JP2005052003A

JP2005052003A - New polypeptide having uba domain and dna encoding the same

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Publication number: JP2005052003A
Application number: JP2003205253A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Koga; 比佐志古閑; Takahiro Nagase; 隆弘長瀬
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Kazusa DNA Research Institute Foundation
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Kazusa DNA Research Institute Foundation
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2005-03-03

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new DNA useful for screening, etc., of a prophylactic agent, a therapeutic agent or a testing agent related to proliferation/differentiation and functional maintenance of various kinds of organs, related to proliferation/differentiation and functional maintenance of cells such as cancer, autoimmune disease/allergy or related to aging and dysfunction and to provide a gene containing the DNA, a new polypeptide encoded with the DNA, a recombinant protein containing the polypeptide and an antibody against the new polypeptide. <P>SOLUTION: The DNA is composed of a base sequence encoding the following polypeptide (a) or (b). (a) a polypeptide composed of part or all of an amino acid sequence which is the same as or substantially the same as a specific amino acid sequence derived from a mouse or (b) a polypeptide composed of an amino acid sequence in which a part of amino acids are deleted, substituted or added in the specific amino acid sequence derived from the mouse and having substantially the same biological activity as that of the polypeptide (a). <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＵＢＡドメインを有し、肺、腎臓、精巣、心臓に於いて高い発現が、また各種臓器に普遍的な発現が認められる新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、並びに、新規ポリペプチドに対する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のヒトゲノムプロジェクト及びヒトｃＤＮＡプロジェクトの成功により、多くのヒト疾患関連遺伝子が同定あるいは推定されるにいたった。しかしながらその一方で倫理上の問題からヒト遺伝子を用いた研究には制約があり、新たな研究の方向性が模索されている。このような観点からモデル生物における相同遺伝子を同定することは、研究を進展させる意味できわめて重要なステップと考えられる。特にマウスは最も研究が進んでいるモデル生物で、ゲノム情報や変異種の情報も比較的多く蓄積されているが、蓄積されたゲノム情報はまだ十分なものではない。一方、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究がなされ、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録、公開がなされた。しかし、多くのＥＳＴは１００塩基長から５００塩基長といった短い塩基配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００３】
各種臓器においては、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。また、各種臓器における機能の調節には、機能を受け持つ特異的な細胞の増殖あるいは同細胞の活性化が関係している。従って、肺、腎臓、精巣、心臓で特に強い発現が、また各種臓器に普遍的な発現が認められる新規な遺伝子を取得して、その遺伝子にコードされる各種臓器に普遍的でかつ複雑な機能を調節する蛋白質を得ることは、医薬品開発に有用である。また、得られた蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現している該蛋白質の遺伝子の機能をホモロジー検索から推定し、その情報を基にして該蛋白質を適当な発現系で発現させて組換え蛋白質を得、更にして該蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることが必要であった。
【０００４】
長鎖ヒトｃＤＮＡプロジェクトにて、ヒト脳由来のヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子（Ｓｅｋｉ，Ｎ．，Ｏｈｉｒａ，Ｍ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．，Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｎ．，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｄ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｎ．ａｎｄＯｈａｒａ，Ｏ．，ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ４（５），３４５−３４９（１９９７），ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｃｌｏｎｅｓｉｎｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｉｅｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｒａｉｎ．ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＢ００７９２２，６３７６ｂｐ，１，１１８ａａ，Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ，ｃＤＮＡ，ＫＩＡＡ０４５３，ＯｈａｒａＯ．ｅｔａｌ．）が報告されているが、その機能については不明であった。
ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子は染色体１ｐ３６．３１−ｐ３６．１１に存在し、更に、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子のＳＮＰｓも複数箇所報告されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｃｍｄ＝Ｄｉｓｐｌａｙ＆ｄｏｐｔ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＿ｓｎｐ＆ｆｒｏｍ＿ｕｉｄ＝６６３４０３６）、ヒト疾患の大部分が単なる遺伝子の欠失によって引き起こされるのではなくて、アミノ酸置換によって蛋白質の機能や活性が一部分だけ変化することにより引き起こされることを鑑みると、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子は各種臓器の分化やその機能保全に関わる、あるいは癌、ウイルス感染、自己免疫疾患、及びアレルギーといった細胞の増殖・分化に関わる疾患に関与している可能性が考えられる。ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子にコードされるポリペプチドは１，１１８アミノ酸長（初期の論文の値では、１，０５２アミノ酸長であったがその後改訂がなされた）で、重要なドメインが認めらなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
１．ＢｕｃｈｂｅｒｇｅｒＡ．，２００２，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：２１６−２２１，ＦｒｏｍＵＢＡｔｏＵＢＸ：ｎｅｗｗｏｒｄｓｉｎｔｈｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎｖｏｃａｂｕｌａｒｙ．
【非特許文献２】
２．ＨｏｆｍａｎｎＫ．，ＢｕｃｈｅｒＰ．，１９９６，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１７２−１７３．，ＴｈｅＵＢＡｄｏｍａｉｎ：ｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｅｆｐｒｅｓｅｎｔｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｅｎｚｙｍｅｃｌａｓｓｅｓｏｆｔｈｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎｐｈａｔｈｗａｙ．
【非特許文献３】
３．佐伯泰、川原裕之、横沢英良、実験医学、２００３、２１：３４０−３４５、ユビキチンと相互作用するドメイン構造
【非特許文献４】
４．Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔａｌ．，１９９８，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ，５：１０４２−１０４７，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｈｕｍａｎＤＮＡｒｅｐａｉｒｐｒｏｔｅｉｎＵＢＡｄｏｍａｉｎｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈＨＩＶ−１Ｖｐｒ．
【非特許文献５】
５．ＭｕｅｌｌｅｒＴ．Ｄ．，ＦｅｉｇｏｎＪ．，２００２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１９：１２４３−１２５５，ＳｏｌｕｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＵＢＡｄｏｍａｉｎｓｒｅｖｅａｌａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｓｕｒｆａｃｅｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．
【非特許文献６】
６．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．，Ｍｉｌｐｅｔｚ，Ｆ．，Ｂｏｒｋ，Ｐ．ａｎｄＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．，１９９８，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９５：５８５７−５８６４，．ＳＭＡＲＴ，ａｓｉｍｐｌｅｍｏｄｕｌａｒａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ．
【非特許文献７】
７．田中啓二、実験医学、１９９７、１５：２０５６−２０６２、ユビキチン／プロテアソームと疾患
【非特許文献８】
８．阿南正、中尾光善、蛋白質・核酸・酵素、４４：７７６−７８６、ユビキチン病の分子機構−ユビキチン／プロテアソームに関連した疾患群−
【非特許文献９】
９．鈴木俊顕、志村秀樹、服部信孝、実験医学、２０００、１８：１４７８−１４８２、ユビキチンと神経性疾患
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
従来、ヒト長鎖ｃＤＮＡプロジェクトでヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子が取得されていたが、遺伝子情報が完全でなく、その機能に関する情報も不完全であった。一方、肺、腎臓、精巣、心臓で特に強い発現が、また各種臓器に普遍的に発現する新規遺伝子を取得し、該遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質あるいはその蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることは、細胞内で該蛋白質が他の蛋白質との結合を阻害する化合物を、あるいはシグナル伝達等に影響及ぼす化合物をスクリーニングするのに重要である。
【０００７】
従って、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子に関連する新規遺伝子を取得し、新規モチ−フを取得し、同遺伝子の組織特異的発現パターンを得て、本発明の新規遺伝子がコードする蛋白質の機能に関する情報を得ることは、本発明のポリペプチドの特異的結合蛋白質や、アゴニスト、アンタゴニストを検索する際の非常に重要な手段となる。上記のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質が見出されなくても、本発明のポリペプチドの不活化実験（例えばノックアウト動物の作製）からそのポリペプチドの生理作用を解析することにより、本発明のポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することが可能であり、本発明のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、各種臓器に関わる疾患の患者の機能不全に関連する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬として活用することが可能となる。
生体での本発明のポリペプチドの機能の低下または昂進が、各種臓器に関わる疾患の原因となっている場合が考えられる場合がある。この場合には、そのポリペプチド該蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、そのポリペプチドの各種臓器をターゲットとした本発明のポリペプチド投与や、そのポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸の投与、あるいは該遺伝子を用いた遺伝子治療に応用することもできる。この場合には本発明のポリペプチドをコードする塩基配列は、本発明のポリペプチドの各種臓器に関わる疾患の患者の遺伝子欠失や変異の有無を調べるために必要な情報であり、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明のポリペプチドの機能不全に関与する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬に応用することができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、その遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側にヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子になかった全く新しい７９９アミノ酸長の配列が付加していること、また、得られた遺伝子が肺、腎臓、精巣において高く、心臓に於いてやや高く、肝臓、胸腺、眼、平滑筋において少し高いが脳に於いてやや弱く、調べた限りの全ての臓器で発現が認められること、また、発生の全過程に於いて発現していることを見出した。更に、得られた遺伝子情報を解析することにより、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子がコードするポリペプチド配列に対してＮ−末端側に７９９アミノ酸伸張している本発明のポリペプチド配列には、ＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが存在することを発見し、それらのドメインが細胞内の重要な機能に係わっていることを示し、更にその遺伝子情報をもとに新規ポリペプチドとそれに特異的な抗体を得て、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部（例えば、以下に示すＵＢＡドメインを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において８４番目（メチオニン）〜１，９１８番目（トリプトファン）の１，８３５個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、に係る。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列（配列番号：２の塩基対第３〜５，７５６番目の５，７５４塩基対長）及びその一部（例えば、以下に示すＵＢＡドメインを有する配列の少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において８４番目（メチオニン）〜１，９１８番目（トリプトファン）の１，８３５個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに係る。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明のＤＮＡ」ともいう。本発明のＤＮＡは、新規ポリペプチドをコードするものである。又、本発明はこれらＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、哺乳動物が齧歯類である齧歯類由来遺伝子、特に齧歯類がマウスであるマウス遺伝子にも係る。特に、マウス遺伝子は「マウスＫＩＡＡ０４５３遺伝子」ともいう。
更に、本発明は本発明のＤＮＡ又は遺伝子（以下、「ＫＩＡＡ０４５３遺伝子」ともいう。）にコードされるポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」ともいう。）、例えば、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質であるポリペプチド（以下、「ＫＩＡＡ０４５３蛋白質」ともいう）に係る。
また、本発明は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を含む組換えベクター、及び、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩に特異的に結合する抗体に係る。
【００１０】
また、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、該ポリペプチドに対する抗体を用いることによって、該蛋白質の発現量を変化させる化合物、該蛋白質に結合する蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法などを提供する。更に、本発明ポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩を用いることを特徴とする、それら物質と特異的に結合する物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニング用キット等も提供する。
【００１１】
更に、本発明は、本発明のＤＮＡ、本発明のＤＮＡを含有する組換えベクター又は発現ベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又はその塩の製造方法、及び、こうして得られる本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質またはその塩を提供する。又、本発明は、本発明のＤＮＡを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質をコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド又はそれらを含有してなる医薬、本発明のＤＮＡの配列情報を基に合成した短い２重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）又はそれらを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を含有してなる医薬を提供する。
更に、本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて得られる、所謂、ＤＮＡチップ（アレイ）、プロテインチップにも係る。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、本発明者により採取されたマウス脳由来ｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４：５３−５９）に従って調製したマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、約４５，０００個の組換え体を選択した。次に、このクローンのうち約８，０００個の３’末端ＤＮＡ配列を決定し、その中から、その中から、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子に高い相同性を有するクローンを選択し全塩基配列の決定を行なった。次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（ＧＣＧ，Ｆａｓｔａ＆Ｂｌａｓｔ）を用いてホモロジー検索を行なった
すなわち、マウス脳由来由来ｃＤＮＡライブラリーに対し、ヒト長鎖ｃＤＮＡ（ＫＩＡＡ０４５３）にホモロジーを有する遺伝子取得を試みたところ、驚くべきことにヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側に対し７９９アミノ酸長の新規アミノ酸配列が付加した構成のより長い新規アミノ酸配列（全長が１，９１８アミノ酸長）を有する新規ポリペプチドをコードする新規遺伝子が取得することに成功した。
その結果、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子がコードするアミノ酸配列（１，１１８アミノ酸長）のほぼ全長（１番目から１，１１８番目までの１，１１８アミノ酸長）と本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列（１，９１８アミノ酸長）の８００番目から１，９１８番目までのアミノ酸配列（１，１１９アミノ酸長）とで、約９７．０４％という有意な相同性を有する、配列番号：２に示される塩基配列を有するクローンを取得した（クローン名：ｍｂｇ０１９６９）。
【００１３】
取得したｍｂｇ０１９６９にコードされるポリペプチド（本発明のポリペプチド）のアミノ酸配列は１，９１８アミノ酸長であり、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４：３４５−３４９，ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＢ００７９２２）にコードされている蛋白のアミノ酸配列（１，１１８アミノ酸長）に比較し相同部分を除外すると、Ｎ−末端側に７９９アミノ酸長分の伸長が認められた。得られた「本発明のポリペプチド」のアミノ酸配列について、以下の実施例に記載したように、公共のデータベースを用いてホモロジー検索を行った結果、今までに出願された配列に対して「本発明のポリペプチド」の配列のうち３８７アミノ酸長、１，１４８アミノ酸長、及び５５７アミノ酸長について比較的高いホモロジーが認められた。しかし、それらは本発明の「本発明のポリペプチド」（１，９１８アミノ酸長）の全長をカバーするものでなく、部分的な短い配列にホモロジーが認められるのみで、本発明による「本発明のポリペプチド」配列の解明により、ようやく新規配列蛋白とその機能を述べること可能となった。
尚、配列番号：２に示される塩基配列を有する本発明のＤＮＡを含むプラスミド（プラスミド表示名：ｍｂｇ０１９６９）は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年７月２日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９４１９が付されている。
【００１４】
ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子の配列は６，３７５塩基対長であり、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは１，１１８アミノ酸である（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４：３４５−３４９，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０４５３／，ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＢ００７９２２）。ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子ホモログを詳細に研究することにより、Ｎ−末端側にはさらにポリペプチドがコードされている可能性について検証される可能性がある。本発明のＤＮＡにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは１，９１８アミノ酸であるが、本発明のＤＮＡに対するホモログについて更に詳細に研究することにより、Ｎ−末端側に更に伸張してポリペプチドがコードされていることを見つける可能性がある。
【００１５】
尚、当業者であれば、本明細書によって初めて開示された配列番号：２に示した塩基配列に基づいてクローンの５’側に適当なプライマー（例えば、配列番号：２の塩基対第６１〜８０番目５’−ＴＧＡＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＣＴＣ−３に対応させて合成した配列５’−ＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡ−３’ ）を調製し、該プライマーと市販されている哺乳動物由来のｍＲＮＡ、あるいは哺乳動物由来組織から調製した哺乳動物由来のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なった後に逆転写反応を行なうことにより本発明のＤＮＡの上流側（遺伝子の５’側）の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片を特異的に合成することができる。合成した５’側の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した後、配列番号２の一部分をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来ＫＩＡＡ０４５３遺伝子の全領域を調製することが可能である。あるいは他の方法、例えば、本発明のＤＮＡをプローブとして用いれば、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ０４５３遺伝子の５’末端領域を調製することができる。
更に、本発明のＤＮＡ配列及び本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が開示されている以上、当業者であれば、これらの情報に基づき、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ０４５３遺伝子の５’末端領域を容易に取得することができる。又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ０４５３遺伝子の全領域を調製することが可能である。
【００１６】
本発明のＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。各種哺乳動物由来の各種臓器、例えば、脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胸腺、筋肉、骨髄等、あるいは発生の各段階の各種組織・細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織、あるいはそれらの細胞質よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１７】
配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。従って、本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを挙げることができる。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。又、本発明のポリペプチドには、例えば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１〜３５番目のアミノ酸）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドも含まれる。
【００１８】
更に、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、好ましくは更に配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと同質の生物学的活性を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。かかる条件下で、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ（ベーリンガー・マンハイム社製ＣａｔＮｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧＥａｓｙＨｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製ＣａｔＮｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１９】
本発明のＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２０】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、（１）本発明のＤＮＡ又は本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、ＣＭＶウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した発現ベクター等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、あるいはそれらプロモーターを組み合わせまたは複合させたプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＨＳＰプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００２１】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
【００２２】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、あるいはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｂ株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル腎臓細胞由来ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞あるいはヒトミエローマ細胞などが用いられる。
【００２３】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献を参照することができる。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２４】
このようにして得られた、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２５】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明のポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことができる。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することもできる。更に、トリプシン、キモトリプシン、ＦａｃｔｏｒＸａ、トロンビン、又は、ＫＥＸ２プロテアーゼのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００２６】
本発明のポリペプチド（蛋白質）は、Ｃ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ−末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
【００２７】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）がＣ−末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ−末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの一部からなるペプチドとしては、前記した本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明の組換え蛋白質と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。このような部分ペプチドの具体例としては、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の中の、Ｎ−末端側にＵＢＡドメインを有する配列を含むもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において８４番目（メチオニン）〜１，９１８番目（トリプトファン）の１，８３５個のアミノ酸から成るポリペプチドを挙げることができる。又、本発明の部分ペプチドはＣ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ−末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２９】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）又はその一部からなるペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００３０】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することもできる。例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００３１】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルオキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００３２】
本発明の一部からなるペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当な蛋白質限定分解酵素で切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（２）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）（３）矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成広川書店。
又は、一部からなるペプチドは、例えば、Ｃ−末端から十数残基の配列或いは配列番号：１で示されるアミノ酸配列の任意の場所の十数残基の部分を公知のペプチド合成装置等を用いて合成することができる。更に、このような部分ぺプチドは例えば約５０から５００アミノ酸長までの長さの適当な部位のポリペプチド、または約５００アミノ酸長から全長までの長さの適当な場部位のポリペプチドを選択して、組換え蛋白質として前述の遺伝子組換え技術を用いて製造しても良い。
反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３３】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩と特異的に結合する抗体は、それらを特異的に認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドを抗原として用い、当業者に公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。このように免疫原として使用できる部分ぺプチドの例として、配列番号１に示される本発明ポリペプチドのＣ末端における十数個〜１００個程度の連続したアミノ酸から成るペプチドを挙げることができる。
例えば、ポリクローナル抗体の場合には、上記抗原を単独、又は、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の適当な担体に結合させて、アジュバントの存在又は非存在下で、例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの適当な動物に対して免疫誘導することによって容易に得ることができる。ポリクローナル抗体は免疫された動物の血清から公知の様々な方法によって回収及び精製することができる。
一方、モノクローナル抗体を製造するためには、例えば、上記の免疫された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、公知の不死化増殖細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等の骨髄腫細胞株）との細胞融合により、ハイブリドーマを作成する。これを更にクローニングし、本発明のポリペプチド等に特異的に認識する抗体を生産しているハイブリドーマのクローンを選別し、該ハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を回収し精製することによって容易に得ることができる。
尚、合成ペプチドに対する抗体の作製と抗体の精製に関する参考文献として、例えば、新細胞工学実験プロトコル、東大医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年、２−２−２，合成ペプチドに対する抗体の作製、ｐ２１０−２１７を挙げることができる。
更に、当業者には公知である様々な遺伝子工学的手法により、こうして得られた抗体の抗原決定基等を含む、ヒト化抗体等の各種キメラ抗体も容易に製造することができる。本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチド（蛋白質）等を検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチド（蛋白質）の検出、被検細胞内における本発明のポリペプチド（蛋白質）の挙動の分析などのために使用することができる。
【００３４】
更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明のポリペプチド（蛋白質）等の定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、及び組織染色等による検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）等が関与する疾病の診断を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることができる。
【００３５】
これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＡ））、同書Ｖｏｌ．７３（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．７４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＣ））、同書Ｖｏｌ．８４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＥ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＧｅｎｅｒａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＩ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３６】
本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３７】
更に、本発明のポリペプチド（蛋白質）等は、これら物質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチド（蛋白質）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、該物質又はそれらの塩の活性を阻害する化合物（以下、「阻害剤」ともいう）のスクリーニング方法、及びその為のスクリーニング用キットを提供する。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物である。該化合物またはその塩は、本発明の蛋白質等の活性を直接阻害するものであってもよいし、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の発現を阻害することによって間接的に本発明のポリペプチド（蛋白質）等の活性を阻害するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。
【００３８】
本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子をプローブとして使用することにより、ヒトにおける本発明のポリペプチド又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。更に、本発明のＫＩＡＡ０４５３遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明のポリペプチド（蛋白質）等を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。前者の場合、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を適当なベクターをベヒクルとして使用し、ベクターにのせた形の該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
【００３９】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００４０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：１，９１８）を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を含む、クローンｍｂｇ０１９６９の全塩基配列（６，１０６塩基対）を示す。
【００４１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている方法に従った。
【００４２】
（１）マウス脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ａｔｔＢ１部位を有するオリゴヌクレオチド：５’−ＦｇｃＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）_１８−３’（Ｆ、ｇおよびｃは、それぞれフルオレッセイン基、フォスフォロチオエイト修飾Ｇ、フォスフォロチオエイト修飾Ｃ残基を表す）をプライマーとして、マウスの成体（８週令雄のＢＡＬＢ／ｃマウス）脳由来ｍＲＮＡを鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにａｔｔＢ１部位を有するアダプターをｃＤＮＡにライゲーションした。その後、アガロースゲルで１ｋｂ−２ｋｂ、２ｋｂ−３ｋｂ、３ｋｂ−５ｋｂ、５ｋｂ−７ｋｂ、７ｋｂ−１１ｋｂと１１ｋｂ−１３ｋｂにｃＤＮＡをサイズ分画した。これらを、サイズを小さくしたａｔｔＰｐＳＰＯＲＴ−１エントリーベクター（インビトロジェン社製）にＢＰ反応により移し換えた後、大腸菌ＥｌｅｃｔｏｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポーレーション法により導入した。プレートに出現した１０^６個以上の形質転換体を集め、液体培地中で、３７℃で２−３時間培養した後プラスミドを調製した。スーパーコイルドプラスミドの形でサイズ分画した後、ＬＲ反応によりａｔｔＲｐＢＣデスティネーションベクター（インビトロジェン社製）にｃＤＮＡを移し換えた。このプラスミドを精製後、ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポーレーション法により導入し、各分画が期待されるサイズになるまで、上記の分画操作を２−３回繰り返した。最後に各分画ごとにＤＨ１０Ｂ株にプラスミドを導入した。なお、ここで用いた試験管内での相同組み換え反応を利用したクローニングシステムは小原等の方法（ＮｕｃｒｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２９，ｅ２２（２００１）およびＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ．９，４７−５７（２００２））に従った。
次に、５ｋｂ−７ｋｂ画分に含まれる約８，０００個のクローンの末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、ヒトＫＩＡＡ０４５３に相同性が高いクローンのｃＤＮＡに関して全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７００）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
【００４３】
（２）ホモロジー検索による本発明ＤＮＡを含むクローンの決定
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（Ｆａｓｔａ＆Ｂｌａｓｔ）を用いたホモロジー検索を実施したところ、公開されているデータベースの中のヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子と高いホモロジーを示す候補クローンｍｂｇ０１９６９が見出された。更に、別のＤＮＡ解析プログラム（ＢＥＳＴＦＩＴ）を用いて、このクローンｍｂｇ０１９６９とヒトＫＩＡＡ０４５３のアミノ酸配列と塩基配列について比較したところ、アミノ酸配列のレベルでは、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子がコードするアミノ酸配列（１，１１８アミノ酸長）の全長（１番目から１，１１８番目）と本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列（１，９１８アミノ酸長）の８００番目から１，９１８番目までアミノ酸配列（１，１１９アミノ酸長）について、約９７．０４％のホモロジーを示すことが判明した。
公開されたポリペプチドのアミノ酸配列に関するデータベースを検索すると、複数の報告があったが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体をカバーする報告はなかった。詳しくには、次に示す公開されたポリペプチドのアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチド１，９１８アミノ酸長のポリペプチドアミノ酸配列塩基配列は長く、新規配列の付加が認められた。
１）特許公開番号２００２−１９１３６３（発明の名称：全長ｃＤＮＡ合成用プライマー、およびその用途、出願人：株式会社ヘリックス研究所，公開日：９，Ｆｅｂ．２００２）のＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＩＤＮＯ：１１７４３（６０９アミノ酸長）の２１０−５９５番目の３８６アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のポリペプチド（１，９１８アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号１番目から３８７番目の３８７アミノ酸長のアミノ酸配列とで、やや高いホモロジーが認められた（約８８．３７％）。本発明の１，９１８アミノ酸配列は、公開されたＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＩＤＮＯ：１１７４３（６０９アミノ酸長）配列に対し、Ｃ−末端側に１，５３１アミノ酸長の新規配列が付加されている。特許公開番号２００２−１９１３６３３のＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＩＤＮＯ：１１７４３の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列（ＥＳＴｓ）について各種治療用アミノ酸配列として記載しているのみで、その機能については不明である。６０９アミノ酸長のうちホモロジーの認められる３８６アミノ酸長のアミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチドの１，９１８アミノ酸配列は長大であり、後に述べるようにその機能についても推定可能で有用である。
２）国際公開番号ＷＯ２００１７５０６７−Ａ２（発明の名称：Ｎｏｖｅｌｈｕｍａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ＃２１００４，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＹＳＥＱＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：１１，Ｏｃｔ．２００１）のＮｏｖｅｌｈｕｍａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ＃２１００４（１，１５４アミノ酸長）の１番目から１，１５１番目の１，１５１アミノ酸長の配列（１，１５１アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（１，９１８アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号７０２番目から１，８４９番目の１，１４８アミノ酸長とで、比較的高いホモロジーが認められた（約９６．５３％）。ＷＯ２００１７５０６７−Ａ２のＮｏｖｅｌｈｕｍａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ＃２１００４の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列を用いた診断用蛋白質として記載しているのみで、その機能については不明である。１，１５４アミノ酸長であるＮｏｖｅｌｈｕｍａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ＃２１００４のアミノ酸配列に対し、本発明の１，９１８アミノ酸配列は，Ｎ−末端側に７０１アミノ酸長の付加があり長大であり、また、機能についても記載可能で有用である。
３）国際公開番号ＷＯ２００１１８０２２−Ａ１（発明の名称：Ｈｕｍａｎｇｅｎｅ３８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＦＩＵＷ３６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳｃｉ．ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：１５，Ｍａｒ．２００１）のＳＥＱＩＤＮＯ：１２０（５５６アミノ酸長）の１−５５６番目の配列（５５６アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（１，９１８アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号１，２８１−１，８３７（５５７アミノ酸長）の配列とで高いホモロジーが認められた（約９７．３１％）。ＷＯ２００１１８０２２−Ａ１のＨｕｍａｎｇｅｎｅ３８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＦＩＵＷ３６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列を用いた各種疾病処置用組成物として記載されているのみで、その機能については不明である。５５６アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明の１，９１８アミノ酸配列は、Ｎ−末端側に１，２８０アミノ酸長の付加があり、長大であり、後に述べるようにその機能についても推定可能で有用である。
本発明のｍｂｇ０１９６９蛋白質アミノ酸配列（１，９１８アミノ酸長）について、上記に示したように、今までに出願された配列に対して本発明の配列のうち３８７アミノ酸長、１，１４８アミノ酸長、及び５５７アミノ酸長について比較的高いホモロジーが認められたが、それらは本発明のｍｂｇ０１９６９蛋白質アミノ酸配列（１，９１８アミノ酸長）の全長をカバーするものでなく、一部のより短い配列に関連があるのみであった。
【００４４】
公開された遺伝子の塩基酸配列に関するデータベースを検索すると、本発明のｍｂｇ０１９６９塩基配列（６，１０６塩基長）の一部の配列とホモロジーを有する部分配列について複数の報告があったが、配列全体をカバーする報告はなかった。詳しくには、次に示す公開された塩基配列に対し、本発明の６，１０６塩基長の塩基配列は長く、新規配列の付加が認められた。
１）特許公開番号２００２−１９１３６３（発明の名称：全長ｃＤＮＡ合成用プライマー、およびその用途、出願人：株式会社ヘリックス研究所，公開日：９，Ｆｅｂ．２００２）のＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＩＤＮＯ：１１７４３（３，９８９塩基長）の１，１２４番目から１，８３０番目の７０７塩基長の塩基配列と、本発明の塩基配列（６，１０６塩基長）の４３５−１，１４４番目の７１０塩基長の塩基配列、また、７０１番目から１，０７９番目の３７９塩基長の塩基配列と本発明の塩基配列（６，１０６塩基長）の１２番目から３９０番目の３７９塩基長の塩塩基配列とで、それぞれ約８７．０４％と約９１．８２％というやや高いホモロジーが認められた。
２）国際公開番号ＷＯ２００１７５０６７−Ａ２（発明の名称：Ｎｏｖｅｌｈｕｍａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ＃２１００４，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＹＳＥＱＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：１１，Ｏｃｔ．２００１）のＮｏｖｅｌｈｕｍａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ＃２１００４（６，９９９塩基長）の配列番号１番目から３，６６９番目までの３，６６９塩基長と本発明の塩基配列（６，１０６塩基長）の一部、すなわち、配列番号２，１０４番目から５，７５９番目までの３，６５６塩基長ととで、約８８．１０％というやや高いホモロジーが認められた。
３）国際公開番号ＷＯ２００１１８０２２−Ａ１（発明の名称：Ｈｕｍａｎｇｅｎｅ３８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＦＩＵＷ３６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳｃｉ．ＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：１５，Ｍａｒ．２００１）のＳＥＱＩＤＮＯ：１２０（２，６０９塩基長）の配列番号１２番目から２，２３３番目までの２，２２２塩基長と、本発明の塩基配列（６，１０６塩基長）の一部の配列、すなわち配列番号３，５３５番目から５，７５９番目までの２，２２５塩基長とで、約約８８．１０％というやや高いホモロジーが認められた。
１）、２）、及び３）で出願された配列については、本発明の塩基配列（６，１０６塩基長）と比較すると、上記に示すように、３７９塩基長、７１０塩基長、３，６５６塩基長、及び２，２２５塩基長についてやや高いホモロジーが認められた。しかし、それらの配列はいずれも本発明の塩基配列すなわちｍｂｇ０１９６９遺伝子配列（６，１０６塩基長）の全長をカバーするものでなく、全長の長さが違うが、部分的に相同配列を含む関係にあり、１）、２）、及び３）の配列と本発明の遺伝子の配列は、断片的に比較的高いホモロジーが認められるものの全く異なる新規な配列と判断される。
【００４５】
以上のホモロジー検索の結果から、候補クローンｍｂｇ０１９６９はヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子と高いホモロジーを示し、かつヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子に対し新規配列が付加された構成となっていること、また、部分的には類似遺伝子が存在するが全長については既知配列の例がない、全く新規遺伝子であることが判明した。
【００４６】
（３）モチ−フ検索
本発明のＤＮＡに関して、ＰＲＯＳＩＴＥｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムであるｐｆｔｏｏｌｓ（ＢａｉｒｏｃｈＡ，ＢｕｃｈｅｒＰ，ＨｏｆｍａｎｎＫ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９７Ｊａｎ１；２５（１）：２１７−２１）、及びＰｆａｍｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムｈｍｍｅｒ２．１（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．，Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｒｎｅｙ，Ｅ．，Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．，ａｎｄＤｕｒｂｉｎ，Ｒ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９９８；２６，３２０−３２２）を用いてモチ−フ検索を行なった（Ｓｕｙａｍａｅｔ．ａｌ．１９９９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２７：３３８−３３９）。
本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、１，９１８アミノ酸長とヒトＫＩＡＡ０４５３と比較し７９９アミノ酸長く、下記に示すように、Ｎ−末端側に７９９アミノ酸伸張しているポリペプチド配列には、ＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する、今までにない構成であることを新たに見出した（図１）。
詳しくは、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，１９９８，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，９５：５８５７−５８６４）によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側から１６７−２０４番目にＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが、更にＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側から１６２−２０５番目にＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが、また、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によっても、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち１６６−２０５番目にＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが見出された。
これらにより、本発明のｍｂｇ０１９６９遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ−末端側に７９９アミノ酸伸張している部分にＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する、今までにない構成であることを見出し、このことにより補強された強力な機能を推定することが可能となった。
【００４７】
（４）ｍＲＮＡレベルでの発現頻度
ｍＲＮＡレベルでのヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子の発現頻度については知見はないが（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０４５３／、ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４：３４５−３４９）、本発明の遺伝子の一つであるマウスＫＩＡＡ０４５３遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現頻度について、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスにおける同遺伝子の組織特異的及び発生段階特異的発現を解析した。マウスＫＩＡＡ０４５３遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅して検出するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を５’− ＣＧＡＧＣＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＡＣＡ −３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’− ＣＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴ −３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスＫＩＡＡ０４５３遺伝子の転写産物をＲＴ−ＰＣＲ法で増幅すると、約５２９ｂｐＤＮＡ断片（配列番号３９４８−４４７６番目）が得られる設計にした。マウス各組織から調製されたｍＲＮＡを材料とし、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により１ｓｔストランドｃＤＮＡまで調製が終了しているＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅｃＤＮＡＰａｎｅｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｋ１４２３−１，＃Ｋ１４３０−１）を用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社が示す方法により以下のようにして解析を行った。すなわち、各マウス組織１ｓｔストランドｃＤＮＡと上記プライマーをそれぞれ混合し、各々についてＰＣＲを行い、マウスＫＩＡＡ０４５３遺伝子の転写産物のうち約５２９ｂｐＤＮＡ長のＤＮＡ断片の増幅を図った。ＰＣＲは、ＴａｑポリメラーゼとしてＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（宝酒造，＃ＲＰ００１Ａ）を用い、上述のＤＮＡ混合液を９５°Ｃ（２．５分）で加熱した後、９５°Ｃ（３０秒）／５５°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（３０秒）のサイクルを３２回繰り返して行った。コントロールとしてＣｌｏｎｔｅｃｈ社が提供するＧ３ＰＤＨプライマー（＃５４０６−１）を使用したＧ３ＰＤＨ転写産物由来約９３８ｂｐＤＮＡ断片の増幅も同様にして行った。増幅を終えたＰＣＲ産物を、サイズマーカーとともに２％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、＃５００７０）を用いて電気泳動で分画し、分画したＰＣＲ産物の量を半定量的に比較した（図２）。その結果、マウスＫＩＡＡ０４５３遺伝子に由来する約５２９ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、調べた限りの全ての臓器、全ての発生過程にて発現していることが確認された。より詳しくには、肺、腎臓、精巣において強い、心臓に於いてやや強い濃さの、肝臓、胸腺、眼、平滑筋に於いて少し濃い、脳に於いてやや薄いバンドとして、また、調べたその他の臓器、組織について、すなわち脾臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、骨髄、リンパ節、平滑筋、前立腺、胸腺においては全て中程度の濃さのバンドとして検出された。また、発生の過程では７日目、１１日目、１５日目、１７日目の全過程において中程度の濃さのバンドとして検出された。
尚、図２において、下段のＧ３ＰＤＨはコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現パターンを示す。従って、以上の結果から、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは肺、腎臓、精巣、心臓をはじめ各種臓器に普遍的に、あるいは発生の全過程に発現が認められ、これにより関連する臓器、組織の発生・分化や機能保全に関わっているといえる。
【００４８】
（５）本発明遺伝子の機能推定
本発明のポリペプチド（全長が１，９１８アミノ酸長）は、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側に対し７９９アミノ酸長の新規アミノ酸配列が付加した、より長い新規なアミノ酸配列といえる。ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子にコードされるポリペプチドには、重要なモチーフが認められず機能が不明であった。
本発明のポリペプチド配列についてモチーフ検索を行った結果、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側に対し７９９アミノ酸長付加された部分に、ＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが認められた。
ＵＢＡドメインは約４０アミノ酸長からなるモチーフとして、例えばＥ２ｓ、Ｅ３ｓ、ＵＢＰｓ等がユビキチンに相互作用がある配列として同定されている（ＢｕｃｈｂｅｒｇｅｒＡ．，２００２，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：２１６−２２１）。ＵＢＡドメインが認められる蛋白質には、ＲＡＤ２３、ＳＮＦ１−ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅｓ、ｐ６２等が報告されている（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．ａｎｄＢｕｃｈｅｒＰ．，１９９５，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１７２−１７３，ＢｕｃｈｂｅｒｇｅｒＡ．，２００２，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１２：２１６−２２１，佐伯泰、川原裕之、横沢英良、実験医学、２００３、２１：３４０−３４５）。
ＵＢＡドメインは、３つのコンパクトなヘリックス・バンドルから構成され、それらは、立体構造上に配置された疎水性が高い表面パッチを形成し、その疎水性パッチが、非共有結合にてユビキチンとの相互作用をするすると想定される（ＭｕｅｌｌｅｒＴ．Ｄ．ａｎｄＦｅｉｇｏｎＪ．，２００２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１９：１２４３−１２５５）。ＵＢＡドメインを含む蛋白質は、バルク蛋白質分解、細胞周期制御、ストレス反応、ＤＮＡ修復、シグナル伝達、転写調節、及び小胞輸送といった多様な細胞内の反応に関与している。これらの細胞内の多様な反応においては、個別の蛋白質に対するユビキチン化機構に於ける高い基質特異性が要求される。
それだけでなく、ＵＢＡドメインが認められる蛋白質の仲間には、ＵＶ切断を修復する蛋白質、蛋白質リン酸化酵素（キナーゼ）、細胞内シグナル伝達経路や細胞周期制御に含まれる蛋白質等が知られている。更に、ＵＢＡドメインが認められる蛋白質の仲間には、ユビキチンとは関係の薄い蛋白質、例えばＨＩＶＶｐｒ（Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔａｌ．，１９９８，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ，５：１０４２−１０４７）、３−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅＤＮＡｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（ＭＰＧ）、あるいはｎｕｃｌｅａｒｍＲＮＡｅｘｐｏｒｔｆａｃｔｏｒＴＡＰ／Ｍｅｘ６７についても、ＵＢＡドメインと相互作用を示すことが示され、ＵＢＡドメインのより広範な機能が解明されつつある（ＭｕｅｌｌｅｒＴ．Ｄ．ａｎｄＦｅｉｇｏｎＪ．，２００２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１９：１２４３−１２５５）。
本発明のポリペプチドについても、Ｎ−末端側にＵＢＡドメインが存在することから、そのＵＢＡドメインがユビキチンに結合し、ユビキチン化に関与し、細胞の分化・増殖調節に直接関係することでそれら細胞内の重要な働きの調節に関わる蛋白質と推定された。Ｃ−末端側にＵＢＡドメインが存在する蛋白質は多く知られているが、Ｎ−末端側にＵＢＡドメインが存在する蛋白質としては、酵母Ｓｈｐ１とそのヒトホモログｐ４７、ヒトＹ３３Ｋといった数百アミノ酸長の短いもの２例のみ報告があるだけで（ＢｕｃｈｂｅｒｇｅｒＡ．，２００２，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：２１６−２２１）、本発明のポリペプチドはそれらに比較し長大であり従来のものと異なる全く新しいタイプのＵＢＡドメインを有するポリペプチドといえる。
また、ｍｂｇ０１９６９遺伝子の組織特異的発現パターンから、本発明のポリペプチドは肺、腎臓、精巣、心臓、肝臓、胸腺、眼、平滑筋のみならず各種組織における細胞の重要な機能に係わっていると類推される。これらを総合すると、本発明のＵＢＡドメインを有するポリペプチドは、主に細胞内にあってユビキチンと結合し特定蛋白のユビキチン化、プロテオソーム分解等が障害されることにより発生するユビキチン化、細胞内蛋白質の分解といった細胞の重要なプロセスを担う新規蛋白質であり、それら重要機能に関わる各種臓器における生体内の複合蛋白質の中心をなしているといえる。
【００４９】
これまでに、Ｎ−末端側にＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する１，０００アミノ酸長を超える巨大なポリペプチドについては報告がない。また、Ｎ−末端側にＵＢＡドメインを有するアミノ酸配列をコードする本発明の遺伝子配列は、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析の結果、肺、腎臓、精巣において高く、心臓に於いてやや高く、肝臓、胸腺、眼、平滑筋において少し高いが脳に於いてやや弱く、調べた限りの全ての臓器で発現が認められること、また、発生の全過程に於いて発現していることが今回初めて見出され、本発明の遺伝子がコードする蛋白質が全組織に於いて細胞の増殖・分化を制御する重要な働きに関わっている可能性が示された。
本発明の新規ポリペプチドをコードする遺伝子は、特に肺、腎臓、精巣、心臓に於いて高く、全ての臓器で発現していることを特徴とし、本発明のポリペプチドはＵＢＡドメインを有する新規なポリペプチド蛋白質であり、それら組織に於いて発育、機能保全、あるいは全身の臓器に関わる病態（例えば癌化・老化・機能不全）解明、それによる予防薬、治療薬、検査薬の開発に有用であることが明らかで、それが本発明の優れた点である。また、本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる点が優れている。
【００５０】
ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現について知見はないが（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０４５３／、ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４：３４５−３４９）、本発明のｍｂｇ０１９６９遺伝子は、肺、腎臓、精巣において高く、心臓に於いてやや高く、肝臓、胸腺、眼、平滑筋において少し高いが脳に於いてやや弱く、調べた限りの全ての臓器で発現が認められること、また、発生の全過程に於いて発現していることから、特に肺、腎臓、精巣、肝臓、胸腺、眼、平滑筋において、また、各種臓器において、発育、機能保全、あるいは各種臓器における癌・自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖に関わる疾患や老化、機能不全、あるいは先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療薬、検査薬の開発に有用である。本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる。
【００５１】
このように細胞の増殖・分化や老化に極めて重要なＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、それ自身も直接疾患原因遺伝子となりうる。本発明のポリペプチドにはＮ−末端に付加された部分に認められるＵＢＡドメインが特徴となっているが、このＵＢＡドメインについては、以下の疾患原因となりうることが知られている。
例えば、ユビキチン化異常、細胞内蛋白質の分解異常が原因となる疾患群には、アルツハイマー病（ユビキチンレベルが高値）、パーキンソン病（ユビキチンレベルが高値）、Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群（ユビキチンシステム異常）、レビー小体病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト−ヤコブ病、あるいはトリプレットリピート病（ハンチントン病等）、あるいは精子形成異常といった神経変性疾患、更には腫瘍性疾患、遺伝性疾患、ウイルス感染症あるいは免疫についても報告があり（田中啓二、実験医学、１９９７、１５：２０５６−２０６２、阿南正、中尾光善、蛋白質・核酸・酵素、４４：７７６−７８６、鈴木俊顕、志村秀樹、服部信孝、実験医学、２０００、１８：１４７８−１４８２）、それら疾患と関連が深いと考えられる。
これらのことから、本発明のＵＢＡドメインを有するポリペプチドに関わるＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質については、それらが各種臓器に普遍的に、バルク蛋白質分解、細胞周期制御、ストレス反応、ＤＮＡ修復、シグナル伝達、転写調節、及び小胞輸送といった多様な細胞内の反応に関与し、それにより、細胞の増殖あるいは分化の調節などに、また、それら臓器の機能保全や老化に関わる病態の解明に関わることが強く示唆される。
すなわち、ｍｂｇ０１９６９遺伝子がコードするＵＢＡドメインを有するポリペプチは特に肺、腎臓、精巣、肝臓、胸腺、眼、平滑筋において、また、各種臓器において、全身の臓器・組織に於いてユビキチン化異常、細胞内蛋白質の分解異常が原因となる疾患群に関わること、また、癌細胞における癌抑制蛋白質の機能喪失、癌遺伝子産物の機能獲得といった機構に関わること、あるいは、ＨＩＶ等感染性のウイルスが進入した細胞内でウイルス蛋白質の分解をまぬかれる機構にも関わること等が容易に推察できる。
【００５２】
【発明の効果】
ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子にコードされているポリペプチドは１，１１８アミノ酸長と長さが十分でなく、その機能を類推するモチ−フ構造が認められなかったため、その機能の推定ができなかった。今回、本発明者はマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ０４５３遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、Ｎ−末端側に新たにＤＮＡ配列が付加されている新規ＤＮＡ配列を取得することに成功した。その新規ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドは１，９１８アミノ酸長と長く、また、そのポリペプチドは、、Ｎ−末端側にＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する従来にはない構造であり、細胞の増殖、分化あるいは機能の発現といった細胞の重要なプロセスに関係すると推定された。更に本発明の遺伝子配列は、脳においては発現量が比較的低いこと、また、発生の全過程に於いて発現していることが今回初めて見出され、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドが各種臓器において細胞の増殖・分化を制御する重要な働きに関わっている可能性が示された。
【００５３】
これまでに記載したことから、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドあるいは本発明の抗体は、発育、機能保全、あるいは各種臓器における癌・自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖に関わる疾患や老化、機能不全、あるいは先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療上、また、各種臓器の機能保全や老化の防止に必要不可欠な役割を果たすと考えられる。また、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析のよる各組織及び発生段階での発現のパターン情報は、各種臓器に普遍的に発現していること、及び各発生過程に於いて普遍的に発現していることを明らかとし、本発明の遺伝子が各種臓器の発生・分化やその機能保全また老化において重要性であること明らかにした。
従って、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、それらがコードするポリペプチドの一部又は全長、該ポリペプチドの一部又は全長に対する抗体、アンチセンスＤＮＡ等は、癌や先天奇形を含めたヒト疾患を治療する為のモデル動物であるマウスを用いた各種治療・予防方法開発において、医薬として使用することが可能である。
【００５４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチドに新規に認められたＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する新規ポリペプチドを示す（ａａ：アミノ酸配列で数字はアミノ酸数、ボックス：上から、ＨＭＭＰｆａｍ検索法（上段）、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法（中段）、またＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法（下段）といった異なった検索法にて同定したＵＢＡドメインを示す。
これらの結果から、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、及びＨＭＭＳｍａｒｔ検索法により、ＵＢＡドメインを新たに同定した。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍｂｇ０１９６９（マウスＫＩＡＡ０４５３）遺伝子のマウス各組織、及び各発生段階における発現強度の比較。上段の２つの写真はｍｂｇ０１９６９遺伝子の発現強度、下段はコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現強度を、アガロース電気泳動で分画した後のエチジウムブロミド染色パターンについての写真で示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention has a UBA domain, is highly encoded in the lung, kidney, testis, and heart, and has a universal expression in various organs, a gene containing the DNA, and the DNA encoded by the DNA The present invention relates to a novel polypeptide, a recombinant protein containing the polypeptide, an antibody against the novel polypeptide, and the like.
[0002]
[Prior art]
The recent success of the Human Genome Project and the Human cDNA Project has led to the identification or estimation of many human disease-related genes. On the other hand, however, research using human genes is limited due to ethical issues, and new research directions are being sought. From this point of view, identifying homologous genes in model organisms is considered to be an extremely important step in terms of advancing research. In particular, the mouse is the most studied model organism, and relatively large amounts of genome information and mutant information are accumulated. However, the accumulated genome information is still not sufficient. On the other hand, as a means of analyzing genes expressed in vivo, studies have been made to randomly analyze cDNA sequences, and the obtained cDNA fragment sequences are registered in the database as Expressed Sequence Tag (EST) and published. It was. However, many ESTs have only short base sequence information such as a length of 100 bases to 500 bases, and it is difficult to estimate their functions.
[0003]
In various organs, physiological functions are regulated under the regulation of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In addition, the regulation of functions in various organs involves specific cell growth or activation of the cells responsible for the function. Therefore, by acquiring new genes that are particularly strongly expressed in the lungs, kidneys, testis, and heart, and that are universally expressed in various organs, universal and complex functions in the various organs encoded by these genes Obtaining a protein that regulates is useful for drug development. In addition, in order to efficiently screen for agonists and antagonists for the obtained protein and develop a pharmaceutical product, the function of the gene of the protein expressed in vivo is estimated from homology search, and based on the information. It was necessary to obtain a recombinant protein by expressing the protein in an appropriate expression system, and further to obtain an antibody that specifically binds to the protein.
[0004]
In the long human cDNA project, human KIAA0453 gene derived from human brain (Seki, N., Ohira, M., Nagase, T., Ishikawa, K., Miyajima, N., Nakajima, D., Nomura, N. and Ohara, O., DNA Research 4 (5), 345-349 (1997), Characterization of cDNA clones in size-fragmented cDNA Library, Human Bran. sapiens, cDNA, KIAA0453, Ohara O. et al.) have been reported But it was unclear about its function.
The human KIAA0453 gene is present on chromosome 1p36.31-p36.11, and more than one SNPs of the human KIAA0453 gene have been reported (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi). Db = nucleotide & cmd = Display & dopt = nucleotide_snp & from_uid = 66334036), that most human diseases are not caused by mere gene deletions, but are caused by partial changes in protein function and activity due to amino acid substitutions. In view of this, the human KIAA0453 gene is involved in the differentiation of various organs and functional preservation thereof, or the proliferation of cells such as cancer, viral infections, autoimmune diseases, and allergies. - be involved in the disease involved in the differentiation it can be considered. The polypeptide encoded by the human KIAA0453 gene was 1,118 amino acids long (the value in the initial paper was 1,052 amino acids long but was subsequently revised), and no important domain was found.
[0005]
[Non-Patent Document 1]
1. Buchberger A.M. , 2002, Trends Cell Biol. 12: 216-221, From UBA to UBX: new words in the ubiquitin vocabulary.
[Non-Patent Document 2]
2. Hofmann K.M. , Bucher P. , 1996, Trends Biochem. Sci. 21: 172-173. , The UBA domain: sequence motif present in multiple enzyme classes of the ubiquitination wayway.
[Non-Patent Document 3]
3. Yasuki Saeki, Hiroyuki Kawahara, Hideyoshi Yokozawa, Experimental Medicine, 2003, 21: 340-345, Domain structure interacting with ubiquitin
[Non-Patent Document 4]
4). Dickmann, T .; et al. , 1998, Nature Structural Biology, 5: 1042-1047, Structure of a human DNA reprote protein UBA domain that interacts with HIV-1 Vpr.
[Non-Patent Document 5]
5. Mueller T. D. , Feigon J. et al. , 2002, J. et al. Mol. Biol. 319: 1243-1255, Solution structures of UBA domains revival a concealed hydrophobic surface for protein-protein interactions.
[Non-Patent Document 6]
6). Schultz, J.M. Milpetz, F.M. , Bork, P.A. and Ponting, C.I. P. , 1998, Proc Natl Acad Sci USA, 95: 5857-5864,. SMART, a simple modular architecture research tool: identification of signaling domains.
[Non-Patent Document 7]
7. Tanaka Keiji, Experimental Medicine, 1997, 15: 2056-2062, Ubiquitin / Proteasome and Disease
[Non-Patent Document 8]
8). Anan Tadashi, Nakao Mitsuyoshi, Protein / Nucleic Acid / Enzyme, 44: 776-786, Molecular mechanism of ubiquitin disease-Diseases related to ubiquitin / proteasome-
[Non-patent document 9]
9. Toshiaki Suzuki, Hideki Shimura, Nobutaka Hattori, Experimental Medicine, 2000, 18: 1478-1482, Ubiquitin and Neurological Diseases
[0006]
[Problems to be solved by the present invention]
Conventionally, the human KIAA0453 gene was obtained in the human long-chain cDNA project, but the gene information was not complete, and the information on its function was also incomplete. On the other hand, a novel gene that is particularly strongly expressed in the lungs, kidneys, testis, and heart and that is universally expressed in various organs is obtained, and the gene, a protein encoded by the gene, or an antibody that specifically binds to the protein is obtained. Obtaining is important for screening compounds that inhibit the binding of the protein to other proteins in cells or compounds that affect signal transduction or the like.
[0007]
Therefore, a novel gene related to the human KIAA0453 gene is obtained, a novel motif is obtained, a tissue-specific expression pattern of the gene is obtained, and information on the function of the protein encoded by the novel gene of the present invention is obtained. Is a very important means for searching for a specific binding protein, agonist or antagonist of the polypeptide of the present invention. Even if a specific binding protein for the above-mentioned polypeptide is not found, by analyzing the physiological action of the polypeptide from the inactivation experiment of the polypeptide of the present invention (for example, production of a knockout animal), It is possible to produce an agonist or antagonist for a peptide, and a specific binding protein, agonist or antagonist for the polypeptide of the present invention is a prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of a patient related to various organs. And can be used as a diagnostic agent.
In some cases, a decrease in function or progression of the polypeptide of the present invention in a living body may cause diseases related to various organs. In this case, not only administration of antagonists and agonists to the polypeptide, but also administration of the polypeptide of the present invention targeting various organs of the polypeptide, and antisense nucleic acid to the gene encoding the polypeptide. It can also be applied to administration or gene therapy using the gene. In this case, the base sequence encoding the polypeptide of the present invention is information necessary for examining the presence or absence of gene deletion or mutation in patients with diseases related to various organs of the polypeptide of the present invention. A gene encoding a polypeptide can be applied to a preventive or therapeutic agent or a diagnostic agent for a disease associated with dysfunction of the polypeptide of the present invention.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have cloned a gene (DNA) showing high homology to the human KIAA0453 gene from a mouse brain-derived cDNA library, and placed it on the N-terminal side of the polypeptide encoded by the gene. The addition of a completely new 799 amino acid sequence that was not found in the human KIAA0453 gene, and the resulting gene is high in the lung, kidney, and testis, and slightly higher in the heart, liver, thymus, eye, and smooth muscle. It was found that the expression was observed in all organs as far as examined, and that it was expressed in the whole developmental process. Further, by analyzing the obtained gene information, the polypeptide sequence of the present invention, which is extended by 799 amino acids to the N-terminal side with respect to the polypeptide sequence encoded by the human KIAA0453 gene, has UBA (Ubiquitin-associated). ) We discovered the existence of domains, showed that these domains are involved in important functions in the cell, and obtained new polypeptides and antibodies specific to them based on their genetic information. The invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention provides, as a first aspect, DNA comprising a base sequence encoding the following polypeptide (a) or (b): (a) the same as or substantially the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A part of the same amino acid sequence (for example, one having the UBA domain shown below, or 1,835 amino acids from 84th (methionine) to 1,918th (tryptophan) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, consisting of an amino acid sequence in which some amino acids are deleted, substituted or added, and the polypeptide of (a) It relates to a polypeptide having biological activity substantially the same as part or all of the peptide.
In the second aspect of the present invention, the following DNA (a), (b) or (c): (a) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (sequence) Number: 2 base pairs 3 to 5,756, 5,754 base pairs long) and a part thereof (for example, one having at least one of the sequences having the UBA domain shown below, or SEQ ID NO: 1 A DNA encoding a polypeptide of 1,835 amino acids from the 84th (methionine) to the 1,918th (tryptophan) in the amino acid sequence shown) or a DNA encoding the whole; (b) a base complementary to the DNA of (a) DNA that hybridizes with DNA comprising a sequence under stringent conditions; or (c) DNA that comprises a base sequence complementary to the DNA of (a) and DNA under stringent conditions. And Buridaizu, according to the DNA encoding a protein having a part of a polypeptide or all substantially the same biological activity of (a).
The DNAs according to the first and second aspects of the present invention will be collectively referred to as “the DNA of the present invention” hereinafter. The DNA of the present invention encodes a novel polypeptide. The present invention also relates to a mammal-derived gene containing these DNAs, a rodent-derived gene whose mammal is a rodent, particularly a mouse gene whose rodent is a mouse. In particular, the mouse gene is also referred to as “mouse KIAA0453 gene”.
Furthermore, the present invention provides a polypeptide (hereinafter also referred to as “polypeptide of the present invention”) encoded by the DNA or gene of the present invention (hereinafter also referred to as “KIAA0453 gene”), for example, the DNA or gene of the present invention. The present invention relates to a polypeptide (hereinafter also referred to as “KIAA0453 protein”) which is a recombinant protein produced in a host cell into which a gene has been introduced.
The present invention also provides a recombinant vector comprising the DNA or gene of the present invention, and an antibody that specifically binds the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof or a recombinant protein comprising the polypeptide or a salt thereof. Concerning.
[0010]
Further, the expression level of the protein is changed by using the DNA of the present invention, a gene containing the DNA, a novel polypeptide encoded by the DNA, a recombinant protein containing the polypeptide, and an antibody against the polypeptide. Provided are a compound, a screening method for a compound (antagonist, agonist) that changes the binding property to a protein that binds to the protein, a screening kit, the screening method, and the like. Furthermore, a screening method for a substance that specifically binds to the substance, a screening kit, etc., characterized by using the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide or a salt thereof Also provide.
[0011]
Furthermore, the present invention relates to a DNA of the present invention, a recombinant vector or expression vector containing the DNA of the present invention, a transformant carrying the vector, a culture of the transformant, and a part of the polypeptide of the present invention. Alternatively, a method for producing a polypeptide of the present invention, a recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof, characterized in that a recombinant protein containing a full-length polypeptide is produced, accumulated, and collected. Provided is a recombinant protein or a salt thereof containing a part or full length polypeptide of the polypeptide of the present invention thus obtained. In addition, the present invention has a nucleotide sequence substantially complementary to DNA encoding a pharmaceutical comprising the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a recombinant protein containing the polypeptide. Antisense nucleotides or pharmaceuticals containing them, short double-stranded RNA (RNAi) synthesized based on the sequence information of the DNA of the present invention, pharmaceuticals containing them, polypeptide of the present invention or partial peptide thereof Alternatively, a medicament comprising a recombinant protein containing the polypeptide is provided.
Furthermore, the present invention comprehensively prepares the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide, or an antibody against the DNA or gene of the present invention and accumulates them. It also relates to a so-called DNA chip (array) and protein chip.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The DNA of the present invention was isolated from a cDNA library prepared by the present inventor using mouse brain-derived mRNA collected by the present inventor as a cDNA fragment, and the base sequence was determined and identified. is there. Specifically, about 45,000 recombinants were selected from a mouse brain-derived cDNA library prepared according to the method of Ohara et al. (DNA Research, 1997, 4: 53-59). Next, about 8,000 3 'terminal DNA sequences of this clone are determined, and a clone having high homology to the human KIAA0453 gene is selected from the 3' terminal DNA sequences, and the entire base sequence is determined. It was. Next, based on the total nucleotide sequence thus obtained, a homology search was performed using a DNA analysis program (GCG, Fasta & Blast).
That is, when an attempt was made to obtain a gene having homology to human long-chain cDNA (KIAA0453) from a mouse brain-derived cDNA library, it was surprisingly 799 against the N-terminal side of the polypeptide encoded by the human KIAA0453 gene. The inventors succeeded in obtaining a novel gene encoding a novel polypeptide having a longer novel amino acid sequence (the total length is 1,918 amino acids in length) to which a novel amino acid sequence having an amino acid length was added.
As a result, almost the entire amino acid sequence (length of 1,118 amino acids) encoded by the human KIAA0453 gene (length of 1,118 amino acids from the first to 1,118) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention The base shown in SEQ ID NO: 2 having a significant homology of about 97.04% with the amino acid sequence (1,119 amino acids long) from the 800th to the 1,918th amino acids of (1,918 amino acids long) A clone having the sequence was obtained (clone name: mbg01969).
[0013]
The amino acid sequence of the obtained polypeptide encoded by mbg01969 (polypeptide of the present invention) is 1,918 amino acids long, and the human KIAA0453 gene (DNA Research, 1997, 4: 345-349, NCBI-GenBank Accession No. AB007922). In comparison with the amino acid sequence (length of 1,118 amino acids) of the protein encoded by), an extension of 799 amino acids in length was observed on the N-terminal side. The amino acid sequence of the obtained “polypeptide of the present invention” was subjected to a homology search using a public database as described in the following examples. Relatively high homology was observed for the 387 amino acids, 1,148 amino acids, and 557 amino acids in the sequence of the “polypeptide of the invention”. However, they do not cover the entire length of the “polypeptide of the present invention” (1,918 amino acids long) of the present invention, and only homology is observed in a partial short sequence. The elucidation of the “polypeptide” sequence has finally made it possible to describe the novel sequence protein and its function.
In addition, the plasmid containing the DNA of the present invention having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (plasmid display name: mbg01969) is AIST 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture. Deposited at the Patent Biological Deposit Center on July 2, 2003, and given the accession number FERM P-19419.
[0014]
The sequence of the human KIAA0453 gene is 6,375 base pairs long, and the length of the amino acid sequence of the encoded polypeptide is 1,118 amino acids (DNA Research, 1997, 4: 345-349, http: /// www.kazusa.or.jp/huge/gfpage/KIAA0453/, NCBI-GenBank Accession No. AB007922). By studying the human KIAA0453 gene homolog in detail, the possibility that a polypeptide is further encoded on the N-terminal side may be verified. The length of the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA of the present invention is 1,918 amino acids, but by further studying the homologue to the DNA of the present invention, it can be further extended to the N-terminal side. You may find that the polypeptide is encoded.
[0015]
It should be noted that those skilled in the art will recognize an appropriate primer on the 5 ′ side of the clone based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 disclosed for the first time by this specification (for example, base pairs 61 to 80 '5'-TGAAAGGCACCACAGGCTCC-3 synthesized sequence corresponding to 5'-GAGCACTGTGGGTCCCTTTCA-3'), and this primer and commercially available mRNA from mammals or mammals prepared from mammal-derived tissues A new cDNA fragment containing a region upstream (5 ′ side of the gene) of the DNA of the present invention can be specifically synthesized by performing a reverse transcription reaction after hybridization with the derived mRNA. A new cDNA fragment containing the synthesized 5 ′ region was inserted into a plasmid, and then a KIAA0453 derived from a mammal containing the DNA of the present invention was obtained by homologous cloning such as colony hybridization using a part of SEQ ID NO: 2 as a probe. It is possible to prepare the entire region of the gene. Alternatively, when other methods, for example, the DNA of the present invention is used as a probe, the 5 ′ terminal region of KIAA0453 genes derived from various mammals including humans can be prepared by homologous cloning such as colony hybridization.
Furthermore, since the DNA sequence of the present invention and the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention have been disclosed, those skilled in the art will be able to understand the 5′-terminal region of KIAA0453 genes derived from various mammals including humans based on these information. Can be easily obtained. In addition, all of the KIAA0453 genes derived from various mammals including humans can also be obtained by using a PCR method such as RACE while paying sufficient attention to prevent artificial errors in short fragments and the obtained sequences. It is possible to prepare the region.
[0016]
The DNA of the present invention may be any DNA as long as it comprises a base sequence encoding the above-described polypeptide of the present invention. Identification from various organs derived from various mammals such as brain, heart, lung, liver, spleen, kidney, testis, thymus, muscle, bone marrow, or cDNA library derived from various tissues and cells at each stage of development -Either isolated cDNA or synthetic DNA may be used. The vector used for creating the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, amplification is performed directly by ReverseTransscriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”) using a totalRNA fraction or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cells / tissues or their cytoplasm. You can also.
[0017]
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an average degree of homology with the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of about 60% or more, preferably about It means an amino acid sequence that is 80% or more, more preferably about 90% or more. Therefore, as a polypeptide consisting of an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, for example, the above homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used. And a polypeptide having substantially the same biological activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Here, “substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. In addition, the polypeptide of the present invention includes, for example, a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several, Or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, consisting of an amino acid sequence in which the amino acids 1 to 35 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted or added, or an amino acid sequence combining them. A polypeptide having substantially the same biological activity as a polypeptide consisting of
[0018]
Furthermore, the DNA of the present invention includes, for example, a DNA that encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA and a string. Any DNA can be used as long as it hybridizes under a gentle condition and preferably encodes a polypeptide (protein) having the same biological activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Good. Under such conditions, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, as a DNA that can hybridize with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, the DNA Examples include DNA containing a nucleotide sequence having a degree of homology with the entire nucleotide sequence of about 60% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more on the average as a whole. . Hybridization was performed using Molecular cloning method. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) and the like, and the like, can be carried out according to a method known in the art or a method analogous thereto. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. Here, “stringent conditions” means, for example, when a probe is labeled with DIG DNA Labeling (Cat No. 1175033, manufactured by Boehringer Mannheim), a DIG Easy Hyb solution (Cat manufactured by Boehringer Mannheim) at 32 ° C. No. 1603558) and washing the membrane in a 0.1 × SSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) at 40 ° C. (1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M citric acid) The condition is such that it hybridizes to the human DNA probe of the present invention by Southern blot hybridization with sodium).
[0019]
As a means for cloning the DNA of the present invention, a DNA amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having an appropriate base sequence such as a polypeptide portion of the present invention or incorporated into an appropriate vector is used. Can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the polypeptide or labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods are described in, for example, Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. The DNA base sequence can be converted by using a known kit such as SuperScript II reverse transcriptase kit (Gibco BRL) according to a known method such as the Gapped duplex method or Kunkel method or a method analogous thereto. it can. The DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
[0020]
The expression vector of the polypeptide of the present invention can be prepared according to a method known in the art. For example, (1) excising a DNA fragment containing a DNA of the present invention or a mammal-derived gene containing the DNA of the present invention, and (2) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector can do. Expression vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC118), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. Or an expression vector using a sequence derived from an animal virus such as SV40, CMV virus, retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, bovine papilloma virus, or the like. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when the host is Escherichia coli, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, or a promoter in which these promoters are combined or combined, and when the host is Bacillus subtilis, When the host is yeast such as SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc., PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When animal cells are used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, HSP promoter, metallothionein promoter and the like can be mentioned.
[0021]
In addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori), etc., are added to the expression vector, if desired. be able to. If necessary, the protein encoded by the DNA of the present invention can be expressed as a fusion protein with other proteins (for example, glutathione S-transferase, histidine tag, calmodulin binding protein, protein A, etc.). is there. Such a fusion protein can be cleaved using an appropriate protease and separated into each protein.
[0022]
Examples of host cells that can be used include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like. Specific examples of the genus Escherichia include DH1 derived from Escherichia coli K12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 30). (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), and HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), or Escherichia coli (Escherichia coli et al.). Used. Examples of the Bacillus genus include Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCY It is done. Examples of animal cells include monkey kidney cell-derived COS-1, COS-7, Vero cells, Chinese hamster CHO cells (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter referred to as CHO (dhfr-)). Abbreviated cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, human Hela cells, or human myeloma cells.
[0023]
Transformation of these host cells can be performed according to methods known in the art. For example, the following documents can be referred to. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978); Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha); and Virology, 52, 456 (1973).
[0024]
The thus obtained transformant transformed with an expression vector containing a mammal-derived gene containing the DNA of the present invention can be cultured according to a method known in the art. For example, when the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added. When the host is a genus Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added. When cultivating a transformant whose host is yeast, the culture is usually performed at a temperature of about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours using a medium adjusted to a pH of about 5 to 8, with aeration and agitation as necessary. Can also be added. When culturing a transformant whose host is an animal cell, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours using a medium whose pH is adjusted to about 6 to 8, and if necessary, aeration or agitation. Can also be added.
[0025]
In order to separate and purify the polypeptide of the present invention from the above culture, for example, after culturing, cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freezing. After disrupting cells or cells by thawing or the like, a crude protein extract is obtained by centrifugation or filtration. Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride in the buffer, Triton X-100 ^TM A surfactant such as may be contained. When the protein is secreted into the culture solution, the cells or cells are separated from the supernatant by a known method after completion of the culture, and the supernatant is collected. Purification of the protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining known separation / purification methods. The polypeptide (protein) of the present invention thus obtained can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, it can be released by a known method or a method analogous thereto. Can be converted to body or other salts. Further, the protein produced by the recombinant is purified before or after purification using methionine aminopeptidase to remove the N-terminal methionine, using myristoyltransferase to perform myristoylation of the N-terminal amino acid, Amino acids can be arbitrarily modified by acetylating the N-terminal amino acid using transferase, or by using other modifying enzymes. In addition, the C-terminal amino acid can be modified by the action of a processing carboxyl peptidase that modifies the C-terminus, a C-terminal amidating enzyme, or the like. Furthermore, the polypeptide can also be partially removed by the action of an appropriate proteolytic enzyme such as trypsin, chymotrypsin, FactorXa, thrombin, or KEX2 protease.
When it is produced as a fusion protein, an unnecessary polypeptide portion can be removed using a suitable protein-degrading enzyme.
The presence of the polypeptide (protein) of the present invention or a salt thereof can be measured by various binding assays and enzyme immunoassays using specific antibodies.
[0026]
In the polypeptide (protein) of the present invention, the C-terminus is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminus is an amide (—CONH). ₂ ) Or ester (—COOR). Here, as R in the ester, for example, a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, for example, phenyl, α -C6-12 aryl groups such as naphthyl, for example, C7-14 aralkyl groups such as phenyl-C1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or α-naphthyl-C1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl, Pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, is used.
[0027]
When the polypeptide of the present invention (the presence state is a protein) has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, the carboxyl group is amidated or esterified. Included in protein. As the ester in this case, for example, the C-terminal ester described above is used. Furthermore, the protein of the present invention includes those in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as formyl group, acetyl group, etc.) or cleaved in vivo. The N-terminal glutamic acid residue produced is pyroglutaminated, such as OH, COOH, NH on the side chain of the amino acid in the molecule. ₂ , SH and the like are protected with an appropriate protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as formyl group, acetyl group, etc.), or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
[0028]
The peptide comprising a part of the polypeptide of the present invention is any partial peptide of the above-described polypeptide of the present invention (its presence state is a protein) and has substantially the same activity. It may be. For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more amino acid sequences of the constituent amino acid sequences of the polypeptide (protein) of the present invention. For example, a peptide having substantially the same biological activity as the recombinant protein of the present invention is used. Specific examples of such a partial peptide include those containing a sequence having a UBA domain on the N-terminal side in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or 84 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Mention may be made of a polypeptide consisting of 1,835 amino acids from the ith (methionine) to 1,918th (tryptophan). In the partial peptide of the present invention, the C-terminus is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminus is an amide (—CONH) as in the protein of the present invention described above. ₂ ) Or ester (—COOR). Further, in the partial peptide of the present invention, as in the above-described protein of the present invention, the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protective group, and the N-terminal side is cleaved in vivo. In which the glutamyl group is pyroglutamine oxidized, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound .
[0029]
The physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable as the salt of the polypeptide of the present invention (its presence state is a protein) or a peptide salt thereof. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
[0030]
The polypeptide of the present invention (its presence state is a protein), a peptide consisting of a part thereof, a salt thereof, or an amide thereof can also be prepared by a chemical synthesis method known in the art. For example, a commercially available resin for protein synthesis is used, and an amino acid with an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is subjected to various condensation methods known in the art according to the sequence of the target protein. Condensation on the resin. At the end of the reaction, the protein is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and an intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein, its partial peptide, or their amides. Regarding the condensation of the above protected amino acids, for example, for protein synthesis represented by carbodiimides such as DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide. Various activating reagents that can be used can be used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a control acid anhydride, HOBt ester or HOBt ester. Once done, it can be added to the resin.
[0031]
Solvents used for the activation of protected amino acids and condensation with resins include acid amides, halogenated hydrocarbons, alcohols, sulfoxides, ethers, and the like that can be used in protein condensation reactions in the industry. It may be appropriately selected from known solvents. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for protein bond forming reaction, and is usually selected appropriately from a range of about -20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction. As a protective group such as each amino group, carboxyl group, and serine hydroxyl group of the raw material, groups usually used in this technical field can be used. The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
[0032]
A peptide comprising a part of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se in the art, or by cleaving the protein of the present invention with a suitable protein-degrading enzyme. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. Examples of known condensation methods and protecting group elimination include the methods described in the following (1) to (3).
(1) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(2) Haruaki Yajima and Shunpei Hagiwara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) (3) Supervision of Yajima Haruaki, follow-up drug development Vol. 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten.
Alternatively, the peptide consisting of a part of, for example, a sequence of ten or more residues from the C-terminal or a portion of ten or more residues at an arbitrary position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used with a known peptide synthesizer or the like. Can be synthesized. Further, such partial peptides may be selected from, for example, a polypeptide having an appropriate site length of about 50 to 500 amino acids, or a polypeptide having an appropriate field site having a length of about 500 amino acids to the full length. Thus, a recombinant protein may be produced using the aforementioned genetic recombination technique.
For the purification after the reaction, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of methods known per se, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method. Can do.
[0033]
An antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention (its presence state is a protein), a peptide comprising a part thereof, or a salt thereof, can be a polyclonal antibody, as long as it can specifically recognize them. Any of monoclonal antibodies may be used. An antibody against the polypeptide (protein) of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof uses the polypeptide (protein) of the present invention or a partial peptide thereof as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known to those skilled in the art. Can be manufactured. As an example of a partial peptide that can be used as an immunogen in this manner, a peptide consisting of about 10 to 100 consecutive amino acids at the C-terminus of the polypeptide of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
For example, in the case of a polyclonal antibody, the antigen described above alone or bound to a suitable carrier such as cellulose, polymerized amino acid, albumin and keyhole limpet hemocyanin (KLH), in the presence or absence of an adjuvant, For example, it can be easily obtained by immunizing a suitable animal such as a rat, rabbit, sheep, goat or horse. Polyclonal antibodies can be recovered and purified from the sera of immunized animals by various known methods.
On the other hand, in order to produce a monoclonal antibody, for example, antibody-producing cells (for example, derived from spleen or lymph nodes) are collected from the immunized animal, and known immortalized proliferating cells (for example, bone marrow such as P3X63Ag8 strain) A hybridoma is produced by cell fusion with a tumor cell line. This can be easily obtained by further cloning, selecting a hybridoma clone producing an antibody specifically recognizing the polypeptide of the present invention, and recovering and purifying the monoclonal antibody from the culture medium of the hybridoma. Can do.
References regarding the production of antibodies against synthetic peptides and purification of antibodies include, for example, New Cell Engineering Experimental Protocol, Department of Cancer Research, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Shujunsha, 1993, 2-2-2, Synthesis Examples include the production of antibodies against peptides, p210-217.
Furthermore, various chimeric antibodies such as humanized antibodies containing the antigenic determinants of the antibodies thus obtained can be easily produced by various genetic engineering techniques known to those skilled in the art. The antibody of the present invention can be used to detect the polypeptide (protein) of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. In addition, the production of antibody columns used for purifying them, the detection of the polypeptide (protein) of the present invention in each fraction during purification, the behavior of the polypeptide (protein) of the present invention in test cells Can be used for analysis etc.
[0034]
Further, the antibody of the present invention can be used for quantification of the polypeptide (protein) of the present invention in a test solution by a known method, in particular, quantification by sandwich immunoassay using a monoclonal antibody, detection by tissue staining, etc. Can be used for Thereby, for example, diseases associated with the polypeptide (protein) of the present invention can be diagnosed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ′) 2, Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (for example, protein mass) in the solution to be measured. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method in which the amount is detected by a chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is preferably used in terms of sensitivity and specificity. As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like known in the technical field can be used.
[0035]
For the details of general technical means relating to these measurement / detection methods, review articles, books, etc. can be referred to. For example, Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1979), “Enzyme immunoassay” (3rd edition) edited by Eiji Ishikawa, et al. (Published in 1966), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. . 70 (Immunochemical Technologies (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), Vol. 84 (Immunochemical Technologies (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Technologies (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Vol. 121 (Immunochemical Technologies (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (published by Academic Press).
[0036]
The antisense DNA having a base sequence substantially complementary to the DNA encoding the polypeptide (protein) of the present invention or a peptide comprising a part thereof is a base sequence substantially complementary to the base sequence of the DNA. Any antisense DNA may be used as long as it has an action capable of suppressing the expression of the DNA. The substantially complementary base sequence is, for example, a base sequence having a homology of about 95% or more, most preferably 100% with the entire base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention. Is mentioned. Further, nucleic acid sequences (RNA or modified DNA) having the same action as these antisense DNAs are also included in the antisense DNA referred to in the present invention. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
[0037]
Furthermore, the polypeptide (protein) of the present invention is useful as a reagent for screening for compounds or salts thereof that inhibit the activity of these substances. That is, the present invention uses a polypeptide (protein) of the present invention, a peptide comprising a part thereof, or a salt thereof, a compound that inhibits the activity of the substance or a salt thereof (hereinafter referred to as “inhibition”). A screening method for the same, and a screening kit therefor. The compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that inhibits biological activity such as the polypeptide (protein) of the present invention. It is. The compound or salt thereof may directly inhibit the activity of the protein or the like of the present invention, or indirectly by inhibiting the expression of the polypeptide (protein) or the like of the present invention. It may be one that inhibits the activity of (protein) or the like. Examples of the salt of the compound include pharmaceutically acceptable salts. Examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. A compound that inhibits biological activity, such as the polypeptide (protein) of the present invention, may also be used as a medicament such as a therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned various diseases.
[0038]
By using the DNA of the present invention and a mammal-derived gene containing the DNA as probes, an abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention or a peptide comprising a part thereof in humans is detected. Therefore, it is useful as a genetic diagnostic agent for, for example, damaging, mutating or reducing expression of the DNA or mRNA, and increasing or overexpressing the DNA or mRNA. The gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the Science of Sciences of the United States). of America, 86, 2766-2770 (1989)). Furthermore, when the KIAA0453 gene of the present invention is abnormal or deficient or the expression level is decreased, a patient who cannot exhibit normal functions in vivo is treated according to known means (1) Retro The gene of the present invention or a gene derived from a mammal is introduced into the patient and expressed by gene therapy using an appropriate vector such as a viral vector, an adenoviral vector, an adenoviral associated viral vector as a vehicle, or ( 2) It is considered that the function of the protein of the present invention can be exhibited in the patient by injecting the polypeptide (protein) of the present invention into the patient. In the former case, the DNA of the present invention or a gene derived from a mammal is used as a vehicle, and the DNA on the vector is used alone or together with an auxiliary agent for promoting intake, a gene gun or a hydrogel It can also be administered by a catheter such as a catheter.
[0039]
In the present specification and drawings, when bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations, they are based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, and when amino acids may have optical isomers, Unless otherwise specified, L body is shown.
[0040]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention (amino acid number: 1,918).
[SEQ ID NO: 2] This shows the entire base sequence (6,106 base pairs) of clone mbg01969 containing the base sequence of the DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
[0041]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. In addition, various gene manipulations in the examples are described in Molecular cloning third. ed. The method described in (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) was followed.
[0042]
(1) Construction of mouse brain-derived cDNA library
Oligonucleotide with attB1 site: 5′-FgcGCACCACTTTGTTACAAGAAAAGCTGGGCGGCCGC (T) ₁₈ -3 ′ (F, g, and c represent a fluorescein group, phosphorothioate-modified G residue, and phosphorothioate-modified C residue), respectively, and a mouse adult (8-week-old male BALB / c mouse) Double-stranded cDNA was synthesized with SuperScript II reverse transcriptase kit (manufactured by Invitrogen) using brain-derived mRNA as a template. An adapter having an attB1 site was ligated to cDNA. Thereafter, cDNA was size-fractionated into 1 kb-2 kb, 2 kb-3 kb, 3 kb-5 kb, 5 kb-7 kb, 7 kb-11 kb and 11 kb-13 kb on an agarose gel. These were transferred to an attP pSPORT-1 entry vector (Invitrogen) having a reduced size by BP reaction, and then introduced into E. coli ElectroMax DH10B strain (Invitrogen) by electroporation. 10 appeared on the plate ⁶ One or more transformants were collected and cultured in a liquid medium at 37 ° C. for 2-3 hours, and then a plasmid was prepared. After size fractionation in the form of a supercoiled plasmid, the cDNA was transferred to an attR pBC destination vector (Invitrogen) by LR reaction. After purification of this plasmid, it was introduced into the DH10B strain by electroporation, and the above fractionation operation was repeated 2-3 times until each fraction had the expected size. Finally, a plasmid was introduced into the DH10B strain for each fraction. The cloning system using the in vitro homologous recombination reaction used here is the method of Ohara et al. (Nucleic Acids Res., 29, e22 (2001) and DNA Research Vol. 9, 47-57 (2002)). I followed.
Next, the terminal DNA sequences of about 8,000 clones contained in the 5 kb-7 kb fraction were determined. Among them, the entire nucleotide sequence was determined for cDNA of a clone having high homology to human KIAA0453. For sequencing, a DNA sequencer (ABI PRISM 3700) manufactured by Applied Biosystems and a reaction kit manufactured by the same company were used. Most sequences were determined by shotgun clones using the dye terminator method. For some base sequences, oligonucleotides were synthesized based on the determined base sequences and determined by the primer walking method.
[0043]
(2) Determination of clones containing the DNA of the present invention by homology search
Next, when a homology search using a DNA analysis program (Fasta & Blast) was performed based on the total nucleotide sequence thus obtained, a candidate clone mbg01969 showing high homology with the human KIAA0453 gene in the published database. Was found. Furthermore, using another DNA analysis program (BESTFIT), the amino acid sequence and base sequence of this clone mbg01969 and human KIAA0453 were compared, and at the amino acid sequence level, the amino acid sequence encoded by the human KIAA0453 gene (1,118 amino acids). Amino acid sequence (length of 1,119 amino acids) from the 800th to 1,918th positions of the amino acid sequence (1,918 amino acids long) represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention ) Was found to show about 97.04% homology.
When a database on the amino acid sequence of the published polypeptide was searched, there were a plurality of reports, but there was no report covering the entire amino acid sequence of the polypeptide of the present invention. Specifically, the polypeptide amino acid sequence base sequence of the polypeptide of the present invention having a length of 1,918 amino acids was longer than the amino acid sequence of the published polypeptide shown below, and addition of a new sequence was recognized.
1) Human protein sequence SEQ ID NO: 11743 of Patent Publication No. 2002-191363 (Title for Invention of Full-Length cDNA Synthesis and Its Use, Applicant: Helix Laboratory Co., Ltd., Publication Date: 9, Feb. 2002) (609 amino acid length) 210-595th amino acid sequence of 386 amino acid length and partial amino acid sequence of the polypeptide of the present invention (1,918 amino acid length), that is, 387 amino acid length from SEQ ID NO: 1 to 387th Slightly high homology was observed (about 88.37%). In the 1,918 amino acid sequence of the present invention, a novel sequence having a length of 1,531 amino acids is added to the C-terminal side with respect to the published human protein sequence SEQ ID NO: 11743 (609 amino acid length) sequence. In the application of Human protein sequence SEQ ID NO: 11743 of Patent Publication No. 2002-1913633, the amino acid sequence (ESTs) of the polypeptide fragment is merely described as various therapeutic amino acid sequences, and its function is unknown. . The 1,918 amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is longer than the amino acid sequence of 386 amino acids in which homology is recognized among the 609 amino acids, and its function can be estimated and useful as described later. is there.
2) International human number WO200175067-A2 (Name of invention: human human protein protein # 21004, Application: HYSEQ INC., Publication date: 11, Oct. 2001) 1st to 1,151st 1,151 amino acid long sequence (1,151 amino acid long) and a part of the polypeptide of the present invention (1,918 amino acid long), ie, SEQ ID NO: 702 to 1 , 849th 1,148 amino acid length, relatively high homology was observed (about 96.53%). In the application of Novel human diagnostic protein # 21004 of WO200175067-A2, it is merely described as a diagnostic protein using the amino acid sequence of the polypeptide fragment, and its function is unknown. Compared to the amino acid sequence of Novel human diagnostic protein # 21004, which is 1,154 amino acids long, the 1,918 amino acid sequence of the present invention has a length of 701 amino acids added to the N-terminal side and is also large in function. It can be described and is useful.
3) International Publication No. WO20011822-A1 (Invention name: Human gene 38 encoded secret protein HFIUW36, SEQ ID NO: 120, Applicant: Human Genome Sci. INC., Publication ID: 15) 120 (556 amino acids long) of the 1-556th sequence (556 amino acids long) and the partial amino acid sequence of the polypeptide of the present invention (1,918 amino acids long), that is, SEQ ID NOs: 1,281-1, 837 ( High homology with the 557 amino acid sequence (approximately 97.31%). In the application of Human gene 38 encoded secreted protein HFIUW36, SEQ ID NO: 120 of WO20011822-A1, it is merely described as a composition for treating various diseases using the amino acid sequence of the polypeptide fragment, and its function is unknown. It is. Compared to the 556 amino acid sequence, the 1,918 amino acid sequence of the present invention has a length of 1,280 amino acids on the N-terminal side and is long, and its function can be estimated and useful as described later. It is.
Regarding the mbg01969 protein amino acid sequence of the present invention (1,918 amino acid length), as shown above, the sequence of the present invention is 387 amino acids long, 1,148 amino acids long, and Although relatively high homology was observed for the 557 amino acid length, they do not cover the full length of the mbg01969 protein amino acid sequence of the present invention (1,918 amino acid length) and are only related to some shorter sequences. Met.
[0044]
When searching the database on the base acid sequence of the published gene, there were a plurality of reports on partial sequences having homology with a partial sequence of the mbg01969 base sequence (6,106 base length) of the present invention. There were no reports to cover. Specifically, the 6,106-base long base sequence of the present invention was longer than the published base sequence shown below, and the addition of a new sequence was recognized.
1) Human protein sequence SEQ ID NO: 11743 of Patent Publication No. 2002-191363 (Title for Invention of Full-Length cDNA Synthesis and Its Use, Applicant: Helix Laboratory Co., Ltd., Publication Date: 9, Feb. 2002) (3,989 bases long) from 1,124th to 1,830th bases of 707 bases in length, and 431 bases from 145-1, 144th in bases of the present invention (6,106 bases in length) to 710 bases in length A base sequence, a base sequence of 379 base length from 701 to 1,079 and a salt base sequence of 379 base length from twelfth to 390 base length of the base sequence of the present invention (6,106 base length); Slightly high homology of about 87.04% and about 91.82% was observed.
2) International human number WO200175067-A2 (title: Novell human diagnostic protein # 21004, Application: HYSEQ INC., Publication date: 11, Oct. 2001) 3,669 base length from SEQ ID NO: 1 to 3,669 and a part of the base sequence of the present invention (6,106 base length), that is, 3, from SEQ ID NO: 2,104 to 5,759 A slightly high homology of about 88.10% was observed with the 656 base length.
3) International Publication No. WO200111822-A1 (Invention name: Human gene 38 encoded secret protein HFIUW36, SEQ ID NO: 120, Applicant: Human Genome Sci. INC., Publication ID: 15) 120 (2,609 base length) of SEQ ID NO: 12 to 2,233, 2,222 base length, and part of the base sequence of the present invention (6,106 base length), ie, SEQ ID NO: 3, A slightly high homology of about 88.10% was observed with the 2,225 base length from the 535th to the 5,759th.
As compared with the base sequences of the present invention (6,106 bases long), the sequences filed in 1), 2), and 3) are 379 bases long, 710 bases long, 3,656 as shown above. Slightly high homology was observed for the base length and 2,225 base length. However, these sequences do not cover the full length of the base sequence of the present invention, that is, the mbg01969 gene sequence (6,106 base length), and the total length is different, but partially includes a homologous sequence. Yes, the sequences of 1), 2), and 3) and the sequence of the gene of the present invention are judged to be completely different novel sequences although relatively high homology is observed in fragments.
[0045]
From the results of the above homology search, the candidate clone mbg01969 shows a high homology with the human KIAA0453 gene, and a new sequence is added to the human KIAA0453 gene, and a similar gene exists in part. However, the total length was found to be a completely novel gene with no examples of known sequences.
[0046]
(3) Motif search
Regarding the DNA of the present invention, pftools (Bairoch A, Bucher P, Hofmann K, Nucleic Acids Res. 1997 Jan 1; 25 (1): 217-21), and Pfad, which are protein analysis programs for searching PROSITE database Protein analysis program for searching hmmer 2.1 (Sonhammer, E. L. L., Eddy, S. R., Birney, E., Bateman, A., and Durbin, R., Nucleic Acids Res 1998; 26 , 320-322), and Motif search was performed (Suyama et. Al. 1999 Nucleic Acids Res. 27: 338-339).
The amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA of the present invention is 1,918 amino acids long and 799 amino acids longer than human KIAA0453. As shown below, the polypeptide sequence extends to the N-terminal side by 799 amino acids. Has newly found that it has an unprecedented configuration having a UBA (Ubiquitin-associated) domain (FIG. 1).
Specifically, according to the HMMSmart search method (Schultz, J. et. Al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA, 95: 5857-5864), 167- from the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 204 UBA (Ubiquitin-associated) domain, and according to the ProfileScan search method, UBA (Ubiquitin-associated) domain 162-205 from the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, Also by the HMMPfam search method, a UBA (Ubiquitin-associated) domain was found at positions 166 to 205 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Accordingly, the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the mbg01969 gene of the present invention has an unprecedented structure having a UBA (Ubiquitin-associated) domain in a portion extending by 799 amino acids on the N-terminal side. It became possible to estimate the powerful function reinforced by the headline and this.
[0047]
(4) Expression frequency at the mRNA level
Although there is no knowledge about the expression frequency of the human KIAA0453 gene at the mRNA level (http://www.kazusa.or.jp/huge/gfpage/KIAA0453/, DNA Research, 1997, 4: 345-349). The expression frequency of the mouse KIAA0453 gene, which is one of these genes, at the mRNA level was analyzed for tissue-specific and developmental stage-specific expression of the gene in mice by RT-PCR. A forward primer and a reverse primer necessary to amplify and detect the transcription product of the mouse KIAA0453 gene by PCR were synthesized using a commercially available DNA automatic synthesizer. The forward primer sequence was 5′-CGAGCACTCCAGATAACA-3 ′ (SEQ ID NO: 3), the reverse primer sequence was 5′-CCCTCTATTCTGCCTGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 4), and these primers were used for the mouse KIAA0453 gene. When the transcript was amplified by the RT-PCR method, an about 529 bp DNA fragment (SEQ ID NOs: 3948-4476) was obtained. Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech Cat. No. # K1423-1, manufactured by Clontech), which has been prepared from mRNA prepared from each mouse tissue as a material and reverse transcriptase (RT) to the first strand cDNA. Using # K1430-1), analysis was performed as follows by the method shown by Clontech. That is, each mouse tissue 1st strand cDNA was mixed with the above primers, and PCR was performed on each of them to amplify a DNA fragment of about 529 bp DNA length in the transcription product of mouse KIAA0453 gene. In PCR, TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo, # RP001A) was used as Taq polymerase, and the above DNA mixture was heated at 95 ° C (2.5 minutes), and then 95 ° C (30 seconds) / 55 ° C ( 30 seconds) / 72 ° C. (30 seconds) was repeated 32 times. Amplification of an approximately 938 bp DNA fragment derived from a G3PDH transcript using the G3PDH primer (# 5406-1) provided by Clontech as a control was performed in the same manner. The amplified PCR product was fractionated by electrophoresis using 2% agarose gel (manufactured by Rockland, # 50070) together with a size marker, and the amount of the fractionated PCR products was compared semi-quantitatively (FIG. 2). ). As a result, it was confirmed that an approximately 529 bp DNA fragment derived from the mouse KIAA0453 gene was specifically amplified and expressed in all organs and all development processes as far as examined. More specifically, it was examined as a strong band in the lungs, kidneys and testis, a slightly strong concentration in the heart, a little darkness in the liver, thymus, eyes and smooth muscles, and a slightly thin band in the brain. In other organs and tissues, ie, spleen, lung, skeletal muscle, liver, kidney, bone marrow, lymph node, smooth muscle, prostate, and thymus, all were detected as a medium dark band. Moreover, in the process of generation | occurrence | production, it was detected as a medium intensity | strength band in all the processes of the 7th day, the 11th day, the 15th day, and the 17th day.
In FIG. 2, G3PDH in the lower row shows the expression pattern of the housekeeping gene (G3PDH) used as a control. Therefore, from the above results, the polypeptide encoded by the gene of the present invention is expressed in various organs including lungs, kidneys, testis and heart universally or throughout the entire development process. It can be said that it is involved in the development and differentiation of organizations and functional preservation.
[0048]
(5) Function estimation of the gene of the present invention
The polypeptide of the present invention (total length is 1,918 amino acids long) can be said to be a longer novel amino acid sequence in which a novel amino acid sequence having a length of 799 amino acids is added to the N-terminal side of the polypeptide encoded by the human KIAA0453 gene. . In the polypeptide encoded by the human KIAA0453 gene, an important motif was not recognized and its function was unknown.
As a result of a motif search for the polypeptide sequence of the present invention, a UBA (Ubiquitin-associated) domain was found in the portion added with a length of 799 amino acids to the N-terminal side of the polypeptide encoded by the human KIAA0453 gene.
The UBA domain has been identified as a sequence having an interaction with ubiquitin, for example, E2s, E3s, UBPs, etc. as a motif consisting of about 40 amino acids (Buchberger A., 2002, Trends Cell Biol. 12: 216-221). RAD23, SNF1-like kinases, p62 and the like have been reported as proteins in which the UBA domain is recognized (Hofmann, K. and Bucher P., 1995, Trends Biochem. Sci. 21: 172-173, Buchberger A., 2002, Trends Cell Biol., 12: 216-221, Yasushi Saeki, Hiroyuki Kawahara, Hideyoshi Yokozawa, Experimental Medicine, 2003, 21: 340-345).
The UBA domain is composed of three compact helix bundles, which form highly hydrophobic surface patches arranged in a three-dimensional structure that interact with ubiquitin non-covalently. It is assumed to work (Mueller TD and Feigon J., 2002, J. Mol. Biol., 319: 1243-1255). Proteins containing UBA domains are involved in various intracellular reactions such as bulk proteolysis, cell cycle control, stress response, DNA repair, signal transduction, transcriptional regulation, and vesicular transport. These various intracellular reactions require high substrate specificity in the ubiquitination mechanism for individual proteins.
In addition, proteins that are found to have a UBA domain include proteins that repair UV cleavage, protein kinases (kinases), proteins involved in intracellular signal transduction pathways and cell cycle control, and the like. Furthermore, proteins belonging to the UBA domain include proteins that are not related to ubiquitin, such as HIV Vpr (Deckmann, T. et al., 1998, Nature Structural Biology, 5: 1042-1047), 3-methylenine DNA. Glycosidase (MPG) or nuclear mRNA export factor TAP / Mex67 has also been shown to interact with the UBA domain, and a wider function of the UBA domain is being elucidated (Müller TD and Feigon J. et al. , 2002, J. Mol. Biol., 319: 1243-1255).
The polypeptide of the present invention also has a UBA domain on the N-terminal side. Therefore, the UBA domain binds to ubiquitin, is involved in ubiquitination, and is directly involved in cell differentiation / proliferation regulation. It was presumed to be a protein involved in the regulation of important functions in the body. Many proteins having a UBA domain on the C-terminal side are known, but proteins having a UBA domain on the N-terminal side are short of several hundred amino acids such as yeast Shp1 and its human homolog p47 and human Y33K. Only two cases have been reported (Buchberger A., 2002, Trends Cell Biol. 12: 216-221), and the polypeptides of the present invention are long compared to them and a completely new type of UBA domain different from the conventional ones. It can be said that the polypeptide has
In addition, from the tissue-specific expression pattern of the mbg01969 gene, the polypeptide of the present invention is involved in important functions of cells in various tissues as well as lung, kidney, testis, heart, liver, thymus, eye and smooth muscle. By analogy. In summary, the polypeptide having the UBA domain of the present invention is mainly a ubiquitination, intracellular protein that is generated by binding to ubiquitin and impairing ubiquitination of specific proteins, proteosome degradation, etc. It is a novel protein responsible for important cellular processes, such as the degradation of proteins, and is said to be the center of complex proteins in vivo in various organs involved in these important functions.
[0049]
So far, there has been no report on a huge polypeptide having a length of 1,000 amino acids having a UBA (Ubiquitin-associated) domain on the N-terminal side. In addition, the gene sequence of the present invention encoding an amino acid sequence having a UBA domain on the N-terminal side is high in the lung, kidney, testis, slightly higher in the heart, liver, It was found for the first time that thymus, eyes, and smooth muscles were slightly higher but slightly weaker in the brain, and that expression was observed in all organs as long as they were examined, and that they were expressed throughout the entire development process. Thus, it was shown that the protein encoded by the gene of the present invention may be involved in an important function of controlling cell proliferation / differentiation in all tissues.
The gene encoding the novel polypeptide of the present invention is high in the lung, kidney, testis and heart, and is characterized by being expressed in all organs. The polypeptide of the present invention is a novel gene having a UBA domain. It is a polypeptide protein, and it is useful for developing growth, functional conservation, or pathological conditions related to organs throughout the body (eg canceration, aging, dysfunction), and for the development of preventive drugs, therapeutic drugs, and test drugs. It is clear that this is an excellent point of the present invention. Further, the use of the recombinant protein of the present invention or a recombinant expressing the recombinant protein is excellent in that it can be used for screening for agonists and antagonists or for drug design research.
[0050]
Although there is no knowledge about expression of mRNA level of human KIAA0453 gene (http://www.kazusa.or.jp/huge/gfpage/KIAA0453/, DNA Research, 1997, 4: 345-349), mbg01969 gene of the present invention Is high in the lungs, kidneys, and testis, slightly higher in the heart, slightly higher in the liver, thymus, eyes, and smooth muscles but slightly weaker in the brain, and is expressed in all organs examined In addition, since it is expressed throughout the entire development process, especially in the lung, kidney, testis, liver, thymus, eye, smooth muscle, and in various organs, growth, functional maintenance, or cancer / Diseases related to cell proliferation such as autoimmune diseases and allergies, aging, dysfunction, or congenital malformations Mechanisms elucidated and diagnostic and therapeutic agents for human diseases, including throat abnormal differentiation, useful in the development of the test agent. By using the recombinant protein of the present invention or a recombinant expressing the recombinant protein, it can be used for screening for agonists and antagonists or for drug design studies.
[0051]
Thus, a gene encoding a polypeptide having a UBA (Ubiquitin-associated) domain that is extremely important for cell proliferation / differentiation and senescence can itself directly become a disease-causing gene. The polypeptide of the present invention is characterized by the UBA domain found in the portion added to the N-terminus, and it is known that this UBA domain can cause the following diseases.
For example, disease groups caused by abnormal ubiquitination and abnormal degradation of intracellular proteins include Alzheimer's disease (high ubiquitin level), Parkinson's disease (high ubiquitin level), Angelman syndrome (ubiquitin system abnormality), Lewy bodies. Diseases, neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Creutzfeldt-Jakob disease, triplet repeat disease (such as Huntington's disease), or spermatogenesis, as well as neoplastic diseases, genetic diseases, viral infections There is also a report on the disease or immunity (Keiji Tanaka, Experimental Medicine, 1997, 15: 2056-2062, Tadashi Anan, Mitsuyoshi Nakao, Protein / Nucleic Acid / Enzyme, 44: 766-786, Toshiaki Suzuki, Hideki Shimura, Hattori Nobutaka, Experimental Medicine, 2000, 18: 1478-1482), closely related to these diseases Considered.
From these facts, the DNA related to the polypeptide having the UBA domain of the present invention, the gene containing the DNA, the polypeptide encoded by the DNA and the recombinant protein containing the polypeptide are universally used in various organs. In particular, it is involved in various intracellular reactions such as bulk proteolysis, cell cycle control, stress response, DNA repair, signal transduction, transcriptional regulation, and vesicular transport, thereby controlling cell growth or differentiation. Moreover, it is strongly suggested to be involved in elucidation of pathological conditions related to functional maintenance and aging of these organs.
That is, the polypeptide having the UBA domain encoded by the mbg01969 gene is ubiquitinated abnormally in various organs and tissues, particularly in lung, kidney, testis, liver, thymus, eye and smooth muscle. Involved in disease groups caused by abnormal protein degradation, involved in mechanisms such as loss of function of tumor suppressor proteins in cancer cells, acquisition of functions of oncogene products, or cells invaded by infectious viruses such as HIV It can be easily guessed that it is also involved in the mechanism by which the viral proteins are broken down within.
[0052]
【The invention's effect】
Since the polypeptide encoded by the human KIAA0453 gene was not sufficiently long and 1,118 amino acids long, and no motif structure was found to analogize its function, its function could not be estimated. This time, the present inventors have cloned a gene (DNA) showing high homology to the human KIAA0453 gene from a cDNA library derived from mouse brain, and obtained a new DNA sequence in which a DNA sequence is newly added to the N-terminal side. Succeeded in doing. The polypeptide encoded by the novel DNA sequence is as long as 1,918 amino acids, and the polypeptide has an unconventional structure having a UBA (Ubiquitin-associated) domain on the N-terminal side, It was presumed to be related to important cellular processes such as proliferation, differentiation or expression of function. Furthermore, it has been found for the first time that the gene sequence of the present invention has a relatively low expression level in the brain and is expressed throughout the entire development process. The possibility of being involved in an important function of controlling cell proliferation and differentiation in various organs was shown.
[0053]
From what has been described so far, the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention or the antibody of the present invention is a disease associated with growth, functional conservation, or cell proliferation such as cancer, autoimmune disease, allergy in various organs. It is considered to play an indispensable role in elucidating the mechanism and diagnosis / treatment of human diseases including differentiation abnormalities such as aging, dysfunction, dysfunction, or congenital malformations, and for functional preservation of various organs and prevention of aging. In addition, expression pattern information at each tissue and developmental stage by expression frequency analysis at the mRNA level is universally expressed in various organs and is universally expressed in each developmental process. It was clarified that the gene of the present invention is important in the development and differentiation of various organs, the functional maintenance thereof, and aging.
Therefore, the DNA of the present invention and a gene derived from a mammal containing the DNA, a part or full length of the polypeptide encoded by them, an antibody against the partial or full length of the polypeptide, antisense DNA, etc. It can be used as a pharmaceutical in the development of various treatment / prevention methods using mice, which are model animals for treating human diseases.
[0054]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a novel polypeptide having a UBA (Ubiquitin-associated) domain newly recognized in the polypeptide of the present invention (aa: amino acid sequence, the number is the number of amino acids, box: from the top, HMMPfam search method (upper row) ), The HMMSmart search method (middle), and the UBA domain identified by different search methods such as the ProfileScan search method (lower).
From these results, a UBA domain was newly identified by the ProfileScan search method, the HMMPfam search method, and the HMMSmart search method.
FIG. 2 compares the expression intensity of the mbg01969 (mouse KIAA0453) gene in each mouse tissue and each developmental stage by RT-PCR. The upper two photographs show the expression intensity of the mbg01969 gene, and the lower photograph shows the expression intensity of the housekeeping gene (G3PDH) used as a control for the ethidium bromide staining pattern after fractionation by agarose electrophoresis.

Claims

DNA comprising a base sequence encoding the following polypeptide (a) or (b): (a) consisting of a part or all of an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide; or (b) consisting of an amino acid sequence in which a part of the amino acids is deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and biology substantially the same as the polypeptide of (a) A polypeptide having an activity.

DNA of the following (a), (b) or (c): (a) DNA encoding part or all of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; b) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA of (a); or (c) DNA and stringent base sequence complementary to the DNA of (a). DNA encoding a protein that hybridizes under conditions and has substantially the same biological activity as the polypeptide encoded by the DNA of (a).

A mammal-derived gene comprising the DNA according to claim 1 or 2.

A rodent-derived gene, wherein the mammal according to claim 3 is a rodent.

A mouse gene, wherein the rodent according to claim 4 is a mouse.

The following polypeptide (a) or (b): (a) a polypeptide comprising a part or all of an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; or (b) a sequence The amino acid sequence represented by No. 1 consists of a part or all of the amino acid sequence in which some amino acids are deleted, substituted or added, and has substantially the same biological activity as the polypeptide of (a). Having a polypeptide.

The polypeptide according to claim 6, which is a recombinant protein produced in a host cell into which the DNA according to claim 1 or 2 or the gene according to any one of claims 3 to 5 has been introduced.

A recombinant vector comprising the DNA according to claim 1 or 2, or the gene according to any one of claims 3 to 5.

An antibody that specifically binds to the polypeptide according to claim 6 or 7.