JP2005295938A - アンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型の効率的タイピング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】被検者のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の挿入／欠失多型の効率的なタイピングする方法を提供する。
【解決手段】被検者のＡＣＥ遺伝子の挿入／欠失多型をタイピングする方法であって、以下の工程：(a)当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、(b)工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、(c)工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、特定の配列で表される塩基配列を有するプライマー、それぞれ特定の配列で表される塩基配列を有する３種のプライマー、特定の配列で表される塩基配列を有するプローブおよび特定の配列で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、(d)工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、および(e)工程(d)の測定結果に基づいて被験者のＡＣＥ遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、を包含する。
【選択図】なし
【解決手段】被検者のＡＣＥ遺伝子の挿入／欠失多型をタイピングする方法であって、以下の工程：(a)当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、(b)工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、(c)工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、特定の配列で表される塩基配列を有するプライマー、それぞれ特定の配列で表される塩基配列を有する３種のプライマー、特定の配列で表される塩基配列を有するプローブおよび特定の配列で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、(d)工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、および(e)工程(d)の測定結果に基づいて被験者のＡＣＥ遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、を包含する。
【選択図】なし
Description
本発明は、被検者のアンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型をタイピングする方法に関する。
遺伝子多型（gene polymorphism）とは、一つの生物種における個体間の遺伝情報の相違をいい、通常、集団の１％以上の頻度で存在するものを指す。代表的な遺伝子多型として、(1)DNA配列の1箇所の塩基配列が別な塩基に変わっている一塩基多型（SNP:single
nucleotide polymorphism）と、(2)２個から４個の単位の配列が数回から数十回繰り返す、「繰り返し配列」の繰り返し回数の個人差のマイクロサテライト多型（microsatellite
polymorphism）の二つがある。SNPはヒトゲノム上で最も数多く存在する多型で、平均約1000塩基ごとに一箇所の割合で存在し、ゲノム全体では200万箇所以上存在すると考えられる。また、マイクロサテライト多型は3万〜10万塩基に一箇所の割合で存在し、ヒトゲノム全体では約10万個存在すると考えられる。
nucleotide polymorphism）と、(2)２個から４個の単位の配列が数回から数十回繰り返す、「繰り返し配列」の繰り返し回数の個人差のマイクロサテライト多型（microsatellite
polymorphism）の二つがある。SNPはヒトゲノム上で最も数多く存在する多型で、平均約1000塩基ごとに一箇所の割合で存在し、ゲノム全体では200万箇所以上存在すると考えられる。また、マイクロサテライト多型は3万〜10万塩基に一箇所の割合で存在し、ヒトゲノム全体では約10万個存在すると考えられる。
ヒトアンジオテンシン変換酵素（ACE：Angiotensin Converting Enzyme）遺伝子は、図１に示したように第17番染色体長腕（17q23）に位置し、図２に示したように26個のエクソンと25個のイントロンを含む。1990年にRigatらはACE遺伝子の16番目のイントロンに287bpのDNAフラグメントを含む挿入アレル（Ｉアレル：insertion
allele）と欠失アレル（Ｄアレル：deletion allele）とが存在し（以下、ACE遺伝子ID多型という）、これによってII型、ID型、DD型の３つの遺伝子型に分類されること、そして各遺伝子型によって血清ACE濃度が異なり、ＤアレルのヒトのほうがＩアレルのヒトより血清ACE濃度が高いことを報告した。このID多型について、Cambienが心筋梗塞のリスクになると発表して以来、あらゆる病態でこの多型の有無が調査された。その結果、DD型はIgA腎症や糖尿病性腎症などの危険因子であることが判明した。また、高血圧に関しても、1998年のFramingham研究により男性において高血圧と相関することが報告された以外に、日本人においても吹田研究においてHigakiらが男性特異的に高血圧と相関することを報告している。
allele）と欠失アレル（Ｄアレル：deletion allele）とが存在し（以下、ACE遺伝子ID多型という）、これによってII型、ID型、DD型の３つの遺伝子型に分類されること、そして各遺伝子型によって血清ACE濃度が異なり、ＤアレルのヒトのほうがＩアレルのヒトより血清ACE濃度が高いことを報告した。このID多型について、Cambienが心筋梗塞のリスクになると発表して以来、あらゆる病態でこの多型の有無が調査された。その結果、DD型はIgA腎症や糖尿病性腎症などの危険因子であることが判明した。また、高血圧に関しても、1998年のFramingham研究により男性において高血圧と相関することが報告された以外に、日本人においても吹田研究においてHigakiらが男性特異的に高血圧と相関することを報告している。
今後は、各人の遺伝子多型を調べた上で、個人個人にあった予防・治療を可能とするいわゆるテーラーメイド医療の時代が到来すると予測されている。そのような状況下、上記各疾患に対する危険因子の一つとしてACE遺伝子のID多型を簡便に調べる技術が重要となる。従来、ACE遺伝子のID多型のタイピングは、ID多型部位の一部または全部を含む領域をＰＣＲにより増幅後、アガロースゲル電気泳動により増幅断片をサイズに基づいて分離し、それをエチジウムブロマイド等で染色し可視化した上で、増幅断片を調べることにより行ってきた。しかし、電気泳動には数10分の時間を要し、より簡便なタイピング法が求められている。
本発明は、電機泳動を行うことなくACE遺伝子のID多型をタイピングする方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブを用いたTaqMan PCR法により、電気泳動法を行うことなくより簡便に、ACE遺伝子のID多型をタイピングすることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の(1)から(7)である。
(1) 被検者のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の挿入／欠失多型をタイピングする方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、および
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記タイピング方法。
(1) 被検者のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の挿入／欠失多型をタイピングする方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、および
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記タイピング方法。
(2) 配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブを主要構成要素として含有してなる、ヒトアンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型タイピング用キット。
(3)心筋梗塞、心肥大、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症および紫斑病性腎炎からなる群から選択される少なくとも一つの疾患に対する被検者の易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のＡＣＥ遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、および
(f) 工程(e)において得られた結果に基づいて、当該被検者の前記疾患への易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記易罹患性判定方法。
(3)心筋梗塞、心肥大、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症および紫斑病性腎炎からなる群から選択される少なくとも一つの疾患に対する被検者の易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のＡＣＥ遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、および
(f) 工程(e)において得られた結果に基づいて、当該被検者の前記疾患への易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記易罹患性判定方法。
(4) 心筋梗塞、心肥大、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症および紫斑病性腎炎からなる群から選択される少なくとも一つの疾患に対する被検者の易罹患性の判定を、ヒトＡＣＥ遺伝子のＤＤ型、ＩＤ型およびＩＩ型の３種類からなるＩＤ多型のうち、当該被験者のＡＣＥ遺伝子がＤＤ型である場合には、当該被検者は、ＩＤ型およびＩＩ型のヒトに比べると前記疾患に罹患し易いと判定し、当該被験者のＡＣＥ遺伝子がＩＤ型である場合には、当該被検者はＤＤ型のヒトに比べると前記疾患に罹患し難く、ＩＩ型のヒトに比べると前記疾患に罹患し易いと判定し、被験者のＡＣＥ遺伝子がＩＩ型である場合には、当該被検者はＤＤ型およびＩＤ型のヒトに比べると最も前記疾患に罹患し難いと判定する判定基準に基づいて行なうことを特徴とする上記(3)の前記易罹患性判定方法。
(5) 高血圧症の治療又は予防におけるＡＣＥ阻害剤の有効性を予測する方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のアンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、および
(f) 工程(e)において得られた結果に基づいて、当該被検者の高血圧症の治療又は予防におけるＡＣＥ阻害剤の有効性を予測する工程、
を包含することを特徴とするＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のアンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、および
(f) 工程(e)において得られた結果に基づいて、当該被検者の高血圧症の治療又は予防におけるＡＣＥ阻害剤の有効性を予測する工程、
を包含することを特徴とするＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。
(6) 被検者の高血圧症の治療又は予防におけるＡＣＥ阻害剤の有効性の予測を、ヒトＡＣＥ遺伝子のＤＤ型、ＩＤ型およびＩＩ型の３種類からなるＩＤ多型のうち、被験者のヒトＡＣＥ遺伝子がＤＤ型である場合には、当該被検者は、ＩＤ型およびＩＩ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果が高いと予測し、ＩＤ型である場合には、当該被検者はＤＤ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果は低く、ＩＩ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果は高いと予測し、ＩＩ型である場合には、当該被検者はＤＤ型およびＩＤ型のヒトに比べると、ＡＣＥ阻害剤の効果は低いと予測する予測基準に基づいて行なうことを特徴とする上記(5)のＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。
(7) ＡＣＥ阻害剤が、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸キナプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、トランドラプリル、ペリンドプリルエルブミン、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル、ラクトトリペプチド、かつお節オリゴペプチド、いわしペプチドからなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする上記(5)または(6)のＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。
(7) ＡＣＥ阻害剤が、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸キナプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、トランドラプリル、ペリンドプリルエルブミン、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル、ラクトトリペプチド、かつお節オリゴペプチド、いわしペプチドからなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする上記(5)または(6)のＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。
本発明により、電気泳動を行うことなくアンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型を解析することができる方法が提供される。以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のACE遺伝子ID多型タイピング法は、電機泳動を行うことなく多型のタイピングを判定することを特徴とする。ここで、「ヒトACE遺伝子」とは、ヒトアンジオテンシン変換酵素をコードし、ヒト第17番染色体長腕（17q23）にマップされ、NCBIアクセッションナンバーＪ04144として登録されている塩基配列で表されるmRNAをコードする遺伝子をいう。「心筋梗塞」とは、冠動脈の閉塞によってもたらされる心筋壊死をいう。「心肥大」とは、心臓の壁が厚くなり、心臓の重量が増加した状態をいう。「糖尿病性腎症」とは、糖尿病の合併症のひとつで、糖尿病の悪化（高血糖、低血糖の頻発）により毛細血管が痛むことにより引き起こされる腎病変をいう。「ＩｇＡ腎症」とは、慢性糸球体腎炎のうち糸球体メサンギウム細胞と基質の増殖性変化とメサンギウム領域へのＩｇＡを主体とする沈着物とを認めるものをいう。「紫斑病性腎炎」とは、シェンライン・ヘノッホ紫斑病に合併する腎炎症状をいい、紫斑、腹部症状、関節痛の三主徴に加え、巣状増殖性腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、場合により半月体形成を伴う糸球体腎炎像を呈することを特徴とする免疫複合体疾患をいう。「易罹患性」とは、それぞれの疾患への罹り易さをいう。
本発明において、心筋梗塞、心肥大、糖尿病性腎症、IgA腎症、紫斑病性腎炎等ヘの易罹患性判定の基準となる多型は、ACE遺伝子の第16イントロンに存在する。ヒト染色体DNAは、両親から由来する各一対が存在するので、被検者のACE遺伝子のID多型には、両染色体のACE遺伝子とも挿入型であるII型（I型のホモ接合型）、一方の染色体は挿入型でもう一方の染色体は欠失型であるID型（I型とD型のヘテロ接合型）、そして両染色体とも欠失型であるDD型（D型のホモ接合型）の３つのタイプが存在する。ACE遺伝子のID多型が挿入型（I型）である場合の、挿入配列を含むその前後450bpの塩基配列を配列番号１に示した。配列番号１中で、第92番目から第380番目が挿入配列である。
ヒトＡＣＥ遺伝子のＩＤ多型のタイピングは、本発明の(1)配列番号２の塩基配列を含むプライマー、(2)配列番号３の塩基配列を含むプライマー、(3)配列番号４の塩基配列を含むプライマー、(4)配列番号５の塩基配列を含む蛍光標識プローブ、(5)配列番号６の塩基配列を含む蛍光標識プローブを用いるTaqMan
PCR法によって行うことができる。
PCR法によって行うことができる。
TaqManPCR法の原理を図３に示した。TaqManPCR法は蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブ（TaqManプローブともいう）とTaqDNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である。TaqManPCR法で用いるTaqManプローブは約14〜20塩基程度の長さであり、5’末端はFAM、VIC、TET等の蛍光レポーター色素（R）によって標識され、一方3’末端はクエンチャー（Q）によって標識されている。この状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出できない。本法ではPCR反応を同時に行なうが、TaqManプローブの3’末端はリン酸化されているためTaqManプローブからのDNA鎖伸長は起こらない。しかし、このTaqManプローブをＩＤ多型を含む領域を増幅するように設計したプライマーとTaqDNAポリメラーゼとともにPCR反応を行なうと、まずTaqManプローブが鋳型DNAの特異的な配列にハイブリダイゼーションし、同時にPCRプライマーから伸長反応が起こる。しかしこの際、TaqDNAポリメラーゼは5’ヌクレアーゼ活性を有しているため、PCRプライマーの伸長反応が進む際にハイブリダイゼーションをしたTaqManプローブを切断する。TaqManプローブが切断されると蛍光色素がクエンチャーの影響を受けなくなり蛍光を発するようになる。
より具体的には、287bpの挿入配列のあるアレル（Iアレル：挿入型アレル）と挿入配列のないアレル（Dアレル：欠失型アレル）とが存在する場合、287bpの挿入配列の挿入部位より5〜50bpほど上流域に存在する配列（IアレルおよびDアレルの両方に共通して存在する配列）に特異的にハイブリダイズするTaqManプローブはVIC（Ｒ1）で、Iアレルの287bpの挿入配列に特異的にハイブリダイズするTaqManプローブはFAM（Ｒ2）で標識する。この２種類のTaqManプローブをPCR試薬に同時に添加し、タイピングの対象となる鋳型DNAとTaqManPCR反応を行なう。その後、蛍光検出器にてVICおよびFAMの蛍光強度を測定する。その結果、図４に示したように、鋳型がIアレルのホモ接合型（II型）ならばFAMの強い蛍光強度が検出され、VICの蛍光は殆ど検出されない。IアレルとＤアレルのヘテロ接合体（ID型）ならば、FAMとVIC両者の強い蛍光強度が検出される。Dアレルのホモ接合型（DD型）ならばVICの強い蛍光強度が検出でき、FAMの蛍光は殆ど検出されない。このようにして対象DNAサンプルのACE遺伝子のID多型タイピングを行うことができる。
解析の結果、ヒトＡＣＥ遺伝子のＤＤ型、ＩＤ型およびＩＩ型の３種類からなるＩＤ多型のうち、被験者のＡＣＥ遺伝子がＤＤ型である場合には、当該被検者は、心筋梗塞、心肥大、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症および紫斑病性腎炎からなる群から選択される少なくとも一つの疾患に、ＩＤ型およびＩＩ型のヒトに比べると罹患し易いと判定することができ、被験者のＡＣＥ遺伝子がＩＤ型である場合には、当該被検者はＤＤ型のヒトに比べると罹患し難く、ＩＩ型のヒトに比べると罹患し易いと判定することができ、被験者のＡＣＥ遺伝子がＩＩ型である場合には、当該被検者はＤＤ型およびＩＤ型のヒトに比べると最も前記疾患に罹患し難いと判定することができる。
また、解析の結果、ヒトＡＣＥ遺伝子のＤＤ型、ＩＤ型およびＩＩ型の３種類からなるＩＤ多型のうち、被験者のヒトＡＣＥ遺伝子がＤＤ型である場合には、当該被検者は、ＩＤ型およびＩＩ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果が高いと予測することができ、ＩＤ型である場合には、当該被検者はＤＤ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果は低く、ＩＩ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果は高いと予測することができ、ＩＩ型である場合には、当該被検者はＤＤ型およびＩＤ型のヒトに比べると、ＡＣＥ阻害剤の効果は低いと予測することができる。なお、ＡＣＥ阻害剤としては、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸キナプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、トランドラプリル、ペリンドプリルエルブミン、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル等を有効成分とする医薬品のみならず、ラクトトリペプチド、かつお節オリゴペプチド、いわしペプチド（サーデンペプチドともいう）などのオリゴペプチドを含む食品が挙げられるが、これらに限定されない。
上記のヒトACE遺伝子のＩＤ多型をタイピングするためのプライマー及び蛍光標識プライマーを主要構成要素として含むキットも本発明の好ましい実施態様である。以下に、多型タイピング用キットの具体的構成例を示した。
〔ACE遺伝子ID多型タイピング用キット〕
(1) 配列番号２の塩基配列を含むプライマー
(2) 配列番号３の塩基配列を含むプライマー
(3) 配列番号４の塩基配列を含むプライマー
(4) 配列番号５の塩基配列を含む蛍光標識プローブ
(5) 配列番号６の塩基配列を含む蛍光標識プローブ
以上の構成要素には、さらに必要に応じて、各ヌクレオチド混液、酵素反応停止溶液、希釈溶液等を追加補充することができる。
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔ACE遺伝子ID多型タイピング用キット〕
(1) 配列番号２の塩基配列を含むプライマー
(2) 配列番号３の塩基配列を含むプライマー
(3) 配列番号４の塩基配列を含むプライマー
(4) 配列番号５の塩基配列を含む蛍光標識プローブ
(5) 配列番号６の塩基配列を含む蛍光標識プローブ
以上の構成要素には、さらに必要に応じて、各ヌクレオチド混液、酵素反応停止溶液、希釈溶液等を追加補充することができる。
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
遺伝子多型の配列番号2、配列番号３および配列番号４の塩基配列で表されるプライマー並びに配列番号５および配列番号６の塩基配列で表されるプローブ（TaqManプローブ）を当該技術分野において周知の化学合成法により合成した。なお、配列番号５の塩基配列で表されるプローブは、その5’末端を蛍光色素ＦＡＭで標識し、配列番号６の塩基配列で表されるプローブの5’末端は蛍光色素ＶＩＣで標識した。また、両プローブともその3’末端はクエンチャー（消光物質）で標識した。
ＰCRは、DNAテンプレート10
ng/μｌを1μｌ、プライマー(Fw1)10pMを0.1μl、プライマー(Fw2)10pMを0.1μl、プライマー(Rv)10pMを0.1μl、TaqManプローブ(Iアレル特異的)を0.1μl、TaqManプローブ(Dアレル特異的)を0.1μl、Universal
PCR Master Mix(アプライド・バイオシステム社)を5μl、滅菌蒸留水を3.5μl混合液作製後、「95℃10分」を1サイクル、「95℃30秒、59℃1分、72℃1分」を計45サイクルの条件で行った。その後、PCR産物の蛍光色素を検出したところ、事前に電気泳動によるACE遺伝子のID多型のタイピングデータと照合した結果、ACE遺伝子のID多型がI型アレルのホモ接合型（II型）と電気泳動的に判定されたサンプルでは、FAMの強い蛍光強度が検出されVICの蛍光は殆ど検出されず、またI型アレルとD型アレルのヘテロ接合体（ID型）と電気泳動的に判定されたサンプルでは、FAMとVIC両者の強い蛍光強度が検出され、D型アレルのホモ接合型（DD型）と電気泳動的に判定されたサンプルでは、VICの強い蛍光強度が検出でき、FAMの蛍光は殆ど検出されなかった。これにより本発明のプライマーおよびプローブセットを用いたTaqManPCR法によりACE遺伝子のID多型タイピングを効率的に行うことができることが判明した
ng/μｌを1μｌ、プライマー(Fw1)10pMを0.1μl、プライマー(Fw2)10pMを0.1μl、プライマー(Rv)10pMを0.1μl、TaqManプローブ(Iアレル特異的)を0.1μl、TaqManプローブ(Dアレル特異的)を0.1μl、Universal
PCR Master Mix(アプライド・バイオシステム社)を5μl、滅菌蒸留水を3.5μl混合液作製後、「95℃10分」を1サイクル、「95℃30秒、59℃1分、72℃1分」を計45サイクルの条件で行った。その後、PCR産物の蛍光色素を検出したところ、事前に電気泳動によるACE遺伝子のID多型のタイピングデータと照合した結果、ACE遺伝子のID多型がI型アレルのホモ接合型（II型）と電気泳動的に判定されたサンプルでは、FAMの強い蛍光強度が検出されVICの蛍光は殆ど検出されず、またI型アレルとD型アレルのヘテロ接合体（ID型）と電気泳動的に判定されたサンプルでは、FAMとVIC両者の強い蛍光強度が検出され、D型アレルのホモ接合型（DD型）と電気泳動的に判定されたサンプルでは、VICの強い蛍光強度が検出でき、FAMの蛍光は殆ど検出されなかった。これにより本発明のプライマーおよびプローブセットを用いたTaqManPCR法によりACE遺伝子のID多型タイピングを効率的に行うことができることが判明した
本発明、アンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型を解析するためのキットを提供できるので、医療検査キット製造業などにおいて好適に用いることができる。
Claims (7)
- 被検者のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の挿入／欠失多型をタイピングする方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、および
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記タイピング方法。 - 配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブを主要構成要素として含有してなる、ヒトアンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型タイピング用キット。
- 心筋梗塞、心肥大、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症および紫斑病性腎炎からなる群から選択される少なくとも一つの疾患に対する被検者の易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のＡＣＥ遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、および
(f) 工程(e)において得られた結果に基づいて、当該被検者の前記疾患への易罹患性を判定する工程、
を包含することを特徴とする前記易罹患性判定方法。 - 心筋梗塞、心肥大、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症および紫斑病性腎炎からなる群から選択される少なくとも一つの疾患に対する被検者の易罹患性の判定を、ヒトＡＣＥ遺伝子のＤＤ型、ＩＤ型およびＩＩ型の３種類からなるＩＤ多型のうち、当該被験者のＡＣＥ遺伝子がＤＤ型である場合には、当該被検者は、ＩＤ型およびＩＩ型のヒトに比べると前記疾患に罹患し易いと判定し、当該被験者のＡＣＥ遺伝子がＩＤ型である場合には、当該被検者はＤＤ型のヒトに比べると前記疾患に罹患し難く、ＩＩ型のヒトに比べると前記疾患に罹患し易いと判定し、被験者のＡＣＥ遺伝子がＩＩ型である場合には、当該被検者はＤＤ型およびＩＤ型のヒトに比べると最も前記疾患に罹患し難いと判定する判定基準に基づいて行なうことを特徴とする請求項３記載の前記易罹患性判定方法。
- 高血圧症の治療又は予防におけるＡＣＥ阻害剤の有効性を予測する方法であって、以下の工程：
(a) 当該被検者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、
(b) 工程(a)において得られた生体試料からゲノムDNAを分離精製する工程、
(c) 工程(b)において得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号５で表される塩基配列を有するプローブおよび配列番号６で表される塩基配列を有するプローブ存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
(d) 工程(c)の反応後の反応液の蛍光強度を測定する工程、
(e) 工程(d)の測定結果に基づいて被験者のアンジオテンシン変換酵素遺伝子の挿入／欠失多型を判定する工程、および
(f) 工程(e)において得られた結果に基づいて、当該被検者の高血圧症の治療又は予防におけるＡＣＥ阻害剤の有効性を予測する工程、
を包含することを特徴とするＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。 - 被検者の高血圧症の治療又は予防におけるＡＣＥ阻害剤の有効性の予測を、ヒトＡＣＥ遺伝子のＤＤ型、ＩＤ型およびＩＩ型の３種類からなるＩＤ多型のうち、被験者のヒトＡＣＥ遺伝子がＤＤ型である場合には、当該被検者は、ＩＤ型およびＩＩ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果が高いと予測し、ＩＤ型である場合には、当該被検者はＤＤ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果は低く、ＩＩ型のヒトに比べるとＡＣＥ阻害剤の効果は高いと予測し、ＩＩ型である場合には、当該被検者はＤＤ型およびＩＤ型のヒトに比べると、ＡＣＥ阻害剤の効果は低いと予測する予測基準に基づいて行なうことを特徴とする請求項５記載のＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。
- ＡＣＥ阻害剤が、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸キナプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、トランドラプリル、ペリンドプリルエルブミン、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル、ラクトトリペプチド、かつお節オリゴペプチド、いわしペプチドからなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項５または６記載のＡＣＥ阻害剤有効性予測方法。
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