JP2005069787A - バイオチップ - Google Patents

Abstract

【課題】 スポットの位置が判別可能な金属基板からなるバイオチップを得ることにある。特に表面プラズモン共鳴イメージング法に適したバイオチップを得る。
【解決手段】 金属基板上に形成されたアレイ部分を有し、スポットの場所を記したマーカーが備えられていることを特徴とするバイオチップ。好ましくはマーカーは識別可能な文字もしくは数字である。さらに好ましくは単分子レベルでマーカーがパターン化されている。
【選択図】なし

Description

本発明は、スポットの位置の判別を容易とするマーカーを有する金属基板バイオチップに関する。

近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を同時に解析することができる。
一般的なバイオチップとしてＤＮＡチップが挙げられる。ＤＮＡチップはＤＮＡ分子を固体基板に固定化したもので、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用の観察に用いられる。最近は分子の集積度が非常に高くなっており、一回の測定から得られる情報量も増加している。しかし、結合の検出には蛍光や化学発光、放射線同位体などのラベル方法が必要である。従って、ラベルの困難な蛋白や糖などの生体分子の相互作用には適さない。

ラベルフリーの相互作用解析方法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、エリプソメトリ法、和周波発生法などの光学的検出方法が注目を浴びている。中でもＳＰＲ法を応用したＳＰＲイメージング法は二次元領域の相互作用を観察することが可能であり、注目を浴びている。すなわち、チップ全面に偏光光束を照射し、その反射光をＣＣＤカメラで撮影する手法である。金属基板チップ上にアレイを作製すれば、ＳＰＲイメージング法による多点での相互作用が可能となる（特許文献１）。

しかし、ＳＰＲイメージング法の光学系は複雑であり、ＣＣＤカメラはチップの背面から撮影するため、ＣＣＤカメラにはチップ表面に形成したパターンが反転して映しだされる。従って、サンプルを固定化した場所の特定が困難となる。この問題を解決するため、決められたパターンで表面に固定化する手法が取られている（非特許文献１，２）。このようにパターンで表面に固定化するとどの分子が相互作用したか判別が容易となる。しかし、パターンを形成するためには一つのサンプルを複数のスポットに固定化する必要があり、測定のスループットが限られる問題点があった。
本発明はチップ上にスポットの位置を特定するマーカーを備えることで、多点での相互作用解析に適したバイオチップを実現する。

米国特許６１２７１２９号明細書 Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ．ａｌ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３（２００１）１−７ Ｓｍｉｔｈ ｅｔ．ａｌ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２４（２００２）６８１０−６８１１

本発明の課題は、スポットの位置が判別可能な金属基板からなるバイオチップを得ることにある。

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段を用いたバイオチップとすることにより、上記課題を解決できることを見出した。
１．金属基板上に形成されたアレイ部分を有し、スポットの場所を記したマーカーが備えられていることを特徴とするバイオチップ
２．上記金属基板が、金薄膜がコーティングされた透明基板である１記載のバイオチップ
３．上記金属基板上のアレイが表面プラズモン共鳴法の測定用である１〜２いずれか記載のバイオチップ
４．上記金属基板上のアレイが表面プラズモン共鳴イメージング法の測定用である１〜３いずれか記載のバイオチップ
５．マーカーが判別可能な文字及び／または数字である１〜４いずれか記載のバイオチップ
６．単分子層でパターン化されているマーカーを有する１〜５いずれか記載のバイオチップ
７．マーカー部分にコーティングされた分子の平均分子量と、周囲の部分にコーティングされた分子の平均分子量の比が０．５以下もしくは２以上である１〜６記載のバイオチップ

本発明により得られたバイオチップは、光学的検出法による金属基板上の相互作用において、マーカーによってスポットの位置を容易に知ることが可能である。

本発明のバイオチップは金属基板に形成されたアレイ部分を有している。金属基板としては金薄膜がコーティングされた透明基板であることが好ましい。なぜならば、ＳＰＲ、エリプソメトリ、和周波発生法などの光学的検出方法に適しているからである。また、末端に官能基を有するアルカンチオール類、ジスルフィド類などを用いることで、金表面に金−硫黄結合により自己組織化表面を形成し、表面に官能基を導入することができるため好ましい。官能基は特に限定されるものではないが、例えばカルボキシル基を有するアルカンチオールを用いることで金表面にカルボキシル基が導入され、水溶性カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性化した後にアミノ基を有する物質を表面に固定化することが可能である。

金薄層をコーティングする方法は特に限定されるものではなく、蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが挙げられる。一般的には金の剥離を抑制するため、金の下にクロムもしくはチタンが１〜１０ｎｍコーティングされる。金の厚みは限定されるものではないが、３０〜１００ｎｍコーティングされるのが一般的である。
透明基板の素材は特に限定されるものではなく、ガラスやポリカーボネート、ポリオレフィンなどのプラスチック類が挙げられる。金属基板上のアレイ部分とは、分子を規則正しく配列して基板に固定化している、もしくは固定化可能な部分を言う。

光学的検出方法としては表面の屈折率変化に敏感なＳＰＲ法が好ましい。ＳＰＲ法はラベルフリーかつリアルタイムである測定方法であり、相互作用解析法として実績がある。中でもＳＰＲイメージング法は二次元の領域の相互作用を観察できるためさらに好ましい。アレイを作製すれば、多点での相互作用が測定できる。

本発明のバイオチップはアレイ部分のスポットの場所を記したマーカーが備えられていることが特徴である。マーカーを備えていることで、アレイ上に固定化された物質がどこにあるのかを容易に判別できる。特に光学的検出方法としてＳＰＲイメージング法を用いる場合、チップの背面からＣＣＤカメラで撮影する場合が一般的である。背面から撮影するとチップ上のパターンが反転して映るために、場所が判別しにくい。マーカーが存在することで、スポットの場所を容易に特定できる。

マーカーは一つであっても、多数存在してもよく、マーカーの形状もどのようなものでもよい。ただし、アレイの行と列を容易に判別するためにマーカーの形状は判別可能な文字及び／または数字であることが好ましい。例えば、固定化するサンプルは市販の９６穴プレートや３８４穴プレートに用意する場合、プレートに記載された行と列の文字数字をそのまま反映させることが考えられる。９６穴プレートの場合であると、縦軸にＡからＨまでのアルファベット文字、横軸に１から１２まで数字が記載される場合が考えられる。
また、アレイは市販の９６穴プレートや３８６穴プレートに対応させるため、８×１２のスポット部、１２×１６のスポット部もしくは１６×２４のスポット部をもつことが好ましい。

マーカーの導入方法としては、検出系で検出可能な方法であればその方法に限定されるものでないが、例えば、マーカーの部分のみ金属の蒸着を行わない、マーカーの部分のみ金属の厚みを変える、マーカーの部分またはマーカー以外の部分の金属表面上もしくは基板−金属層間にポリマー、有機物質、無機物質等を付着させるか他の部分とは異なる物質を付着させる、等の方法が挙げられる。

マーカーの部分またはマーカー以外の部分にポリマー、有機物質、無機質等を付着させる方法としては、マスクして蒸着する、マスクしてコーティングする、凸版やインクジェット法等による印刷を行う、全面にコートした後に光・レーザー・放射線照射等により付着物を分解除去するか変質させて不要部分を除去する、不要部分を除去した後さらに他の物質を付着させる、などの方法が挙げられ、適宜単独もしくは組み合わせることができる。金属表面上に付着させる場合には、金属層を設けた基板に上記方法によってマーカーを設けることが出来る。基板−金属層間に付着させる場合には、基板上に上記方法によってマーカーを付着させた後に金属層を設けることが出来る。

ポリマー、有機物質としては金属、基板に付着可能であり、金属上に付着させる場合には測定液を流した際に流失されないものであれば問題はなく、例えばインキ、塗料等に用いられるポリマーや有機物質、これらの組成物が挙げられるが、金と強固に結合可能である分子内にチオール、スルフィルド、ジスルフィド等のイオウを含有する有機物質、ポリマーが好ましく用いられる。

また、マーカーと他の部位とのチップ表面での高さの差は３μ以下であることが好ましい。より好ましくは１μｍ以下、さらに好ましくは１００ｎｍ以下、特に好ましくは５０ｎｍ以下である。さらには、マーカーは単分子層で導入されていることが好ましい。チップ表面に３μｍを越える凹凸があると、分析対象物質を含んだ溶液をチップ表面に曝す際に、表面の流れが悪くなり、相互作用のＫｉｎｅｔｉｃｓを評価するには好ましくなく、分子レベルでの凹凸である方が好ましいからである。分子レベルの凹凸はＳＰＲイメージング法などの光学的検出方法によって十分に判別可能である。
なお、表面の凹凸は、触針式や非接触の表面粗さ計、干渉顕微鏡、トンネル顕微鏡、ＳＰＲ角度からの計算、断面でカットして観察する等、その凹凸の規模により測定して決定することが出来る。

さらに、マーカー部はスポット部を形成する際に同時に形成されることが好ましい。マーカー部とスポット部のどちらかを予め形成させると、スポットのパターンが制限されたり、位置ズレが生じる場合がある。なお、ここで同時というのは、時間的に完全な同時でなくとも、同一工程もしくは基板を移動させずに引き続き行われるものであればかまわない。マーカー部とスポット部を同時に形成する方法としては、金属層を設ける際にマスクして金属の蒸着等を行いマーカー部とスポット部を設ける、金属層上にスポッティングによりスポット部を設ける際にマーカー部も設ける、バックグランド部にあたる部分の金属面を表面処理してスポット部を設ける際にマーカー部分も設けるなどの方法が挙げられる。

具体的には、金属層上にスポッティングによりスポット部を設ける際にマーカー部も設ける場合には、例えば、金属上に自動スポッター等でスポッティングを行い、その中で同一か別の物質を用いてマーカーを設ける。スポッティングおよびマーカーは、ピンやペンによる方法、インクジェットによる方法等が挙げられる。また、スポッティング工程後レーザー等を用いて基板にマーカーを刻印してもかまわない。

バックグランド部にあたる部分の金属面を表面処理してスポット部を設ける際にマーカー部分も設ける場合には、例えば、金属面全面にバックグランド部にあたる親水性化合物等をコートし、その後にスポット部から親水性化合物等を除去するが、その際にマーカー部の親水性化合物を除去する方法が挙げられる。
この方法の最も好ましい例としては、既知の光リソグラフィによってアルカンチオールを酸化する方法（特許文献１に記載）がある。すなわち、分子を固定化するスポット部分に紫外線照射を行い、周囲部分とスポット部分を区別する手段である。この方法でスポット部分だけでなく、マーカー部分もパターン化することができる上、単分子層でパターン化できる。

ただし、ＳＰＲイメージング法で分子レベルの凹凸を識別するには、固定化されている分子の分子量が異なっている必要がある。チップの表面層において異なる屈折率を有する厚みを変化させなければ、違いを識別できないからである。
具体的には、マーカー部分に結合した分子の平均分子量と、周囲部分に結合した分子の平均分子量の比が０．５以下もしくは２以上であることが好ましい。結合される分子が分子量分布のある高分子の場合、平均分子量として、ＧＰＣによる重量平均分子量が選択される。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

［実施例］
（ステップ１）
アルキル鎖の炭素数が２であり、末端の官能基がチオール基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を1ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。ＰＥＧチオールの分子量は５０００であり、親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの末端はメトキシ基であり、反応性をほとんど有さない。

１８ｍｍ四方、１ｍｍ厚のＳＦ１０ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを単分子層で結合させた。

（ステップ２）
このスライドの上に図１に示すフォトマスク（クロム面が上で示されている）を載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、照射部のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクにはアレイ部分とマーカー部分が備えられている。アレイ部分のスポットは９６個存在し、９６穴プレートを反映した形でマーカーが存在する。すなわち、縦軸はＡからＨの８行、横軸は１から１２の１２列となっている。この場合、フォトマスクはクロム面を下にして、金表面に置かれる。従って、紫外線の照射により、左右反転して金表面にパターン化される。ＳＰＲイメージング法では、チップ背面から撮影するため、結果的に文字と数字は正しい方向に映しだされる。

（ステップ３）
次に分子量１７６の７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭ溶液中にスライドを１時間浸漬し、固定化部に７−ＣＨＴを単分子で固定化した。
こうして得られたバイオチップはマーカー部とアレイ部には７−ＣＨＴが、周囲部分にはＰＥＧチオールが固定化されており、分子量の比は０．０３５である。また、このバイオチップは単分子でパターン化されている。
このバイオチップをＳＰＲイメージング機器（東洋紡績製）にセットして、ミリＱ水を流した。その際のＳＰＲ画像を図２に示す。このように縦軸に文字が、横軸に数字がはっきりと読み取ることができる。

この文字部とバックグラウンド部のＳＰＲ角を測定した。ＳＰＲ角とは反射光強度が極小になる角度のことを言う。文字部のＳＰＲ角は５３．８０°、バックグラウンド部のＳＰＲ角は５４．０６°と測定され、ＳＰＲ角の変位は０．２６°であった。
Ｈａｎｓｅｎ（Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．１９６８，５８，３８０−３９０）によるＮ相のＦｒｅｓｎｅｌ式に基づいて、８３０ｎｍの光に関して、層の厚みの計算を行った。ＳＦ１０ガラスの屈折率１．７１０、金のｎ＝０．１５５、ｋ＝５．１６３４、厚み４５ｎｍ、ＰＥＧ層の屈折率１．４０、水の屈折率１．３３として計算を行ったところ、０．２６°の変位は１１ｎｍの厚みの差に相当した。５０ｎｍ以下であるため、チップ上の流れへの影響は非常に少ないと推測される。
こうして得られたバイオチップには９６穴プレートに用意したサンプルが固定でき、スポットの位置が容易に参照可能である。

実施例で使用したフォトマスク 実施例によるＳＰＲイメージング像

Claims (7)

1. 金属基板上に形成されたアレイ部分を有し、スポットの場所を記したマーカーが備えられていることを特徴とするバイオチップ
2. 上記金属基板が、金薄膜がコーティングされた透明基板である請求項１記載のバイオチップ
3. 上記金属基板上のアレイが表面プラズモン共鳴法の測定用である請求項１〜２いずれか記載のバイオチップ
4. 上記金属基板上のアレイが表面プラズモン共鳴イメージング法の測定用である請求項１〜３いずれか記載のバイオチップ
5. マーカーが判別可能な文字及び／または数字である請求項１〜４いずれか記載のバイオチップ
6. 単分子層でパターン化されているマーカーを有する請求項１〜５いずれか記載のバイオチップ
7. マーカー部分にコーティングされた分子の平均分子量と、周囲の部分にコーティングされた分子の平均分子量の比が０．５以下もしくは２以上である請求項１〜６記載のバイオチップ