JP2007279035A - 生分子を固定せずに電界効果トランジスタを利用して生分子を検出する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生分子を固定せずに電界効果トランジスタを利用して生分子を検出する方法を提供する。
【解決手段】電界効果トランジスタは、半導体材料で構成された基板、基板内に相互に離隔されて形成され、基板と逆極性にドーピングされたソース領域及びドレイン領域、ソース領域とドレイン領域との間に配置されたチャンネル領域、チャンネル領域上に配置されるものであって、検出表面を有する絶縁層、及び絶縁層上に離隔されて配置された基準電極を備えており、第１ターゲット生分子を含有する第１試料を電界効果トランジスタの検出表面に提供するステップと、電界効果トランジスタの電気的信号の変化を測定するステップと、を含むことを特徴とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、電界効果トランジスタを利用してターゲット生分子の存在または濃度を検出する方法に関する。

電気的な信号で生分子を検出するセンサーのうち、トランジスタを備える構造を有するトランジスタ基盤バイオセンサーがある。これは、半導体工程を利用して製作されるものであって、電気的な信号の転換が速いという長所があって、これまでトランジスタ基盤バイオセンサーについての多くの研究が進められてきた。

電界効果トランジスタ（Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ、以下、‘ＦＥＴ’という）を使用して、生物学的な反応を測定する源泉特許として、特許文献１がある。これは、抗原−抗体反応を表面電荷密度の変化による半導体反転層の変化を電流で測定するバイオセンサーに係り、生分子のうち蛋白質の検出に関する。特許文献２は、バイオ単量体をゲート表面に吸着させて相補的な単量体との混成化程度をＦＥＴで測定することに関する。

特許文献３は、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅｄ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、結合された生分子による吸光現象で混成化如何を測定する方法を開示している。特許文献４及び５では、ＴＦＴ（Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）を使用し、回路を適用させて信号対ノイズ比を向上させる内容を開示している。

このようなＦＥＴをバイオセンサーとして使用する場合には、従来の方式に比べてコスト及び時間が少なくかかり、ＩＣ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ）／ＭＥＭＳ工程との適用が容易であるという点で大きい長所を有している。

図１Ａは、従来のＦＥＴの構造を概略的に示す図面である。図１Ａを参照すれば、ｎ型またはｐ型にドーピングされた基板１１上に、両側部に基板１１と逆極性にドーピングされたソース１２ａ及びドレイン１２ｂが形成されており、基板１１上にソース１２ａ及びドレイン１２ｂと接触するゲート１３が形成されている。一般的に、前記ゲート１３は、酸化層１４、ポリシリコン層１５及びゲート電極層１６で構成され、基準電極１７に対面するゲート電極層１６の表面には、プローブ生分子が付着される。プローブ生分子は、所定のターゲット生分子と水素結合によって結合し、これを電気的な方法で測定してプローブ生分子とターゲット生分子との結合程度を測定する。

図１Ｂは、ゲート電極１６の表面にプローブ生分子１８を固定させ、前記プローブ生分子１８にターゲット生分子が結合する過程を概略的に示す図面である。図１Ｂを参照すれば、前記ゲート電極１６の表面にプローブ生分子１８の固定如何、及び前記固定されたプローブ生分子１８にターゲット生分子の結合如何によって、チャンネルを通じて流れる電流の強度がそれぞれ変わり、したがって、それによってターゲット生分子を検出しうる。

前記のような従来の全てのＦＥＴ構造は、ゲート電極の表面に、例えば、オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ産物のような生分子を固定させることを特徴とする。前記固定化のために、マイクロアレイの製作に使われる固定技術がそのまままたは変形されて使われる。例えば、特許文献６では、湿式工程を通じてゲート電極の表面に正の電荷を帯びるポリ−Ｌ−ライシン（ＰＬＬ：Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）を処理し、前記表面にスポッタを利用してＤＮＡをスポッティングした後、スポッティング前後の電圧差を測定した。

しかし、ゲート電極の表面に生分子が固定されたＦＥＴを利用した生分子の検出方法は、ただ１回の使用後に前記ＦＥＴを廃棄せねばならず、センサーの反応が遅いという問題点がある。また、生分子を固定するための追加層のコーティングまたは蒸着の追加的な製作工程が必要であり、前記追加工程によって装置間の特性差が発生する可能性が非常に高い。また、スポッティング技術で生分子を固定する場合に、ラボオンチップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）に使われ難いという問題点がある。
米国特許第４,２３８,７５７号明細書 米国特許第４,７７７,０１９号明細書 米国特許第５,８４６,７０８号明細書 米国特許第５,４６６,３４８号明細書 米国特許第６,２０３,９８１号明細書 ＷＯ第０３／０６２８１１号公報

本発明は、前記従来の技術の問題点を解決するために成されたものであって、本発明の目的は、複数の生分子の存在または濃度を連続的に容易かつ正確に検出しうる生分子の検出方法を提供することである。

本発明の目的を達成するために、本発明は、ＦＥＴを利用してターゲット生分子の存在または濃度を検出する方法において、前記ＦＥＴは、半導体材料で構成された基板、前記基板内に相互に離隔されて形成され、前記基板と逆極性にドーピングされたソース領域及びドレイン領域、前記ソース領域とドレイン領域との間に配置されたチャンネル領域、前記チャンネル領域上に配置されるものであって、検出表面を有する絶縁層、及び前記絶縁層上に離隔されて配置された基準電極を備えており、第１ターゲット生分子を含有する第１試料を前記ＦＥＴの検出表面に提供するステップと、前記ＦＥＴの電気的信号の変化を測定するステップと、を含むことを特徴とする生分子を固定せずに生分子を検出する方法を提供する。

本発明の一具体例において、第２ターゲット生分子を含有する第２試料を前記ＦＥＴの検出表面に提供するステップをさらに含みうる。

本発明の一具体例において、前記第２試料を提供するステップよりも前に生分子を含有していない溶液を前記ＦＥＴの検出表面に提供して洗浄するステップをさらに含みうる。

本発明の一具体例において、前記ＦＥＴの電気的信号の変化は、ドレイン電流、ゲート及びソース間電圧、または、ソース及びドレイン間電圧のうちの何れか一つ以上の変化でありうる。

本発明の一具体例において、前記第１ターゲット生分子は、核酸または蛋白質でありうる。

本発明の一具体例において、前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）及びその混成体で構成された群から選択されうる。

本発明の一具体例において、前記蛋白質は、酵素、基質、抗原、抗体、リガンド、アプタマー及び受容体からなる群から選択されうる。

本発明の一具体例において、前記核酸は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物またはその精製物でありうる。

本発明の一具体例において、前記半導体材料は、シリコンであり、前記電気的絶縁材料は、二酸化珪素、窒化珪素または酸化金属でありうる。

本発明の一具体例において、前記基板は、ｎ型にドーピングされており、前記ソース領域及びドレイン領域は、それぞれｐ型にドーピングされうる。

本発明の一具体例において、前記基板は、ｐ型にドーピングされており、前記ソース領域及びドレイン領域は、それぞれｎ型にドーピングされうる。

本発明の一具体例において、前記ＦＥＴは、マイクロチャンネル内に形成されうる。

本発明の一具体例において、前記基板は、前記マイクロチャンネルの内面を構成するものでありうる。

本発明に係る生分子を固定せずに生分子を検出する方法によれば、ＦＥＴを利用して複数の異なる生分子を連続的に検出できるだけでなく、前記ＦＥＴを１回使用した後に廃棄する必要がなく、その後にも継続的に生分子の検出に使用しうる。また、ＦＥＴを利用した生分子検出反応の速度が速い。また、生分子が固定されたＦＥＴを使用していないため、ＦＥＴの製作時に工程が簡単であり、追加工程時に生じるＦＥＴ間の特性差を大きく下げて、生分子検出の正確性を確保することができる。

以下、添付された図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。

本発明は、ＦＥＴを利用して生分子を固定せずにターゲット生分子の存在または濃度を検出する方法に関する。

図２は、本発明による生分子の検出方法に使われるＦＥＴの構造を概略的に示す図面である。

図２を参照すれば、本発明による生分子の検出方法に使われるＦＥＴは、半導体材料で構成された基板２１、前記基板２１内に相互に離隔されて形成され、前記基板２１と逆極性にドーピングされたソース領域２２ａ及びドレイン領域２２ｂ、前記ソース領域２２ａとドレイン領域２２ｂとの間に配置されたチャンネル領域、前記チャンネル領域上に配置されるものであって、検出表面２３ａを有する絶縁層２３、及び前記絶縁層２３上に離隔されて配置された基準電極２４を備える。

本発明において、前記ＦＥＴは、従来のバイオセンサーまたはＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）素子に使用されてきた如何なるＦＥＴをも使うことができ、ｎ−ＭＯＳ及びｐ−ＭＯＳの２種類とも使用可能である。例えば、前記基板２１がｎ型にドーピングされた場合、前記ソース２２ａ及びドレイン２２ｂは、それぞれｐ型にドーピングされ、逆に、前記基板２１がｐ型にドーピングされた場合、前記ソース２２ａ及びドレイン２２ｂは、それぞれｎ型にドーピングされうる。

前記ＦＥＴにおいて、ソース２２ａは、キャリア、例えば、自由電子または正孔を供給し、ドレイン２２ｂは、前記ソース２２ａから供給されたキャリアが到達する部位であり、ゲートとして作動する検出表面２３ａは、前記ソース２２ａとドレイン２２ｂとの間のキャリアの流れを制御する役割を行う。

前記基板２１を構成する半導体材料は、シリコンであり、前記絶縁層２３を構成する電気的な絶縁材料は、生分子が固定されていない任意の材料であり、例えば、二酸化珪素、窒化珪素または酸化金属でありうる。また、前記絶縁層２３に生分子が固定されていない他の材料で構成される付加層が形成されてもよい。

望ましくは、前記ＦＥＴは、マイクロチャンネル内に形成されてもよい。この場合、前記基板２１は、前記マイクロチャンネルの内面を構成でき、前記基準電極２４は、前記マイクロチャンネルの内部または内面に配置されうる。

本発明による生分子の検出方法は、生分子を固定せずにＦＥＴを利用して生分子を検出することを特徴とする。

本発明の方法を利用して生分子を検出するために、まず、第１ターゲット生分子を含有する第１試料を前記ＦＥＴのゲート電極に提供する。

本発明において、前記生分子は、核酸または蛋白質でありうる。

前記核酸は、多様な核酸、類似核酸、またはその混成体を意味し、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びその混成体で構成された群から選択されうる。また、前記核酸は、オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ産物であるが、ＰＣＲ産物またはその精製物であることが望ましい。

前記蛋白質は、例えば、酵素、基質、抗原、抗体、リガンド、アプタマー及び受容体からなる群から選択されうる。

次いで、前記第１試料を提供した後に、生分子を含有していない溶液を前記ＦＥＴの検出表面及び基準電極に提供して洗浄しうる。前記溶液は、電解質溶液であることが望ましい。

次いで、第２ターゲット生分子を含有する第２試料を前記ＦＥＴのゲート電極に提供しうる。前記第２ターゲット生分子は、前記第１ターゲット生分子と種類または濃度が同じであってもよく、異なってもよい。

前記生分子を含有する試料の提供ステップと生分子を含有していない溶液の提供ステップとの間に、前記ＦＥＴの電気的信号変化を測定する。

前記ＦＥＴの電気的信号の変化は、ドレイン電流、ゲート及びソース間電圧、または、ソース及びドレイン間電圧のうちの何れか一つ以上の電気的信号の変化でありうる。

本発明による生分子の検出方法の最も望ましい具体例は、前記ＰＣＲ産物を検出することである。もし、試料内に標的生分子が存在したならば、ＰＣＲが行われ、逆に、試料内に標的生分子が存在していないならば、ＰＣＲが行われないため、ＰＣＲ産物を検出することによって、前記試料内の標的生分子の存否及びその濃度を検出しうる。

本発明の生分子の検出方法によれば、ＦＥＴを利用して複数の異なる生分子を連続的に検出しうるだけでなく、前記ＦＥＴを１回使用した後に廃棄する必要なく、その後にも継続的に生分子の検出に使用しうる。また、ＦＥＴを利用した生分子検出反応の速度が速いという長所を有する。また、生分子が固定されたＦＥＴを使用していないため、ＦＥＴの製作時の工程が簡単であり、追加工程時に生じるＦＥＴ間の特性差を大きく下げて、生分子検出の正確性を確保することができる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されてはならない。

実施例１
本発明によるＦＥＴ基盤バイオセンサーの製造
本発明で使用したＦＥＴ素子は、Ｘ−ＦＡＢ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｆｏｕｎｄｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）の設備を利用して製作し、前記企業のＸＣ１０−１.０ｕｍ ＣＭＯＳ工程を使用した。その後に、ゲートの上面を酸化ケイ素以前までエッチングし、それと離隔させてゲート電極を形成し、図２のような形態のＦＥＴを製造した。

次いで、露出された酸化ケイ素及びゲート電極を備えるＦＥＴ表面をよく洗浄した。洗浄は、純粋アセトン及び水で行い、洗浄した後に乾燥した。前記基板の洗浄過程は、半導体製造工程で利用されるウェットステーションを利用した。洗浄が終わった後に、スピンドライを利用して乾燥した。

実施例２
本発明によるＦＥＴ基盤バイオセンサーを利用したＰＣＲ産物の検出
実施例１で製造したＦＥＴ基盤バイオセンサーを利用して、センシング表面である絶縁層にＰＣＲ産物を固定せずとも、それを検出できるか否か、及び前記ＰＣＲ産物を洗浄した後に前記ＦＥＴ基盤バイオセンサーを利用して、さらに他のＰＣＲ産物を検出できるか否かを確認した。

このために、前記ＦＥＴ基盤バイオセンサーにＰＣＲ産物及び洗浄溶液を交互に注入した。

図３Ａは、本発明によるＦＥＴの検出表面と基準電極との間にＰＣＲ産物及び洗浄用バッファを交互に注入する順序を概略的に示す図面である。図３Ａを参照すれば、一つ以上のＦＥＴ基盤バイオセンサー３１に順次に洗浄溶液３３ａ、ＰＣＲ産物３２ａ、洗浄溶液３３ｂ、ＰＣＲ産物３２ｂ、洗浄溶液３３ｃ、ＰＣＲ産物３２ｃ及び洗浄溶液３３ｄを順次に提供した。

本実施例で使われた洗浄溶液は、０.０１ｍＭのリン酸バッファ（ｐＨ６.０４）を利用した。

また、本実施例で使われたＰＣＲ産物は、スタフィロコックスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）バクテリアの鋳型を利用して、ＰＣＲ増幅過程を経て、使われた順方向及び逆方向プライマーの塩基配列は、それぞれ５’−（ＴＡＧ ＣＡＴ ＡＴＣ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＡＣ ＡＣＣ Ｃ）−３’及び５’−（ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＣＡ ＴＴ）−３’であった。増幅が完了したＰＣＲ産物は、２４０ｂｐのサイズを有し、前記ＰＣＲ産物を含有するリン酸バッファのｐＨは、６.４７であり、ＰＣＲ産物の濃度は、１０ｎｇ／マイクロリットルであった。

図３Ｂは、図３Ａと同じ順序でＦＥＴのゲート電極に、ＰＣＲ産物及び洗浄用バッファを交互に注入する場合の電流変化を測定したグラフである。

図３Ｂを参照すれば、ＰＣＲ産物を注入する場合（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）、電流が急減し、逆に、洗浄溶液を注入する場合（３３ｂ、３３ｃ、３３ｄ）、電流が元来の値に急増するということが分かる。

前記電流変化量を絶縁層の表面の電圧変化量で換算した結果を表１に表した。

表１に示したように、ＰＣＲ産物を注入する場合の電圧降下値及び洗浄溶液を注入する場合の電圧上昇値が顕著であった。

ＰＣＲ産物を含有する溶液と洗浄溶液とのｐＨ差が前記電圧変化に影響を及ぼしたか否かを確認した結果、前述したように、前記二つの溶液のｐＨ差は、０.４３であり、それによる電圧変化は、１０ｍＶに過ぎず、前記電圧変化に大きい影響を及ぼさないということを確認した。

前記結果から、本発明によるＦＥＴを利用して生分子を固定せずにターゲット生分子の存在または濃度を検出する方法は、複数の生分子を連続的に容易かつ正確に検出しうるだけでなく、同じＦＥＴを洗浄して半永久的に生分子の検出に使用しうるということが分かる。

以上、本発明についてその望ましい実施例を中心に説明した。当業者は、本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲で変形された形態で具現されうるということが分かる。したがって、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されねばならない。本発明の範囲は、前述した説明ではなく、特許請求の範囲に現れており、それと同等な範囲内にある全ての差異点は、本発明に含まれていると解釈されねばならない。

本発明は、ＦＥＴ関連の技術分野に適用可能である。

従来のＦＥＴの構造を概略的に示す図面である。 図１ＡのＦＥＴのゲート電極の表面にプローブ生分子を固定させ、前記プローブ生分子にターゲット生分子が結合する過程を概略的に示す図面である。 本発明による生分子の検出方法に使われるＦＥＴの構造を概略的に示す図面である。 本発明によるＦＥＴのゲート電極にＰＣＲ産物及び洗浄用バッファを交互に注入する順序を概略的に示す図面である。 図３Ａと同じ順序でＦＥＴのゲート電極にＰＣＲ産物及び洗浄用バッファを交互に注入する場合の電流変化を測定したグラフである。

符号の説明

２１ 基板、
２２ａ ソース領域、
２２ｂ ドレイン領域、
２３ 絶縁層、
２３ａ 検出表面、
２４ 基準電極。

Claims (11)

1. 電界効果トランジスタを利用してターゲット生分子の存在または濃度を検出する方法において、
   前記電界効果トランジスタは、半導体材料で構成された基板、前記基板内に相互に離隔されて形成され、前記基板と逆極性にドーピングされたソース領域及びドレイン領域、前記ソース領域とドレイン領域との間に配置されたチャンネル領域、前記チャンネル領域上に配置されるものであって、検出表面を有する絶縁層、及び前記絶縁層上に離隔されて配置された基準電極を備えており、
   第１ターゲット生分子を含有する第１試料を前記電界効果トランジスタの検出表面に提供するステップと、
   前記電界効果トランジスタの電気的信号の変化を測定するステップと、
   を含むことを特徴とする生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
2. 第２ターゲット生分子を含有する第２試料を、前記電界効果トランジスタの検出表面に提供するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
3. 前記第２試料を提供するステップよりも前に、生分子を含有していない溶液を前記電界効果トランジスタの検出表面に提供して洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
4. 前記電界効果トランジスタの電気的信号の変化は、ドレイン電流、ゲート及びソース間電圧、または、ソース及びドレイン間電圧のうちの何れか一つ以上の変化であることを特徴とする請求項１に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
5. 前記第１ターゲット生分子は、核酸または蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
6. 前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びその混成体で構成された群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
7. 前記蛋白質は、酵素、基質、抗原、抗体、リガンド、アプタマー及び受容体からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
8. 前記核酸は、ＰＣＲ産物またはその精製物であることを特徴とする請求項５に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
9. 前記半導体材料は、シリコンであり、前記電気的な絶縁材料は、二酸化珪素、窒化珪素または酸化金属であることを特徴とする請求項１に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
10. 前記電界効果トランジスタは、マイクロチャンネル内に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。
11. 前記基板は、前記マイクロチャンネルの内面を構成することを特徴とする請求項１０に記載の生分子を固定せずに生分子を検出する方法。

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