JP2005341937A - 経口ワクチンキャリアシステム - Google Patents
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- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
【解決手段】目的ペプチド、例えば、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子、とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を発現した植物体(ジャガイモ)を経口投与することよりなる目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段、及び当該遺伝子組換え植物。
【効果】経口投与された目的ペプチドは、消化管で分解されることはなく、目的の場所(腸管粘膜等)へ到達し、目的ペプチドの機能を誘導することができる。
【選択図】図1
Description
(1)ピリメタミンやサルファ剤といった化学薬剤の使用による予防法があり、飼料に化学薬剤を添加することにより、本疾病の発生を抑えることに成功し、大きな効果を上げ、防疫法の最も確実で安価な手段として普及し、その後、薬剤耐性の原虫の出現が明らかとなり、薬の改良と耐性原虫の出現とが繰り返し行われてきたが、飼料安全法の一部が改正され、採卵鶏には薬剤の使用ができなくなった。
(2)本疾病がニワトリヌカカにより媒介されることから、蚊の侵入しにくい鶏舎構造ヘの改築が考えられ、ウィンドレス鶏舎が代表的なものとして提案された他、防虫網や送風装置の設置と殺虫剤の併用が行われた。
(3)スポロゾイトを用いた生ワクチンと虫体由来物質を抗原とする不活化ワクチンの二種類のワクチンが提案された。これらのワクチン製造には、材料として何れもニワトリヌカカと鶏の双方が必要なため、大量、安全且つ安価な製造を困難にしており、生産効率の低い従来法によるワクチン製造では、工業的規模での大量生産には限界があった。
また、本発明は、経口投与しても、消化管での耐分解性を有し、作用すべき目的の場所である腸管等に到着することが可能な、目的ペプチドを産生する組換え植物体を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、免疫原性ペプチド、血圧低下ペプチド等の機能性ペプチドを産生する、組換え植物体を作出することを目的とするものである。
また、本発明は、目的ペプチドを産生した植物体を大量に栽培することを可能にして、目的ペプチドを、大量に、経済的に提供することを目的とするものである。
また、本発明は、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子を導入・発現した植物体による、経口ワクチンキャリア手段を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、目的ペプチドを、植物体を通して、人又は動物に摂取させることにより、筋肉内注射によるストレスを与えることがない、簡便な、省力化したワクチンの投与を可能とすることを目的とするものである。
更に、本発明は、医療、医薬の技術分野において有用な、植物体による目的ペプチドの産生と、経口投与を可能とする新しい技術の創生を目的とするものである。
(1) 免疫原性、機能性等を有する目的ペプチドを経口投与により生体の目標部位に運搬する機能を有する経口キャリア手段であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス(NLV:Norwalk virus)外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させた組換え植物体を有効成分とすることを特徴とする上記経口キャリア手段。
(2)目的ペプチドが、免疫原性ペプチドないし機能性ペプチドである、上記(1)に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
(3)免疫原性ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1である、上記(2)に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
(4)目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号1で示される組換え遺伝子である、上記(1)に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
(5)融合させた遺伝子をジャガイモに導入・発現させた組換え植物体を使用する、上記(1)に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
(6)融合させた遺伝子を導入・発現させた組換え植物体を、更に目的ペプチドを抽出・精製して使用する、上記(1)に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
(7)目的ペプチドを経口投与により生体の目標部位に運搬する機能を有する組換え植物体であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス(NLV:Norwalk virus)外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させたことを特徴とする上記組換え植物体。
(8)目的ペプチドが、免疫原性ペプチドないし機能性ペプチドである、上記(7)に記載の上記組換え植物体。
(9)免疫原性ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1である、上記(8)に記載の上記組換え植物体。
(10)目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号1で示される組換え遺伝子である、上記(7)に記載の上記組換え植物体。
(11)融合させた遺伝子を導入し・発現させた組換え植物体が、ジャガイモである、上記(7)に記載の上記組換え植物体。
(12)ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を連結した、配列番号1で示されることを特徴とするCalici-LRE1抗原組換え遺伝子。
本発明は、目的ペプチド、例えば、免疫原性ペプチドないし機能性ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を発現した植物体を、人又は動物に経口投与することを特徴とする目的ペプチドを生体の目標部位に運搬する機能を有する経口投与するためのキャリア手段及び組換え植物体に関するものであり、例えば、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子、及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合した、Calici-LRE1抗原発現キャリアシステム遺伝子を発現した植物体を、鶏に、経口投与する経口ワクチンキャリアシステム、及び該システムに使用するジャガイモ等の組換え植物体に関するものである。本発明は、目的ペプチドをコードする遺伝子をノーウォークウイルス外皮蛋白遺伝子と融合させ、当該遺伝子を植物体に導入・発現させる組換え植物体を作出し、この植物体を経口投与して、その有効な機能を発揮させるものである。
植物発現用遺伝子を導入し得られた再分化系統の葉に、5倍量のPBS-T緩衝液〔135mM塩化ナトリウム、1.5mMリン酸二水素ナトリウム、2.7mMリン酸水素二ナトリウム、0.05%(v/v)Tween20、pH7.2〕を加え試料を調製し、粗汁液とした。本材料は抗ノーウォークウイルス血清を用いたELISA検定に供した。抗Norwalk like virus 血清(ウサギポリクローナル抗体:国立感染症研究所より分与)又は抗Norwalk like virus抗体(マウスモノクローナル抗体)を、0.05M Carbonate-Bicarbonate緩衝液(15mM 炭酸ナトリウム、35mM炭酸水素ナトリウム、2.5mMアジ化ナトリウム)で希釈し、ELISAプレート(Maxisorp; Nunc)に加えた後、37℃で3時間プレートに固相化した。固相化プレートをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄した後、調製した組換え植物体の葉及び種子の粗汁液を加え4℃で一晩インキュベートした。このプレートをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄した後、抗NLV HRPO conj.を順に加えた。このプレートをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄した後、o-phenylenediamineを基質として加え、室温で30分間反応させた。反応は停止液(5% sodium lauryl sulfate)で停止後、493nmの吸光値をマイクロプレートリーダー(Bio Rad model 2550 EIA reader)で測定した。
Calici-LRE1遺伝子のジャガイモへの遺伝子導入をゲノミックPCR法により確認した。ジャガイモの葉からの全DNA抽出及びゲノミックPCRにはREDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit (SIGMA)を用いた。作出した再分化系統の葉から抽出した全DNAを鋳型に用い、Calici-LRE1遺伝子の塩基配列を基に2種類のプライマーを設計し{(CaL553:5'−TTGTACACTCCTCTC−3':配列2)及び(CaL1423:5'−AGTGGAGTAAGGCAG−3':配列3)、ゲノミックPCRを行った。即ち、抽出した植物の全DNA(4μl)を鋳型とし、導入遺伝子の塩基配列を基に設計したプライマー(最終濃度0.4μM)及び、REDExtract-N-Amp PCR reaction mix(10μl)を用い、DWで全容量を20μlにしPCRを行った。PCR反応は、94℃で3分間の後、94℃30秒間、55℃で30秒間、72℃で1.5分間を1サイクルとして30サイクルを行い、72℃で10分間伸長反応を行った。この反応にはサーマルサイクラー (MJ RESARCH DNA Engine PTC-200)を使用した。結果、アガロースゲル電気泳動パターンでは、目的の大きさ(約870bp)の位置に再分化系統由来のバンドが得られた。陰性対照として用いた非組換えジャガイモ由来のバンドは同様の位置に確認されなかった(図3)。この結果より、ジャガイモへの原虫抗原キャリアシステム遺伝子の導入が確認された。
Calici-LRE1遺伝子を導入したジャガイモの葉を、乾燥重量とて生重量の約1/12になるまで凍結乾燥(共和真空技術株式会社製RLE-204を用いて48時間工程で実施)した。乾燥した葉を、パウダー状に磨砕後、鶏用配合飼料(船橋農場製)と混合して、経口投与材料とした。
Claims (12)
- 免疫原性、機能性等を有する目的ペプチドを経口投与により生体の目標部位に運搬する機能を有する経口キャリア手段であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス(NLV:Norwalk virus)外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させた組換え植物体を有効成分とすることを特徴とする上記経口キャリア手段。
- 目的ペプチドが、免疫原性ペプチドないし機能性ペプチドである、請求項1に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
- 免疫原性ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1である、請求項2に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
- 目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号1で示される組換え遺伝子である、請求項1に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
- 融合させた遺伝子をジャガイモに導入・発現させた組換え植物体を使用する、請求項1に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
- 融合させた遺伝子を導入・発現させた組換え植物体を、更に目的ペプチドを抽出・精製して使用する、請求項1に記載の目的ペプチドを経口投与するためのキャリア手段。
- 目的ペプチドを経口投与により生体の目標部位に運搬する機能を有する組換え植物体であって、目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス(NLV:Norwalk virus)外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子を植物体に導入・発現させたことを特徴とする上記組換え植物体。
- 目的ペプチドが、免疫原性ペプチドないし機能性ペプチドである、請求項7に記載の上記組換え植物体。
- 免疫原性ペプチドが、ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1である、請求項8に記載の上記組換え植物体。
- 目的ペプチドをコードする遺伝子とノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を融合させた遺伝子が、配列番号1で示される組換え遺伝子である、請求項7に記載の上記組換え植物体。
- 融合させた遺伝子を導入し・発現させた組換え植物体が、ジャガイモである、請求項7に記載の上記組換え植物体。
- ロイコチトゾーン・カウレリー第2代シゾント由来の免疫原性ペプチドLRE1をコードするLRE1遺伝子及びノーウォークウイルス外被蛋白質遺伝子を連結した、配列番号1で示されることを特徴とするCalici-LRE1抗原組換え遺伝子。
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