JP2005110686A - 紫外線照射を利用したａｔｐ測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 紫外線照射を利用したＡＴＰ測定方法および装置を提供する。
【解決手段】 サンプルに存在しうるＡＴＰが化学反応可能にサンプルを処理する段階と、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、陽イオンを含むＡＴＰ反応性混合物を前記処理されたサンプルと酸素下で接触反応させる段階と、前記接触反応で発生する発光を３２０〜３７０ｎｍの紫外線で増幅させて４７５〜６７５ｎｍのフォトルミネセンスを生成させる段階と、を含むＡＴＰを測定する方法とすることにより、ＬＣＤや半導体表面のような比較的広い固体表面の異物が生体物質であるか否か（およびその汚染部位まで）を確認することができる。また、特別なサンプリング過程が不要であって非常に速かに現場でインシトゥ分析が可能である。
【選択図】 図２

Description

本発明は、アデノシン５′−トリホスフェート（ＡＴＰ：Adenosine 5'-TriphosPhate）の測定方法およびその測定方法を利用したＡＴＰ分析装置に係り、さらに詳細には、汚染物質が生物体から由来したものであるか否かを判定するためのＡＴＰ測定方法およびＡＴＰ分析装置に関する。

電子機器、精密機械、精密化学品、病院などで微量に発生する汚染の原因が微生物によるものであるか、あるいは単なる有機物質であるかを判断することは、汚染の種類によって除去方法が異なることがあるため、非常に重要な作業である。発見された汚染物質が生物体か否かを決定する方法は、３つの方法に大別される。一番目の方法は、顕微鏡（光学または電子顕微鏡）を利用して、微生物の成長の測定または実際の形態の観察をおこなうことであり、二番目の方法は微生物の特異代謝産物を分析して微生物の生長活動如何を測定することであり、三番目の方法は蛋白質やＤＮＡ等の生体物質を分析することである。

前記３つの方法のうち、三番目の方法である生体物質の分析方法としては、地球上の全ての生命体のエネルギーキャリアとして知られているＡＴＰを測定することによって、生命体の存在有無を確認することが、１９４７年以降、最も感度が高く信頼性の高い方法と考えられ、多くの分野で活用されている。

特許文献１には、ＡＴＰを確認する方法として、ルシフェリンとルシフェラーゼとを利用して下記の反応式１のように反応させて生成される発光（luminescence）を測定する方法が開示されている。

前記発光反応に必要な反応物は、基質であるルシフェリンと、酵素であるルシフェラーゼと、活性化剤であるＡＴＰと、陽イオン（主に、マグネシウム）と、酸素である。全体的な反応は、酵素であるルシフェラーゼが触媒として作用する酸化反応であり、反応の結果、発光が生成される。このような反応は、ＡＴＰに固有の反応であり、他のいかなる化学物質もＡＴＰに代替することができない反応である。また、ＡＴＰは、全ての生命体に存在するため、前記反応により、微生物の存在を速やかに判定することができる。

これまで、前記ＡＴＰ固有の発光反応の発光程度を測定する方法として、発光測定器を利用する方式が最も一般的に利用されており、かつ信頼しうる方法であると考えられてきた。

しかし、前記ＡＴＰ測定方法の最も深刻な欠点としては、サンプルが常に液状で存在しなければならず、サンプリング過程でエラーが発生する確率が高く、分析プロセスに比較的長い時間がかかるという点である。また、ＡＴＰが存在してもそれが極微量だと、生成される発光の強度も非常に弱いため、測定感度の低下が免れないという点も問題である。

特に、前記ＡＴＰ測定方法を固体サンプルに適用する場合には、サンプリングが難しく、微生物の濃度が極めて低いため、前記のような一般生化学反応を適用することは困難であり、分析時間も長くなる虞がある。

また、前記ＡＴＰ測定方法で電子部品のような固体表面のＡＴＰを測定するためには、一般に、図１に段階別に示す方法に従う。すなわち、従来の方法は、一般に、ポリエステル綿棒などを利用したサンプリング段階と、ＡＴＰが存在しない水に前記綿棒を溶解する段階と、ＡＴＰ分泌のためのサンプル処理（たとえば加熱処理）段階と、ルシフェリン／ルシフェラーゼ反応段階と、発光測定器を利用した定量段階と、からなる。しかし、このような方法でＡＴＰを測定する場合には、ＬＣＤ基板や半導体表面のように汚染部位が非常に小さい一方で全体サンプルが非常に大きい場合には、発光分析器から発光情報を得られたとしても、その情報はスペクトルに限定されるので、全体サンプル中でどの部位が汚染されたかを判別することが困難であるという問題点がある。すなわち、汚染部位自体が目で確認できず、実際に、どの部分が汚染されたかについてはほとんど分析が不可能である。したがって、固体表面で具体的にどの部位が生物学的に汚染されているかを把握するためには、既存の方法とは異なる分析技術の開発が切実に要求される。
米国特許第３,９３３,５９２号明細書

本発明が解決しようとする課題は、ルシフェリンを利用した発光反応を利用してＬＣＤ基板や半導体表面のような固体表面でのＡＴＰの存在有無と含量程度と存在位置を測定する方法を提供することである。

また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記方法を利用して固体表面でのＡＴＰ存在有無と含量程度と存在位置を測定するＡＴＰ分析装置を提供することである。

前記課題を解決するために、本発明は、サンプルに存在するかもしれないＡＴＰが化学反応可能となるようにサンプルを処理する段階と、ルシフェリン（luciferin）とルシフェラーゼ（luciferase）と陽イオン（cation）を含むＡＴＰ反応性混合物を前記処理されたサンプルと酸素下で接触反応させる段階と、前記接触反応で発生する発光を３２０〜３７０ｎｍの紫外線で増幅させて４７５〜６７５ｎｍのフォトルミネセンス（photoluminescence:光発光）を生成させる段階と、を含むＡＴＰを測定する方法を提供する。

前記ＡＴＰ測定方法で生成されたフォトルミネセンスは、フォトルミネセント（photoluminescent）撮影装置を利用して撮影することができる。また、前記撮影されたフォトルミネセントイメージは、イメージ処理装置を利用して処理（分析）することによって、ＡＴＰのサンプル内の存在位置を把握するために活用することができる。

前記ＡＴＰ測定方法において、サンプルは液状または固状のサンプルいずれもが可能である。

前記方法において、ＡＴＰが化学反応可能にサンプルを処理する段階は、微生物に存在するＡＴＰを抽出することによってなされるものとすることができる。そのようなＡＴＰの抽出は、塩化ベンザルコニウム（benzalkonium chloride）処理または熱処理によってなされるものとすることができる。

また、前記サンプルを処理する段階は、前記サンプルをリン酸化酵素（phosphorylating enzyme）と反応させて存在するＡＴＰ前駆体をＡＴＰに変換させる段階を含むものとしてもよい。前記リン酸化酵素としては、ホスホクレアチンキナーゼ（phosphocreatine kinase）を利用することができる。

前記陽イオンとしては、マグネシウム、カルシウム、ナトリウムなどを使用しうるが、マグネシウムが最も望ましい。

本発明はまた、前記ＡＴＰ測定方法によってサンプルのＡＴＰの存在有無、含量、位置、またはこれらの組み合わせを測定するＡＴＰ分析装置を提供する。

本発明によれば、液体に比べてサンプリングが相対的に難しいＬＣＤや半導体表面のような固体表面の異物が生体物質であるか否かを確認できる。また、表面積が相対的に広く光学顕微鏡または電子顕微鏡では全体サンプルの汚染状態を判断し難い場合であっても、汚染如何およびその汚染部位まで分かって非常に有用である。また、特別なサンプリング過程が不要であって非常に速かに現場で（インシトゥで）分析が可能である。

本発明のＡＴＰ測定方法は、サンプルに存在するかもしれないＡＴＰが化学反応できるようにサンプルを処理する第１段階と、ルシフェリンとルシフェラーゼと陽イオンを含むＡＴＰ反応性混合物を前記処理されたサンプルと酸素下で接触反応させる第２段階と、前記接触反応で発生する発光（luminescence）を３２０〜３７０ｎｍの紫外線で増幅させて４７５〜６７５ｎｍのフォトルミネセンス（photoluminescence）を生成させる第３段階と、を含む。

従来のＡＴＰ測定方法は、前記第２段階で発生する発光を直接発光分析器で測定する方法に止まったが、本発明者は、第２段階で発生した発光を特定範囲の波長を有する紫外線で増幅させることによって、フォトルミネセンスを生成させてＡＴＰの測定感度を高めただけでなく、フォトルミネセント（photoluminescent）撮影装置によるそのイメージの撮影を可能にした。フォトルミネセント撮影装置による発光イメージの撮影が可能となり、ＡＴＰを有する微生物による汚染部位の判定が可能になった。

前記ＡＴＰ測定方法は、液体だけでなく、固体サンプルにも適用可能である。特に、前記ＡＴＰ測定方法は、従来の方法に比べて固体サンプルに使用する時に特に有効である。前記のように、固体サンプルでは固体サンプル上で前記発光生成反応とその発光の紫外線による増幅反応を直接実施してフォトルミネセント撮影装置で撮影することによって、発光位置を確認できる利点があるためである。液体サンプルの場合にも、生成された発光を紫外線によって増幅させることによって、発光の強度が大きくなるため、ＡＴＰの測定感度が良くなるため、有利である。

前記ＡＴＰ測定方法で、サンプルをルシフェリンを利用して発光反応を可能にするためには、サンプルに存在するかもしれない微生物のＡＴＰが反応できるようにＡＴＰを抽出しなければならない。ＡＴＰを抽出する方法には、塩化ベンザルコニウムで微生物を処理する方法と、熱処理による方法とがある。前記熱処理方法は、加熱コイルでサンプルを直接的に加熱してもよいが、固体サンプルの場合には固体の表面に熱湯を加え、または液体サンプルの場合には液体に直接熱湯を加えてもよい。前記熱処理によってサンプルの温度は約９５〜１００℃となることが望ましい。

前記ＡＴＰ測定方法で、発光生成反応に使われる陽イオンとしては、マグネシウムや、カルシウムや、ナトリウムがあるが、そのうちマグネシウムを使用することが最も望ましい。前記本発明のＡＴＰ測定方法を図２に段階別に示した。

本発明はまた、前記ＡＴＰ測定方法によってＡＴＰの存在有無、含量程度、ＡＴＰの存在位置を測定できるＡＴＰ分析装置を提供する。このようなＡＴＰ分析装置は、サンプルのＡＴＰが化学反応可能に処理するサンプル処理部１と、サンプル内のＡＴＰと反応して発光を生成させる試薬をサンプル処理部上のサンプルに供給する試薬供給部２と、前記試薬とサンプルとの反応で生成される発光を増幅させるための３２０〜３７０ｎｍの紫外線を生成しうる照明部３（光源）と、前記照明部の波長のうち３２０〜３７０ｎｍ波長の紫外線だけを透過するフィルター４と、前記発光の増幅によって生成されるフォトルミネセンスを撮影するためのフォトルミネセント撮影装置５と、前記撮影されたフォトルミネセントイメージを処理するためのイメージ処理装置６と、を含む。

前記ＡＴＰ分析装置で、前記照明部は３２０〜３７０ｎｍ範囲の波長の光を生成することができる光源であれば、いずれも使用可能であり、そのような光源の例としては、ハロゲンランプや、タングステンランプや、水銀ランプがある。

前記ＡＴＰ分析装置で、発光が紫外線によって増幅されて生成されるフォトルミネセンスを測定するために使用可能なフォトルミネセント撮影装置としては、たとえば、ＣＣＤカメラ、または蛍光カメラがある。

本発明の一実施形態による前記ＡＴＰ分析装置の配置およびその測定原理を図３に概略的に示した。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲はこれら実施例に限定されない。

実験例１−吸収波長の選択
ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応で生成される発光が吸収して増幅されることが可能な特定波長を測定するために、紫外線−可視光線分光分析器を利用して測定した。まず、ＡＴＰとルシフェリン／ルシフェラーゼとの比率が１：１０になるように混合した後、混合された溶液１００μｌを最終容量が１ｍｌになるように超純水で希釈した。希釈された溶液を２００〜９００ｎｍ波長の光を利用して吸光する比率を測定した。ＡＴＰを含んでいないルシフェリン／ルシフェラーゼ溶液を対照標準として利用した。
測定の結果、前記ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光反応で生成される発光によって吸収される光は３２０〜３７０ｎｍ波長の紫外線であることがわかった。

実験例２−３２０〜３７０ｎｍ波長の紫外線でのフォトルミネセンス分析
前記実験例１で確認された吸収波長３２０〜３７０ｎｍの光を利用してフォトルミネセンスが生成される領域を確認した。前記実験例１のような方法で製造されたＡＴＰとルシフェリン／ルシフェラーゼ（１：１０）との希釈溶液から発生する発光に３２０〜３７０ｎｍ波長のうち特定波長を励起波長として固定させた後、２００〜９００ｎｍで励起される波長の光の強度（輝度）を測定した。実験例１でのようにＡＴＰを含んでいないルシフェリン／ルシフェラーゼ溶液を対照標準として利用した。
フォトルミネセンスによって励起される光の波長は４７５〜６７５ｎｍの波長を有する可視光線であることがわかった。この結果を図４および図５のグラフに示す。

実施例１−ＡＴＰ分析装置の構成
サンプル処理部と、ルシフェリン／ルシフェラーゼを含有する試薬供給部と、Ａｒｃ光源と、前記光源の波長のうち３２０〜３７０ｎｍ波長の紫外線のみを透過するフィルターと、生成されるフォトルミネセンスを撮影可能な蛍光カメラ（OPTRONICS DEI-470）と、蛍光カメラによって撮影されたイメージを処理できるコンピュータイメージ処理装置（Zeiss KS-400 ver. 3.0）と、を利用して全体ＡＴＰ分析装置を構成した。

実施例２−標準微生物を利用したＡＴＰ分析
製造工程水から分離された２種の菌株を韓国生命工学研究院に分析を依頼して同定した後実験に使用した。１６ｓＲＮＡの分析結果、一つの菌株は、Bacillus cereusの標準菌株（IAM 12605T）と９９.８％の同族関係（family relation）を有しており、さらに他の菌株はPseudomonas saccharophilaの標準菌株（DSM 654T）と９８.３％の同族関係を示した。これら菌株を栄養ブロスで増殖させた後、１０^-7まで希釈した後に濾過するか、または固状で単一コロニーを取って、ＬＣＤカラーフィルター上に付置した。濾過したサンプルの場合は、フィルターの表面全面をＴＬＣ用スプレイを利用して塩化ベンザルコニウム（１０ｍＭ）を噴射した後、再びルシフェリン／ルシフェラーゼ溶液を噴射した。ＬＣＤカラーフィルターのサンプルの場合は、適用された地点に１００℃に加熱した超純水５０μｌを適用した後に１分ほど放置した後、再び１０ｍＭの濃度の塩化ベンザルコニウム５０μｌを適用し、再び１分ほど放置した。ここに、１００μｌのＤ−ルシフェリン／ルシフェラーゼ溶液を加えた後に生成された発光をＡｒｃ光源およびフィルターを利用して３６５ｎｍ波長の紫外線で励起させた後、蛍光カメラでフォトルミネセンスイメージを撮影し、イメージ処理装置を利用して分析した（OPTRONICS DEI-470，Zeiss KS400 ver. 3.0）。
濾過したサンプルの撮影イメージを図６に示し、ＬＣＤカラーフィルター上に適用したサンプルの撮影イメージを図７Ａに示す。図６および図７Ａを参照すれば、微生物が適用された部位が蛍光を帯びていることが確認できる。

実施例３−実際サンプルを利用したＡＴＰ分析
ある関連会社が分析依頼したＬＣＤカラーフィルターを実施例２におけるＬＣＤカラーフィルターのサンプルを処理した方法と同じ方法で処理した後に分析した。
その結果を図７Ｂに示す。図７Ｂによれば、蛍光反応が現れなかったので、その関連会社の分析依頼したＬＣＤカラーフィルターが微生物性の異物によって汚染されていないことが分かる。

比較例１−その他の波長領域でのＡＴＰ分析
２００〜３２０ｎｍの紫外線のみを透過できるフィルターを利用することを除いては、実施例１と同じ方法でＡＴＰ分析を実施した。サンプルは、実施例２の濾過されたサンプルを利用した。
その結果を図８に示す。図８に示すように、何らの蛍光も現れなかった。

本発明による方法および装置は、ＬＣＤや半導体表面のような固体表面中の異物質の存在有無や異物質の種類や異物質の位置などが判定可能であり、電子機器、精密機械、精密化学、病院産業などの分野に適用可能である。

従来のＡＴＰ測定方法で固体表面のＡＴＰを測定するための方法を段階的に表す図面である。 本発明によるＡＴＰ測定方法を段階別に表す図面である。 本発明の一実施形態による前記ＡＴＰ分析装置の配置およびその測定原理を概略的に示す模式図である。 本発明によるＡＴＰ測定時に３２０〜３７０ｎｍの紫外線の照射によって生成されたフォトルミネセンスの波長および強度を分析した結果を表すグラフである。 本発明によるＡＴＰ測定時に３２０〜３７０ｎｍの紫外線の照射によって生成されたフォトルミネセンスの波長および強度を対照標準と比較して分析した結果を表すグラフである。 サンプルを濾過した後にフィルターの表面全面を本発明のＡＴＰ測定方法によって行って蛍光カメラで撮影した写真である。 ＬＣＤカラーフィルターに微生物を接種して本発明のＡＴＰ測定方法によって行って蛍光カメラで撮影した写真である。 関係社から依頼されたＬＣＤカラーフィルターを本発明のＡＴＰ測定方法によって行って蛍光カメラで撮影した写真である。 サンプルを濾過した後にフィルター表面全面を３２０〜３７０ｎｍ波長の紫外線の代わりに２００〜３２０ｎｍの紫外線を利用して本発明のＡＴＰ測定方法によって行って蛍光カメラで撮影した写真である。

符号の説明

１ サンプル処理部
２ 試薬供給部
３ 照明部（光源）
４ 紫外線フィルター
５ フォトルミネセント撮影装置
６ イメージ処理装置
７ 紫外線フィルターによって濾過された３２０〜３７０ｎｍ波長の紫外線
８ 紫外線によって増幅された４７５〜６７５ｎｍ波長のフォトルミネセンスの測定

Claims (6)

1. サンプルに存在するかもしれないアデノシン５′−トリホスフェート（ＡＴＰ）が化学反応できるようにサンプルを処理する段階と、
   ルシフェリンとルシフェラーゼと陽イオンとを含むＡＴＰ反応性混合物を、前記処理されたサンプルと酸素下で接触反応させる段階と、
   前記接触反応で発生する発光を３２０〜３７０ｎｍの紫外線で増幅させて４７５〜６７５ｎｍのフォトルミネセンスを生成させる段階と、を含むＡＴＰを測定する方法。
2. 前記生成されたフォトルミネセンスをフォトルミネセント撮影装置を利用して撮影することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記撮影されたイメージをイメージ処理装置を利用して分析することによって、ＡＴＰのサンプル内の存在位置を把握することを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記サンプルは、固体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. サンプルのＡＴＰを化学反応可能に処理するサンプル処理部と、
   サンプル内のＡＴＰと反応して発光を生成させる試薬をサンプル処理部上のサンプルに供給する試薬供給部と、
   前記試薬とサンプルとの反応で生成される発光を増幅させるための３２０〜３７０ｎｍの紫外線を生成する照明部と、
   前記照明部の波長のうち３２０〜３７０ｎｍの波長の紫外線だけを透過するフィルターと、
   前記発光の増幅によって生成されるフォトルミネセンスを撮影するためのフォトルミネセント撮影装置と、
   前記撮影されたフォトルミネセントイメージを処理するためのイメージ処理装置と、を含み、請求項１ないし５のうち何れか１項に記載の方法によってサンプルのＡＴＰの存在有無、含量、位置、またはこれらの組み合わせを測定できるＡＴＰ分析装置。
6. 前記フォトルミネセント撮影装置は、ＣＣＤカメラまたは蛍光カメラであることを特徴とする請求項５に記載のＡＴＰ分析装置。