JP2022528270A - プロモーター領域の解析方法とそれを実行するための細胞 - Google Patents

プロモーター領域の解析方法とそれを実行するための細胞 Download PDF

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Abstract

プロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。方法は、核酸を含む細胞を培養することであって、核酸は、プロモーター領域がアクティブであるときにEDが発現される条件下で、プロモーター領域に操作可能に結合された、エンザイムドナー(ED)をコードする領域を含む、培養することを含む。方法は、さらに、EDを、発現される場合、エンザイムアクセプター(EA)と接触させて、酵素活性を有するED-EA錯体を形成することを含む。方法は、さらに、プロモーター領域の活性を評価するための酵素活性のレベルを検出することを含む。プロモーター領域の活性は、対象の細胞シグナル伝達経路および／または対象の内因性または外因性（例えば、導入された）転写因子の活性を示す可能性があり、したがって、評価するために使用され得る。例えば、本開示の方法を実践する際における使用を見出した細胞、組成物、及びキットもまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第62/825,559号を2019年3月28日に出願したが、これをその全体としてここに引用する。
政府保持体記載
なし
本発明は、通常、プロモータ領域の活動を評価する方法に向けられ、より具体的には、プロモータ領域の発現がプロモータ領域の活動を測定する検出剤の発現を導く検出剤と結合したプロモータ領域に向けられている。開示された方法は、細胞シグナル伝達経路の活性と細胞シグナル伝達経路に対するテスト複合体の影響を評価する。
配列LISTINGの参照
このインスタントアプリケーションには、ASCIIテキストファイルとして提出され、ここにその全体として参考文献に組み込まれた配列リストが含まれている。このテキストファイルは、2020年3月22日に作成された"PBH_010_1Seq_List.txt"と記されており、サイズは49,795バイトである。
細胞シグナル伝達経路の様々な側面、および細胞シグナル伝達経路調節に対する異なる化合物または分子の効果を探索することへの対象は、疾患を理解し、治療法を見出す上で重要な原動力となっている。細胞のシグナル伝達経路のタンパク質やその機能がさらに同定されるにつれて、これらのタンパク質の活性を調節する分子を見つけることへの対象は非常に高まっている。経路タンパク質の式または阻害は、試験化合物または試験条件がシグナル伝達経路に及ぼす影響を理解し、医薬用途の新薬を見出すのに役立つ。
以下の簡単な要約は、本発明の全ての特徴及び側面を含むことを意図したものではなく、また、本要約で議論されている全ての特徴及び側面を本発明が含んでいなければならないことを意味するものでもない。
本発明の多くの実施形態は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。他の多くの実施形態において、プロモーター領域の活性を評価する方法は、プロモーター領域と作動的に結合された他のベータガラクトシダーゼフラグメントをエンコードする領域を含む核酸である核酸を含む細胞を、プロモーター領域が活性しているときに他のベータガラクトシダーゼフラグメントが発現される条件下で、細胞を構成する細胞で構成されている。さらなる実施形態において、本方法は、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントを、発現される場合、第2のβ-ガラクトシダーゼフラグメントと接触させて、活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。別の実施形態では、プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路及び/又は内生または外生の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、示唆し得るし、従って、使用してもよい。
多くの実施形態において、本発明は、核酸を含む細胞を培養している細胞を含む促進領域の活性度を評価する方法を提供する。核酸は、促進領域が活性しているときにEDが発現される条件下で、促進領域に動作的に結合された、エンザイムドナー(ED)をエンコードしている領域を含む。多くの他の実施形態において、本方法は、EDを、発現される場合、酵素受容体(EA)と接触させて、酵素活性を有するED-EA錯体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。更に更なる実施形態では、EDフラグメントは、配列番号30に記載されたアミノ酸配列、又はそれらの変形物を含む。別の実施形態では、プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路及び/又は内生または外生の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、示唆し得るし、従って、使用してもよい。
更なる実施形態において、プロモーター領域の活性を評価する方法が開示されている。この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含んでおり、核酸は、運搬性たんぱく質に融合した最初のベータガラクトシダーズ断片をエンコードする領域を含む核酸であり、第1のベータガラクトシダーズ断片が、第1のベータガラクトシダーズ断片-運搬性たんぱく質融合が発現される条件下で、プロモーター領域と実用的に結合される。プロモーター領域が活性化している。特定の実施形態では、本方法は、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントを、発現された場合、第2のβ-ガラクトシダーゼフラグメントと接触させて活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出してプロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。多くの実施形態において、プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路及び/又は内生または外生の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、示唆し得るし、従って、使用され得る。多くの他の実施形態において、担体タンパク質は、ED担体タンパク質溶融体の安定性に影響を及ぼすように選択されたドメインを含み、ここで、ドメインは、ドメインを欠くED担体タンパク質溶融体と比較して、ED担体タンパク質溶融体の安定性を増加させるように選択され、またはドメインは、ドメインを欠くED担体タンパク質溶融体と比較して、ED担体タンパク質溶融体を不安定化するように選択される。さらに、担体タンパク質領域はプロテオソーム分解のためのED‐担体タンパク質溶融を標的とする。領域は、プロライン(P)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、およびスレオニン(T)、(PEST)劣化信号またはCL1劣化信号からなる。
さらなる実施形態において、プロモーター領域の活性を評価する方法が開示され、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、この核酸は、担体タンパク質に融合された酵素ドナー(ED)フラグメントをコードする領域を含み、ここで、EDフラグメントは、プロモーター領域に作動可能にカップリングされ、ここで、EDは、プロモーター領域が活性であるときに発現される条件下で、プロモーター領域に作動可能にカップリングされる。特定の実施形態では、本方法は、EDを、発現される場合、酵素受容体(EA)フラグメントと接触させて、酵素活性を有するED-EA錯体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。多くの他の実施形態において、担体タンパク質は、ED-担体タンパク質溶融体の安定性に影響を及ぼすように選択されたドメインを含み、ここで、ドメインは、ドメインを欠くED-担体タンパク質溶融体と比較して、ED-担体タンパク質溶融体の安定性を増加させるように選択されるか、またはドメインが、ドメインを欠くED-担体タンパク質溶融体と比較して、ED-担体タンパク質溶融体を不安定化するように選択される。
多くの実施形態において、担体タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ酵素活性の酵素活性と同一ではない検出可能な酵素活性を有し得、ここで、担体タンパク質酵素活性は、開示された方法に記載されるように担体タンパク質が発現される場合、その酵素活性についての公知の検出方法を使用して検出され得る。他の多くの実施形態において、担体タンパク質は、担体タンパク質のエンザイマティックな活動が検出できるように、プロモーター領域が活性である条件下で発現される。検出方法を用いて、プロモーター領域の活性を評価する。さらなる実施形態において、担体タンパク質は、プロモーター領域が活性である場合、EDフラグメントの発現と同時発現され、ここで、EDフラグメントは、EAフラグメントと複合体を形成して、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、プロモーター領域の活性を評価するために、担体タンパク質およびβ-ガラクトシダーゼ酵素複合体の両方の酵素活性のレベルを検出する。別の実施形態では、プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路及び/又は内生または外生の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、示唆し得るし、従って、使用してもよい。
様々な実施形態において、担体タンパク質は、天然タンパク質、突然変異タンパク質、合成タンパク質であり得、ここで、担体タンパク質の酵素活性は、そのような担体タンパク質についての公知の検出方法によって検出される。さらなる実施形態では、担体タンパク質は、この突然変異により担体タンパク質の活性が不活発になるように変形される。更に更なる実施形態では、変性担体タンパク質は、対象の促進領域が活動しているときに検出された酵母活性を示すことなく、対象の促進領域と動作的にリンクされた、ベータガラクトシダーゼの断片と融合した担体タンパク質としてのみ作用することができる。
一実施形態では、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は、ED担体タンパク質融合がプロモーター領域に作動可能にカップリングされている、EDに融合された担体タンパク質をコードする領域を含み、プロモーター領域が活性である場合、EDフラグメントが担体タンパク質の発現と共に発現される条件下で、ED担体タンパク質融合がプロモーター領域に作動可能にカップリングされる。別の実施形態では、方法は、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成するためにEDフラグメントをEAフラグメントと接触させること、およびプロモーター領域の活性を評価するために酵素活性のレベルを検出することをさらに含む。なおさらなる実施形態において、本方法は、担体タンパク質の非β-ガラクトシダーゼ酵素活性およびED-EA酵素複合体のβ-ガラクトシダーゼ酵素活性を検出し、その結果が、担体タンパク質酵素活性およびED-EA断片複合体酵素活性の両方からのアッセイ結果を与える2点検出法であるようにする。
多くの実施形態において、本発明は、核酸を含む細胞を培養する方法、および融合した担体タンパク質をエンコードする領域を含む核酸を含む領域のプロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。ED変異担体タンパク質溶融物がプロモーター領域に作動可能にカップリングされており、変異担体タンパク質が検出可能な酵素活性を欠いているEDフラグメントである。細胞は、促進領域が活動しているときにEDフラグメントが発現される条件下で培養される。特定の実施形態では、本方法は、EDを、発現された場合、EAと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。
多くの実施形態において、本発明は、核酸を含む細胞を培養することを含むプロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、ここで、核酸は、ED担体タンパク質溶融がプロモーター領域に作動可能にカップリングされている、EDフラグメントに溶融されたいかなる固有の酵素活性も有さない担体タンパク質をコードする領域を含む。ここで、担体タンパク質は、検出可能な酵素活性を欠いている。細胞は、促進領域が活動しているときにEDフラグメントが発現される条件下で培養される。特定の実施形態では、本方法は、EDを、発現された場合、EAと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。
多くの実施例において、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。さらなる実施形態において、プロモーター領域の活性を評価する方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は、プロモーター領域に作動可能に結合された第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントをコードする領域を含み、試験薬剤を培養物に導入し、ここで、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントは、プロモーター領域が活性である場合に発現される。さらなる実施形態において、本方法は、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントを、発現される場合、第2のβガラクトシダーゼフラグメントと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。別の実施形態では、プロモーター領域の活動は、細胞シグナル伝達経路及び/又は内生または外生の(例えば、導入された)転写因子の活動を評価するために、示唆し得るし、したがって、使用され得る。
多くの実施形態において、この方法は、さらに、複数のテストエージェントとセルに接触し、テストエージェントに応答するプロモーター領域の活性を評価することにより、テストエージェントの効果を検出することを含む。他の多くの実施形態において、この方法は、さらに、細胞が最初である第1の剤及び第2の剤と細胞を接触することを含む。興味領域の活性に影響を与える第1のエージェントと接触し、それをED-EA錯体エンザイマティック活性を検出することによって評価し、細胞と第2のエージェントと接触し、第1のエージェントのみと接触したときにED-EA錯体エンザイマティック活性を検出し、それをプロモータ領域の活性と比較することによって評価した。様々な実施形態において、第1のエージェントはアゴニストであり、第2のエージェントはアンタゴニストであり得る。
様々な実施形態において、細胞は、複数のエージェントと接触することができる。開示された複数のエージェントは、第1のエージェントが導入され、第2のエージェントが同時にセルカルチャーに導入された複数のエージェントのような組み合わせで、対象プロモーター活性に対する異なるテストエージェントの効果を決定するように、順番にセルに導入され得る。薬剤は、試験薬剤、小分子、アゴニスト、アンタゴニスト、生物学的製剤、承認された薬剤、治験薬、ペプチド、タンパク質、抗体、細胞、異種タンパク質を発現する細胞、内因性タンパク質を発現する細胞、細胞によって分泌される産物、毒素、天然産物、プロモーター、阻害剤または逆アゴニストであり得る。
特定の実施形態では、プロモータ領域は、興味の転写因子の活性が転写因子の活性を示すことを含む、興味の転写因子のための少なくとも1つの転写因子レスポンス要素(TFRE)を含む。ある実施形態では、転写因子の活性化レベルの評価は、促進領域が活動しているときに発現される最初のベータガラクトシダーゼフラグメントの検出された活性レベルに基づいている。
特定の実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREからなる。いくつかの他の実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREが同じ転写因子のTFREである第1のTFREと第2のTRFEを構成する。更なる実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREを含み、第1のTFREと第2のTFREは異なった転写因子のTFREである。
様々な実施形態において、プロモーター領域は少なくとも1つのTFREからなる。さらに、多くの実施形態によれば、プロモーター領域は2つ以上のTFREを含む。促進剤領域内に含まれるTFREsは、以下のような同じTFREsである場合がある。TFREは同じ転写因子に対するものであるか、プロモーター領域内の異なるTFREが異なる転写因子に対するものであるように異なるTFREである可能性がある。
特定の実施形態では、プロモータ領域は、対象の遺伝子のための内生のプロモータ領域を構成する。ある実施形態では、プロモーター領域を活性化する経路の活性化レベルの評価は、プロモーター領域が活動しているときに発現される最初のベータガラクトシダーゼフラグメントの検出レベルに基づいている。
さらなる実施形態において、開示される方法は、細胞に転写因子をエンコードする式ベクトルを導入し、プロモーター領域が最初のベータガラクトシダーゼフラグメントと結合した転写因子が発現される条件下で細胞を培養することを含む。より特定の実施形態において、発現ベクトルコード化転写因子の活性化レベルの評価は、プロモーター領域が活動しているときに発現される最初のベータガラクトシダーゼフラグメントの検出された活性レベルに基づいている。
他の実施形態では、プロモーター領域の活動は、検出されたエンザイマティック活動レベルに基づいて細胞シグナリング経路の活動レベルを評価する、対象細胞シグナリング経路の活動を示す。他の多くの実施形態において、興味の転写因子の活動は、検出された酵母活動のレベルに基づいて細胞シグナル伝達経路の活動レベルを評価する、対象の細胞シグナル伝達経路の活動を示すことである。
多くの実施形態において、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、これは、細胞を剤(例えば、試験剤)と接触させること、および、検出されたレベルの担体タンパク質酵素活性に基づいて、細胞を剤と接触させることに応答して、プロモーター領域の活性レベルを評価することを含む。より具体的な実施形態では、本発明は、プロモーター領域の活性レベルを評価する方法を提供し、これは、細胞を剤(例えば、試験剤)と接触させること、ED-EA錯体の酵素活性の検出レベルに基づいて、細胞を剤と接触させることに応答して、プロモーター領域の活性レベルを評価すること、および試験剤の存在下で検出された酵素活性のレベルを、試験剤の非存在下でのED-EA錯体の酵素活性のレベルと比較することを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、この核酸は、aに作動可能にカップリングされた第一のβ-ガラクトシダーゼフラグメントをコードする領域を含むプロモーター領域が活動しているときに、第1のベータガラクトシダーゼフラグメントが発現される条件下で、細胞に剤(例、テスト剤)と接触する。もし発現されているならば、第1のベータガラクトシダーゼフラグメントに接触し、2番目のベータガラクトシダーゼフラグメントを用いて、エンザイム活動を有する活性なエンザイム錯体を形成し、細胞と剤との接触に反応してプロモーター領域の活動を評価し、テスト剤または制御条件がないときにテスト剤の存在で検出されたエンザイム活動のレベルと比較するために、プロモーター領域の活動レベルを検出する。
さらなる実施形態において、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、この核酸は、プロモーター領域が活性である場合に、EDフラグメントが発現される条件下で、プロモーター領域に作動可能にカップリングされた酵素ドナー(ED)フラグメントをコードする領域を含み、細胞を作用物質(例えば、試験作用物質)と接触させ、発現された場合に、EDをEAフラグメントと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、ED-EA複合体の酵素活性レベルを検出して、細胞を作用物質と接触させることに応答して、プロモーター領域の活性を評価し、作用物質の存在下で検出される酵素活性レベルを、作用物質の非存在下での酵素活性レベルと比較することを含む。
したがって、多くの実施形態において、本方法は、ED-上記タンパク質溶融がプロモーター領域が活性である場合に発現されるように、EDに溶融した上記タンパク質を符号化する核酸を開示した。1つの実施形態において、担体タンパク質は、ED-EA錯体の酵素活性と同じではない酵素活性を示す。別の実施形態では、担体タンパク質は、野生型担体タンパク質と比較して、検出されたエンザイマティックな活動性を示さない、変化した担体タンパク質である。さらに別の実施形態では、任意の固有の酵素活性を欠く担体タンパク質は、EDフラグメントに融合され、その結果、ED-担体タンパク質融合は、プロモーター領域が活性である場合に発現される。
より具体的には、剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、抗菌、細胞表面たんぱく質、テスト剤、細胞、細胞からの製品(例えば、細胞によって秘密にされた製品)、アゴニスト、逆数のアゴニスト、部分的なアゴニスト、またはアンタゴニストである。多くのより多くの実施例において、細胞表面タンパク質は、核酸を構成しない細胞上に存在し、その領域は、ベータガラクトシダーゼのEDフラグメントをエンコードしている。他の実施形態では、細胞表面タンパクは、β-ガラクトシダーゼ酵素のEDフラグメントをコードする領域を含む核酸を構成する細胞上に存在する。
多くの態様において、本方法は、ED-EA複合体のための基質を提供することを含む、酵素活性のレベルを検出することをさらに含み、ここで、検出可能なシグナルは、ED-EA複合体による基質の加水分解の際に生成される。他の多くの実施形態において、検出可能な信号は、化学発光信号または生化学発光信号である。さらなる実施形態において、EDおよびEAは、EDフラグメントが配列番号30に示される配列またはEAと複合してグリコシダーゼヒドロラーゼ活性を有するED-EA錯体を形成するその変形例を含むβ-ガラクトシダーゼフラグメントである。
さらなる実施態様において、細胞は、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、ヒト細胞、免疫細胞、T細胞、JURKAT細胞、癌細胞、癌細胞、HepG2細胞、肉腫細胞または他の既知の細胞型である。
種々の態様において、核酸は、プラスミド、細胞の染色体、核染色体、有糸分裂軟骨染色体である。他の実施形態では、核酸はさらに、EDに融合した運搬性タンパク質をエンコードし、その結果、促進領域が活性化されたときにED-運搬性タンパク質の融合が発現される。
より多くの実施例において、検出可能なエンザイマティック活動を有する担体タンパク質は、ルシフェラーゼ、改良ルシフェラーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、アルカリリン・ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、蛍光性たんぱく質または検出可能な活動を有する他の担体タンパク質であり得る。
本発明は、多くの実施例において、様々な経路及び促進領域の敵対者、敵対者、活動家及び阻害者を研究するためのアッセイを提供する。
更なる実施例において、本発明はまた、例えば、本開示の方法を実践する際に使用することができる細胞、組成物、キットを開示する。
他の特徴は、添付の図と、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
実施例は、例示の方法で図示されており、また、参考文献が類似の要素を示しているように、表及び付随する図中に限定されていない。
活性化されたT細胞(NFAT)エンザイムフラグメント補完(EFC)レポーター構造の核因子のプラズミドマップである。 フォルボル12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)およびイオノマイシンの細胞刺激カクテルに反応して、U2OS NOS FAT EFCレポーター細胞内に構築される式NFAT EFCレポーターである。 NF-kB EFCレポーターのプラズミドマップである。 サイトキンTNFαに対するU2OS NF-kB EFCレポーター細胞の単細胞クローンの応答である。 U2OS NFkB EFCレポーターセルベースアッセイを用いたインヒビターのスクリーニングである。 NFκB EFCレポーター・アッセイを用いた2つのHumira(R)ロットのTNFα阻害活性および効能の試験である。 NFκB EFCレポーターアッセイ細胞における内因性CD40レセプターは、CD40リガンド(CD40L)にロバストに応答する。 Jurkat NFAT EFCレポーターセルはOKT3配位子に反応し、共同培養アッセイでCHO-K1細胞の表面を発現し、提示した。 IL2-Promoter-EFCレポーターのためのプラズミドマップである。 Jurkat IL2-promoter EFCレポーターセルラインは、異なるシグナル伝達経路の活性化を通して、複数の明確な応答要素の刺激を検出する。 複数の異なる応答要素を持つ複雑で天然促進剤から成るIL2-促進剤EFCレポーター構成体の、2つの異なるシグナル伝達経路の細胞内模倣への応答である。 RORγT転写因子およびRORγT EFCレポータープラスミドを発現するU2OS細胞において、逆アゴニストGSK805によってRORγT転写因子の活性が低下する。 EFCベースのNFκ転写レポーターアッセイは、LuciferaseシステムよりもCD40L/CD40レセプターにより良好な感度を示す。 EFCベースのNFκ転写レポーターアッセイは、LuciferaseシステムよりもTNFαへのより良い感度を示す。 本開示の一実施の形態によれば、NFκパスレポーターセルラインのアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本開示の一実施の形態によるNFATパスレポーターセルラインのアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本発明の実施の形態によるSTAT3経路レポーターセルラインのアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本開示の一実施の形態によるNFATパスレポーターセルラインのアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 パスレポーターアッセイが、本開示の一実施形態による他のターゲットのためのアッセイを生成するために、パスレポーターアッセイが更に改良され得ることを発明するPD1パスレポーターアッセイの結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本開示の実施の一形態によれば、NFκウェイレポーターのためのアッセイ結果は、担体タンパク質・カッド・プロモーターを用いたアッセイである。 本開示の一実施の形態による、U2OS RANK NF-κウェイレポーターアッセイの結果である。 本開示の一実施の形態によれば、HEK NF-κウェイレポーターアッセイの結果である。 本開示の一実施の形態によれば、HEK CD27-NF-κウェイレポーターアッセイの結果である。 図24aおよび24bは、本開示の一実施形態による、U2OS NF-κBレポーター細胞株およびU2OS RANKNF-κBレポーター細胞株のアッセイ結果である。
本実施形態の他の特徴は、付随する図面及び以下の詳細な記述から明らかである。
促進剤領域の活性を評価する方法を提供する。この方法は核酸を含む細胞、すなわち核酸を含んでいる細胞を培養することを含んでいる。この領域は、対象の促進剤領域に操作可能な形で結合された最初のベータガラクトシダーゼの断片をエンコードしている領域であり、その条件下では、促進剤領域が活動的であるときには、促進剤領域が細胞培養条件に応じて活動的になることができる、最初のベータガラクトシダーゼの断片が発現される。この方法は、第一のβ-ガラクトシダーゼ酵素を接触させることをさらに含む。もし断片が2番目のベータガラクトシダーゼ・フラグメントで発現されているならば、それは活性化されたエンザイム・コンプレックスを形成する。つまり、エンザイマティック・アクティビティのレベルを検出することは、プロモーター領域の活動を評価することになる。プロモーター領域の活性は、対象細胞シグナル伝達経路及び/又は内生または外生の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、指標であり、従って、使用され得る。
さらに、この方法には、核酸を含む細胞を培養すること、すなわち、促進領域が活動しているときにEDが発現される条件の下で、対象の促進領域に操作可能に結合された、エンザイムドナー(ED)をエンコードする領域を含む核酸を含む。本方法は、さらに、EDを、発現される場合、酵素受容体(EA)と接触させて、酵素活性を有するED-EA錯体を形成することを含む。この方法には、さらに、促進者領域の活性を評価するためのエンザイマティック活性のレベルを検出することが含まれる。プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路および/または内生または外生の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、指標であり、従って、用いられることがある。また、細胞とエージェント(例えば、テストエージェント)とのコンタクトを含む方法、および検出されたエンザイマティック活動レベルに基づいて細胞とエージェントとのコンタクトに対するプロモーター領域のアクティビティレベルを評価する方法も提供される。例えば、本開示の方法を実践する際に使用することを発見した細胞、構文、及びキットもまた提供される。
本発明はまた、細胞中のプロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、ここで、核酸を含む細胞は、酵素ドナー(ED)フラグメントに融合された担体タンパク質を含み、ここで、担体タンパク質-ED融合は、目的のプロモーター領域に作動可能にカップリングされる。さらに、促進領域が活動しているときにEDが発現される条件下で細胞を培養すること、エンザイマティック活動を持つED-EA錯体を形成するためにEDと接触すること、および、対象の促進領域の活動を評価するためのエンザイマティック活動のレベルを検出すること、すなわち、促進領域の活動が対象の転写因子および/または対象のセルシグナル経路の活動を示すことである。
本開示の方法、細胞、組成物およびキットがより詳細に記載される前に、方法、細胞、組成物およびキットは、記載される特定の実施形態に限定されず、当然ながら上記のように変化することが理解されるべきである。ここで用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、また、限定することを意図したものではないことを理解する。なぜなら、方法、細胞、組成物及びキットの範囲は、特許請求範囲によってのみ限定されるからである。
値域が与えられた場合、文脈が明確にそうでない限り、その範囲の上限と下限と、その範囲内で述べられたまたは介入する値との間の、下限の単位の10分の1までの各介入値が、方法、細胞、組成物およびキットの中に含まれることが理解される。これらの小さな範囲の上限と下限は、より小さな範囲に独立して含まれることができ、また、記載された範囲内で特に除外された制限に被検者する方法、細胞、組成物及びキットの中にも含まれる。記載された範囲に限界の一つまたは両方が含まれる場合、限界のいずれかまたは両方を除いた範囲も、方法、細胞、組成物およびキットに含まれる。
ここでは、いくつかの範囲について、「about」という語の前に数字がついている。「about」という語は、その語の前にある正確な数字と、その語の前にある数字に近い数字、あるいはその前にある数字を文字通り保持するために使われる。ある数が、特定に暗唱された数に近いか、近似的で引用されていない数であるかを決定する際には、それが提示される文脈において、具体的に暗唱された数と実質的に同等である数であってもよい。
別に定義されない限り、本分野で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、その方法、細胞、組成物及びキットが属する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持つ。どのような方法、細胞、組成物及びキットであっても、本記載のものに類似する又は同等のものは、本方法の実践又は試験においても使用することができるが、細胞、組成物及びキット、代表的な実例的方法が今説明されている。
この明細書において引用されるすべての出版物及び特許は、引用される個々の出版物又は特許が、引用によって具体的かつ個別に記載されているかのように、ここに引用される参考文献に組み込まれ、引用される資料及び/又は方法を記載することにより、参考文献に組み込まれている。いかなる公表も、その公表のためのものであり、公表日の前に公表されるものであって、また、現在の方法、細胞、組成物及びキットが、上記公表日を前日にする資格がないことを認めるものと解釈してはならない。なぜなら、提供される公表日は、独立に確認される必要がある実際の公表日と異なる可能性があるからである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明白に別段の指示をしない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するために作成され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の記載または「消極的」限定の使用に関連して、「単独」、「のみ」などの排他的用語を使用するための先行基礎として役立つことを意図している。
明確にするために、別個の実施形態の文脈において記載されている方法、細胞、組成物およびキットの特定の特徴も、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、単独の実施形態の文脈で説明される、簡潔にするために、方法、細胞、組成物及びキットの様々な特徴も、別に、又は適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。本実施形態の全ての組み合わせは、本開示により特に包含され、また、そのような組み合わせが操作可能な工程及び/又は組成物を包含する範囲で、各々及び全ての組み合わせが個別に、また明示的に開示されたように、ここに開示される。加えて、このような変数を記述する実施形態に記載されている全てのサブコンビネーションもまた、本方法、細胞、組成物及びキットによって具体的に包含されており、この中で、このようなサブコンビネーションの各々が、ここに個別に、かつ明示的に、ここに開示されている。
この開示を読んでいる当業者に明らかなように、ここに説明された個々の実施例は、本方法の範囲又は精神から逸脱することなく、容易に他のいくつかの実施例の特徴から分離又は組み合わせることができる、離散した成分及び特徴を有している。いかなる暗唱法も、暗唱される事象の順序または論理的に可能なその他の順序で実行することができる。
方法
以上要約したように、本開示は、促進剤地域の活性を評価する方法を提供する。この方法には、核酸を含む細胞を培養すること、すなわち、促進領域が活動しているときにEDが発現される条件下で、対象の促進領域に操作可能に結合された、エンザイムドナー(ED)をエンコードする領域を含む核酸を培養することが含まれる。本方法は、さらに、EDを、発現される場合、酵素受容体(EA)と接触させて、酵素活性を有するED-EA錯体を形成することを含む。この方法はさらに、対象の促進剤領域の活性を評価するために、エンザイマティック活性のレベルを検出することを含んでいる。プロモーター領域の活性は、対象の転写因子および/または対象の細胞シグナル伝達経路の活性を示すことができる。従って、本方法は、検出されたエンザイマティック活動量に基づいて、興味の転写因子及び/又は対象のセルシグナル化経路の活動を評価することを更に含み得る。
プロモーター領域の活性を評価する方法は、様々な状況で使用されていることを見いだす。たとえば、細胞が対象のある条件下にあるとき、プロモーター領域のアクティビティレベルを決定する際に使用する方法を見つける。興味の対象となる条件は、pH、温度、細胞の遺伝的条件(例えば、細胞の1つ以上の染料(例えば、点突然変異、削除、挿入、および/またはその両方)、細胞がエージェント(例えば、試験剤)と接触する条件などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、プロモーター領域の活性を評価する方法は、細胞とエンザイマティック活性の検出レベルに基づき、セルと剤との接触に反応するプロモーター領域の活性(および任意に、対象のある遺伝子の転写活性および/または対象のセルシグナル伝達経路の活性)を評価する際に、細胞と剤(例、テスト剤)と接触することを含んでいる。このような方法は、例えば、エージェントがプロモーター領域の活動レベルに影響を与えるかどうか(また、任意に、対象の遺伝子の転写活動および/または対象の細胞シグナル伝達経路の活動)を決定する際に、使用を見出す。プロモーター領域の活性を評価する方法はまた、アゴニスト、アンタゴニスト、試験剤、転写因子、細胞シグナル伝達経路の活性化剤、または細胞シグナル伝達経路のインヒビターの効果を評価するために用いることができる。
また、被験物質が対象の細胞シグナル伝達経路の活性レベルに影響するかどうかを評価する方法も提供される。このような方法には、試験剤の存在の中で細胞を培養することが含まれる。この方法では、EDが発現される条件下で、EDをプロモーター領域に操作可能に結合する領域を含む核酸を細胞は含む。プロモーター領域は活性であり、ここで、プロモーター領域の活性は、対象の細胞シグナル伝達経路の活性レベルを示す。さらに、この方法には、EDと接触し、もしEAと接触してED-EA錯体を形成し、エンザイマティックな活動を有し、試験剤が対象の細胞シグナル伝達経路の活動レベルに影響を与えるかどうかを評価するために、エンザイマティック活動のレベルを検出することが含まれる。
この方法は、ある部分は、本開示のEFCに基づくレポーターアッセイ/システムが、全長(単一ポリペプチド)エンザイム、全長・ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)、および2)蛍光タンパク質のような1)全長(単一ポリペプチド)エンザイムの発現に依存する既存のレポーターシステムと比較して、より高い感度を示すことを予期せぬ発見に基づいている。さらに、この方法は、例えば、以下の実験セクションで示されるように、本開示のEFCベースのレポーター・アッセイにおいて、全長 (単一ポリペプチド)ルシフェラーゼエンザイムの発現に依存するカウンターパート・ルシフェラーゼベースのアッセイと比較して、リガンド刺激に対する感度の向上が観察されたことをさらに実証する。このように、本開示のアッセイは、アッセイにおいてより強力に振る舞う剤(例、テスト剤)の能力に関して、既存のレポーターアッセイよりも向上を構成する。このアッセイでは、いくつかの実施形態において、アッセイがより生理学的に関連している。すなわち、天然文脈において、より生体内の文脈において、剤(例、テスト剤)の細胞への影響をより正確に反映している。
いくつかの実施形態において、方法の感度は、半最大有効濃度(EC50)値に従って発現される。この値は、発明開示の文脈において、ベースラインと、特定の曝露時間のために、細胞をエージェントに曝露した後の最高値の中間で、細胞内で反応を誘発するエージェント(例えばテストエージェント)の濃度である。いくつかの実施形態によれば、本開示の方法(例えば、対象のプロモーター領域または細胞シグナル伝達経路に対する試験薬の効果を評価する方法)は、100μg/mL以下、10μg/mL以下、1μg/mL以下、100ng/mL以下、10ng/mL以下、1ng/mL以下、100pg/mL以下、または10pg/mL以下のEC50値を示す。
いくつかの実施形態によれば、本開示の方法(例えば、対象のプロモーター領域またはセルシグナル経路に対するテストエージェントの影響を評価する方法)は、EC50値を10mm以下、1mm以下、100 nM以下、10 nM以下、1 nM以下、100 pM以下、10 pM以下、1 pM以下、1 pM以下とする。
いくつかの実施例によれば、本開示の方法は、全長・ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT)、及び/又は2)蛍光タンパク質のような、1)全長(シングル・ポリペプチド)エンザイムの発現に依存する既存のレポーター・システムと比較して、より大きな効能を示す。上記のEC50 の値を小さくすると、有効性が高くなる。特定の実施形態において、本開示の方法は、2:1以上、5:1以上、10:1以上、15:1以上、20:1以上、25:1以上、30:1以上、35:1以上、40:1以上、45:1以上、または50:1以上である効力を示す。
ここで用いられるように、「プロモーター領域」は、転写を制御することで知られる少なくとも一つの要素(例えば、転写因子反応要素(TFRE)のようなヌクレオチド配列)を含む核酸(例えば、DNA)の領域である。例えば、プロモーター領域は、転写因子のDNA結合領域によって結合されることが知られている少なくとも一つの要素を含み得る。特定の実施形態においては、少なくとも1つの要素が、活性化された転写因子が元素に結合されるかどうかに応じて、1つ以上の遺伝子の発現を調節することが知られている。このようにして、プロモーター領域とED-EAレポーターシステムの組合せにより、プロモーター領域の活動レベルの審尋が可能となり、それはひいては、プロモーター領域の少なくとも1つの要素によって規制されることが知られている1つ以上の遺伝子の効果発現の条件の同定を容易にする。理解されるであろうが、プロモーター領域の活性レベルは、対象の転写因子および/または細胞シグナル伝達経路の活性レベルの指標となり得る(例えば、1つまたは複数の遺伝子の転写上方調節および/または下方調節は、対象のシグナル伝達経路の下流の結果であり得る。例えば、シグナル伝達経路は、プロモーター領域およびED-EAレポーター系が対象の転写因子および/または細胞シグナル伝達経路の活性レベルの探索を可能にし、次いで、対象の転写因子および/または細胞シグナル伝達経路の活性レベルに影響を及ぼす条件の同定を容易にするように、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、および/または他の共有結合修飾によって転写因子の活性を上記調節する)。条件のような幾つかの実施例によれば、細胞とエージェント、例えば試験剤との接触を含む。
シグナル伝達経路が転写因子の活性を調節する別の方法は、その部位における活性型転写因子の濃度を調節することである。ED式に関連する促進剤は、その合成、その劣化、および/またはそのサブセラーの位置を変えることによって、いずれも促進剤領域を制御する転換因子の能力に影響する可能性がある。
対象転写因子には、内在性転写因子(すなわち、細胞の天然/非導入核酸(例えば、細胞の野生型染色体)由来の細胞によって発現される転写因子)異種、トランスフェクト天然転写因子(すなわち、細胞によって他の方法で発現されない転写因子の野生型)異種、トランスフェクト組換えキメラ転写因子(すなわち、核酸の一般的なTFRE (例えば、GAL4/UAS)に結合するための異種DNA結合ドメイン(例えば、GAL4 DNA結合ドメイン)に融合された2以上の異種ドメイン、例えば、対象転写因子の活性化ドメインを含む転写因子)異種トランスフェクト構成的活性転写因子、または2以上のこのようなタイプの転写因子の任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。このような実施形態によれば、転写因子は、内生またはエンジニアリングされた細胞シグナル伝達経路によって活性化または不活性化され、またそれらの活動を反映することができる。
ある実施態様において、細胞経路またはシグナル伝達経路の1つ以上のタンパク質は、経路がよりよく研究されるように、特定の機構的疑問に答えるために、または陽性もしくは陰性の実験制御として働くように、遺伝的に改変されてもよい(例えば、過剰発現されてもノックアウトされてもよいし、ノックアウトされてもよい)。ある種の実施形態では、遺伝子的に変更された細胞経路またはシグナル伝達経路は、意図された実験目的のために必要とされるように、構成的に活動的または非活動的であることができる。
以上に要約したように、本開示の方法には、興味の転写因子及び/又はセルシグナル化経路の活動を評価することが含まれ得る。そこでは、プロモータ領域の活動レベル(及びEDの対応する発現レベル)が、興味の転写因子及び/又はセルシグナル化経路の活動レベルの読み取りを提供する。いくつかの実施例において、方法は、検出されたエンザイマティック活動レベルに基づいて、細胞とエージェント(例えば、制御剤、試験剤等)と接触することに対する対象の転写因子及び/又はセルシグナル化経路の活動レベルを評価することを含む。「試薬」とは、細胞に剤と接触する前に、剤(小分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸など)を意味する。細胞を薬剤と接触させることによって、対象の転写因子および/または対象の細胞シグナル伝達経路の活性レベルが変化するかどうかは不明である。試験剤とは、さらに、小分子、アンタゴニスト、アンタゴニスト、生物学的、承認された薬物、ペプチド、プロテイン、タンパク、抗菌、細胞、異種性タンパク質を表す細胞、内生性タンパク質を表す細胞、エル、毒素、天然製品、促進剤、抑制剤、または逆アゴニストによって秘密にされた産物を意味するが、それに限らない。
本開示の方法に従った試験剤は、細胞の不透過性の(例えば、試験剤が対象の転写因子および/またはセルシグナル化経路の活動レベルを変化させるか、対象の転写因子および/またはセルシグナル化経路と相互作用すること(例えば、結合すること)を介して、対象の活動レベルを変化させるか、またはセル浸透性であるか、例えば、試験剤がセルの表面上の分子またはその区画内の分子(例えば、細胞質ゾル内の分子、オルガンエルの表面上の分子、オルガンエル内の分子)と相互作用すること(例えば結合すること)を介して、細胞シグナリング化経路の活動レベルを変化させるかどうかを疑問視すること)である。
ここで用いられるように、「細胞シグナル伝達経路」は、外部信号に反応するセルまたはセルの一連の分子(例えば、1つ以上のセル表面分子および/または1つ以上のセル内分子)を含む。この外シグナルは、1つ以上の遺伝子の式のアップレギュレーションおよび/または1つ以上の遺伝子のダウンレギュレーションをもたらすような外的シグナルに反応する。1つ以上の遺伝子の式のアップレギュレーションおよび/またはダウンレギュレーションは、1つ以上の遺伝子のプロモーター活性レベルの増加および/または減少に対応する。そのように、細胞シグナル伝達経路の活性レベルは、細胞シグナル伝達経路を介するシグナル伝達の下流標的(正または負)であるプロモーター領域(またはそのサブ領域)の活性レベルに基づいて評価され得る。
理解されるように、特定のシグナル伝達経路は、シグナル伝達経路に存在する分子に従って指定/特徴付けされ得る。例えば、シグナル伝達経路は、外部信号への結合時にシグナルを開始するレセプター(例えば、細胞表面レセプター、サイトソリックレセプター等)に応じて指定され得る。また、例の方法によって、特定のシグナル伝達経路を、外部信号のレセプターの「下流」の分子およびシグナル伝達経路における転写因子の「上流」に従って指定/特徴付けしてもよい。別の実施例として、ある特定のシグナル経路は、シグナル伝達経路における転写因子(例えば、NFκB、NFAT、STAT3など)に従って指定/特徴付けされ得る。
多くの実施形態において、活動レベルが評価され得る細胞シグナル伝達経路(例えば、試験化合物がシグナル伝達経路の活動レベルに影響するかどうかを決定するため)には、Aktシグナル伝達経路、AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)シグナル伝達経路、上皮成長因子受容体(EGFR)シグナル伝達経路、線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路、NF-κBシグナル伝達経路、活性化T細胞(NFAT)シグナル伝達経路の核因子、p53シグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない 血管内皮増殖因子(VEGF)シグナル伝達経路であるtoll様レセプター(TLR)シグナル伝達経路であるトランスフォーミング増殖因子β (TGF-β)シグナル伝達経路、そして、Wntシグナル伝達経路である。幾つかの実施形態によれば、細胞シグナル伝達経路はNFカッパシグナル伝達経路である。特定の実施例において、細胞シグナル経路は、STAT (例えば、STAT3および/またはSTAT5)シグナル経路である。いくつかの実施形態によれば、細胞シグナル伝達経路はNFATシグナル伝達経路である。
細胞が接触する可能性のある物質(例えば、試験剤)は、小分子、ポリペプチド(ペプチドを含む)、核酸などを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、剤はアゴニスト、逆アゴニスト(すなわち、アゴニストと同じ分子(例えば、レセプター)に結合するが、アゴニストとは逆の効果を持つ剤)、部分アゴニスト(すなわち、アゴニストと同じ分子(例えば、レセプター)に結合し、アゴニストと同じ効果を持つ剤)、または反対者(すなわち、アゴニストと同じ分子(例えば、レセプター)に結合し、アゴニストと分子との結合を防ぐ剤、例えば、分子の活性に影響を与えない)である。「低分子」とは、1000原子質量単位(amu)以下の分子を有する複合体をいう。幾つかの実施例では、小分子は750 amu以下、500 amu以下、400 amu以下、300 amu以下、200 amu以下である。ある局面では、小分子は、ポリマーに存在するような繰り返しの分子単位で作られていない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「たんぱく質」という用語は、ここでは、隣接する残留物のアルファ-アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって、互いにつながっている一連のアミノ酸残基を、ここでは互換的に呼ぶことにする。また、アミノ酸には、遺伝的に親和性のある20のアミノ酸、アミノ酸アナログ、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。ある実施例では、試験剤がタンパク質である場合、タンパク質は溶性タンパク質であり、例えば、細胞に関連しない(結合している、あるいは一部していない)。他の実施形態では、試験剤は難解決性タンパク質であることがある。対象不溶分のタンパク質の実施例は、細胞表面タンパク質を含むが、これに限定されない。このように、いくつかの実施例において、この方法は、セルを第2のセルに曝露し、細胞表面上(セル表面タンパク質とセルの接触時)で、セル内の対象のセルシグナル伝達経路の活動レベルに影響するかどうかを評価することを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、第2の細胞の細胞表面タンパク質と細胞に接触するために、第2の細胞と共培養されることができる。いくつかの実施例によれば、第2細胞(例えば、細胞表面配位子)の細胞表面タンパク質は、第2細胞から分離され、浄化され、溶けやすく、相互に連結されているか、または固体保持体(例えば、ビーズの表面または組織カルチャー板)に被覆されたときに、細胞(反応細胞)と接触することができる。
いくつかの実施形態において、剤が核酸である場合、剤はオリゴヌクレオチドである。ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」は、2～500のヌクレオチド、例えば2～200のヌクレオチドのシングルストランドの多量体である。オリゴヌクレオチドは、合成されているか、あるいは、エンザイム的に作られていることがあり、いくつかの実施例では、長さ5～50のヌクレオチドである(例えば、長さ9～50のヌクレオチド)。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー(すなわち、オリゴリボヌクレオチド又は「リボヌクレオチド」又は「リボヌクレオチド」)又はデオキシリボヌクレオチドモノマー(すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチド又は「DNAオリゴヌクレオチド」)を含むことができる。
オリゴヌクレオチドは5～9、10～20、21～30、31～40、41～50、51～60、61～70、71～80、80～100、100～150、150～200、500以上の長さのヌクレオチドなどである。いくつかの実施形態において、エージェントが核酸であるとき、このエージェントは、短い干渉型の(sirna)の(mirna)、マイクロ転換型(mirna)、モルフォリノ、および/またはそれに類するものである。例えばMonsoori et al. (2014) Adv Pharm Bullのように、特定のmrnaをターゲットにするためのsirnas、mirnas、morpholinosなどを設計し、提供するためのアプローチが知られており、説明されている。4(4):313-321; Xin et al. (2017) Mol Cancer 16:134、Chakraborty et al. (2017) Mol Ther Nucleic Acids 8:132-143、およびAhmadzada et al. (2018) Biophys Rev. 10(1):69-86.siRNAs、miRNA、モルホリノなどは、設計に基づいてもよい標的化されるべきmrnaの既知の配列について、また利用可能なツール、例えば、InvivogenからのsiRna Wizard、DharmaconからのsiDESIGN Center、InvitrogenからのBLOCK-iTTMNARi Designer、miR-Synthがmicrorna.osumc.edu/mir-synth、WMD3-Gene Toolsなどが提供するモルフォリノデザインツール、MicroRNA Web Designerで利用可能である。
いくつかの実施形態において、細胞は、エージェントがエージェントのライブラリの一部であるエージェント(例えば、低分子ライブラリ、ポリペプチドライブラリー、sirnaライブラリーなど)と接触する。このような方法は、細胞が組織培養プレート(例えば、4-、6-、8-、12-、24-、48-、96-、384-、1536-ウェル組織培養板)のウェルに提供される高スループットでこの方法を実施することをさらに含むことができ、細胞は、試験薬剤のライブラリー(例えば、小分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、siRNAライブラリーなど)からの試験薬剤の1つまたはサブセットと接触され、この方法は、検出された酵素活性レベルに基づいて、対象のシグナル伝達経路の活性レベルに影響を及ぼす薬剤を同定することを含む。
いくつかの実施形態によると、プロモーター領域は、目的の転写因子についての転写因子応答エレメント(TFRE)を含み、プロモーター領域の活性は転写因子の活性を示す。いくつかの実施形態において、方法は、検出された酵母活動レベルに基づいて転写因子の活性化レベルを評価することを含む。ある種の実施形態では、自然に生じている対象の転写因子が、細胞内で発現されたり、過剰に発現されたりすることがある(例えば、アッセイに理想的なレベルよりも低いレベルで欠けていたり、存在していたりする場合)。特定の実施形態において、転写因子は、構成的に活性または不活性であるように変異した転写因子である一般的転写因子である。ある実施形態では、転写因子がノックダウンされたり、ノックアウトされたりすることがある。ある種の実施例において、転写因子は、対象の転写因子の活性化領域を含むキメリック転写因子であり、それは、TFREに結合するヘテロロゴ酸結合ドメイン融合している。TFREは、対象の野生型転写因子のDNA結合ドメインが結合するTFRE(例えば、STAT3の活性レベルを評価することを含む方法において野生型STAT3が結合するTFRE)であってよい。いくつかの実施形態において、TFREは、「一般的な」TFREであり、つまり、TFREは、本質的に異なるTFREと結合する様々な転写因子の活動レベルを評価するためのレポーター分析システムで使用され得るものである。例えば、いくつかの実施例において、細胞は、ゲネリックTFREに結合する異種のロゴの核酸結合領域に融合した対象の転写因子の活性化領域を含むキメリック転写因子を発現する。このように、自然界では同じTFREと結合しない転写因子の活動レベルを評価するために、同じ核酸をEFCレポーターのアッセイで使用することができる。採用され得る一般的なTFREの非限定的な例は、GAL4/上流活性化配列(GAL4/UAS)であり、ここで、対象のある転写因子(例えば、NFκB、STAT3、NFAT、ELK1など)の活性化ドメインがGAL4 DNA結合ドメインに融合され、対象のある転写因子に対する天然のTFREを必要とせずに、対象のある転写因子の活性化の評価を可能にする。いくつかの実施形態において、本方法は、転写因子をエンコードする式ベクトルをセルに導入し、転写因子が発現される条件下で細胞を培養することを含む。
特定の実施形態において、プロモータ領域は、単一の転写因子応答エレメント(TFRE)を含む。単一のTFREは、以下の実験セクションのある例で例示されるように、単一の転写因子(例えば、NF-kB応答要素である教室A)に結合し反応するTFREであることができる。このような実施例は、例えば、対象の特定のTFREを分離して、そのTFREの活動を単独で(すなわち、他のTFREからの干渉なしで)影響する条件を決定し、TFREが結合し反応する転写因子の活性化または不活性化に影響する条件を決定するのに使用する。特定の他の実施形態において、プロモータ領域は、複数の転写因子応答エレメント(TFRE)を含む。
いくつかの実施形態によれば、プロモーター領域は少なくとも1つのTFREからなる。さらに、多くの実施形態によれば、プロモーター領域は2つ以上のTFREを含む。プロモーター領域内に含まれるTFREは、TFREが同じ転写因子に対するものであるように同じTFREであってもよいし、プロモーター領域内の異なるTFREが異なる転写因子に対するものであるように異なるTFREであってもよい。TFREは、組み合わせて、あるいは順次細胞に導入することができる。特定の実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREを含み、第1のTFREと第2のTFREは異なる。例えば、異なる転写因子の活性化および/または失活に結合し反応するTFREである。2つ以上のTFREを含むプロモーター領域が、使用を発見する。例えば、プロモーター領域が、異なる転写因子(例えば、IL-2遺伝子プロモーターが少なくとも6つの異なった転写因子比の応答要素を有する例)の活性化及び/又は停止に結合し反応する複数のTFREを有する自然に発生する野生型プロモーター領域を模倣することが望ましい場合、以下の「実験」の部では、いくつかの実施例において、プロモータ領域は、様々な転写因子の活性化及び/又は停止に結合し反応する複数のTFREを有する自然発生の野生型プロモータ領域に存在するすべてのTFREのサブセットを模倣する。いくつかの実施形態において、プロモータ領域は向上剤であるTFREを含む。「エンハンサー」とは、遺伝子転写を増加させるために1つ以上のタンパク質によって結合することができ、かつEDをコードする領域から最大1Mb離れて位置し得るシス作用性DNA配列を意味する。教室Aまたは教室Bのいずれかの特定のプロモーター領域を使用する能力は、種々の生物学的問題に本方法を広範囲に適用することを可能にし、また、望ましい結果を生み出す条件、例えば、対象事の転写因子の活性化または不活化、対象事の遺伝子の発現の活性化または不活化、対象事の細胞シグナル伝達経路の活性化または不活化、および/または不活発化のスクリーニングを可能にする。
以上要約したように、この方法には、促進領域が活動しているときにEDが発現される条件下で細胞を培養することが含まれる。「活」とは、プロモーター領域が、ED式の検出可能なレベルが背景上にある状態であることを意味し、そのような状態は、バックグラウンド上のED式の検出可能なレベルがプロモーター領域に結合されないときに発生する「unbound」状態である可能性がある。このような状態はまた、バックグラウンドを超えるED式の検出可能なレベルの上昇が、1つ以上の転写因子がプロモーター領域に結合した場合(例えば、1つ以上の転写因子自体の活性化の場合)、および1つ以上の転写因子の結合がED式の検出可能なレベルの上昇に必要とされる状態であってもよいか、および/または、プロモーター領域が非結合状態にある場合、ED式のレベルと比較して、ED式のレベルをアップレギュレート(誘導)またはダウンレギュレート(ダウンレギュレート)する状態であってもよい。
促進剤領域が活動しているときにEDが発現されるような細胞を培養するための条件は、様々である。上記条件は、適当な培地(例えば、DMEM、RPMI、MEM、IMDM、DMEM/F-12などの細胞培養培地)中で、適当な温度(例えば、32℃～42℃、例えば37℃)およびpH (例えば、pH 7.0～7.7、例えばpH 7.4)で、適当な割合のCO2、例えば、3%～10%、例えば5%)を有する環境中で、細胞を適当な容器(例えば、細胞培養プレートまたはそのウェル)中で培養することを含むことができる。使用されうる細胞培養条件の限定されない例は、以下の実験セクションに説明される。
この方法で用いられる細胞は、適当な細胞であればどれでもよい。特定の実施形態において、細胞のタイプは、対象の生物学的過程に基づいて選択される。例として、T細胞活性化に影響を与える条件を調査するために本方法を実施したいと望むならば、細胞は活性化可能なTセル、例えばJurkatセルであるかもしれない。いくつかの実施例によれば、細胞は、対象細胞シグナル伝達経路を尋問するために、当業者によって使用されるタイプの細胞である。特定の実施例において、細胞は、対象のある経路、例えば、プロテインキナーゼ、アダプター、転写因子において、特定のレセプター又は下流側のシグナル分子のような対象のある特定の細胞及び分子の成分を含む細胞を調べるために、当業者によって使用される細胞のタイプである。
幾つかの実施形態によれば、細胞は一次細胞である。「一次細胞」とは、生きた組織(例えば、生体物質)から直接得られ、生体内で成長するために確立された細胞を意味する。幾つかの実施例において、細胞は細胞株から来ている。このような細胞株の無制限の実施例としては、Jurkat、U2OS、HepG2、HeLa、MCF-7、PC-12、PBMC、HUVECs、HEK293、COS-7、BHK-21、HEp-2、HT-1080、MDCKなどがある。いくつかの実施形態によれば、細胞は上皮細胞、中皮細胞、または内皮細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、防御細胞である。採用され得る免疫細胞の非限定的な例としては、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好塩基球、および好酸球が挙げられる。特定の実施形態において、防除細胞はT細胞である。T細胞の実施例としては、ナイーブT細胞(TN)、細胞傷害性T細胞(TCTL)、記憶部T細胞(TMEM)、T記憶部幹細胞(TSCM)、中枢記憶部T細胞(TCM)、エフェクター記憶部T細胞(TEM)、組織常在記憶部T細胞(TRM)、エフェクターT細胞(TEFF)、制御性T細胞(TREG)、ヘルパーT細胞(TH、TH1、TH2、TH17)、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、ウイルス特異的T細胞、αβT細胞(Tαβ)、γδT細胞(Tγδ)などがある。
幾つかの実施形態によれば、細胞は癌細胞である。「癌細胞」とは、腫瘍性細胞発現型を示す細胞を意味し、これは、例えば、異常な細胞増殖、異常な細胞増殖、密度依存性増殖阻害の喪失、足場非依存性増殖能、免疫不全の非ヒト動物モデルにおける腫瘍増殖および/または現像を促進する能力、および/または細胞形質転換の任意の適切な指標の1つまたは複数を特徴とすることができる。「癌細胞」と本明細書中で「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「癌性細胞」と互換的に使用することができ、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍、癌細胞株、およびこれらの癌細胞を包含してもよい。ある局面において、癌細胞は癌細胞である。対象の癌細胞は、限定されるわけではないが、HepG2細胞を含む。特定の局面において、癌細胞は肉腫細胞である。肉腫細胞の非限定的な例としては、U2OS細胞などの骨肉腫細胞が挙げられる。
本方法で用いられる核酸は、促進領域とEDをエンコードする領域とを有機的に結合するのに適したどんな核酸でもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、非特定的又はサイト特有の、細胞の色素DNAに安定に統合される。いくつかの実施形態において、核酸はエピソーム(又は「エピソーム」)であり、「エピソーム」又は「エピソーム」とは、細胞の遺伝子とは独立に複製する核酸(例えば、DNA)分子を意味する。本方法で用いられるエピソードの限定されていない例はプラスミドである。核酸がエピソーム(たとえばプラスミド)である場合、エピソームは促進領域とEDをエンコードする領域に加えて、1つ以上の元素を含んでいる。例えば、プラスミドには、複製の起源、細胞に抗生物質抵抗性を付与する1つ以上の領域(例、アンピシリン抵抗性(AmpR)、ヒグロマイシン抵抗性、および/またはそれに類する)、1つ以上のポリ(A)シグナル、ポーズ部位、SV40ポリ(A)シグナル、SV40向上剤、SV40初期プロモーターなど、およびそのような元素の望ましい組み合わせが含まれ得る。エピソームあるいは色相統合式のために核酸を導入するプラスミドは、核酸を安定的に発現する細胞のみを選択するために使用できる抗生物質選択可能なマーカーに隣接し、遺伝的にリンクしていることがある。核酸を導入するプラスミドは、バイラルベクターによって運ばれるか、あるいは化学試薬、エレクトロプラクションまたは他の適切なアプローチによりトランスフェクトされることができる。
本開示の方法を実践する際に使用することを見いだすプラスミドの核化配列(以下の実験セクションで使用されるプラスミドを含む)及びその要素/後帰結は、以下の表1に示されている。
[表１]
ある実施態様において、核酸は細胞の色素である。例えば、細胞の染色体を(例えば、相同組換え、CRISPR-Cas9、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などのゲノム編集技術を用いて)、EDを符号化する領域が染色体に挿入されるように改変することができる。いくつかの実施形態において、EDをエンコードしている領域は、EDをエンコードしている領域が、色素の固有のプロモーター領域と操作可能に結合するように、細胞のゲノムに挿入される。天然のプロモーター領域は、対象のある1つ以上の遺伝子、および/または対象のある1つ以上の細胞シグナル伝達経路の転写活性化を評価するために使用を見出すプロモーター領域であってよい。単なる一例として、細胞内のNFκBシグナル伝達経路の活性化を評価したい場合、EDをコードする領域は、NFκB結合部位を含むプロモーター領域の下流側に部位特異的に挿入され得る。ある種の実施形態では、EDをエンコードする領域は、プロモータ領域(すなわち外生プロモータ領域)と一緒に、遺伝子をエンコードする領域が外生プロモータ領域と操作可能に結合される、第三者領域に挿入される。核酸がaである実施形態のいずれにおいても細胞の染色体、染色体は核染色体、またはミトコンドリア染色体であり得る。
特定の実施例では、核酸はさらに、EDに融合した担体タンパク質をエンコードし、したがって、ED担体タンパク質融合は、プロモーター領域が活性化されたときに発現される。EDに選ばれた担体タンパク質は、EDに異なる希望する物理的または生物学的特性(例えば、安定性、局在性、生物学的不活性、EFCとは異なる別の方法による検出など)を与えることができる。いくつかの実施形態によれば、担体タンパク質は、ED-担体タンパク質の融合の安定性に影響するように選択された領域を含む。特定の実施形態では、領域を欠くED担体タンパク質融合に比べて、ED担体タンパク質融合の安定性を高めるために領域が選択される。他の実施形態では、領域を欠くED-担体タンパク質融合に比べて、領域がED-担体タンパク質融合を不安定化させるように選択される。例えば、領域は、プロテソーマー分解のためのED-担体タンパク質の融合を標的とする領域(例えば、ユビキチン依存プロテアーソール分解)である。プロテゾマル分解のためのED-担体タンパク質の融合を標的にするために使用されることができる領域の一例として、プロリン(P)、グルタミン酸(E)、セリン(S)およびスレオニン(T) (PEST)分解シグナルがある。上記領域のもう一つの実施例は、CL1劣化信号である。実施例PESTとCL1の劣化信号のアミノ酸配列は、下の表2に示すとおりである。
[表２]
特定の実施において、組み合わせたんぱく質は、ED-組み合わせたんぱく質の融合の安定性に影響するように選択された2つ以上のドメインを含む。例えば、担体タンパク質は、単一のそのようなシグナルを用いて達成された目標達成に対するプロテオマール分解のためのED‐担体タンパク質融合のターゲティングを強化するために、PEST分解信号とCL1分解信号を含むことができる。
多くの実施形態において、プロモーターは、担体タンパク質の存在が信号を高め、その結果、全長・ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT)、および2)蛍光性タンパク質のような、1)全長(単一ポリペプチド)エンザイムの発現に依存する既存のレポーターシステムと比較して、より感度が高く、より強力なアッセイをもたらす担体タンパク質と更に結合される。担体タンパク質は、プロモーター領域と動作的に結合することができる。担体タンパク質は、既知の検出方法によって担体タンパク質の発現を検出することができるように、検出可能な活性を有するものであってもよい。多くの他の実施形態において、担体タンパク質の検出可能な活性は、β-ガラクトシダーゼ酵素の酵素活性と同一ではない。
さらなる実施形態では、担体タンパク質が、プロモーター領域に操作可能に結合されている、ベータガラクトシダーゼのEDエンザイムフラグメントと融合することができる。多くの実施例において、担体タンパク質は、プロモーター領域が活性化されて出力信号またはデータポイントが強化されるときに、EDエンザイムフラグメントと共発現することができる。本開示の方法において使用される担体タンパク質は、β-ガラクトシダーゼの酵素活性と同一ではない検出可能な酵素活性を有し得、ここで、担体タンパク質酵素活性は、プロモーター領域が前記酵素活性についての公知の検出方法を使用して活性である場合に検出され得る。検出された活性のある担体タンパク質は、ルシフェラーゼ、改良ルシフェラーゼ、蛍光性たんぱく質、天然たんぱく質、あるいは合成タンパク質であり得る。
さらに、担体タンパク質はまた、担体タンパク質の中での突然変異が担体タンパク質のエンザイマティック活動の抑制をもたらし、担体タンパク質は、プロモーター領域が活性化したときに検出された活動を一切発現しないような、変異担体タンパク質であってもよい。このような枝変わりをした担体タンパク質は、EDエンザイムフラグメントと結合して、プロモーター領域と動作的に結合することができる。EDフラグメントは、もし発現されているならば、EAエンザイムフラグメントと結合して、ED-EAエンザイム錯体を形成し、エンザイマティックな活動と共に、対象のプロモーター領域の活動を評価し、それゆえ転写因子の活動を測定するための、エンザイム活動を測定することができる。従って、本発明は、β-ガラクトシダーゼ酵素と同一ではない酵素活性を有する担体タンパク質の使用を開示し、さらに、担体タンパク質の酵素活性を不活性にするために変異された担体タンパク質を開示する。
多くの実施形態において、担体タンパク質は、固有エンザイマティック活性を持たない。担体タンパク質は、さらに、ベータガラクトシダーズフラグメントの安定性に影響するように選択された領域、例えば、領域を欠くED担体タンパク質溶融と比較して、ED担体タンパク質溶融の安定性を高めるためにドメインが選択された、エンザイムドナー(ED)フラグメント-担体タンパク質溶融を含む。さらに、担体タンパク質は、領域を欠くED‐担体タンパク質溶融に比べて、ED‐担体タンパク質溶融を不安定化させるために選択された領域を含み得る。
以上に要約したように、本開示の方法は、更に、促進剤領域の活性を評価するためのエンザイマティック活性のレベルを検出することを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、酵素活性のレベルを検出することは、ED-EA複合体のための基質を提供することを含み、検出可能なシグナルは、ED-EA複合体による基質の加水分解時に生成される。特定の実施形態において、検出可能な信号は、化学発光信号である。
この方法の側面としては、ベータガラクトシダーゼ・エンザイムフラグメント補完(EFC)レポーターシステムのような、親和性を減少させる酵母レポーターシステムの使用が含まれる。「親和性を減少させる」ことによって、補充レポーターシステムとは、それ自体が、親のエンザイムに観察される検出活性(直接的または間接的に検出可能であるかもしれない)が欠如しているが、十分に密接に結合されたとき、例えば、無作為の相互作用または結合部材を媒介した相互作用によって、親のエンザイムの活性の検出可能な量を生み出す、2つ以上のフラグメント(すなわちレポーターサブユニット)から構成されるシステムを意味する。本発明の親和性補足レポーターシステムの減少の一側面は、本システムで使用されるレポーターサブユニットの少なくとも1つは、その野生型親エンザイムの対応する領域の変形例であり、そのようなシステムの他のサブユニットとの相互作用は、興味の結合したモイテイによって仲介される相互作用がない分析条件下では可逆的であることである。この系では、ベーガラクトシダーゼの小さな断片とベータガラクトシダーゼのより大きな断片を使用し、この2つの断片は互いに低い親和性を持っている。β-ガラクトシダーゼの小さな断片、酵素供与体(「ED」)は、天然に存在する配列または変異した配列を有し得る。いくつかの実施形態によれば、EDは、ベータガラクトシダーゼドナーフラグメントである。いろいろな種類のベータガラクトシダーゼフラグメントEDを用いることができる。ある実施態様において、EDがベータ-ガラクトシダーゼドナーである場合EDは、以下の表3に示すアミノ酸配列、あるいはその変形物(例えば、10以下、8以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、表3に示すアミノ酸配列に対する1つの控えめなアミノ酸置換物)を含み、EAと錯体を形成して、エンザイマティックな活性を持つエンザイムを形成する。一例として、表3に表-galactosidase donor fragment EDのアミノ酸配列を示す。
酵素活性を有する活性βガラクトシダーゼ酵素複合体を形成するβ-ガラクトシダーゼまたはED-EA複合体の活性は、化学発光アッセイを用いて検出することができる。例えば、β-gal溶融物を含有する細胞を、Galactolight Plusアッセイキット(Tropix、Bedford Mass.)からのGalacton Plus基材を含有する緩衝液の混合物中で溶解する。Bronsteinら、J. BioluminChemilumin., 4:99-111 (1989)。Light Emission Accelerator溶液を加えた後、ルミノメーターまたはシンチレーションカウンターでルミネッセンスを測定する。多くの態様において、β-ガラクトシダーゼ酵素活性の検出方法はまた、細胞を溶解し、直接発色性、蛍光発生性、または化学発光性基材などの検出可能な産物を生じることができる任意のβ-ガラクトシダーゼ基材を用いてED-EA酵素断片の酵素活性を検出すること、または生物発光性の準備を有するカップリングアッセイの基材を検出することを含む。
実施例β-ガラクトシダーゼドナーフラグメントEDアミノ酸配列
[表３]
ここで用いられるように、「保守的置換」とは、ペプチド/タンパク質化学の熟練者は、ペプチド/タンパク質またはその領域の二次構造および水中分解性を実質的に変化しないと期待するような、類似した特性を有する他のアミノ酸の代わりにアミノ酸が置き換えられるものである。特に特定の実施形態を意図するポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造において修正がなされ、依然として望ましい特性を有する変形例又は誘導体ポリペプチドをエンコードする機能性ポリペプチドを得ることができる。例えば、イーアと錯体を形成し、グリコシドハイドロラーゼ活性を有するエンザイムを形成する能力である。例えば、当業者は、ED、EA、またはその領域のアミノ酸配列を変えて同等の、あるいは改良された改良型EDまたはEAを作り出すことが望まれる場合、エンコーディングDNA配列の1つ以上のコドンを変えることができる。
「EA」とは、エンザイムフラグメント補完アッセイで使用するためのエンザイムアクセプター断片を意味する。特定の実施形態では、EDはβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメントであり、EAはβ-ガラクトシダーゼアクセプターフラグメントである。例として、EDは、表3に示すアミノ酸配列を含むED(またはEAと複合してグリコシドヒドロラーゼ活性を有する酵素を形成するその変形例)であってもよく、EAは、EDと複合してグリコシドヒドロラーゼ活性を有する酵素を形成する市販のEAである。いくつかの実施形態によれば、このようなEAは、ユーロフィンズディスカバーX社から入手可能なPathHunter(R) ProLabel(R)/ProLinkTM検出キットに提供される。
本開示の方法には、もし発現されているならば、EDと接触し、エンザイマティックな活動を有するED-EA錯体を形成することが含まれる。いくつかの実施形態では、EDがEAと接触したとき、細胞は無傷であるが、例えば、細胞が生きているとき、細胞が固定されたときなど、EDはEAと接触することができる。EAとEDが接触したとき、細胞が無傷であるとき、EAは通常、細胞膜を横切って細胞内で発現されたEDと接触することができる上記のような細胞透過性である。ベータガラクトシダをベースとしたEFCシステムを使用する場合、生細胞フローサイトメトリーと、発色基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ベータ-D-ガラクトピラノサイド(X-Gal)による組織化学的な汚染を含む、ベータガラクトシダーゼの活性を測定するための様々な方法が利用可能である。例えば、Nolanら、ProcNatl. Acad.Sci., USA, 85: 2603-2607 (1988)、Lojda, Z., Enzyme Histochemistry: A laboratory Manual, Springer, Berlin (1979)を参照されたい。生きた細胞で使用することができる、ベーター・ガルの必須基質もまた、現在開示されている方法及び材料によって包含されている。例えば、蛍光発生基質、レゾルフィンβ-ガラクトシダーゼビス-アミノプロピルポリエチレングリコール1900(RGPEG)が記載されている。ミンデン(1996)バイオテクニック20(1):122-129。この化合物は、マイクロインジェクション、電気注入、または様々なバルクロード技術によって細胞に送ることができる。いったん細胞の中に入ると、基質はプラズマ膜やギャップジャンクションから逃げることができなくなる。現在開示されている方法および材料の実施において使用することができる別の重要な基質は、蛍光活性化細胞選別(FACS)およびフローサイトメトリーによる分析に特によく適したフルオレセインジ-β-D-ガラクトピラノシド(FDG)である。Nolanら、ProcNatl. Acad.Sci, USA, 85:2603-2607 (1988) および Rotman et al. (1963) Proc.Natl. Acad.米国科学省 50:1-6。
いくつかの態様において、方法は、細胞を溶解することをさらに含み、EDをEAと接触させることは、細胞溶解物をEAと組み合わせることを含む。細胞を溶解するために、任意の適切な溶解剤(例えば、溶解緩衝液)を使用してもよい。リズム緩衝液の限定のない例としては、NP-40リシス緩衝液、RIPA (RadioImmuno Precipitation Assay)リシス緩衝液、SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)リサイス緩衝液、ACK (アンモニウム-塩化カリウム)リサイン緩衝液等がある。溶解緩衝液には、緩衝塩(例えば、トリス-HCl)および/またはイオン性塩(例えば、NaCl)を含み、リサートのpHおよびオスモラリティを調節することができる。細胞膜構造を破壊するために、洗剤(トリトンX-100やSDSなど)を加えることができる。溶解緩衝液には、プロテアーゼ阻害剤などの有用な成分が含まれることがある。方法が細胞を溶解することを含み、β-ガラクトシダーゼベースのEFC系が使用される場合、活性再構成β-ガラクトシダーゼは、化学発光アッセイを使用して検出され得る。例えば、再構成されたβ-ガラクトシダーゼ(EFCを介する)を含有する細胞は、Galactolight Plusアッセイキット(Tropix、Bedford Mass.)からのGalacton Plus基質を含有する緩衝液の混合物中で溶解され得る(架橋剤と接触するかまたは接触しない)。Bronsteinら、J. BioluminChemilumin., 4:99-111 (1989).Light Emission Accelerator溶液を加えた後、ルミノメーターまたはシンチレーションカウンターでルミネッセンスを測定する。いくつかの実施形態では、方法が細胞を解析することを含み、β-ガラクトシダースベースのEFCシステムが採用される場合、ユーロフィンズディスカバリックス社から入手可能なPathHunter(R) ProLabel(R) /ProLinkTMまたはKILR(R)検知キットを使用して、ケミルミネセンスによるエンザティックアクティビティを検出することができる。
また、本開示により提供されるのは細胞である。細胞は、本開示の方法を実践する際に使用することを発見する。本開示の細胞は、本方法のセクション及び以下の実験セクションに記載された核酸のいずれかを含む、プロモーター領域に動作的に結合したエンザイムドナー(ED)をエンコードする領域を含む、本開示の核酸のいずれかを含み得るが、これらは簡潔さのために組み込まれているが、ここに繰り返されていない。いくつかの実施形態において、細胞は、本方法セクション及び以下の実験セクションにおいて上述された細胞の何らかの特性(例えば、細胞タイプ等)を有するが、これらは、簡潔さのために本稿では取り入れられているが、ここで繰り返されていない。
組成物
以上要約したように、本開示はまた、組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、例えば、本開示の方法を実践する際に使用する。いくつかの実施形態によれば、本開示の組成は、上の方法セクション及び下の実験セクションに記載された核酸及び/又は細胞のいずれかを含む、本開示のいずれかの核酸及び/又はセルを含み、これらは組み込まれているが、簡潔さの目的でここに繰り返されることはない。
本開示の組成は、液状媒体に存在する本開示の核酸及び/又は細胞のいずれかを含み得る。液状媒体は、水、緩衝液、細胞培地(例えば、DMEM、RPMI、MEM、IMDM、DM/F-12等)のような水性液状媒体であってもよい。抗生物質、塩(例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4)、緩衝剤(トリス緩衝液緩衝剤、N-(2ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)など)、可溶化剤、洗剤(例えば、Tween-20などの非イオン性洗剤)、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセリン、キレート剤などの1つ以上の添加剤が、そのような組成物中に存在し得る。
特定の実施形態では、緩衝化液状媒体中に存在する、本開示の細胞のいずれかを含む組成物が提供される。いくつかの実施例によれば、液状媒体は細胞媒体である。例えば、DMEM、RPMI、MEM、IMDM、DMEM/F-12、またはそれに類するものである。特定の実施例において、提供される組成物は、本開示の核酸のいずれかを含む、親水型であるか、または緩衝液状媒体に存在する。
本開示の組成は、チューブ、ビアル、アンプル、板の1つ以上のウェル、例えば、4-、6-、8-、12-、24-、48-、96-、384-、1536-ウェルティッシュ・カルチャー・プレート等に存在することができる。
キット
本開示の側面には、さらにキットが含まれる。特定の実施形態において、キットは、例えば、本開示の方法を実践する際に使用する。いくつかの実施形態によれば、本開示のキットには、上の方法及び構成セクション及び下の実験セクションに記載された核酸、細胞及び/又は組成物のいずれかを含む、本開示の核酸、細胞及び/又は組成物のいずれかが含まれているが、これらは簡潔さの目的でここに繰り返されることはない。
特定の実施において、プロモータ領域に作動可能にエンザイムドナー(ED)をエンコードする領域を構成する核酸を含むセルからなるキット、および、当該セルを本開示の方法のいずれかを実施するために使用する命令を提供する。例えば、キットは、核酸の促進剤領域の活性を評価するための命令を含むことができる。キットは、上記の方法セクションおよび下の実験セクションで説明されている、文化、接触、検出などの工程のための指示(および有用な試薬)で構成されている。
多くの実施例において、プロモーター領域と操作可能に結合された運搬性タンパク質をエンコードする領域を含む核酸からなる細胞を含むキットが提供され、本開示の方法のいずれかを実施するために細胞を使用するための指示が与えられる。
本開示のキットは、さらに、細胞と剤(例、小分子(例、細胞表面タンパク質)、核酸など)との接触に応じて、細胞の活動レベルを、検出された酵母活動レベルに基づいて評価し、また促進剤領域の活動レベルを評価する際に、細胞にエージェント(例、制御剤、試験剤、および/またはそれに類するもの)と接触するための命令を含み得る。このようなキットは、更に、対象のある細胞シグナル伝達経路を活性化する制御アゴニストと細胞に接触するための命令を含み得る。このようなキットは、さらに、制御アゴニストを含む。プロモーター領域の活性レベルは、対象の転写因子および/または対象の細胞シグナル伝達経路に対する作用物質の効果を評価するための基礎として使用することができる。この命令には、そのような評価を行うための命令が含まれることがある。
いくつかの実施形態によれば、キットの細胞に存在する核酸によってエンコードされるEDは、β-galactosidaseドナーフラグメントEDである。例えば、EDは、表3に記載されている例β-ガラクトシダーゼ・ドナーフラグメントEDのアミノ酸配列、又は、グリコシド・ハイドロラーゼ活性を有するエンザイムを形成するためにEAと複合化することができるその変形物を含むことができる。特定の実施例において、本開示のキットには、EAが含まれる。例えば、細胞の核酸がβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメントEDをエンコードするとき、キットに含まれるEAは、ED-EAペアがEFCを介してグリコシドハイロラーゼ活性を有する機能的なエンザイムを生成するように選択されたβ-ガラクトシダーゼアクセプターフラグメントEAであってもよい。
幾つかの実施例によれば、本開示のキットは、EAとEDと接触する前に細胞を分解するための命令を更に含んでいる。ある実施例では、本開示のキットは、分解剤を含む。本開示のキットに含まれることができる無限の溶解バッファーの例には、NP-40溶解バッファー、RIPA (RadioImmuno Precipitation Assay)溶解緩衝液、SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)溶解緩衝液、ACK (アンモニウム-塩化カリウム)溶解緩衝液などが含まれる。他の実施形態では、本開示のキットには、細胞が無傷であるときにEAとEDと接触するための命令が含まれる。このようなキットには、固定した無傷のセルなどで、生のセル(およびフローサイトメトリーなどによる検出)でEDとEAと接触するための指示が含まれることがある。
キットの構成要素は、別々のコンテナに存在することもあれば、多数のコンポーネントが単一のコンテナに存在することもある。適当な容器には、個々のチューブ(例えば、バイアル)、アンプル、1つ以上の板のウェルなどが含まれる。
キットに付属している説明書は、適切な記録媒体に記録することができる。例えば、説明書は紙や塑性などのような基材に印刷されてもよい。このように、この命令は、キットのコンテナまたはその成分(すなわち、包装または副包装に関連する)の標識において、パッケージ・挿入としてキットに存在することができる。他の実施例において、説明書は、適切なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えば、携帯用フラッシュドライブ、DVD、CD-ROMに存在する電子記憶データファイルとして存在する。ディスケット等他の実施例においては、実際の命令はキットには発明せず、遠隔源から命令を得る手段、例えばインターネットを介して提供される。本実施形態の例は、命令を見ることができ、また/または命令をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、適切な基材に記録されている。
以下の実施例は、限定としてではなく例示として提示するものである。
実験例
（実施例1）NFAT EFC Reporter Construct
NFAT EFC Reporterの構築は、配列:GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (配列番号:5)を持つ、4つの反復(4x) NFAT転写因子結合反応元素を持つ促進剤を含む。PESTは、報告されているProlabel (ePL)タンパク質のプロテイン不安定化配列(プロライン(P)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、およびスレオニン(T)が豊富なペプチド配列)であり、プロテアソームを媒介したProlabel (ePL)タンパク質の転換を強化する。ePLタンパク質は、ベータ‐ガラクトシダーゼの不活性～45アミノ酸断片である。担体タンパク質の寿命を短くすることは、分析に必要な応答時間を短くし、おそらくリガンド濃度への感受性を高めることが前もって示されている(Fan and Wood, Assay Drug Dev Technol. 2007年2月5日(1):127-36)。
図1は、NFAT転写因子活性化のEFCベースのアッセイに使用されるNFAT EFCレポーター構成のためのプラスミドマップを示し、NFATにインプットするシグナル経路の活性化を示す。異なったプロモーター要素(例えば、この例の4x応答NFAT要素)が、異なった担体タンパク質と異なった不安定化モチーフ(例えば、この例のPEST)を用いて、異なる用途のためにこれらの構成要素を標的にし、調整することができる。
図2は、フォルボル12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)とイオノマイシン(1xカクテルが81 nM PMA/1.34mm Ionomycin細胞刺激である場合の1x1として表される)の「細胞刺激」カクテルに対するU2OS NOS FAT EFCレポーター細胞の線量反応曲線(DRC)を示している。細胞を20時間刺激した後、PathHunter(R)フラッシュ検出試薬(+エンザイム・アクセプタ(EA))を1時間にわたって検出した。5Kと10Kは、384のウェルプレートの各ウェルにメッキされたセル数である。S/Bは分析応答曲線の背景(下)上の信号(上)である。
ホルボール12-ミリスタート13-酢酸(PMA)およびイオノマイシンの「細胞刺激」カクテルは、「NFATシグナル伝達経路」およびNFAT転写因子を活性化することが知られている。20時間のPMA/イオノマイシンカクテル(1X = 81 nM PMA/1.34マイクロム・イオノマイシン)の異なる希釈を用いて、NFAT EFCレポーター構成体(図1参照)で安定的にトランスフェクトされたU2OS細胞の刺激は、+EAを追加した後のEFCによって証明されるように、NFAT EFCレポーターの線量依存刺激を明らかにした。カクテルの効力は5,000細胞を用いて0.047X(または3.8nMPMA/63nMイオノマイシン)であることが示された。これらのデータは、U2OS NFAT EFCレポーター細胞が、「NFATシグナル伝達経路」およびNFAT転写因子の活性化または阻害のためのアッセイを開発するのに適していることを実証する。細胞刺激カクテルまたは他の活性化リガンドの刺激量の存在の中で、試験化合物の相対光単位(RLU)の減少として抑制を検出することができた。
（実施例2）NFkB EFC Reporterの構築
NF-kB EFC Reporter Plasmid には、NF-kB 転写因子拘束因子応答エレメントを5 つのタンデムに繰り返すプロモーターが含まれており、GGGAATTTCC (配列番号:6)配列の3 つと交互にGGGGACTTTCC (配列番号:6)配列の2 つが配置されている。
図3は、NF-kB転写因子の活性化とNF-kBシグナル伝達経路の活性化のEFCに基づくアッセイに用いられるNF-kB EFCレポータープラスミドのプラスミドマップを示している。担体タンパク質と不安定化のモチーフ(例えば、この例のPEST)は、これらの構成要素を異なる用途に合わせるために使用されることがある。
図 4は、U2OS NF-kB EFCレポーター細胞の単細胞クローンのサイトカインTNFαに対する応答NF-kB EFCレポーター構築を安定に表すU2OS細胞の5個の単一細胞/ウェルからの2500細胞/ウェルを、384のウェルプレートにメッキした。細胞分析では、6hのTNFαの表示濃度に続いて、PathHunter(R)フラッシュ検出試薬(+5x EA)で検出され、細胞は刺激された。
TNFαは、「NF-kBシグナル伝達経路」およびNF-kB転写因子を刺激することが知られている。6時間のTNFαの異なる希釈を用いてNF-kB EFCレポーター構成で安定的にトランスフェクトされたU2OS細胞の刺激は、+EA (図4)を追加した後のEFCによって証明されるように、NF-kB EFCレポーターの線量依存刺激を明らかにした。異なったクローンに対するTNFαの効力は0.03-0.12 nMであることを示した。これらのデータは、U2OS NF-kB EFCレポーター細胞が、サイトカインTNFαに敏感に応答することができ、これは、以下の可能性を示す。NF-kBシグナル伝達経路およびNF-kB転写因子の活性化または阻害のためのアッセイの開発抑制のためのアッセイは、TNFαまたは他の活性化リガンドの刺激量が存在する前に試験化合物を含むRLUの減少を探すことによって開発されることができる(図5を参照)。
図 5は、U2OS NFkB EFCレポーターセルベースアッセイを用いたインヒビターのスクリーニングである。U2NFOS kNFB EFCレポーター細胞を、種々の濃度(および3ロット)の抗TNFαインヒビターアダリムマブを伴うまたは伴わない2nM TNFα (アゴニスト)で処理した。この実施例では、試験した3ロットのHumiraはすべてロット#1047318から得られたもので、試料がストレスを受けていない(例えば、コントロール)、70℃を15分間、70℃を30分間ストレスを受けた場合、特定の活動の減少または活動の喪失をシミュレートするために強制劣化手順を通して実行された。
U2OS NF-kB EFCレポーター細胞を用いて、NF-kBシグナル伝達のインヒビターを測定し、研究することもできる。U2OS NF-kB EFCレポーターアッセイを用いて、アダリムマブ(Humira(R))がTNFα-刺激NF-kB信号を抑制できることを実証した(図5)。この抑制反応の用量依存性により、異なるロットのアダリムマブの効力を測定することができた。図5のHumira(R)は、加熱による様々な量の強制劣化を受けたHumira(R)試料の抑制力の変化を示している。強制劣化は、たとえばQC/ロット放出アッセイのため、あるいは様々な原因による力の喪失のためなど、異なる力を持つロットをシミュレーションするために、生物学(たんぱく質治療薬)のためのアッセイの開発において用いられる方法であることに注意されたい。U2OS NF-kB EFCレポーターアッセイは、70°Cで0、15または30分の強制劣化を受けたHumira(R)試料の段階的喪失(右へのシフト)を検出した。また、この分析を用いて、Humira(R)の経時的な安定性を検討することも可能である。4℃で貯蔵されている2ロットのHumira(R)(どちらも市販品で調達されており、したがって、その効力は放出時に本質的に同一であった)、有効期限切れのないもの(#1047318)、および有効期限を過ぎた14ヶ月間のもの(#1017235)が、TNF-kB経路阻害能力を有することがU2OS NF-kB EFCレポーターアッセイにおいて示された(図6)。
図 6は、NFkB EFCレポーターアッセイが、試験した2つのHumira(R)ロットが、14か月前に期限切れになったロット#1017235(Humira(R)ロット#1047318は期限切れではなかった)にもかかわらず、同一のTNFα阻害活性と効能を有していたことを明らかにした。有効期限の切れたロット#1017235の安定性はまた、図5に示す強制劣化実験におけるロット#1047318の安定性と同等であった。
図 7は、NFkB EFCレポーターアッセイ細胞における内因性CD40レセプターが、3時間または6時間のインキュベーション後にCD40リガンド(CD40L)に強固に応答した。これらの同じ細胞は内生的にTNFレセプターを発現し、水溶性のTNFαに反応する(図4-6参照)。
多くの場合、異なる細胞受容体を介して作用する複数のリガンドが同じシグナル伝達経路を刺激することにより、同じEFCレポーターアッセイを用いてこれらの複数のリガンドの機能および機能抑制を検討することができる。例えば、図4-6において、TNFα-刺激NFkBシグナルおよび遺伝子発現の刺激および抑制を研究した。同じアッセイを用いて、図7における研究は、CD40レセプターを介して作用するCD40Lもまた、この同じ転写因子および遺伝子発現経路を刺激することを示す。
（実施例3）共培養アッセイにおけるNFAT EFCレポーター細胞刺激
活動と抑制が現在の研究の対象事である多くのリガンドは、TNFα、CD40Lのような溶性細胞外リガンドまたはPMAやイオノマイシンのような溶性細胞内リガンドである。しかしながら、これらの同じ細胞ベースのEFCレポーターアッセイは、一方のセル表面上の分析細胞に提示される細胞関連配位子を検討するのにも使用することができる(例えば、細胞-細胞または細胞間相互作用)。この細胞を提示するこの他の配位子は、アッセイ細胞に関して、異種の細胞または自身の細胞であることができる。図8は、CHO-K1細胞の表面に提示されたOKT3配位子が、Jurkat NFAT EFCレポーターセルプール内のNFATを介した遺伝子発現を活性化することができることを示している。
図 8は、Jurkat NFAT EFCレポーター細胞がOKT3配位子に反応し、共同培養アッセイでCHO-K1細胞の表面に表明され、提示された。OKT3は、殺人抗ヒトT細胞受容体CD3サブユニットの単一チェーンの断片に融合されたCD5リーダーペプチドから成り、リーダーレスヒトCD14に融合した、アクセション数HM208750.1である。CHO OKT3細胞の添加は、約700細胞のOKT3細胞を刺激するEC50で、NFAT EFCレポーターのキャリア蛋白質発現を段階的に刺激した。
（実施例4）IL2-Promoter-EFC Reporter Construct
図 9は、IL2-Promoter-EFC Reporter Plasmidのプラズミドマップである。このレポーター構築物では、複数の特定転写因子結合サイトを含む完全な内生IL2遺伝子プロモーター("IL2prom")は、担体タンパク質と融合した担体タンパク質-ePLの上流で融合され、ドライブ発現される。IL2促進剤内に含まれるのは、NFAT (1)、NFkB (2)、OCT (3)、ARRE-2(4)およびNFAT/AP1(6)転写因子およびIL2最小限促進剤(7)の結合部位である。使用されているDNA配列のIL2促進剤は、gtacCTTTTCTGAGTTACTTTTGTATCCCCACCCCCTTAAAGAAAGGAGGAAAAACTGT TTCATACAGAAGGCGTTAATTGCATGAATTAGAGCTATCACCTAAGTGTGGGCTAAT GTAACAAAGAGGGATTTCACCTACATCCATTCAGTCAGTCTTTGGGGGTTTAAAGAA ATTCCAAAGAGTCATCAGAAGAGGAAAAATGAAGGTAATGTTTTTTCAGACAGGTAA AGTCTTTGAAAATATGTGTAATATGTAAAACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCC AGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAAT
CACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCAgctag (配列番号:11)であり、Weaver et al. (Molecular Immunology, 06 Mar 2007, 44(11): 2813-2819)に記載されているように、8つの異なった転写因子結合サイトとIL-2コアプロモーターで構成されている。以下の8つのDNA要素ACCCCCTTAAAGAAAGGAGGAA(SE ID NO:12)、GGAGAGATACATTGAGCGT(配列番号:13)、AATTGCATGAA(配列番号:14)、GGGATTTCACC(配列番号:15)、ATGAAGGTAATGTTTTTTCAG(配列番号:16)、GTCTTTGAAAATATGTGTAAT(配列番号:17)、AAACATTTTG(配列番号:18)、そしてTAATATTTTT(配列番号:19)は、転写因子NFAT & AP1、NFAT、OCT、NFkB、NFAT & AP1、NFAT & AP1、OCT、NFAT、NFAT、IL-2コアプロモーターにそれぞれ応答するが、TATAGATATACATTAGATTAATCATAGATTCTGATTCTATC (配列番号:20)とTATA ボックスは下線が引かれている。
図 10は、Jurkat IL2-プロモーターEFCレポーター細胞株が、異なるシグナル伝達経路の活性化を介して、複数の異なる応答エレメントの刺激を検出することができる。5K Jurkat IL2プロモーターセルは、384のウェルプレートのウェルにメッキされ、フラッシュ検出試薬(+5x EA)をセル分解(およびEFC発光を読む)を加える前に、37°CでOKT3セル(正方形)またはOKT3セル+ CD28(円形)のどちらかで16時間刺激された。EC50は、1ウェルあたりのOKT3-presenting CHO-K1セル数である。
OKT3-ベアリングCHO-K1細胞は、主にNFAT反応元素(図10、正方形)の活性化を通して生じると信じられているJurkat細胞IL2-promoter reporter expressionを刺激する。NFkB反応元素を主として作用すると信じられているCD28抗体は、OKT3細胞だけで、信号が約2倍、EC50が約2倍に減少することから明らかなように、IL2促進剤(図10、円)のOKT3刺激を増強する。OKT3+抗CD28の応答をOKT3単独の応答と比較すると、複数の応答要素およびシグナル伝達経路を刺激することによってIL2促進剤EFCレポーターの添加剤(または相乗的)誘導が実証される。したがって、このより複雑な生理学的促進剤を用いて、インビボでのIL2発現および分泌の調節について見られるものとより類似した、天然のIL2促進剤のより複雑で統合的な調節を検討することができる。
図 11は、2つの異なるシグナル伝達経路、ホルボールエステルおよびイオノマイシンの細胞内模倣物に対する、IL2-プロモーターEFCレポーター構築物、複数の異なる応答要素を有する複合体、天然プロモーターの応答である。5K細胞は、細胞分解(および読光)でフラッシュ検出試薬(+5x EA)を加える前に、384のウェルプレートのウェルにめっきし、16時間刺激した。S/Bは、RLU(PMA/イオノマイシンを用いた)/RLU (PMA/イオノマイシンを用いない)をとることによって算出される。
IonomycinおよびPhorbol ester PMAはそれぞれNFATおよびAP-1応答要素の刺激を介して、IL2-promoter EFCレポーター構築における明確な要素の活性化を増加させる(図11)。図10に示された例のように、これは、生体内でのIL2式と秘密の規制のために見られるものとより類似した、天然IL2プロモーターのより複雑で統合的な規制を検討するために、複数のインプットを使用することができることを示している。
（実施例5）敵のためのアッシングのための促進剤-EFCレポーター構築
図 12は、RORγT転写因子およびRORγT EFCレポータープラスミドを発現するU2OS細胞において、逆アゴニストGSK805によりRORγT転写因子の活性が低下する。細胞を18hの間GSK805(Tocris)で処理し、その後、EA+PathHunter(R)フラッシュ検出試薬を加えてEFCを用いて担体タンパク質ePLの発現を検出した。
比EFCレポーター構築物を用いて、トランスフェクトされた転写因子に対するインバースアゴニスト(インバースアゴニストは、転写因子またはレセプターに直接結合し、その活性を基礎レベル以下に低下させるリガンドである)の活性を検討することができる。この場合、逆アゴニストGSK805は、U2OS細胞におけるRORimT EFCレポーターの刺激のためのRORimT転写因子の活性を減少させることが示された(図12)。
（実施例6）EFCベースのNFkB転写レポーターアッセイはルシフェラーゼ系よりも優れた感度を示す
図 13は、EFCにベースNFkB転写レポーターアッセイが、ルシフェラーゼ系よりもCD40L/CD40レセプターに対してより良好な感度を示す。安定にトランスフェクトされたU2OS細胞EFCレポーター(左パネル)または(蛍光)ルシフェラーゼ‐PESTの発現を促進するNFkB転写反応要素を暗号化したプラスミドを用いて、CD40Lの6時間の濃度の範囲で刺激し、その後に細胞分解、余剰EAの添加、1hのインキュベーション、および発光(RLU)の判定を行った。検出されたルミネッセンスは、CD40Lによる各担体タンパク質の誘導の程度を示している。
EFCにベースNFkB転写レポーターアッセイは、ルシフェラーゼにベースアッセイよりもCD40Lに対する感受性が35倍以上高かった。レポータープラスミドは安定した細胞株を作るのに用いたが、元素は同一であり、唯一の有意な差は担体タンパク質のアイデンティティであることに注意されたい。具体的には、両方のプラスミドは同じ促進剤元素を持ち、両方とも同じタンパク質不安定要素(PEST配列)を持っていた。従って、CD40Lでは、レポーター検出EFCは明るい活性を検出するよりも有意に感度が高かった。
図 14は、EFCにベースNFkB転写レポーターアッセイが、ルシフェラーゼ系よりも良好な感度を示す。EFCレポーター(左パネル)または(蛍光)ルシフェラーゼ‐PESTの発現を促進するNFkB転写反応要素をエンコードしたプラスミドで安定的にトランスフェクトされたU2OS細胞は、18hのTNFαの濃度の範囲で刺激され、それに続いてセル分解、余剰EAの添加、1hのインキュベーション、および発光(RLU)の判定を行った。ルミネッセンス検出は、TNFαによる担体タンパク質の誘導の程度を示した。
図14は、EFCベースのNFkBトランスクリプショナルレポーターアッセイが、LuciferaseシステムよりもTNFレセプターリガンドTNFαにより良好な感度を示すことを示している。リガンドTNFαは、スクリーニングアッセイにおける候補物質に対する弱い応答の検出に有利なルシフェラーゼアッセイ(右パネル)よりも、EFCアッセイ(左パネル)において12-15よりも強力である。
EFCベースのレポーターアッセイによるリガンド刺激に対する感受性の増加が、CD40LおよびTNFαの両方について観察された。この感度の向上は有益で重要である。なぜなら、EFCレポーターアッセイを用いて、化学阻害剤の親和性成熟の初期(ヒット発見や創薬のヒット・ツー・リード最適化の初期など)に見られるような、より強力でない化合物を検討することができるからである。
（実施例7）NFkB パスウェイレポーターアッセイの細胞株
レポーター細胞系は、経路誘導性転写反応要素によって制御されたエンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫された。経路の活性化はED標識タンパク質の誘導された式をもたらす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、細胞株は、NFkB(核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞株である。
細胞は、NFkB応答エレメントを含むプロモーター領域に作動可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むU2OS細胞である。
細胞を96ウェルプレートに盛り込み、37℃と5%CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を制御アゴニスト(ここではCD40L)で刺激した。刺激後、PathHunter(R) ProLabel(R)/ProLinkTM検出キット(ユーロフィンズ・ディスカバーX社製)を用いて、推奨されるプロトコールに従って信号を検出した。
分析条件
[表４]
結果は、図15に示される。このレポーターセルラインは、制御アゴニスト刺激として225.4ng/mlのEC50を示し、アゴニストEMAXで26.3の信号:背景比を示した。
セルラインは、アッセイ窓やEC50の変化がなく、10通を通して安定していることが確認された。
（実施例8）NFAT Pathway Reporter Assay のセルライン
レポーター細胞系は、経路誘導性転写反応要素によって制御されたエンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫された。経路活性化は、EDタグをつけたタンパク質の誘発された発現をもたらす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、細胞株はNFAT (活性化されたT細胞の核因子)パスレポーター細胞株である。
細胞は、NFAT応答エレメントを含むプロモーター領域に作動可能にカップリングされたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号:30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むJurkat細胞である。
細胞を96ウェルプレートに盛り込み、37℃と5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を制御装置アゴニスト(ここでは、抗CD3)で刺激した。奨励後、PathHunter(R) ProLabel(R)/ProLinkTM検出キット(ユーロフィンズ・ディスカバーX社製)を用いて、推奨されるプロトコールに従って信号を検出した。
分析条件
[表５]
結果は、図16に示される。このレポーターセルラインは、302.5ng/mlの制御アゴニスト刺激のEC50と、7.6のアゴニストEMAXの信号:背景比を示した。
この分析のために、PBSで作られた1:3希釈系列の50 Lをメッキし、4℃で一晩でプレートをインキュベートすることにより、抗CD3(OKT3)をウェル内で予めコーティングした。アッセイのためにメッキ細胞の直前にウエルから身体を取り除いた。
セルラインは、アッセイ窓やEC50の変化がなく、10通を通して安定していることが確認された。
（実施例9）STAT3 Pathway Reporter Assay 用のセルライン
経路誘導性転写応答エレメントにより制御されるEnzyme Donor (ED)標識担体タンパク質を発現するようにレポーター細胞株を操作した。経路活性化は、EDタグをつけたタンパク質の誘発された発現をもたらす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、セルラインは、STAT3(シグナル伝達物質とトランスクリプション3の活性化剤)パスレポーターセルラインである。細胞は、STAT3応答エレメントを含むプロモーター領域に作動可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むHepG2細胞である。
細胞を96ウェルプレートに盛り込み、37℃と5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を対照アゴニスト(ここではIL-6)で刺激した。奨励後、PathHunter(R)ProLabel(R)/ProLinkTM検出キット(ユーロフィンズ・ディスカバーX社製)を用いて、推奨されるプロトコールに従って信号を検出した。
分析条件
[表６]
結果は、図17に示されている。このレポーターセルラインは、0.601ng/mlの制御アゴニスト刺激のEC50と信号:アゴニストEMAXの背景技術比21.3を示した。
セルラインは、アッセイ窓やEC50の変化がなく、10通を通して安定していることが確認された。
HepG2 STAT3アッセイのための細胞系は、IL-6信号を検出するためにHepG2細胞における内在性IL-6レセプターを使用する。
（実施例10）Jurkat NFAT Pathway Reporter Assay
レポーターセルラインは、NFAT経路誘導トランスプリプション反応要素によって制御されたエンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するために設計された。NFAT経路の活性化は、NFAT経路誘導性転写応答エレメントに結合し、EDtagged担体タンパク質の発現を誘導するNFAT転写因子の活性化をもたらす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液の付加により、細胞が溶け、不活性EDとEAのベータガラクトシダーゼの断片を補完する力が加わる。これにより、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能性β-ガラクトシダーゼ酵素が形成される。
この実施例では、細胞株はNFAT (活性化T細胞の核因子)レポーター細胞株である。NFAT経路の活性化は、NFAT経路誘導性転写応答エレメントに結合し、ED標識担体タンパク質の発現を誘導するNFAT転写因子の活性化をもたらす。細胞は、NFAT応答エレメントを含むプロモーター領域に作動可能にカップリングされたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号:30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むJurkat細胞である。
細胞を96ウェルプレートに盛り込み、37℃と5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。次に、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を対照アゴニスト(ここでは、防CD-3)で刺激した。奨励後、PathHunter(R) ProLabel(R) /ProLinkTM検知キット(ユーロフィンズ・ディスカバーX社製)を用いて、推奨されるプロトコールに従って信号を検出した。
分析条件
[ 表７]
結果は、図18に示されている。このレポーターセルラインは、制御アゴニスト刺激として3.025ng/mlのEC50を示し、信号:アゴニストEMAXのバックグラウンド比7.6を示した。
このアッセイでは、活性化されたT細胞レセプター(TCR)Abid、CD3 Abidを、10mmug/mlをメッキし、20時間板をインキュベートすることにより、ウェル内で予めコーティングする。アッセイのためにメッキ細胞の直前にウエルから身体を取り除いた。
セルラインは、アッセイ窓やEC50の変化がなく、10通を通して安定していることが確認された。
(実施例11)パスウェイ・レポーター・アッセイは、他のターゲット(リガンドやレセプターなど)のためのアッセイを生成するために、さらに修正することができる。
レポーター細胞系は、経路誘導性転写反応要素によって制御されたエンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫された。経路の活性化はED標識タンパク質の誘導された式をもたらす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、このアッセイは、第一細胞系と第二細胞系の共培養で構成される。共培養アッセイにおける第一の細胞株は、上記開発されたJurkat NFAT Pathway Reporter細胞においてPD1を発現することにより誘導されるJurkat PD1(プログラム細胞死-1)経路レポーター細胞株である。PD1が添加された細胞は、NFAT経路応答エレメントを含むプロモーター領域に作動可能にカップリングされたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号:30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むJurkat細胞である。PD1経路レポーター共培養アッセイにおける2番目の細胞株は、PD-L1(Programmed death ligand 1)とTCR (T細胞受容体)活性化剤分子を共発現するU2OS細胞株である。PD1がそのリガンドであるPDL1(Programmed death ligand 1)に結合すると、TCR (TI抗原)の活性が阻害され、それによってTCR (TI抗原)活性化剤分子によるTCR誘導性のNFAT経路の活性化が阻害される。この共同培養アッセイは、これらの阻害剤がNFAT経路のTCR誘発活性化のPD1‐媒介抑制を遮断するので、PDL1への結合の阻害因子を分析するために使用され得る。
ジャーカットPD-1レポーター細胞をPD-1アンタゴニスト抗体(Ab)とプレインキュベートし、次いでU2OS PD-L1/TCR活性化剤細胞を加えてTCRを活性化する。PD-1 AbはPD-1のPD-L1活性化を遮断し、TCR活性化のPD-1減衰量を遮断し、最終結果は高濃度のPD-1 AbによるTCR活性化の増加である。
図19は、Jurkat NFATパスレポーター分析セルラインが、他のターゲット(他のレセプターおよびリガンド)のためのアッセイを生成するために、どのようにパスレポーターアッセイを更に修正することができるかを実証するPD-1経路レポーターセルラインを作成するために使用できることを示している。
（実施例12）U2OS NF-κB経路レポーターアッセイのための細胞系
レポーター細胞系を、経路誘導性転写反応要素によって制御された担体タンパク質‐エンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグをつけたたんぱく質の発現を引き起こす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、細胞株は、NFkB (核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞株である。
細胞は、NFκB応答エレメントを含むプロモーター領域に作動可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するレポーターフラグメントおよびβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むU2OS細胞である。また、この細胞はCD40(レセプター)を内因性に発現する。
細胞を96ウェルプレートに盛り込み、37℃と5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を制御アゴニスト(ここではCD40L)で刺激した。奨励後、PathHunter(R) ProLabel(R) /ProLinkTM検知キット(ユーロフィンズ・ディスカバーX社製)を用いて、推奨されるプロトコールに従って信号を検出した。
分析条件
[表８]
結果は、図20に示されている。このレポーターセルラインは、制御アゴニスト刺激として0.0886mm/mlのEC50を示し、信号:背景技術比は102.8であった。
NFKB経路を通してシグナルを送る他の内生的レセプターおよびリガンドもまた、この分析(例えば、TNFFRを通したTNFα)で成功裏に使用されている。
（実施例13）U2OS RANK-NFκB経路レポーターアッセイ
レポーター細胞系を、経路誘導性転写反応要素によって制御された担体タンパク質‐エンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグをつけたたんぱく質の発現を引き起こす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、細胞株は、NFkB(核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞株である。
細胞は、NFκB応答エレメントを含むプロモーター領域に作動可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するレポーターフラグメントおよびβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むU2OS細胞である。ランクNFkBレポーターアッセイランク (Receptor activator of nuclear factor κ B receptor)を産生するために、上記開発したU2OS NFκB Pathway Reporter細胞に共発現させる。
細胞を96ウェルプレートに盛り込み、37℃と5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を制御アゴニスト(ここではsRANKL)で刺激した。奨励後、PathHunter(R) ProLabel(R) /ProLinkTM検知キット(ユーロフィンズ・ディスカバーX社製)を用いて、推奨されるプロトコールに従って信号を検出した。
分析条件
[ 表９]
結果は図21に示されている。このレポーターセルラインは、制御アゴニスト刺激として4.034ng/mlのEC50を示し、信号:背景技術比は24.0であった。
（実施例14）HEK NF-κB経路レポーターアッセイ
レポーター細胞系を、経路誘導性転写反応要素によって制御された担体タンパク質‐エンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグをつけたたんぱく質の発現を引き起こす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例において、細胞系は、NF-κB (核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞系である。細胞は、NFκB応答要素から成るプロモーター領域に動作的に結合された、レポーター断片をエンコードする核酸と、アミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号:30)を含むHEK-293細胞(HEK)である。さらに、HEKで内因的に発現するTNFα (リガンド)とTNFR (レセプター)を用いて、NF‐κB経路レポーターアッセイを開発した。
分析条件
[表１０]
アッセイの結果は、図22に示されている。
（実施例15）HEK CD27-NF-κB経路レポーターアッセイ
レポーター細胞系を、経路誘導性転写反応要素によって制御された担体タンパク質‐エンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグをつけたたんぱく質の発現を引き起こす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例において、細胞系はCD27-NF-κB経路レポーター細胞系である。該細胞は、アミノ酸配列VLVLAVLDQTVLANLLARPPAHFASWRNSEERTDR (配列番号:30)を持つレポーター断片およびβ-ガラクトシダーゼドナーを符号化する核酸を含むHEK細胞であるフラグメント(ED)は、NFB レスポンス要素を含むプロモーター領域と動作的に結合される。CD27(レセプター)は、上記開発のHEK NF-κB経路レポーター細胞株において共発現される。アッセイの結果は、図23に示されている。
分析条件
[ 表１１]
（実施例16） NF-κBレポーター細胞株からのアッセイ結果とRANKNF-κBレポーター細胞株からのアッセイ結果との比較
2つのレポーターセルラインを、経路誘導性転写反応要素によって制御された担体タンパク質‐エンザイムドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように工夫した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグをつけたたんぱく質の発現を引き起こす。外生エンザイム・アクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例において、第一の細胞株はU2OS-NF-κB経路レポーター細胞株であり、第二の細胞株はU2OS RANKNF-κB細胞株である。細胞は、この実施例16で準備したように、両方の細胞ラインのU2OSである。
U2OSNF-カッパBセルラインは、レポーターフラグメントをエンコードする核酸と、β-ガラクトシダーズドナーフラグメント(ED)を含み、NFκB応答要素から成るプロモーター領域に操作可能に結合された、アミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号:30)を有する。U2OS RANKNF-κB細胞株は、アミノ酸配列VLAVRDVRNQTVLAHFAPPAHWRNSEERTDR (配列番号:30)を持つレポーターフラグメントおよびβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)を符号化する核酸を含む上述の開発されたU2OS NF-κB経路レポーター細胞株におけるRANK-CD27(レセプター)の共式に続くNFkB応答要素を含むプロモーター領域と動作的に結合した。
CD40L配位子を有するU2OS NF-線Bセルラインのアッセイ結果が図24aに示され、また、sRANK配位子を有するU2OS RANK NF-線Bセルラインのアッセイ結果が図24bに示されている。図24a及び24bに示すように、U2OS RANK NF-カップルの分析結果は、EC50が低く、シグナル:背景技術比が大きいことを示している。
アッセイは、RANKNF‐カッパB担体タンパク質がNFカッパB担体タンパク質より良好な結果を示すことを示した。従って、ある運搬性タンパク質は他の運搬性タンパク質よりも良好な結果を示すかもしれない。
従って、前述したことは、単に本開示の原理を説明するに過ぎない。当業者であれば、本願において明確に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化し、その精神と範囲に含まれる種々の配置を考案できることが十分理解されるであろう。さらに、本願で引用したすべての例および従来の言葉は、基本的に、本発明の原理および当該技術分野の促進のために本発明者らによって導き出された概念を理解する上で読者を補助することを意図しており、そのような具体的に引用した例および状態に限定しないものとして解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態を引用した本願のすべての記述は、その具体的な例と共に、その構造的および機能的均等物の両方を包含することを意図している。さらに、そのような均等物は、現在既知の均等物および将来開発される均等物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を実行するように開発された任意の元素を含むことが意図されている。本発明の範囲したがって、ここに示され説明される実施の形態に限定されることを意図していない。
関連出願の相互参照
本出願は、2019年3月28日に出願された米国仮出願第62/825,559号の優先権を主張し、その全体において参照により本明細書に引用する。
政府サポートのステートメント
なし
本発明は、通常、プロモーター領域の活動を評価する方法に向けられ、より具体的には、プロモーター領域の発現がプロモーター領域の活動を測定する検出剤の発現を導くように検出剤と結合したプロモーター領域に向けられている。開示された方法は、細胞シグナル伝達経路の活性と細胞シグナル伝達経路に対する試験化合物の影響を評価する。
配列表の参照
本出願は、ASCIIテキストファイルとして提出され、その全体において参照により組み込まれている、配列表を含む。このテキストファイルは、2020年3月22日に作成された"PBH_010_1Seq_List.txt"と記されており、サイズは49,795バイトである。
細胞シグナル伝達経路の様々な側面、および細胞シグナル伝達経路調節に対する異なる化合物または分子の効果を探索することへの対象は、疾患を理解し、治療法を見出す上で重要な原動力となっている。細胞のシグナル伝達経路のタンパク質やその機能がさらに同定されるにつれて、これらのタンパク質の活性を調節する分子を見つけることへの目的のは非常に高まっている。経路タンパク質の発現または阻害は、試験化合物または試験条件がシグナル伝達経路に及ぼす影響を理解し、医薬用途の新薬を見出すのに役立つ。
以下の簡単なサマリは、本発明の全ての特徴および態様を含むことを意図したものではなく、また、本サマリで議論されている全ての特徴および態様を本発明が含んでいなければならないことを意味するものでもない。
本発明の多くの実施形態は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。他の多くの実施形態では、開示されるプロモーター領域の活性を評価する方法は、プロモーター領域が活性化しているときに最初のβ-ガラクトシダーゼフラグメントが発現される条件下で、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は、プロモーター領域に操作可能（作動可能）に結合（カップリング）された第１のβ－ガラクトシダーゼフラグメントをコードする領域を含む。さらなる実施形態において、本方法は、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントを、発現される場合、第2のβ-ガラクトシダーゼフラグメントと接触させて、活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。別の実施形態では、プロモーター領域の活性が示されていることとしてもよく、したがって、細胞シグナル伝達経路および/または内因性または外因性の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために使用されてもよい。
多くの実施形態において、本発明は、核酸を含む細胞を培養している細胞を含むプロモーター領域の活性度を評価する方法を提供する。核酸は、プロモーター領域が活性しているときにEDが発現される条件下で、プロモーター領域に動作的に結合された、酵素ドナー(ED)をコードしている領域を含む。多くの他の実施形態において、本方法は、EDを、発現される場合、エンザイムアクセプター(EA)（酵素受容体）と接触させて、酵素活性を有するED-EA複合体（錯体）を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。より更なる実施形態では、EDフラグメントは、配列番号30に記載されたアミノ酸配列、またはそれらの変異体を含む。別の実施形態では、プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路および/または内因性または外因性の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために示されてもよく、従って、使用されてもよい。
更なる実施形態において、プロモーター領域の活性を評価する方法が開示され、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含んでおり、核酸は、担体タンパク質に融合した第1のベータガラクトシダーゼフラグメントをコードする領域を含む核酸であり、第1のベータガラクトシダーゼフラグメントが、プロモーター領域が活性化しているときに第1のベータガラクトシダーゼフラグメント-担体タンパク質融合が発現される条件下で、プロモーター領域と操作可能に結合される。特定の実施形態では、本方法は、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントを、発現されている場合、第2のβ-ガラクトシダーゼフラグメントと接触させて活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出してプロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。多くの実施形態において、プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路および/または内因性または外因性の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、示され得、従って、使用され得る。多くの他の実施形態において、担体タンパク質は、ED‐担体タンパク質溶融体の安定性に影響を及ぼすように選択されたドメインを含み、ドメインは、ドメインを欠くED‐担体タンパク質溶融体と比較して、ED‐担体タンパク質溶融体の安定性を増加させるように選択され、またはドメインは、ドメインを欠くED‐担体タンパク質溶融体と比較して、ED‐担体タンパク質溶融体を不安定化するように選択される。さらに、担体タンパク質ドメインは、プロテオソーム分解のためのED‐担体タンパク質溶融を標的とする。ドメインは、プロリン(P)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、およびスレオニン(T)(PEST)劣化シグナルまたはCL1劣化シグナルを含む。
さらなる実施形態において、プロモーター領域の活性を評価する方法が開示され、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は、担体タンパク質に融合された酵素ドナー(ED)フラグメントをコードする領域を含み、EDフラグメントは、プロモーター領域に操作可能にカップリングされ、ここで、EDは、プロモーター領域が活性化しているときに発現される条件下で、プロモーター領域に操作可能にカップリングされる。特定の実施形態では、本方法は、EDを、発現される場合、エンザイムアクセプター(EA)フラグメントと接触させて、酵素活性を有するED-EA複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。多くの他の実施形態において、担体タンパク質は、ED-担体タンパク質溶融体の安定性に影響を及ぼすように選択されたドメインを含み、ここで、ドメインは、ドメインを欠くED-担体タンパク質溶融体と比較して、ED-担体タンパク質溶融体の安定性を増加させるように選択される、または、ドメインが、ドメインを欠くED-担体タンパク質溶融体と比較して、ED-担体タンパク質溶融体を不安定化するように選択される。
多くの実施形態において、担体タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ酵素活性の酵素活性と同一ではない検出可能な酵素活性を有し得、ここで、担体タンパク質酵素活性は、開示された方法に記載されるように担体タンパク質が発現される場合、その酵素活性についての公知の検出方法を使用して検出され得る。他の多くの実施形態において、担体タンパク質は、プロモーター領域の活性を評価するための検出方法を用いて、担体タンパク質の酵素活性が検出できるように、プロモーター領域が活性化している条件下で発現される。さらなる実施形態において、担体タンパク質は、プロモーター領域が活性化している場合、EDフラグメントの発現と同時発現され、ここで、EDフラグメントは、EAフラグメントと複合体を形成して、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、プロモーター領域の活性を評価するために、担体タンパク質およびβ-ガラクトシダーゼ酵素複合体の両方の酵素活性のレベルを検出する。別の実施形態では、プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路および/または内因性または外因性の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、示され得、従って、使用され得る。
様々な実施形態において、担体タンパク質は、天然タンパク質、突然変異タンパク質、合成タンパク質であり得、ここで、担体タンパク質の酵素活性は、そのような担体タンパク質についての公知の検出方法によって検出される。さらなる実施形態では、担体タンパク質は、この突然変異により担体タンパク質の活性が不活発になるように変異される。更に更なる実施形態では、変性担体タンパク質は、目的のプロモーター領域が活性化しているときに検出可能な酵素活性を示すことなく、目的のプロモーター領域と操作可能に結合された、βガラクトシダーゼ酵素フラグメントと融合した担体タンパク質としてのみ作用することができる。
一実施形態では、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は、ED‐担体タンパク質融合がプロモーター領域に操作可能にカップリングされている、EDに融合された担体タンパク質をコードする領域を含み、プロモーター領域が活性化している場合、EDフラグメントが担体タンパク質の発現と共に発現される条件下で、ED‐担体タンパク質融合がプロモーター領域に操作可能にカップリングされる。別の実施形態では、方法は、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成するためにEDフラグメントをEAフラグメントと接触させること、およびプロモーター領域の活性を評価するために酵素活性のレベルを検出することをさらに含む。なおさらなる実施形態において、本方法は、担体タンパク質の非β-ガラクトシダーゼ酵素活性およびED-EA酵素複合体のβ-ガラクトシダーゼ酵素活性を検出し、その結果が、担体タンパク質酵素活性およびED-EAフラグメント複合体酵素活性の両方の担体タンパク質からのアッセイ結果を与える2点検出法であるようにする。
多くの実施形態において、本発明はプロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、方法は核酸を含む細胞を培養する方法を含み、核酸がEDフラグメントに融合した変異担体タンパク質をコードする領域を含み、ED-変異担体タンパク質溶融物がプロモーター領域に操作可能に結合しており、変異担体タンパク質が検出可能な酵素活性を欠いている。細胞は、プロモーター領域が活動しているときにEDフラグメントが発現される条件下で培養される。特定の実施形態では、本方法は、EDを、発現された場合、EAと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。
多くの実施形態において、本発明は、核酸を含む細胞を培養することを含むプロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、核酸は、ED‐担体タンパク質溶融がプロモーター領域に操作可能にカップリングされている、EDフラグメントに溶融されたいかなる固有の酵素活性も有さない担体タンパク質をコードする領域を含み、担体タンパク質は、検出可能な酵素活性を欠いている。細胞は、プロモーター領域が活性化しているときにEDフラグメントが発現される条件下で培養される。特定の実施形態では、本方法は、EDを、発現された場合、EAと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。
多くの実施形態において、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。さらなる実施形態において、プロモーター領域の活性を評価する方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は、プロモーター領域に操作可能に結合された第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントをコードする領域を含み、テスト剤（作用物質）を培養物に導入し、ここで、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントは、プロモーター領域が活性化している場合に発現される。さらなる実施形態において、本方法は、第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントを、発現される場合、第2のβガラクトシダーゼフラグメントと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出して、プロモーター領域の活性を評価することをさらに含む。別の実施形態では、プロモーター領域の活動は、細胞シグナル伝達経路および/または内因性または外因性の(例えば、導入された)転写因子の活動を評価するために、示され得る、したがって、使用され得る。
多くの実施形態において、この方法は、さらに、複数のテスト剤と細胞に接触し、テスト剤に応答するプロモーター領域の活性を評価することにより、テスト剤の効果を検出することを含む。他の多くの実施形態において、この方法は、さらに、他の多くの実施形態では、本方法は、細胞を第１の薬剤および第２の薬剤と接触させ、細胞は、目的のプロモーター領域の活性に影響を与える第１の薬剤と最初に接触され、ED-EA複合酵素活性を検出することによって評価され、細胞を第2の薬剤と接触させ、ここで、第２の薬剤は第１の薬剤の活性に影響を及ぼし、ED-EA複合酵素活性を検出することによって評価され、細胞が第１の薬剤のみと接触したときのプロモーター領域の活性と比較することをさらに含む。様々な実施形態において、第１の薬剤はアゴニストであり、第2の薬剤はアンタゴニストであり得る。
様々な実施形態において、細胞は、複数の薬剤と接触させることができる。開示された複数の薬剤は、第１の薬剤が導入され、第2の薬剤が同時に細胞培養に導入された複数の薬剤のような組み合わせで、目的のプロモーター活性に対する異なるテスト剤の効果を決定するように、順番に細胞に導入され得る。薬剤は、テスト剤、小分子、アゴニスト、アンタゴニスト、生物学的製剤、承認された薬剤、治験薬、ペプチド、タンパク質、抗体、細胞、異種タンパク質を発現する細胞、内因性タンパク質を発現する細胞、細胞によって分泌される産物、毒素、天然産物、プロモーター、阻害剤または逆アゴニストであり得る。
特定の実施形態では、プロモーター領域は、目的の転写因子のための少なくとも1つの転写因子応答エレメント(TFRE)を含み、ここで、プロモーター領域の活性は、転写因子の活性を示している。特定のより多くの実施形態において、転写因子の活性化レベルの評価は、プロモーター領域が活性化しているときに発現される最初のβ-ガラクトシダーゼフラグメントの酵素活性の検出されたレベルに基づいている。
特定の実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREを含む。いくつかの他の実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREが同じ転写因子のTFREである第1のTFREと第2のTRFEを含む。更なる実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREを含み、第1のTFREと第2のTFREは異なった転写因子のTFREである。
様々な実施形態において、プロモーター領域は少なくとも1つのTFREを含む。さらに、多くの実施形態によれば、プロモーター領域は2つ以上のTFREを含む。プロモーター領域内に含まれるTFREは、TFREが同じ転写因子のためのものであるように同じTFREであり得るか、またはプロモーター領域内の異なるTFREが異なる転写因子のためのものであるように異なるTFREであり得る。
特定の実施形態では、プロモーター領域は、目的の遺伝子のための内因性のプロモーター領域を含む。特定のより多くの実施形態において、プロモーター領域を活性化する経路の活性化レベルの評価は、プロモーター領域が活性化しているときに発現される第1のβガラクトシダーゼフラグメントの酵素活性の検出レベルに基づいている。
さらなる実施形態において、開示される方法は、細胞に転写因子をコードする発現ベクターを導入し、転写因子が発現される条件下で細胞を培養することを含み、プロモーター領域が第1のベータガラクトシダーゼフラグメントと結合される。特定のより多くの実施形態において、発現ベクターコード化転写因子の活性化レベルの評価は、プロモーター領域が活性化しているときに発現される第1のβガラクトシダーゼフラグメントの検出された酵素活性化レベルに基づいている。
他の実施形態では、プロモーター領域の活性は、検出された酵素活性化レベルに基づいて細胞シグナリング経路の活動レベルを評価する、目的の細胞シグナリング経路の活動を示す。他の多くの実施形態において、目的の転写因子の活動は、検出された酵素活性のレベルに基づいて細胞シグナル伝達経路の活性化レベルを評価する、目的の細胞シグナル伝達経路の活性化を示すことである。
多くの実施形態において、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、これは、細胞を薬剤(例えば、テスト剤)と接触させることと、検出されたレベルの担体タンパク質酵素活性に基づいて、細胞を薬剤と接触させることに応答して、プロモーター領域の活性化レベルを評価することと、を含む。より具体的な実施形態では、本発明は、プロモーター領域の活性化レベルを評価する方法を提供し、細胞を薬剤(例えば、テスト剤)と接触させることと、ED-EA複合体の酵素活性の検出レベルに基づいて、細胞を薬剤と接触させることに応答して、プロモーター領域の活性化レベルを評価することと、テスト剤の存在下で検出された酵素活性のレベルを、テスト剤の非存在下でのED-EA複合体の酵素活性のレベルと比較することと、を含む。
さらなる実施形態では、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、プロモーター領域が活性化しているときに第1のβガラクトシダーゼフラグメントが発現される条件下で、核酸はプロモーター領域に操作可能に結合される第1のβ-ガラクトシダーゼフラグメントをコードする領域を含み、細胞を薬剤(例、テスト剤)と接触させ、発現されている場合、第1のβガラクトシダーゼフラグメントに接触させ、第2のβガラクトシダーゼフラグメントを用いて、酵素活性を有する活性なエンザイム複合体を形成し、酵素活性を検出して細胞と薬剤との接触に反応してプロモーター領域の活動を評価し、テスト剤がないときまたはコントロール条件のときの酵素活性のレベルと、テスト剤の存在で検出された酵素活性のレベルとを比較する。
さらなる実施形態において、本発明は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、この核酸は、プロモーター領域が活性化している場合に、EDフラグメントが発現される条件下で、プロモーター領域に操作可能に結合された酵素ドナー(ED)フラグメントをコードする領域を含み、細胞を薬剤(例えば、テスト剤)と接触させ、発現した場合に、EDをEAフラグメントと接触させて、酵素活性を有する活性酵素複合体を形成し、ED-EA複合体の酵素活性化レベルを検出して、細胞を作用物質と接触させることに応答して、プロモーター領域の活性を評価し、薬剤の存在下で検出される酵素活性化レベルを、薬剤の非存在下での酵素活性化レベルと比較することを含む。
したがって、多くの実施形態において、本方法は、ED-担体タンパク質溶融がプロモーター領域が、活性化している場合に発現されるように、EDに溶融した担体タンパク質をコードする核酸を開示した。1つの実施形態において、担体タンパク質は、ED-EA複合体の酵素活性と同じではない酵素活性を示す。別の実施形態では、担体タンパク質は、野生型担体タンパク質と比較して、検出可能な酵素活性を示さない、変異した担体タンパク質である。さらに別の実施形態では、任意の固有の酵素活性を欠く担体タンパク質は、EDフラグメントに融合され、その結果、ED-担体タンパク質融合は、プロモーター領域が活性化している場合に発現される。
より具体的には、薬剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞表面タンパク質、テスト剤、細胞、細胞由来の産生物(例えば、細胞によって分泌された産生物)、アゴニスト、逆アゴニスト、部分的なアゴニスト、またはアンタゴニストである。多くのより多くの実施例において、細胞表面タンパク質は、核酸を構成しない細胞上に存在し、その領域は、βガラクトシダーゼのEDフラグメントをコードしている。他の実施形態では、細胞表面タンパクは、β-ガラクトシダーゼ酵素のEDフラグメントをコードする領域を含む核酸を構成する細胞上に存在する。
多くの態様において、本方法は、ED-EA複合体のための基質を提供することを含む、酵素活性のレベルを検出することをさらに含み、検出可能なシグナルは、ED-EA複合体による基質の加水分解の際に生成される。他の多くの実施形態において、検出可能なシグナルは、化学発光シグナルまたは生化学発光シグナルである。さらなる実施形態において、EDおよびEAは、EDフラグメントが配列番号30に示される配列またはEAと複合してグリコシダーゼヒドロラーゼ活性を有するED-EA複合体を形成するその変形例を含むβ-ガラクトシダーゼフラグメントである。
さらなる実施態様において、細胞は、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、ヒト細胞、免疫細胞、T細胞、JURKAT細胞、癌細胞、癌細胞、HepG2細胞、肉腫細胞または他の既知の細胞型である。
種々の態様において、核酸は、プラスミド、細胞の染色体、核染色体、ミトコンドリア染色体である。他の実施形態では、核酸はさらに、EDに融合した担体タンパク質（キャリアプロテイン／運搬性タンパク質）をコードし、その結果、プロモーター領域が活性化されたときにED-担体タンパク質の融合が発現される。
より多くの実施例において、検出可能な酵素活性を有する担体タンパク質は、ルシフェラーゼ、改良ルシフェラーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、蛍光性タンパク質または検出可能な活動を有する他の担体タンパク質であり得る。
本発明は、多くの実施例において、様々な経路およびプロモーター領域のアゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーターおよびインヒビターを研究するためのアッセイを提供する。
更なる実施例において、本発明はまた、例えば、本開示の方法を実践する際に使用を見出すことができる細胞、組成物、キットを開示する。
他の特徴は、添付の図と、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
実施例は、例示の方法で図示されており、また、参考文献が類似の要素を示しているように、表および付随する図中に限定されていない。
活性化されたT細胞(NFAT)酵素フラグメント補完(EFC)レポーター構造の核因子のプラスミドマップである。 フォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)およびイオノマイシンの細胞刺激カクテルに反応して、U2OS NOS FAT EFCレポーター細胞内に構築される発現NFAT EFCレポーターである。 NF-kB EFCレポーター構築物のプラスミドマップである。 サイトキンTNFαに対するU2OS NF-kB EFCレポーター細胞の単細胞クローンの応答である。 U2OS NFkB EFCレポーター細胞ベースアッセイを用いたインヒビターのスクリーニングである。 NFkB EFCレポーターアッセイを用いた2つのHumira（登録商標）ロットのTNFα阻害活性および効能の試験である。 NFkB EFCレポーターアッセイ細胞における内因性CD40レセプターは、CD40リガンド(CD40L)にロバストに応答する。 Jurkat NFAT EFCレポーター細胞はOKT3リガンドに反応し、共同培養アッセイでCHO-K1細胞の表面で発現し、存在した。 IL2-プロモーター-EFCレポーター構築物についてのプラスミドマップである。 Jurkat IL2-プロモーターEFCレポーター細胞株は、異なるシグナル伝達経路の活性化を通して、複数の明確な応答エレメントの刺激を検出する。 複数の異なる応答エレメントを持つ複雑な天然プロモーターを含むIL2-プロモーターEFCレポーター構築物の、2つの異なるシグナル伝達経路の細胞内模倣への応答である。 RORγT転写因子およびRORγT EFCレポータープラスミドを発現するU2OS細胞において、逆アゴニストGSK805によってRORγT転写因子の活性が低下する。 EFCベースのNFκ転写レポーターアッセイは、ルシフェラーゼシステムよりもCD40L/CD40レセプターにより良好な感度を示す。 EFCベースのNFκ転写レポーターアッセイは、ルシフェラーゼシステムよりもTNFαへのより良い感度を示す。 本開示の一実施の形態によるNFκ経路レポーター細胞株のアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本開示の一実施の形態によるNFAT経路レポーター細胞株のアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本発明の実施の形態によるSTAT3経路レポーター細胞株のアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本開示の一実施の形態によるNFAT経路レポーター細胞株のアッセイ結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 経路レポーターアッセイが、本開示の一実施形態による他のターゲットのためのアッセイを生成するために、経路レポーターアッセイが更に改良され得ることを示すPD1経路レポーターアッセイの結果である。RLU = 相対ライトユニットである。 本開示の実施の一形態による、担体タンパク質結合プロモーターを用いたNFκB経路レポーターアッセイについてのアッセイ結果である。 本開示の一実施の形態による、U2OS RANK NFκB経路レポーターアッセイの結果である。 本開示の一実施の形態による、HEK NFκB経路レポーターアッセイの結果である。 本開示の一実施の形態による、HEK CD27-NFκB経路レポーターアッセイの結果である。 図24aおよび24bは、本開示の一実施形態による、U2OS NF-κBレポーター細胞株およびU2OS RANKNF-κBレポーター細胞株のアッセイ結果である。
本実施形態の他の特徴は、付随する図面および以下の詳細な記述から明らかである。
プロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。この方法は、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は目的のプロモーター領域に操作可能に結合された第1のβ-ガラクトシダーゼ酵素フラグメントをコードする領域を含み、プロモーター領域が活性であるときに最初のβ-ガラクトシダーゼ酵素フラグメントが発現される条件下で、プロモーター領域は細胞培養条件に応答して活性化し得る。この方法はさらに、発現されている場合、第１のβ－ガラクトシダーゼ酵素フラグメントを第２のβ－ガラクトシダーゼ酵素フラグメントと接触させて、活性酵素複合体を形成し、酵素活性のレベルを検出することを含み、プロモーター領域の活性の評価を提供する。プロモーター領域の活性は、対象細胞シグナル伝達経路および/または内因性または外因性の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために示され、従って、使用され得る。
さらに、この方法には、核酸を含む細胞を培養すること、すなわち、プロモーター領域が活性化しているときにEDが発現される条件の下で、目的のプロモーター領域に操作可能に結合された、酵素ドナー(ED)をコードする領域を含む核酸を含む。本方法は、さらに、EDを、発現される場合、エンザイムアクセプター(EA)と接触させて、酵素活性を有するED-EA複合体を形成することを含む。この方法には、さらに、プロモーター領域の活性を評価するための酵素活性のレベルを検出することが含まれる。プロモーター領域の活性は、細胞シグナル伝達経路および/または内因性または外因性の(例えば、導入された)転写因子の活性を評価するために、示され、従って、使用され得る。また、細胞と薬剤(例えば、テスト剤)とのコンタクトを含む方法、および検出された酵素活性化レベルに基づいて細胞と薬剤との接触に対するプロモーター領域の活性化レベルを評価する方法も提供される。例えば、本開示の方法を実践する際に使用することを発見した細胞、組成物、およびキットもまた提供される。
本発明はまた、細胞中のプロモーター領域の活性を評価する方法を提供し、ここで、細胞は核酸を含み、核酸は、酵素ドナー(ED)フラグメントに融合された担体タンパク質を含み、ここで、担体タンパク質-ED融合は、目的のプロモーター領域に操作可能にカップリングされる。さらに、方法は、プロモーター領域が活性化しているときにEDが発現される条件下で細胞を培養することと、発現している場合には、酵素活性を持つED-EA複合体を形成するために、酵素アクセプター（EA）とEDと接触させることと、目的のプロモーター領域の活性化を評価するための酵素活性のレベルを検出することと、を含み、プロモーター領域の活性化が目的の転写因子および/または目的の細胞シグナル経路の活性化を示す。
本開示の方法、細胞、組成物およびキットがより詳細に記載される前に、方法、細胞、組成物およびキットは、記載される特定の実施形態に限定されず、当然ながら変化することが理解されるべきである。ここで用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、また、限定することを意図したものではないことが理解されるべきである。なぜなら、方法、細胞、組成物およびキットの範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
値の範囲が提供された場合、文脈が明確にそうでない限り、その範囲の上限と下限と、その範囲内で述べられたまたは介入する値との間の、下限の単位の10分の1までの各介入値が、方法、細胞、組成物およびキットの中に含まれることが理解される。これらの小さな範囲の上限と下限は、より小さな範囲に独立して含まれることができ、また、記載された範囲内で特に除外された制限に供される方法、細胞、組成物およびキットの中にも含まれる。記載された範囲に限界の一つまたは両方が含まれる場合、限界のいずれかまたは両方を除いた範囲も、方法、細胞、組成物およびキットに含まれる。
本明細書では、特定の範囲が示され、数値の前に「約」という用語が付いている。「約」という語は、本明細書では、その語の前にある正確な数字と、「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数に近いかまたはほぼその数に対する文字通りのサポートを提供するために使用される。数が具体的に記載された数に近いかまたはほぼ等しいかどうかを決定する際に、記載されていない数に近いかまたは近似する数は、それが提示される文脈において、具体的に記載された数と実質的に同等のものを提供する数であり得る。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、その方法、細胞、組成物およびキットが属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持つ。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法、細胞、組成物およびキットもまた、方法、細胞、組成物およびキットの実施または試験に使用することができるが、代表的な例示的な方法、細胞、組成物およびキットを次に記載する。
本明細書で引用されているすべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されることに関連する材料および／または方法を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。出版物の引用は、出願日の前に開示するためのものであり、現在の方法、セル、組成物、およびキットがそのような出版物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではなく、提供された発行日は実際の発行日と異なる場合があり、個別に確認する必要がある場合がある。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１の（a）」、「１の（an）」、および「前記（the）」は、文脈が明白に別段の指示をしない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するために作成され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の記載または「消極的」限定の使用に関連して、「単独」、「のみ」などの排他的用語を使用するための先行詞として役立つことを意図している。
明確にするために、別個の実施形態の文脈において記載されている方法、細胞、組成物およびキットの特定の特徴も、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、単独の実施形態の文脈で説明される、簡潔にするために、方法、細胞、組成物およびキットの様々な特徴も、別に、または適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。本実施形態の全ての組み合わせは、本開示により特に包含され、また、そのような組み合わせが操作可能な工程および/または組成物を包含する範囲で、各々および全ての組み合わせが個別に、また明示的に開示されたように、ここに開示される。加えて、このような変異を記述する実施形態に記載されている全てのサブコンビネーションもまた、本方法、細胞、組成物およびキットによって具体的に包含されており、この中で、このようなサブコンビネーションの各々が、ここに個別に、かつ明示的に、ここに開示されている。
この開示を読んでいる当業者に明らかなように、ここに説明および示された個々の実施例は、本方法の範囲または精神から逸脱することなく、容易に他のいくつかの実施例の特徴から分離または組み合わせることができる、別個のコンポーネントおよび特徴を有している。上記のいかなる方法も、列挙されるイベントの順序または論理的に可能なその他の順序で実行することができる。
方法
上記に概要を述べたように、本開示は、プロモーター領域の活性を評価する方法を提供する。この方法には、核酸を含む細胞を培養することを含み、核酸は、プロモーター領域が活性化しているときにEDが発現される条件下で、目的のプロモーター領域に操作可能に結合された酵素ドナー（ED）をコードする領域を含む。本方法は、さらに、EDを、発現される場合、エンザイムアクセプター(EA)と接触させて、酵素活性を有するED-EA複合体を形成することを含む。この方法はさらに、目的のプロモーター領域の活性を評価するために、酵素活性のレベルを検出することを含んでいる。プロモーター領域の活性化は、目的の転写因子および/または対象の細胞シグナル伝達経路の活性を示すことができる。従って、本方法は、検出された酵素活性量（レベル）に基づいて、目的の転写因子および/または対象の細胞シグナル伝達経路の活動を評価することを更に含み得る。
プロモーター領域の活性を評価する方法は、様々な状況で使用されていることを見いだす。例えば、細胞が目的のある条件下にあるとき、プロモーター領域のアクティビティレベルを決定する際に使用する方法を見つける。目的の対象となる条件は、pH、温度、細胞の遺伝的条件(例えば、1つ以上の細胞の染色体における、細胞の1つ以上の変異(例えば、ポイント突然変異、欠失、挿入、など)）、細胞が薬剤(例えば、テスト剤)と接触する条件などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、プロモーター領域の活性を評価する方法は、細胞と酵素活性の検出レベルに基づき、細胞と薬剤との接触に反応するプロモーター領域の活性(および任意に、目的のある遺伝子の転写活性および/または目的の細胞シグナル伝達経路の活性)を評価する際に、細胞と薬剤(例、テスト剤)と接触させることを含んでいる。このような方法は、例えば、薬剤がプロモーター領域の活動レベルに影響を与えるかどうか(また、任意に、目的の遺伝子の転写活動および/または目的の細胞シグナル伝達経路の活動)を決定する際に、使用を見出す。プロモーター領域の活性を評価する方法はまた、アゴニスト、アンタゴニスト、テスト剤、転写因子、細胞シグナル伝達経路の活性化剤、または細胞シグナル伝達経路のインヒビターの効果を評価するために用いることができる。
また、テスト剤が目的の細胞シグナル伝達経路の活性化レベルに影響するかどうかを評価する方法も提供される。このような方法には、テスト剤の存在の中で細胞を培養することが含まれ、細胞は、プロモーター領域が活性化している場合に、EDが発現される条件下で、EDをプロモーター領域に操作可能に結合する領域を含む核酸を含み、プロモーター領域の活性は、目的の細胞シグナル伝達経路の活性化レベルを示す。さらに、この方法は、さらに、EDを、発現する場合には、EAと接触させて、酵素活性を有するED-EA複合体を形成し、テスト剤が目的の細胞シグナル伝達経路の活動レベルに影響を与えるかどうかを評価するために、酵素活性のレベルを検出することを含む。
この方法は、本開示の酵素フラグメント補完（ＥＦＣ）ベースのレポーターアッセイ／システムが既存のレポーターシステムと比較して増加した感度を示すという予想外の発見に部分的に基づいており、1）全長ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などの全長（単一ポリペプチド）酵素の発現、および2）蛍光タンパク質に依存する。さらに、この方法は、例えば、以下の実験セクションで示されるように、本開示のEFCベースのレポーターアッセイにおいて、全長(単一ポリペプチド)ルシフェラーゼエンザイムの発現に依存するカウンターパートルシフェラーゼベースのアッセイと比較して、リガンド刺激に対する感度の向上が観察されたことをさらに実証する。このように、本開示のアッセイは、アッセイにおいてより強力に作用する薬剤(例、テスト剤)の性能に関して、既存のレポーターアッセイよりも向上を構成し、このアッセイでは、いくつかの実施形態において、アッセイがより生理学的関連性がある－すなわち、より生体内の環境に類似する、天然の環境において、薬剤(例、テスト剤)の細胞への影響をより正確に反映している。
いくつかの実施形態において、本方法の感度は、半最大有効濃度(EC50)値に従って発現され、この値は、発明開示の文脈において、ベースラインと、特定の曝露時間、細胞を薬剤に曝露した後の最大値の中間で、（酵素活性のレベルによって示されるように）細胞内で反応を誘発する薬剤(例えばテスト剤)の濃度である。いくつかの実施形態によれば、本開示の方法(例えば、目的のプロモーター領域または細胞シグナル伝達経路に対する試験薬の効果を評価する方法)は、100μg/mL以下、10μg/mL以下、1μg/mL以下、100ng/mL以下、10ng/mL以下、1ng/mL以下、100pg/mL以下、または10pg/mL以下のEC50値を示す。
いくつかの実施形態によれば、本開示の方法(例えば、目的のプロモーター領域または細胞シグナル経路に対するテスト剤の影響を評価する方法)は、EC50値を10μM以下、1μM以下、100 nM以下、10nM以下、1nM以下、100pM以下、10pM以下、1pM以下とする。
いくつかの実施例によれば、本開示の方法は、1)全長(シングルポリペプチド)酵素、例えば、全長ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT)の発現および/または2)蛍光タンパク質に依存する既存のレポーターシステムと比較して、より大きな効能を示す。上記のEC50 の値を小さくすると、より高い有効性が示される。特定の実施形態において、本開示の方法は、2:1以上、5:1以上、10:1以上、15:1以上、20:1以上、25:1以上、30:1以上、35:1以上、40:1以上、45:1以上、または50:1以上である効力を示す。
本明細書で用いられる場合、「プロモーター領域」は、転写を制御することで知られる少なくとも一つの要素(例えば、転写因子反応要素(TFRE)のようなヌクレオチド配列)を含む核酸(例えば、DNA)の領域である。例えば、プロモーター領域は、転写因子のDNA結合ドメインによって結合されることが知られている少なくとも一つのエレメントを含み得る。特定の実施形態では、少なくとも1つのエレメント（要素）が、活性化された転写因子がエレメントに結合されるかどうかに応じて、1つ以上の遺伝子の発現を調節することが知られている。このようにして、プロモーター領域とED-EAレポーターシステムの組合せにより、プロモーター領域の活動レベルの照合が可能となり、それはひいては、プロモーター領域の少なくとも1つのエレメントによって規制されることが知られている1つ以上の遺伝子の効果発現の条件の同定を容易にする。理解されるように、プロモーター領域およびED-EAレポーターシステムが、目的の転写因子および/または目的の細胞シグナル伝達経路の活性レベルの調査を可能にするように、プロモーター領域の活性レベルは、目的の転写因子および/または目的の細胞シグナル伝達経路の活性レベルを示し得（例えば、1つまたは複数の遺伝子の転写のアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションは、目的のシグナル伝達経路のダウンストリームの結果であり得、例えば、シグナル伝達経路は、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、および／または他の共有結合修飾によって翻訳後修飾することにより、転写因子の活性を調節し得る）、これにより、目的の転写因子および/または目的の細胞シグナル伝達経路の活性レベルに影響を与える条件の特定が容易になる。いくつかの実施形態によれば、そのような条件には、細胞と薬剤、例えば試験薬剤との接触が含まれる。
シグナル伝達経路が転写因子の活性を調節する別の方法は、ED発現に関連するプロモーターのサイト（site）における活性型転写因子の濃度を調節することであり、その合成、その劣化、および/またはその細胞内の位置を変えることによって、いずれもプロモーター領域を制御する転換因子の能力に影響する可能性がある。
目的の転写因子には、以下が含まれるが、これらに限定されない：内在性転写因子（すなわち、細胞の天然/非導入核酸（例えば、細胞の野生型染色体）から細胞によって発現される転写因子）；異種のトランスフェクトされた天然の転写因子（つまり、細胞によって発現されない野生型の転写因子）；異種のトランスフェクトされた組換えキメラ転写因子（つまり、2以上の異種ドメインを含む転写因子、例えば、核酸の一般的なTFRE（例えば、GAL4/UAS）に結合するための異種DNA結合ドメインに融合した目的の転写因子の活性化ドメイン（例えば、GAL4 DNA結合ドメイン）；異種トランスフェクトされた構成的に活性化している転写因子；またはそのようなタイプの転写因子の2つ以上の任意の組み合わせ。このような実施形態によれば、転写因子は、内因性または操作された細胞シグナル伝達経路によって活性化または不活性化され、またそれらの活性を反映することができる。
ある実施態様において、細胞経路またはシグナル伝達経路の1以上のタンパク質は、経路がよりよく研究されるように、特定の機構的疑問に答えるために、または陽性もしくは陰性の実験対照として働くように、遺伝的に改変されてもよい(例えば、過剰発現されてもノックダウンされてもよいし、ノックアウトされてもよい)。ある種の実施形態では、遺伝子的に変更された細胞経路またはシグナル伝達経路は、意図された実験目的のために必要とされるように、構成的に活動的または非活動的であることができる。
以上に要約したように、本開示の方法には、目的の転写因子および/または細胞シグナル化経路の活動を評価することが含まれ得、プロモーター領域の活動レベル(およびEDの対応する発現レベル)が、目的の転写因子および/または細胞シグナル化経路の活動レベルの読み取りを提供する。いくつかの実施例において、方法は、検出された酵素活性化レベルに基づいて、細胞と薬剤(例えば、制御剤、テスト剤等)と接触させることに応答する目的の転写因子および/または細胞シグナル化経路の活動レベルを評価することを含む。「テスト剤（試薬）」とは、細胞に薬剤と接触させる前の、薬剤(小分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸など)を意味し、細胞を薬剤と接触させることによって、目的の転写因子および/または目的の細胞シグナル伝達経路の活性化レベルが変化するかどうかは不明である。テスト剤とは、さらに、小分子、アゴニスト、アンタゴニスト、生物学的に承認された薬物、治験薬、ペプチド、タンパク質、抗体、細胞、異種性タンパク質を表す細胞、内因性タンパク質を発現する細胞、細胞によって分泌された産物、毒素、天然産生物、プロモーター、インヒビター、または逆アゴニスト意味するが、それらに限定されない。
本開示の方法に従って使用されるテスト剤は、（例えば、テスト剤が、細胞の表面上の分子と相互作用する（例えば、結合する）ことを介して、目的の転写因子および／または目的の細胞シグナル伝達経路の活性レベルを変化させるかどうかを調べるため）細胞不透過性であり得、または、例えば、テスト剤が、細胞の表面上の分子または細胞内の分子またはそのコンパートメント、例えば、細胞質ゾル内の分子、細胞小器官の表面上の分子、細胞小器官内の分子などと相互作用する（例えば、結合する）ことによって細胞シグナル伝達経路の活性レベルを変化させるかどうかを調べるために、細胞透過性であり得る。
本明細書で用いられるように、「細胞シグナル伝達経路」は、外部シグナルが1つまたは複数の遺伝子の発現のアップレギュレーションおよび/または1つまたは複数の遺伝子の発現のダウンレギュレーションをもたらすように、外部シグナルに反応する細胞または細胞の一連の分子(例えば、1つ以上の細胞表面分子および/または1つ以上の細胞内分子)を含む。1つ以上の遺伝子の発現のアップレギュレーションおよび/またはダウンレギュレーションは、1つ以上の遺伝子のプロモーター活性化レベルの増加および/または減少に対応する。そのように、細胞シグナル伝達経路の活性化レベルは、細胞シグナル伝達経路を介するシグナル伝達の下流標的(正または負)であるプロモーター領域(またはそのサブ領域)の活性化レベルに基づいて評価され得る。
理解されるように、特定のシグナル伝達経路は、シグナル伝達経路に存在する分子に従って指定/特徴付けされ得る。例えば、シグナル伝達経路は、外部シグナルへの結合時にシグナルを開始するレセプター(例えば、細胞表面レセプター、サイトソリックレセプター等)に応じて指定され得る。また、実施例の方法によって、特定のシグナル伝達経路を、外部シグナルのレセプターの「下流」の分子およびシグナル伝達経路における転写因子の「上流」に従って指定/特徴付けしてもよい。別の実施例として、ある特定のシグナル経路は、シグナル伝達経路における転写因子(例えば、NFκB、NFAT、STAT3など)に従って指定/特徴付けされ得る。
多くの実施形態において、活動レベルが評価され得る細胞シグナル伝達経路(例えば、試験化合物がシグナル伝達経路の活動レベルに影響するかどうかを決定するため)には、Aktシグナル伝達経路、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）シグナル伝達経路、アポトーシスシグナル伝達経路、上皮成長因子受容体（EGFR）シグナル伝達経路、エストロゲンシグナル伝達経路、線維芽細胞成長因子受容体（FGFR）シグナル伝達経路、成長因子受容体シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、JAK-STATシグナル伝達経路、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路、ラパマイシン（mTOR）シグナル伝達経路の機械的標的、NF-κBシグナル伝達経路、Notchシグナル伝達経路、活性化T細胞の核因子（NFAT）シグナル伝達経路、p53シグナル伝達経路、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）シグナル伝達経路、Toll様受容体（TLR）シグナル伝達経路、血管内皮増殖因子（VEGF）シグナル伝達経路、およびWntシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、細胞シグナル伝達経路は、NFκBシグナル伝達経路である。特定の実施例において、細胞シグナル経路は、STAT (例えば、STAT3および/またはSTAT5)シグナル経路である。いくつかの実施形態によれば、細胞シグナル伝達経路はNFATシグナル伝達経路である。
細胞が接触させる可能性のある物質(例えば、テスト剤)は、小分子、ポリペプチド(ペプチドを含む)、核酸などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬剤はアゴニスト、逆アゴニスト(すなわち、アゴニストと同じ分子(例えば、レセプター)に結合するが、アゴニストとは逆の効果を持つ剤)、部分アゴニスト(すなわち、アゴニストと同じ分子(例えば、レセプター)に結合し、アゴニストと同じ効果を持つ剤であるが、効果の大きさは小さい)、またはアンタゴニスト（すなわち、アゴニストと同じ分子（例えば、レセプター）に結合し、例えば、分子の活性に影響を与えることなく、アゴニストの分子への結合を妨げる薬剤）である。いくつかの実施形態では、「小分子」とは、1000原子質量単位(amu)以下の分子量を有する複合体をいう。いくつかの実施形態では、小分子は750 amu以下、500 amu以下、400 amu以下、300 amu以下、200 amu以下である。ある態様では、小分子は、ポリマーに存在するような繰り返しの分子単位で作られていない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、隣接する残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連の線形アミノ酸残基を示す。アミノ酸は、20個の「標準的な」遺伝的にコード化可能なアミノ酸、アミノ酸類似体、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、テスト剤がタンパク質である場合、タンパク質は溶性タンパク質であり、例えば、細胞に関連(結合しているまたは一部である)しない。他の実施形態では、テスト剤は不溶解性タンパク質であることがある。目的とする不溶解性のタンパク質の実施例は、細胞表面タンパク質を含むが、これに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、細胞を第2の細胞に曝露すること、および、細胞が細胞表面タンパク質と接触したとき、第2の細胞の表面上のタンパク質が細胞内の目的の細胞シグナル伝達経路の活性レベルに影響を与えるかどうかを評価することを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞は、第2の細胞の細胞表面タンパク質と細胞に接触させるために、第2の細胞と共培養されることができる。いくつかの実施形態によれば、第2の細胞(例えば、細胞表面リガンド)の細胞表面タンパク質は、第2の細胞から単離および精製され得、可溶性、可溶性および架橋のいずれかとして、または、固体支持体、例えば、ビーズの表面または組織培養プレートにコーティングされた場合、細胞(反応細胞)と接触させることができる。
いくつかの実施形態において、薬剤が核酸である場合、薬剤はオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、2～500のヌクレオチド、例えば2～200のヌクレオチドの一本鎖の多量体である。オリゴヌクレオチドは、合成されているか、あるいは、酵素的に作成されていてもよく、いくつかの実施例では、長さ5～50のヌクレオチドである(例えば、長さ9～50のヌクレオチド)。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー(すなわち、オリゴリボヌクレオチドまたは「RNAオリゴヌクレオチド」)またはデオキシリボヌクレオチドモノマー(すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたは「DNAオリゴヌクレオチド」)を含むこととしてもよい。オリゴヌクレオチドは5～9、10～20、21～30、31～40、41～50、51～60、61～70、71～80、80～100、100～150、150～200、500以上の長さのヌクレオチドなどである。いくつかの実施形態において、薬剤が核酸であるとき、この薬剤は、短い干渉型RNA(siRNA)、マイクロ転換型(miRNA)、モルフォリノ、および/またはそれに類するものである。特定のmRNAを標的にするためのsiRNA、miRNA、morpholinosなどを設計し、提供するためのアプローチが知られており、例えば、Monsoori et al. (2014) Adv Pharm Bull. 4(4):313-321; Xin et al. (2017) Mol Cancer 16:134; Chakraborty et al. (2017) Mol Ther Nucleic Acids 8:132-143; and Ahmadzada et al. (2018) Biophys Rev. 10(1):69-86 に記載されている。siRNAs、miRNA、モルフォリノなどは、標的となるmRNAの既知の配列に基づいて、利用可能なツール、例えば、InvivogenのsiRNA Wizard、DharmaconのsiDESIGN Center、InvitrogenのBLOCK-iT（商標）RNAiDesigner、microrna.osumc.edu/mir-synthで入手可能なmiR-Synth、WMD3-Web MicroRNA Designer、GeneToolsが提供するモルフォリノデザインツール等を使用して設計され得る。
いくつかの実施形態において、細胞を、薬剤が薬剤のライブラリ(例えば、低分子ライブラリ、ポリペプチドライブラリ、siRNAライブラリなど)の一部である薬剤（例えば、テスト剤）と接触させる。このような方法は、高スループットでこの方法を実施することをさらに含むことができ、細胞が組織培養プレート(例えば、4-、6-、8-、12-、24-、48-、96-、384-、1536-ウェル組織培養プレート)のウェルに提供され、細胞は、試験薬剤のライブラリ(例えば、小分子ライブラリ、ポリペプチドライブラリ、siRNAライブラリなど)からのテスト剤の1つまたはサブセットと接触し、本方法は、検出された酵素活性化レベルに基づいて、目的のシグナル伝達経路の活性化レベルに影響を及ぼす薬剤を同定することを含む。
いくつかの実施形態によると、プロモーター領域は、目的の転写因子についての転写因子応答エレメント(TFRE)を含み、プロモーター領域の活性は転写因子の活性を示す。いくつかの実施形態において、方法は、検出された酵素活性化レベルに基づいて転写因子の活性化レベルを評価することを含む。ある実施形態では、自然に生じている目的の転写因子が、細胞内で発現されたり、過剰に発現されたりすることがある(例えば、存在しない、または、アッセイに理想的なレベルよりも低いレベル存在していたりする場合)。特定の実施形態において、転写因子は、ジェネリック（generic）な転写因子であり、構成的に活性または不活性である変異転写因子である。特定の実施形態において、転写因子は、ノックダウンまたはノックアウトされ得る。特定の実施形態において、転写因子は、ＴＦＲＥに結合する異種核酸結合ドメインに融合された目的の転写因子の活性化ドメインを含むキメラ転写因子である。TFREは、目的の野生型転写因子のDNA結合ドメインが結合するTFREであり得る（例えば、STAT3の活性レベルの評価を含む方法で野生型STAT3が結合するTFRE）。いくつかの実施形態において、TFREは、「ジェネリック（generic）」TFREであり、つまり、TFREは、本質的に異なるTFREと結合する様々な転写因子の活動レベルを評価するためのレポーター分析システムで使用され得るものである。例えば、いくつかの実施例において、細胞は、ジェネリックTFREに結合する異種の核酸結合ドメインに融合した目的の転写因子の活性化ドメインを含むキメラ転写因子を発現する。このように、天然では同じTFREと結合しない転写因子の活動レベルを評価するために、同じ核酸をEFCレポーターのアッセイで使用することができる。採用され得るジェネリックTFREの非限定的な例は、GAL4/上流活性化配列(GAL4/UAS)であり、ここで、目的のある転写因子(例えば、NFκB、STAT3、NFAT、ELK1など)の活性化ドメインがGAL4 DNA結合ドメインに融合され、目的の転写因子に対する天然のTFREを必要とせずに、目的の転写因子の活性化の評価を可能にする。いくつかの実施形態において、本方法は、転写因子をコードする発現ベクターを細胞に導入し、転写因子が発現される条件下で細胞を培養することを含む。
特定の実施形態において、プロモーター領域は、単一の転写因子応答エレメント(TFRE)を含む。単一のTFREは、以下の実験セクションのある例で例示されるように、単一の転写因子(例えば、NF-kB応答エレメントであるクラスA)に結合し反応するTFREであり得る。このような実施例は、例えば、目的の特定のTFREを分離して、そのような実施形態は、例えば、関心のある特定のＴＦＲＥを単離して、そのＴＦＲＥの活動に単独で（すなわち、他のＴＦＲＥからの干渉なしに）影響を与える条件を決定するおよび/またはTFREが結合および応答する転写因子の活性化または不活性化に影響を与える条件を決定する用途を見出す。特定の他の実施形態において、プロモーター領域は、複数の転写因子応答エレメント(TFRE)を含む。
いくつかの実施形態によれば、プロモーター領域は少なくとも1つのTFREからなる。さらに、多くの実施形態によれば、プロモーター領域は2つ以上のTFREを含む。プロモーター領域内に含まれるTFREは、TFREが同じ転写因子に対するものであるように同じTFREであってもよいし、プロモーター領域内の異なるTFREが異なる転写因子に対するものであるように異なるTFREであってもよい。TFREは、組み合わせて、あるいは順次細胞に導入することができる。特定の実施形態において、プロモーター領域は、第1のTFREと第2のTFREを含み、第1のTFREと第2のTFREは異なり、例えば、異なる転写因子の活性化および/または失活に結合し反応するTFREである。2つ以上のTFREを含むプロモーター領域は、以下の実験セクションの特定の実施例に例示されているように、例えば、プロモーター領域が、結合する複数のTFREを有する天然に存在する野生型プロモーター領域を模倣し、さまざまな転写因子（例えば、クラスB、その例は、少なくとも6つの異なる転写因子特異的応答エレメントを有するIL-2遺伝子プロモーターである）の活性化および/または非活性化に応答することが望ましい場合に使用される。いくつかの実施例において、プロモーター領域は、様々な転写因子の活性化および/または停止に結合し反応する複数のTFREを有する天然の野生型プロモーター領域に存在するすべてのTFREのサブセットを模倣する。いくつかの実施形態において、プロモーター領域はエンハンサーであるTFREを含む。「エンハンサー」とは、遺伝子転写を増加させるために1つ以上のタンパク質によって結合することができ、かつEDをコードする領域から最大1Mb離れて位置し得るシス作用性DNA配列を意味する。クラスAまたはクラスBのいずれかの特定のプロモーター領域を使用する能力は、種々の生物学的問題に本方法を広範囲に適用することを可能にし、また、望ましい結果を生み出す条件、例えば、目的の転写因子の活性化または不活化、目的の遺伝子の発現の活性化または不活化、目的の細胞シグナル伝達経路の活性化または不活化等のスクリーニングを可能にする。
以上要約したように、この方法には、プロモーター領域がアクティブ（活性／活性化）であるときにEDが発現される条件下で細胞を培養することが含まれる。「アクティブ」とは、プロモーター領域が、バックグラウンドを超える検出可能なレベルのED発現を可能にする状態にあることを意味する。このような状態は、転写因子がプロモーター領域に結合していない場合に、バックグラウンドを超える検出可能なレベルのED発現が発生する「非結合」状態である可能性があり得る。このような状態はまた、1つまたは複数の転写因子がプロモーター領域に結合しているときに（例えば、1つまたは複数の転写因子自体の活性化時）、バックグラウンドを超える検出可能な高レベルのED発現が起こり、検出可能なレベルのED発現のために1つまたは複数の転写因子の結合が必要とされる状態、および/またはプロモーター領域が非結合状態にある場合、ED発現のレベルと比較してED発現のレベルをアップレギュレート（誘導）またはダウンレギュレートする状態であり得る。
プロモーター領域が活性化しているときにEDが発現されるような細胞を培養するための条件は、様々である。そのような条件は、適当な培地(例えば、DMEM、RPMI、MEM、IMDM、DMEM/F-12などの細胞培養培地)中で、適当な温度(例えば、32℃～42℃、例えば37℃)およびpH (例えば、pH 7.0～7.7、例えばpH 7.4)で、適当な割合のCO2のパーセンテージ、例えば、3%～10%、例えば5%)を有する環境中で、細胞を適当な容器(例えば、細胞培養プレートまたはそのウェル)中で培養することを含むことができる。使用されうる細胞培養条件の限定されない例は、以下の実験セクションに説明される。
この方法で用いられる細胞は、適当な細胞であればどれでもよい。特定の実施形態において、細胞のタイプは、目的の生物学的過程に基づいて選択される。例として、T細胞活性化に影響を与える条件を調査するために本方法を実施したいと望むならば、細胞は活性化可能なT細胞、例えばJurkat細胞であることとしてもよい。いくつかの実施例によれば、細胞は、目的の細胞シグナル伝達経路を調べるために、当業者によって使用されるタイプの細胞である。特定の実施例において、細胞は、目的のある経路、例えば、プロテインキナーゼ、アダプター、転写因子において、特定のレセプターまたは下流側のシグナル分子のような目的のある特定の細胞および分子の成分を含む細胞を調べるために、当業者によって使用される細胞のタイプである。
いくつかの実施形態によれば、細胞は一次細胞である。「一次細胞」とは、生きた組織(例えば、生検材料)から直接得られ、生体内で成長するために確立された細胞を意味する。いくつかの実施例において、細胞は細胞株由来である。このような細胞株の非限定的な実施例としては、Jurkat、U2OS、HepG2、HeLa、MCF-7、PC-12、PBMC、HUVECs、HEK293、COS-7、BHK-21、HEp-2、HT-1080、MDCKなどがある。いくつかの実施形態によれば、細胞は上皮細胞、中皮細胞、または内皮細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫細胞である。採用され得る免疫細胞の非限定的な例としては、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好塩基球、および好酸球が挙げられる。特定の実施形態において、免疫細胞はT細胞である。T細胞の例としては、ナイーブT細胞(TN)、細胞傷害性T細胞(TCTL)、メモリーT細胞(TMEM)、メモリー幹細胞(TSCM)、中枢メモリーT細胞(TCM)、エフェクタメモリーT細胞(TEM)、組織常在メモリーT細胞(TRM)、エフェクターT細胞(TEFF)、制御性T細胞(TREG)、ヘルパーT細胞(TH、TH1、TH2、TH17)、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、ウイルス特異的T細胞、αβT細胞(Tαβ)、γδT細胞(Tγδ)などがある。
いくつかの実施形態によれば、細胞は癌細胞である。「癌細胞」とは、腫瘍性細胞発現型を示す細胞を意味し、これは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存性増殖阻害の喪失、足場非依存性増殖能、免疫不全の非ヒト動物モデルにおける腫瘍増殖および/または発現を促進する能力、および/または細胞形質転換の任意の適切な指標の1つまたは複数を特徴とすることができる。「癌細胞」と本明細書中で「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「癌性細胞」と互換的に使用することができ、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍、癌細胞株、およびこれらの癌細胞を包含してもよい。ある態様において、癌細胞は癌細胞である。対象の癌細胞は、限定されるわけではないが、HepG2細胞を含む。特定の態様において、癌細胞は肉腫細胞である。肉腫細胞の非限定的な例としては、U2OS細胞などの骨肉腫細胞が挙げられる。
本方法で用いられる核酸は、プロモーター領域とEDをコードする領域とを操作可能に結合するのに適したどんな核酸でもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、非特異的または部位特異的に、細胞の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。いくつかの実施形態において、核酸はエピソーム(または「エピソーマル（episomal）」)であり、「エピソーム」または「エピソーマル」とは、細胞の染色体DNAとは独立に複製する核酸(例えば、DNA)分子を意味する。本方法で用いられるエピソードの限定されていない例はプラスミドである。核酸がエピソーム(例えば、プラスミド)である場合、エピソームはプロモーター領域とEDをコードする領域に加えて、1つ以上の元素を含んでいる。例えば、プラスミドには、複製の起源、細胞に抗生物質抵抗性を付与するタンパク質をコードする1つ以上の領域(例えば、アンピシリン抵抗性(AmpR)、ヒグロマイシン抵抗性、および/またはそれに類する)、1つ以上のポリ(A)シグナル、ポーズ部位、SV40ポリ(A)シグナル、SV40後期ポリ（Ａ）シグナル、SV40エンハンサー、SV40初期プロモーターなど、およびそのような要素の任意の所望の組み合わせ。SV40エンハンサー、SV40初期プロモーターなど、およびそのようなエレメントの望ましい組み合わせが含まれ得る。エピソームまたは染色体に組み込まれた発現のために核酸を導入するプラスミドは、核酸を安定して発現している細胞のみを選択するために使用できる抗生物質選択マーカーに隣接し、遺伝的に連結され得る。核酸を導入するプラスミドは、ウイルスベクターによって送達され得るか、またはエレクトロポレーション、または他の任意の適切なアプローチによって化学試薬でトランスフェクトされ得る。
本開示の方法を実施する際に使用が見出されるプラスミドのヌクレオチド配列（以下の実験セクションで使用されるプラスミドを含む）およびその要素／部分配列は、以下の表１に提供される。
Figure 2022528270000026
Figure 2022528270000027
Figure 2022528270000028
Figure 2022528270000029
Figure 2022528270000030
Figure 2022528270000031
Figure 2022528270000032
Figure 2022528270000033
Figure 2022528270000034
Figure 2022528270000035
Figure 2022528270000036
Figure 2022528270000037
Figure 2022528270000038
Figure 2022528270000039
Figure 2022528270000040
Figure 2022528270000041
Figure 2022528270000042
Figure 2022528270000043
Figure 2022528270000044
Figure 2022528270000045
Figure 2022528270000046
Figure 2022528270000047
ある実施態様において、核酸は細胞の染色体である。例えば、細胞の染色体を(例えば、相同組換え、CRISPR-Cas9、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などのゲノム編集技術を用いて)、EDをコードする領域が染色体に挿入されるように改変することができる。いくつかの実施形態において、EDをコードしている領域は、EDをコードしている領域が、染色体の天然のプロモーター領域と操作可能に結合するように、細胞のゲノムに挿入される。天然のプロモーター領域は、目的の1つ以上の遺伝子、および/または目的の1つ以上の細胞シグナル伝達経路の転写活性化を評価するために使用を見出すプロモーター領域であってよい。単なる一例として、細胞内のNFκBシグナル伝達経路の活性化を評価したい場合、EDをコードする領域は、NFκB結合部位を含むプロモーター領域の下流側に部位特異的に挿入され得る。ある実施形態では、EDをコードする領域は、プロモーター領域(すなわち外因性プロモーター領域)と一緒に、EDをコードする領域が外因性プロモーター領域と操作可能に結合される、染色体に挿入される。核酸がaである実施形態のいずれにおいても細胞の染色体、染色体は核染色体、またはミトコンドリア染色体であり得る。
ある実施例では、核酸はさらに、EDに融合した担体タンパク質をコードし、したがって、ED‐担体タンパク質融合は、プロモーター領域が活性化されたときに発現される。EDに選ばれた担体タンパク質は、EDに異なる希望する物理的または生物学的特性(例えば、安定性、局在性、生物学的不活性、EFCとは異なる別の方法による検出など)を与えることができる。いくつかの実施形態によれば、担体タンパク質は、ED-担体タンパク質の融合の安定性に影響するように選択されたドメインを含む。ある実施形態では、ドメインを欠くED‐担体タンパク質融合に比べて、ED‐担体タンパク質融合の安定性を高めるためにドメインが選択される。他の実施形態では、ドメインを欠くED-担体タンパク質融合に比べて、ドメインがED-担体タンパク質融合を不安定化させるように選択される。例えば、ドメインは、プロテアソーム分解のためのED-担体タンパク質の融合を標的とするドメイン(例えば、ユビキチン依存性プロテアソーム分解)である。プロテアソーム分解のためのED-担体タンパク質の融合を標的にするために使用されることができるドメインの一例として、プロリン(P)、グルタミン酸(E)、セリン(S)およびスレオニン(T) (PEST)分解シグナルがある。上記領域のもう一つの実施例は、CL1劣化シグナルである。実施例のPESTとCL1の劣化シグナルのアミノ酸配列は、下の表2に示すとおりである。
Figure 2022528270000048
特定の実施において、担体タンパク質は、組み合わせにおいて、ED-担体タンパク質の融合の安定性に影響するように選択された2つ以上のドメインを含む。例えば、担体タンパク質は、単一のそのようなシグナルを用いて達成されたターゲティング達成に対するプロテアソーム分解のためのED‐担体タンパク質融合のターゲティングを強化するために、PEST分解シグナルとCL1分解シグナルを含むことができる。
多くの実施形態において、プロモーターは、担体タンパク質の存在がシグナルを高め、その結果、全長・ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、および2)蛍光性タンパク質のような、1)全長(単一ポリペプチド)エンザイムの発現に依存する既存のレポーターシステムと比較して、より感度が高く、より強力なアッセイをもたらす担体タンパク質と更に結合される。担体タンパク質は、プロモーター領域と操作可能に結合することができる。担体タンパク質は、既知の検出方法によって担体タンパク質の発現を検出することができるように、検出可能な活性を有するものであってもよい。多くの他の実施形態において、担体タンパク質の検出可能な活性は、β-ガラクトシダーゼ酵素の酵素活性と同一ではない。
さらなる実施形態では、担体タンパク質が、プロモーター領域に操作可能に結合されている、βガラクトシダーゼのEDエンザイムフラグメントと融合することができる。多くの実施例において、担体タンパク質は、プロモーター領域が活性化されて出力シグナルまたはデータポイントが強化されるときに、EDエンザイムフラグメントと共発現することができる。本開示の方法において使用される担体タンパク質は、β-ガラクトシダーゼの酵素活性と同一ではない検出可能な酵素活性を有し得、ここで、担体タンパク質酵素活性は、プロモーター領域が前記酵素活性についての公知の検出方法を使用して活性化している場合に検出され得る。検出された酵素活性のある担体タンパク質は、ルシフェラーゼ、改変ルシフェラーゼ、蛍光性タンパク質、天然タンパク質、あるいは合成タンパク質であり得る。
さらに、担体タンパク質はまた、担体タンパク質の中での突然変異が担体タンパク質の酵素活性の抑制をもたらし、担体タンパク質は、プロモーター領域が活性化したときに検出された活性を一切発現しないような、変異担体タンパク質であってもよい。このような変異をした担体タンパク質は、プロモーター領域と操作可能に結合するED酵素フラグメントと融合することができ、EDフラグメントは、発現されている場合、EA酵素フラグメントと組み合わせて、酵素活性を有するED-EA酵素複合体を形成し、目的のプロモーター領域の活性化、それゆえ転写因子の活性化を評価し、酵素活性を測定することができる。従って、本発明は、β-ガラクトシダーゼ酵素と同一ではない酵素活性を有する担体タンパク質の使用を開示し、さらに、担体タンパク質の酵素活性を不活性にするために変異された担体タンパク質を開示する。
多くの実施形態において、担体タンパク質は、固有酵素活性を持たない。担体タンパク質は、さらに、βガラクトシダーゼフラグメントの安定性に影響するように選択されたドメイン、例えば、ドメインを欠くED‐担体タンパク質溶融と比較して、ED‐担体タンパク質溶融の安定性を高めるためにドメインが選択された、酵素ドナー(ED)フラグメント-担体タンパク質溶融を含む。さらに、担体タンパク質は、ドメインを欠くED‐担体タンパク質溶融に比べて、ED‐担体タンパク質溶融を不安定化させるために選択されたドメインをも含み得る。
以上に要約したように、本開示の方法は、更に、プロモーター領域の活性を評価するための酵素活性のレベルを検出することを含んでいる。いくつかの実施形態によれば、酵素活性のレベルを検出することは、ED-EA複合体のための基質を提供することを含み、検出可能なシグナルは、ED-EA複合体による基質の加水分解時に生成される。特定の実施形態において、検出可能なシグナルは、化学発光シグナルである。
本方法の態様は、βガラクトシダーゼ酵素フラグメント補完(EFC)レポーターシステムのような、親和性低減酵素補完レポーターシステムの使用を含む。「親和性低減」によって、酵素補完レポーターシステムは、それ自体が、親酵素に観察される検出活性(直接的または間接的に検出可能であることとしてもよい)が欠如しているが、十分に近接したとき、例えば、ランダムな相互作用または結合部材を媒介した相互作用によって、親のエンザイムの活性の検出可能な量を生み出す、酵素の2つ以上のフラグメント(すなわちレポーターサブユニット)から構成されるシステムを意味する。本発明の親和性低減酵素補完レポーターシステムの一態様は、システムの他のサブユニットとの相互作用がアッセイ条件下で可逆的であり、目的の結合部分によって媒介される相互作用がないように、システムで使用されるレポーターサブユニットの少なくとも1つは、野生型の親酵素の対応するドメインの変異体であるものである。このシステムでは、βガラクトシダーゼの小さなフラグメントとβガラクトシダーゼのより大きなフラグメントを使用し、この2つのフラグメントは互いに低い親和性を有する。βガラクトシダーゼの小さなフラグメント、酵素ドナー(「ED」)は、天然に存在する配列または変異した配列を有し得る。いくつかの実施形態によれば、EDは、βガラクトシダーゼドナーフラグメントである。いろいろな種類のβガラクトシダーゼフラグメントEDを用いることができる。ある実施態様において、EDがβガラクトシダーゼドナーである場合、EDは、以下の表3に示すアミノ酸配列、あるいはその変異体(例えば、表3に示すアミノ酸配列に対する10以下、8以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1つのコンサバティブ（保守的）なアミノ酸置換物)を含み、EAと複合体を形成して、酵素的活性を持つ酵素を形成する。一例として、以下の表3にβガラクトシダーゼドナーフラグメントEDのアミノ酸配列を示す。
酵素活性を有する活性化βガラクトシダーゼ酵素複合体を形成するβ-ガラクトシダーゼまたはED-EA複合体の活性は、化学発光アッセイを用いて検出することができる。例えば、β-gal溶融物を含有する細胞を、Galactolight Plusアッセイキット(Tropix、Bedford Mass.)からのGalacton Plus基質を含有する緩衝液の混合物中で溶解する。Galactolight Plus assay kit (Tropix, Bedford Mass.). Bronstein et al, J. Biolumin. Chemilumin., 4:99-111 (1989)。Light Emission Accelerator溶液を加えた後、ルミノメーターまたはシンチレーションカウンターで発光を測定する。多くの実施形態において、β-ガラクトシダーゼ酵素活性の検出方法はまた、細胞を溶解し、直接発色性、蛍光発生性、または化学発光性基材などの検出可能な産物を生じることができる任意のβガラクトシダーゼ基質を用いてED-EA酵素フラグメントの酵素活性を検出すること、または生物発光性の読み出された情報（readout）を有するカップリングアッセイの基質を検出することを含む。
Figure 2022528270000049
本明細書で使用される場合、「保守的置換」とは、ペプチド/タンパク質化学の当業者が、ペプチド/タンパク質またはそのドメインの二次構造および水中分解性を実質的に変化しないと期待するような、類似した特性を有する他のアミノ酸の代わりにアミノ酸が置き換えられるものである。特に特定の実施形態を意図するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において改変がなされ、依然として望ましい特性を有する変異体または誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。例えば、EAと複合体を形成し、グリコシドヒドロラーゼ活性を有する酵素を形成する能力である。例えば、当業者は、ED、EA、またはそのドメインのアミノ酸配列を変えて同等の、あるいは改良された変異体EDまたはEAを作り出すことが望まれる場合、DNA配列をコードする1つ以上のコドンを変化させることができる。
「EA」とは、酵素フラグメント補完アッセイで使用するための酵素アクセプターフラグメントを意味する。特定の実施形態では、EDはβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメントであり、EAはβ-ガラクトシダーゼアクセプターフラグメントである。例として、EDは、表3に示すアミノ酸配列を含むED(またはEAと複合してグリコシドヒドロラーゼ活性を有する酵素を形成するその変形例)であってもよく、EAは、EDと複合してグリコシドヒドロラーゼ活性を有する酵素を形成する市販のEAである。いくつかの実施形態によれば、このようなEAは、Eurofins DiscoverX, Corporationから入手可能なPathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLink（商標）検出キットに提供される。
本開示の方法には、発現されている場合、EDと接触し、酵素活性を有するED-EA複合体を形成することが含まれる。いくつかの実施形態では、EDがEAと接触したとき、細胞は無傷である。例えば、細胞が生きているとき、細胞が固定されたときなど、EDはEAと接触させることができる。EAとEDが接触したとき、細胞が無傷であるとき、EAは通常、細胞膜を横切って細胞内で発現されたEDと接触させることができる上記のような細胞透過性酵素フラグメントである。βガラクトシダをベースとしたEFCシステムを使用する場合、生細胞フローサイトメトリーと、発色基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノサイド(X-Gal)による組織化学的な汚染を含む、βガラクトシダーゼの酵素活性を測定するための様々な方法が利用可能である。例えば、Nolan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2603-2607 (1988); および Lojda, Z., Enzyme Histochemistry: A laboratory Manual, Springer, Berlin (1979)を参照されたい。生きた細胞で使用することができる、βガラクトシダーゼの必須基質もまた、現在開示されている方法および材料によって包含されている。例えば、蛍光発生基質、レゾルフィンβ-ガラクトシダーゼビス-アミノプロピルポリエチレングリコール1900(RGPEG)が記載されている。Minden (1996) BioTechniques 20(1):122-129。この化合物は、マイクロインジェクション、電気注入、または様々なバルクロード技術によって細胞に送ることができる。いったん細胞の中に入ると、基質はプラズマ膜やギャップジャンクションから逃げることができなくなる。現在開示されている方法および材料の実施において使用することができる別の重要な基質は、蛍光活性化細胞選別(FACS)およびフローサイトメトリーによる分析に特によく適したフルオレセインジ-β-D-ガラクトピラノシド(FDG)である。Nolan et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 85:2603-2607 (1988) および Rotman et al. (1963) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 50:1-6。
いくつかの実施形態において、方法は、細胞を溶解することをさらに含み、EDをEAと接触させることは、細胞溶解物をEAと組み合わせることを含む。細胞を溶解するために、任意の適切な溶解剤(例えば、溶解緩衝液)を使用してもよい。溶解緩衝液の限定のない例としては、NP-40溶解緩衝液、RIPA (RadioImmuno Precipitation Assay)溶解緩衝液、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)溶解緩衝液、ACK (アンモニウム-塩化カリウム)溶解緩衝液等がある。溶解緩衝液には、緩衝塩(例えば、トリス-HCl)および/またはイオン性塩(例えば、NaCl)が含まれ、溶解物のpHおよび浸透圧を調節することができる。細胞膜構造を破壊するために、洗剤(トリトンX-100やSDSなど)を加えることができる。溶解緩衝液には、プロテアーゼ阻害剤などの有用な成分が含まれることがある。方法が細胞を溶解することを含み、β-ガラクトシダーゼベースのEFC系が使用される場合、活性再構成β-ガラクトシダーゼは、化学発光アッセイを使用して検出され得る。例えば、再構成されたβ-ガラクトシダーゼ(EFCを介する)を含有する細胞は、Galactolight Plusアッセイキット(Tropix、Bedford Mass.)からのGalacton Plus基質を含有する緩衝液の混合物中で溶解され得る(架橋剤と接触するまたは接触しない)。Bronstein et al, J. Biolumin. Chemilumin., 4:99-111 (1989)。発光促進剤溶液を加えた後、ルミノメーターまたはシンチレーションカウンターでルミネッセンスを測定する。いくつかの実施形態では、方法が細胞を溶解することを含み、β-ガラクトシダースベースのEFCシステムが採用される場合、Eurofins DiscoverX Corporationから入手可能なPathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLink（商標）またはKILR（登録商標）検出キットを使用して、ケミルミネセンスによる酵素活性を検出することができる。
また、本開示により提供されるのは細胞である。細胞は、本開示の方法を実践する際に使用することを発見する。本開示の細胞は、本方法のセクションおよび以下の実験セクションに記載された核酸のいずれかを含む、プロモーター領域に操作可能に結合した酵素ドナー(ED)をコードする領域を含む、本開示の核酸のいずれかを含み得るが、これらは組み込まれているが、簡潔さのために本明細書中で繰り返されていない。いくつかの実施形態において、細胞は、本方法セクションおよび以下の実験セクションにおいて上述された細胞の何らかの特性(例えば、いかなる細胞タイプ等であってもよい)を有するが、これらは、本明細書中に組み込まれているが、簡潔さのために本明細書中で繰り返されていない。
組成物
以上要約したように、本開示はまた、組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、例えば、本開示の方法を実践する際における使用を見出す。いくつかの実施形態によれば、本開示の組成物は、上の方法セクションおよび下の実験セクションに記載された核酸および/または細胞のいずれかを含む、本開示のいずれかの核酸および/または細胞を含み、これらは組み込まれているが、簡潔さの目的でここに繰り返されることはない。
本開示の組成物は、液状媒体に存在する本開示の核酸および/または細胞のいずれかを含み得る。液状媒体は、水、緩衝液、細胞培地(例えば、DMEM、RPMI、MEM、IMDM、DM/F-12等)のような水性液状媒体であってもよい。抗生物質、塩(例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4)、緩衝剤(トリス緩衝液緩衝剤、N-(2ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)など)、可溶化剤、洗剤(例えば、Tween-20などの非イオン性洗剤)、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセリン、キレート剤などの1つ以上の添加剤が、そのような組成物中に存在し得る。
特定の実施形態では、緩衝化液状媒体中に存在する、本開示の細胞のいずれかを含む組成物が提供される。いくつかの実施例によれば、液状媒体は細胞媒体であり、例えば、DMEM、RPMI、MEM、IMDM、DMEM/F-12、またはそれに類するものである。特定の実施例において、提供される組成物は、本開示の核酸のいずれかを含む、親水型であるか、または緩衝液状媒体に存在する。
本開示の組成物は、適切な容器、例えば、チューブ、バイアル、アンプル、1つ以上のウェルのプレート、例えば、4-、6-、8-、12-、24-、48-、96-、384-、1536-ウェルの組織培養プレート等に存在することができる。
キット
本開示の側面には、さらにキットが含まれる。特定の実施形態において、キットは、例えば、本開示の方法を実践する際における使用を見出す。いくつかの実施形態によれば、本開示のキットには、上記の方法および構成セクションおよび下気の実験セクションに記載された核酸、細胞および/または組成物のいずれかを含む、本開示の核酸、細胞および/または組成物のいずれかが含まれているが、これらは簡潔さの目的でここに繰り返されることはない。
特定の実施において、プロモーター領域に操作可能に酵素ドナー(ED)をコードする領域を構成する核酸を含む細胞を備えるキット、および、当該細胞を本開示の方法のいずれかを実施するために使用するインストラクションを提供する。例えば、キットは、核酸のプロモーター領域の活性を評価するためのインストラクションを含むことができる。キットは、上記の方法セクションおよび下の実験セクションで説明されている、培養、接触、検出などの工程のためのインストラクション(および有用な試薬)で構成されている。
多くの実施例において、プロモーター領域と操作可能にEDに融合された担体タンパク質をコードする領域を含む核酸からなる細胞を含むキットが提供され、本開示の方法のいずれかを実施するために細胞を使用するためのインストラクションが与えられる。
本開示のキットは、培養中に細胞を薬剤（例えば、対照薬剤、試験薬剤など）と接触させ、検出された酵素活性のレベルに基づいて、細胞を薬剤（例えば、小分子、タンパク質（例えば、細胞表面タンパク質）、核酸など）と接触させることに応答して、プロモーター領域の活性レベルを評価するためのインストラクションをさらに含み得る。このようなキットは、更に、目的の細胞シグナル伝達経路を活性化する制御アゴニストと細胞に接触させるためのインストラクションを含み得る。このようなキットは、さらに、制御アゴニストを含む。プロモーター領域の活性化レベルは、対象の転写因子および/または対象の細胞シグナル伝達経路に対する作用物質の効果を評価するための基礎として使用することができる。このインストラクションには、そのような評価を行うためのインストラクションが含まれていてもよい。
いくつかの実施形態によれば、キットの細胞に存在する核酸によってコードされるEDは、β-ガラクトシダーゼドナーフラグメントEDである。例えば、EDは、表3に記載されている実施例のβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメントEDのアミノ酸配列、または、グリコシド・ハイドロラーゼ活性を有するエンザイムを形成するためにEAと複合化することができるその変異体を含むことができる。特定の実施形態において、本開示のキットには、EAが含まれる。例えば、細胞の核酸がβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメントEDをコードするとき、キットに含まれるEAは、ED-EAペアがEFCを介してグリコシドハイロラーゼ活性を有する機能的な酵素を生成するように選択されたβ-ガラクトシダーゼアクセプターフラグメントEAであってもよい。
いくつかの実施形態によれば、本開示のキットは、EAとEDと接触させる前に細胞を分解するための命令を更に含んでいる。ある実施形態では、本開示のキットは、溶解剤を含む。本開示のキットに含まれることができる無限の溶解バッファーの例には、NP-40溶解バッファー、RIPA(RadioImmuno Precipitation Assay)溶解緩衝液、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)溶解緩衝液、ACK(アンモニウム-塩化カリウム)溶解緩衝液などが含まれる。他の実施形態では、本開示のキットには、細胞が無傷であるときにEAとEDと接触させるためのインストラクションが含まれる。このようなキットには、固定した無傷の細胞などで、生の細胞(およびフローサイトメトリーなどによる検出)でEDとEAと接触させるための指示が含まれることがある。
キットの構成要素は、別々のコンテナに存在することもあれば、多数のコンポーネントが単一のコンテナに存在することもある。適当な容器には、個々のチューブ(例えば、バイアル)、アンプル、1つ以上の板のウェルなどが含まれる。
キットに付属しているインストラクションは、適切な記録媒体に記録することができる。例えば、インストラクションは紙やプラスチックなどのような基材に印刷されてもよい。このように、このインストラクションは、キットのコンテナまたはその成分(すなわち、包装またはサブ包装に関連する)のラベリングにおいて、パッケージインサートとしてキットに存在することができる。他の実施例において、インストラクションは、適切なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えば、携帯用フラッシュドライブ、DVD、CD-ROM、ディスケット等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。他の実施形態においては、実際のインストラクションはキットには存在せず、遠隔ソースからインストラクションを得る手段、例えばインターネットを介して提供される。本実施形態の一例は、インストラクションを見ることができ、また/またはインストラクションをダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。インストラクションとともに、インストラクションを得るための手段は、適切な基材に記録されている。
以下の実施例は、限定としてではなく例示として提示するものである。
実験例
（実施例1）NFAT EFC レポーター構築
NFAT EFC レポーター構築は、配列:GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT(配列番号5)を有する、4つのタンデムな反復(4x) NFAT転写因子結合反応元素を持つプロモーターを含む。PESTは、プロテイン不安定化配列(プロリン(P)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、およびスレオニン(T)が豊富なペプチド配列)であり、プロテアソームを媒介した、レポーター強化Prolabel(ePL)タンパク質の転換を強化する。ePLタンパク質は、βガラクトシダーゼの不活性～45アミノ酸フラグメントである。担体タンパク質の寿命を短くすることは、分析に必要な応答時間を短くし、おそらくリガンド濃度への感受性を高めることが前もって示されている(Fan and Wood, Assay Drug Dev Technol. 2007 Feb;5(1):127-36)。
図1は、NFAT転写因子活性化のEFCベースのアッセイに使用されるNFAT EFCレポーター構築のためのプラスミドマップを示し、NFATにインプットするシグナル経路の活性化を示す。異なるプロモーター要素(例えば、この例の4x応答NFAT要素)が、異なった担体タンパク質と異なった不安定化モチーフ(例えば、この例のPEST)を用いて、異なる用途のためにこれらの構成要素を標的にし、調整することができる。
図2は、フォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)とイオノマイシン(データは1xカクテルが81 nM PMA/1.34μMイオノマイシン細胞刺激である場合のx1として表される)の「細胞刺激」カクテルに対するU2OS NOS FAT EFCレポーター細胞の用量反応曲線(DRC)を示している。細胞を20時間刺激した後、PathHunter（登録商標）フラッシュ検出試薬(+エンザイムアクセプター(EA))を1時間にわたって検出した。5Kと10Kは、384のウェルプレートの各ウェルにプレートされた細胞数である。S/Bは分析応答曲線のバックグラウンド(下)上のシグナル(上)である。
フォルボール12-ミリステート13-酢酸(PMA)およびイオノマイシンの「細胞刺激」カクテルは、「NFATシグナル伝達経路」およびNFAT転写因子を活性化することが知られている。20時間のPMA/イオノマイシンカクテル(1X = 81 nM PMA/1.34μMイオノマイシン)の異なる希釈を用いて、NFAT EFCレポーター構築物(図1参照)で安定的にトランスフェクトされたU2OS細胞の刺激は、+EAを追加した後のEFCによって証明されるように、NFAT EFCレポーターの用量依存刺激を明らかにした。カクテルの効力は5,000細胞を用いて0.047X(または3.8nMPMA/63nMイオノマイシン)であることが示された。これらのデータは、U2OS NFAT EFCレポーター細胞が、「NFATシグナル伝達経路」およびNFAT転写因子の活性化または阻害のためのアッセイを開発するのに適していることを実証する。細胞刺激カクテルまたは他の活性化リガンドの刺激量の存在の中で、試験化合物の相対光単位(RLU)の減少として阻害を検出することができた。
（実施例2）NFkB EFCレポーター構築物
NF-kB EFCレポータープラスミドには、NF-kB 転写因子結合応答エレメントを5つのタンデムに繰り返すプロモーターが含まれており、GGGAATTTCC(配列番号6)配列の3つと交互にGGGGACTTTCC (配列番号6)配列の2つが配置されている。
図3は、NF-kB転写因子の活性化とNF-kBシグナル伝達経路の活性化のEFCに基づくアッセイに用いられるNF-kB EFCレポータープラスミドのプラスミドマップを示している。様々な担体タンパク質と様々な不安定化のモチーフ(例えば、この例のPEST)は、これらの構築物を異なる用途に合わせるために使用されることとしてもよい。
図4は、U2OS NF-kB EFCレポーター細胞の単細胞クローンのサイトカインTNFαに対する応答。NF-kB EFCレポーター構築物を安定に表すU2OS細胞の5つの単一細胞クローンからの2500細胞/ウェルを、384のウェルプレートにプレート（播種）した。細胞を指示された濃度のTNFαで6時間刺激した後、細胞溶解を伴うPathHunter（登録商標）FLASH検出試薬（+5xEA）で検出した。
TNFαは、「NF-kBシグナル伝達経路」およびNF-kB転写因子を刺激することが知られている。6時間のTNFαの異なる希釈を用いてNF-kB EFCレポーター構築物で安定的にトランスフェクトされたU2OS細胞の刺激は、+EA(図4)を追加した後のEFCによって証明されるように、NF-kB EFCレポーターの用量依存刺激を明らかにした。異なったクローンに対するTNFαの効力は0.03-0.12 nMであることを示した。これらのデータは、U2OS NF-kB EFCレポーター細胞が、サイトカインTNFαに敏感に応答することができ、これは、NF-kBシグナル伝達経路およびNF-kB転写因子の活性化または阻害のためのアッセイの開発の可能性を示す。阻害のアッセイは、刺激用量のTNFαまたは他の活性化リガンドの存在下で試験化合物によるRLUの減少を探すことによって開発することができる(図5を参照)。
図5は、U2OS NFkB EFCレポーター細胞ベースアッセイを用いたインヒビターのスクリーニングである。U2OS NFkB EFCレポーター細胞を、種々の濃度(および3ロット)の抗TNFαインヒビターアダリムマブを伴うまたは伴わない2nM TNFα(アゴニスト)で処理した。この実施例では、試験した3ロットのHumira（ヒュミラ）はすべてロット#1047318から得られたもので、試料がストレスを受けていない(例えば、コントロール)、70℃15分間、70℃30分間ストレスを受けた場合、特定の活性の減少または活性の喪失をシミュレートするために強制劣化手順を通して実行された。
U2OS NF-kB EFCレポーター細胞を用いて、NF-kBシグナル伝達の阻害を測定し、インヒビターを研究することもできる。U2OS NF-kB EFCレポーターアッセイを用いて、アダリムマブ(Humira（登録商標）)がTNFα-刺激NF-kBシグナル伝達を抑制できることを実証した(図5)。この抑制反応の用量依存性により、異なるロットのアダリムマブの効力を測定することができた。図5のHumira（登録商標）は、加熱による様々な量の強制劣化を受けたHumira（登録商標）試料の抑制力の変化を示している。強制劣化は、例えば、QC/ロット放出アッセイのため、あるいは様々な原因による力の喪失のためなど、異なる力を持つロットをシミュレーションするために、生物学(タンパク質治療薬)のためのアッセイの開発において用いられる方法であることに注意されたい。U2OS NF-kB EFCレポーターアッセイは、70°Cで0、15または30分の強制劣化を受けたHumira（登録商標）試料の段階的喪失(右へのシフト)を検出した。また、この分析を用いて、Humira（登録商標）の経時的な安定性を検討することも可能である。4℃で貯蔵されている2ロットのHumira（登録商標）(どちらも市販品で調達されており、したがって、その効力は放出時に本質的に同一であった)、有効期限切れのないもの(#1047318)、および有効期限を過ぎた14ヶ月間のもの(#1017235)が、同じNF-kB経路阻害能力を有することがTNFαで刺激されたU2OS NF-kB EFCレポーターアッセイにおいて示された(図6)。
図6は、NFkB EFCレポーターアッセイが、試験した2つのHumira（登録商標）ロットが、14か月前に期限切れになったロット#1017235(Humira（登録商標）ロット#1047318は期限切れではなかった)にもかかわらず、同一のTNFα阻害活性と効能を有していたことを明らかにした。有効期限の切れたロット#1017235の安定性はまた、図5に示す強制劣化実験におけるロット#1047318の安定性と同等であった。
図7は、NFkB EFCレポーターアッセイ細胞における内因性CD40レセプターが、3時間または6時間のインキュベーション後にCD40リガンド(CD40L)に強固に応答した。これらの同じ細胞は内因性的にTNFレセプターを発現し、水溶性のTNFαに反応する(図4-6参照)。
多くの場合、異なる細胞受容体を介して作用する複数のリガンドが同じシグナル伝達経路を刺激することにより、同じEFCレポーターアッセイを用いてこれらの複数のリガンドの機能および機能抑制を検討することができる。例えば、図4-6において、TNFα-刺激NFkBシグナルおよび遺伝子発現の刺激および抑制を研究した。同じアッセイを用いて、図7における研究は、CD40レセプターを介して作用するCD40Lもまた、この同じ転写因子および遺伝子発現経路を刺激することを示す。
（実施例3）共培養アッセイにおけるNFAT EFCレポーター細胞刺激
活動と抑制が現在の研究の対象である多くのリガンドは、TNFα、CD40Lのような溶性細胞外リガンドまたはPMAやイオノマイシンのような溶性細胞内リガンドである。しかしながら、これらの同じ細胞ベースのEFCレポーターアッセイは、別の細胞表面上の分析細胞に提示される細胞関連リガンドを検討するのにも使用することができる(例えば、細胞-細胞または細胞間相互作用)。細胞を提示するこの他のリガンドは、アッセイ細胞に関して、異種の細胞または自己の細胞であることができる。図8は、CHO-K1細胞の表面に提示されたOKT3リガンドが、Jurkat NFAT EFCレポーター細胞プール内のNFATを介した遺伝子発現を活性化することができることを示している。
図8は、Jurkat NFAT EFCレポーター細胞が、発現されるOKT3リガンドに反応し、共同培養アッセイでCHO-K1細胞の表面に発現され、提示された。OKT3は、リーダーレスヒトCD14に融合した、マウス抗ヒトT細胞受容体CD3サブユニットの単一鎖フラグメントに融合されたCD5リーダーペプチドから構成され、受入番号HM208750.1である。CHO OKT3細胞の添加は、約700細胞のOKT3細胞を刺激するEC50で、NFAT EFCレポーターの担体タンパク質発現を段階的に刺激した。
（実施例4）IL2-プロモーター-EFCレポーター構築物
図9は、IL2-プロモーター-EFCレポータープラスミドのプラスミドマップである。このレポーター構築物では、複数の特定転写因子結合部位を含む完全な内因性IL2遺伝子プロモーター("IL2prom")は、担体タンパク質と融合した担体タンパク質-ePLの上流で融合され、ドライブ発現される。IL2プロモーター内に含まれるのは、NFAT(1)、NFkB(2)、OCT(3)、ARRE-2(4)およびNFAT/AP1(6)転写因子およびIL2最小プロモーター(7)の結合部位である。使用されているIL2プロモーターのDNA配列は、
[化１]
gtacCTTTTCTGAGTTACTTTTGTATCCCCACCCCCTTAAAGAAAGGAGGAAAAACTGT TTCATACAGAAGGCGTTAATTGCATGAATTAGAGCTATCACCTAAGTGTGGGCTAAT GTAACAAAGAGGGATTTCACCTACATCCATTCAGTCAGTCTTTGGGGGTTTAAAGAA ATTCCAAAGAGTCATCAGAAGAGGAAAAATGAAGGTAATGTTTTTTCAGACAGGTAA AGTCTTTGAAAATATGTGTAATATGTAAAACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCC AGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAAT
CACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCAgctag（配列番号11）

であり、Weaver et. al. (Molecular Immunology, 06 Mar 2007, 44(11):2813-2819) に記載されているように、8つの異なった転写因子結合部位とIL-2コアプロモーターで構成されている。以下の8つのDNAエレメント
[化２］
ACCCCCTTAAAGAAAGGAGGAA(配列番号12)、
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT(配列番号13)、
AATTGCATGAA(配列番号14)、
GGGATTTCACC(配列番号15)、
ATGAAGGTAATGTTTTTTCAG(配列番号16)、
GTCTTTGAAAATATGTGTAAT(配列番号17)、
AAACATTTTG(配列番号18)、および
TAATATTTTT(配列番号19)

は、転写因子NFAT & AP1、NFAT、OCT、NFkB、NFAT & AP1、NFAT & AP1、OCT、NFATにそれぞれ応答し、一方、IL-2コアプロモーターは、
[化３］

CAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCT(配列番号20)

であり、TATA ボックスは下線が引かれている。
図10は、Jurkat IL2-プロモーターEFCレポーター細胞株が、異なるシグナル伝達経路の活性化を介して、複数の異なる応答エレメントの刺激を検出することができる。5K Jurkat IL2プロモーターレポーター細胞は、384のウェルプレートのウェルにプレートされ、フラッシュ検出試薬(+5x EA)を細胞分解(およびEFC発光を読み取る)とともに加える前に、37°CでOKT3細胞(正方形)またはOKT3細胞+ CD28(円形)のどちらかで16時間刺激された。EC50は、1ウェルあたりのOKT3存在CHO-K1細胞数である。
OKT3-ベアリングCHO-K1細胞は、主にNFAT反応元素(図10、正方形)の活性化を通して生じると信じられているJurkat細胞IL2-プロモーターレポーター発現を刺激する。NFkB反応元素を主として作用すると信じられているCD28抗体は、OKT3細胞だけで、シグナルが約2倍増加し、EC50が約2倍減少することから明らかなように、IL2プロモーター(図10、円)のOKT3刺激を増強する。OKT3+抗CD28の応答をOKT3単独の応答と比較すると、複数の応答エレメントおよびシグナル伝達経路を刺激することによってIL2プロモーターEFCレポーターの添加剤(または相乗的)誘導が実証される。したがって、このより複雑な生理学的プロモーターを用いて、インビボでのIL2発現および分泌の調節について見られるものとより類似した、ナイーブなIL2プロモーターのより複雑で統合的な調節を検討することができる。
図11は、2つの異なるシグナル伝達経路、フォルボールエステルおよびイオノマイシンの細胞内模倣物に対する、IL2-プロモーターEFCレポーター構築物、複数の異なる応答エレメントを有する複合的ナイーブ（天然）プロモーターの応答である。5K細胞は、細胞分解(および発光を読み取る)でフラッシュ検出試薬(+5x EA)を加える前に、384のウェルプレートのウェルにプレートされ、16時間刺激した。S/Bは、RLU(PMA/イオノマイシンを用いた)/RLU(PMA/イオノマイシンを用いない)をとることによって算出される。
イオノマイシンおよびフォルボールエステルPMAはそれぞれNFATおよびAP-1応答エレメントの刺激を介して、IL2-プロモーターEFCレポーター構築物における明確な要素の活性化を増加させる(図11)。図10に示された例のように、これは、生体内でのIL2発現と分泌のレギュレーションのために見られるものとより類似した、ナイーブIL2プロモーターのより複雑で統合的な規制を検討するために、複数のインプットを使用することができることを示している。
（実施例5）アンタゴニストのアッセイのためのプロモーター-EFCレポーター構築物
図12は、RORγT転写因子およびRORγT EFCレポータープラスミドを発現するU2OS細胞において、インバース（逆）アゴニストGSK805によりRORγT転写因子の活性が低下する。細胞を18hの間GSK805(Tocris)で処理し、その後、EAプラスPathHunter（登録商標）フラッシュ検出試薬を加えてEFCを用いて担体タンパク質ePLの発現を検出した。
具体的なEFCレポーター構築物を用いて、トランスフェクトされた転写因子に対するインバースアゴニスト(インバースアゴニストは、転写因子またはレセプターに直接結合し、その活性を基礎レベル以下に低下させるリガンドである)の活性を検討することができる。この場合、インバースアゴニストGSK805は、U2OS細胞におけるRORγT EFCレポーターの刺激のためのRORγT転写因子の活性を減少させることが示された(図12)。
（実施例6）EFCベースのNFkB転写レポーターアッセイはルシフェラーゼ系よりも優れた感度を示す
図13は、EFCにベースNFkB転写レポーターアッセイが、ルシフェラーゼ系よりもCD40L/CD40レセプターに対してより良好な感度を示す。EFCレポーター（左パネル）または（Firefly（ホタル））ルシフェラーゼ-PESTのいずれかの発現を駆動するNFkB転写応答エレメントをコードするプラスミドで安定的にトランスフェクトされたU2OS細胞を、さまざまな濃度のCD40Lで6時間刺激した後、細胞溶解、過剰なEAの添加、1時間のインキュベーション、発光（RLU）の測定を行った。検出されたルミネッセンスは、CD40Lによる各担体タンパク質の誘導の程度を示している。
EFCにベースNFkB転写レポーターアッセイは、ルシフェラーゼベースアッセイよりもCD40Lに対する感受性が35倍以上高かった。安定した細胞株を作るために使用されたレポータープラスミドは同一の要素（エレメント）を持っていたが、唯一の重要な違いはキャリアタンパク質の同一性であることに注意されたい。具体的には、両方のプラスミドは同じプロモーター要素を有し、両方とも同じタンパク質不安定要素(PEST配列)を有していた。従って、CD40Lでは、レポーターアッセイ検出EFCはルシフェラーゼ活性を検出するよりも有意に感度が高かった。
図14は、EFCにベースNFkB転写レポーターアッセイが、ルシフェラーゼ系よりも良好な感度を示す。EFCレポーター(左パネル)または(Firefly)ルシフェラーゼ‐PESTの発現を促進するNFkB転写反応要素をコードしたプラスミドで安定的にトランスフェクトされたU2OS細胞は、18hのTNFαの濃度の範囲で刺激され、それに続いて細胞分解、余剰EAの添加、1hのインキュベーション、およびルミネッセンス(RLU)の測定を行った。検出されたルミネッセンスは、TNFαによる各担体タンパク質の誘導の程度を示した。
図14は、EFCベースのNFkBトランスクリプショナルレポーターアッセイが、ルシフェラーゼシステムよりもTNFレセプターリガンドTNFαにより良好な感度を示すことを示している。リガンドTNFαは、例えば、スクリーニングアッセイにおける候補物質に対する弱い応答の検出に有利なルシフェラーゼアッセイ(右パネル)よりも、EFCアッセイ(左パネル)において12-15より強力である。
EFCベースのレポーターアッセイによるリガンド刺激に対する感受性の増加が、CD40LおよびTNFαの両方について観察された。この感度の向上は有益で重要である。なぜなら、EFCレポーターアッセイを用いて、化学阻害剤の親和性成熟の初期(ヒットディスカバリやドラッグディスカバリのヒット・トゥ・リード最適化フェーズの初期など)に見られるような、より強力でない化合物を検討することができるからである。
（実施例7）NFkB 経路（パスウェイ）レポーターアッセイの細胞株
レポーター細胞系は、経路誘導性転写反応要素によって制御された酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作された。経路の活性化はED標識タンパク質の誘導された発現をもたらす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAの酵素フラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、細胞株は、NFkB(核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞株である。
細胞は、NFkB応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ－ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むU2OS細胞である。
細胞を96ウェルプレートにプレートし、37℃と5%CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を制御アゴニスト(ここではCD40L)で刺激した。刺激後、PathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLinkTM検出キット(Eurofins DiscoverX Corporation)を用いて、推奨されるプロトコールに従ってシグナルを検出した。
Figure 2022528270000050
結果は、図15に示される。このレポーター細胞株は、コントロールアゴニスト刺激として225.4ng/mlのEC50を示し、アゴニストEMAXで26.3のシグナル:背景比を示した。
細胞株は、アッセイウインドウやEC50の変化がなく、10パッセージを通して安定していることが確認された。
（実施例8）NFAT経路レポーターアッセイの細胞株
レポーター細胞系は、経路誘導性転写反応要素によって制御された酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作された。経路活性化は、EDタグをつけたタンパク質の誘発された発現をもたらす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、細胞株はNFAT(活性化されたT細胞の核因子)経路レポーター細胞株である。
細胞は、NFAT応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に結合されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ－ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むJurkat細胞である。
細胞を96ウェルプレートにプレートし、37℃、5%CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞をコントロールアゴニスト(ここでは、抗CD3)で刺激した。刺激後、PathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLinkTM検出キット(Eurofins DiscoverX Corporation)を用いて、推奨されるプロトコールに従ってシグナルを検出した。
Figure 2022528270000051
結果は、図16に示される。このレポーター細胞株は、302.5ng/mlのコントロールアゴニスト刺激のEC50と、7.6のアゴニストEMAXのシグナル:背景比を示した。
この分析のために、PBSで作られた1:3希釈系列の50Lをプレートし、4℃で一晩プレートをインキュベートすることにより、抗CD3(OKT3)をウェル内で予めコーティングした。アッセイのためにプレートした細胞の直前にウェルから抗体を取り除いた。
細胞株は、アッセイウインドウやEC50の変化がなく、10パッセージを通して安定していることが確認された。
（実施例9）STAT3経路レポーターアッセイの細胞株
経路誘導性転写応答エレメントにより制御されるEnzyme Donor(ED)標識担体タンパク質を発現するようにレポーター細胞株を操作した。経路活性化は、EDタグ付きタンパク質の誘発された発現をもたらす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAの酵素フラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的な酵素が形成される。
この実施例では、細胞株は、STAT3(シグナル伝達物質とトランスクリプション3の活性化剤)経路レポーター細胞株である。細胞は、STAT3応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ－ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むHepG2細胞である。
細胞を96ウェルプレートにプレートし、37℃と5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞をコントロールアゴニスト(ここではIL-6)で刺激した。刺激後、PathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLinkTM検出キット(Eurofins DiscoverX Corporation)を用いて、推奨されるプロトコールに従ってシグナルを検出した。
Figure 2022528270000052
結果は、図17に示されている。このレポーター細胞株は、0.601ng/mlのコントロールアゴニスト刺激のEC50とアゴニストEMAXのシグナル:バックグラウンド比21.3を示した。
細胞株は、アッセイウインドウやEC50の有意な低下はなく、10パッセージを通して安定していることが確認された。
HepG2 STAT3アッセイのための細胞系は、IL-6シグナルを検出するためにHepG2細胞における内在性IL-6レセプターを使用する。
（実施例10）Jurkat NFAT経路レポーターアッセイ
レポーター細胞株は、NFAT経路誘導性転写応答エレメントによって制御された酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するために設計された。NFAT経路の活性化は、NFAT経路誘導性転写応答エレメントに結合し、EDタグ付担体タンパク質の発現を誘導するNFAT転写因子の活性化をもたらす。外因性酵素アクセプター(EA)と緩衝液の付加により、細胞が溶け、不活性EDとEAのベータガラクトシダーゼ酵素フラグメントを補完する力が加わる。これにより、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能性β-ガラクトシダーゼ酵素が形成される。
この実施例では、細胞株はNFAT(活性化T細胞の核因子)レポーター細胞株である。NFAT経路の活性化は、NFAT経路誘導性転写応答エレメントに結合し、EDタグ付担体タンパク質の発現を誘導するNFAT転写因子の活性化をもたらす。細胞は、NFAT応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に結合されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むJurkat細胞である。
細胞を96ウェルプレートにプレートし、37℃、5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。次に、以下に述べる分析条件を用いて、細胞をコントロールアゴニスト(ここでは、抗CD-3)で刺激した。刺激後、PathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLinkTM検出キット(Eurofins DiscoverX Corporation)を用いて、推奨されるプロトコールに従ってシグナルを検出した。
Figure 2022528270000053
結果は、図18に示されている。このレポーター細胞株は、コントロールアゴニスト刺激として3.025ng/mlのEC50を示し、アゴニストEMAXのシグナル:バックグラウンド比7.6を示した。
このアッセイでは、活性化されたT細胞レセプター(TCR)抗体、CD3抗体を、10mmug/mlをプレートし、20時間プレートをインキュベートすることにより、ウェル内で予めコーティングする。アッセイのためにプレートした細胞をプレートする直前にウェルから抗体を取り除いた。
細胞株は、アッセイウインドウやEC50の変化がなく、10パッセージを通して安定していることが確認された。
(実施例11)経路レポーターアッセイは、他の標的(リガンドやレセプターなど)のためのアッセイを生成するために、さらに改変（修飾）することができる。
レポーター細胞系は、経路誘導性転写応答エレメントによって制御された酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作された。経路の活性化は、ED標識タンパク質の誘導された発現をもたらす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、アッセイは、第1の細胞株と第2の細胞系の共培養で構成される。共培養アッセイにおける第1の細胞株は、上記開発されたJurkat NFAT経路レポーター細胞においてPD1を発現することにより誘導されるJurkat PD1(プログラム細胞死-1)経路レポーター細胞株である。PD1が添加された細胞は、NFAT経路応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に結合されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)をコードする核酸を含むJurkat細胞である。PD1経路レポーター共培養アッセイにおける第2の細胞株は、PD-L1(プログラム細胞死リガンド1)とTCR(T細胞受容体)活性化剤分子を共発現するU2OS細胞株である。PD1がそのリガンドであるPDL1(プログラム細胞死リガンド1)に結合すると、TCR (T細胞抗原)の活性が阻害され、それによってTCR(TI抗原)活性化剤分子によるTCR誘導性のNFAT経路の活性化が阻害される。この共同培養アッセイは、これらの阻害剤がNFAT経路のTCR誘発活性化のPD1‐媒介抑制を遮断するので、PD1へのPDL1結合の阻害因子を分析するために使用され得る。
Jurkat PD-1レポーター細胞をPD-1アンタゴニスト抗体(Ab)とプレインキュベートし、次いでU2OS PD-L1/TCR活性化細胞を加えてTCRを活性化する。PD-1 AbはPD-1のPD-L1活性化を遮断し、TCR活性化のPD-1減衰量を遮断し、最終結果は高濃度のPD-1 AbによるTCR活性化の増加である。
図19は、Jurkat NFAT経路レポーター分析細胞株が、他の標的(他のレセプターおよびリガンド)のためのアッセイを生成するために、どのように経路レポーターアッセイを更に修正することができるかを実証するPD-1経路レポーター細胞株を作成するために使用できることを示している。
（実施例12）U2OS NF-κB経路レポーターアッセイのための細胞株
レポーター細胞株を、経路誘導性転写応答エレメントによって制御された担体タンパク質‐酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグ付きタンパク質の発現を引き起こす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAの酵素フラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的な酵素が形成される。
この実施例では、細胞株は、NFkB (核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞株である。細胞は、NFκB応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ－ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)およびレポーターフラグメントをコードする核酸を含むU2OS細胞である。また、細胞はCD40(レセプター)を内因性に発現する。
細胞を96ウェルプレートにプレートし、37℃と5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞を制御アゴニスト(ここではCD40L)で刺激した。刺激後、PathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLinkTM検出キット(Eurofins DiscoverX Corporation)を用いて、推奨されるプロトコールに従ってシグナルを検出した。
Figure 2022528270000054
結果は、図20に示されている。このレポーター細胞株は、コントロールアゴニスト刺激として0.0886μg/mlのEC50を示し、シグナル:バックグラウンド比は102.8であった。
NFKB経路を通してシグナルを送る他の内因性的レセプターおよびリガンドもまた、この分析(例えば、TNFRを通したTNFα)で成功的に使用されている。
（実施例13）U2OS RANK-NFκB経路レポーターアッセイ
レポーター細胞株を、経路誘導性転写応答エレメントによって制御された担体タンパク質‐酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグをつけたタンパク質の発現を引き起こす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例では、細胞株は、NFkB(核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞株である。細胞は、NFκB応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に連結されたアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ－ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)およびレポーターフラグメントをコードする核酸を含むU2OS細胞である。RANK-NFkBレポーターアッセイRANK(核因子NF-κ-Bレセプターの受容体活性化因子)を産生するために、上記開発したU2OS NFκB経路レポーター細胞に共発現させる。
細胞を96ウェルプレートにプレートし、37℃の5% CO2でインキュベートし、細胞が付着し成長するようにした。その後、以下に述べる分析条件を用いて、細胞をコントロールアゴニスト(ここではsRANKL)で刺激した。刺激後、PathHunter（登録商標）ProLabel（登録商標）/ProLinkTM検出キット(Eurofins DiscoverX Corporation)を用いて、推奨されるプロトコールに従ってシグナルを検出した。
Figure 2022528270000055
結果は図21に示されている。このレポーター細胞株は、コントロールアゴニスト刺激として4.034ng/mlのEC50を示し、シグナル:バックグラウンド比は24.0であった。
（実施例14）HEK NF-κB経路レポーターアッセイ
レポーター細胞株を、経路誘導性転写応答エレメントによって制御された担体タンパク質‐酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグ付きタンパク質の発現を引き起こす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例において、細胞株は、NF-κB(核因子NF-κ-B p100サブユニット)経路レポーター細胞株である。細胞は、NFκB応答エレメントから成るプロモーター領域に操作可能に結合された、アミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント（ED）およびレポーターフラグメントをコードする核酸を含むHEK-293細胞(HEK)である。さらに、HEKで内因的に発現するTNFα(リガンド)とTNFR(レセプター)を用いて、NF‐κB経路レポーターアッセイを開発した。
Figure 2022528270000056
アッセイの結果は、図22に示されている。
（実施例15）HEK CD27-NF-κB経路レポーターアッセイ
レポーター細胞株を、経路誘導性転写応答エレメントによって制御された担体タンパク質‐酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグ付きタンパク質の発現を引き起こす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例において、細胞株はCD27-NF-κB経路レポーター細胞株である。細胞は、NFκB応答エレメントを含むプロモーター領域と操作可能に結合されるアミノ酸配NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)およびレポーターフラグメントをコードする核酸を含むHEK細胞である。CD27(レセプター)は、上記開発のHEK NF-κB経路レポーター細胞株において共発現される。アッセイの結果は、図23に示されている。
Figure 2022528270000057
（実施例16） NF-κBレポーター細胞株からのアッセイ結果とRANKNF-κBレポーター細胞株からのアッセイ結果との比較
2つのレポーター細胞株を、経路誘導性転写応答エレメントによって制御された担体タンパク質‐酵素ドナー(ED)タグ付き担体タンパク質を発現するように操作した。経路活性化は、担体タンパク質‐EDタグ付きタンパク質の発現を引き起こす。外因性エンザイムアクセプター(EA)と緩衝液を加えると、細胞が溶け、EDとEAのエンザイムフラグメントの相補性が強まる。その結果、基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的なエンザイムが形成される。
この実施例において、第1の細胞株はU2OS-NF-κB経路レポーター細胞株であり、第2の細胞株はU2OS RANK-NF-κB細胞株である。細胞は、この実施例16で準備したように、両方の細胞株のU2OSである。U2OSNF-κB細胞株は、NFκB応答エレメントを含むプロモーター領域に操作可能に結合された、アミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を有するβ-ガラクトシダーズドナーフラグメント(ED)およびレポーターフラグメントをコードする核酸を含む。U2OS RANK-NF-κB細胞株は、上述の開発されたU2OS NF-κB経路レポーター細胞株におけるRANK-CD27(レセプター)の共発現に続くNFκB応答エレメントを含むプロモーター領域と操作可能に結合したアミノ酸配列NSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDR(配列番号30)を持つβ-ガラクトシダーゼドナーフラグメント(ED)およびレポーターフラグメントをコードする核酸を含む。
CD40Lリガンドを有するU2OS NF-κB細胞株のアッセイ結果が図24aに示され、また、sRANKリガンドを有するU2OS RANK NF-κB細胞株のアッセイ結果が図24bに示されている。図24aおよび24bに示すように、U2OS RANK NF-κBのアッセイ結果は、EC50が低く、シグナル:バックグラウンド比が大きいことを示している。
アッセイは、RANK NF-κB担体タンパク質がNF-κB担体タンパク質より良好な結果を示すことを示す。従って、ある担体タンパク質は他の担体タンパク質よりも良好な結果を示すかもしれない。
従って、前述したことは、単に本開示の原理を説明するに過ぎない。当業者であれば、本願において明確に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化し、その精神と範囲に含まれる種々の配置を考案できることが十分理解されるであろう。さらに、本願で引用したすべての例および条件の記載は、基本的に、本発明の原理および当該技術分野の促進のために本発明者らによって導き出された概念を理解する上で読者を補助することを意図しており、そのような具体的に引用した例および状態に限定しないものとして解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態を引用した本願のすべての記述は、その具体的な例と共に、その構造的および機能的均等物の両方を包含することを意図している。さらに、そのような均等物は、現在既知の均等物および将来開発される均等物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を実行するように開発された任意のエレメントを含むことが意図されている。本発明の範囲にしたがって、ここに示され説明される実施の形態に限定されることを意図していない。

Claims (28)

  1. 核酸を含む細胞、すなわち、促進領域が活動的であるときにEDが発現される条件下で、促進領域に操作可能に結合する、エンザイムドナー(ED)をエンコードする領域を含む核酸を培養すること、
    エンザイマティックな活動を持つED-EA錯体を形成するために、もし発現されているならば、EDに、エンザイムアクセプター(EA)をもって接触すること、
    プロモーター領域の活性を評価するために、酵素活性のレベルを検出すること、
    プロモーター領域の活動を評価するためのエンザイマティック活動のレベルを検出し、検出されたエンザイマティック活動のレベルに基づいて転写因子の活性化レベルを評価すること、
    を含む促進剤領域の活性を評価する方法。
  2. 請求項1によれば、プロモーター領域が興味の転写因子に対する転写因子レスポンス要素(TFRE)を含み、かつプロモーター領域の活性が転写因子の活性を示すものである方法。
  3. 請求項2によれば、プロモーター領域が少なくとも1つのTFREからなる方法。
  4. 請求項1による方法は、更に、転写因子をエンコードする発現ベクトルを細胞に導入し、転写因子が発現される条件下で細胞を培養することを含む。
  5. 請求項1による方法は、さらに、細胞に剤と接触し、検出されたエンザイマティック活動レベルに基づいて、セルと剤と接触することに反応して、プロモータ領域の活動レベルを評価することである。
  6. 請求項5によれば、プロモーター領域の活性が、対象細胞シグナル伝達経路の活性を示す方法。
  7. 請求項5による方法で、細胞と剤との接触は、剤の存在の中で細胞を文化することを含む。
  8. 細胞を薬剤と接触させることに応答してプロモーター領域の活性レベルを評価することが、薬剤の非存在下で検出された酵素活性のレベルを薬剤の存在下で検出された酵素活性のレベルと比較することを含む、請求項5に記載の方法。
  9. 請求項5によれば、剤は小分子である。
  10. 請求項5によれば、剤はテスト剤である。
  11. 請求項5による方法で、細胞が複数の試験剤と接触する。
  12. 請求項1によれば、核酸はさらにEDに融合した運搬性タンパク質をエンコードし、したがってED-運搬性タンパク質融合は、上記領域が活性であるときに発現される。
  13. 担体タンパク質がED-EA複合体とは異なるエンザイマティックな活動を示すことを特徴とする請求項12による方法。
  14. 酵素活性のレベルを検出することが、ED-EA複合体のための基質を提供することを含み、検出可能なシグナルが、ED-EA複合体による基質の加水分解時に生成される、請求項1に記載の方法。
  15. 請求項1によれば、EDは、配列番号:30に記載されたアミノ酸配列、又はEAと複合してED-EA錯体を形成するその変形物を含む。
  16. 核酸は、ED-担体タンパク質溶融を形成するエンザイムドナー(ED)に溶融する担体タンパク質をエンコードする領域であり、ED-担体タンパク質溶融がプロモーター領域と実用的に結合される場合、プロモーター領域でED-担体タンパク質溶融を発現する条件下で、核酸はED-担体タンパク質溶融を形成する領域である核酸からなる細胞を作ること、
    エンザイマティックな活動を持つED-EA錯体を形成するために、もし発現されているならば、EDに、エンザイムアクセプター(EA)をもって接触すること、
    前記酵素活性のレベルを検出して、前記プロモーター領域の活性を評価すること、
    プロモーター領域の活動を評価するためのエンザイマティック活動のレベルを検出し、検出されたエンザイマティック活動のレベルに基づいて転写因子の活性化レベルを評価すること、
    を含む促進剤領域の活性を評価する方法。
  17. 請求項16によれば、プロモーター領域が、興味の転写因子に対する転写因子レスポンス要素(TFRE)を含み、かつ、プロモーター領域の活性が転写因子の活性を示すものである方法。
  18. 請求項17による方法は、担体タンパク質がED-担体タンパク質融合の安定性に影響するように選択された領域を含む。
  19. 請求項18による方法は、領域を欠くED-担体タンパク質溶融に比べて、ED-担体タンパク質溶融の安定性を増加させるように領域を選択する。
  20. 請求項18による方法は、領域を欠いたED-担体タンパク質融合に比べて、ED-担体タンパク質融合を不安定化するように選択される。
  21. 請求項16による方法は、更に、転写因子をエンコードする発現ベクトルを細胞に導入し、転写因子が発現される条件下で細胞を培養することを含む。
  22. 請求項16によれば、細胞に剤と接触し、検出されたエンザイマティック活動レベルに基づいて、細胞と剤と接触することに対応して、プロモータ領域の活動レベルを評価する方法。
  23. 請求項16によれば、プロモーター領域の活性が、対象の細胞シグナル伝達経路の活性を示すものである方法。
  24. 細胞を薬剤と接触させることに応答してプロモーター領域の活性レベルを評価することが、薬剤の非存在下で検出された酵素活性のレベルを薬剤の存在下で検出された酵素活性のレベルと比較することを含む、請求項22に記載の方法。
  25. 請求項22による、物質が小分子である方法。
  26. エージェントが試験剤であることを特徴とする請求項22による方法。
  27. プロモーター領域に動作可能に結合した酵素ドナー（ED）をコードする領域を含む核酸を含む細胞であって、
    請求項1～26のいずれかに従い、細胞を使用するための命令、プロモータ領域に操作可能に結合された、エンザイムドナー(ED)をエンコードする領域を含む核酸からなる細胞、を構成するキット。
  28. 請求項27のキットは、検出された酵母活動のレベルに基づいて、転写因子の活性化レベル、すなわち転写因子を活性化する経路を評価するための命令をさらに構成し、培養中に細胞に剤と接触し、検出された酵母活動レベルに基づいて細胞と剤と接触することに対するプロモータ領域の活性化を評価した。
JP2021560297A 2019-03-28 2020-03-26 プロモーター領域の解析方法とそれを実行するための細胞 Pending JP2022528270A (ja)

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