし、固定化ＣＡＬ−Ｂは、２５％（ｖ／ｖ）ＰＰｈＡの基質装填量で多数の分割サイクルについて（Ｓ）−ＰＰｈＡ及び（Ｒ）−ＰＰｈの両者の効率的な分割を触媒した。
別の例において、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．Ｃ２（酵素装填量３０、６０及び１２０Ｕ／ｍｌ）の性能を、２０％（ｖ／ｖ）の基質装填量でＰＥＡ加水分解について実験規模で試験した。酵素の再循還は、１５超のサイクルについて示された（実施例８及び図６参照）。多数のサイクルにわたる分割性能は、１２０Ｕ／ｍｌの酵素装填量において最良であった。また、酵素再循還を、Ｒｏｃｈｅ製の固定化ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．Ｃ２，ｌｙｏ．）を２６．６ｍｇ／ｍｌの濃度で用い、２５％ ＰＭＡの３０バッチ（又はサイクル）の加水分解について示した。（Ｓ）−ＰＭＡのエナンチオ純度は２０％又は２５％の基質濃度で実施した実験において３０反応サイクルの間、約９７％ｅｅであった。
スケールアップ実験において、固定化ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．Ｃ２；約２４０Ｕ／ｍｌ）を、１．５リットル規模で２５％のＰＭＡの１５リサイクルのエナンチオ選択的加水分解に用いた。サイクル時間は２．５〜６時間であった。反応パラメーターは、反応温度３７℃、撹拌（羽根車速度）２００ｒｐｍ、及びｐＨ約７（２０％（ｖ／ｖ）水酸化ナトリウムの添加によって維持）を含んでいた。他のスケールアップ実験においては、固定化ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．Ｃ２；約２４０Ｕ／ｍｌ）を、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＡを基質とする３０サイクル超のエナンチオ選択的加水分解に用いた（実施例８並びに図７及び９参照）。約８時間のサイクル時間によって、（Ｓ）−ＰＥＡ及び（Ｒ）−ＰＥを高エナンチオ純度で分割できた。追加酵素（最初の装填量の〜１０％）をサイクル８、１０、１６及び２５において供給して、所望の反応サイクル時間を維持した。３２反応サイクルの間の平均生成物純度は（Ｓ）−ＰＥＡが９７．９％ｅｅ超及び（Ｒ）−ＲＥが９５％ｅｅ超であった。反応パラメーターはＰＭＡの場合と同様とした。これらの実験の生成物の回収について以下に記載する。
分割対掌体の回収
分割された両光学活性種は両方（グリコールエーテルアセテート及びグリコールエーテル）は、液液抽出、熱活性化分離、蒸留、液固吸着法又はそれらの組合せによって反応マトリックスから回収及び単離できる。
例えば、最初の一連の前記スケールアップ実験においては、塩化メチレンを用いた液液抽出が、９９％ｅｅ超の（Ｓ）−ＰＭＡ及び約８５％ｅｅの（Ｒ）−ＰＭを含む混合物の回収を容易にした。しかし、キラル（Ｒ）−ＰＭは水溶性であるので、水性反応混合物の抽出によって回収するのは困難であることがわかった。
別の例において、第２の一連の前記スケールアップ実験においては、塩化メチレンによる反応混合物の抽出は、それぞれ９８％ｅｅ及び９５％ｅｅの（Ｓ）−ＰＥＡ及び（Ｒ）−ＰＥの混合物を生成した。
更に別の例において、１５バッチ分のＰＭＡ加水分解反応及び３２バッチ分のＰＥＡ加水分解反応からの材料を蒸留して、キラルグリコールエーテル及びそれらの対応する対掌体酢酸エステルを単離する。
分割対掌体の有用性
前述のように、本発明の方法は、製薬産業（Ｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ７：３１８１〜３１８６）及び農業において多くの用途を有する分割対掌体を提供する。例えば、分割された化合物は、医薬、コンビケム（ｃｏｍｂｉ−ｃｈｅｍ）及び強誘電性液晶への使用の可能な出発原料と考えられる。これらはまた、化学−酵素法に組込んでジアステレオマーエステル（ラセミ体エステルではなく）を形成することによって生体分割の選択性を改良すると考えられる。他の用途において、それらは、増加する選択性に関して酵素性能を増大すると考えられる。他の側面のおいて、これらの分割化合物は、結晶化による「古典的分割」用の溶媒又は補助溶媒として並びに生体触媒反応用の補助触媒又はエステル交換用の溶媒として有用な、経済的な極性キラル溶媒を提供すると考えられる。更に、これらの溶媒は、結晶化によって誘導される動的分割（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＣＩＤＲ）に有用であるかもしれない。更に、これらの化合物は、同時蒸留時にキラル材料の選択的又は部分選択的共沸蒸留に使用できると考えられる。キラルクロマトグラフィーにおいて、分割された化合物は、移動相の単純なアルコールと置きかわって、存在するキラル分離を促進するか、固相に結合するリガンドとしてキラル分離に使用されると考えられる。他の用途としては、キラル塩基（アルコキシド）の製造、及びＴｉＣｌ4との反応よるキラルルイス酸の製造が考えられる。後者は、オレフィンのＳｈａｒｐｌｅｓｓエポキシ化及びスルフィドのスルホキシドへの酸化のような選択的酸化に使用されるかもしれない。
以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施態様及び側面を示し且つ更に説明するために記載するが、本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。
以下の実験の開示において以下の略語を適用する：Ｎ（規定）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｐｍｏｌ（ピコモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｌ又はＬ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメーター）；ｍｍ（ミリメーター）；μｍ（マイクロメーター）；ｎｍ（ナノメーター）；Ｕ（酵素活性の単位；典型的には転化された基質のモルとして表される）；℃（摂氏度）；％（パーセント）；（ｖ／ｖ）（容量／容量）；％Ｃ（転化率％）；ｅｅ（対掌体過剰）；Ｅ（エナンチオ選択率）。
実施例１
材料及び分析方法
基質
Ｐ系グリコールエーテル及びアシレートを基質として用いた。この系は以下のものを含んでいた：
プロピレングリコールメチルエーテル（また、１−メトキシ−２−プロパノール，ＰＭ）。
プロピレングリコールメチルエーテルアセテート（また、１−メトキシ−２−プロパノールアセテート，ＰＭＡ）。
プロピレングリコールエチルエーテル（１−エトキシ−２−プロパノール，ＰＥ）。
プロピレングリコールエチルエーテルアセテート（１−エトキシ−２−プロパノールアセテート，ＰＥＡ）。
プロピレングリコールｎ−プロピルエーテル（１−ｎ−プロピルオキシ−２−プロパノール，ＰｎＰ）。
プロピレングリコールｎ−プロピルエーテルアセテート（１−ｎ−プロピルオキシ−２−プロパノールアセテート，ＰｎＰＡ）。
プロピレングリコールイソプロピルエーテル（１−イソプロピルオキシ−２−プロパノール，ＰｉＰ）。
プロピレングリコールイソプロピルエーテルアセテート（１−イソプロピルオキシ−２−プロパノールアセテート，ＰｉＰＡ）。
プロピレングリコールｎ−ブチルエーテル（１−ｎ−ブチルオキシ−２−プロパノール，ＰｎＢ）。
プロピレングリコールｎ−ブチルエーテルアセテート（１−ｎ−ブチルオキシ−２−プロパノールアセテート，ＰｎＢＡ）。
プロピレングリコールｔ−ブチルエーテル（１−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−２−プロパノール，ＰｔＢ）。
プロピレングリコールｔ−ブチルエーテルアセテート（１−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−２−プロパノールアセテート，ＰｔＢＡ）。
プロピレングリコールフェニルエーテル（１−フェノキシ−２−プロパノール，ＰＰｈ）。
プロピレングリコールフェニルエーテルアセテート（１−フェノキシ−２−プロパノールアセテート，ＰＰｈＡ）。
酵素
種々のリパーゼ、エステラーゼ及びプロテアーゼを商業的供給業者から得た。その例としては、Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのＣｈｉｒｏＳｃｒｅｅｎ（商標）ＥＨキット；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ＵＳ販売はＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡによる）からのグルタリルアシラーゼ及びペニシリンＧアミダーゼであるＣｈｉｒａｚｙｍｅ（商標）Ｌｉｐａｓｅｓ ＆ Ｅｓｔｅｒａｓｅｓ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｅｔ ２；Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｌｅｍｏｎｔ，ＩＬ）からのＴｈｅｒｍｏＣａｔ（商標）ＱｕｉｃｋＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｅｓｔｅｒａｓｅ Ｋｉｔ；Ｆｌｕｋａ ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ ＡＧ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのＬｉｐａｓｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ及び組換えＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ型；並びにＡｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．（名古屋，日本）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、及びＧｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）からの工業酵素サンプルが挙げられる。酵素は、製造メーカーの忠告に従って４℃又は−２０℃で貯蔵した。
化学薬品及び溶液
アセトニトリル、ヘキサン（ＨＰＬＣ用）、酢酸ビニル、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4，９９．０％ ｍｉｎ．）及びリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4，９９．０％以上）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。（Ｓ）−プロピレンオキシドはＣｈｉｒｅｘから得た（バッチＴ６７８９３，Ｃｈｉｒｅｘ ｏｒｄｅｒ ｎｏ．６０７）。Ｓｏｒｅｎｓｅｎのリン酸緩衝液を２９．６モル％ ＫＨ2ＰＯ4及び７０．４モル％ Ｎａ2ＨＰＯ4ｘＨ2Ｏから指定された濃度で製造し、必要に応じてｐＨを７．２から調整した。
以下のプロピレングリコールアルキル／アリールエーテル及びそれらの酢酸エステルをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た：ＰＭ（９９．５％）、ＰＭＡ（９９．５％）、ＰＥＡ（９５％）、ＰｎＰ（９９％）、ＰｎＢ（９９％）、ＰｔＢ及びＰＰｈ（９３％；７％以下のジ（プロピレングリコール）フェニルエーテル、ＤＰＰｈを含む）。ＰＥ、ＰｉＰ、ＰｉＰＡ、ＰｎＰＡ、ＰｎＢＡ、ＰＰｈＡ及びグリコールエーテルの対掌体標準（以下の不斉合成を参照）はＴｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙにおいて製造した。ＰｔＢＡ対掌体の非ラセミ混合物は、５ｍｇ／ｍｌのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−１０（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の存在下でＰｔＢ及び酢酸ビニルを（モル比１：２）反応させることによって製造した。
不斉対掌体標準
ラセミ体のどの対掌体が酵素触媒反応において加水分解又はエステル交換されるかを判定するためには、分析方法において使用するための、空間的配置のわかっている標準を得ることが必要であった。これらの標準の使用は更に、ＧＣ保持時間と特定の公知化合物との相関を可能にした。そのために、Ｐ系グリコールエーテル及びそれらの対応する酢酸エステルの個々の構成員の純粋な対掌体を化学合成した。
最初に、（Ｓ）−ＰＭ及び（Ｓ）−ＰＭＡを合成し（実施例２参照）、それらのＧＣ溶出時間を測定した。２つの対掌体に関する溶出時間の相対的順序を、（Ｓ）−ＰＭ及び（Ｓ）−ＰＭＡの溶出時間を対応するラセミ体の溶出時間と比較することによって求めた。使用した分析条件下において、（Ｓ）−ＰＭＡは（Ｒ）−ＰＭＡより前に溶出し（それぞれ、４．１分及び４．２４分）、非アシル化対掌体、（Ｓ）−ＰＭ及び（Ｒ）−ＰＭについても同じ相対的溶出順序が観察された。種々の対掌体に関する溶出時間のこの相対的順序は、Ｐ系グリコールエーテル及びそれらの対応する酢酸エステルの他の構成員にも類推によって適用され、この系を含む酵素触媒反応の生成物及び残留基質の分析に使用された。続いて、Ｐ系グリコールエーテル及びそれらの対応する酢酸エステルの他の構成員の純粋な（Ｓ）−対掌体もまた、化学合成し（これらは、（Ｓ）−ＰＥ及び（Ｓ）−ＰＥＡ、（Ｓ）−ＰｎＰ及び（Ｓ）−ＰｎＰＡ、（Ｓ）−ＰｎＢ及び（Ｓ）−ＰｎＢＡ、並びに（Ｓ）−ＰＰｈ及び（Ｓ）−ＰＰｈＡを含んでいた）、相対溶出順序が正しいと確認した（以下の記載）。ＧＣ分析の結果は、ＰＥ、ＰＥＡ、ＰｎＰ、ＰｎＰＡ、ＰｎＢ、ＰｎＢＡ、ＰＰｈ及びＰＰｈＡの（Ｓ）対掌体が、分割ラセミ標準において観察された、対応する１−アルコキシ−２−プロパノール（又は１−アルコキシ−２−プロパノールアセテート）の第１溶出ピークに対応することを示した。
分析方法
ガスクロマトグラフ法 標準キャピラリー入り口、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）及びＬＥＡＰ−ＣＴＣ自動装入装置（１００サンプルトレイ）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈを分析に用いた。種々のＰ系基質を含むサンプルの分析に５種のＧＣ法を用いた。異なるＧＣ法は同一オーブン温度プログラムを用いたが、スクリーニングの間に使用した基質に特異的な化合物較正及び積分を含んでいた。簡潔に言うと、Ｓｕｐｅｌｃｏ製のβ−ＤＥＸ３２５キラル・キャピラリーカラム（３０ｍ×ＩＤ ０．２５ｍｍ，フィルム厚０．２５μｍ）を分離に用いた。カラム温度はＰＭ及びＰＭＡについては７０℃から１２０℃まで１０℃／分でプログラムし、他の基質及び生成物については１５０℃までプログラムした。キャリアガスは１８．０ｐｓｉ（定圧）のヘリウムとした。注入口及び検出器の温度はそれぞれ、２００℃及び２５０℃とした。アセトニトリル又は水中で２００：1に希釈したサンプルをスプリット比２５：１で注入した（１．０μｌ）。方法は、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ又はＳｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ製のラセミ体サンプルを０．００５〜０．５％の範囲の濃度で用いて較正し、化合物全てについてｒ2０．９９超を示した。
前記条件下における化合物保持時間を、グリコールエーテル生成物の主要成分である第二アルコール及びそれらの対応する酢酸エステルについて示す。ＰＥ、ＰｎＰ、ＰｉＰ、ＰｎＢ、ＰＰｈ及びそれらの対応する酢酸エステルの絶対立体配置は、分割ラセミ体に比較した、標準として合成された（Ｓ）−対掌体の溶出順序に基づいて対応づけた。いずれの場合にも、第二アルコール及びそれらの酢酸エステルの（Ｓ）−対掌体は、対応する（Ｒ）−対掌体の前に溶出した。（±）−ＰＭの場合には、対掌体の基線分離は達成されなかった。記載した条件下で、化合物の保持時間は以下の通りであった：（±）−ＰＭ（２．８１１分）、（Ｓ）−ＰＭＡ（４．１０４分）、（Ｒ）−ＰＭＡ（４．２４６分）、（Ｓ）−ＰＥ（３．２０３分）、（Ｒ）−ＰＥ（３．２４８分）、（Ｓ）−ＰＥＡ（４．７７４分）、（Ｒ）−ＰＥＡ（４．９３６分）、（Ｓ）−ＰｎＰ（４．１５７分）、（Ｒ）−ＰｎＰ（４．２２４分）、（Ｓ）−ＰｎＰＡ（６．０分）、（Ｒ）−ＰｎＰＡ（６．１４５分）、（Ｓ）−ＰｉＰ（３．６２９分）、（Ｒ）−ＰｉＰ（３．７１８分）、（Ｓ）−ＰｉＰＡ（５．３１６分）、（Ｒ）−ＰｉＰＡ（５．４４８分）、（Ｓ）−ＰｎＢ（５．３９４分）、（Ｒ）−ＰｎＢ（５．４８４分）、（Ｓ）−ＰｎＢＡ（７．４２分）、（Ｒ）−ＰｎＢＡ（７．５４５分）、（Ｓ）−ＰｔＢ（５．５５９分）、（Ｒ）−ＰｔＢ（５．９０８分）、（Ｓ）−ＰｔＢＡ（７．５２９分）及び（Ｒ）−ＰｔＢＡ（７．６７９分）。
（±）−ＰＭ対掌体は、２０．０ｐｓｉ（定圧）のヘリウムをキャリアガスとし且つオーブン温度が５０〜１５０℃に１０℃／分でプログラムされたＳｕｐｅｌｃｏ製のα−Ｄｅｘ １２０キラル・キャピラリーカラム（３０ｍ×ＩＤ ０．２５ｍｍ，フィルム厚０．２５μｍ）上でクロマトグラフィーによって分割できた。注入口及び検出器の温度はそれぞれ、２００及び２５０℃とし、アセトニトリル又は水中で２００：1に希釈されたサンプル（１．０μｌ）をスプリット比２５：１で注入した。これらの条件は、（Ｓ）−ＰＭ及び（Ｒ）−ＰＭをそれぞれ３．１３６分及び３．１９２分に分割した。
液体クロマトグラフ法 クォータナリーＬＣポンプ、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）、Ｐｅｌｔｉｅｒカラムオーブン及びＳｅｒｉｅｓ ２００オートサンプラーを装着したＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ２００液体クロマトグラフを、ＤＯＷＡＮＯＬ（商標）ＰＰｈ（１−フェノキシ−２−プロパノール；ＰＰｈ）及びその酢酸エステル（ＰＰｈＡ）を含むサンプルの分析に用いた。化合物は、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−ＲＨカラム（４．６×１５０ｍｍ；Ｃｈｉｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）上で一定組成の１０／４０／５０エタノール／アセトニトリル／水移動相を用いて０．６５ｍｌ／分の流量で、カラム温度を３５℃に保持しながら分離した。これらの条件下で、（Ｒ）−ＰＰｈ、（Ｓ）−ＰＰｈ、（Ｒ）−ＰＰｈＡ及び（Ｓ）−ＰＰｈＡに関する保持時間はそれぞれ、約６．０分、７．３分、１２．６分及び１３．１分であった。この方法は、ＧＣ−法によって完全には分割されなかったＰＰｈ対掌体の基線分割を実現したので、ＰＰｈｅｅ測定に有用であった。更に、ＰＰｈ及びＰＰｈＡは、ジ（プロピレングリコール）フェニルエーテル（ＤＰＰｈ；ＰＰｈの市販製剤中に７％以下で存在する）及びその酢酸ステル、ＤＰＰｈＡであると推定される微少量の不純物から充分に分離された。
実施例２
（Ｓ）−ＰＭ及び（Ｓ）−ＰＭＡの不斉合成
（Ｓ）−１−メトキシ−２−プロパノール［（Ｓ）−ＰＭ］
１００ｍｌ３つ口丸底フラスコに、冷却水コンデンサー、サーモウェル、熱マントル／温度調節器、電磁撹拌棒及びゴムセプタムを装着した。次いで、フラスコを、撹拌プレート上に置かれている加熱マントルに移し、コンデンサーの上から反応セットアップ上に窒素パッドを置き、反応の間じゅう保持した。フラスコに、メタノール（２２．９９ｇ）を装填し、次いで、撹拌しながら水酸化カリウム（０．０３２２ｇ）を添加し、設定値を４５℃に調節した。溶液が目的温度に達したら、あらかじめ冷却した（Ｓ）−プロピレンオキシド［（Ｓ）−ＰＯ；Ｃｈｉｒｅｘ Ｂａｔｃｈ Ｔ６７８９３，Ｃｈｉｒｅｘ ｏｒｄｅｒ Ｎｏ．６０７］を、シリンジを用いて約５ｍｌ単位でゴムセプタムを通して反応フラスコに添加した。合計１２．１９ｇのＰＯを反応フラスコに加えた。ＧＣ分析（以下の分析方法を参照）は、メタノール及びＰＯの、目的プロピレングリコールメチルエーテル（ＰＭグリコールエーテル）への最小転化率を示した。ＫＯＨを更に０．０２９４ｇ添加し、反応器を約１５時間５０℃において加熱した。サンプリング及びＧＣ分析は、未反応（Ｓ）−ＰＯがわずか０．００７％であることを示した。内部温度を１５０℃に増加させることによって、ＰＭグリコールエーテルを触媒及び比較的高沸点の副生成物からフラッシュ除去した。ＰＭグリコールエーテルフラクションは、９１〜１１８℃の頂部温度において沸騰し始め、約１５ｍｌの液体が回収された。フラッシュされた材料のＧＣ分析は、１−メトキシ−２−プロパノール（ＰＭ−２）９５．４％及び２−メトキシ−１−プロパノール（ＰＭ−１）３．２％を示した。
（Ｓ）−ＰＯの塩基触媒加水分解は、求核置換反応を受ける炭素における完全反転と共に進行する（Ｅｇｅ，１９８９）ので、ＰＭ−２を生成する開環反応は、キラル中心における立体配置を保持しながら起こり、得られる第二アルコールは（Ｓ）−配置である。これに対して、少ない方のＰＭ−１生成物はＣ２炭素における置換によって形成され、得られる第一アルコールは（Ｒ）−配置である。
（Ｓ）−１−メトキシ−２−プロパノールアセテート［（Ｓ）−ＰＭＡ］
２５ｍｌのフラスコに、（Ｓ）−ＰＭ−２／（Ｒ）−ＰＭ−１混合物４．０ｇ（０．０４４モル）を無水塩化亜鉛０．０２ｇと共に添加した。乾燥管を有する還流冷却器を取り付け、乾燥管を瞬間的に持ち上げることによって無水酢酸４．７ｇ（０．０４６モル）を添加した。混合物を約１１８℃において２時間還流し、次いで冷却させた。１％水溶液のＧＣ−分析は、市販のＰＭＡ−２対掌体について観察された第１ピークと一致する保持時間を有するＰＭＡ−２の単一ピークを示した。これらの結果は、第１のＰＭＡ−２ピークが（Ｓ）−対掌体であることを示した。単一ピークはＰＭＡ−１対掌体についても観察された。このピークはまた、市販混合物中に〜３％で存在するＰＭＡ−１の第１ピークと一致し、このことは、それが（Ｒ）−２−メトキシ−１−プロパノールアセテートであることを示した。これらの結果は、（Ｒ）及び（Ｓ）ＰＭＡ−１対掌体が、対応するＰＭＡ−２対掌体について観察されるのとは反対の溶出順序を示すことを示している。混合物を、無水炭酸ナトリウム２．４４ｇ（０．０２４モル）を添加し且つＣＯ2を放出させながら約１時間撹拌することによって中和した。短工程蒸留ヘッドを取り付け、熱源としてヒートガンを用いて反応生成物を蒸留した。９５〜１３７℃の範囲で沸騰する材料約５．０ｇを回収した。ＧＣ分析は、サンプル純度が約９５％（Ｓ−ＰＭＡ−２ ９２．６％及びＲ−ＰＭＡ−１ ２．７％）であることを示した。
実施例３
ＰＭＡの加水分解：酵素のスクリーニング
１１０種超の市販ヒドロラーゼのパネルを、ＰＭＡのエナンチオ選択的加水分解についてスクリーニングした。
方法
ＰＭＡのエナンチオ選択的加水分解のための市販酵素の最初のスクリーニングを、０．０６５Ｍ ＫＮａＰＯ4（（ｐＨ ７．２）のＳｏｒｅｎｓｅｎリン酸緩衝液中に０．５％（ｖ／ｖ）の基質（１０％水性原液から添加）及び１．０ｍｇ／ｍｌの酵素を含む反応０．２ｍｌ中で実施した。反応は、基質の添加によって開始し、３００ｒｐｍで水平に振盪しながら１．８ｍｌのテフロンライニングを施されたネジ蓋付きオートサンプラー中で３０℃（特に断らない限り）においてインキュベートした。酵素を含まない対照反応を用いて、非生物的転化を評価した。反応はアセトニトリル０．８ｍｌの添加によって終了させた。得られた溶液を少なくとも１時間冷蔵し、次いでＧＣ−ＦＩＤ（以下を参照）によって分析した。
結果
分析した最初の基質、ＰＭＡに関して、１１０種超の市販ヒドロラーゼのスクリーニングに基づく結果は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ型（ＣＡＬ−Ｂ）がＰＭＡの（Ｒ）−対掌体［（Ｒ）−１−メトキシ−２−プロパノールアセテート；（Ｒ）−ＰＭＡ］の選択的加水分解を触媒して、（Ｓ）−ＰＭＡを９９％ｅｅ超で分割することを示した（表Ｉに示した通り；この表は、ＰＭＡのエナンチオ選択的加水分解を触媒した酵素を記載している）。Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｌｙｏ．，（Ｒｏｃｈｅ）、Ａｌｔｕｓ １３（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、Ｌｉｐａｓｅ ＳＰ−４３５（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）及び組換えＣＡＬ−Ｂ（Ｆｌｕｋａ ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ）として供給された酵素製剤において、ＣＡＬ−Ｂの高いエナンチオ選択性が観察された。この実施例においてＣＡＬ−Ｂに関して記載したその他の研究は、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｌｙｏ．（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。
同様なエナンチオ選択性を示すが一般にスクリーニングアッセイにおいてより低いエナンチオ純度（８０％ｅｅ超）を示す他の酵素としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−６，ｌｙｏ；Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ（Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ）、リパーゼＰＳ−Ｃ１（Ａｍａｎｏ）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ）が挙げられる（表Ｉ）。ＣＡＬ−Ｂと逆のエナンチオ選択性を示す酵素としては、エステラーゼＥ００１、Ｅ００２及びＥ００３（Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。
Figure 2005520570
実施例４
加水分解：最適化
収率又は転化率（加水分解された基質の割合又は量として定量）、異性体純度（％ｅｅとして測定）、基質装填量（又は濃度）、酵素装填量、反応時間、反応温度及び反応媒体を含む種々の反応パラメーターを、実験室規模及び反応器規模（又はスケールアップ）のために最適化できる条件を割り出すために、実験を行った。
方法
基質の加水分解速度及び分割基質の対掌体過剰を典型的には、１．８ｍｌのテフロンライニングを施されたネジ蓋付きオートサンプラーバイアル中にセットされた反応混合物０．５ｍｌ中で評価した。特に断らない限り、反応混合物は、水平に回転振盪しながら（３００ｒｐｍ）、典型的には３０℃において、生体触媒としてＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｌｙｏ．，Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ型，１２０Ｕ／ｍｇ ｌｙｏ超）を用いてインキュベートした。少なくとも１０％（ｖ／ｖ）の基質を含む反応をサンプリングし、分析前にアセトニトリル中で１：１００に希釈した。一連の研究は、Ｐ系グリコールエーテルアシレートの加水分解分割のための酵素触媒としてのＣＡＬ−Ｂの性能を系統的に評価するため、及び効率的な酵素分割バイオプロセスの条件を特定するために実施した。以下の条件を、独立したスクリーニング実験において試験した：
・種々の溶媒を含む二相反応混合物（相比０．５）
・種々の二相反応混合物中における基質濃度の増加
・水性反応混合物中の種々の基質濃度における生成物濃度の増加
・水性反応及び二相反応における緩衝能の増加
・完全なエナンチオ選択的加水分解のための最大基質濃度
・二相反応における種々の酵素濃度
・高い酵素濃度及び基質濃度による転化反応の終点
・水性反応おける種々のインキュベーション温度
結果
トルエン及びヘキサンを用いた二相反応
酵素触媒ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２）による基質（ＰＭＡ）の加水分解を、二相反応条件下で比較的高い基質濃度及び種々の補助溶媒を用いて試験した。トルエン及びヘキサンを、１０％（ｖ／ｖ）ＰＭＡを含む反応において相比０．５（５０％ｖ／ｖ）で補助溶媒として添加した。同様な反応をセットアップして、基質及び溶媒の両者としての１０％（ｖ／ｖ）及び５０％（ｖ／ｖ）のＰＭＡを用いてＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２）の性能を試験した。反応を３０℃において１６時間インキュベートし、生成物をＧＣによって分析した。
結果は以下の結論を裏付ける。基質及び溶媒の両者としての５０％（ｖ／ｖ）のＰＭＡはわずかに抑制的であった。５０％（ｖ／ｖ）のトルエンは補助溶媒としては適当であったが、分割（Ｓ）−ＰＭＡの最終収率はより低かった（収率の低下は、より低いエナンチオ選択性又はより速い触媒反応の結果として残留（Ｓ）−ＰＭＡを加水分解する時間が長くなったことによると考えられる）。５０％（ｖ／ｖ）のヘキサンは、９９％ｅｅ超の（Ｓ）−ＰＭＡの高い収率が観察されたことに基づき、最良の補助溶媒であった。水性反応おける１０％（ｖ／ｖ）のＰＭＡは、効率よく加水分解され、（Ｓ）−ＰＭＡを高収率且つ９９％ｅｅ超で分割した。
ヘキサン及びトルエン二相反応おけるＰＭＡ濃度の増加
基質濃度の増加の影響を、補助溶媒としてヘキサン又はトルエンを含む二相反応において試験した。
補助溶媒として５０％（ｖ／ｖ）ヘキサンを用いてＰＭＡ装填量を１０％（ｖ／ｖ）から２５％（ｖ／ｖ）まで増加させると、（Ｓ）−ＰＭＡの最終エナンチオ純度は９９％ｅｅ超から８７％ｅｅ超まで低下した。２５％及び４０％のヘキサンを用いた５０％ＰＭＡを含む反応はそれぞれ、８３％ｅｅ超及び６６％ｅｅ超の最終（Ｓ）−ＰＭＡ純度を生じた。
生成物を抑制せずに完全なエナンチオ選択性を可能にする最高基質濃度を、補助溶媒としてのヘキサン及びトルエン（２５〜６５％，ｖ／ｖ）並びに２５％ｖ／ｖの一定水相濃度を用いる反応において１０〜５０％（ｖ／ｖ）のＰＭＡの加水分解を測定することによって割り出した。終点の分析はまた、ヘキサンが比較的良い補助溶媒であることを立証し、補助溶媒としてヘキサンを含む１０％（ｖ／ｖ）ＰＭＡは９９％ｅｅ超で（Ｓ）−ＰＭＡを分割することを更に示した。同一条件下で２０％（ｖ／ｖ）ＰＭＡを用いると、（Ｓ）−ＰＭＡのエナンチオ純度は９３％ｅｅに低下した。
水性反応おける１０％＆２５％ＰＭＡを用いたＰＭ濃度の増加の影響
ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２）がＰＭによって生成物抑制を受けるか否かを確認するために、水性条件下でＰＭ濃度を増加させて、ＰＭＡの加水分解を試験した。
加水分解度は、１５％（ｖ／ｖ）以下の添加ＰＭの存在下において１０％（ｖ／ｖ）ＰＭＡを含む反応においては影響されなかった。（Ｓ）−ＰＭＡの分割は、２時間までに最大理論収率で９９．５％ｅｅ超までなされた。しかし、２０％（ｖ／ｖ）のＰＭを含む反応においてはわずかな抑制が見られ、（Ｓ）−ＰＭＡのエナンチオ純度は〜９６％ｅｅまで低下した。この閾値を更に、添加ＰＭ濃度を増加させて（０〜５０％）２５％（ｖ／ｖ）ＰＭＡの加水分解を試験することによって分析した。これらの条件下において、基質の完全なエナンチオ選択的加水分解は、約１２．５％のＰＭを遊離させると推測され、最終生成物の添加は、転化度を抑制し且つ（Ｓ）−ＰＭＡの最終エナンチオ純度を低下させた。従って、これらの結果は、好ましい基質濃度は約２５％（ｖ／ｖ）であることを示している。
これらの反応の最終ｐＨは３．５〜４．５の範囲であった。従って、アルコール最終生成物による抑制に加えて、酢酸遊離によるｐＨ抑制の可能性も考えられた（以下を参照）。
前記結果に基づき、生成物の回収及び除去を総合した選択的方法は反応をより高い基質濃度で進行させることができることが考えられる（例えば、Ｉｎｄｌｅｋｏｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５２：４５９〜４７４；及びＩｎｄｌｅｋｏｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １１：４３６〜４４２）。
緩衝液濃度の増加
緩衝液濃度の増加の影響を、５０％（ｖ／ｖ）ＰＭＡ及び１ｍｇ／ｍｌ ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）を含む水性及び二相（ヘキサン２５％（ｖ／ｖ））中で試験した。
０、６６及び２００ｍＭのＳｏｒｅｎｓｅｎリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を含む反応は、４４時間にわたってＰＭＡの加水分解速度及び加水分解度に差を示さなかった。水性及び二相反応の場合に１８時間までに達した最終生成物のエナンチオ純度はそれぞれ、９３％ｅｅ超及び８４％ｅｅ超の（Ｓ）−ＰＭＡに相当した。これらの結果は、基質の加水分解過程で遊離された酢酸は反応の進行を抑制しないことを示唆した。水、６６ｍＭ緩衝液及び２００ｍＭ緩衝液中で実施した反応の最終ｐＨはそれぞれ、３．０〜３．５、４．０〜４．５及び４．５であった。
水性及び二相反応において完全なエナンチオ選択的加水分解を受ける最大ＰＭＡ濃度
水性及び二相条件（ｎ−ヘキサン；相比０．２）下で完全なエナンチオ選択的加水分解を引き起こすＰＭＡの最大濃度を割り出すために、基質加水分解度及び基質加水分解の最終％ｅｅを基質濃度の関数として測定した。酵素触媒は、１ｍｇ／ｍｌのＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）とした。
２５％（ｖ／ｖ）以下のＰＭＡを含む水性反応おいて６４時間までに９９．５％ｅｅ超の（Ｓ）−ＰＭＡの完全な分割が観察された。３０％（ｖ／ｖ）及び４０％（ｖ／ｖ）のＰＭＡを含む同様な反応ではそれぞれ、９７．５％ｅｅ超及び９５．５％ｅｅ超の（Ｓ）−ＰＭＡが生成された。２０％（ｖ／ｖ）のヘキサンを含む二相条件下では、これより低い生成物エナンチオ純度が観察され；２０％（ｖ／ｖ）、２５％（ｖ／ｖ）及び４０％（ｖ／ｖ）で装填されたＰＭＡは６４時間以内にそれぞれ、９８．５％ｅｅ超、９７％ｅｅ超及び９２％ｅｅ超で（Ｓ）−ＰＭＡに分割された。
これらの結果は、ＰＭＡは水性条件下で最も効率的に加水分解されること、及び使用実験条件下で完全なエナンチオ選択的加水分解を受けるＰＭＡの最大濃度は２５％（ｖ／ｖ）であることを示した（図２に示した通り）。
水性及び５０％へキサン二相反応におけるＰＭＡ加水分解に対する酵素濃度の影響
ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．，１２０Ｕ／ｍｌ超）を１．０、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度で含む反応を用いて、５０％（ｖ／ｖ）ヘキサンを含む二相条件下において１０％（ｖ／ｖ）ＰＭＡのエナンチオ選択的加水分解を行うのに必要な最小活性単位を求めた。
２時間後、１．０及び０．５ｍｇ／ｍｌの酵素装填量を含む反応は、ＰＭＡの（Ｓ）−対掌体をほぼ理論収率において９８％ｅｅ超まで分割した、７２時間までに、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上の酵素装填量を含む反応は（Ｓ）−ＰＭＡを９９．５％ｅｅ超で分割した。しかし、インキュベーション時間の延長により、更に加水分解が起こり、その結果、酵素を０．５及び１．０ｍｇ／ｍｌで含む反応おける（Ｓ）−ＰＭＡの収率はそれぞれ、約２５％及び１０％まで（最大理論収率５０％に基づく）低下した。
同様な実験において、加水分解を、２５％（ｖ／ｖ）ＰＭＡを含む水性反応おける酵素濃度の関数として試験した。結果を図３に示す。結果は、２．０、１．０及び０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）はそれぞれ、４、６及び２４時間以内に（Ｓ）−ＰＭＡを９９％ｅｅ超まで完全に分割することを示した（図３）。これに対して、０．１ｍｇ／ｍｌのＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）を含む反応は、３０時間以内に（Ｓ）−ＰＭＡを部分的に分割した（６０％ｅｅ未満）。
エナンチオ選択性に対する高い酵素濃度及びＰＭＡ濃度の影響
２．０及び５．０ｍｇ／ｍｌのＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）及び２５％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）の範囲のＰＭＡ濃度を含む反応を用いて、酵素選択性及び基質転化度を評価した。
２．０及び５．０ｍｇ／ｍｌの酵素装填量を含む水性反応は、６時間以内に４０％（ｖ／ｖ）以下のＰＭＡ装填量を分割し、最大収率で９５％ｅｅ超の（Ｓ）−ＰＭＡを生じた。３０時間のインキュベーション後に（Ｓ）−ＰＭＡの％ｅｅ又は収率にほとんど低下は見られなかった。このことは、記載した条件下では、ＣＡＬ−Ｂ製剤が（Ｒ）−ＰＭＡの加水分解に対して極めてエナンチオ選択的であることを示した。
水性反応におけるＰＭＡの加水分解に対する温度の影響
３０℃〜５０℃（５℃刻み）のインキュベーション温度の影響を、２５％（ｖ／ｖ）のＰＭＡ並びに１．０及び０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）を含む水性反応において試験した。これらの条件下で、ＰＭＡの加水分解は４０℃において最も速く、最終エナンチオ純度はこの温度においては影響されなかった。しかし、より少ない酵素装填量で３５℃においてインキュベートされた反応は、より長い時間、持続可能な触媒反応を示し、４０℃においてインキュベートされた反応よりも高い（Ｓ）−ＰＭＡエナンチオ純度を生じた。５０℃におけるインキュベーションは５時間以内に酵素を不活化した。
測定された加水分解速度が、温度による基質溶解度の差とは独立していると仮定するならば、これらの結果は、ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）に最適な温度は約４０℃であるが、３５℃ではより高い酵素安定性が観察されることを示した。
実施例５
その他のＰ系グリコールエーテルアセテートのエナンチオ選択的加水分解
加水分解：酵素スクリーニング
ＰＭＡのエナンチオ選択的加水分解に関してスクリーニングしたのと同じパネルの１１０種超の市販ヒドロラーゼを更に、その他のＰ系グリコールエーテルアセテートのエナンチオ選択的加水分解に関してスクリーニングした。これらの酵素は最初に、実施例２に一般的に記載したようにしてスクリーニングし、基質濃度は０．５％（ｖ／ｖ）とした。各期質に関して２種の反応をセットアップし、４時間及び２４時間で終了させた。４時間のサンプリングは、極めて速い加水分解反応を触媒する選択的酵素を特定するために実施した。最初に、同一ＧＣ条件下で分離されたＰＥＡ、ＰｎＰＡ、ＰｉＰＡ及びＰｎＢＡ対掌体の絶対配置を決める基準としてＰＭＡ対掌体の溶出順序を用い、最も速く溶出する対掌体に経験的に（Ｓ）−配置と決めた。続いて、この溶出を、化学的に合成された、対掌体として純粋な、公知の空間的配置を有する化合物を用いて確認した（実施例１に記載した方法で）。
各基質のエナンチオ選択的加水分解を触媒するいくつかの酵素を特定した。これらの酵素を「ヒット」と称する。これらのヒットの大部分は、グリコールエーテルアセテート基質の（Ｒ）−対掌体を加水分解して、グリコールエーテルアセテートの（Ｓ）−対掌体を８５％ｅｅ超で分割した。逆のエナンチオ選択性を示す酵素も存在し、最初の酵素スクリーニングにおいて特定された。これらの酵素としては、エステラーゼＥ００１、Ｅ００２及びＥ００３（Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）が挙げられる。しかし、これらの最初のスクリーニング反応において観察されたそれらのエナンチオ選択性は、それらの対応する酵素ほどは高くなかった。
最もエナンチオ選択的な酵素を、約２ｍｇ／ｍｌの酵素及び０．５％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）、２５％（ｖ／ｖ）のグリコールエーテルアセテート基質を含む０．５ｍｌ水性反応において再びスクリーニングした。これらの第２のスクリーニング反応を用いて、より高い基質濃度でエナンチオ選択的酵素の性能を試験した。ＰＥＡ、ＰｎＰＡ、ＰｉＰＡ及びＰｎＢＡの加水分解に関して最もエナンチオ選択的な酵素を表II〜Ｖに記載する。これらのうち、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ型（ＣＡＬ−Ｂ）がグリコールエーテルアセテート基質のそれぞれに対して最も選択的であった。ＣＡＬ−Ｂの選択性能は、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｌｙｏ．，（Ｒｏｃｈｅ）、Ａｌｔｕｓ １３（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ）、Ｌｉｐａｓｅ ＳＰ−４３５（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）及び組換えＣＡＬ−Ｂ（Ｆｌｕｋａ ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ）として供給された酵素製剤において観察された。複数のヒットが種々の商業的供給業者から同一酵素を同定したので、スクリーニングされた酵素の回収における重複は利点と見なされた。
Figure 2005520570
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ＣＡＬ−ＢによるＰＥＡ、ＰｎＰＡ、ＰｉＰＡ及びＰｎＢＡの選択的分割（前記表II〜Ｖに示される）に基づき、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｌｙｏ及びＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２，ｌｙｏ．を用いて、高基質濃度におけるＰＰｈＡのエナンチオ選択的加水分解を別々に試験した。１．０ｍｇ／ｍｌのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｌｙｏ．又は２６．６ｍｇ／ｍｌのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２，ｌｙｏ．及び１０、１５、２５、３５及び５０％（ｖ／ｖ）のＰＰｈＡを含む０．２ｍｌ水性反応を用いて、ＰＰｈＡ転化の酵素選択性及び程度を評価した。Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２，ｌｙｏ．を含む水性反応の分析は、（Ｓ）−ＰＰｈＡ及び（Ｒ）−ＰＰｈがいずれも、２５％以下の基質装填量において９９％ｅｅ（収率５０％）で分割されることを示した。３５％（８１％ｅｅ）及び５０％（７４％ｅｅ）の基質装填量では（Ｓ）−ＰＰｈＡの部分分割が観察された。Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｌｙｏ．を含む反応は、１０％の装填量で（Ｓ）−ＰＰｈＡを完全に分割し（９９％ｅｅ超）、１５％（ｖ／ｖ）、２５％（ｖ／ｖ）、３５％（ｖ／ｖ）及び５０％（ｖ／ｖ）で基質を装填すると、（Ｓ）−ＰＰｈＡが約９５％ｅｅ、８６％ｅｅ、７９％ｅｅ及び６９％ｅｅまで分割された。
ＣＡＬ−Ｂのエナンチオ選択性
種々のＰ系グリコールエステルアセテートに関するＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）のエナンチオ選択性を、水性反応において種々の条件下で試験した。いくつかの実験条件及び結果を、以下の表VIに要約する。
Figure 2005520570
これらの結果は、ＣＡＬ−ＢがＰＥＡ、ＰｎＰＡ、ＰｉＰＡ、ＰｎＢＡ及びＰＰｈＡのエナンチオ選択的加水分解を触媒し、（Ｓ）−酢酸エステル及び（Ｒ）−エーテルを共に高純度で生成することを示している。これらの結果はまた、ＣＡＬ−Ｂが広い基質特定性を示し、ほとんどの場合には試験された条件下では全ての基質装填量において高いエナンチオ選択性を保持することを示している。
高基質濃度までの種々の各グリコールエーテルアセテート基質濃度（５０〜７０％ｖ／ｖ）及び種々の酵素濃度におけるＣＡＬ−Ｂのエナンチオ選択的分割性能を表VIIに要約する。表VIIにはまた、グリコールエーテルアセテートのエナンチオ選択的加水分解に関するいくつかの最適パラメーターの概略を示してある。
Figure 2005520570
実施例６
エステル交換：最初の評価
ＣＡＬ−ＢによるＰＭのエステル交換
ＣＡＬ−Ｂがグリコールアルキル（又はアリール）エーテルのエステル交換を触媒できることを最初にいくつかの異なる反応において試験した。０．５ｍｌのこれらの反応は、５．０ｍｇ／ｍｌのＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）及び１０％（ｖ／ｖ）のＰＭを含んでおり、アシル供与体として酢酸ビニル又は酢酸エチルを用い、無極性補助溶媒としてトルエン又はヘキサンを用いるか用いずに行った。結果を表VIIIに示す。
Figure 2005520570
１６時間において実施した終点の分析は、ＣＡＬ−Ｂが、アシル供与体として酢酸ビニル又は酢酸エチルを用いたＰＭのエナンチオ選択的アシル化を触媒することを示した（表VIIIに示した通り）。別の実験は、最高のエナンチオ選択性が最初は無水条件下で酢酸エチルを９０％（ｖ／ｖ）で用いた場合に起こるらしいことを示した。しかし、好ましいアルコール対掌体のより速いエステル化の後にはおそらく、あまり好ましくないアルコール対掌体のよりゆっくりとしたアシル化が起こるという仮説に基づいて、酢酸ビニルを用いた高い初期エナンチオ選択性を除外することはできなかった。この仮説は、５．０ｍｇ／ｍｌのＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ ｌｙｏ．）が、アシル供与体として酢酸ビニル又は酢酸エチルを用いた５０％（ｖ／ｖ）以下のＰＭのエナンチオ選択的アシル化を触媒することを示した、反応の時間的な分析によって確認された。ＰＭ及び酢酸エチルをそれぞれ５０％（ｖ／ｖ）含む反応において、得られる（Ｒ）−ＰＭＡは、１時間以内に９８％ｅｅで形成された。
非活性化エステルである酢酸エチルがこの反応のアシル供与体として働くことができるという観察は、光学的に活性なＰ系グリコールエーテルが高収率で製造できることを示している。
ＣＡＬ−Ｂによるその他のＰ系グリコールエーテルのエステル交換
ＣＡＬ−Ｂを酵素触媒とし、酢酸エチル及び酢酸ビニルをアシル供与体とし、並びに有機溶媒を反応媒体としてＰ系グリコールエーテルＰＭ、ＰＥ、ＰｎＰ、ＰｉＰ、ＰｎＢ及びＰＰｈのエステル交換による分割を試験した。対応するグリコールエーテルアセテートの（Ｒ）−対掌体が高い光学純度で生成物として形成された。
試験した全てのグリコールエーテルの転化は最初は、アシル供与体として酢酸ビニルを用いた場合に最も速いことが観察された。
実施例７
エステル交換：最適化
収率又は転化率（アシル化された基質の割合又は量として定量）、異性体純度（％ｅｅとして測定）、基質装填量（又は濃度）、酵素装填量、反応時間、反応温度及び反応媒体を含む種々の反応パラメーターを、実験室規模及び反応器規模（又はスケールアップ）のために最適化できる条件を割り出すために、実験を行った。
酵素濃度及び温度の影響
酵素装填量の調整は、反応工学によって生成物の光学純度を増加させる有効な方法であることが示された。
基質／アシル供与体比７５／２５％（ｖ／ｖ）ＰＭ／ＶＡ及び８０／２０％（ｖ／ｖ）ＰＰｈ／ＶＡの１．０ｍｌの反応に関するＰＭ及びＰＰｈのエナンチオ選択的エステル交換を、２６．６、１３．３及び６．７ｍｇ／ｍｌのキャリア固定Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ型（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２．ｌｙｏ．）を用いて試験した。結果は、ＰＭＡ及びＰＰｈＡの（Ｒ）−対掌体酢酸エステル生成物に関する最高％ｅｅは、反応中の酵素濃度の減少と相関していることを示した。この相関は転化度とは独立していた。ＰＭの全転化率は、３種の酵素装填量に関する計算理論転化率（アシル供与体の量に基づく）よりも〜１０％高く、ＰＰｈの転化率は計算されたリオン転化率よりも〜１０％低かった。（Ｒ）−ＰＭ及び（Ｒ）−ＰＰｈＡ生成物への選択的アシル化の結果を図４に示す。この結果は、（Ｒ）−ＰＭ及び（Ｒ）−ＰＰｈＡ生成物の最高％ｅｅをもたらす条件が転化率％と独立し、試験された最低酵素装填量（６．６ｍｇ／ｍｌ）を含む反応に相関することを示す。
酢酸ビニルを用いたＰＭのエステル交換を種々の酵素装填量で試験した別の実験の結果を、以下の表IXに示す。
反応温度を低下させると、ＰＭのエステル交換による分割に関してはＣＡＬ−Ｂのエナンチオ選択性は増加した。分割速度は遅いが、反応温度の低下は、生成物の光学純度を増加させる有効な方法であった。この効果は、−２０℃〜３０℃の範囲の温度で示された。
ＰＭ／酢酸ビニル比７５／２５％又は７０／３０％ｖ／ｖの１．０ｍｌの反応に関するＰＭのエナンチオ選択的エステル交換を、振盪せずに３０、２０、４及び−２０℃（±２℃）においてインキュベートされた２６．６、１３．３、６．７、３．３及び１．７ｍｇ／ｍｌのキャリア固定Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ型（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２，ｌｙｏ．）を用いて試験した。最低酵素装填量を含み且つ最低温度（−２０℃）でインキュベートされた反応は、最高％ｅｅの（Ｒ）−ＰＭＡを生成したが、速度は最も遅かった。しかし、結果は、所望の分割性能に適当な条件は、最適化インキュベーション温度及び酵素装填量によって確認できることを示している。種々の温度においてインキュベートされた、種々の酵素装填量を含む反応の性能を表IXに示す。
Figure 2005520570
水の影響
アシル化速度及びエナンチオ選択性に対する水分活性及びリン酸緩衝液（３％ｖｏｌ．未満）の影響を、ＰＭ及びＰＰｈを用いて示した。含水量（水分活性）は、反応速度を遅くするが；しかし、含水量は反応の進行を制御するのに使用できると考えられる。
基質濃度の影響
表Ｘに示した通り、ＣＡＬ−Ｂは、７０％（ｖ／ｖ）以下の基質濃度におけるグリコールエーテルＰＭ、ＰＥ、ＰｎＰ、ＰｉＰ、ＰｎＢ及びＰＰｈのエナンチオ選択的分割を、５０〜１５０超のエナンチオ選択率（Ｅ）値で触媒することが示された。
Figure 2005520570
（Ｒ）−エステルの純度は、反応の持続時間、又は生成物が分析された段階によって異なる。これはまた、基質転化率が５０％より高いか低いかによっても異なる（ＣＡＬ−Ｂによって触媒された酢酸ビニルによるＰＰｈのエステル交換に関する結果を図５に示す）。典型的には、５０％未満の基質転化率においては、（Ｒ）−エステルが高いｅｅ値で存在する。例えば、（Ｒ）−酢酸エステルに関しては、ＰＥＡが約９６％ｅｅ超であり、ＰＰｈＡが約９５％ｅｅ超であり、残りの、Ｐ系グリコールエーテルの（Ｒ）−酢酸エステルは約８０％ｅｅ超であった（例えば、約８７％、８９％及び８２％がＰｎＢＡに関して観察された）。
アシル供与体
種々の可能なアシル供与体の性能を、６．６ｍｇ／ｍｌのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２．ｌｙｏ、基質又はアシル受容体としてのＰＥ及び１．０モル当量に相当する量のアシル供与体を含む１．０ｍｌの反応において試験した。得られたＰＥ基質装填量は３５〜５５％（ｖ／ｖ）の範囲であり、残りの反応容量はアシル供与体であった。同様な反応において、ＰｎＰを基質とし、アシル供与体を１：１及び１：２に対応するモル比で用いた。得られたＰｎＰ基質装填量は３１〜５９％（ｖ／ｖ）の範囲であり、残りの反応容量はアシル供与体であった。試験したアシル供与体は、酢酸ブチル（ＢＡ）、酢酸エチルフェニル（ＥＰＡ）、酢酸エチル（ＥｔＡ）、トリクロロ酢酸エチル（ＥｔＣＡ）、トリフルオロ酢酸ビニル（ＥｔＦＡ）、酢酸イソプロペニル（ＩＰＡ）、酢酸ビニル（ＶＡ）、メトキシ酢酸エチル（ＥＭＡ）、酪酸２，２，２−トリフルオロエチル（ＴｆＥＢ）、ジケテン（ＤＫ）及びプロピオン酸ビニル（ＶＰ）である。反応は３０℃においてインキュベートし、２４時間にわたってサンプリングした。形成された分割（Ｓ）−基質及び（Ｒ）−エステルの％ｅｅ並びに転化率％を表XIに示す。
Figure 2005520570
アシル供与体としてトリクロロ酢酸エチル又はジケテンを用いた場合にはエステル交換はほとんど認められなかった。これらの結果は、酢酸ビニル及び酢酸イソプロペニルが有効なアシル供与体であって、グリコールエーテルアシル化に対して高い選択性を与えることを示している。
適当なアシル供与体の選択は、その他の考慮事項によって誘導する。このような考慮事項としては、反応中に形成される生成物の型、並びに揮発性及び毒性を含む、その生成物の特性が挙げられる。例えば、アシル供与体として酢酸ビニルを使用すると、ビニルアルコールが生成され、これはアセトアルデヒドに互変異性化することがわかっている。アセトアルデヒドは、極めて引火性で（引火点−４０℃）、動物の発ガン物質ではないかという疑いが持たれており、蒸留によって効率よく回収するのが困難である。従って、生成物は安全上の問題があり、健康上有害であり、分割対掌体の分離に使用される蒸留装置を汚染すると考えられる。他方、アシル供与体として酢酸イソプロペニルを使用すると、イソプロペニルアルコールが生成され、これはアセトンに互変異性化することが考えられる。アセトンはより高い引火点（−１７℃）を有するため、アルデヒドほどは引火性でなく、発ガン物質でないかという疑いもなく、分割された対掌体から蒸留するのにより適当であることがわかるであろう。更に、表XIIに示した別の実験は、酢酸イソプロペニルがＰＭ、ＰＥ、ＰｎＰ、ＰｎＢ及びＰＰｈの有効且つ選択的なアシル供与体であることを示している。
Figure 2005520570
アシル供与体に対する基質の比：基質転化度の制御
ＰＭ及びＰＰｈのＣＡＬ−Ｂ触媒エステル交換をそれぞれ、８０％及び８４％の基質装填量で示した。反応の残りの容量は酢酸ビニル（アシル供与体として）であった。アシル供与体の量の制限は、基質転化度を制御する有効な方法であり；従って、アシル供与体の量は、５０％の基質転化率よりもわずかに低いかわずかに高い転化率を可能にするのに充分な量で供給する。この概念はまた、所望の転化度に関して許容できる最高基質濃度の使用によって容量生産性を最大にすることに重点を置く。
別の実験によって、酢酸ビニルがアシル供与体である場合の、種々のアシル供与体比におけるグリコールエーテル基質のエステル交換を試験した。結果を以下の表XIIIに示す。
Figure 2005520570
実施例８
触媒の再循還
加水分解又はエステル交換用の酵素触媒は再循還することができる。以下の実験は、プロピレングリコールエーテルアセテートのエナンチオ選択的加水分解への使用時にＣＡＬ−Ｂを再循還するための種々のパラメーターを評価及び最適化するために行った。
酵素再循還は、２５、３５及び４５％（ｖ／ｖ）の濃度のＰＭＡ及び１３ｍｇ／ｍｌのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２．（約１０Ｕ／ｍｇ）を含む０．５ｍｌの水性反応において試験した。反応は４０℃において３００ｒｐｍで回転振盪しながらインキュベートした。分析は２４時間のサイクルの間に実施し、その時点で、反応溶液を除去し、基質を含む新しい緩衝液を元の固定化酵素に添加して、次の反応サイクルを開始した。３５％及び４５％の基質濃度において、サイクル３まで分割は不完全であり、両酵素とも（Ｓ）−ＰＭＡを９２％ｅｅ以下の純度で生成した。これに対して、２５％のＰＭＡを含む反応は一般に、６つの反応サイクルを通して（Ｓ）−ＰＭＡを９６〜９８％ｅｅ超まで分割した。別の酵素再循還の研究を、２０及び２５％基質装填量において実施した。Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２に関しては、（Ｓ）−ＰＭＡのエナンチオ純度は、２０％又は２５％の基質濃度を用いて実施された実験において３０反応サイクルの間、約９７％ｅｅであった。
ＰＭＡ分割のスケールアップを、ＢｉｏＦｌｏ ３５００ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で１．５ Ｌの反応容量で、２５％（ｖ／ｖ）ＰＭＡの基質濃度において行った。２６．６ｍｇ／ｍｌのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２（約２８０Ｕ／ｍｌ）の初期酵素装填量において、１５サイクルまで（各反応サイクルの長さは約２〜５時間の範囲であった）の間は２５％ＰＥＡの分割が観察された。各サイクルの最後に、撹拌を止め、沈降した固定化ＣＡＬ−Ｂ生体触媒を反応器中に保持しながら、分割された反応マトリックスを除去した。ラセミ体ＰＭＡを含む新鮮な緩衝液を反応器に加えて、次のサイクルを開始させた。１５の分割サイクルの間に、追加の酵素は添加しなかった。１５の分割サイクルの間に塩化メチレン抽出後に回収された（Ｓ）−ＰＭＡ及び（Ｒ）−ＰＭの平均エナンチオ純度はそれぞれ、９９．５％ｅｅ超及び８５％ｅｅ超であった。
固定化ＣＡＬ−Ｂ（Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．Ｃ２；約２４０Ｕ／ｍｌ）を、ＰＥＡを基質とするいくつかの異なる酵素再循還実験に用いた。これらの実験は実験室規模（５ｍｌ未満）及び１．５−Ｌ規模の両方で行った。１つの実験においては、３つの異なる酵素装填量について１５サイクル（サイクル時間は一般に２４時間であった）より長い間、１ｍｌの反応容量中における２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＡの分割が観察された。この実験において、反応マトリックスを、各サイクルの最後に固定化ＣＡＬ−Ｂから除去し、分析し、新しい反応マトリックスをこの固定化酵素に添加して、次のサイクルを開始させた。反応混合物を約４０℃においてインキュベートした。結果は図６に示す。これらの結果は、使用した実験条件下では、いくつかのサイクルで（Ｓ）−ＰＥＡの非常に良好な分割を観察できること及び酵素濃度高いほど、多くのサイクルの間、高い分割を生じることを示している。
別に実験において、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＡの分割を、ＢｉｏＦｌｏ ３５００ Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で反応容量１．５Ｌの反応容量までスケールアップした。生体触媒の再循還は３０サイクル超の間（各サイクルの長さは約２〜約９時間であった）、ＣＡＬ−Ｂによる分割を可能にした。この実験において、反応マトリックスを、各サイクルの最後に固定化ＣＡＬ−Ｂから除去し、分析し、新しい反応マトリックスをこの固定化酵素に添加して、次のサイクルを開始させた。反応混合物をｐＨ７．２に保持し（２０％水酸化ナトリウムの添加によって）、３７℃においてインキュベートした。各サイクルの過程においてサンプルを除去し且つ分析することによって、生成物のエナンチオ純度を監視した。最初の１８サイクルの結果を図７に示す。基質の分割に必要な反応サイクル時間が増加した時、新しい酵素（最初の装填量の１０％）を反応器に添加した。これはサイクル８、１０、１６及び２５において行った。３２のＰＥＡ分割サイクルにわたって性能を図８に示す。各サイクルの最後のサンプルを用いて、（Ｓ）−ＰＥＡ及び（Ｒ）−ＰＥ両方の分割（％ｅｅとして表す）並びに総転化率（％として表す）を計算した。結果を図８に示す。これらの結果は、スケールアップ条件下において、いくつかのサイクルにわたって、（Ｓ）−ＰＥＡ及び（Ｒ）−ＰＥ両者の非常に良好な分割及び高転化レベルを観察できることを示している。更に、これらの実験は、スケールアップ条件下におけるＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．Ｃ２の有効な再循還を示している。再循還は、サイクル当たりの酵素コスト寄与を著しく低下させた。更なる酵素再循還は、より有利なプロセス効率及び全生成物経済性を提供できるであろう。高濃度のＰＰｈのエステル交換による分割は、以下の条件下、１．０−Ｌの規模でアシル供与体として酢酸ビニルを用いてＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．Ｃ２（６．６ｍｇ／ｍｌ）によって示した。５０％未満に転化される反応を、ＰＰｈ／ＶＡ比７０／３０〜７６／３０で構成し、室温において進行させて、（Ｒ）−ＰＰｈＡを高％ｅｅで生成した。５０％超の転化率が望ましい反応に関しては、７０／３０のＰＰｈ／ＶＡ比を用い、４℃においてより高いエナンチオ選択性が得られ、典型的には（Ｓ）−ＰＰｈ及び（Ｒ）−ＰＰｈＡの生成物エナンチオ純度はそれぞれ９０％ｅｅ超及び９５％ｅｅ超である。撹拌は、電磁撹拌棒によって行う。反応容量からの固定化酵素の分離は濾過によって行うことができる。これらの条件下における酵素の再循還は５〜８サイクルの間、行うことができる。
別の反応を、エステル交換条件下において１．０リットル規模で種々のＰＧＥＡ基質を用いて実施して、対応する（Ｓ）−ＰＧＡＥ及び（Ｒ）−ＰＧＡＥＡを高エナンチオ純度で分割した。この研究における酵素を、バッチ分割の複数のサイクルに再利用した。条件及び分割性能を表XIVに要約する。
Figure 2005520570
実施例９
キラルアシル供与体としてのラセミ体ＰＭＡ
方法：
１．８ｍｌのバイアルに、以下の量のラセミ体１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノール（ＰｔＢ）、記載したアシル供与体及び生体触媒（酵素）としてのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ Ｃ２を加えた。ＰｔＢのおおよその理論転化率は、基質及びアシル供与体のモル比に基づく。１００％超の理論転化率値は、供給されたアシル供与体が化学量論過剰であったことを意味する。
Figure 2005520570
総容量１．０ｍｌの反応混合物を、４℃において振盪しながらインキュベートした。サブサンプルを、６５時間にわたって定期的に除去し、キラルＧＣによって分析して、ＰｔＢの転化率並びに得られた酢酸エステル生成物１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノールアセテート（ＰｔＢＡ）、ＰＭＡ及びＰＭのエナンチオ純度を監視した。
結果
表XVに示した結果は、ＤＯＷＡＮＯＬ ＰＭＡがＰｔＢの酵素エステル交換においてアシル供与体として働いて、（Ｒ）−ＰｔＢＡを高エナンチオ純度（９９％ｅｅ超）で生成できることを示している。（Ｒ）−ＰｔＢの高選択性アシル化に加えて、酵素選択性もキラルアシル供与体、ＰＭＡの使用において観察された。反応１及び２は、ＣＡＬ−Ｂが（Ｒ）−ＰＭＡをアシル供与体として優先的に使用して、ＰｔＢのアシル化と同時に（Ｒ）−ＰＭを副生成物として形成し且つ（Ｓ）−ＰＭＡを部分分割することを示している。グリコールエーテル基質（例えばＰｔＢ）のキラルＰＭＡに対する比及び揮発性（Ｒ）−ＰＭの除去は、原則として、反応転化度の制御に用いることができる。例えば、ＰｔＢ／ＰＭＡを容量比５０：５０（反応１）及び７０：３０（反応２）で含む反応はそれぞれ、ＰｔＢ転化率３１％及び２０％で９９％ｅｅ超のＲ−ＰｔＢＡを生成した。また、酵素濃度、反応時間及びインキュベーション温度を反応速度及びエナンチオ選択性の制御に使用できることも留意すべきである。結果を表XVに示す。
Figure 2005520570
実施例１０
キラルアシル供与体としてのラセミ体ＰＭＡ
方法
グリコールエーテル基質とアシル供与体との比の変化の影響を更に試験した。ＰｔＢ／ＰＭＡ容量比３０：７０，４０：６０、５０：５０、６０：４０及び７０：３０のを含む反応混合物を用いて、転化度及びＲ−ＰｔＢＡ、Ｓ−ＰｔＢ、Ｒ−ＰＭ及びＳ−ＰＭＡから得られる分割を試験した。反応は、１．８ｍｌのバイアル中に以下の量のラセミ体ＰｔＢ、アシル供与体としてのＰＭＡ及び生体触媒（酵素）としてのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ Ｃ２を含んでいた。
Figure 2005520570
１００％超の理論転化率値は、供給されたアシル供与体が化学量論過剰であったことを意味する。１．０ｍｌの反応混合物を４℃において振盪しながらインキュベートした。サブサンプルを４８時間にわたって除去し、キラルＧＣによって分析して、ＰｔＢの転化率並びにＰｔＢ、ＰｔＢＡ、ＰＭＡ及びＰＭのエナンチオ純度を監視した。
結果
種々の容量比のＰｔＢ／ＰＭＡを含む反応は、種々のＰｔＢ転化度を示し、Ｒ−ＰｔＢＡを９９％ｅｅ超で且つ（Ｓ）−ＰｔＢを種々のエナンチオ純度で分割した（表XV参照）。ＰｔＢ／ＰＭＡを３０：７０の比で含む反応は、ＰｔＢの最高転化率を示し、それより高い割合のＰｔＢ及びより少ない量のアシル供与体を含む反応よりも高いエナンチオ純度にそれを分割した。更に、キラルアシル供与体としてのＲ−ＰＭＡの選択的利用は、Ｒ−ＰＭを効率よく分割し、Ｓ−ＰＭＡ対掌体を濃縮した。結果を表XVIに示す。
Figure 2005520570
実施例１１
キラルアシル供与体としてのラセミ体ＰＭＡ
実験Ａ
方法
前記反応においてみられる転化度に基づき、減圧下におけるＰＭストリッピングの効果を、ＰｔＢ／ＰＭＡを容量比６０：４０で含む１００ｍｌの反応に関して試験した。ＰＭの除去後、反応に更にＰＭＡを加えた。反応＃１からのＲ−ＰＭの回分式除去及び新しいアシル供与体（ＰＭＡ）のそれに続く添加を用いて、反応性蒸留計画の概念を明らかにした。ＰＭストリッピングを行わずに、転化度及び生成物のエナンチオ純度を評価する対照反応には、（ｉ）ＰＭＡの単一添加（反応＃２）及び（ｉｉ）回分式ＰＭＡ添加（反応＃３）を行った。この反応は、以下の量のラセミ体ＰｔＢ、アシル供与体としてのＰＭＡ及び生体触媒（酵素）としてのＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ Ｃ２を含んでいた。
Figure 2005520570
反応混合物を、２５０ｍｌのガラス容器中で３０℃において撹拌しながらインキュベートした。反応１のストリッピングは、１．５時間毎に以下のようにして実施した：液相を固定化酵素から丸底フラスコ中にデカントし、減圧下で７４℃において回転蒸発に供して、ＰＭを除去した。ＰＭ除去後、反応内容物を冷却し（３０℃）、サンプリングし、ＰＭＡを更に供給した。
結果
結果は表XVIIに示す。これらの結果は、反応１及び反応３において得られたＰｔＢの（Ｒ）−ＰｔＢＡへの最終転化率がそれぞれ、７０％及び４６％であったことを示す。この差は、反応３におけるアシル供与体副生成物（ＰＭ）の蓄積によるものであり、不都合な反応平衡がそれ以上の転化を抑制する。両反応において形成された（Ｒ）−ＰｔＢＡは９９％ｅｅ超であった。しかし、キラル副生成物（Ｒ）−ＰＭのストリッピングによって達成されたより高い転化率は、反応１においては（Ｓ）−ＰｔＢを８４％ｅｅ超に分割できたが、反応３においては（Ｓ）−ＰｔＢの分割はわずか６５．６％ｅｅであった。反応１は７０％のＰｔＢ転化率を示したが９９％ｅｅ超の（Ｒ）−ＰｔＢＡを含んでいた。これは、ストリッピングプロセスにおける反応からのＰｔＢの部分的減少による。ＰＭＡがアシル供与体としてエナンチオ選択的に利用されたことは、反応１において回収された（Ｒ）−ＰＭの分析によって明らかである。回収された（Ｒ）−ＰＭは、１．５時間、３．０時間及び４．５時間の時点で凝縮された材料についてエナンチオ純度が６６％ｅｅ〜７４％ｅｅの範囲であった。
この実験は、回分式でオフライン副生成物除去によって行ったが、反応性蒸留計画での連続生成物除去にも概念は有効であり、拡大できるであろう。回収された（Ｒ）−ＰＭは、アシル供与体として酢酸ビニルを用いて第２の分割において品質を向上させて、高エナンチオ純度の（Ｒ）−ＰＭＡを生成することができる。
Figure 2005520570
実験Ｂ
方法
第２の実験は、ＰｔＢ／ＰＭＡを容量比５０：５０で含む１００ｍｌの反応において減圧下におけるＰＭストリッピングの効果を試験するために行った。実験条件は、指定された時間に５０ｍｌのＰＭＡをアシル供与体として供給する以外は、実験Ａに記載したのと同様であった。反応は以下の成分を含んでいた。
Figure 2005520570
結果
実験Ｂの結果（表XVIII）は、実験Ａにおいて示された効果を裏付けた。反応１及び３において得られたＰｔＢの（Ｒ）−ＰｔＢＡへの最終転化率はそれぞれ、７７％及び４３％であった。５０％のアシル供与体の存在下でも、反応３におけるアシル供与体副生成物（ＰＭ）の蓄積は、実験Ａにおいて観察されたレベル以上に転化を抑制した。更に、両反応において形成された（Ｒ）−ＰｔＢＡは９９％ｅｅ超に達した。反応１において（Ｒ）−ＰＭのストリッピングによって達成されたより高い転化率はまた、５時間以内に（Ｓ）−ＰｔＢを８０％ｅｅ超まで分割できるのに対し、（Ｓ）−ＰｔＢの分割は反応３においてはわずか６０％ｅｅであった。アシル供与体副生成物の除去は、基質をより高い転化率でより高いエナンチオ純度の生成物にすることができるという点で明らかに有利である。実験Ｂの反応１から回収された、ストリッピングされた（Ｒ）−ＰＭのエナンチオ純度は、６９〜８７％ｅｅであった。ストリッピングの効果は、反応１及び３のＰｔＢ転化度並びに生成物エナンチオ純度の比較によって明らかである。
Figure 2005520570
実施例１２
（Ｒ，Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノールからの
（Ｓ）−１，２−プロパンジオールの製造
工程（ａ）：（Ｒ，Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノールの酵素分割
（Ｒ，Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノール（ＰｔＢ）３６６ｍｌ及び酢酸ビニル１３４ｍｌを含む１．０Ｌ反応容器に、３．３５ｇの固定化ＣＡＬ−ＢをＣｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２ Ｃ２として添加した。（Ｒ，Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノール及び酢酸ビニルを容量比７３：２７（ＰｔＢのＰｔＢＡへの約６０％の転化に充分である）で含む５００ｍｌの反応を３０℃において撹拌しながらインキュベートした。生成物の収率及びエナンチオ純度を、２０〜２４時間のインキュベーション時間にわたってキラルＧＣによって監視した。生成物の収率は典型的には、２０時間以内に約５０％の転化率を示し、その時点で反応の溶媒相を固定化酵素粒子から濾過によって分離した。固定化酵素は、容量比７３：２７の（Ｒ，Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノール及び酢酸ビニルを５００ｍｌの容量ずつ更に加えることによって、このようにして１０以上の分割サイクルの間、アシル化触媒として再循還した。
ＧＣ分析の結果は、反応の回収溶媒相が、分割生成物（Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−アセトキシプロパン（Ｒ−ＰｔＢＡ）を９９％ｅｅ超で及び（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノール（Ｓ−ＰｔＢ）を９６％ｅｅ超で含むことを示した。アセトアルデヒドを、酵素アシル化の副生成物として得た。続いて、キラル生成物を、工程（ｂ）に記載したようにして蒸留によって単離した。
工程（ｂ）：（Ｓ）−ＰｔＢ／（Ｒ）−ＰｔＢＡの蒸留による分離
工程（ａ）からのキラル生成物を２工程で精製した。第１工程において、反応混合物からアセトアルデヒドを除去した。典型的なランにおいては、３７９０ｇのアセトアルデヒド／（Ｓ）−ＰｔＢ／（Ｒ）−ＰｔＢＡ混合物を５Ｌ丸底フラスコに入れた。１／４”セラミックサドルが充填された２フィートのガラスカラム及びＳＲ−１を冷却剤とする磁気還流冷却器（−１５℃に設定）から成る真空蒸発装置に、このフラスコを取り付けた。フラスコを、２／２の還流／順流比（ｒｅｆｌｕｘ／ｆｏｒｗａｒｄｉｎｇ ｒａｔｉｏ）を用いて３５０ｍｍＨｇにおいて４７℃に加熱した。アセトアルデヒドのほとんどは３．５時間後に除去された。次いで、アセトアルデヒドを含まない（Ｓ）−ＰｔＢ／（Ｒ）−ＰｔＢＡ混合物を、１／４”セラミックサドルが充填された６フィートのカラムを装着した同様な蒸留装置中で蒸留した。この工程においては、冷却剤として水を用いた。典型的なランにおいては、４，０３３ｇの（Ｓ）−ＰｔＢ／（Ｒ）−ＰｔＢＡ混合物を５Ｌのフラスコ中に入れ、次いでそれを、２／１の還流／順流比を用いて６〜３６ｍｍＨｇの範囲の圧力において７４〜８９℃に加熱した。２４の留分を採取した。これらの留分を、キャピラリーＧＣによって分析し、同様な組成の留分を合した。コンビネーションｂ（留分７〜１６）は１，２６５ｇであり、（Ｓ）−ＰｔＢを９８．４％含んでいた。コンビネーションｅ（留分２０〜２４）は１，９９０ｇであり、（Ｒ）−ＰｔＢＡを９９．５％含んでいた。各コンビネーションの希釈サンプル（水中、比２００：１）の分析は、（Ｓ）−ＰｔＢ及び（Ｒ）−ＰｔＢＡが共に９９．５％ｅｅ超で存在することを示した。
工程（ｃ−１）：（Ｓ）−ＰｔＢの（Ｓ）−ＰＧへの脱アルコキシル化
１０ｍｌの２つ口コニカル・ボトム・フラスコ中に、工程（ｂ）で得られた（Ｓ）−ＰｔＢ ５．００３２ｇ及びｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−ＴＳＡ）触媒０．１８８８ｇを入れた。無水ＣａＳＯ4乾燥管を有する冷却器をフラスコの口の一方の取り付けた。フラスコの他方の口にセプタムを取り付けた。フラスコを、１００℃に加熱されたシリコーン油浴中に入れた。サンプルを時々採取し且つＧＣによって分析しながら、反応を１３時間進行させた。反応の完了後、（Ｓ）−ＰｔＢの９８．６％が反応しており、（Ｓ）−ＰＧへの選択率が８１．６％であることが示された（表XVIII参照）。水中で希釈（比２００：１）された（Ｓ）−ＰＧ生成物をキラルＧＣによって分析し、９９．５％ｅｅ超であることがわかった。
工程（ｃ−２）：（Ｒ）−ＰｔＢＡの（Ｒ）−ＰＧへの加水分解及び脱アルコキシル化
１０ｍｌの２つ口コニカル・ボトム・フラスコ中に、工程（ｂ）で得られた（Ｒ）−ＰｔＢＡ ５．０３７５ｇ、蒸留水１５．０９１９ｇ及びｐ−ＴＳＡ触媒０．４６７１ｇを入れた。無水ＣａＳＯ4乾燥管を有する冷却器をフラスコの口の一方の取り付けた。フラスコの他方の口にセプタムを取り付けた。フラスコを、１００℃に加熱されたシリコーン油浴中に入れた。時々サンプルを採取し且つＧＣによって分析しながら、反応を３３時間進行させた。反応の完了後、（Ｒ）−ＰｔＢＡの１００％が反応しており、（Ｒ）−ＰＧへの選択率が８６．５％であることが示された（表XVIII参照）。水中で希釈（比２００：１）された（Ｒ）−ＰＧ生成物をキラルＧＣによって分析し、９９．５％ｅｅ超であることがわかった。
工程（ｄ）：脱アルコキシル化生成物からの（Ｓ）−ＰＧの単離
５ｍｌの丸底フラスコに、工程（ｃ−１）からの生成物混合物及び撹拌棒を入れた。温度計、真空コネクター及び受け器を装着したミクロ−フラッシュ蒸留装置をこのフラスコに取り付けた。ヒートガンを用いて、８４〜８７℃及び１０ｍｍＨｇにおいて生成物をフラッシュした。単離された生成物をＧＣによって分析し、ＰＧを８９％含むことがわかった。赤外分光法によって、単離された生成物の主成分がＰＧであって、若干のカルボニル不純物が含まれることが確認された。この不純物は後にＧＣ−ＭＳによってプロピレングリコールのモノ−及びジ−アセテートと確認された。単離された（Ｓ）−ＰＧ（水中で２００：１の比で希釈）をキラルＧＣによって分析し、９９．５％ｅｅ超であることがわかった。
工程（ｅ）：（Ｓ）−ＰｔＢから残留酢酸を除去することによる収率の改良
前記工程で記載したプロピレングリコールアセテートは、工程（ｂ）において（Ｒ）−ＰｔＢＡの部分分解によって生じる（Ｓ）−ＰｔＢ中に残留酢酸が存在するために形成されたと考えられた。このことを念頭に置いて、少量の（Ｓ）−ＰｔＢを少量の１０Ｎ ＮａＯＨで処理し、次いでフラッシュ蒸留させた。次に、処理された（Ｓ）−ＰｔＢを用いて、表XIVに示したように工程（ｃ−１）の実験を繰り返した。今度は、（Ｓ）−１，２−プロパンジオールへの選択率が９５％超（９９．５％ｅｅ）であった。前記のフラッシュ蒸留後の生成物のＩＲ分析は、酢酸エステルのピークを示さなかった。これは、（Ｓ）−ＰｔＢ中の遊離酢酸の悪影響を示した。当業者ならば、工程（ｂ）においてより注意深い蒸留を実施することによって酢酸の形成を減少させるか、又はなくすことができることがわかるであろう。
Figure 2005520570
前述の出版物及び特許は全て、参照することによって本明細書中に取り入れる。本発明の前記方法及び系についての種々の変更及び変形を、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく実施できることは、当業者には明白であろう。本発明を特定の好ましい実施態様に関連して記載したが、特許請求の範囲に記載した本発明は、このような特定の実施態様に不当に限定すべきでないことを理解すべきである。実際に、物性物理学、化学及び分子生物学又は関連分野における熟練者には自明である、本発明の前記実施形態の種々の変更は、添付した「特許請求の範囲」の範囲内であるものとする。
一連のプロピレングリコールアルキル（又はアリール）エーテル及びそれらの対応する酢酸エステル。 ＧＣ／ＦＩＤによって分析された反応混合物からの（Ｓ）−ＰＭＡの分割を示すグラフ図。 ＣＡＬ−Ｂ酵素濃度の関数としての（Ｓ）−ＰＭＡの分割を示すグラフ図。 Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ Ｌ−２，ｃ．−ｆ．，Ｃ２装填量の関数として測定した、（ａ）（±）−１−メトキシ−３−プロパノール（ＰＭ）及び（ｂ）（±）−１−フェノキシ−２−プロパノール（ＰＰｈ）のエステル交換を示すグラフ図。 ＣＡＬ−Ｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む反応混合物中における酢酸ビニル３０％（ｖ／ｖ）によるＰＰｈ７０％（ｖ／ｖ）のエナンチオ選択的アシル化を示すグラフ図。 ＰＥＡ加水分解に関する酵素再循還を示すグラフ図。 スケールアップ条件下におけるＰＥＡ加水分解に関する酵素再循還を示すグラフ図。 ３２サイクルまでのスケールアップ条件下におけるＰＥＡ加水分解に関する酵素再循還を示すグラフ図。

Claims (49)

  1. 反応混合物中において、式Ｉ：
    Figure 2005520570
     ［式中、Ｒはアルキル又はアリール基から選ばれる］
    のプロピレングリコールエーテルアセテートラセミ体を有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと接触させることによって前記ラセミ体の対掌体をプロピレングリコールエーテルの対応する異性体にエナンチオ選択的に加水分解することを含んでなる方法。
  2. 前記ラセミ体が約１０％ｖ／ｖ超の濃度である請求項１に記載の方法。
  3. 前記ラセミ体のＲ−対掌体を対応するＲ−プロピレングリコールエーテルにエナンチオ選択的に加水分解する請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ラセミ体のＳ−対掌体を対応するＳ−プロピレングリコールエーテルにエナンチオ選択的に加水分解する請求項１又は２に記載の方法。
  5. ＲがＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3及びＣ6Ｈ5から選ばれる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ヒドロラーゼがリパーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記リパーゼがＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢ、リパーゼＬＰ‘Ｓ’、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リポ蛋白リパーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．リパーゼ又は及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼである請求項６に記載の方法。
  8. 前記リパーゼがＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢである請求項７に記載の方法。
  9. 前記ラセミ体が少なくとも２０％ｖ／ｖの濃度である請求項２に記載の方法。
  10. 前記ラセミ体の約３０％〜約５０％が加水分解される請求項８に記載の方法。
  11. 加水分解されたラセミ体の対掌体純度が少なくとも約７０％ｅｅである請求項８に記載の方法。
  12. ｂ）反応混合物からＲ−プロピレングリコールエーテルを回収することを更に含む請求項３に記載の方法。
  13. ａ）反応混合物から未反応Ｓ−対掌体基質を回収し；そして
    ｂ）前記Ｓ−対掌体基質を転化して、対応するＳ−プロピレングリコールエーテルを得ることを更に含む請求項３に記載の方法。
  14. ｂ）反応混合物からＳ−プロピレングリコールエーテルを回収することを更に含む請求項４に記載の方法。
  15. ａ）反応混合物から未反応Ｒ−対掌体基質を回収し；そして
    ｂ）前記Ｒ−対掌体基質を転化して、対応するＲ−プロピレングリコールエーテルを得ることを更に含む請求項４に記載の方法。
  16. ｂ）酵素触媒を再循還させることを更に含む請求項１に記載の方法。
  17. 反応混合物中において、式ＩＩ：
    Figure 2005520570
     ［式中、Ｒはアルキル又はアリール基から選ばれる］
    のプロピレングリコールエーテルラセミ体を有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと接触させることによって前記ラセミ体の対掌体をアシル化プロピレングリコールエーテルの対応する対掌体にエナンチオ選択的にエステル交換することを含んでなる方法であって、前記ラセミ体は少なくとも約５％ｖ／ｖの濃度であり、前記ラセミ体混合物がアシル供与体を更に含み、前記アシル供与体が活性化エステル、エノールエステル及び無水物からなる群から選ばれた活性化アシル供与体である方法。
  18. ＲがＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3及びＣ6Ｈ5から選ばれる請求項１７に記載の方法。
  19. 前記アシル供与体が酢酸ビニル、酢酸エチル、プロピオン酸ビニル、酢酸２，２，２−トリクロロエチル、酢酸２，２，２−トリフルオロエチル、酢酸ブチル、酢酸エチルフェニル、酢酸イソプロペニル、メトキシ酢酸エチル、酢酸１−エトキシビニル、ジケテン、酪酸トリフルオロエチル、無水酢酸、ラクチド及びコハク酸無水物から選ばれる請求項１８に記載の方法。
  20. 前記アシル供与体が酢酸ビニル及び酢酸イソプロペニルから選ばれる請求項１９に記載の方法。
  21. 反応混合物中において、式ＩＩ：
    Figure 2005520570
     ［式中、Ｒはアルキル又はアリール基から選ばれる］
    のプロピレングリコールエーテルラセミ体を有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと接触させ、それによって前記ラセミ体の対掌体をアシル化プロピレングリコールエーテルの対応する対掌体にエナンチオ選択的にエステル交換することを含んでなる方法であって、前記ラセミ体が少なくとも約５％ｖ／ｖの濃度であり、前記反応混合物がアシル供与体を更に含み、前記アシル供与体が酢酸エチル及びキラルアシル供与体からなる群から選ばれた非活性化アシル供与体である方法。
  22. ＲがＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3及びＣ6Ｈ5から選ばれる請求項２１に記載の方法。
  23. 前記アシル供与体がラセミ体１−メトキシ−２−プロパノールアセテート、ラセミ体１−エトキシ−２−プロパノールアセテート又はラセミ体１−プロピルオキシ−２−プロパノールアセテートである請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ヒドロラーゼがリパーゼである請求項１８又は２２に記載の方法。
  25. 前記リパーゼがＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢである請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ラセミ体及び前記アシル供与体が反応混合物の約１００％ｖ／ｖを構成する請求項１７又は２１に記載の方法。
  27. 前記ラセミ体及び前記アシル供与体がラセミ体をアシル化プロピレングリコールエーテルに約５０％転化する比で存在する請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ラセミ体の約３０〜約５０％をエステル交換する請求項１７又は２１に記載の方法。
  29. アシル化プロピレングリコールエーテルの対掌体純度が少なくとも約７０％ｅｅである請求項１７又は２１に記載の方法。
  30. ａ）反応混合物からアシル化プロピレングリコールアルキルエーテルの目的対掌体を回収し；そして
    ｂ）回収されたアシル化プロピレングリコールアルキルエーテル対掌体を転化して、プロピレングリコールアルキルエーテルの対応する対掌体を得る
    ことを更に含む請求項１７又は２１に記載の方法。
  31. 反応混合物から未反応対掌体基質を回収することを更に含む請求項１７又は２１に記載の方法。
  32. 酵素触媒を再循還させることを更に含む請求項１７又は２１に記載の方法。
  33. 第１基質プロピレングリコールエーテルを第２基質アシル供与体でエステル交換するエステル交換によるプロピレングリコールエーテルのラセミ混合物の分割方法において基質転化度を制御する方法であって、
    ａ）転化基質の目的対掌体収率並びに転化及び／又は未転化基質の目的純度を決定し；
    ｂ）前記目的収率及び前記目的純度を達成するための、第１基質と第２基質のモル比を計算し；
    ｃ）前記目的収率及び前記目的純度を理論的に達成するための第１基質及び第２基質の量をモル比に基づいて計算し；
    ｄ）反応混合物中において、式ＩＩ：
    Figure 2005520570
     ［式中、Ｒはアルキル、アリール、アリール置換アルキル、アリル又はアセタール基から選ばれる］
    のプロピレングリコールエーテルのラセミ混合物を含む第１計算量の第１基質並びに活性化エステル、非活性化エステル、エノールエステル及び無水物から選ばれた活性化又は非活性化アシル供与体であるアシル供与体を含む第２計算量の第２基質を、有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと合し、それによってラセミ体の第１対掌体を対応する第１対掌体アシル化プロピレングリコールエーテルにエナンチオ選択的にエステル交換する
    ことを含んでなる基質転化度の制御方法。
  34. 第１計算量の第１基質及び第２計算量の第２基質が反応混合物の反応マトリックスの約１００％を構成する請求項３３に記載の方法。
  35. ＲがＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ2、ＣＨ3（ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＣＨ2）3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ6Ｈ5、Ｃ（ＣＨ3）3、Ｃ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、Ｃ（ＣＨ3）（Ｃ6Ｈ5）2、Ｃ（Ｃ6Ｈ5）3、Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3及びＣＨ2ＯＣＨ3から選ばれる請求項３３に記載の方法。
  36. ａ）反応混合物から第１対掌体アシル化プロピレングリコールアルキルエーテル生成物を回収し；そして
    ｂ）前記生成物を転化して、対応する第１対掌体プロピレングリコールアルキルエーテルを得ることを更に含む請求項３３に記載の方法。
  37. 反応混合物から未反応の第２対掌体プロピレングリコールアルキルエーテルを回収することを更に含む請求項３３に記載の方法。
  38. 酵素触媒を再循還することを更に含む請求項３３に記載の方法。
  39. ａ）アシル化プロピレングリコールエーテルの収率及びアシル化若しくは非アシル化プロピレングリコールエーテルの対掌体純度を監視し；そして
    ｂ）目的収率及び目的純度を達成するために第２基質に対する第１基質の比を調整する
    ことを更に含む請求項３３に記載の方法。
  40. 式ＩＩＩ：
    Figure 2005520570
     のキラル化合物の製造方法であって、
    （ａ）活性化エステル、エノールエステル及び無水物から選ばれたアシル供与体を更に含む反応混合物中で、式ＩＩ：
    Figure 2005520570
     ［式中、Ｒはアルキル、アリール置換アルキル、アリル又はアセタール基である］
    のプロピレングリコールエーテルラセミ体を、リパーゼ、エステルラーゼ、アシラーゼ及びプロテアーゼからなる群から選ばれた有効量の酵素触媒ヒドロラーゼと接触させることによって（Ｓ）−１−アルコキシ−２−プロパノール及び（Ｒ）−１−アルコキシ−２−プロパノールアシレートを得；
    （ｂ）工程（ａ）において形成された（Ｒ）−１−アルコキシ−２−プロパノールアシレートから（Ｓ）−１−アルコキシ−２−プロパノールを分離し；
    （ｃ）工程（ｂ）で分離された（Ｓ）−１−アルコキシ−２−プロパノールを緩和な反応条件下で酸触媒の存在下において脱アルコキシル化して、（Ｓ）−１，２−プロパンジオールを得；そして
    （ｄ）工程（ｃ）で得られた（Ｓ）−１，２−プロパンジオールを単離する
    工程を含んでなるキラル化合物の製造方法。
  41. （ｅ）工程（ｂ）で分離された（Ｒ）−１−アルコキシ−２−プロパノールアシレートを緩和な反応条件下で酸触媒の存在下において脱アルコキシル化して、（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを得；そして
    （ｆ）工程（ｅ）で得られた（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを単離する
    工程を更に含む請求項４０に記載の方法。
  42. ＲがＣ（ＣＨ3）3、Ｃ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、Ｃ（ＣＨ3）（Ｃ6Ｈ5）2、Ｃ（Ｃ6Ｈ5）3、Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＨ3、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3及びＣＨ2ＯＣＨ3から選ばれる請求項４０に記載の方法。
  43. ＲがＣ（ＣＨ3）3である請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ヒドロラーゼがリパーゼ又はエステラーゼである請求項４０〜４３のいずれかに記載の方法。
  45. 前記ヒドロラーゼがＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢである請求項４４に記載の方法。
  46. 工程（ｃ）の酸触媒がｐ−トルエンスルホン酸又はイオン交換樹脂である請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. （ａ）酢酸ビニルを更に含む反応混合物中で、（Ｒ，Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノールを有効量のＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ・フラクションＢと接触させ、それによって（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノール及び（Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−アセトキシプロパンを得；
    （ｂ）蒸留によって（Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−アセトキシプロパンから（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノールを分離し；
    （ｃ）工程（ｂ）で分離された（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−プロパノールを緩和な反応条件下でｐ−トルエンスルホン酸触媒の存在下において脱アルコキシル化して、（Ｓ）−１，２−プロパンジオールを得；そして
    （ｄ）工程（ｃ）で得られた（Ｓ）−１，２−プロパンジオールを単離する
    工程を含む請求項４０に記載の方法。
  48. （ｅ）工程（ｂ）で分離された（Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシアセトキシプロパンを緩和な反応条件下でｐ−トルエンスルホン酸触媒の存在下において脱アルコキシル化して、（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを得；そして
    （ｆ）工程（ｃ）で得られた（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを単離する
    工程を更に含む請求項４４に記載の方法。
  49. 前記アシル供与体がラセミ体グリコールエーテルアセテートであり、前記方法が、反応と、蒸留又はストリッピングによる副生成物アルコールの除去との組合せを含む請求項２１に記載の方法。
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