JP2005270007A

JP2005270007A - 安定化酵素及びその製造方法並びにその安定化酵素を用いた材料合成方法

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Publication number: JP2005270007A
Application number: JP2004089118A
Authority: JP
Inventors: Toshiyuki Ito; 敏幸伊藤
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2005-10-06

Abstract

【課題】反応速度、光学選択性に優れ、かつ室温で放置でき、有機溶媒中でも活性を保持する安定化酵素及び酵素の安定化方法を提供すること。また、反応速度、光学選択性に優れた酵素反応を用いた材料合成方法を提供すること。
【解決手段】酵素の緩衝溶液にイオン性液体を加えた後、凍結乾燥することでイオン性液体でコートした酵素となり、室温で放置可能な、有機溶媒中でも活性を保持する安定化酵素となる。この安定化酵素を材料合成反応に用いることにより、反応速度、光学選択性に優れた材料合成方法が提供できる。イオン性液体の中でも特にＢｒｉｊ−ＩＬを基質アルコールに対して１０ｍｏｌ％以下の割合で酵素反応液に加えることが有効である。
【選択図】なし

Description

本発明は安定化酵素およびその製造方法並びにその安定化酵素を用いた材料合成方法に関する。

イオン性液体は一般にイミダゾリウムなどのカチオンと適当なアニオン（Ｂｒ^-、ＡｌＣｌ₄ ^-、ＢＦ₄ ^-、ＰＦ₆ ^-など）との組み合わせで構成され、不揮発性、難燃性、高い熱安定性などの優れた性質を持つ。このためイオン性液体は溶媒抽出や化学反応の溶媒として広く研究されている。

一方、高い選択性をもつ酵素反応は工業的利用価値が高く、例えば、リパーゼは温和な条件で幅広い有機化合物基質と反応し、高い純度をもつ光学活性アルコールや光学活性エステルを与えるので、医薬、農薬、食品分野などの材料の合成手段として有用である。

こうしたことから、イオン性液体を酵素反応の溶媒として応用する研究がいくつか報告されている。

例えば、酵素の選択性向上の研究として、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンを含むイオン性液体中でリパーゼによるアルコールの不斉アシル化反応があり、高い光学選択性を示すことが報告されている（非特許文献１、２参照のこと）。しかし、反応率は通常の有機溶媒を用いた場合に比べて劣るか、あるいはほぼ同じという結果に留まっている。

また、超臨界二酸化炭素溶媒で酵素反応を行う場合にイオン性液体が存在すると酵素が安定化するという報告がある（非特許文献３参照のこと）。

さらに、ポリエチレングリコールで処理したリパーゼが、イオン性液体（１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム＝ヘキサフルオロホスフェート）中で高い活性を示すことが報告されている（非特許文献４参照のこと）。しかし、この方法ではリパーゼの顕著な安定性向上は報告されていない。

さらに、１−ブチル−２、３−ジメチルイミダゾリウム＝テトラフルオロボレートを溶媒に用いればリパーゼを繰り返し使用可能であることが報告されている（非特許文献５参照のこと）。しかし、反応速度、光学選択性をともに大きく向上させることはできていない。

ところで、こうした酵素は、リパーゼなどの加水分解酵素に限らず、一般に、冷蔵庫や冷凍庫など低温で保存しないと失活することが知られており、簡単な処理で安定に酵素を保存する方法が求められている。
Ｔ. Ｉｔｏｈ, Ｎ. Ｏｕｃｈｉ, Ｓ. Ｈａｙａｓｅ, Ｙ. Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ, Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００１, ２６２. Ｔ. Ｉｔｏｈ, Ｎ. Ａｋａｓａｋｉ, Ｋ. Ｋｕｂｏ, Ｓ. Ｓｈｉｒａｋａｍｉ, Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３, ３２, ６５４. P. Lozano, T. De Diego, J. P. Guegan, M. Vaultier, J. L. Ibora, Biotechnol. Bioeng., 2001, 75, 563. Ｔ. Ｉｔｏｈ, Ｙ. Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ, Ｎ. Ｏｕｃｈｉ, Ｓ. Ｈａｙａｓｅ, Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ, ２００３, ２６, ４１. Ｔ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．Ｎａｇａｓａｗａ, Ｍ．Ｇｏｔｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００２, ２４, １３４１.

本発明の目的は、この様な状況に鑑み、反応速度、光学選択性に優れた安定化酵素を提供することである。

本発明の安定化酵素は、酵素反応の反応溶液中にイオン性液体を添加すること、又は、酵素反応を発現する酵素を溶解した緩衝液中にイオン性液体を加えること、により得られ、安定性、反応速度、選択性を向上させた酵素となり、例えば、室温で長時間失活せず、有機溶媒中で高い反応性と選択性を持つ。

本発明の安定化酵素は、前記酵素の有効成分である酵素タンパクが溶解されてなる緩衝液中に酵素タンパクに対して例えば、等モル以上の前記イオン性液体を加えた後、凍結乾燥することで得られ、非常に安定である。

また、本発明の安定化酵素は、酵素を含む反応溶液中にイオン性液体を酵素反応の基質に対して例えば、１０ｍｏｌ％以下の割合で添加することで形成されて成り、容易に形成され得る。

前記イオン性液体としては、Ｂｒｉｊ−ＩＬが好ましく用いられ、また、酵素がリパーゼ類である場合に有効である。

本発明の安定化酵素を用いた材料合成反応は、優れた反応速度、選択性を併せ持つものとなる。

本発明の安定化酵素の製造方法によれば、室温や有機溶媒中では容易に失活してしまう酵素を、容易かつ効率的に安定化することができ、また製造された安定化酵素は、室温で長時間保存できるものとなる。また、本発明の安定化酵素を用いた製造方法により、目的化合物、特に光学活性な有機化合物を、高効率かつ選択的に生産できる。

本発明に好ましく用いられるイオン性液体のカチオンとしては、イミダゾリウムカチオン（化１）、ピリジニウムカチオン（化２）、ピロリジニウムカチオン（化３）、アンモニウムカチオン（化４）、トリアジン誘導体カチオン（化５）が挙げられる。

ただし、（化１）〜（化５）において、Ｒ₁〜Ｒ₁₇はそれぞれＨ、Ｃ、Ｆ、Ｏ、Ｎのうち少なくとも1種類の原子を含む置換基または水素である。

一方、本発明に好ましく用いられるイオン性液体のアニオンとしては、ＢＦ₄ ^-、ＰＦ₆ ^-、ＮＯ₃ ^-、ＲＣＯＯ^-、ＲＳＯ₃ ^-、ＮＨ₂ＣＨＲＣＯＯ^-、ＲＳＯ₄ ^-（ここでＲはＨ、Ｃ、Ｆ、Ｏ、Ｎのうち少なくとも1種類の元素を含む置換基または水素である）が挙げられる。

特に、イミダゾ−ルまたはその誘導体のカチオン(化１)と（化６）で表される硫酸またはその誘導体のアニオン（ここでｎ＝３〜２０であり、Ｒ₁₈は炭素原子１〜３０個のアルキル基）からなるイオン性液体が本発明に用いるイオン性液体として優れている。

本発明は、例えば、酵素タンパクを溶解した緩衝液中に酵素に対して等モル以上のイオン性液体を加えて凍結乾燥し、室温で保存できるイオン性液体処理酵素を調製する方法である。また、本発明は、酵素を含む溶液にイオン性液体を基質に対して例えば１０ｍｏｌ％以下の割合で添加する方法である。このような材料合成方法を用いることにより、酵素の反応速度、選択性を良好に向上させることができる。

例えば、１‐ブチル−２、３ジメチルイミダゾリウムカチオンとＢｒｉｊ−５６から誘導したアルキル硫酸アニオンからなるイオン性液体をリパーゼの溶液に加えれば、大きな安定化、反応加速、選択性向上を実現することができる。

本発明の製造方法により製造した安定化酵素を材料合成方法として用いた場合、例えば酵素としてリパーゼを用い、基質として、ラセミ体２−フェニルエタノール((±)ー１)及び酢酸ビニルを用いた合成反応においては、相対速度１．５％ｃｏｎｖ．／ｈ以上の反応性、Ｅ値１４０以上の光学選択性得られ、また、この安定化酵素は室温で３日間以上失活しない安定性を持つ。

（Ｂｒｉｊ−ＩＬの合成）
図１の（１）及び（２）に示す反応スキームにより、イオン性液体であるＢｒｉｊ‐ＩＬを合成した。

二口ナスフラスコにＢｒｉｊ‐５６５４．６４ｇ（８０ｍｍｏｌ）、及びアミド硫酸３．８８ｇ（４０ｍｍｏｌ）を入れ、１１０℃で２４時間加熱した後、室温で放置冷却したところ、淡黄白色固体が得られた。これが図１の（１）の反応スキームである。

これに１−ブチルー２，３−ジメチルイミダゾリウム＝クロリド７．５４ｇ（４０ｍｍｏｌ）の乾燥アセトン溶液６０ｍｌを加えて５０℃で２４時間攪拌した。続いて、得られたアセトン溶液をセライト濾過して塩化アンモニウムを除き、さらにアセトンで4回洗浄を行った。次に、洗浄したアセトン溶液に活性炭を加えて１０分間室温で攪拌したのちセライト濾過した。濾液を中性の活性アルミナ（タイプI）を充填したカラムに通し、得られたアセトン溶液を濃縮乾固し、これを６０℃、１Ｔｏｒｒで２４時間減圧して溶媒を除去したところ、灰白色固体１３．６ｇが得られた。得られた灰白色固体の融点は３５〜３７℃であり、IRおよび¹H NMR、¹³C NMR測定の結果は以下の通りとなった。これより得られた灰白色個体はＢｒｉｊ−ＩＬと同定された。これが図１の（２）の反応スキームである。
IR(neat) 2916，2851，1468，1350(SO₂逆対称伸縮),1252, 1115(SO₂，対称伸縮)，951，845 ｃｍ^-1.
¹H NMR (500 MHz, 溶媒CDCl₃) 0.80 (3H, t, J=7.4 Hz), 0.88 (3H, t, J= 7.3 H
z), 1.10-1.30 (32H, m), 1.29-1.31 (2H, m), 1.47-1.50 (4H, m), 1.70-1.73 (2H, m), 2.61 (3H, s), 3.36 (4H, t, J= 5.1 Hz), 3.49-3.62 (34H, m), 3.81 (3H, s), 4.00 (2H, t, J=5.1 Hz), 4.07 (2H, t, J=7.8 Hz), 7.31 (1H, s), 7.45 (1H, s)
¹³C NMR (125 MHz, 溶媒CDCl₃) 9.48, 13.20, 13.77, 19.23, 22.30, 25.73, 28.9
8, 29.11, 29.23, 29.31, 31.35, 31.54, 35.06, 48.01, 61.20, 65.78, 69.68, 69.05, 70.19, 71.12, 72.26, 120.17, 122.65, 143.57 ｐｐｍ
（実施例１）
図２に示す反応スキームにより、酵素であるリパーゼによる反応を実施した。

基質として、ラセミ体２−フェニルエタノール((±)ー１)を５０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）、酢酸ビニルを５５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、溶媒としてジイソプロピルエーテル（２．０ｍｌ）、そして酵素としてリパーゼ（ＬｉｐａｓｅＰＳ）を９２５ｍｇ（５０ｗｔ％）、ビーカーに入れて、さらにそこに添加物としてイオン性液体であるＢｒｉｊ−ＩＬを３７ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ：ラセミ体２−フェニルエタノール((±)ー１)に対して１０ｍｏｌ％）加えて３５℃で攪拌した。

反応をガスクロマトグラフィーで追跡し、生成したアセタートと残るアルコールの比率がほぼ1:1になった時点で酢酸エチルを反応溶液に加えて反応を停止し、即座にセライト濾過して酵素を除去し、ろ液を減圧濃縮したのちシリカゲル薄層クロマトグラフィーで精製して(Ｒ)−体アセタート２（図２中の（Ｒ）ー２）と(Ｓ)−体アルコール３（図２中の（Ｓ）ー３）を単離した。

得られた(Ｒ)−体アセタート２と(Ｓ)−体アルコール３の光学純度（ｅｅ２、ｅｅ３）を高速液体クロマトグラフィー（カラム・Chiralcel OD、溶媒・ヘキサン：イソプロピルアルコール＝８：１）により決定し、これらの値から転化率ｃ(％ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ)を以下の数式１により算出した。

算出した転化率ｃ（％ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を反応時間（ｔｉｍｅ）で割った値を相対速度（ｒｅｌａｔｉｖｅｒａｔｅ）と定義し、この相対速度の値により酵素活性の評価を行った。この場合の相対速度は２．３％ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ／ｔｉｍｅ（ｈ）であった。

また、以下の数式２によりＥを定義し、Ｅの値により光学選択性の評価を行った。この場合のＥ値は２００より大きな値であった。結果を表１にまとめる。

表１において、
ａは単離収率、
ｂは高速液体クロマトグラフィーにより決定（カラム・Chiralcel OD、溶媒・ヘキサン：イソプロピルアルコール＝８：１）される光学純度、
ｃは（Ｒ）−２および（Ｒ）−３の光学純度（ｅｅ２、ｅｅ３）から数式１により計算される値、
ｄはガスクロマトグラフィー結果より決定される反応時間２時間に対する％ｃｏｎｖ．／ｈ、
ｅは文献（C. -S. Chen, Y. Fujimoto, G. Girdauskas, and C. J. Sih, J. Am. Chem. Soc., 1982, 102, 7294.）に基づき数式２により計算される値である。

全くエナンチオ選択性が無い場合はＥ＝１となり、実用可能な系でのＥ値は２０以上であり、また、完璧なエナンチオ選択性を示す場合はＥ値が１００以上となる。

（実施例２）
酵素反応の溶媒として、実施例１において用いたジイソプロピルエーテルの代わりに、実施例２ではヘキサンを用い、他の条件は実施例１と同じにした。

その結果を表１に示す。実施例２では、相対速度は１．７％ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ／ｔｉｍｅ（ｈ）であり、Ｅ値は４８０より大きくなった。従って、溶媒がヘキサンの場合でもＢｒｉｊ−ＩＬを添加した系では高い反応速度、光学選択性を示すことが判った。

（比較例１）
比較例１では、実施例１においては添加したＢｒｉｊ−ＩＬを添加せずに酵素反応を行ない、他の条件は実施例１と同じにした。

その結果を表１に示す。比較例１では、相対速度は１．４％ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ／ｔｉｍｅ（ｈ）、Ｅ値は９であった。溶媒にジイソプロピルエーテルを用いた場合には、Ｂｒｉｊ−ＩＬを添加しなければ反応速度、光学選択性とも低いことが判った。

（比較例２）
比較例２では、実施例２においては添加したＢｒｉｊ−ＩＬを添加せずに酵素反応を行ない、他の条件は実施例１と同じにした。

その結果を表１に示す。比較例２では、相対速度は０．９％ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ／ｔｉｍｅ（ｈ）、Ｅ値は１３０であった。溶媒にヘキサンを用いた場合にもＢｒｉｊ−ＩＬを添加しなければ反応速度、光学選択性とも低いことが判った。

表１に示すように、系にＢｒｉｊ−ＩＬを添加しない場合には、相対速度、光学選択性ともに低くなった。すなわちＢｒｉｊ−ＩＬの添加は、リパーゼによるアルコールのアシル化反応の反応加速、光学選択性向上に極めて効果的である。

（実施例３）
ＬｉｐａｓｅＰＳ（Ａｍａｎｏ）１ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．２、１０ｍｌ）に溶かして３５００ｒｐｍで５ｍｉｎ．間遠心分離を行い、セライトを沈殿させた。

次に、上澄み液を５０ｍｌフラスコにとり即座に液体窒素で凍結し、減圧しつつ室温まであげて凍結乾燥法で溶媒を留去して乾燥し、これを対象用ＮａｔｉｖｅＬｉｐａｓｅＰＳとした（収量２８９ｍｇ）。

アルゴン雰囲気下で、３０ｍｌフラスコに、ＮａｔｉｖｅＬｉｐａｓｅＰＳを７．５ｍｇ、ジイソプロピルエーテルを３．０ｍｌ、Ｂｒｉｊ−ＩＬを３６．６ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）、入れて室温で３日間放置した後、実施例１と同様の酵素反応を行った。結果を表２に示す。酵素活性は強く、反応は極めて早かった。

表２において、
ａは３５℃で２時間攪拌し、ガスクロマトグラフィーで検定した結果に基づく値である。生成物である２−フェニルエチルアセタートと基質である２−フェニルエタノールのガスクロマトグラムの面積比はあらかじめ標品を測定することで検定した。転換率は基質がアセタートに転換された割合を重量百分率で示したものである。

（比較例３）
アルゴン雰囲気下、３０ｍｌフラスコに、ＬｉｐａｓｅＰＳを２５ｍｇ（Ｃｌｉｔｅ担持とする、実施例３の結果から、２８９ｍｇ／１ｇが酵素タンパクとされるため、酵素量は約７．５ｍｇに相当)、ジイソプロピルエーテルを３．０ｍｌ、入れて室温で３日間放置した後、実施例１と同様の酵素反応を行った。結果を表２に示す。反応は極めて遅く、１０時間で転化率が数％ｃｏｎｖ．であった。Ｂｒｉｊ−ＩＬを加えないＬｉｐａｓｅＰＳは３日間の室温放置で活性が著しく失われることが判った。

（比較例４）
アルゴン雰囲気下，３０ｍｌフラスコに、ＮａｔｉｖｅＬｉｐａｓｅＰＳを７．５ｍｇ、ジイソプロピルエーテルを３．０ｍｌ、入れて室温で３日間放置した後、実施例１と同様の酵素反応を行った。結果を表２に示す。酵素は完全に失活していた。つまり、Ｂｒｉｊ−ＩＬを加えないＮａｔｉｖｅＬｉｐａｓｅＰＳは３日間の室温放置で活性が完全に失われることが判った。

上記実施例３、比較例３、及び比較例４の結果から、Ｂｒｉｊ−ＩＬを添加したＮａｔｉｖｅＬｉｐａｓｅＰＳは３日間の室温放置の後も活性が保たれることがわかった。これに対して、比較例３及び比較例４では、Ｂｒｉｊ−ＩＬを加えていないので、３日間室温で放置すると酵素活性は著しく低下した。

（実施例４）
ＬｉｐａｓｅＰＳ（Ａｍａｎｏ）１ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．２、１０ｍｌ）に溶かして３５００ｒｐｍで５ｍｉｎ．間遠心分離を行い、セライトを沈殿させた。

次に、上澄み液を５０ｍｌフラスコにとり、この溶液にＢｒｉｊ−ＩＬを２９ｍｇ加えて溶解した。ついで、即座にこれを液体窒素で凍結し、減圧しつつ室温まであげて凍結乾燥法で溶媒を留去して乾燥し、これをＢｒｉｊ−ＩＬ−ｃｏａｔｅｄＬｉｐａｓｅＰＳとした（収量２９７ｍｇ）。

アルゴン雰囲気下、３０ｍｌフラスコに、Ｂｒｉｊ−ＩＬ−ｃｏａｔｅｄＬｉｐａｓｅＰＳを７．５ｍｇ、ジイソプロピルエーテルを３．０ｍｌ、入れて室温で３日間放置した後、実施例１と同様の酵素反応を行った。結果を表２に示す。酵素活性は極めて強く、２時間反応時の反応速度では、比較例３に示したジイソプロピルエーテル中で室温で３日間放置した市販ＬｉｐａｓｅＰＳ(Ｃｌｉｔｅ担持)の反応速度の２６００倍もの大きな反応速度を示した。つまり、Ｂｒｉｊ−ＩＬ−ｃｏａｔｅｄＬｉｐａｓｅＰＳでは室温で３日間放置後も活性が保たれることが判った。

Ｂｒｉｊ−ＩＬの合成スキーム。ＬｉｐａｓｅＰＳによる、ラセミ体２−フェニルエタノール((±)−１)および酢酸ビニルを反応基質とする酵素反応の反応スキーム。

Claims

酵素反応に用いられる安定化酵素であって、該酵素反応の反応溶液中にイオン性液体を添加すること、又は、該酵素反応を発現する酵素を溶解した緩衝液中にイオン性液体を加えること、により得られる安定化酵素。
請求項１に記載の安定化酵素であって、前記酵素の有効成分である酵素タンパクが溶解されてなる緩衝液中に前記酵素タンパクに対して等モル以上の前記イオン性液体を加えた後、凍結乾燥することで得られることを特徴とする安定化酵素。
請求項１に記載の安定化酵素であって、前記酵素を含む前記反応溶液中に前記イオン性液体を前記酵素反応の基質に対して１０ｍｏｌ％以下の割合で添加することで形成されて成ることを特徴とする安定化酵素。
請求項１〜３のいずれかに記載の安定化酵素であって、前記イオン性液体がＢｒｉｊ−ＩＬであることを特徴とする安定化酵素。
請求項１〜４のいずれかに記載の安定化酵素であって、前記酵素がリパーゼ類であることを特徴とする安定化酵素。
請求項１〜５のいずれかに記載の安定化酵素の製造方法。
請求項１〜５のいずれかに記載の安定化酵素を用いた材料合成方法。