JP2005298371A - アンタゴニストポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アミノ酸配列中に
Leu-Tyr-Ala-Argからなる配列を少なくとも有するポリペプチド又はその塩を上記FGF-5阻害剤とする。
Description
このため、FGF-5アンタゴニストの育毛剤への実用化に向けて、より強いアンタゴニスト活性をもつペプチドが要望されている。
(2)下記(I)〜(VII)のいずれかに記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記(1)に記載のポリペプチド又はその塩。
(I) Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(II) Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
(III) Leu-Tyr-Ala-Arg
(IV) Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(V) Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
(VI) Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(VII)
Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
(3)上記(1)又は(2)に記載のポリペプチド又はその塩を含有することを特徴とする、繊維芽細胞成長因子5(FGF-5)阻害剤。
(4)上記(1)又は(2)に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、FGF-5が原因で生じる疾患に対する治療薬剤。
(5)上記(1)又は(2)に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、育毛剤
以上のことから本発明によれば、より低濃度で活性を示し、かつ特異性の高いFGF-5阻害剤を提供することが可能となり、FGF-5が原因で生じる疾患の予防乃至治療剤、特に育毛剤等の開発に大いに貢献することができる。
(I) Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(II) Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
(III) Leu-Tyr-Ala-Arg
(IV) Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(V) Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
(VI) Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(VII)
Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することができる。また、通常の遺伝子発現操作等の生物学的手法に従って、上記ポリペプチドをコードするDNA配列を含む組み換えベクターを製造した後、該ベクターにより形質転換された細胞、例えば微生物を調製し、該形質転換対を培養した培養物から所望のポリペプチドを分離精製することもできる。
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
同実施例2は、FGF-5によるR1c/Ba/F3細胞の細胞増殖に対する本発明のポリペプチドの阻害活性をアミノ酸配列(VIII)のペプチドと比較して示すとともに、R1c/Ba/F3細胞のIL-3による細胞増殖活性に対しては、本発明のポリペプチドは阻害活性をもたないことを示すものである。
また、実施例3は、特許文献2に記載されている、マイクロタイタープレートを用いたFGFR-1(III)cの細胞外ドメインをイムノグロブリンFc部位と結合したリコンビナントキメラ蛋白と、該レセプターリガンドであるFGF-5を用い、本発明ポリペプチドのレセプター結合活性をFGF-5のレセプター結合に対する阻害活性として測定し、構造式(VIII)のペプチドと比較して示すものである。
R1c/Ba/F3細胞は以下の参考文献1に記載されているそれ自体公知の方法に従い作成した。すなわちヒトFGFR-1(III)cプラスミド(参考文献2)を電気せん孔法によりBa/F3細胞に挿入した。10% FBS、500 μg/mlの抗Antibiotic G-418 Sulfate(プロメガ社)、10 ng/mlのFGF-1と10 μg/mlのheparinを含むRPMI培地で継代培養して形質転換させた安定なR1c/Ba/F3細胞を得た。
参考文献1;Yoneda, A.,
Asada, M., Oda, Y., Suzuki, M. and Imamura, T., 2000. Engineering of an
FGF-proteoglycan fusion protein with
heparin-independent, mitogenic activity. Nat. Biotec. 18(6):641-644.
参考文献2;Ornitz, DM., Xu,
J., Colvin, JS., McEwen, DG., MacArthur, CA., Coulier, F., Gao, G. and
Goldfarb, M., 1996. Receptor specificity of the fibroblast growth factor
family. J. Biol. Chem. 271(25):15292-15297.
(1) R1c/Ba/F3細胞を10% FBS、500 μg/mlの抗Antibiotic G-418 Sulfateを含むRPMI培地に懸濁した後、96穴の細胞培養用プレートにウエルあたり5 x 104個加えた。
次いで、本発明のアミノ酸配列(I)~(VII)のペプチドと従来の上記アミノ酸配列VIIIのペプチドをそれぞれ濃度を変えて、1.54 x 10-9MのFGF-5、及び5μg/mlのheparin / 10% FBS / 500 μg/mlのAntibiotic
G-418 Sulfate / RPMI培地とともに1ウエルあたり100
μl加え、72時間培養した。 R1c/Ba/F3細胞の増殖活性は、各ウエルにWST-8(和光純薬工業株式会社)液 5μlを加え、さらに3時間培養し、WST-8ホルマザンの産生量に伴う450 nmの発色を測定して求めた。結果を図1に示す。
図1aによれば、上記各ペプチドの添加濃度依存的に発色量が低下し、上記本発明のアミノ酸配列I〜VIIのペプチド、及び従来のアミノ酸配列(VIII)のペプチドは、いずれも、FGF−5による細胞増殖活性を濃度依存的に阻害することを示した。
一方、図1bは、上記(I)〜(VIII)のぺプチドについて、各濃度毎にコントロールに対する発色量を%で求めた結果を示すグラフであり、このグラフより求めた、FGF-5による細胞増殖活性の50%阻害を示すペプチド濃度(IC50)は、それぞれ、アミノ酸配列(I)のペプチドで65 μM、アミノ酸配列(II)のペプチドで 265 μM、アミノ酸配列(III)のペプチドで184 μM、アミノ酸配列(IV)のペプチドで146 μM、アミノ酸配列(V)のペプチドで346 μM、アミノ酸配列(VI)のペプチドで12 μM、アミノ酸配列(VII)のペプチドで56 μMであるのに対して、従来のアミノ酸配列(VIII)のペプチドでは470 μMであり、本発明の上記ペプチドにおける、FGF-5による細胞増殖阻害活性は、従来のペプチドと比べ極めて高いことが明らかとなった。
図2によれば、上記各ペプチドは、添加濃度を変化させてもIL-3によるR1c/Ba/F3細胞増殖に基づく発色変化が殆と起こらず、IL-3によるR1c/Ba/F3細胞の増殖をまったく阻害しなかった。
このことから、アミノ酸配列(I)-(VIII)のペプチドはいずれも特異性の高いFGF-5阻害物であることがわかる。
5 mg/mlのProtein Aを含むDDWを96穴のマイクロタイタープレートにウエルあたり50 ml加え、一晩4℃で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄し100 ml
の1% BSA/PBSを加え二時間室温で放置後、50 mlの0.5 mg/mlのFGFR-1(III)c-Fc-キメラ体/1% BSA/PBSを加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、上記アミノ酸配列(I)〜(VIII)の各ペプチドをそれぞれ濃度を変えて、1.54 x 10-9MのFGF-5及び5 μg/mlのheparin / 10% FBS / RPMI培地とともに、1ウエルあたり50 μl加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、2 mg/mlのヒツジ由来抗ヒトFGF-5ポリクローナル抗体を1ウエルあたり50 ml加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、500倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウマ由来抗ヒツジイムノグロブリン抗体(フナコシ)を1ウエルあたり50 ml加え、一時間室温で放置した。PBS/0.05% Tween 20 により洗浄後、3 mg/mlのペルオキシダーゼ基質(シグマ)と0.01% H2O2を含む0.1M クエン酸緩衝液(pH5.2)を1ウエルあたり50 ml加え、30分間室温で放置した後1M H2SO4を1ウエルあたり50 ml加え、492 nmの発色を測定した。マイクロタイタープレートに結合しているFGF-5結合量に伴うペルオキシダーゼ基質の発色を測定し、ペプチドを加えないときの発色量を100%コントロールとして加えたペプチド濃度毎のコントロールに対する発色量を%で求めた。
図3は、この測定結果に基づき上記(I)〜(VIII)のペプチドについての結果を示すグラフである。
図3によれば、FGF-5のレセプターへの結合量の50%阻害を示すペプチド濃度(IC50)は、それぞれアミノ酸配列(I)のペプチドでは224 μM、アミノ酸配列(II)のペプチドでは 300 μM、アミノ酸配列(III)のペプチドでは667 μM、アミノ酸配列(IV)のペプチドでは195 μM、アミノ酸配列(V)のペプチドでは99 μM、アミノ酸配列(VI)のペプチドでは141 μM、アミノ酸配列(VII)のぺプチドでは123 μM、アミノ酸配列(VIII)では759 μMであった。したがって、本発明のペプチドはFGF−5のレセプターの結合に対する阻害活性も、従来のもの(アミノ酸配列(VIII))より顕著に高い。
Claims (5)
-
アミノ酸配列中に Leu-Tyr-Ala-Argなる配列を有し、かつ繊維芽細胞成長因子5(FGF−5)阻害活性を有することを特徴とするポリペプチド又はその塩。
- 下記(I)〜(VII)のいずれかに記載のアミノ酸配列で示される請求項1に記載のポリペプチド又はその塩。
(I) Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(II) Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
(III) Leu-Tyr-Ala-Arg
(IV) Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(V) Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His
(VI) Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His-Leu-Gln
(VII)
Arg-Arg-Thr-Gly-Ser-Leu-Tyr-Ala-Arg-Val-Gly-Ile-Gly-Phe-His - 請求項1又は2に記載のポリペプチドを含有することを特徴とする、繊維芽細胞成長因子5(FGF-5)阻害剤。
- 請求項1又は2に記載のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、FGF-5が原因で生じる疾患に対する予防又は治療薬剤。
- 請求項1又は2に記載のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、育毛剤
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