JP2005221503A - 生体分子結晶の生成を監視するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】少なくとも１つの蛍光放射源を含んでいる高分子結晶の生成を監視するための方法および装置を提供する。
【解決手段】（ａ）少なくとも１つの蛍光放射源を含んでいる分子種の高分子を溶解してなる溶液塊を、該高分子の高分子結晶への結晶化を生じさせる条件、または該高分子の高分子結晶への結晶化を生じさせると予想される条件にさらす工程、（ｂ）工程ａの溶液塊にコヒーレントな光を照射し、高分子結晶によって散乱した光を、少なくとも１つの所定の空間角度範囲において、散乱光の検出のための手段によって検出する工程、（ｃ）工程ｂの前、工程ｂと同時、または工程ｂの後に、その光放射が前記蛍光放射源の励起に適している光源によって前記溶液塊を照射し、蛍光を検出する工程、を有している方法ならびに装置により実施することが出来る。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光放射源を少なくとも１つ含んでいる生体分子結晶の生成を監視するための方法であって、蛍光放射源を少なくとも１つ含んでいる生体分子を溶解してなる溶液塊を、該生体分子の生体分子結晶への結晶化を生じさせる条件、または該生体分子の生体分子結晶への結晶化を生じさせると予想される条件にさらす工程、その光放射が前記蛍光放射源の励起に適している光源によって前記溶液塊を照射し、蛍光を蛍光の検出のための手段によって検出する工程、および、該蛍光光の検出のための手段によって生成された信号を評価ユニットに供給し、該評価ユニットにおいて該信号を蛍光強度に変換し、該蛍光強度を要求される蛍光強度と比較する工程、を有する方法に関する。

この技術分野において、微粒子またはナノ粒子を含んでいる液体を、例えばレーザによって生み出された光などの時間および空間に関してコヒーレントである光で、多数の不連続な波長で照射し、（後方）散乱による放射を検出して、各照射波長における散乱放射の強度を割り出す方法が、欧州特許出願公開第１０２２５４９号明細書から公知である。これは、動的光散乱法（ＤＬＳ）または光子相関分光法（ＰＣＳ）の一変種であり、異なる波長を使用することによって、とくに多重散乱の影響を補償する目的のための異なる散乱角度での測定が不要になる。この方法により、最終的に、変動の時間依存を測定し、得られた関数の自己相関によって、粒子サイズ分布または粒子サイズの割り出しを実行することができる。さらに、この文献には、この方法を実行するための装置が詳細に説明されている。それらの装置は、基本的に、放射波長（可視光から近赤外まで）が相違する所定の数（２つ以上）のレーザを有しており、それらの光が、例えば光伝導体によってサンプルまで導かれている。後方散乱光が、光伝導体によって同時に集められ、検出されて評価される。

この技術分野において、結晶化テストの能率向上という状況において結晶化テストを最適化するための方法が、国際公開第０２／０８１５０２号パンフレットから公知であり、生体分子種の生体分子を含んでいるゲル形成成分の溶液が、結晶化を促進する他の物質と、当該物質を届けるための自動の装置によって反応させられている。これにより、例えばプレートに多数の液滴として配置された多数の溶液を、能率よく結晶化テストにさらすことができる。

例えばＸ線構造解析の目的で結晶を生成するためなど、生体分子の結晶化テストにおいては、結晶化プロセスを監視することが必要であり、さらに、生体分子結晶を同様に生成されるであろう塩の結晶から区別しなければならない。実際においては、これは、例えば生体分子種を含んでいる溶液を、例えば顕微鏡を使用することによる単純な視覚的手法によって観察することによって行なわれる。通常は生体分子の結晶化に困難が伴い、あるいは適切な結晶化条件を整えることに困難を伴うことから、多数の結晶化テストが必要とされることがしばしばである。従来の結晶化方法においては、上述の高能率の方法も含め、結晶化の成功の確認を、高価につくとともに誤りの可能性が比較的高い作業者による観察によっているため、これが所要時間を大きく決定付ける工程となっている。

したがって、本発明の技術的課題は、生体分子結晶の生成を容易に、迅速に、かつ確実に検出することができ、とくに自動的に検出できる方法および装置を提供することにある。

この技術的課題を解決するため、本発明は、高分子結晶の生成を監視するための方法であって、（ａ）蛍光放射源を少なくとも１つ含んでいる高分子を溶解してなる溶液塊を、該高分子の高分子結晶への結晶化を生じさせる条件、または該高分子の高分子結晶への結晶化を生じさせると予想される条件にさらす工程、（ｂ）工程ａの溶液塊にコヒーレントな光を照射し、高分子結晶によって散乱した光を、少なくとも１つの所定の空間角度範囲において、散乱光の検出のための手段によって検出する工程、および、（ｃ）工程ｂの前、工程ｂと同時、または工程ｂの後に、その光放射が前記蛍光放射源の励起に適している光源によって前記溶液塊を照射し、蛍光を蛍光の検出のための手段によって検出する工程、を有している方法を教示する。

詳しくは、蛍光の検出は、前記溶液塊の二次元蛍光写真として行なうことができる。

本発明による方法は、とくに生体分子に適している。したがって、以下では生体分子結晶に関して説明を行なうが、他の任意の高分子にも適用可能である。

本発明は、基本的には、生体分子結晶の生成を自動的に監視する目的で、それ自身は公知である２つの異なる方法を組み合わせる。コヒーレント光の（後方）散乱の測定が、最終的に、多少なりとも結晶が生成されたか否かを検出し、生成されている場合には、そのような結晶のサイズの検出するために役立ち、蛍光の測定または蛍光写真の撮影が、生体分子結晶を、例えば通常は蛍光放射源を含んでいない塩の結晶と区別するために役に立つ。この組み合わせによって、生体分子結晶の生成を高い確実性で検出でき、さらに塩の結晶の生成を識別することができる。工程ｂにおいて粒子の生成が検出され、かつ蛍光写真において蛍光強度の大きい点領域が見られなかった場合、その粒子は塩の結晶である。一方、工程ｂにおいて、同時に蛍光強度の大きい点領域が観測された場合、その点領域が高分子結晶である。

本発明による方法の自動化は、（ｄ）前記散乱光の検出のための手段によって生成された信号を評価ユニットに供給し、該評価ユニットにおいて該信号を粒子サイズまたはこれに関係する測定値に変換し、該粒子サイズまたは該測定値を、要求される所定の粒子サイズまたは測定値と比較する工程、（ｅ）前記蛍光の検出のための手段によって生成された信号を評価ユニットに供給し、該評価ユニットにおいて該信号を蛍光強度に変換し、該蛍光強度（画像面において解像された蛍光強度、または蛍光写真において蛍光強度が最大である点領域の蛍光強度）を要求される蛍光強度と比較する工程、および、（ｆ）前記粒子サイズが前記要求される粒子サイズよりも大きく、あるいは前記測定値が前記要求される測定値よりも大きく、かつ同時に前記蛍光強度が前記要求される蛍光強度よりも大きい場合に生体結晶が選択される工程を追加することによって、容易に可能である。

粒子サイズを要求される粒子サイズと比較し、あるいは測定値を要求される測定値と比較し、さらに蛍光強度を要求される蛍光強度と比較することによって、（i）結晶が生成されているか否か、および（ii）生成された結晶が生体結晶か否かについて、自動検出が行なわれる。要求される粒子サイズは、きわめて小さい値をとることができ、これによって結晶の生成そのものが検出されるが、この値は、結晶サイズが例えばＸ線構造解析に充分であるように選択してもよい。要求される蛍光強度については、その値が、他の条件を同一とした同じ溶液であるが生体分子が完全に溶液中にある溶液によって放射される蛍光放射の少なくとも２倍である（結晶は、結晶における分子の空間濃度のために、蛍光強度が溶液よりも大になる）。いずれにせよ、両方の条件が満たされたとき、生体結晶化テストの成功を示す信号が生成される。次いで、このような信号を、さらなるプロセスおよび／または自動搬送装置の制御のために使用することができる。

原理的には、本発明による方法は、上述の自動化による変形例も含め、ただ１つの結晶化テストを監視するためだけに使用することができる。しかしながら、同一または異なる生体分子からなる多数の溶液塊を同時または順次に前記工程ａ〜ｆに供した場合、とくに効果的であり、生体結晶の生成の成功に関して迅速な最終結果を得ることができ、さらに前記工程ａの結晶化条件を、種々の溶液塊において同一または異ならしめることができ、これら多数の溶液塊を、好ましくは１つの支持部材上または支持部材中に配置することができる。

適切な支持部材は、例えばいわゆる多穴プレートであり、溶液を収容することができる凹部を多数、例えば９６個有している。そのようなプレートは標準化されており、そのようなプレートを自動で満たし自動で搬送するための多数の自動化装置が市販されている。他の変種においては、支持部材が凹部を有しておらず、その表面がサンプル領域を除いて疎水性であり、サンプル領域が疎水性の領域で包囲されている。このようなプレートは、適切な疎水化コーティングと同様、この技術分野において公知である。これらのプレートを用い、溶液をサンプル領域への液滴として適用し、周囲を囲む疎水性表面ゆえ、液滴の広がり、つまり隣の液滴との混合の恐れが防止される。

溶液塊または凹部あるいはサンプル領域の数は、基本的には、５〜１，０００の範囲であってよく、好ましくは５０〜５００の範囲であってよい。

基本的には、工程ｂと工程ｃの順序は任意であり、例えば同時であってもよい。これにより、工程ｂおよびｃを、工程ｃの後に工程ｂまたは工程ｂの後に工程ｃで続けざまに行なった場合、本発明による高い能率と装置の著しい小型化が、同時に達成できる。このとき、例えば溶液塊へと向けられた光伝導体を、両方の工程のために使用することができ、これらの工程のために別個の光伝導体を設ける必要はない。

工程ｂは、種々の変種にて実行することができる。生成される結晶が少数のみである場合、１つの波長のコヒーレント光のみを使用し、１つの（後方）散乱角度のみについて散乱光の検出を実行するだけで充分かもしれない。ごくわずかの結晶しか存在しない場合、一方では多重散乱の確率が小さくなり、他方では、単位体積あたりの結晶の数が少ないため、ブラウン運動にさらされた結晶の平均自由行程長さが小さくなることによって誤差が小さくなる。結果における誤差は、とくに単位体積あたりの結晶の数が多いときには、コヒーレント光を別個の異なる波長で照射し、選択された波長について（後方）散乱光の強度の変動を測定すれば、防止することができる。異なる波長での測定は、同時に行なうことができ、あるいは順次に行なうことができる。同時測定においては、基本的には順次測定も同じであるが、一次光の照射および散乱光の検出は、ただ１つの光伝導体によって行なうことができる。これは、検出器側において、波長に応じた適切な分解能を必要とする。

しかしながら、各波長ごとにそれぞれ１つの一次光伝導体および／または各波長ごとにそれぞれ１つの散乱光伝導体を使用することも可能であり、これにより検出器側において所望の波長をフィルタ処理によって選び取るための出費を減らすことができる。原理的には、例えばフーリエ変換アルゴリズムによって、種々の波長について強度の変動の評価を実行することができ、おそらくは高価であるフィルタ装置または分光器を不要にすることができる。

もちろん、代案として、多重散乱および高い粒子密度による誤差を補償するため、ただ１つの波長を照射して、さまざまな所定の後方散乱角度で散乱光を検出することもでき、おそらくはこれが好ましいであろう。

工程ｂのコヒーレント光の生成において、好ましくはレーザを使用することができる。放射波長は、可視光および赤外（ＩＲ）にあることができ、例えば近赤外の範囲にあることができる。工程ｃで使用される光源は、例えば蛍光励起に通常である紫外（ＵＶ）光源であることができるが、原理的には、可視範囲にある光源を除外するものではない。検出される蛍光の波長は、ＵＶ範囲にあることができるが、可視範囲にあってもよい。

工程ｃで使用される光源は、偏光した光を放射してもよい。この場合、蛍光も同様に偏光している。次いで、この蛍光の検出において、外部の光ならびに散乱光の識別を可能にする偏光フィルタを設けることができる。

基本的には、工程ｂのコヒーレント光および／または工程ｃの光源の光を、通常の任意の光学的手段によって溶液塊へと導くことができ、該当する場合には、溶液塊へと合焦することができる。対応する検討が、散乱光および／または蛍光の受け取る場合についても当てはまる。しかしながら、コヒーレント光の光源および／または蛍光励起のための光源および／または散乱光を検出するための手段および／または蛍光を検出するための手段が、一端がこれらに接続され他端が溶液塊へと導かれている光伝導体を有する場合、外部の光の影響がとくに効果的に防止される。次いで、溶液塊へと導かれているこれらの端部を、溶液塊にきわめて近接して位置させることができる。さらに、高能率での実験のために必要とされるきわめて小さくかつ密接に配置された溶液塊についてすら使用することができるきわめて小型の測定ヘッドを生み出すべく、これらの端部をいわば束ねることができる。

蛍光を検出するための手段に関し、溶液塊または少なくともその一部を蛍光写真として、例えば蛍光の波長の範囲において感度がよいＣＣＤなど二次元空間解像度で機能する検出器上に画像化するため、適切な光学部材を設けることが推奨できる。

散乱光を検出するための手段および／または蛍光光を検出するための手段は、原理的には任意であってよい。これらは、例えば半導体検出器であってよく、例えば本質的に波長選択法で動作してもよい。しかしながら、前記手段が古典的な光電子増倍管を有する場合、高い感度が得られる。工程ｃにおいて、例えば光伝導体と蛍光を検出すべくこれに接続された手段との間、あるいはカメラのレンズの前面など、溶液塊と蛍光を検出するための手段との間に、ＵＶフィルタを介装してもよい。

さらに、本発明は、生体結晶の生成を、好ましくは高い能率で監視するための装置であって、基部部材上に配置され、生体分子を溶解させて含んでいる溶液塊を自身の上または中に適用することができる支持部材、前記溶液塊へと向けられたコヒーレントな光のための少なくとも１つの光源、前記溶液塊へと向けられた蛍光放射源の励起のために適した光のための光源、前記溶液塊からの散乱光を検出するための手段、前記溶液塊からの蛍光を検出するための手段、および、前記散乱光を検出するための手段および前記蛍光を検出するための手段に接続された評価ユニット、を有している装置を教示する。基本的に、本発明による方法に関する前記の説明が、本発明による装置についても同様に当てはまる。

高能率での結晶化実験という目的のため、支持部材が、それぞれが１つの溶液塊を収容する複数のサンプル領域を有していることが推奨される。コヒーレント光を生成するための光源、および／または蛍光放射源の励起に適した光を生成するための光源、および／または散乱光を検出するための手段、および／または蛍光を検出するための手段は、共通の光伝導体またはそれぞれに１つ割り当てられた光伝導体を有することができ、該光伝導体の自由端が前記溶液塊に向けられている。例えば、１つの光伝導体を光源の一部に割り当て、１つの光伝導体を検出のための手段に割り当てることも可能である。光伝導体を複数使用した任意の組み合わせが可能である。

光伝導体の自由端は、溶液塊から放射された光であって照射光の軸に対して０°〜１７０°、例えば０°〜８０°の角度にある光を受け取るべく設けることができる。

完全に自動である監視という目的のため、支持部材、または光源、散乱光を検出するための手段、および蛍光を検出するための手段を、操縦装置によって基部部材に対して変位可能にすることができる。これは、溶液塊を測定位置へと動かすことによって連続的に本発明による方法にさらすことができるため、とくに多数の溶液塊を保持する支持部材について推奨でき、自動的に制御されることが推奨できる。ここで、操縦装置の制御は、各溶液塊について本発明による方法の実行が終了したことを知らせ、操縦装置の制御において溶液塊および前記した他の構成部品の相対移動を生じさせるための制御信号を生成する評価ユニットによって、前進信号を生成することによって達成され、調査の済んだ溶液塊が測定位置から離れ、調査すべき未調査の他の溶液塊と置き換えられる。

本発明による方法であって、上述の方法から完全に独立しておりかつ独自の重要性を有しているのが、例えばＸ線回折装置などの装置において、蛍光放射源を含んでいる高分子種からの高分子の高分子結晶の心出しを行なうための本発明の方法であり、高分子結晶を有する結晶ホルダを蛍光放射源の蛍光励起に適した光で照射し、結晶ホルダの領域の蛍光写真を記録し、記録された蛍光写真の空間座標を装置において要求される結晶位置の空間座標に関連付け、蛍光写真における高分子結晶の蛍光画像の空間座標を要求される結晶位置の空間座標と比較する。この比較において、所定の最大の差を超えた場合、結晶ホルダの位置の修正を手動または自動で行なうことができる。後者によれば、自動化によってＸ線構造解析を高い能率で実行することができる。適切な位置決め技法は、そのための各操作装置も含め、当業者にとって公知である。本発明のこの態様は、蛍光高分子結晶が蛍光放射源の濃度ゆえに、周囲を囲んでいる溶液および／または結晶ホルダ（例えば、レーヨンなどの有機重合体材料からなる環）にくらべてきわめて強い強度で蛍光を発するという点にもとづいている。したがって、強い明暗によって、結晶ホルダ内の高分子結晶およびその空間配置を、画像化手法によって確実に識別することが可能であり、Ｘ線回折装置における正確な位置決めのために使用することができる。

用語の定義
生体分子結晶は結晶であり、その結晶学的繰り返し単位が、生体分子で形成されている。生体分子結晶は、所定のＸ線回折パターンを生成し、そこから生体分子を構成する原子の空間配置を割り出すことができる。

生体分子は、通常は、高分子有機化合物であって、天然の生物中に存在し、あるいは、それ自身は天然の生物中には存在しないが、天然に存在する分子成分で形成され、あるいは、天然の分子成分に対して修飾がなされた分子成分から形成されている。後者の成分は、例えば蛍光放射源の導入によって修飾された成分である。そのような成分の例としては、天然アミノ酸、天然アミノ酸の非天然アイソフォーム、化学修飾されたアミノ酸、天然ヌクレオチド、化学修飾されたヌクレオチド、糖質および脂質がある。生体分子の例としては、ペプチド、蛋白質、抗体、受容体、酵素、ステロイド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、前記種類のいくつかの異なるまたは同一の分子からなる複合体があり、細胞核およびウィルスなどの複雑な構造もある。

高分子は、通常は１，０００を上回り、多くの場合１０，０００を上回り、５００，０００およびそれ以上に至る分子量（ＭＷ）を有する。高分子は、一方では、上記生体分子からなる。他方で、高分子は、天然の分子成分または修飾されたそのような成分から作られてはいない有機重合体化合物をも含む。そのような重合体化合物は、同一または異なる有機単量体からの重合生成物、例えばプラスチック材料である。

高分子種または生体分子種という用語は、所定の分子構造を指している。或る種の高分子または生体分子は、同一の分子構造を有し、同一という用語は、化学式または配列に関し、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、通常は９５％を超え１００％までの一致を含んでいる。

蛍光放射源は、例えばベンゼン環または対応するヘテロ環などの芳香族の分子構造を含んでいる。蛋白質においては、ベンゼン環は、例えばトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンに存在する。芳香族ヘテロ環は、さらに、例えばアデニンに存在する。さらに、例えばローダミンまたはデキストラン・ブルーなど、高分子に蓄積または高分子と反応する蛍光分子を加えてもよく、このようにして高分子または生体分子に蛍光放射源が供給される。

溶液塊は、通常は０．００１μｌ〜１０ｍｌ、とくには０．０１μｌ〜０．１ｍｌの範囲であってよい。高能率での実験の場合、溶液塊は、通常は０．０１μｌ〜１００μｌ、特には０．０１μｌ〜５μｌの範囲である。

可視光は、約３８０ｎｍと８００ｎｍの間の波長を有している。ＵＶ光は、３８０ｎｍ未満から約１ｎｍまでの波長を有している。ＩＲ光は、８００ｎｍを上回り１０，０００ｎｍまでの波長を有しており、近赤外の場合には、８００ｎｍを上回り２，０００ｎｍまでの波長を有している。

結晶化条件は、高分子を有する溶液に物質を加え、さらに／または溶液を高分子の結晶化をもたらす、あるいは高分子の結晶化が予想される物理学的または物理化学的条件（温度、圧力、濃度、塩の濃度、など）にさらすことによって達成される。

本発明の状況においては、溶液という用語はゲルをも含んでいる。

例えばＸ線構造解析に適した結晶サイズは、通常は０．００１〜５０μｌ、とくには０．０１〜５μｌの範囲にある。要求される粒子サイズは、通常は上記最小値の少なくとも１０％であり、好ましくは前記指定の範囲内である。

以下では、あくまで実施の例を代表している実施の形態を参照し、本発明をより詳細に説明する。

本発明による装置構造の一例
図１に、本発明による装置が示されている。凹部８を多数有している支持部材７を見て取ることができる。支持部材７は、可視光に対して透明である。凹部８には、それぞれが溶媒に加えて生体分子種の生体分子を含んでいる１つの溶液塊が塗布されている。この例においては、生体分子種はグルコース・イソメラーゼである。他の成分に関しては、実施例２を参照されたい。

支持部材７の上方には、ＤＬＳ装置の必須の構成要素、すなわち測定ヘッド１０を見て取ることができ、２つの光伝導体１１、１２の端部が配置され固定されている。光伝導体１２の他端には、レーザが光学的に接続されている。このレーザによって放出された単色の光が、光伝導体１２によって、図１の中央に位置する溶液塊（測定位置）へと導かれる。光伝導体１１の他端には、例えば光電子増倍管などの高速かつ高感度の検出器が光学的に接続されている。溶液塊から後方散乱した光子が光伝導体１１へと進入し、光伝導体１１を通過して検出器へと至り、測定される。分かりやすさのため図示されていないが、評価ユニットが検出器に接続されており、レーザの波長における後方散乱の強度の時間変動を検出し、これによって最終的に、粒子サイズまたは粒子サイズの分布に関係する信号またはデータが得られる。したがって、光伝導体１１、１２の端部の配置に関し、その構成は、光放射の空間的角度および後方散乱されてくる光子の検出の空間的角度が、溶液塊に合焦されるようになっている。粒子密度または生体分子結晶の密度が低く、かつ測定の正確さに関する要求が低いため、他の後方散乱角度において検出を行なう必要はなく、別の波長の一次光を使用する必要もない。

さらに、支持部材７の上方には、レンズ２およびＵＶフィルタ３を備えたカメラ１が設けられている。ＵＶフィルタは、ＵＶに対しては不透明であるが、より長い波長の蛍光に対しては透明である。蛍光励起のため、約３６０ｎｍで放射を行なうＵＶ光源５が設けられ、その光が、半透過鏡によって、レーザによって放射された単色光が合焦している当該溶液塊へと導かれる。カメラ１によって、溶液塊または溶液塊の一部分の二次元写真が記録される。カメラは、カメラのセンサ上の輝点または輝点群の最大強度を検出する電子式評価回路に接続されている。

最後に、透明な支持部材７の直下に配置され、支持部材７を通してカメラの方向へと光を放射する可視光のための光源４を見て取ることができる。鏡が半透過性であるため、このようにして、カメラ１によって溶液塊の通常の透過光写真を取得および観察することができる。

支持部材７は、可動のテーブルとして構成された基部部材６上に配置されている。基部部材６は、制御装置および基部部材へと機械的に接続された駆動部材によって、支持部材７または基部部材６の主平面と平行な方向に往復移動が可能である。制御装置は、前進信号に従って個々の溶液塊を順次、測定しようとする溶液塊がＤＬＳ装置の焦点に位置することを特徴とする測定位置に移動させる。

生体分子の結晶化
支持部材７の溶液塊において、グルコース・イソメラーゼの析出のための硫酸アンモニウムの最適な析出濃度を割り出すことによって、以下の結晶化テストが実行される。

支持部材７として、リンブロ・プレート（Ｌｉｎｂｒｏ ｐｌａｔｅ）を使用する。リンブロ・プレートの室のそれぞれ２つに、１．５Ｍから始まって２．６Ｍで終わる０．１Ｍ刻みで増加する一連の濃度から、５００μｌの同一の硫酸アンモニウム溶液（緩衝液）を入れた。各濃度段階の溶液塊の対からなる組が得られた。溶液塊の境界にはそれぞれ、封止の目的でシリコン塊の縁を設けた。

並行して、一式のシリコン処理カバー・スリップに、３μｌの蛋白質溶液（３０ｍｇ／ｍｌ緩衝液）および３μｌの硫酸アンモニウム溶液を、中央への適用によって供給した。次いで、慎重に混合を実施した。それぞれに同一である硫酸アンモニウム濃度ゆえ、１対のカバー・スリップが、それぞれ溶液塊の対に対応する。カバー・スリップを上下反転させ、リンブロ・プレートの溶液塊または縁に押し付け、硫酸アンモニウム濃度ゆえの前記配置を観察する。

すべてのカバー・スリップを設置した後、リンブロ・プレートのカバーを塑像用粘土でわずかに持ち上げ、リンブロ・プレート上に設置する。その後、最後に、溶液塊の位置に対するそれぞれの硫酸アンモニウム濃度の配置および記録を実行する。次いで、冷蔵庫中で４℃で１２時間、結晶化実験を実行する。

本発明による方法を用いた高能率の結晶化実験
実施例２の結晶化実験を終えた後、実施例２の支持部材７を冷蔵庫から取り出し、実施例１による装置に設置した。基部部材６の制御装置を初期化して、最初の溶液塊を測定位置へと移動させた。

次いで、制御装置の起動信号によってＤＬＳ装置を動作させ、後方散乱光またはその強度変動の測定を開始する。測定の終了後に得られ、粒子サイズまたは粒子サイズに関係付けられた測定値が、評価ユニットにて、対応する最小の測定値と比較され、この比較によって、所定の最小サイズの粒子の存在が示されたならば、第１の肯定信号が生成される。そうでない場合には、否定信号が生成される。

そこで早速、評価ユニットによってＵＶ光源５およびカメラ１が起動され、蛍光写真が記録される。次いで、評価ユニットは、蛍光写真の写真点または写真点群の強度測定結果を、蛋白質を有するが結晶化していない溶液塊（背景）の蛍光の強度よりも大である最小強度値と比較する。評価ユニットにおけるこの比較により、第２の肯定または否定信号が生成される。

次いで、評価ユニットにおいて、第１および第２の肯定または否定信号が、測定位置にある溶液塊に割り当てられて記憶される。或る溶液塊について第１ならびに第２の肯定信号が記録された場合、これは、この溶液塊において、（塩の結晶化ではなく）蛋白質の結晶化が生じていることを示している。

第１の溶液塊について第１および第２の信号が得られた後、評価ユニットが前進信号を生成し、基部部材６の移動によって次の溶液塊を測定位置へと移動させる。その後、別の前進信号が生成されて、第１の溶液塊に関して前述したプロセスが、今度は２番目の溶液塊のために実行される。これが、各溶液塊に関して第１および第２の信号が得られ、各溶液塊に割り当てられるまで、溶液塊のそれぞれについて繰り返される。

測定の間、あるいはすべての測定の終了後、評価ユニットは、溶液塊を有する支持部材の表示を表示装置上に生成することができ、割り当てられた第１および第２の肯定または否定信号に応じて異なる色で示すことができる。例えば、第１および第２の信号として肯定信号が割り当てられている溶液塊を、結晶化テストの成功を示すべく赤色で表示することができる。例えば、第１の信号が肯定信号であって第２の信号が否定信号である溶液塊を、塩が結晶化しているが蛋白質は結晶化していないことを示すべく青色で表示することができる。例えば、第１および第２の信号が否定信号である溶液塊を、いかなる結晶化も決して生じていないことを示すべく白色で表示することができる。

表示を行なう代わりに、あるいは表示に加えて、第１および第２の肯定または否定信号を、第１および第２の工程信号に従って選択された溶液塊を例えばＸ線構造解析のために用意するなど、さらなる自動化プロセスの制御のために使用してもよい。

全体的に見ると、多数の結晶化実験および引き続く構造解析を、従来に比べてきわめて高速かつ高信頼度で自動的に実行することができる。

本発明による装置を示した図である。

Claims (16)

1. 少なくとも１つの蛍光放射源を含んでいる高分子結晶の生成を監視するための方法であって、
   （ａ）少なくとも１つの蛍光放射源を含んでいる分子種の高分子を溶解してなる溶液塊を、該高分子の高分子結晶への結晶化を生じさせる条件、または該高分子の高分子結晶への結晶化を生じさせると予想される条件にさらす工程、
   （ｂ）工程ａの溶液塊にコヒーレントな光を照射し、高分子結晶によって散乱した光を、少なくとも１つの所定の空間角度範囲において、散乱光の検出のための手段によって検出する工程、および
   （ｃ）工程ｂの前、工程ｂと同時、または工程ｂの後に、その光放射が前記蛍光放射源の励起に適している光源（５）によって前記溶液塊を照射し、該蛍光を蛍光検出のための手段（１）によって検出する工程
   を有している方法。
2. 前記高分子種が、生体分子種である請求項１に記載の方法。
3. （ｄ）前記散乱光の検出のための手段によって生成された信号を、評価ユニットに供給し、該評価ユニットにおいて該信号を、粒子サイズまたはこれに関係する測定値に変換し、該粒子サイズまたは該測定値を、要求される所定の粒子サイズまたは測定値と比較する工程、
   （ｅ）前記蛍光検出のための手段によって生成された信号を、評価ユニットに供給し、該評価ユニットにおいて該信号を、蛍光強度に変換し、該蛍光強度を要求される蛍光強度と比較する工程、および
   （ｆ）前記粒子サイズが前記要求される粒子サイズよりも大きく、同時に前記蛍光強度が前記要求される蛍光強度よりも大きい場合に、高分子結晶が選択される工程
   が追加されている請求項１または２に記載の方法。
4. 同一または異なる高分子種を有する多数の溶液塊が、同時または順次に工程ａ〜ｃまたはａ〜ｆにさらされ、工程ａの結晶化条件が、これら種々の溶液塊について同一または異なることができる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記多数の溶液塊が、１つの支持部材（７）上または１つの支持部材（７）内に配置される請求項４に記載の方法。
6. 溶液塊の数が、５〜１，０００の範囲、好ましくは５０〜５００の範囲にある請求項４または５に記載の方法。
7. 工程ｂおよびｃが、工程ｃの後に工程ｂまたは工程ｂの後に工程ｃで続けざまに行なわれる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 工程ｃで使用される前記光源（５）が、ＵＶ光源である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記散乱光を検出するための手段および／または前記蛍光光を検出するための手段（１）が、一端が該散乱光を検出するための手段および／または該蛍光を検出するための手段（１）に接続され、他端が前記溶液塊へと導かれている光伝導体（１１）を有している請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記散乱光を検出するための手段および／または前記蛍光を検出するための手段が、光電子増倍管を有している請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記溶液塊と前記蛍光を検出するための手段（１）との間に、ＵＶフィルタ（３）が介装されている請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
12. 高分子結晶の生成を、好ましくは高い能率で監視するための装置であって、
    ・基部部材（６）上に配置され、高分子種の高分子を溶解させて含んでいる溶液塊を自身の上または中に適用することができる支持部材（７）、
    ・前記溶液塊へと向けられたコヒーレントな光のための少なくとも１つの光源、
    ・前記溶液塊へと向けられた蛍光放射源の励起のために適した光のための光源（５）、
    ・前記溶液塊からの散乱光を検出するための手段、
    ・前記溶液塊からの蛍光を検出するための手段（１）、および
    ・前記散乱光を検出するための手段および前記蛍光を検出するための手段（１）に接続された評価ユニット
    を有している装置。
13. 前記支持部材（７）が、それぞれに１つの溶液塊を収容するための多数のサンプル領域（８）を有している請求項１２に記載の装置。
14. 前記散乱光を検出するための手段および／または前記蛍光を検出するための手段（１）が、共通の光伝導体（１１）またはそれぞれに割り当てられた光伝導体（１１）を有し、該光伝導体（１１）の自由端が前記溶液塊に向けられている請求項１２または１３に記載の装置。
15. 前記光伝導体（１１）の前記自由端が、前記溶液塊から放射された光であって照射光の軸に対して０°〜７０°の角度にある光を受け取るべく配置されている請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の装置。
16. 前記支持部材（７）、または前記散乱光を検出するための手段および前記蛍光を検出するための手段（１）が、操縦装置によって前記基部部材（６）に対して変位可能である請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の装置。

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