JP2005077237A - バイオセンサ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被検試料中の標的物質を検出するためのバイオセンサであって、絶縁膜と、前記絶縁膜の一面側に形成されたゲート電極と、前記絶縁膜の他面側に、前記ゲート電極と対向する部分を隔てて形成されたソース電極およびドレイン電極と、前記ソース電極および前記ドレイン電極相互間の前記絶縁膜の他面側表面に固定された前記標的物質と特異的に相互作用するプローブと、を含むバイオセンサ。
【選択図】 図1
Description
この方法では、相補核酸鎖の相互作用(ハイブリダイゼーション)、抗原−抗体反応、酵素−基質反応、受容体−リガンド相互作用など、生体分子の特異的な親和性を利用して標的物質を固相担体表面に捕捉するので、標的物質に特異的な親和性を有する物質がプローブとして選択される。
プローブは、プローブや固相担体の種類に適した方法によって固相担体表面に固定される。あるいは、固相担体表面でプローブを合成(例えば、核酸伸長反応など)することもでき、いずれの場合もプローブが固定された固相担体表面を被検試料と接触させ、適当な条件下でインキュベートすることにより、固相担体表面でプローブ−標的物質複合体が形成される。
そこで、本発明は、電界効果型トランジスタ(FET)を用いたバイオセンサの利点を生かしつつ上述の問題点を解決すべく、多様な生体分子の相互作用を高感度に検出でき、多数の被検試料をハイスループットに並列処理することができるバイオセンサを提供することを目的とする。
表面ポテンシャルは、表面付近に双極子が存在することにより容易に変化する。例えば、プローブが一本鎖核酸である場合、該プローブは分子内で部分的に二本鎖を形成するため直線状には伸びておらず、分子全体の双極子は比較的小さくなっている。一方、プローブ核酸に、プローブ核酸と相補的な塩基配列を有する標的核酸がハイブリダイゼーションすると、二重らせん構造をとる直線的なプローブ−標的物質複合体に変化するので、複合体全体としての双極子が大きくなることが知られている。このような双極子の変化は核酸間の相互作用に限られず、タンパク質や合成された化合物等を含む相互作用においても、コンフォメーションの変化が生じることによって双極子モーメントが変化する。したがって、FET特性の変化を測定することにより、プローブ−標的物質複合体の形成の有無を検出することが可能となる。
タンパク質は、例えば、酸化シリコン膜表面を各種官能基で修飾したシリコンカップリング剤で表面処理し、タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、ポリペプチド鎖の途中の残基、各種のスペーサを用いて、シリコンカップリング剤の官能基と結合させることにより、絶縁膜上に固定することができる。また、固定しようとする表面をアルデヒドやポリリジンでコートすることにより、タンパク質のアミノ基を介して結合させることができる。アンカー分子として、プロテインG、プロテインA、ビオチン、ストレプトアビジンなどを介して間接的に結合させてもよい。
<第一の実施形態>
図1は、第一の実施形態に係るバイオセンサ100の断面図を示す。本実施例では、チャネル領域に一本鎖DNAが固定された核酸検出用バイオセンサの場合を例にとって説明する。
バイオセンサ100では、ガラス基板10上に、金薄膜からなるゲート電極12が形成され、ゲート電極12の上にゲート絶縁膜として酸化シリコン膜14が成膜されている。絶縁膜上には、ゲート電極12の上部を隔てて、ソース電極16とドレイン電極18が金薄膜により形成され、これによって両電極相互間の絶縁膜表面、即ちゲート電極12の上部がチャネル領域20となる。チャネル領域20には、標的核酸と相補的な配列を有する一本鎖DNAがプローブとして固定されている。
(製造方法)
次に、本実施の形態に係るバイオセンサの製造方法を説明する。図2は、このバイオセンサ100の製造工程断面図である。図2(a)に示すように、ガラス基板10上に例えば蒸着法によって、金薄膜を膜厚約20μm程度に形成し、その後パターニングして、ゲート電極12とする。ゲート電極には、タンタル、アルミニウム、白金、クロム等を用いてもよい。
続いて図2(b)に示すように、ガラス基板10およびゲート電極12に酸化シリコン膜14を、例えばPECVD法により膜厚約500nmとなるよう形成する。酸化シリコン膜14は、ゲート絶縁膜として機能する。図2(b)に示すように、エッチバック法によりゲート絶縁膜を平坦化してもよい。
さらに、同図(c)に示すように、例えばスパッタリング法により、金薄膜28を膜厚約20μmに形成する。そして図2(d)に示すように、パターニングして、ゲート電極の上方にチャネル領域20を形成する。チャネル領域の大きさは、標的物質の種類等にあわせて適宜変更できるが、約5μmから20μm四方が好ましい。
次に、同図(e)に示すように、プローブとしての一本鎖DNA22を、チャネル領域20内の絶縁膜14表面に固定する。DNAの固定は、上述の方法に準じて行うことができる。例えば、DNAの末端に酸化シリコン膜上でSAM膜を形成する官能基を結合させ、これを含む溶液を、インクジェット式吐出ヘッドによりチャネル領域に供給することで行うことが可能である。
(検出方法)
次に、図3(a)から図1(d)を参照して、このバイオセンサを用いた検出方法について説明する。まず、例えば、PBS緩衝液(50mM KPO4、5mM EDTA、1M NaCl、pH7.0)などで、標的物質を含む試料を例えば核酸濃度が1μMとなるように希釈し、被検試料とする。
次に、図3(b)に示すように、チャネル領域20に、被検試料24をインクジェット式吐出ヘッドにより吐出し、インキュベートして、ハイブリダイゼーション反応を行う。プローブ核酸22の塩基配列と相補的な配列を有する標的試料中の核酸は、プローブ核酸22とハイブリダイゼーションして二本鎖を形成する。なお、緩衝液の組成は特に限定されず、塩濃度(イオン強度)や温度を変化させて、ストリンジェンシーを調節することができる。
続いて、チャネル領域20に導電性インターカレータとして、特開平8−313521号公報に開示された次式の界面活性色素インターカレータ25を添加する。図3(c)に示すように、インターカレータ25は、二本鎖核酸が形成された部分に選択的に挿入結合する。導電性インターカレータとしては、メチレンブルーのほか、臭化エチジウム、アクチノマイシンD、アクリジン色素など、またはこれらに界面活性や導電性官能基を付与したものを用いてもよい。
次に、チャネル領域20を洗浄し、プローブに結合していない核酸等を含む被検試料をチャネル領域から除去する。洗浄には、SSC(saline-sodium citrate)溶液を超純水で適宜希釈し、必要に応じてSDS(Sodium dodecyl sulfate)を加えたものを用いることができる。
図3(d)に示すように、チャネル領域20、ソース電極16およびドレイン電極18上に、有機半導体層26として、F8T2(poly(9,9-dioctylfluorene-co-bithiophene))をキシレンに溶解したものを積層し、電界効果型トランジスタを形成する。有機半導体層は、インクジェット式吐出ヘッドにより供給することができる。インクジェット式吐出ヘッドにより吐出すれば、二本鎖核酸およびインターカレータを半導体層の中に効果的に封じ込めることができる。有機半導体層の形成は、インクジェット法のほか、蒸着法、スピンコート法、LB法などを用いてもよい。なお、半導体層は、水溶性ポリマーを用いて形成することも可能である。
最後に、ドレイン電極にプラス電圧を加えた状態で、プラスのゲート電圧を徐々にあげていき、ソース/ドレイン電極間に電流が流れ始める閾値電圧(Vth)、およびソース/ドレイン電極間に流れるドレイン電流(Id)を測定する。
一方、比較例として、図3(a)に示すバイオセンサに、被検試料の調製に用いたPBS緩衝液のみを添加し、インキュベート工程を経て洗浄し、同様に閾値電圧およびドレイン電流を測定する。
こうして得られるVg−Id特性曲線の一例を図4に示す。図中実線で示されているのは、二本鎖核酸が形成され、インターカレータがこの二本鎖に結合している場合のVg−Id特性曲線であり、点線で示されているのは比較例の特性曲線である。比較例は、有機半導体層中に絶縁性で双極子モーメントの小さい一本鎖核酸しか含まれないため、真性半導体のVg−Id特性に近い、急峻に立ち上がるカーブを描く。
これに対して、有機半導体層にインターカレータが含まれる実施例では、二本鎖が形成されてプローブ−標的物質の双極子モーメントが増大するとともに、インターカレータがトラップとして機能するため、閾値電圧(Vth)の絶対値が増大し、ドレイン電流(Id)が低下する。また、カーブの傾きが緩やかになり、S値が大きくなる。
このように、本実施の形態に係るバイオセンサによれば、複数のパラメータによってプローブと標的物質との結合を高感度且つ定量的に測定することができ、生体分子の多様な相互作用の検出に有用である。また、一つの基板に多数のバイオセンサを作りこむことができ、ハイスループットな測定可能となる。さらに製造コストが比較的安く、焼却処理もできるので使い捨て使用に適し、被検試料同士のコンタミネーションを防ぐこともできる。
<第二の実施形態>
図5は、第二の実施形態に係るバイオセンサ200の断面図を示す。本実施例では、チャネル領域上部における半導体層表面に、抗体が固定された、抗原検出用バイオセンサの場合を例にとって説明する。
ガラス基板50上に金薄膜によりゲート電極52が形成され、ゲート電極52の上に酸化シリコン膜がゲート絶縁膜54として成膜されている。絶縁膜54の上には、ゲート電極52の上部を隔てて、ソース電極56とドレイン電極58が金薄膜により形成され、これによって両電極相互間の半導体薄膜表面、即ちゲート電極52の上部がチャネル領域60となる。ソース電極56、ドレイン電極58、およびチャネル領域60上には、半導体層66が形成され、ゲート電極52の上部における半導体層66の表面には、標的物質に親和性を有する抗体がプローブとして固定されている。
(製造方法)
本実施の形態に係るバイオセンサは、通常の製造方法に従って電界効果型トランジスタを製造し、半導体膜表面に抗体を固定することにより製造することができる。まず、第一の実施形態にかかるバイオセンサと同様の方法で、基板50上に、ゲート電極52、絶縁膜54、ソース電極56およびドレイン電極58を形成し、ソース電極、ドレイン電極およびチャネル領域上に有機半導体層66を形成する。有機半導体層66は、例えばF8T2をキシレンに溶解したものを用いて蒸着法により形成することができる。十分な感度を得るためには、有機半導体層66をできるだけ薄く形成することが好ましく、5nmから50nmの厚さに形成するとよい。有機半導体を薄く形成することにより、チャネル領域60の上部に凹部が形成されるので、この凹部をセンシング部として利用することができる。
次に、前記凹部に、抗体62を有機半導体層表面に固定する。抗体の固定は、上述したタンパク質の固定方法に準じて行うことができ、例えば半導体層66の表面をアルデヒドでコートすることにより、抗体のアミノ基を介して結合させることができる。いずれの方法においても、立体障害や高次構造が失われることによって結合能が損なわれないように、また標的物質と結合するための配向性が保たれるよう固定する。
(検出方法)
次に、図6を参照して、本実施の形態に係るバイオセンサを用いた、標的物質の検出方法を説明する。標的物質を含むと考えられる被検試料64を、例えばタンパク質濃度が0.1〜0.5mg/mlになるように希釈して、添加する。インキュベーションを行った後、PBSで洗浄し、結合しなかった物質を含む被検試料64を洗い流す。抗体62と標的物質との結合により分子全体の双極子モーメントが変化し、半導体膜66の表面ポテンシャルが変化することによって、FET特性に変化が生じる。バイオセンサ200のFETとしての特性を予め測定しておくことにより、複合体の形成を定量的に測定することが可能である。
標的物質によって異なる特性の変化を、閾値電圧、Vg−Id特性、S値といった複数のパラメータによって表し、それぞれの値を記録したデータベースを作成することにより、未知の物質がプローブに結合した場合に、データベースを参照してこの物質を同定することも可能である。
このように、本実施の形態の係るバイオセンサを用いれば、インキュベーション後に半導体層を形成する工程が不要で、被検試料を半導体層表面に接触させる工程、インキュベーション工程、洗浄工程を経て、容易にプローブ−標的物質複合体を検出することができる。また、第一の実施の形態に係るバイオセンサと同様に、高感度、定量的且つハイスループットな相互作用の測定を実施することができ、使い捨て使用にも適する。
Claims (13)
- 被検試料中の標的物質を検出するためのバイオセンサであって、
絶縁膜と、
前記絶縁膜の一面側に形成されたゲート電極と、
前記絶縁膜の他面側に、前記ゲート電極と対向する部分を隔てて形成されたソース電極およびドレイン電極と、
前記ソース電極および前記ドレイン電極相互間の前記絶縁膜の他面側表面に固定された前記標的物質と特異的に相互作用するプローブと、
を含むバイオセンサ。 - 被検試料中の標的物質を検出するためのバイオセンサであって、
絶縁膜と、
前記絶縁膜の一面側に形成されたゲート電極と、
前記絶縁膜の他面側に前記ゲート電極と対向する部分を隔てて形成されるソース電極およびドレイン電極と、
少なくとも前記絶縁膜の他面側に、前記ゲート電極と対向し、前記ソース電極および前記ドレイン電極と接するように形成される半導体層と、
前記ゲート電極に対向する領域の前記半導体層表面に固定された前記標的物質と特異的に相互作用するプローブと、
を含むバイオセンサ。 - 前記絶縁膜が前記ゲート電極上に形成され、前記ソース電極およびドレイン電極が前記絶縁膜上に形成されている、請求項1または2に記載のバイオセンサ。
- 前記半導体層が、有機半導体層である請求項1または2に記載のバイオセンサ。
- 前記標的物質およびプローブが、それぞれ独立に、核酸またはタンパク質である請求項1または2に記載のバイオセンサ。
- 被検試料中の標的物質を検出する方法であって、
絶縁膜と、前記絶縁膜の一面側に形成されたゲート電極と、前記絶縁膜の他面側に、前記ゲート電極と対向する部分を隔てて形成されるソース電極およびドレイン電極と、前記ソース電極および前記ドレイン電極相互間の前記絶縁膜の他面側表面に固定された前記標的物質と特異的に相互作用するプローブと、を含むバイオセンサを用い、
前記プローブに、被検試料を接触させてインキュベートする工程と、
前記プローブが固定された絶縁膜表面を洗浄する工程と、
前記プローブが固定された表面に、前記ソース電極および前記ドレイン電極と接するように半導体層を成膜し、電界効果型トランジスタを形成する工程と、
前記電界効果型トランジスタの特性を測定する工程と、
を含む方法。 - 被検試料中の標的物質を検出する方法であって、
絶縁膜と、前記絶縁膜の一面側に形成されたゲート電極と、前記絶縁膜の他面側に前記ゲート電極と対向する部分を隔てて形成されるソース電極およびドレイン電極と、少なくとも前記絶縁膜の他面側に、前記ゲート電極と対向し、前記ソース電極および前記ドレイン電極と接するように形成される半導体層と、からなる電界効果型トランジスタを含み、前記ゲート電極に対向する領域の前記半導体層表面に固定された前記標的物質と特異的に相互作用するプローブと、を含むバイオセンサを用い、
前記プローブに、被検試料を接触させてインキュベートする工程と、
前記プローブが固定された半導体層表面を洗浄する工程と、
前記電界効果型トランジスタの特性を測定する工程と、
を含む方法。 - 請求項6または7に記載の方法により測定した電界効果型トランジスタ特性と、前記プローブが標的物質と相互作用しない場合に測定した電界効果型トランジスタ特性と、を比較する工程をさらに含む、請求項6または7に記載の方法。
- 前記半導体層が有機半導体層である、請求項6または7に記載の方法。
- 前記インキュベートする工程の前に、前記標的物質に標識分子を結合させておくことを特徴とする、請求項6または7に記載の方法。
- 前記標的物質および前記プローブが一本鎖核酸であり、前記インキュベートする工程の後に、導電性インターカレータを加える工程さらに含む、請求項6または7に記載の方法。
- 前記電界効果型トランジスタの特性が、閾値電圧、Vg−Id特性およびS値のうちのいずれかである、請求項6または7に記載の方法。
- 請求項1に記載のバイオセンサと、有機半導体材料と、を含む試料中の標的物質を検出するための検出キット。
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