JP2004073076A

JP2004073076A - NEW POLYPEPTIDE HAVING BTB/POZ DOMAIN AND Kelch RECURRING SEQUENCE AND DNA ENCODING THE SAME

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Publication number: JP2004073076A
Application number: JP2002237736A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Koga; 古閑　比佐志; Takahiro Nagase; 長瀬　隆弘
Original assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Kazusa DNA Research Institute Foundation
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2002-08-19
Publication date: 2004-03-11

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new DNA useful for screening preventive medicines, therapeutic medicines or examination medicines for oculopathy or encephalopathy/neuropathy, to provide a gene comprising the same, to provide a new polypeptide encoded by said DNA, to provide a recombinant protein comprising said polypeptide, and to provide an antibody to said new polypeptide. <P>SOLUTION: The DNA comprises a base sequence encoding the following polypeptide(a) or (b): (a) a polypeptide comprising part or the whole of a sequence identical or substantially identical with an amino acid sequence represented by a specific sequence, or (b) a polypeptide comprising a sequence where some amino acids are deleted, substituted or added in the above-amino acid sequence and having biological activity substantially identical with that of the polypeptide(a). <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列を有し、かつ眼に強発現が認められる新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、並びに、新規ポリペプチドに対する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のヒトゲノムプロジェクト及びヒトｃＤＮＡプロジェクトの成功により、多くのヒト疾患関連遺伝子が同定あるいは推定されるにいたった。しかしながらその一方で倫理上の問題からヒト遺伝子を用いた研究には制約があり、新たな研究の方向性が模索されている。このような観点からモデル生物における相同遺伝子を同定することは、研究を進展させる意味できわめて重要なステップと考えられる。特にマウスは最も研究が進んでいるモデル生物で、ゲノム情報や変異種の情報も比較的多く蓄積されているが、蓄積されたゲノム情報はまだ十分なものではない。一方、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究がなされ、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録、公開がなされた。しかし、多くのＥＳＴは１００塩基長から５００塩基長といった短い塩基配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００３】
脳、神経系では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。また、機能の調節には、機能を受け持つ特異的な細胞の増殖あるいは同細胞の活性化が関係している。従って、眼あるいは脳・神経系に強く発現している新規な遺伝子を取得して、それにコードされる眼あるいは脳・神経系における複雑な機能を調節する蛋白質を得ることは、医薬品開発に有用である。また、得られた蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現している該蛋白質の遺伝子の機能をホモロジー検索から推定し、その情報を基にして該蛋白質を適当な発現系で発現させて組換え蛋白質を得、更にして該蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることが必要であった。
【０００４】
長鎖ヒトｃＤＮＡプロジェクトにて、ヒト脳由来のヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２００１，　８：１７９−１８７）が報告されているが、その機能については不明であった。ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子は染色体２ｐ２３．３に存在し、更に、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子のＳＮＰｓも複数箇所報告されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｌｏｃｕｓＩｄ＝１１４８１８）、ヒト疾患の大部分が単なる遺伝子の欠失によって引き起こされるのではなくて、アミノ酸置換によって蛋白質の機能や活性が一部分だけ変化することにより引き起こされることを鑑みると、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子は脳腫瘍（Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　２４２　（２），　４７０−４７７　（１９９８））やＧｉａｎｔ　ａｘｏｎａｌ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ　（ＧＡＮ）（Ｅｕｒ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　２０００　Ｊｕｌ；８（７）：５２７−３４）のような神経変性疾患に関与している可能性が考えられた考えられる。しかしながら、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子にコードされる蛋白質にはｋｅｌｃｈ繰り返し配列以外には特徴的なドメインが認められず遺伝子情報としては不十分であり、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子の機能を推定することが出来なかった。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
従来、ヒト長鎖ｃＤＮＡプロジェクトでヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子が取得されていたが、遺伝子情報が完全でなくその機能が不明であった。一方、眼あるいは、脳・神経系で発現する新規遺伝子を取得し、該遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質あるいはその蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることは、細胞内で該蛋白質が他の蛋白質との結合を阻害する化合物を、あるいはシグナル伝達等に影響及ぼす化合物をスクリーニングするのに重要である。
【０００６】
従って、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子に関連する新規遺伝子を取得し、新規ドメインを取得し、同遺伝子の組織特異的発現パターンを得て、該新規遺伝子がコードする蛋白質の機能に関する情報を得ることは、該蛋白質の特異的結合蛋白質や、アゴニスト、アンタゴニストを検索する際の非常に重要な手段となる。上記の蛋白質の特異的結合蛋白質が見出されなくても、該蛋白質の不活化実験（例えばノックアウト動物の作製）から該蛋白質の生理作用を解析することにより、該蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することが可能であり、該蛋白質に対する特異的結合蛋白質、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、脳・神経系疾患の患者の機能不全に関連する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬として活用することが可能となる。生体での該蛋白質の機能の低下または昂進が、脳・神経系の疾患の原因となっている場合が考えられる場合がある。この場合には、該蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該蛋白質の脳・神経系への投与や、該蛋白質をコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸の投与、あるいは該遺伝子を用いた遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該蛋白質の塩基配列は、脳・神経系疾患の患者の遺伝子欠失や変異の有無を調べるために必要な情報であり、該蛋白質をコードする遺伝子は、該蛋白質の機能不全に関与する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬に応用することが出来る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、その遺伝子のＮ−末端側にヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子になかった全く新しい配列が付加していること、またその遺伝子の配列内にＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列を有することを発見し、更にその遺伝子情報をもとに新規ポリペプチドとそれに特異的な抗体を得て、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部（例えば、以下に示すＢＴＢ／ＰＯＺドメインあるいはｋｅｌｃｈ繰り返し配列の少なくとも一つを有するもの）又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、に係る。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列（配列番号：２の塩基対第１〜３，０１２番目）の一部（例えば、以下に示すＢＴＢ／ＰＯＺドメインあるいはｋｅｌｃｈ繰り返し配列の少なくとも一つを有するもの）又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに係る。以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明のＤＮＡ」ともいう。本発明のＤＮＡは、新規ポリペプチドをコードするものである。又、本発明はこれらＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、哺乳動物が齧歯類である齧歯類由来遺伝子、特に齧歯類がマウスであるマウス遺伝子にも係る。特に、マウス遺伝子は「マウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子」ともいう。
更に、本発明は本発明のＤＮＡ又は遺伝子にコードされるポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」ともいう。）、例えば、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質であるポリペプチド（以下、「ＫＩＡＡ１９２１蛋白質」ともいう）に係る。
また、本発明は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を含む組換えベクター、及び、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩に特異的に結合する抗体に係る。
【０００９】
また、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、該ポリペプチドに対する抗体を用いることによって、該蛋白質の発現量を変化させる化合物、該蛋白質に結合する蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法などを提供する。更に、本発明ポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩を用いることを特徴とする、それら物質と特異的に結合する物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニング用キット等も提供する。
【００１０】
更に、本発明は、本発明のＤＮＡ、本発明のＤＮＡを含有する組換えベクター又は発現ベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又はその塩の製造方法、及び、こうして得られる本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質またはその塩を提供する。又、本発明は、本発明のＤＮＡを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質をコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド又はそれらを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を含有してなる医薬を提供する。
更に、本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて得られる、所謂、ＤＮＡチップ（アレイ）、プロテインチップにも係る。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、かずさＤＮＡ研究所で採取されたマウス脳由来のｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４：５３−５９）に従って調製したマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、約４５，０００個の組換え体を選択した。次に、このクローンのうち約８，０００個の３’末端ＤＮＡ配列を決定し、その中から、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子に高い相同性を有するクローンを選択し全塩基配列の決定を行なった。次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（ＧＣＧ，　Ｆａｓｔａ＆　Ｂｌａｓｔ）を用いてホモロジー検索を行なった。その結果、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列番号：１で示されるアミノ酸配列の４８９番目から１，００４番目の５１６アミノ酸について比較したところ、アミノ酸レベルで約９８．６％という有意な相同性を有する、配列番号：２に示される塩基配列を有するクローンを取得した（クローン名：ｍｂｇ０２１３３）。
【００１２】
取得したｍｂｇ０２１３３にコードされるポリペプチド（本発明のポリペプチド）のアミノ酸配列は１，００４アミノ酸であり、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子にコードされている蛋白のアミノ酸配列の５４５アミノ酸（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，　８　（４），　１７９−１８７）に比較しＮ−末端側が長く伸びていた。得られた「本発明のポリペプチド」のアミノ酸配列について、以下の実施例に記載したようにホモロジー検索を行った結果、「本発明のポリペプチド」ではヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子にコードされているポリペプチドに比較し、Ｎ−末端側１−４８８番目の４８８個のアミノ酸配列が新規に付加されていることが判明した。新規に付加されていたＮ−末端側４８８個のアミノ酸配列について公共のデーターベースを用いてホモロジー検索を行った結果、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＣ０１３９８２　で報告されたアミノ酸配列に対しホモロジーがあること、しかしその配列と比較しても本発明のポリペプチドのＮ−末端側、１−３１０番目の３１０個のアミノ酸配列は全くの新規であることが判明した。
尚、配列番号：２に示される塩基配列を有する本発明のＤＮＡを含むプラスミド（プラスミド表示名：　ｍｂｇ０２１３３）は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年７月１６日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３４が付されている。
【００１３】
ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子の配列が６，３８５ｂｐ（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２００１，　８：１７９−１８７，　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ１９２１／）であるが、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは５４５アミノ酸である。ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子ホモログを詳細に研究することにより、Ｎ−末端側にはさらにポリペプチドがコードされている可能性について検証される可能性がある。本発明のＤＮＡにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは１，００４アミノ酸であるが、本発明のＤＮＡに対するホモログについて更に詳細に研究することにより、Ｎ−末端側に更に伸張してポリペプチドがコードされていることを見つける可能性がある。
【００１４】
尚、当業者であれば、本明細書によって初めて開示された配列番号：２に示した塩基配列に基づいてクローンの５’側に適当なプライマー（例えば、配列番号：２の塩基対第６１〜８０番目５’−　ＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＧＡＧＡＧＧＡ−３に対応させて合成した配列５’−　ＴＣＣＴＣＴＣＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣ−３’　）を調製し、該プライマーと市販されている哺乳動物脳由来のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なった後に逆転反応を行なうことにより本発明のＤＮＡの上流側（遺伝子の５’側）の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片を特異的に合成することができる。合成した５’側の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した後、配列番号２の一部分をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来ＫＩＡＡ１９２１遺伝子の全領域を調製することが可能である。あるいは他の方法で、例えば次のような方法を用いても遺伝子の５’側が更に伸張した塩基配列を得ることが出来る。すなわち、本発明のＤＮＡをプローブとして用いれば、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１９２１遺伝子の５’末端領域を調製することができる。更に、本発明のＤＮＡ配列及び本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が開示されている以上、当業者であれば、これらの情報に基づき、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１９２１遺伝子の５’末端領域を容易に取得することが出来る。又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１９２１遺伝子の全領域を調製することが可能である。
【００１５】
本発明のＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。また、脳、又は、それ以外の組織、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、等の細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１６】
配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。従って、本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。又、本発明のポリペプチドには、例えば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドも含まれる。
【００１７】
更に、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、好ましくは更に配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと同質の生物学的活性を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。かかる条件下で、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ　Ｎｏ．　１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ　Ｎｏ．　１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１８】
本発明のＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００１９】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明のＤＮＡ又は本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、ＣＭＶウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した発現ベクター等を利用することが出来る。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＨＳＰプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００２０】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
【００２１】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＤＨ１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、あるいはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｂ株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス　ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア　パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル腎臓細胞由来ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞あるいはヒトミエローマ細胞などが用いられる。
【００２２】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；　Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８　新　細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２３】
このようにして得られた、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２４】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明のポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことが出来る。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することも出来る。更に、トリプシン、キモトリプシン、ＦａｃｔｏｒＸａ、トロンビン、又は、ＫＥＸ２プロテアーゼのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００２５】
本発明のポリペプチド（蛋白質）は、Ｃ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ−末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
【００２６】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）がＣ−末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ−末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００２７】
本発明のポリペプチドの一部からなるペプチドとしては、前記した本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明の組換え蛋白質と実質的に同質の生物学的活性を有するするペプチドなどが用いられる。このような部分ペプチドの具体例としては、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の中の、ＢＴＢ／ＰＯＺドメインあるいはｋｅｌｃｈ繰り返し配列の少なくとも一つを有するものを挙げることが出来る。
又、本発明の部分ペプチドはＣ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２　）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ−末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２８】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）又はその一部からなるペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２９】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することも出来る。例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，　ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００３０】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルオキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００３１】
本発明の一部からなるペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当な蛋白質限定分解酵素で切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
（２）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座１、　蛋白質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
（３）矢島治明監修、続医薬品の開発　第１４巻　ペプチド合成　広川書店。
又は、一部からなるペプチドは、例えば、Ｃ−末端から十数残基の配列或いは配列番号：１で示されるアミノ酸配列の任意の場所の十数残基の部分を公知のペプチド合成装置等を用いて合成することが出来る。更に、このような部分ぺプチドは組換え蛋白質として前述の遺伝子組換え技術を用いて製造しても良い。
反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３２】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩と特異的に結合する抗体は、それらを特異的に認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドを抗原として用い、当業者に公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、ポリクローナル抗体の場合には、上記抗原を単独、又は、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等の適当な担体に結合させて、アジュバントの存在又は非存在下で、例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの適当な動物に対して免疫誘導することによって容易に得ることが出来る。ポリクローナル抗体は免疫された動物の血清から公知の様々な方法によって回収及び精製することが出来る。
一方、モノクローナル抗体を製造するためには、例えば、上記の免疫された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、公知の不死化増殖細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等の骨髄腫細胞株）との細胞融合により、ハイブリドーマを作成する。これを更にクローニングし、本発明のポリペプチド等に特異的に認識する抗体を生産しているハイブリドーマのクローンを選別し、該ハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を回収し精製することによって容易に得ることが出来る。
更に、当業者には公知である様々な遺伝子工学的手法により、こうして得られた抗体の抗原決定基等を含む、ヒト化抗体等の各種キメラ抗体も容易に製造することが出来る。
本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチド（蛋白質）等を検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチド（蛋白質）の検出、被検細胞内における本発明のポリペプチド（蛋白質）の挙動の分析などのために使用することができる。
【００３３】
更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明のポリペプチド（蛋白質）等の定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、及び組織染色等による検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）等が関与する疾病の診断を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２　、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることが出来る。
【００３４】
これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３５】
本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３６】
更に、本発明のポリペプチド（蛋白質）等は、これら物質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチド（蛋白質）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、該物質又はそれらの塩の活性を阻害する化合物（以下、「阻害剤」ともいう）のスクリーニング方法、及びその為のスクリーニング用キットを提供する。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物である。該化合物またはその塩は、本発明の蛋白質等の活性を直接阻害するものであってもよいし、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の発現を阻害することによって間接的に本発明のポリペプチド（蛋白質）等の活性を阻害するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。
【００３７】
本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子をプローブとして使用することにより、ヒトにおける本発明のポリペプチド又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。更に、ＫＩＡＡ１９２１遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明のポリペプチド（蛋白質）等を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。前者の場合、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を適当なベクターをベヒクルとして使用し、ベクターにのせた形の該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
【００３８】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００３９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：１，００４）を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を含む、クローンｍｂｇ０２１３３の全塩基配列（５，０７０塩基対）を示す。
【００４０】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている方法に従った。
【００４１】
（１）マウス脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ａｔｔＢ１部位を有するオリゴヌクレオチド：５’−ＦｇｃＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）_１８−３’（Ｆ、ｇおよびｃは、それぞれフルオレッセイン基、フォスフォロチオエイト修飾Ｇ、フォスフォロチオエイト修飾Ｃ残基を表す）をプライマーとして、マウスの成体（８週令雄のＢＡＬＢ／ｃマウス）脳由来ｍＲＮＡを鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにａｔｔＢ１部位を有するアダプターをｃＤＮＡにライゲーションした。その後、アガロースゲルで１ｋｂ−２ｋｂ、２ｋｂ−３ｋｂ、３ｋｂ−５ｋｂ、５ｋｂ−７ｋｂ、７ｋｂ−１１ｋｂと１１ｋｂ−１３ｋｂにｃＤＮＡをサイズ分画した。これらを、サイズを小さくしたａｔｔＰ　ｐＳＰＯＲＴ−１エントリーベクター（インビトロジェン社製）にＢＰ反応により移し換えた後、大腸菌ＥｌｅｃｔｏｒｏＭａｘ　ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポーレーション法により導入した。プレートに出現した１０^６個以上の形質転換体を集め、液体培地中で、３７℃で２−３時間培養した後プラスミドを調製した。スーパーコイルドプラスミドの形でサイズ分画した後、ＬＲ反応によりａｔｔＲ　ｐＢＣデスティネーションベクター（インビトロジェン社製）にｃＤＮＡを移し換えた。このプラスミドを精製後、ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポーレーション法により導入し、各分画が期待されるサイズになるまで、上記の分画操作を２−３回繰り返した。最後に各分画ごとにＤＨ１０Ｂ株にプラスミドを導入した。なお、ここで用いた試験管内での相同組み換え反応を利用したクローニングシステムは小原等の方法　（Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２９，　ｅ２２　（２００１）およびＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ．９，　４７−５７（２００２））　に従った。
次に、５ｋｂ−７ｋｂ画分に含まれる約８，０００個のクローンの末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、ヒトＫＩＡＡ１９２１に相同性が高いクローンのｃＤＮＡに関して全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
【００４２】
（２）ホモロジー検索による本発明ＤＮＡを含むクローンの決定
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（Ｆａｓｔａ　＆　Ｂｌａｓｔ）を用いたホモロジー検索を実施したところ、公開されているデータベースの中のヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子と高いホモロジーを示す候補クローンｍｂｇ０２１３３が見出された。更に、別のＤＮＡ解析プログラム（ＢＥＳＴＦＩＴ）を用いて、このクローンｍｂｇ０２１３３とヒトＫＩＡＡ１９２１のアミノ酸配列と塩基配列について比較したところ、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列番号：１で示されるアミノ酸配列のうち４８９番目から１，００４番目までの５１６アミノ酸について、アミノ酸レベルで約９８．６％のホモロジーを示し、また、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＣ０１３９８２　で報告されたアミノ酸配列と配列番号：１で示されるアミノ酸配列のうち３１０番目から１，００４番目までの６９５アミノ酸について相同性を比較したところ、、アミノ酸レベルで約９８．３％のホモロジーを示した。
また、塩基配列レベルではヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子がコードする２，８８８番目から４，６１２番目までの塩基配列と配列番号：２で示される塩基配列の１，４６５番目から３，１８８番目の１，７２４塩基長について相同性を比較したところ、約８９．９％のホモロジーが認められた。更に、ＷＯ　２０００／５８４７３記載のＯＲＦ　７０４遺伝子の塩基配列（全１，００６塩基長）のうち５番目から１，００５番目までの塩基配列と、配列番号：２で示される塩基配列の１，４９３番目から２，４９３番目の１，００１塩基長について相同性を比較したところ、約９０．３％のホモロジーが認められた。ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＣ０１３９８２　で報告された塩基配列のうち３５番目から２，２９８番目までの２，２６４塩基長の配列と、配列番号：２で示される塩基配列のうち９２６番目から３，１８８番目までの２，２６３塩基長について相同性を比較したところ、約９０．５％のホモロジーが認められた。
【００４３】
（３）ドメイン検索
更に，本発明のＤＮＡに関して、ＰＲＯＳＩＴＥ　ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムであるｐｆｔｏｏｌｓ　（Ｂａｉｒｏｃｈ　Ａ，　Ｂｕｃｈｅｒ　Ｐ，　Ｈｏｆｍａｎｎ　Ｋ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．　１９９７　Ｊａｎ　１；２５（１）：２１７−２１）、及びＰｆａｍ　ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムｈｍｍｅｒ　２．１（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，　Ｅ．　Ｌ．　Ｌ．，　Ｅｄｄｙ，　Ｓ．　Ｒ．，　Ｂｉｒｎｅｙ，　Ｅ．，　Ｂａｔｅｍａｎ，　Ａ．，　ａｎｄ　Ｄｕｒｂｉｎ，　Ｒ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９９８；　２６，　３２０−３２２）を用いてドメイン検索を行なった　（Ｓｕｙａｍａ　ｅｔ．　ａｌ．　１９９９　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２７：　３３８−３３９）。本発明のＤＮＡは、５，０７０塩基対あり、１，００４個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしている。現在、取得している本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列のうちほぼ中央部にＢＴＢ　（Ｂｒｏａｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ，　ｔｒａｍｔｒａｃｋ，ｂｒｉｃ−ａ−ｂｒａｃ）／　ＰＯＺ　（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ）ドメインとＣ−末端部分に６回のｋｅｌｃｈ繰り返し配列を有することが判明した（図１）。詳しくには、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち４４８番目から５６０番目までに、また、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち４５８番目から５６０番目までに、更にＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち４５８番目から５３０番目に、ＢＴＢ／ＰＯＺドメインが認められた。更に、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち４５８番目から５６０番目までに、６個のｋｅｌｃｈ繰り返し配列が見出された。更に、Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ，　１９９９，　１０：２３６１−２３７５に示されるＭａｙｖｅｎ　蛋白のＢＴＢ／ＰＯＺ　ドメインの約４０アミノ酸基上流に認められたｐｕｔａｔｉｖｅ　ｌｉｇａｎｄ　ｆｏｒ　ＳＨ３　ｄｏｍａｉｎ　に特徴的なＰＰＸＰＰＸ　配列が、本発明の配列番号：１における４９２番目〜４９７番目のアミノ酸においてＰＰＰＰＰＡ　配列として認められた。
ＢＴＢ／ＰＯＺドメインをもつ蛋白質の機能については、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　２００１　Ｊｕｎ；２１（１１）：３６０９−１５、あるいは蛋白質　核酸　酵素　１９９９　Ｓｅｐ；４４（１２　Ｓｕｐｐｌ）：１７７１−９といった総説で示されている。それらによると、ＢＴＢ／ＰＯＺドメインはＣ２Ｈ２−ｔｙｐｅの転写因子やＳｈａｗ−ｔｙｐｅ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌなどに特徴的であること、またＢＴＢ／ＰＯＺドメインに関わる機能について、染色体ＤＮＡ上の離れた位置にあるシス制御配列を空間的に近づける新しいタイプの転写因子、構造転写因子（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）であるといわれている。ＢＴＢ／ＰＯＺドメインはＢＴＢドメインともＰＯＺドメインともいわれ、約１２０のアミノ酸からなる蛋白質と蛋白質の相互作用を示すドメインである。ヒトの場合、ＰＯＺ　ドメインを有する蛋白質のうち約２／３が約Ｚｎフィンガー型ＤＮＡ結合ドメインを合わせた構成となっており、残り約１／３はｋｅｌｃｈドメインをあわせ持つアクチンに結合する蛋白質であるという（蛋白質　核酸　酵素，　１９９９，　４４（１２）：１７７１−９）。ＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列ドメインを持つ蛋白質に対する結合因子としてＳＭＲＴ（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｏｆ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｎｄ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などのコリプレッサー群が同定され、それらコリプレッサー群とヒストンデアセチラーゼとが複合体を形成することも見出されている（Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１：８１１−８１４，　Ｎａｔｕｒｅ　，１９９８，　３９１：８１５−８１８）。
このことから、ＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列ドメインを有する蛋白質が、クロマチン構造を介した遺伝子発現の機能に深い関与が考えられている。この場合、ＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列ドメインは、核内構造及びクロマチン構造の形成とそれによる機能調節に関わっていることになり、また同ドメインは発癌に関係する因子でも見出されていることにより、癌化のメカニズムへの関与が想定されている（Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　２００１　Ｊｕｎ；２１（１１）：３６０９−１５、蛋白質　核酸　酵素，　１９９９，　４４（Ｎｏ．１２）：１７７１−９）。
【００４４】
本発明のマウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子において見出されたＢＴＢ／ＰＯＺドメインとＫｅｌｃｈ繰り返し配列を有する新規ポリペプチドをコードする遺伝子と同様にＢＴＢ／ＰＯＺドメインとＫｅｌｃｈ繰り返し配列を有する新規ポリペプチドをコードする遺伝子として、Ｇｉｇａｘｏｎｉｎ、ＥＮＣ−１、　Ｍａｙｖｅｎ及び　ＮＲＰ／Ｂが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　２０００，　２６：３７０−３７４，　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．，　１９９８，　２４２：４７０−４７７，　　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．，　１９９７，１７：３０３８−３０５１，　　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ，　１９９９，　１０：２３６１−２３７５，　　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９９８，　１４１：５５３−５６６）。ＥＮＣ−１はアクチン結合蛋白であり、ニューロン細胞で特異的に発現していること（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７，　１７：　３０３８−３０５１）から、この蛋白質は神経系の運命付けにおいて、更に神経系の発育に関し重要と考えられている。またＥＮＣ−１は神経系腫瘍で発現が低下していることが報告されている（Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．，１９９８，　２４２：　４７０−４７７）。更に、核マトリクス蛋白ＮＲＰ／Ｂは神経系の分化に関連する。例えば、ＮＲＰ／Ｂの強制発現によりＰＣ−１２細胞に神経突起を誘導することができる。また、ＮＲＰ／Ｂは癌抑制遺伝子であるｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ｐ１１０（ＲＢ））の活性型非リン酸化フォームと結合してその活性を制御しているという（Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１９９６，　１４１　：　５５３−５６６　）。Ｇｉｇａｘｏｎｉｎ、Ｍａｙｖｅｎ、ＮＲＰ／Ｂ及びＥＮＣ蛋白質群をコードする遺伝子は、一般に脳・神経系で強く発現していて、アクチンと結合活性があること、脳・神経系の発育、分化に関わっていること、脳腫瘍の形成にも関係があること等が知られている。ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現について調べられたが、特徴的な発現臓器が認められなかった（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，８：１７９−１８７）。本発明のｍｂｇ０２１３３遺伝子は、眼で特に発現量が高いことから、眼の発育、機能保全、眼科領域の老化に関わる病態の解明、あるいは脳・神経系の病態　（例えば老化・痴呆）　解明、それによる予防薬、治療薬、検査薬の開発に有用である。本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる。
【００４５】
このように細胞の増殖や分化に深く関与しているＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列　ドメイン蛋白質は、それ自身も直接疾患原因遺伝子となりうる。たとえば劣勢優性遺伝をする神経変性疾患（Ｇｉａｎｔ　ａｘｏｎａｌ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）　はｇｉｇａｘｏｎｉｎ　と呼ばれるＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列　ドメイン蛋白質の点突然変異によって生じる事が明らかとなっている（Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．　２０００　Ｎｏｖ；２６（３）：３７０−４．）。
これらの知見から、本発明のＢＴＢ／ＰＯＺドメインとｋｅｌｃｈ繰り返し配列　ドメインを持つ蛋白質に関わるＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質については、それらが脳神経系を中心とした細胞、とりわけ眼の細胞の増殖あるいは分化の調節などに関わることが強く示唆される。
【００４６】
（４）ｍＲＮＡレベルでの発現頻度
ｍＲＮＡレベルでのヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子の発現にはあまり特徴的な所見はなかった又（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２００１，　８：１７９−１８７）。そこで、本発明の遺伝子の一つであるマウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスにおける同遺伝子の組織特異的及び発生段階特異的発現を解析した。マウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅して検出するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を５’−ｃａａｔｇａｇｇｃｔａａａｃｇｃｔａｃｃａ−３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−　ｔｇｇｃａｃａｔａｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｃ−３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子の転写産物をＲＴ−ＰＣＲ法で増幅すると、約６０２ｂｐＤＮＡ断片が得られる設計にした。マウス各組織から調製されたｍＲＮＡを材料とし、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により１ｓｔストランドｃＤＮＡ　まで調製が終了しているＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃＤＮＡ　Ｐａｎｅｌｓ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社Ｃａｔ．　Ｎｏ．＃Ｋ１４２３−１，　＃Ｋ１４３０−１）を用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社が示す方法により以下のようにして解析を行った。すなわち、各マウス組織１ｓｔストランドｃＤＮＡと上記プライマーをそれぞれ混合し、各々についてＰＣＲを行い、マウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子の転写産物のうち６０２ｂｐＤＮＡ長のＤＮＡ断片の増幅を図った。ＰＣＲは、ＴａｑポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（宝酒造，　＃ＲＰ００１Ａ）を用い、上述のＤＮＡ混合液を９５°Ｃ（２．５分）で加熱した後、９５°Ｃ（３０秒）／６０°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（３０秒）のサイクルを３０回繰り返して行った。コントロールとしてＣｌｏｎｔｅｃｈ社が提供するＧ３ＰＤＨプライマー（＃５４０６−１）を使用したＧ３ＰＤＨ転写産物由来約９３８ｂｐＤＮＡ断片の増幅も同様にして行った。増幅を終えたＰＣＲ産物を、サイズマーカーとともに２％　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、＃５００７０）を用いて電気泳動で分画し、分画したＰＣＲ産物の量を半定量的に比較した。その結果、調べた組織別あるいは発生過程のｃＤＮＡパネルの内、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子で解析しなかった眼において、マウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子に由来する約６０２ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、濃いバンドとして検出された。また、また脳において約６０２ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、やや強いバンドとして検出された。精巣・肺・脾臓・胸腺等で約６０２ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、弱いバンドとして検出された（図２）。また、発生の各段階については、受精１１日目、１５日目及び受精１７日目の胚で強いバンドとして検出され、受精７日目の胚ではバンドは検出されなかった（図２）。これらの結果から、本発明のＤＮＡの一つであるマウス由来遺伝子はヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子で解析しなかった眼で特異的に発現していること、また脳・精巣での発現も認められたことから、この蛋白質子が眼のみならず脳・神経系の発生・分化のメカニズムに関わっている可能性が高いことが判明した。尚、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子の発現パターン（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２００１，　８：１７９−１８７）と比較すると肺・精巣・脾臓でも発現が認められた。更に、発生段階においては、発生初期では認めず、胎生１１日ころに発現し始め以降持続的に発現していることが判明した。。
尚、同図において、下段のＧ３ＰＤＨはコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現パターンを示す。従って、この蛋白質子が脳の発生・分化や視覚に関連するメカニズムに関わっている可能性が高いといえる。
【００４７】
【発明の効果】
ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子にはその機能を類推するドメイン構造が無く、その機能を推定すること困難で全く未知であった。今回、本発明者はマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ１９２１遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、Ｎ−末端側に新たにＤＮＡ配列が付加されている新規ＤＮＡ配列、すなわちマウスＫＩＡＡ１９２１遺伝子を取得することに成功した。
【００４８】
これまでに記載したことから、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドあるいは本発明の抗体は、癌などの増殖性疾患や先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療上で必要不可欠な役割を果たすと考えられる。また、ＲＴ−ＰＣＲによる各組織及び発生段階での発現のパターン情報は、眼で特に発現量が高く、脳で発現が認められること、及び発生後期での発現が高いことを明らかとし、本発明の遺伝子が特に視覚、及び中枢神経系構築やその機能保全において重要性であること明らかにした。
従って、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、それらがコードするポリペプチドの一部又は全長、該ポリペプチドの一部又は全長に対する抗体、アンチセンスＤＮＡ等は、癌や先天奇形を含めたヒト疾患を治療する為のモデル動物であるマウスを用いた各種治療・予防方法開発において、医薬として使用することが可能である。
【００４９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチドに保存されるＢＴＢ／ＰＯＺ　ドメイン（ａａ：　アミノ酸配列で数字はアミノ酸数、ボックス：上から、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法、またＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によるそれぞれ異なった検索法で同定したＢＴＢ／ＰＯＺ　ドメインを示す。ヒト・マウスともに認められるＫｅｌｃｈ　繰り返し配列に関しても合わせて提示した。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍｂｇ０２１３３（マウスＫＩＡＡ１９２１）遺伝子のマウス各組織における発現強度の比較。上段はｍｂｇ０２１３３遺伝子の発現強度、下段はコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現強度を、アガロース電気泳動で分画した後のエチジウムブロミド染色パターンについての写真で示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel DNA having a BTB / POZ domain and a kelch repeat sequence, which is strongly expressed in the eye, a gene containing the DNA, a novel polypeptide encoded by the DNA, and a recombinant containing the polypeptide. The present invention relates to proteins, antibodies against novel polypeptides, and the like.
[0002]
[Prior art]
The recent success of the human genome and cDNA projects has led to the identification or estimation of many human disease-related genes. However, on the other hand, research using human genes is limited due to ethical problems, and new research directions are being explored. From such a viewpoint, identification of a homologous gene in a model organism is considered to be a very important step in terms of advancing research. In particular, mice are the most studied model organisms, and relatively large amounts of genomic information and information on mutants are accumulated, but the accumulated genomic information is not yet sufficient. On the other hand, as a means for analyzing a gene expressed in a living body, a study of randomly analyzing a cDNA sequence has been conducted, and a fragment sequence of the obtained cDNA has been registered and published in a database as an Expressed Sequence Tag (EST). Was. However, many ESTs have only short base sequence information such as 100 to 500 bases in length, and it is difficult to estimate their functions.
[0003]
In the brain and nervous system, physiological functions are regulated under the regulation by many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In addition, regulation of function involves the proliferation or activation of the specific cell responsible for the function. Therefore, obtaining a novel gene that is strongly expressed in the eye or brain / nervous system and obtaining a protein that regulates complex functions in the eye or brain / nerve system is useful for drug development. is there. Further, in order to efficiently screen for agonists and antagonists to the obtained protein and to develop a drug, the function of the gene of the protein expressed in the living body is estimated from homology search, and based on the information, It was necessary to express the protein in an appropriate expression system to obtain a recombinant protein, and further to obtain an antibody that specifically binds to the protein.
[0004]
The human KIAA1921 gene (DNA Research, 2001, 8: 179-187) derived from the human brain was reported in the long-chain human cDNA project, but its function was unknown. The human KIAA1921 gene is present on chromosome 2p23.3, and multiple SNPs of the human KIAA1921 gene have been reported (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=114818). Considering that most human diseases are not caused by mere gene deletion but by partial changes in protein function or activity due to amino acid substitution, human KIAA1921 gene is a brain tumor (Exp) 242 (2), 470-377 (1998)) and Giant axonal neuropathy (GAN) (Eur J Hum Genet 2000 Jul; 8 (7): 527-34). It is considered likely to be involved was considered. However, the protein encoded by the human KIAA1921 gene did not have any characteristic domains other than the kelch repeat sequence and was insufficient as genetic information, and the function of the human KIAA1921 gene could not be estimated.
[0005]
[Problems to be solved by the present invention]
Conventionally, the human KIAA1921 gene has been obtained by the human long-chain cDNA project, but the gene information is not complete and its function is unknown. On the other hand, obtaining a novel gene expressed in the eye or the brain or nervous system and obtaining the gene, a protein encoded by the gene, or an antibody that specifically binds to the protein requires that the protein be contained in another cell in the cell. It is important for screening a compound that inhibits binding to a protein or a compound that affects signal transduction and the like.
[0006]
Accordingly, obtaining a novel gene related to the human KIAA1921 gene, obtaining a novel domain, obtaining a tissue-specific expression pattern of the gene, and obtaining information on the function of the protein encoded by the novel gene can be performed by obtaining the protein This is a very important means when searching for specific binding proteins, agonists and antagonists. Even if a specific binding protein of the above protein is not found, an agonist or antagonist for the protein is produced by analyzing the physiological action of the protein from an inactivation experiment of the protein (for example, producing a knockout animal). It is possible to use a specific binding protein, agonist, antagonist or the like for the protein as a preventive or therapeutic agent or diagnostic agent for a disease associated with dysfunction of a patient with a brain or nervous system disease. . In some cases, a decrease or increase in the function of the protein in a living body may cause a disease in the brain or nervous system. In this case, in addition to administration of an antagonist or agonist to the protein, administration of the protein to the brain or nervous system, administration of an antisense nucleic acid to a gene encoding the protein, or gene therapy using the gene It can also be applied to In this case, the nucleotide sequence of the protein is information necessary for examining the presence or absence of a gene deletion or mutation in a patient with a cerebral or nervous system disease, and the gene encoding the protein causes dysfunction of the protein. It can be applied to preventive or therapeutic drugs and diagnostic drugs for diseases involved.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have cloned a gene (DNA) exhibiting high homology to the human KIAA1921 gene from a mouse brain-derived cDNA library, and have no human KIAA1921 gene on the N-terminal side of the gene. It was also discovered that a completely new sequence was added, and that the gene had a BTB / POZ domain and a kelch repeat sequence within the sequence of the gene. To complete the present invention.
[0008]
That is, as a first aspect, the present invention provides a DNA comprising a base sequence encoding the following polypeptide (a): (a) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (E.g., a polypeptide having at least one of the following BTB / POZ domains or kelch repeat sequences) or a whole; or (b) a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The present invention relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acids have been deleted, substituted or added, and having substantially the same biological activity as part or all of the polypeptide of (a).
As a second embodiment of the present invention, in the following DNA (a): (a) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (base pair 1 of SEQ ID NO: 2) in a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 DNAs encoding a part (for example, those having at least one of the following BTB / POZ domains or kelch repeat sequences) or all of them; (b) complementary to the DNA of (a) (C) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence; or (c) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA of (a), The present invention relates to a DNA encoding a protein having substantially the same biological activity as part or all of a polypeptide. The above-mentioned DNAs according to the first and second aspects of the present invention are collectively referred to as “DNA of the present invention” hereinafter. The DNA of the present invention encodes a novel polypeptide. The present invention also relates to a gene derived from a mammal containing the DNA, a gene derived from a rodent in which the mammal is a rodent, particularly a mouse gene in which the rodent is a mouse. In particular, the mouse gene is also referred to as “mouse KIAA1921 gene”.
Furthermore, the present invention relates to a polypeptide encoded by the DNA or gene of the present invention (hereinafter, also referred to as “polypeptide of the present invention”), for example, a set produced by a host cell into which the DNA or gene of the present invention has been introduced. It relates to a polypeptide that is a recombinant protein (hereinafter, also referred to as “KIAA1921 protein”).
In addition, the present invention provides a recombinant vector containing the DNA or gene of the present invention, and an antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof. According to.
[0009]
In addition, the expression level of the protein is changed by using the DNA of the present invention, a gene containing the DNA, a novel polypeptide encoded by the DNA, a recombinant protein containing the polypeptide, and an antibody against the polypeptide. Provided are a compound, a method for screening a compound (antagonist, agonist) that changes the binding property to a protein that binds to the protein, a screening kit, the screening method, and the like. Furthermore, a method of screening for a substance that specifically binds to the polypeptide of the present invention, a partial peptide thereof, or a recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof, and a screening kit, etc. Also provide.
[0010]
Further, the present invention provides a DNA of the present invention, a recombinant vector or an expression vector containing the DNA of the present invention, a transformant carrying the vector, culturing the transformant, and a portion of the polypeptide of the present invention. Alternatively, a method for producing a polypeptide of the present invention or a recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof, comprising producing and accumulating a recombinant protein containing the full-length polypeptide, and collecting the same, and The present invention provides a recombinant protein containing a part of the polypeptide of the present invention or a full-length polypeptide or a salt thereof. Further, the present invention provides a medicament comprising the DNA of the present invention, a polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a nucleotide sequence substantially complementary to a DNA encoding a recombinant protein containing the polypeptide. Provided are a medicament containing an antisense nucleotide or a medicament containing them, a polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a recombinant protein containing the polypeptide.
Furthermore, the present invention comprehensively prepares the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide, or an antibody against the DNA or gene of the present invention, and accumulates them. The present invention also relates to a so-called DNA chip (array) and protein chip obtained by the above method.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The DNA of the present invention was identified by isolating it as a cDNA fragment from a cDNA library prepared by the present inventors using mRNA derived from mouse brain collected at Kazusa DNA Research Institute as a starting material, and then determining and identifying the nucleotide sequence. Things. That is, specifically, about 45,000 recombinants were selected from a mouse brain-derived cDNA library prepared according to the method of Ohara et al. (DNA Research, 1997, 4: 53-59). Next, about 8,000 3'-terminal DNA sequences were determined from these clones, and a clone having high homology to the human KIAA1921 gene was selected from among them, and the entire nucleotide sequence was determined. Next, a homology search was performed using a DNA analysis program (GCG, Fasta & Blast) based on the entire base sequence thus obtained. As a result, when the amino acid sequence encoded by the human KIAA1921 gene was compared with the 516 amino acids from the 489th to 1,004th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the significant homology was about 98.6% at the amino acid level. A clone having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 was obtained (clone name: mbg02133).
[0012]
The amino acid sequence of the polypeptide encoded by mbg02133 (the polypeptide of the present invention) is 1,004 amino acids, and 545 amino acids of the amino acid sequence of the protein encoded by the human KIAA1921 gene (DNA Research, 2001, 8 ( 4), 179-187), the N-terminal side was longer. The amino acid sequence of the obtained "polypeptide of the present invention" was subjected to homology search as described in the following Examples. As a result, the "polypeptide of the present invention" showed that the polypeptide encoded by the human KIAA1921 gene In comparison, it was found that 488 amino acid sequences at positions 1 to 488 at the N-terminal side were newly added. A homology search was performed for the newly added 488 amino acid sequences at the N-terminal side using a public database, and as a result, NCBI-GenBank Accession No. Homology to the amino acid sequence reported in BC013982, but that the amino acid sequence at the N-terminal side of the polypeptide of the present invention at the 1-310th position is completely novel compared with that sequence. There was found.
The plasmid containing the DNA of the present invention having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (plasmid designation: mbg02133) was manufactured by AIST, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture Deposited with the Patent Organism Depositary on July 16, 2002, and given the accession number FERM P-18934.
[0013]
Polypeptide encoded by the human KIAA1921 gene having a sequence of 6,385 bp (DNA Research, 2001, 8: 179-187, http://www.kazusa.or.jp/huge/gfpage/KIAA1921/) Has a length of 545 amino acids. By studying the human KIAA1921 gene homologue in detail, there is a possibility that the possibility that a polypeptide is further encoded on the N-terminal side may be verified. The length of the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA of the present invention is 1,004 amino acids. However, by further studying the homologue to the DNA of the present invention, the length of the polypeptide was further extended to the N-terminal side. You may find that the polypeptide is encoded.
[0014]
It should be noted that those skilled in the art will recognize that a suitable primer (for example, base pairs 61 to 61 of SEQ ID NO: 2) may be added to the 5 ′ side of the clone based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 disclosed for the first time by this specification. An 80th 5′-GGAGAGGCAGGAACGAGAGGA-3 sequence (5′-TCCTCTCGTTCCTGCTCTCC-3 ′) was prepared, and the primer was hybridized with a commercially available mRNA derived from mammalian brain, followed by a reverse reaction. By doing so, a new cDNA fragment containing a region on the upstream side (5 ′ side of the gene) of the DNA of the present invention can be specifically synthesized. After inserting a new cDNA fragment containing the synthesized 5'-side region into a plasmid, a mammalian KIAA1921 containing the DNA of the present invention is subjected to homologous cloning such as colony hybridization using a part of SEQ ID NO: 2 as a probe. It is possible to prepare the entire region of the gene. Alternatively, a nucleotide sequence in which the 5 'side of the gene is further extended can be obtained by another method, for example, by using the following method. That is, when the DNA of the present invention is used as a probe, the 5 ′ terminal region of the KIAA1921 gene derived from various mammals including humans can be prepared by homologous cloning such as colony hybridization. Furthermore, as far as the DNA sequence of the present invention and the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention are disclosed, those skilled in the art can use the information to obtain the 5 'terminal region of the KIAA1921 gene derived from various mammals including humans. Can be easily obtained. Also, by using a PCR method such as RACE with sufficient care not to cause artificial errors in the short fragments and the obtained sequence, the entire KIAA1921 gene derived from various mammals including humans can be obtained. Regions can be prepared.
[0015]
The DNA of the present invention may be any DNA as long as it comprises a base sequence encoding the polypeptide of the present invention described above. Further, cDNA identified or isolated from a cDNA library derived from cells or tissues such as brain, or other tissues, for example, heart, lung, liver, spleen, kidney, testis, etc., or synthetic DNA May be any of The vector used for the library construction may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, a total RNA fraction or an mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues may be used and directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”).
[0016]
An amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 means that the degree of homology with the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 60% or more on average, preferably about 60% or more. An amino acid sequence that is 80% or more, more preferably about 90% or more. Accordingly, a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention has, for example, the above-mentioned homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a polypeptide having substantially the same biological activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Here, “substantially the same quality” means that their activities are the same in nature. The polypeptide of the present invention includes, for example, a part (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid of SEQ ID NO: 1 has been deleted, substituted or added, or an amino acid sequence obtained by combining them, and having substantially the same biological activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is also included.
[0017]
Furthermore, the DNA of the present invention may be, for example, a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Any DNA that encodes a polypeptide (protein) that hybridizes under gentle conditions and preferably has the same biological activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Good. Under such conditions, the DNA capable of hybridizing with the DNA consisting of the nucleotide sequence complementary to the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes, for example, the DNA DNA having a base sequence having a degree of homology with the entire base sequence of about 60% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more on the average. . Hybridization was performed using Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001), or a method known in the art or a method analogous thereto. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Here, “stringent conditions” means, for example, when a probe is labeled with DIG DNA Labeling (Cat No. 1175033 manufactured by Boehringer Mannheim), a DIG Easy Hyb solution at 32 ° C. (Cat manufactured by Boehringer Mannheim) No. 1603558), and washing the membrane in a 0.1 × SSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) at 40 ° C. (1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M citric acid) (Sodium is used for hybridization) to the human DNA probe of the present invention by Southern blot hybridization.
[0018]
As a means for cloning the DNA of the present invention, the DNA of the present invention is amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having an appropriate nucleotide sequence such as a portion of the polypeptide of the present invention, or the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector. Can be selected by hybridization with a DNA fragment coding for a part or the entire region of the polypeptide or labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods are described, for example, in Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. The DNA base sequence can be converted using a known kit, for example, a SuperScript II reverse transcriptase kit (Gibco BRL) or the like, according to a known method such as the Gapped Duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto. it can. The DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
[0019]
The expression vector for the polypeptide of the present invention can be prepared according to a method known in the art. For example, it is produced by (1) cutting out a DNA fragment containing the DNA of the present invention or a gene derived from a mammal containing the DNA of the present invention, and (2) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. can do. Examples of expression vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC118), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. Or an expression vector using a sequence derived from an animal virus such as SV40, CMV virus, retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, bovine papilloma virus, and the like. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when the host is Escherichia coli, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, and the like are used. When the host is Bacillus subtilis, the host is yeast, such as the SPO1, SPO2, and penP promoters. In some cases, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When animal cells are used as hosts, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, HSP promoter, metallothionein promoter and the like can be mentioned.
[0020]
In addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like known in the art may be added to the expression vector, if desired. be able to. Further, if necessary, the protein encoded by the DNA of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein (eg, glutathione S-transferase, histidine tag, calmodulin binding protein, protein A, etc.). is there. Such a fusion protein can be cleaved using an appropriate protease and separated into respective proteins.
[0021]
Examples of the host cell include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like. Specific examples of Escherichia bacteria include DH1 derived from Escherichia coli K12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 9). (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), and HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), or Escherichia coli (Escher). Used. As the Bacillus bacterium, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used. Examples of yeasts include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizoscharomyces pombi, Nippon Caspica, Nippon Casp. . Examples of animal cells include monkey kidney cell-derived COS-1, COS-7, Vero cells, Chinese hamster CHO cells (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter, CHO (dhfr-)). Cells, mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, human Hela cells, human myeloma cells, and the like.
[0022]
Transformation of these host cells can be performed according to methods known in the art. For example, the following documents can be referred to. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978); Cell Engineering Annex 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha); and Virology, 52, 456 (1973).
[0023]
The thus obtained transformant transformed with the expression vector containing the mammalian gene containing the DNA of the present invention can be cultured according to a method known in the art. For example, when the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added. When culturing a transformant in which the host is yeast, culturing is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours using a medium adjusted to a pH of about 5 to 8, and if necessary, aeration and stirring may be performed. Can also be added. When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours using a medium whose pH is adjusted to about 6 to 8, and if necessary, aeration and stirring may be performed. Can also be added.
[0024]
In order to separate and purify the polypeptide of the present invention from the above culture, for example, after culturing, cells or cells are collected by a known method, suspended in a suitable buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freezing. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a crude protein extract is obtained by centrifugation or filtration. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. ^TM And the like. When the protein is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the cells or cells are separated from the supernatant by a known method, and the supernatant is collected. The protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. The polypeptide (protein) of the present invention thus obtained can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto. Conversely, when the polypeptide (protein) is obtained as a salt, the polypeptide (protein) is released by a known method or a method analogous thereto. Can be converted to body or other salts. Further, the protein produced by the recombinant, before or after purification, methionine aminopeptidase to remove the N-terminal methionine, myristoyl transfer of the N-terminal amino acid using myristoyltransferase, The N-terminal amino acid can be acetylated using transferase, or the amino acid can be arbitrarily modified using other modifying enzymes. Also, the C-terminal amino acid can be modified by the action of a processing carboxyl peptidase that modifies the C-terminal, a C-terminal amidating enzyme, or the like. Furthermore, the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate proteolytic enzyme such as trypsin, chymotrypsin, Factor Xa, thrombin, or KEX2 protease.
When produced as a fusion protein, unnecessary polypeptide portions can be removed using an appropriate proteolytic enzyme.
The presence of the polypeptide (protein) of the present invention or a salt thereof can be measured by various binding assays, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
[0025]
In the polypeptide (protein) of the present invention, the C-terminal is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminal is an amide (—CONH). ₂ ) Or an ester (—COOR). Here, as R in the ester, for example, a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl, α A C6-12 aralkyl group such as a C6-12 aryl group such as -naphthyl, for example, a phenyl-C1-2 alkyl group such as benzyl or phenethyl or an α-naphthyl-C1-2 alkyl group such as α-naphthylmethyl; Pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an ester for oral use, is used.
[0026]
When the polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein) has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the present invention. Contained in proteins. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used. Furthermore, the protein of the present invention includes a protein in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group and an acetyl group), and which is cleaved in vivo. N-terminal glutamic acid residue produced by pyroglutamination, on the side chain of an amino acid in the molecule, for example, OH, COOH, NH ₂ , SH, and the like are protected with an appropriate protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group and an acetyl group), and a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
[0027]
The peptide comprising a part of the polypeptide of the present invention is a partial peptide of the above-described polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein), as long as it has substantially the same activity. It may be. For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the polypeptide (protein) of the present invention. For example, a peptide having substantially the same biological activity as the recombinant protein of the present invention is used. Specific examples of such a partial peptide include those having at least one of a BTB / POZ domain and a kelch repeat sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—) at the C-terminus, but has an amide (—CONH) at the C-terminus as in the protein of the present invention described above. ₂ ) Or an ester (—COOR). Furthermore, the partial peptide of the present invention has a structure in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and the N-terminal side is cleaved in vivo as in the case of the protein of the present invention. Glutamyl groups are pyroglutamine-oxidized, those in which the substituents on the side chains of the amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, and those in which sugar chains are bonded, such as so-called glycopeptides, are also included. .
[0028]
As a salt of the polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein) or a peptide composed of a part thereof, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
[0029]
The polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein), a peptide composed of a part thereof, a salt thereof, or an amide thereof can also be prepared by a chemical synthesis method known in the art. For example, using a commercially available resin for protein synthesis, an amino acid appropriately protected with an α-amino group and a side chain functional group is subjected to various condensation methods known per se in the art according to the sequence of the target protein. And condensation on a resin. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin and, at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein, its partial peptide or an amide thereof. Regarding the condensation of the protected amino acids described above, for example, protein synthesis represented by carbodiimides such as DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide is useful. Various activating reagents that can be used can be used. For activation by these, the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is previously activated as an acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester as a control. After performing, it can be added to the resin.
[0030]
Solvents used for activation of protected amino acids and condensation with resins include acid amides, halogenated hydrocarbons, alcohols, sulfoxides, and ethers, which can be used in the art for protein condensation reactions. It can be appropriately selected from known solvents. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about −20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole so that the subsequent reaction is not affected. As a protecting group such as each amino group, carboxyl group, and serine hydroxyl group of the raw material, a group usually used in the art can be used. The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
[0031]
The peptide comprising a part of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se in the art, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate protease. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (1) to (3).
(1) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments on Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(2) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Biochemistry Experiments Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(3) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten.
Alternatively, a peptide consisting of a part can be obtained by, for example, using a known peptide synthesizer or the like to obtain a sequence of dozens of residues from the C-terminus or any part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 at any position. Can be used for synthesis. Further, such a partial peptide may be produced as a recombinant protein using the above-mentioned gene recombination technique.
The partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a method known per se, for example, a combination of solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained in a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
[0032]
Antibodies that specifically bind to the polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein), a peptide composed of a part thereof, or a salt thereof are polyclonal antibodies, as long as they can specifically recognize them. Any of monoclonal antibodies may be used. The antibody against the polypeptide (protein) of the present invention, its partial peptide or a salt thereof can be prepared by using the polypeptide (protein) or its partial peptide of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known to those skilled in the art. Can be manufactured.
For example, in the case of a polyclonal antibody, the above antigen alone or bound to an appropriate carrier such as cellulose, polymerized amino acid, albumin and the like in the presence or absence of an adjuvant, for example, rat, rabbit, sheep, goat And can be easily obtained by inducing immunity to a suitable animal such as a horse. Polyclonal antibodies can be recovered and purified from the serum of the immunized animal by various known methods.
On the other hand, in order to produce a monoclonal antibody, for example, antibody-producing cells (for example, spleen or lymph node-derived) are collected from the above immunized animal, and a known immortalized proliferating cell (for example, bone marrow such as P3X63Ag8 strain) is used. (Hymanoma cell line) to produce a hybridoma. This is further cloned, a clone of a hybridoma producing an antibody that specifically recognizes the polypeptide of the present invention is selected, and the monoclonal antibody is easily obtained by recovering and purifying a monoclonal antibody from a culture solution of the hybridoma. Can be done.
Furthermore, various chimeric antibodies, such as humanized antibodies, containing antigenic determinants and the like of the thus obtained antibodies can be easily produced by various genetic engineering techniques known to those skilled in the art.
The antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide (protein) of the present invention and the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying these, detection of the polypeptide (protein) of the present invention in each fraction at the time of purification, and behavior of the polypeptide (protein) of the present invention in the test cells. Can be used for analysis and the like.
[0033]
Further, the antibody of the present invention can be used for quantification of the polypeptide (protein) of the present invention in a test solution by a known method, in particular, quantification by a sandwich immunoassay using a monoclonal antibody, and detection by tissue staining and the like. Can be used for Thereby, for example, a disease involving the polypeptide (protein) of the present invention or the like can be diagnosed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab' or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution. Any method may be used as long as it is a method for measuring the amount of γ by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but it is preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity. As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like known in the art can be used.
[0034]
For details of general technical means relating to these measurement / detection methods, a review, a textbook, and the like can be referred to. For example, edited by Hiro Irie, “Sequence Radio Immunoassay” (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical Publishing, published in 1987), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. . 70 (Immunochemical Technologies (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), ibid., Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all published by Academic Press) can be referred to.
[0035]
The antisense DNA having a base sequence substantially complementary to the DNA encoding the polypeptide (protein) of the present invention or a peptide comprising a part thereof may be a base sequence substantially complementary to the base sequence of the DNA. Any antisense DNA may be used as long as it has the effect of suppressing the expression of the DNA. The substantially complementary nucleotide sequence is, for example, a nucleotide sequence having about 95% or more, most preferably 100% homology with the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention. Is mentioned. Nucleic acid sequences (modified RNA or DNA) having the same action as these antisense DNAs are also included in the antisense DNA of the present invention. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
[0036]
Furthermore, the polypeptides (proteins) and the like of the present invention are useful as reagents for screening compounds that inhibit the activity of these substances or salts thereof. That is, the present invention is characterized by using the polypeptide (protein) of the present invention, a peptide consisting of a part thereof, or a salt thereof, wherein the compound inhibits the activity of the substance or a salt thereof (hereinafter referred to as “inhibition”). Agent), and a screening kit therefor. The compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and a compound that inhibits a biological activity such as the polypeptide (protein) of the present invention. It is. The compound or a salt thereof may directly inhibit the activity of the protein of the present invention, or may indirectly inhibit the expression of the polypeptide (protein) of the present invention, etc. (Protein) and the like may be inhibited. As the salt of the compound, for example, a pharmaceutically acceptable salt or the like is used. Examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. Compounds that inhibit biological activities such as the polypeptides (proteins) of the present invention may also be used as medicaments such as therapeutic / prophylactic agents for the above-mentioned various diseases.
[0037]
Using the DNA of the present invention and a gene derived from a mammal containing the DNA as a probe to detect an abnormality in DNA or mRNA (gene abnormality) encoding the polypeptide of the present invention or a peptide comprising a part thereof in humans Therefore, it is useful as a diagnostic agent for a gene, for example, for damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA. The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States). of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)). Furthermore, if the KIAA1921 gene is abnormal or defective or its expression level is reduced, for patients who cannot exert normal functions in vivo, (1) retroviral vectors, The DNA of the present invention or a gene derived from a mammal is introduced and expressed in the patient by gene therapy using an appropriate vector such as an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector as a vehicle, or By injecting the polypeptide (protein) or the like of the present invention into the patient, it is considered that the function of the protein or the like of the present invention can be exhibited in the patient. In the former case, the DNA of the present invention or a gene derived from a mammal is used as an appropriate vector as a vehicle, and the DNA in a form attached to the vector is used alone or together with an auxiliary for promoting uptake, a gene gun or a hydrogel. It is also possible to administer by catheter, such as a catheter.
[0038]
In the present specification and drawings, when bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations, the abbreviations are based on abbreviations by IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature or abbreviations commonly used in the art. Unless otherwise specified, it indicates the L-form.
[0039]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence (amino acid number: 1,004) of the polypeptide of the present invention.
[SEQ ID NO: 2] This shows the entire base sequence (5,070 base pairs) of clone mbg02133, including the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0040]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. In addition, various genetic operations in Examples are described in Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001).
[0041]
(1) Construction of cDNA library derived from mouse brain
Oligonucleotide with attB1 site: 5′-FgcGCACCACTTTTGTACAAGAAAGCTGGGCGGCCGC (T) ₁₈ -3 ′ (F, g and c represent fluorescein group, phosphorothioate-modified G and phosphorothioate-modified C residues, respectively) as primers and using mouse adult (BALB / 8-week-old male BALB / c mouse) Double-stranded cDNA was synthesized using SuperScript II reverse transcriptase kit (manufactured by Invitrogen) using mRNA derived from brain as a template. An adapter having an attB1 site was ligated to the cDNA. Thereafter, the size of the cDNA was fractionated into 1 kb-2 kb, 2 kb-3 kb, 3 kb-5 kb, 5 kb-7 kb, 7 kb-11 kb and 11 kb-13 kb by agarose gel. These were transferred to a reduced-size attP pSPORT-1 entry vector (manufactured by Invitrogen) by BP reaction, and then introduced into Escherichia coli ElectroMax DH10B (manufactured by Invitrogen) by electroporation. 10 appeared on the plate ⁶ More than one transformant was collected and cultured in a liquid medium at 37 ° C for 2-3 hours to prepare a plasmid. After size fractionation in the form of a supercoiled plasmid, the cDNA was transferred to an attR pBC destination vector (Invitrogen) by LR reaction. After the plasmid was purified, it was introduced into the DH10B strain by an electroporation method, and the above-described fractionation operation was repeated 2-3 times until each fraction became an expected size. Finally, the plasmid was introduced into the DH10B strain for each fraction. The cloning system using a homologous recombination reaction in a test tube used here is based on the method of Ohara et al. (Nucleic Acids Res., 29, e22 (2001) and DNA Research Vol. 9, 47-57 (2002)). Followed.
Next, the terminal DNA sequences of about 8,000 clones contained in the 5 kb to 7 kb fraction were determined. From these, the entire nucleotide sequence of the cDNA of the clone having high homology to human KIAA1921 was determined. For sequencing, a DNA sequencer (ABI PRISM3700) manufactured by Applied Biosystems and a reaction kit manufactured by Applied Biosystems were used. Most sequences were determined from shotgun clones using the dye terminator method. For some base sequences, oligonucleotides were synthesized based on the determined base sequences and determined by the primer walking method.
[0042]
(2) Determination of a clone containing the DNA of the present invention by homology search
Next, a homology search was performed using a DNA analysis program (Fasta & Blast) based on the entire nucleotide sequence thus obtained. As a result, a candidate clone mbg02133 showing high homology with the human KIAA1921 gene in a public database was obtained. Was found. Furthermore, using another DNA analysis program (BESTFIT), the clone mbg02133 was compared with the amino acid sequence and the base sequence of human KIAA1921, and the amino acid sequence of the human KIAA1921 gene and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 were compared. Among them, 516 amino acids from the 489th to the 1,004th show about 98.6% homology at the amino acid level. The homology of the amino acid sequence reported in BC013982 to the 695 amino acids 310 to 1,004 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was compared. As a result, about 98.3% homology was found at the amino acid level. Indicated.
Also, at the nucleotide sequence level, the nucleotide sequence from the 2,888th to 4,612th nucleotides encoded by the human KIAA1921 gene and the 1,724th to 3,188th nucleotides from the 1,465th to 3,188th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 When the homology was compared for the length, about 89.9% homology was recognized. Furthermore, the nucleotide sequence from the 5th to the 1005th nucleotide in the nucleotide sequence (total 1,006 nucleotides) of the ORF 704 gene described in WO 2000/58473, and the 1,493 nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 When the homology was compared for the 2,001-th, 1,001 base length, about 90.3% homology was recognized. NCBI-GenBank Accession No. Among the nucleotide sequences reported in BC013982, a sequence having a length of 2,264 nucleotides from the 35th to 2,298th nucleotides, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, which is 2,263 nucleotides from the 926th to 3,188th nucleotides When the homology was compared with respect to the base length, about 90.5% homology was recognized.
[0043]
(3) Domain search
Furthermore, regarding the DNA of the present invention, pftools (Bairoch A, Bucher P, Hofmann K, Nucleic Acids Res. 1997 Jan 1:25 (1): 217-21m), which is a protein analysis program for searching for PROSITE database, and Pfa A protein analysis program hmmer 2.1 for searching database (Sonhammer, ELL, Eddy, SR, Birney, E., Bateman, A., and Durbin, R., Nucleic Acids 981 Acids 98. 26, 320-322) for domain search (Suyama et. Al. 1999 Nucleic Acids Res. 27: 338-339). The DNA of the present invention has 5,070 base pairs and encodes a protein consisting of 1,004 amino acids. At present, the BTB (Broad complex, traptrack, bric-a-brac) / POZ (Poxvirus and Zinc Finger) domain and the C-terminus are located almost at the center of the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA of the present invention which is currently obtained. The portion was found to have six kelch repeats (FIG. 1). More specifically, according to the HMMPfam search method, the 448th to 560th amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are obtained. According to the HMMSmart search method, the 458th amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is obtained. According to the ProfileScan search method, the BTB / POZ domain was recognized at positions 458 to 530 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, according to the HMMPfam search method, six kelch repeat sequences were found from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 to positions 458 to 560. Further, Mol. Biol. The PPPPPPX sequence characteristic of putative ligand for SH3 domain observed about 40 amino acid groups upstream of the BTB / POZ domain of the Mayven protein shown in of the Cell, 1999, 10: 2361-2375 is the sequence number of the present invention: 1 was found as a PPPPPA sequence at amino acids 492-497.
The function of a protein having a BTB / POZ domain is reviewed in a review such as Mol Cell Biol 2001 Jun; 21 (11): 3609-15, or protein nucleic acid enzyme 1999 Sep; 44 (12 Suppl): 1771-9. . According to them, the BTB / POZ domain is characteristic of C2H2-type transcription factor and Shaw-type potassium channel, and the cis-regulation at a distant position on chromosomal DNA with respect to the function related to the BTB / POZ domain. It is said to be a new type of transcription factor that brings sequences closer in space, an architectural transcription factor. The BTB / POZ domain is also called a BTB domain or a POZ domain, and is a domain consisting of about 120 amino acids and showing an interaction between proteins. In the case of humans, about 2/3 of proteins having a POZ domain have a structure in which about Zn finger-type DNA binding domains are combined, and about 1/3 are proteins that bind to actin having a kelch domain. (Protein nucleic acid enzyme, 1999, 44 (12): 1771-9). A corepressor group such as SMRT (silencing mediator of retinoic and thyroid hormone receptor) was identified as a binding factor for a protein having a BTB / POZ domain and a kelch repeat sequence domain, and a complex of the corepressor group and histone deacetylase was identified. It has also been found to form (Nature, 1998, 391: 811-814, Nature, 1998, 391: 815-818).
From this fact, it is considered that a protein having a BTB / POZ domain and a kelch repeat sequence domain is deeply involved in the function of gene expression via a chromatin structure. In this case, the BTB / POZ domain and the kelch repeat sequence domain are involved in the formation of a nuclear structure and a chromatin structure and the regulation of the function thereof, and the domain has been found in factors involved in carcinogenesis. Thus, it is assumed to be involved in the mechanism of canceration (Mol Cell Biol 2001 Jun; 21 (11): 3609-15, protein nucleic acid enzyme, 1999, 44 (No. 12): 1771-9).
[0044]
As a gene encoding a novel polypeptide having a BTB / POZ domain and a Kelch repeat sequence, as well as a gene encoding a novel polypeptide having a BTB / POZ domain and a Kelch repeat sequence found in the mouse KIAA1921 gene of the present invention, Gigaxonin, ENC-1, Mayven and NRP / B have been reported (Nature Genetics, 2000, 26: 370-374, Experimental Cell Res., 1998, 242: 470-474, J. Neuroscience., 19:19). 3038-3051, Mol. Biol. Of the Cell, 1999, 10: 2361-2375, J. Cell Biology, 1998, 141: 553-566). Since ENC-1 is an actin-binding protein and is specifically expressed in neuronal cells (J. Neuroscience. 1997, 17: 3038-3051), this protein is involved in the fate of the nervous system and also in the nervous system. It is considered important for development. It has been reported that the expression of ENC-1 is reduced in nervous system tumors (Exp. Cell Res., 1998, 242: 470-478). Furthermore, the nuclear matrix protein NRP / B is involved in the differentiation of the nervous system. For example, neurites can be induced in PC-12 cells by forced expression of NRP / B. Also, NRP / B is said to bind to the activated non-phosphorylated form of the tumor suppressor gene retinoblastoma protein (p110 (RB)) and regulate its activity (J. Cell Biol., 1996, 141: 553). -566). Genes encoding Gigaxonin, Mayven, NRP / B and ENC proteins are generally strongly expressed in the brain and nervous system and have an actin-binding activity, and are involved in the development and differentiation of the brain and nervous system. It is also known that it is related to the formation of a brain tumor. When the expression of mRNA level of the human KIAA1921 gene was examined, no characteristic expression organ was observed (DNA Research, 2001, 8: 179-187). Since the expression level of the mbg02133 gene of the present invention is particularly high in the eye, elucidation of pathological conditions related to eye development, functional maintenance, and aging in the ophthalmic field, or elucidation of pathological conditions of the brain and nervous system (eg, aging and dementia), Is useful for the development of prophylactic, therapeutic and testing agents. By using the recombinant protein of the present invention or a recombinant expressing the recombinant protein, it can be used for screening of agonists and antagonists or for drug design research.
[0045]
As described above, the BTB / POZ domain and the kelch repeat sequence domain protein which are deeply involved in cell growth and differentiation can themselves be directly disease-causing genes. For example, it has been revealed that a neurodegenerative disease having a dominant dominant inheritance (Giant axonal neuropathy) is caused by a point mutation in a BTB / POZ domain called gigaxonin and a kelch repeat sequence domain protein (Nat Genet. 2000 Nov; 26 (Nat Genet. 2000 Nov; 26)). 3): 370-4.).
From these findings, regarding the DNA relating to the protein having the BTB / POZ domain and the kelch repeat sequence domain of the present invention, the gene containing the DNA, the polypeptide encoded by the DNA, and the recombinant protein containing the polypeptide, It is strongly suggested that they are involved in the regulation of proliferation or differentiation of cells mainly in the cerebral nervous system, especially cells of the eye.
[0046]
(4) Expression frequency at mRNA level
There were also few characteristic findings on the expression of the human KIAA1921 gene at the mRNA level (DNA Research, 2001, 8: 179-187). Therefore, for the mouse KIAA1921 gene, which is one of the genes of the present invention, the tissue-specific and developmental stage-specific expression of the mouse KIAA1921 gene was analyzed by RT-PCR. Forward primers and reverse primers necessary for amplifying and detecting the transcript of the mouse KIAA1921 gene by PCR were synthesized using a commercially available automatic DNA synthesizer. The sequence of the forward primer was 5'-caatgaggctaaaacgcaccacca-3 '(SEQ ID NO: 3), the sequence of the reverse primer was 5'-tggcatataggactggaggac-3' (SEQ ID NO: 4), and the primers of mouse KIAA1921 gene were used. The design was such that an approximately 602 bp DNA fragment was obtained when the transcript was amplified by the RT-PCR method. Using the mRNA prepared from each mouse tissue as a material, Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech Cat. No. # K1423-1, manufactured by Clontech) which has been prepared by reverse transcriptase (RT) up to the first strand cDNA. Using # K1430-1), analysis was performed as follows by the method shown by Clontech. That is, the first strand cDNA of each mouse tissue and the above-mentioned primers were mixed respectively, and PCR was performed for each of them to amplify a DNA fragment of 602 bp DNA length in the transcript of the mouse KIAA1921 gene. PCR was performed by using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo, # RP001A) as a Taq polymerase, heating the above DNA mixture at 95 ° C (2.5 minutes), and then heating at 95 ° C (30 seconds) / 60 ° C ( A cycle of (30 seconds) / 72 ° C. (30 seconds) was repeated 30 times. A G3PDH transcript-derived approximately 938 bp DNA fragment was amplified in the same manner using a G3PDH primer (# 5406-1) provided by Clontech as a control. The PCR product after completion of amplification was fractionated by electrophoresis using a 2% agarose gel (manufactured by Rockland, # 50070) together with a size marker, and the amount of the fractionated PCR product was compared semi-quantitatively. As a result, of the examined tissue-specific or developmental cDNA panels, an approximately 602 bp DNA fragment derived from the mouse KIAA1921 gene was specifically amplified in eyes not analyzed with the human KIAA1921 gene, and detected as a dark band. In addition, about 602 bp DNA fragment was specifically amplified in the brain, and detected as a rather strong band. An approximately 602 bp DNA fragment was specifically amplified in testis, lung, spleen, thymus, etc. and detected as a weak band (FIG. 2). In addition, for each stage of development, a strong band was detected in embryos on the 11th, 15th and 17th days of fertilization, and no band was detected in the embryo on the 7th day of fertilization (FIG. 2). These results indicate that the mouse-derived gene, which is one of the DNAs of the present invention, was specifically expressed in eyes that had not been analyzed with the human KIAA1921 gene, and that it was also expressed in brain and testis. It has been found that this protein is likely to be involved in the development and differentiation mechanisms of the brain and nervous system as well as the eye. When compared with the expression pattern of the human KIAA1921 gene (DNA Research, 2001, 8: 179-187), expression was also observed in lung, testis and spleen. Furthermore, in the developmental stage, it was not recognized in the early stage of development, and it was found that it began to be expressed around 11 days of fetal life and has been continuously expressed since then. .
In the figure, G3PDH at the bottom shows the expression pattern of the housekeeping gene (G3PDH) used as a control. Therefore, it is highly likely that this protein is involved in mechanisms related to brain development / differentiation and vision.
[0047]
【The invention's effect】
The human KIAA1921 gene does not have a domain structure for estimating its function, and it is difficult to estimate its function, and it was completely unknown. The present inventors have cloned a gene (DNA) showing high homology to the human KIAA1921 gene from a mouse brain-derived cDNA library, and have newly added a DNA sequence to the N-terminal side, ie, a novel DNA sequence, The mouse KIAA1921 gene was successfully obtained.
[0048]
As described above, the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention, or the antibody of the present invention are useful for elucidating the mechanism, diagnosis, and treatment of human diseases including proliferative diseases such as cancer and abnormalities of differentiation such as congenital malformations. It is thought to play an essential role in the above. In addition, the pattern information of expression in each tissue and developmental stage by RT-PCR revealed that the expression level was particularly high in the eyes, that expression was observed in the brain, and that expression was high in the late stages of development. Genes are particularly important in visual and central nervous system architecture and their function maintenance.
Accordingly, the DNA of the present invention and a gene derived from a mammal containing the DNA, a part or the full length of a polypeptide encoded by the DNA, an antibody against the part or the full length of the polypeptide, an antisense DNA, etc. can cause cancer or congenital malformation. It can be used as a medicine in the development of various treatment / prevention methods using mice, which are model animals for treating human diseases, including humans.
[0049]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 BTB / POZ domain conserved in the polypeptide of the present invention (aa: number of amino acids in amino acid sequence, box: from the top, different searches by HMMPfam search method, HMMSmart search method, and ProfileScan search method) 1 shows BTB / POZ domains identified by the method, and also shows Kelch repeat sequences found in both humans and mice.
FIG. 2 shows a comparison of the expression intensity of mbg02133 (mouse KIAA1921) gene in each mouse tissue by RT-PCR. The upper part shows the expression intensity of the mbg02133 gene, and the lower part shows the expression intensity of the housekeeping gene (G3PDH) used as a control, as a photograph of ethidium bromide staining pattern after fractionation by agarose electrophoresis.

Claims

DNA consisting of the following nucleotide sequence encoding the polypeptide of (a) or (b): (a) consisting of part or all of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide; or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which some amino acids are deleted, substituted or added, and are substantially the same as the polypeptide of (a). A polypeptide having a biological activity.

DNA of the following (a), (b) or (c): (a) DNA encoding part or all of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; b) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA of (a); or (c) a DNA that is stringent with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA of (a). A DNA that hybridizes under the conditions and encodes a protein having substantially the same biological activity as the polypeptide encoded by the DNA of (a).

A mammal-derived gene comprising the DNA according to claim 1.

A gene derived from a rodent, wherein the mammal according to claim 3 is a rodent.

A mouse gene wherein the rodent of claim 4 is a mouse.

A polypeptide of the following (a) or (b): (a) a polypeptide consisting of part or all of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; or (b) a sequence In the amino acid sequence represented by No. 1, part or all of the amino acid sequence in which some amino acids have been deleted, substituted or added has a biological activity substantially the same as that of the polypeptide of (a). Polypeptide.

The polypeptide according to claim 6, which is a recombinant protein produced in a host cell into which the DNA according to claim 1 or 2 or the gene according to any one of claims 3 to 5 has been introduced.

A recombinant vector comprising the DNA according to claim 1 or 2, or the gene according to any one of claims 3 to 5.

An antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 6.