JP2005052009A - チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼおよび該酵素遺伝子 - Google Patents
チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼおよび該酵素遺伝子 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードするＤＮＡをクローン化し、その塩基配列を決定し、更にクローン化した組換えＤＮＡを発現させた細胞を用いてチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼ、該酵素をコードするＤＮＡおよびチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはこのチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種テルペノイドを製造することを課題とする。
【解決手段】チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼおよび該酵素遺伝子を用いて、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種トリテルペンを製造する。
【選択図】なし
【解決手段】チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼおよび該酵素遺伝子を用いて、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種トリテルペンを製造する。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２，３−オキシドスクワレンからチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成する活性を有するポリペプチドであって、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成することを特徴とするポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはこのチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種テルペノイドを製造する方法に関する。チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体は他の植物由来のテルペノイドとは異なった構造を有しており、他にはない生理活性を持つことが期待されるとともに、医薬用の原料としても注目されている。
【０００２】
【従来の技術】
チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールは、トリテルペノイドに分類される植物二次代謝産物の一種で、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体はニガキ科のニガキ（Ｐｉｃｒａｓｍａ ｑｕａｓｓｉｏｉｄｅｓ）やニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）やブルケア・ジャバニカ（Ｂｒｕｃｅａ ｊａｖａｎｉｃａ）、ミカン科のパラミグニア・グリフィシー（Ｐａｒａｍｉｇｎｙａ ｇｒｉｆｉｔｈｉｉ）などに含有されていることが知られている。しかしながら、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体の製造に際し、植物体を原料として用いる場合は、栽培に多額のコストがかかるとともに、その生産性は極めて低いものとならざるを得ない。
【０００３】
また、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの生成を触媒する酵素については、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から同定された多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ８Ｈ１２Ｒ．４３［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４１ ，７７０５−７７１０ （２０００）］のみが知られている。多機能型トリテルペン合成酵素とは２，３−オキシドスクワレンを基質として、複数のトリテルペノイド化合物を生成する酵素である。多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ８Ｈ１２Ｒ．４３は２，３−オキシドスクワレンを基質として、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成すると同時に他の８種類のトリテルペノイド化合物を生成する。これら生成物中に占めるチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの割合は非常に低く、該酵素はチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの生産効率が悪い、さらには該酵素を用いた場合、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールと物理化学的性質の似たトリテルペノイド化合物を除去するための煩雑な精製が必要であるという点で産業上実用的でないと言わざるを得ない。
そこで、生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成する、もしくはチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを特異的に生成するチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの発見が望まれていた。
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４１ ，７７０５−７７１０ （２０００）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、２，３−オキシドスクワレンからチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成する活性を有する酵素であって、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成することを特徴とする酵素および該酵素をコードするＤＮＡを提供する。更にこのＤＮＡを含む組換えベクター、この組換えベクターで形質転換させた細胞およびこの形質転換細胞を用いてチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼ、該酵素をコードするＤＮＡおよびチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはこのチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種テルペノイドを製造する方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、トリテルペンシンターゼの保存領域に相補的な縮重プライマーを用い、ニガキ科のニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）から抽出した全ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ、さらにはＲＡＣＥを行い、１種類のトリテルペンシンターゼｃＤＮＡをクローニングした。本ｃＤＮＡの全長のＯＲＦを酵母発現ベクターに組込み、ラノステロールシンターゼを欠く酵母に形質転換して機能解析を行った結果、該酵母において本来生合成されないチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの生産が認められたことから、本ｃＤＮＡがチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードしていることを確認した。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の態様は、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドおよび／または配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、第２の態様は、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡおよび／または配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡが挙げられる。本発明の第３の様態は、第２の様態に記載のＤＮＡを含む組換えベクターである。本発明の第４の様態は、上記組換えベクターで形質転換された細胞である。また、本発明の第５の様態は、上記形質転換細胞を用いて、植物二次代謝産物を製造する方法である。この植物二次代謝産物はチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成されるテルペノイドであってもよい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ニガキ科のニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）からチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードするｃＤＮＡを単離したが、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体を産生する植物であれば、本発明と実質的に同一の酵素が含まれていると推測され本明細書に記載の方法を用いればそれら植物からでも、本発明のチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼと実質的に同一の酵素をコードするｃＤＮＡを単離することができる。
【０００９】
本発明に係るチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼとは、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成する反応を触媒するポリペプチドを指しており、その起源は特に限定されないが、好ましくは植物由来であり、そのようなものとして例えば、ニガキなどのニガキ科Ｐｉｃｒａｓｍａ属植物、ニワウルシなどのニガキ科Ａｉｌａｎｔｈｕｓ属植物、ブルケア・ジャバニカなどのニガキ科Ｂｒｕｃｅａ属植物、パラミグニア・グリフィシーなどのミカン科Ｐａｒａｍｉｇｎｙａ属植物などを挙げることが出来る。
【００１０】
本発明の遺伝子とは、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を指しており、その起源は特に限定されないが、好ましくは植物由来であり、そのようなものとして例えば、ニガキなどのニガキ科Ｐｉｃｒａｓｍａ属植物、ニワウルシなどのニガキ科Ａｉｌａｎｔｈｕｓ属植物、ブルケア・ジャバニカなどのニガキ科Ｂｒｕｃｅａ属植物、パラミグニア・グリフィシーなどのミカン科Ｐａｒａｍｉｇｎｙａ属植物などを挙げることが出来る。
【００１１】
本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクターに関するものである。組換えベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーター、ターミネーターおよび複製起点等を含有する。組換えベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。
【００１２】
更に、本発明は組換えベクターを用いて形質転換された細胞に関する。宿主としては原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば酵母または糸状菌などが使用できる。さらに昆虫細胞、動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としてはマウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。組換えベクターによる宿主の形質転換は常法によって行うことができる。
【００１３】
加えて、本発明はチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体の製造方法に関する。製造方法としては（ｉ）基質である２，３−オキシドスクワレンを含有する宿主を組換えベクターで形質転換して宿主細胞内で製造する方法（ｉｉ）組換え酵素に基質である２，３−オキシドスクワレンを投与して製造する方法を挙げることができる。（ｉ）としては、例えば以下実施例に記載の通り、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主となる酵母を形質転換し、組換え酵素を発現させることによりチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを製造することができる。また、（ｉｉ）としては、例えば組換え酵素を発現する細胞の破砕液に基質である２，３−オキシドスクワレンを投与することで反応させ、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを製造することができる。さらに、宿主細胞にチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを代謝する活性が備わっていれば、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを基質として宿主細胞の活性に依存した代謝産物、すなわちチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オール誘導体を製造することもできる。
【００１４】
本発明でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成するとは、上記（ｉ）または（ｉｉ）の製造方法において、本発明の酵素の活性に依存した代謝産物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールが最も優位に多いということであり、例えば、酵素を発現している細胞の培養液や培養物からトリテルペンモノアルコール画分を抽出し、その抽出物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールのモル比が最も高いということである。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１ 全ＲＮＡの抽出
ニワウルシの葉より全ＲＮＡを抽出した。抽出方法には改変ＣＴＡＢ法（植物のＰＣＲ実験プロトコール、秀潤社）を用いた。
【００１６】
参考例２ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの部分的ｃＤＮＡ断片の単離
チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの部分的ｃＤＮＡ断片を単離するために、ニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型として、報告された植物 のトリテルペンシンターゼ配列における保存領域からデザインした縮重プライマーを用いてネスティッドＰＣＲを行なった。初めは配列番号２で示される塩基配列のプライマーと配列番号３で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５４℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。二回目は配列番号４で示される塩基配列のプライマーと配列番号５で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で７０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物はｐＨＳＧ２９８ベクター（ＴａＫａＲａ社製）にサブクローニングした。いくつかのクローンをシークエンスした結果、配列番号６で示される塩基配列から成る目的のｃＤＮＡ断片を取得した。
【００１７】
参考例３ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードする全長塩基配列の決定
配列番号６に記載の塩基配列をもとに、本酵素のＣ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡ部分をニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型にネスティッドＰＣＲにより増幅した。初めは配列番号７で示される塩基配列のプライマーと配列番号８で示されるアダプター領域を付加したオリゴｄＴプライマーのアダプター領域に対するプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６３℃で３０秒間のアニール、７２℃で３０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。二回目は配列番号９で示される塩基配列のプライマーとオリゴｄＴプライマーのアダプター領域に対するプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６２℃で３０秒間のアニール、７２℃で２５秒間の伸長反応を１サイクルとし、２５サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物はｐＨＳＧ２９８ベクターにサブクローニングした。いくつかのクローンをシークエンスした結果、配列番号１０で示される塩基配列を含んだ目的のｃＤＮＡ断片を取得した。
【００１８】
次に、５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、製造者の説明書に従って、配列番号６に記載の塩基配列をもとに、本酵素のＮ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡ部分を増幅した。逆転写反応では、鋳型としてニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡを、５’末端リン酸化ＲＴ−プライマーには配列番号１１で示される塩基配列のプライマーを用いた。ネスティッドＰＣＲの初めは、配列番号１２で示される塩基配列のプライマーと配列番号１３で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で３０秒間のアニール、７２℃で６０秒間の伸長反応を１サイクルとし、２５サイクル反応させた。二回目は、配列番号１４で示される塩基配列のプライマーと配列番号１５で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５７℃で３０秒間のアニール、７２℃で６０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物はｐＨＳＧ２９８ベクターにサブクローニングした。いくつかのクローンをシークエンスした結果、配列番号１６で示される塩基配列を含んだ目的のｃＤＮＡ断片を取得した。
【００１９】
既に決定していた配列と合わせて、配列番号１に示す２２８９塩基よりなる塩基配列が得られ、その配列より、アミノ酸配列が推定された。配列中には、既知のオキシドスクワレン環化酵素配列中に繰り返し認められるＱＷモチーフ［Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９ ，１５７−１５８ （１９９４）］やオキシドスクワレン環化酵素の活性部位であることが指摘されているＤＣＴＡＥモチーフ［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ ，８０２−８０４ （１９９４）］が存在した。
【００２０】
実施例１ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードする全長ｃＤＮＡの取得
参考例３で決定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡを取得するため、該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの全長ＯＲＦをＰＣＲにより増幅し、クローニングベクターｐＨＳＧ２９８に組込んだ。ＰＣＲは、ニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７と配列番号１８で示される塩基配列のプライマーを用い、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で６０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。
得られたＰＣＲ産物は制限酵素ＫｐｎＩで処理し、ｐＨＳＧ２９８のＫｐｎＩサイトに組込むことでサブクローニングを行った。ここで得たいくつかのクローンについてシークエンスを行い、参考例３で決定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡが挿入されているクローンをｐＨＳＧ−ＴＩＲとした。
【００２１】
実施例２ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの酵母での発現および機能確認
ｐＨＳＧ−ＴＩＲをＫｐｎＩで処理することにより切り出したＯＲＦを、酵母での発現プラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに組込み、ＧＡＬ１プロモーターの下流に本ＯＲＦがセンス方向に導入されているプラスミドｐＹＥＳ２−ＴＩＲを構築した。更に得られたｐＹＥＳ２−ＴＩＲプラスミドをラノステロール合成酵素欠損株である酵母変異株ｅｒｇ７（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ： ４０２１９００）に酢酸リチウム法により導入した。培養条件、ガラクトースによる発現誘導、トリテルペンモノアルコール画分の調整方法はＫｕｓｈｉｒｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．に記載されている方法と同様に行った［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５６， ２３８−２４４（１９９８）］。まず、形質転換酵母を増殖培地（ＳＣ−Ｕ、２０ ｍｇ／ｍＬ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ、５ ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ８０）に植菌し、３０ ℃で２日間振盪培養した。次に、増殖した形質転換酵母を回収し、発現誘導培地（２％ ｇａｌａｃｔｏｓｅ、ＳＣ−Ｕ ｗｉｔｈｏｕｔ ｇｌｕｃｏｓｅ、２０ ｍｇ／ｍＬ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ、５ ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ８０）に懸濁した後、３０ ℃で１０時間振とう培養した。更に、この形質転換酵母をリン酸培地（３％ ｇｌｕｃｏｓｅ、０．１ Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ｐＨ ７．０）に移し、３０ ℃で２４時間振とう培養することで、組換え酵素由来の生成物を生産させた。形質転換酵母からトリテルペンモノアルコール画分を調整する方法は次の通りである。形質転換酵母を２０％ ＫＯＨ／５０％ エタノール溶液で還流後、等量のヘキサンで３度生成物を抽出した。抽出物を濃縮後、シリカゲルカラム（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０， ＭＥＲＣＫ、ｂｅｎｚｅｎｅ ａｓ ａｎ ｅｌｕｅｎｔ）で精製することにより、トリテルペンモノアルコール画分を得た。トリテルペンモノアルコール画分はＬＣ−ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した。分析の条件と結果を以下に示す。
【００２２】
［ＨＰＬＣ条件］
Ｃｏｌｕｍｎ： ＯＤＳ−ＡＭ（ｄｉａｍｅｔｅｒ： ４．６ ｍｍ， ｌｅｎｇｔｈ： １５０ ｍｍ； ＹＭＣ社製）
Ｓｏｌｖｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ： ９８％ ＣＨ３ＣＮ ａｑ．、Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ： １ ｍｌ／ｍｉｎ、Ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐ．： ４０ ℃、Ｄｅ ｔｅｃｔｉｏｎ： ＵＶ ２０２ ｎｍ、Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｔｉｒｕｃａｌｌａ−７，２４−ｄｉｅｎ−３ｂ−ｏｌ： ２３．９ ｍｉｎ．
［ＭＳ］
イオン化法： ＡＰＣＩ（＋）、観測イオン： ４０９［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］
［１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）］
化学シフトの基準は、テトラメチルシランを０ ｐｐｍとする。
ｓ： 一重線、ｄ： 二重線、ｔ： 三重線、ｍ： 多重線を表す。Ｊはカップリング定数を表す。
ｄ（ｐｐｍ）： ０．７５（ｓ）、０．８１（ｓ）、０．８６（ｓ）、０．８８（ｄ、Ｊ＝６．３ Ｈｚ）、０．９７（ｓ）、１．０‐２．２（ ｍ）、１．６０（ｓ）、１．６８（ｓ）、３．２４（ｄｄ、Ｊ＝４．２，１１．１ Ｈｚ）、５．１０（ｔ、Ｊ＝６．５ Ｈｚ）、５．２５（ｄｄ 、Ｊ＝２．４，６．４ Ｈｚ）
［１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ＣＤＣｌ３＝７７．０ ｐｐｍ）］
化学シフトの基準は、ＣＤＣｌ３を７７ ｐｐｍとする。
ｄ（ｐｐｍ）：１３．１、１４．７、１７．６、１８．１、１８．３、２１．９、２３．９、２５．０、２５．７、２７．３、２７．６、２７．７ 、２８．２、３３．８、３４．０、３４．９、３５．９、３６．２、３７．２、３９．０、４３．５、４８．９、５０．６、５１．１、５２．９ 、７６．７、７９．３、１２５．２、１３０．９、１４５．９
【００２３】
これらの分析結果より、トリテルペンモノアルコール画分には本来酵母では生成されないチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールが含まれており、他のトリテルペンモノアルコールは含まれていないことが明らかとなった。よって本ｃＤＮＡは、高等植物から得られたオキシドスクワレン環化酵素の１つに位置づけられ、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを特異的に生成する酵素、すなわちチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードしているものと結論づけた。この結果は、酵母へ導入した組換えベクターに含まれる取得ＯＲＦ由来のチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼが酵母で発現していることを示す。
【００２４】
【発明の効果】
以上記載の如く、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードするＤＮＡのクローン化に初めて成功した。これにより、クローン化した組換えＤＮＡを発現させた細胞を用いて、優位にチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成する酵素、該酵素をコードするＤＮＡおよびイチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはこのチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種テルペノイドを製造する方法が提供される。その結果、従来知られていた多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ８Ｈ１２Ｒ．４３では不可能だったチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの効率的な生産が可能となる。
【００２５】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２，３−オキシドスクワレンからチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成する活性を有するポリペプチドであって、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成することを特徴とするポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはこのチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種テルペノイドを製造する方法に関する。チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体は他の植物由来のテルペノイドとは異なった構造を有しており、他にはない生理活性を持つことが期待されるとともに、医薬用の原料としても注目されている。
【０００２】
【従来の技術】
チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールは、トリテルペノイドに分類される植物二次代謝産物の一種で、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体はニガキ科のニガキ（Ｐｉｃｒａｓｍａ ｑｕａｓｓｉｏｉｄｅｓ）やニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）やブルケア・ジャバニカ（Ｂｒｕｃｅａ ｊａｖａｎｉｃａ）、ミカン科のパラミグニア・グリフィシー（Ｐａｒａｍｉｇｎｙａ ｇｒｉｆｉｔｈｉｉ）などに含有されていることが知られている。しかしながら、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体の製造に際し、植物体を原料として用いる場合は、栽培に多額のコストがかかるとともに、その生産性は極めて低いものとならざるを得ない。
【０００３】
また、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの生成を触媒する酵素については、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から同定された多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ８Ｈ１２Ｒ．４３［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４１ ，７７０５−７７１０ （２０００）］のみが知られている。多機能型トリテルペン合成酵素とは２，３−オキシドスクワレンを基質として、複数のトリテルペノイド化合物を生成する酵素である。多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ８Ｈ１２Ｒ．４３は２，３−オキシドスクワレンを基質として、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成すると同時に他の８種類のトリテルペノイド化合物を生成する。これら生成物中に占めるチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの割合は非常に低く、該酵素はチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの生産効率が悪い、さらには該酵素を用いた場合、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールと物理化学的性質の似たトリテルペノイド化合物を除去するための煩雑な精製が必要であるという点で産業上実用的でないと言わざるを得ない。
そこで、生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成する、もしくはチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを特異的に生成するチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの発見が望まれていた。
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４１ ，７７０５−７７１０ （２０００）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、２，３−オキシドスクワレンからチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成する活性を有する酵素であって、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成することを特徴とする酵素および該酵素をコードするＤＮＡを提供する。更にこのＤＮＡを含む組換えベクター、この組換えベクターで形質転換させた細胞およびこの形質転換細胞を用いてチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼ、該酵素をコードするＤＮＡおよびチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはこのチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種テルペノイドを製造する方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、トリテルペンシンターゼの保存領域に相補的な縮重プライマーを用い、ニガキ科のニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）から抽出した全ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ、さらにはＲＡＣＥを行い、１種類のトリテルペンシンターゼｃＤＮＡをクローニングした。本ｃＤＮＡの全長のＯＲＦを酵母発現ベクターに組込み、ラノステロールシンターゼを欠く酵母に形質転換して機能解析を行った結果、該酵母において本来生合成されないチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの生産が認められたことから、本ｃＤＮＡがチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードしていることを確認した。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の態様は、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドおよび／または配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、第２の態様は、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡおよび／または配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡが挙げられる。本発明の第３の様態は、第２の様態に記載のＤＮＡを含む組換えベクターである。本発明の第４の様態は、上記組換えベクターで形質転換された細胞である。また、本発明の第５の様態は、上記形質転換細胞を用いて、植物二次代謝産物を製造する方法である。この植物二次代謝産物はチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成されるテルペノイドであってもよい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ニガキ科のニワウルシ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）からチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードするｃＤＮＡを単離したが、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体を産生する植物であれば、本発明と実質的に同一の酵素が含まれていると推測され本明細書に記載の方法を用いればそれら植物からでも、本発明のチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼと実質的に同一の酵素をコードするｃＤＮＡを単離することができる。
【０００９】
本発明に係るチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼとは、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成する反応を触媒するポリペプチドを指しており、その起源は特に限定されないが、好ましくは植物由来であり、そのようなものとして例えば、ニガキなどのニガキ科Ｐｉｃｒａｓｍａ属植物、ニワウルシなどのニガキ科Ａｉｌａｎｔｈｕｓ属植物、ブルケア・ジャバニカなどのニガキ科Ｂｒｕｃｅａ属植物、パラミグニア・グリフィシーなどのミカン科Ｐａｒａｍｉｇｎｙａ属植物などを挙げることが出来る。
【００１０】
本発明の遺伝子とは、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を指しており、その起源は特に限定されないが、好ましくは植物由来であり、そのようなものとして例えば、ニガキなどのニガキ科Ｐｉｃｒａｓｍａ属植物、ニワウルシなどのニガキ科Ａｉｌａｎｔｈｕｓ属植物、ブルケア・ジャバニカなどのニガキ科Ｂｒｕｃｅａ属植物、パラミグニア・グリフィシーなどのミカン科Ｐａｒａｍｉｇｎｙａ属植物などを挙げることが出来る。
【００１１】
本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクターに関するものである。組換えベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーター、ターミネーターおよび複製起点等を含有する。組換えベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。
【００１２】
更に、本発明は組換えベクターを用いて形質転換された細胞に関する。宿主としては原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば酵母または糸状菌などが使用できる。さらに昆虫細胞、動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としてはマウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。組換えベクターによる宿主の形質転換は常法によって行うことができる。
【００１３】
加えて、本発明はチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよびその誘導体の製造方法に関する。製造方法としては（ｉ）基質である２，３−オキシドスクワレンを含有する宿主を組換えベクターで形質転換して宿主細胞内で製造する方法（ｉｉ）組換え酵素に基質である２，３−オキシドスクワレンを投与して製造する方法を挙げることができる。（ｉ）としては、例えば以下実施例に記載の通り、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主となる酵母を形質転換し、組換え酵素を発現させることによりチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを製造することができる。また、（ｉｉ）としては、例えば組換え酵素を発現する細胞の破砕液に基質である２，３−オキシドスクワレンを投与することで反応させ、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを製造することができる。さらに、宿主細胞にチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを代謝する活性が備わっていれば、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを基質として宿主細胞の活性に依存した代謝産物、すなわちチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オール誘導体を製造することもできる。
【００１４】
本発明でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成するとは、上記（ｉ）または（ｉｉ）の製造方法において、本発明の酵素の活性に依存した代謝産物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールが最も優位に多いということであり、例えば、酵素を発現している細胞の培養液や培養物からトリテルペンモノアルコール画分を抽出し、その抽出物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールのモル比が最も高いということである。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１ 全ＲＮＡの抽出
ニワウルシの葉より全ＲＮＡを抽出した。抽出方法には改変ＣＴＡＢ法（植物のＰＣＲ実験プロトコール、秀潤社）を用いた。
【００１６】
参考例２ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの部分的ｃＤＮＡ断片の単離
チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの部分的ｃＤＮＡ断片を単離するために、ニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型として、報告された植物 のトリテルペンシンターゼ配列における保存領域からデザインした縮重プライマーを用いてネスティッドＰＣＲを行なった。初めは配列番号２で示される塩基配列のプライマーと配列番号３で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５４℃で３０秒間のアニール、７２℃で９０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。二回目は配列番号４で示される塩基配列のプライマーと配列番号５で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で７０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物はｐＨＳＧ２９８ベクター（ＴａＫａＲａ社製）にサブクローニングした。いくつかのクローンをシークエンスした結果、配列番号６で示される塩基配列から成る目的のｃＤＮＡ断片を取得した。
【００１７】
参考例３ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードする全長塩基配列の決定
配列番号６に記載の塩基配列をもとに、本酵素のＣ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡ部分をニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型にネスティッドＰＣＲにより増幅した。初めは配列番号７で示される塩基配列のプライマーと配列番号８で示されるアダプター領域を付加したオリゴｄＴプライマーのアダプター領域に対するプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６３℃で３０秒間のアニール、７２℃で３０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。二回目は配列番号９で示される塩基配列のプライマーとオリゴｄＴプライマーのアダプター領域に対するプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６２℃で３０秒間のアニール、７２℃で２５秒間の伸長反応を１サイクルとし、２５サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物はｐＨＳＧ２９８ベクターにサブクローニングした。いくつかのクローンをシークエンスした結果、配列番号１０で示される塩基配列を含んだ目的のｃＤＮＡ断片を取得した。
【００１８】
次に、５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、製造者の説明書に従って、配列番号６に記載の塩基配列をもとに、本酵素のＮ末端アミノ酸配列に相当するｃＤＮＡ部分を増幅した。逆転写反応では、鋳型としてニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡを、５’末端リン酸化ＲＴ−プライマーには配列番号１１で示される塩基配列のプライマーを用いた。ネスティッドＰＣＲの初めは、配列番号１２で示される塩基配列のプライマーと配列番号１３で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５５℃で３０秒間のアニール、７２℃で６０秒間の伸長反応を１サイクルとし、２５サイクル反応させた。二回目は、配列番号１４で示される塩基配列のプライマーと配列番号１５で示されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒間のディネーチャー、５７℃で３０秒間のアニール、７２℃で６０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物はｐＨＳＧ２９８ベクターにサブクローニングした。いくつかのクローンをシークエンスした結果、配列番号１６で示される塩基配列を含んだ目的のｃＤＮＡ断片を取得した。
【００１９】
既に決定していた配列と合わせて、配列番号１に示す２２８９塩基よりなる塩基配列が得られ、その配列より、アミノ酸配列が推定された。配列中には、既知のオキシドスクワレン環化酵素配列中に繰り返し認められるＱＷモチーフ［Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９ ，１５７−１５８ （１９９４）］やオキシドスクワレン環化酵素の活性部位であることが指摘されているＤＣＴＡＥモチーフ［Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ ，８０２−８０４ （１９９４）］が存在した。
【００２０】
実施例１ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードする全長ｃＤＮＡの取得
参考例３で決定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡを取得するため、該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの全長ＯＲＦをＰＣＲにより増幅し、クローニングベクターｐＨＳＧ２９８に組込んだ。ＰＣＲは、ニワウルシの葉から抽出した全ＲＮＡより作製したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７と配列番号１８で示される塩基配列のプライマーを用い、９４℃で３０秒間のディネーチャー、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で６０秒間の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクル反応させた。
得られたＰＣＲ産物は制限酵素ＫｐｎＩで処理し、ｐＨＳＧ２９８のＫｐｎＩサイトに組込むことでサブクローニングを行った。ここで得たいくつかのクローンについてシークエンスを行い、参考例３で決定したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡが挿入されているクローンをｐＨＳＧ−ＴＩＲとした。
【００２１】
実施例２ チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの酵母での発現および機能確認
ｐＨＳＧ−ＴＩＲをＫｐｎＩで処理することにより切り出したＯＲＦを、酵母での発現プラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに組込み、ＧＡＬ１プロモーターの下流に本ＯＲＦがセンス方向に導入されているプラスミドｐＹＥＳ２−ＴＩＲを構築した。更に得られたｐＹＥＳ２−ＴＩＲプラスミドをラノステロール合成酵素欠損株である酵母変異株ｅｒｇ７（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ： ４０２１９００）に酢酸リチウム法により導入した。培養条件、ガラクトースによる発現誘導、トリテルペンモノアルコール画分の調整方法はＫｕｓｈｉｒｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．に記載されている方法と同様に行った［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５６， ２３８−２４４（１９９８）］。まず、形質転換酵母を増殖培地（ＳＣ−Ｕ、２０ ｍｇ／ｍＬ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ、５ ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ８０）に植菌し、３０ ℃で２日間振盪培養した。次に、増殖した形質転換酵母を回収し、発現誘導培地（２％ ｇａｌａｃｔｏｓｅ、ＳＣ−Ｕ ｗｉｔｈｏｕｔ ｇｌｕｃｏｓｅ、２０ ｍｇ／ｍＬ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ、５ ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ８０）に懸濁した後、３０ ℃で１０時間振とう培養した。更に、この形質転換酵母をリン酸培地（３％ ｇｌｕｃｏｓｅ、０．１ Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ｐＨ ７．０）に移し、３０ ℃で２４時間振とう培養することで、組換え酵素由来の生成物を生産させた。形質転換酵母からトリテルペンモノアルコール画分を調整する方法は次の通りである。形質転換酵母を２０％ ＫＯＨ／５０％ エタノール溶液で還流後、等量のヘキサンで３度生成物を抽出した。抽出物を濃縮後、シリカゲルカラム（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０， ＭＥＲＣＫ、ｂｅｎｚｅｎｅ ａｓ ａｎ ｅｌｕｅｎｔ）で精製することにより、トリテルペンモノアルコール画分を得た。トリテルペンモノアルコール画分はＬＣ−ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した。分析の条件と結果を以下に示す。
【００２２】
［ＨＰＬＣ条件］
Ｃｏｌｕｍｎ： ＯＤＳ−ＡＭ（ｄｉａｍｅｔｅｒ： ４．６ ｍｍ， ｌｅｎｇｔｈ： １５０ ｍｍ； ＹＭＣ社製）
Ｓｏｌｖｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ： ９８％ ＣＨ３ＣＮ ａｑ．、Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ： １ ｍｌ／ｍｉｎ、Ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐ．： ４０ ℃、Ｄｅ ｔｅｃｔｉｏｎ： ＵＶ ２０２ ｎｍ、Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｔｉｒｕｃａｌｌａ−７，２４−ｄｉｅｎ−３ｂ−ｏｌ： ２３．９ ｍｉｎ．
［ＭＳ］
イオン化法： ＡＰＣＩ（＋）、観測イオン： ４０９［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］
［１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）］
化学シフトの基準は、テトラメチルシランを０ ｐｐｍとする。
ｓ： 一重線、ｄ： 二重線、ｔ： 三重線、ｍ： 多重線を表す。Ｊはカップリング定数を表す。
ｄ（ｐｐｍ）： ０．７５（ｓ）、０．８１（ｓ）、０．８６（ｓ）、０．８８（ｄ、Ｊ＝６．３ Ｈｚ）、０．９７（ｓ）、１．０‐２．２（ ｍ）、１．６０（ｓ）、１．６８（ｓ）、３．２４（ｄｄ、Ｊ＝４．２，１１．１ Ｈｚ）、５．１０（ｔ、Ｊ＝６．５ Ｈｚ）、５．２５（ｄｄ 、Ｊ＝２．４，６．４ Ｈｚ）
［１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ＣＤＣｌ３＝７７．０ ｐｐｍ）］
化学シフトの基準は、ＣＤＣｌ３を７７ ｐｐｍとする。
ｄ（ｐｐｍ）：１３．１、１４．７、１７．６、１８．１、１８．３、２１．９、２３．９、２５．０、２５．７、２７．３、２７．６、２７．７ 、２８．２、３３．８、３４．０、３４．９、３５．９、３６．２、３７．２、３９．０、４３．５、４８．９、５０．６、５１．１、５２．９ 、７６．７、７９．３、１２５．２、１３０．９、１４５．９
【００２３】
これらの分析結果より、トリテルペンモノアルコール画分には本来酵母では生成されないチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールが含まれており、他のトリテルペンモノアルコールは含まれていないことが明らかとなった。よって本ｃＤＮＡは、高等植物から得られたオキシドスクワレン環化酵素の１つに位置づけられ、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを特異的に生成する酵素、すなわちチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードしているものと結論づけた。この結果は、酵母へ導入した組換えベクターに含まれる取得ＯＲＦ由来のチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼが酵母で発現していることを示す。
【００２４】
【発明の効果】
以上記載の如く、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼをコードするＤＮＡのクローン化に初めて成功した。これにより、クローン化した組換えＤＮＡを発現させた細胞を用いて、優位にチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成する酵素、該酵素をコードするＤＮＡおよびイチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールおよび／またはこのチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成される各種テルペノイドを製造する方法が提供される。その結果、従来知られていた多機能型トリテルペン合成酵素ＹＵＰ８Ｈ１２Ｒ．４３では不可能だったチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールの効率的な生産が可能となる。
【００２５】
【配列表】
Claims (9)
- ２，３−オキシドスクワレンからチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを生成する活性を有するポリペプチドであって、２，３−オキシドスクワレンを基質とした場合に得られる生成物中でチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールを最も高い割合で生成することを特徴とするポリペプチド。
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
- 請求項１又は請求項２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
- 配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
- 請求項３〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
- 請求項６に記載の細胞を用いて、チルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法。
- 請求項６記載の細胞を用いて植物二次代謝産物を製造する方法。
- 植物二次代謝産物がチルカラ−７，２４−ジエン−３β−オールから生合成されるテルペノイドである請求項８記載の方法。
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|---|---|---|---|---|
| JP2006318761A (ja) * | 2005-05-12 | 2006-11-24 | Sony Corp | 電解質および電池 |
| WO2020121335A1 (en) * | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Council Of Scientific & Industrial Research | A process for producing tirucalladienol for synthesis of limonoids |
| WO2020249698A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Plant Bioscience Limited | Biosynthetic genes and polypeptides |
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