JP2005515794A - 酵素活性プロテアーゼアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
国際公開第00/039348号には、上述したように、マーカーが、特異的なプロテアーゼ切断部位を有するタンパク質と融合したβ−ガラクトシダーゼ断片であるプロテアーゼアッセイが記載されている。アッセイ・システムにβ−ガラクトシダーゼ断片を使用することに関する文献は他にも多数ある。以下にそれらを示す。Douglasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984,81 : 3983-7には、ATP-2とlacZの融合タンパク質が記載されている。国際公開第92/03559号には、プロテイナーゼを測定するためにβ−ガラクトシダーゼのα−相補性を使用する融合タンパク質が記載されている。国際公開第01/0214号には、β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドを融合タンパク質として用いることで、タンパク質の折り畳み及び/又は溶解度を構造上の相補性によって評価することが記載されている。国際公開第01/60840号には、タンパク質の折り畳み及び溶解度を測定するために、酵素供与体であるβ−ガラクトシダーゼを有する融合タンパク質を含む融合タンパク質が記載されている。Hommaら, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1995,215, 452-8には、融合タンパク質の安定性に対するβ−ガラクトシダーゼのα−断片の効果が記載されている。Abbas-Terkiら, Eur. J. Biochem. 1999,266, 517-23には、α−相補性を有するβ−ガラクトシダーゼを酵素の分子シャペロン・熱ショックタンパク質に対する生体内モデル基質とすることが記載されている。Millerら, Gene, 1984,29, 247-50には、ヒトインシュリンβ鎖ペプチドを含む融合タンパク質についての定量的なβ−ガラクトシダーゼのα−相補性アッセイが記載されている。Thomas及びKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,90, 7744-8には、変異の割合を測定するプラスミドを含むEDが記載されている。国際公開第98/42854号には、融合した補助タンパク質の複合により活性型酵素を形成するβ−ガラクトシダーゼの断片を非独立的に複合することについて記載されている。
a)B-ED-f: 5'-CACGGATCCAGCTCCAATTCACTGGCCGTCG-3'(配列番号2)
b)BH-IL4-R: 5'-CGCGGATCCAAGCTTTCAGCTCGAACACTTTGAATA-3'(配列番号3)
を使用した。
HEK293 親細胞株
HEK293 IkB − β−ガラクトシダーゼ ED(55mer)の安定した形質移入体。
増殖培地(DHEM/10%FBS)
-80℃で貯蔵したFactor Xa、1μg/μlの水溶液のストック(Roche,カタログ番号1585924)。
Factor Xa切断緩衝液、最終濃度が0.1mg/mlとなるように10mg/mlのBSA(New England Biolabs)を添加することによって製造し、0.2M CaCl2とDulbecco's PBS(Sigma、カタログ番号D8537)の比が0.5:98.5であり、BSAを使用前に添加したもの、
EAコア緩衝液(EA core buffer)(PIPES,30.24g/L;NaCl,23.38g/L;EGTA,3.80g/L;酢酸マグネシウム,2.15g/L;Tween,0.5ml;NaOH,6.9g/l;NaN3,0.95g/L,pH6.9)
EA試薬(1.8μMのEAコア緩衝溶液)
細胞溶解緩衝液(KH2PO4,0.6805g/L;K2HPO4,0.8709g/L;NaCl,0.5844g/L;CHAPS,10g/L;pH6.9(NaOHを用いた))
化学発光基質(Tropix,Applied Biosystems Inc.)+Gal-Star+エメラルド・エンハンサー・プラスミド(Emerald Enhancer Plasmid)pPL-FXa-β2-AR(又はpPL(ED)-FXa(FXa切断コンセンサス配列)-β2-アドレナリン受容体(b2-AR))
FuGene 6トランスフェクション試薬(Roche カタログ番号1815091)
この研究において、アッセイ方法は下記の通りである。細胞質タンパク質のIkB-PL(安定した形質移入体)又はPL-FXa-b2AR(一時的な形質移入体)のいずれか一方を発現するHEK293形質移入体細胞を、2日間の培養後に〜80%のコンフルエントとなる密度で6ウェルの培養皿のそれぞれ2個のウェルに蒔いた。トランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を、供給元であるFUGENEに従って、0.15μlのFUGENE試薬、0.05μgのDNA及び5μLの血清のない培地を用いて製造した。トランスフェクションした細胞を、DMEM/10%FBS培地でアッセイ前に48〜72時間培養した。
Claims (31)
- サンプル中の標的のプロテアーゼ活性を測定する方法であって、該方法は、
酵素供与体断片及び前記標的のプロテアーゼ活性による切断に感受性がある共有結合によって結合した第1及び第2の阻害物を、前記阻害物の一つが前記共有結合に近接した表面である場合、その表面阻害物のみ存在すればよいという条件付きで含むタンパク質試薬を使用し、前記タンパク質試薬は、酵素受容体断片と複合して活性型指標酵素を形成する活性がほとんどなく、切断によって、前記酵素受容体と活性があるタンパク質試薬断片が生じて活性型指標酵素を生成し、指標酵素の活性が前記標的のプロテアーゼ活性に関係している方法であって、前記方法は、
前記タンパク質試薬、前記サンプル、酵素受容体及び指標酵素の基質を、前記標的のプロテアーゼ活性が前記共有結合を切断するのに十分な時間混合することと、
前記プロテアーゼ活性を示すものとして前記指標酵素の活性を測定することからなることを特徴とする、前記標的のプロテアーゼ活性を測定する方法。 - 前記酵素供与体断片と前記酵素受容体断片は、独立して複合して活性型指標酵素を形成することが可能な前記酵素の断片を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記酵素供与体断片と前記酵素受容体断片は融合タンパク質から成り、前記酵素供与体断片は、第1の結合タンパク質と前記指標酵素の第1の断片から成り、前記酵素受容体断片は、第2の結合タンパク質と前記指標酵素の第2の断片から成り、前記指標酵素の前記第1及び第2の断片は、独立して複合して活性型酵素を形成せず、前記第1及び第2の結合タンパク質が複合形成することにより活性型指標酵素を形成することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記第1及び第2の阻害物は、少なくとも約5kDaのタンパク質であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記タンパク質試薬断片は、前記酵素受容体と複合し、活性型指標酵素を形成することにおいて、前記タンパク質試薬の少なくとも約10倍の活性があることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記酵素供与体は、約37から120までのアミノ酸からなることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記共有結合は、前記酵素供与体の50アミノ酸以内であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記阻害物の一つは、細胞表面又はリポソームであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- サンプル中のプロテアーゼ活性を測定する方法であって、該方法は、
β−ガラクトシダーゼの酵素供与体断片及び前記プロテアーゼ活性による切断に特異的に感受性があるアミノ酸配列によって結合した第1及び第2の阻害物を含むタンパク質試薬を使用し、前記タンパク質試薬は、β−ガラクトシダーゼの酵素受容体断片と複合して活性型β−ガラクトシダーゼを形成する活性がほとんどなく、切断によって、前記酵素受容体と活性があるタンパク質試薬断片が生じて活性型β−ガラクトシダーゼを生成し、β−ガラクトシダーゼの活性が前記プロテアーゼ活性に関係している方法であって、前記方法は、
前記タンパク質試薬、前記サンプル、酵素受容体及びβ−ガラクトシダーゼの基質を、前記酵素活性が前記アミノ酸配列を切断するのに十分な時間混合することと、
前記酵素活性を示すものとしてβ−ガラクトシダーゼの活性を測定することからなることを特徴とする、前記プロテアーゼ活性を測定する方法。 - 前記第1及び第2の阻害物の少なくとも一つは、少なくとも10kDaのタンパク質であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 前記アミノ酸配列は、前記酵素供与体の50アミノ酸以内であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 前記プロテアーゼは、セリン/スレオニン加水分解酵素であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 前記プロテアーゼは、メタロプロテイナーゼであることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 前記阻害物はタンパク質であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 前記第1のタンパク質はGSTであることを特徴とする、請求項12記載の方法。
- 前記第2のタンパク質は、非共有結合を介して前記リンカーに結合していることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- サンプル中の標的のプロテアーゼ活性を測定する方法であって、該方法は、
β−ガラクトシダーゼの酵素供与体断片及び前記標的のプロテアーゼ活性による切断に感受性がある共有結合によって結合した第1及び第2の阻害物を含むタンパク質試薬を使用し、前記タンパク質試薬は、β−ガラクトシダーゼの酵素受容体断片と複合して活性型β−ガラクトシダーゼを形成する活性がほとんどなく、切断によって、前記酵素受容体と活性がある少なくとも約125kDaのタンパク質試薬断片が生じて活性型指標酵素を生成し、指標酵素の活性が前記標的のプロテアーゼ活性に関係している方法であって、前記方法は、
前記タンパク質試薬、前記サンプル、酵素受容体及びβ−ガラクトシダーゼの基質を、前記標的のプロテアーゼ活性が前記共有結合を切断するのに十分な時間混合することと、
前記プロテアーゼ活性を示すものとして前記指標酵素の活性を測定することからなることを特徴とする、前記標的のプロテアーゼ活性を測定する方法。 - 前記阻害物の一つは、前記タンパク質試薬が結合する表面又はリポソームであることを特徴とする、請求項17記載の方法。
- 前記阻害物の少なくとも一つは、少なくとも約20kDaのタンパク質であることを特徴とする、請求項17記載の方法。
- 前記プロテアーゼはカスパーゼであることを特徴とする、請求項17記載の方法。
- タンパク質試薬が膜表面に結合するという条件付きで、少なくとも約25kDaであって、かつ多くても約200kDaであるタンパク質から本質的に成る水溶性のタンパク質試薬であって、該タンパク質は、タンパク質分解による切断のためにプロテアーゼによって認識される認識配列に結合しており、該認識配列は、少なくとも約25kDaのタンパク質に結合した指標酵素の酵素供与体断片に、直接、又は多くても約50のアミノ酸のリンカーを介して結合しており、前記酵素供与体断片は、前記タンパク質試薬の一部として、酵素受容体断片と複合して活性型の指標酵素を形成することが実質上できず、前記認識配列が切断された際に、酵素受容体断片と複合して活性型指標酵素を形成することができることを特徴とする、前記タンパク質試薬。
- 前記指標酵素はβ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求項21記載の組成物。
- 細胞表面またはリポソームに結合するための結合物を含む少なくとも約10のアミノ酸のリンカーから本質的に成る、少なくとも10kDa以上であって、かつ多くても約150kDaであるタンパク質試薬であって、該リンカーは、タンパク質分解による切断のためにプロテアーゼによって認識される認識配列に結合しており、該認識配列は、少なくとも約25kDaのタンパク質に任意に結合した指標酵素の酵素供与体断片に、直接、又は多くても約50のアミノ酸のリンカーを介して結合しており、前記酵素供与体断片は、前記表面または前記リポソームに結合した前記タンパク質試薬の一部として、酵素受容体断片と複合して活性型指標酵素を形成することが実質上できず、前記認識配列が切断された際に、酵素受容体断片と複合して活性型指標酵素を形成することができることを特徴とする、前記タンパク質試薬。
- 前記指標酵素はβ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求項23記載の組成物。
- 請求項21記載のタンパク質試薬、または前記タンパク質試薬をコードする遺伝子コンストラクト、酵素受容体及び酵素基質を含む、キット。
- 前記遺伝子コンストラクトは細胞内にあることを特徴とする、請求項25記載のキット。
- 酵素供与体断片に結合した少なくとも約25kDaのタンパク質から本質的に成る試薬であって、該酵素供与体断片は、タンパク質分解による切断のためにプロテアーゼによって認識される認識配列に、直接、又は多くても約50アミノ酸のリンカーを介して結合しており、前記認識配列は、多くても約300アミノ酸のリンカーによって表面又はリポソームに結合し、前記酵素供与体断片は、前記タンパク質試薬の一部として、酵素受容体断片と複合して活性型酵素を形成することが実質上できず、前記認識配列が切断された際に、酵素受容体断片と複合して活性型の酵素を形成することができることを特徴とする、前記試薬。
- 前記指標酵素はβ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求項27記載の組成物。
- 請求項27記載のタンパク質試薬、酵素受容体及び酵素基質を含む、キット。
- 請求項21記載の水溶性のタンパク質試薬をコードする遺伝子コンストラクトを含む、細胞。
- 請求項22記載のタンパク質試薬をコードする遺伝子コンストラクトを含む、細胞。
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