JP2005315593A

JP2005315593A - 尿中有機酸を分析するための遠心チューブ及びこれを用いた分析方法

Info

Publication number: JP2005315593A
Application number: JP2004130659A
Authority: JP
Inventors: Yukio Yokoyama; 幸男横山
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-04-27
Filing date: 2004-04-27
Publication date: 2005-11-10

Abstract

【課題】尿中の有機酸を分析するために、ウレアーゼを用いて尿中に大量に含まれ分析を妨害する尿素を分解する前処理を行うためには、酵素消化後にエタノールを加えて除蛋白する必要がある。本発明は、一段階の前処理で尿中の有機酸を検出するための遠心チューブ及びこれを用いた尿中有機酸の分析方法を提供する。
【解決手段】ウレアーゼを担持させた遠心チューブを用い、この遠心チューブに被検者の尿を入れて攪拌し、インキュベートした後、遠心して得られたろ液を分析することにより、一段階の前処理で尿中の有機酸を検出することができる。
【選択図】なし

Description

この発明は、尿中の有機酸を分析するための遠心チューブ及びこれを用いて尿の前処理を行い尿中有機酸を分析する方法に関する。

体内に摂取された栄養素は複雑な代謝を経て分解されるが、代謝異常症の患者ではその分解酵素が欠損あるいは減少しているために代謝が行われず、尿中に病気由来の有機酸が増加する。現在、先天性代謝異常症の化学診断ではこれらの患者尿を用いて尿中に増加している有機酸をGC/MSにより分析している。ただし、この方法は、有機溶媒による除タンパクののち、上澄みを誘導体化する必要があるなど非常に煩雑である。
一方、液体イオン化質量分析法(LI-MS)では尿のような複雑な混合物試料でも簡単な前処理のみで容易に短時間で分析でき、さらに誘導体化の必要がなく直接分析できる特徴を持つ（非特許文献１）。しかし、LI-MSで代謝異常症患者の尿を直接測定すると大量成分の尿素の[M+H]+や[2M+H]+などがそれぞれm/z 61、121に現れるだけで尿中に増加しているはずの有機酸のピークはほとんど観測できない。これは尿素のプロトン親和力が有機酸のそれよりかなり高いためで、尿中の有機酸の検出感度を増大させるためには尿素を効率よく除去する必要がある。同様にGC/MS分析においても共存する尿素が有機酸の抽出や誘導体化及びGC分離検出に影響することが知られている（非特許文献２）。
このため、尿中の有機酸を分析する場合に、ウレアーゼを用いて尿中に大量に含まれ分析を妨害する尿素をアンモニアと炭酸ガスに分解する前処理を行う方法が知られている（非特許文献２）。
J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. vol.43, No.4, page 189-201 (1995) 臨床検査 vol.44, No.1, page 57-67 (2000)

しかし尿中の有機酸を分析するためにウレアーゼを利用して尿の前処理を行う際には、酵素消化後にエタノールを加えて除蛋白する必要がある。更に、有機溶媒を加えて沈殿を形成させる除蛋白法は、大量の蛋白が沈殿する際に分析目的成分が共沈する可能性が高く、正確な定量ができない恐れがある。

発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討した結果、ウレアーゼを担持させた遠心チューブを用い、この遠心チューブに被検者の尿を入れて攪拌し、インキュベート後、遠心して得られたろ液を分析することにより、一段階の前処理で尿中の有機酸を検出することができることを見出した。
本発明では限外ろ過膜を使用したが、この方法は蛋白の沈殿を形成せずに、超遠心により分子量の大きな蛋白質をろ別し、膜の洗浄も可能なので、尿中成分の回収率が高い利点がある。通常は、バッチで酵素消化した後に、試料を限外ろ過膜に移して遠心にかけるが、本発明では、限外ろ過膜チューブの中で簡単に酵素消化を行うことができるように、必要単位数の酵素をあらかじめ担持した限外ろ過膜チューブを開発した。

即ち、本発明は、限外ろ過膜を備えたフィルターカップと回収チューブとから成り、遠心時に試料が限外ろ過膜を通過するように構成された遠心チューブであって、該フィルターカップ内にウレアーゼを担持させ、該限外ろ過膜の排除限界分子量を３×１０^４以下とすることを特徴とする遠心チューブである。
更に本発明は、被検者の尿をこの遠心チューブに入れ攪拌する段階、この遠心チューブをインキュベートする段階、この遠心チューブを遠心する段階、及びこの通過液を分析する段階から成る尿中有機酸の分析方法である。

本発明の遠心チューブを用いて尿の前処理を行うと、尿素の分解と除蛋白を一本のチューブ内で行うことが可能になった。更に試料に緩衝液を添加しするとより高い尿素の分解率が得られる。また、インキュベートと超遠心の時間を合わせて15〜20分程度で済み、従来法より操作が簡便で迅速であり、除蛋白に有機溶媒（エタノール、アセトンなど）を使う必要が無い。更に、本発明の方法によれば内因性のたんぱく質の除去も同時に行われる。本発明の方法は再現性の高い検査方法として、臨床化学、医学、生化学、化学診断、などの現場で有効である。

本発明の検査対象である疾患及び有機酸（カッコ内に示す）として、高乳酸血症（乳酸、ピルビン酸、3−ヒドロキシ酪酸など）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニン、フェニル酢酸、フェニル乳酸、フェニルピルビン酸など）メチルマロン酸血症（メチルマロン酸、2‐メチル‐3ヒドロキシ酪酸、3‐オキソ吉草酸など）、ジカルボン酸尿症（C6〜C10ジカルボン酸であるアジピン酸、スベリン酸、セバシン酸）、マルチプルアシルCoA脱水素酵素欠損症（コハク酸、アジピン酸、スベリン酸などのジカルボン酸類やケトーシスによる3‐ヒドロキシ酪酸など）等を挙げることができる。

本発明の遠心チューブは、フィルターカップと回収チューブとから成る。フィルターカップは限外ろ過膜を備え、試料（尿）が投入される容器であり、その名称はこれに限られない。回収チューブは、遠心時に試料がフィルターカップに備えられた限外ろ過膜を通過したろ液を回収するための容器であり、その名称はこれに限られない。
この遠心チューブとして、例えば、容積0.45〜15mL程度の回収チューブに限外ろ過膜を底部に張った容積0.15〜5mL程度のフィルターカップを入れた二重構造の遠心チューブを用いることができる。
フィルターカップは検査対象である尿が0.1〜1mL程度入れられるものが好ましい。

ウレアーゼはフィルターカップ内に担持される。ウレアーゼはフィルターカップのいずれの部位に担持されてもよいが、特に壁面や限外ろ過膜に担持させるのが好適であり、限外ろ過膜に担持させることが最も簡便である。即ち、尿が限外ろ過膜を通過する以前に担持したウレアーゼと反応できるような場所に、ウレアーゼが担持されている必要がある。
壁面にウレアーゼの溶液を塗布し風乾、乾固したり、限外ろ過膜に所定濃度のウレアーゼ溶液を添加し、風乾、乾固することにより、ウレアーゼを担持することができる。

限外ろ過膜の排除限界分子量は３万以下、好ましくは0.5〜3万がより好ましい。ウレアーゼは会合し易くその分子量は約3万程度であると考えられるため、排除限界分子量が約３万以下であればろ過によりウレアーゼが排除される。

ウレアーゼの担持量は、遠心チューブ（フィルターカップ）に含み得る尿量を40μLとした場合に、好ましくは０．２〜４０単位、より好ましくは１〜５単位、最も好ましくは約４単位である。１単位とは１分間に１μmolの基質を変換させる量をいう。試料（尿）量を40μLとすると新生児尿中の尿素（基質）平均濃度の３倍のモル量は2.4μmolであり、理論上基質を変換させる単位数は約3 単位で十分ある。

このような遠心チューブを用いた尿中の有機酸の分析の手順の一例を示す。
１）まず、被検者の尿をこの遠心チューブに入れ攪拌する。尿のみ入れてもよいが、水で溶解してもよく、特にｐＨが約6.5〜7.5、特に約７.0の緩衝液を加えることが好ましい。この段階で遠心チューブを攪拌することにより、ウレアーゼが試料液に溶け出し、ウレアーゼと尿素とがよく混合される。
２）この遠心チューブをインキュベートする。この段階で、ウレアーゼが尿素を分解する。このときの温度は好ましくは３７℃であり、時間は好ましくは５〜１０分程度である。
３）この遠心チューブを遠心（特に、超遠心）する。超遠心は、10000〜15000gで5〜20分程度行うことが好ましい。
４）この通過液を分析する。分析方法に特に制限はなく、目的に従って適宜選択すればよい。例えば、GC/MS分析、液体イオン化質量分析、LC、LC/MS等、目的の有機酸の分析に適した方法を用いればよい。

以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。

排除限界分子量3万の限外濾過膜（ミリポア製ウルトラフリー 0.5ml用）にミリQ水100μLを滴下し11000Gで5分間洗浄を2回繰り返した。
一方、ウレアーゼ標品（シグマ製ウレアーゼタイプIII、0.45gで20000単位）0.023g（2000単位）を25mlの水に溶解し4〜10℃で保存した。
上記限外ろ過膜にこのウレアーゼ溶液10μLを塗布し、室温で乾燥した(4単位)。
この限外ろ過膜をフィルターカップに装着し、回収チューブと組み合わせ遠心チューブとした（試料容積1.5ml）。

一方、尿素（和光純薬製特級）を100℃の乾燥機内で1〜2時間加温後、デシケーターの中で放冷した。これを6.417gとり、沸騰させ放冷したミリQ水で溶解し100mLとした。使用する際はこれを6 mLとり、沸騰させ放冷したミリQ水で100ｍＬに調製した。得られた尿素標準溶液の最終濃度は64.4mMであった。
この尿素標準溶液を40μLとり、上記フィルターカップに入れた。これを試験管ミキサー（メモリ７）で、溶液の高さが変わらない程度にミキサーの表面に軽くあてるようにして、1分攪拌した。
その後、この遠心チューブを37℃の恒温層に入れ、10分間インキュベートした。
この遠心チューブを遠心分離機（トミー製MCX-150）に装着し、超遠心（11000RPM）に５分間かけた。更に純水40μlを4回通して(合計160μl)限外ろ過膜を洗浄した。

通過液（ろ液）を50μLずつメスフラスコに入れ、サリチル酸ナトリウム溶液、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム溶液の順にそれぞれ4 mL入れ、水で50mLに調整し、室温に1時間放置した。
この溶液の一部を1cmのセルに移し、波長660?における吸光度を測定した。ブランクとして水に同様の操作を行って吸光度を求めた。この吸光度から、予め所定の濃度のアンモニア水を用いて作成しておいた検量線を用いてアンモニアの濃度を求めた。
その結果、ｐH9.8、吸光度0.2957、NH₃回収量64.64μg、尿素分解率73.8%であった。

ウレアーゼの消化最適pHは6.5付近であるが、アンモニアが生成することでpHは上昇しウレアーゼが失活してしまう。そのため、本実施例では中性付近の緩衝液（1 Mのリン酸緩衝液（pH6.9））を加え、実施例１と同様の操作を行い、尿素の分解率を測定した。
その結果、ｐH7.2、吸光度0.3579、NH₃回収量78.99μg、尿素分解率90.2%であった。

排除限界分子量3万の限外濾過膜にウレアーゼ担持量を0.4単位とし、尿素標準溶液の最終濃度を5mMとして、実施例１と同様の試験を行った。
その結果、吸光度0.06268、NH₃回収量3.584μg、尿素分解率78.6%であった。
なお、尿素の分解率は精製したアンモニアを測定して計算したため、アンモニアの揮散により分解率が100%にならないと考えられ、実際は緩衝液を入れなくとも90%程度は分解していると考えられる。

液体イオン化質量分析法による有機酸代謝異常症の化学診断では、尿試料を直接昇温分析して疾患由来の有機酸を検出するが、尿素が共存すると検出を妨害し診断有機酸の存在を見逃す恐れがある。本法で前処理した尿では、尿素が有効に分解されるので、メチルマロン酸血症や高乳酸血症のメチルマロン酸や乳酸のピークが有意な強度で観測された。尿のGC/MS分析法でも、尿中の尿素が抽出や誘導体化反応に強く影響するので、その前処理として極めて有効であると考えられる。

Claims

限外ろ過膜を備えたフィルターカップと回収チューブとから成り、遠心時に試料が限外ろ過膜を通過するように構成された遠心チューブであって、該フィルターカップ内にウレアーゼを担持させ、該限外ろ過膜の排除限界分子量を３×１０^４以下とすることを特徴とする遠心チューブ。
ウレアーゼの担持量が試料に含まれる尿４０μｌあたり０．２〜４０単位である請求項１に記載の遠心チューブ。
ウレアーゼが限外ろ過膜に担持された請求項１又は２に記載の遠心チューブ。
被検者の尿を請求項１〜３のいずれか一項に記載の遠心チューブに入れ攪拌する段階、この遠心チューブをインキュベートする段階、この遠心チューブを遠心する段階、及びこの通過液を分析する段階から成る尿中有機酸の分析方法。