JP2004222680A

JP2004222680A - New polypeptide having fha, ring finger and d111/g-patch domains and dna encoding the same

Info

Publication number: JP2004222680A
Application number: JP2003017854A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Koga; 比佐志古閑; Osamu Obara; 收小原; Akihiko Koseki; 明彦古関
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Kazusa DNA Research Institute Foundation
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Kazusa DNA Research Institute Foundation
Priority date: 2003-01-27
Filing date: 2003-01-27
Publication date: 2004-08-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new DNA useful for the screening of a preventing, treating or diagnosing agent related to the propagation/differentiation and its functional maintenance of various organs generally, or related to the propagation/differentiation, its functional maintenance or aging of cells such as cancer, autoimmune diseases/allergy, a gene containing such DNA, a new peptide encoded by the DNA, a recombinant protein containing the polypeptide and an antibody against the new polypeptide. <P>SOLUTION: This DNA consists of a base sequence encoding a polypeptide of the following (a) or (b). The (a) is a polypeptide consisting of a part or the whole of the amino acid sequence which is the same as or substantially same as the specific amino acid sequence, and the (b) consists of an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding a part of the amino acids in the above amino acid sequence, and having a substantially equivalent biological activity. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有し、各種臓器に普遍的に発現が認められる新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、並びに、新規ポリペプチドに対する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のヒトゲノムプロジェクト及びヒトｃＤＮＡプロジェクトの成功により、多くのヒト疾患関連遺伝子が同定あるいは推定されるにいたった。しかしながらその一方で倫理上の問題からヒト遺伝子を用いた研究には制約があり、新たな研究の方向性が模索されている。このような観点からモデル生物における相同遺伝子を同定することは、研究を進展させる意味できわめて重要なステップと考えられる。特にマウスは最も研究が進んでいるモデル生物で、ゲノム情報や変異種の情報も比較的多く蓄積されているが、蓄積されたゲノム情報はまだ十分なものではない。一方、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究がなされ、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録、公開がなされた。しかし、多くのＥＳＴは１００塩基長から５００塩基長といった短い塩基配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００３】
各種臓器においては、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。また、各種臓器における機能の調節には、機能を受け持つ特異的な細胞の増殖あるいは同細胞の活性化が関係している。従って、各種臓器に普遍的に強く発現している新規な遺伝子を取得して、その遺伝子にコードされる各種臓器に普遍的でかつ複雑な機能を調節する蛋白質を得ることは、医薬品開発に有用である。また、得られた蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現している該蛋白質の遺伝子の機能をホモロジー検索から推定し、その情報を基にして該蛋白質を適当な発現系で発現させて組換え蛋白質を得、更にして該蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることが必要であった。
【０００４】
長鎖ヒトｃＤＮＡプロジェクトにて、ヒト脳由来のヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．，Ｓｕｙａｍａ，Ｍ．，Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｎ．，Ｔａｎａｋａ，Ａ．，Ｋｏｔａｎｉ，Ｈ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｎ．ａｎｄＯｈａｒａ，Ｏ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｈｕｍａｎｇｅｎｅｓ．Ｘ．Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１００ｎｅｗｃＤＮＡｃｌｏｎｅｓｆｒｏｍｂｒａｉｎｗｈｉｃｈｃｏｄｅｆｏｒｌａｒｇｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｉｔｒｏ．，ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，５：１６９−１７６（１９９８））が報告されているが、その機能については不明であった。ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子は染色体６ｐ２１．３に存在し、更に、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子のＳＮＰｓも複数箇所報告されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｃｍｄ＝Ｄｉｓｐｌａｙ＆ｄｏｐｔ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＿ｓｎｐ＆ｆｒｏｍ＿ｕｉｄ＝３３２７１０５）、ヒト疾患の大部分が単なる遺伝子の欠失によって引き起こされるのではなくて、アミノ酸置換によって蛋白質の機能や活性が一部分だけ変化することにより引き起こされることを鑑みると、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子は各種臓器の分化やその機能保全に関わる、あるいは癌、自己免疫疾患、及びアレルギーといった細胞の増殖・分化に関わる疾患に関与している可能性が考えられる。ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子にコードされるポリペプチドにはＦＨＡ、及びＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインが認められ、Ｚｎ−ｆｉｎｇｅｒの変形であるＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインを有する遺伝子ファミリーに属していることが判明していた。しかしながら、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子にコードされる蛋白質にはＦＨＡ、及びＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメイン以外に特徴的なモチーフが認められず遺伝子情報としては不十分であり、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子の機能を充分に推定することが出来なかった。
【０００５】
【非特許文献１】
１．宮内康弘等，実験医学，２０００，１８：２５８１−２５８６，ＲＩＮＧフィンガードメインとユビキチンリガーゼ活性
【非特許文献２】
２．Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔａｌ，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，２０００，２５：３０２−３０５，ＦａｍｉｌｉａｌＰａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ，ｐａｒｋｉｎ，ｉｓａｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅ．
【非特許文献３】
３．Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２４−２２５Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｆｏｒｍｏｆａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｂｙｐａｒｋｉｎｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｒａｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＰａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ．
【非特許文献４】
４．Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ＤａｎｄＪａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，２００２，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ，５１３：５８−６６，ＴｈｅＦＨＡｄｏｍａｉｎ．
【非特許文献５】
５．Ａｒａｖｉｎｄ，Ｌ．，＆Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２４：３４２−３４４，Ｇ−ｐａｔｃｈ：ａｎｅｗｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃＲＮＡ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｙｐｅＤｒｅｔｅｒｏｖｉｒａｌｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ．
【非特許文献６】
６．Ｓｅｒｏｖａ，Ｏ．，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，５８：４２−５１，ＡｈｉｇｈｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＢＲＣＡ１ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎ２０ｂｒｅａｓｔ−ｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｆａｍｉｌｉｅｓ．
【非特許文献７】
７．Ｂａｒｉｎａｇａ，Ｍ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：２２３−２２５，Ａｎｅｗｆｉｎｇｅｒｏｎｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎｂｕｔｔｏｎ．
【非特許文献８】
８．Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．ａｎｄＢｕｃｈｅｒ，Ｐ．，１９９５，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０：３４７−３４９，ＴｈｅＦＨＡｄｏｍａｉｎａｐｕｔａｔｉｖｅｎｕｃｌｅａｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｏｍａｉｎｆｏｕｎｄｉｎｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
従来、ヒト長鎖ｃＤＮＡプロジェクトでヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子が取得されていたが、遺伝子情報が完全でなくその機能が不明であった。一方、各種臓器に普遍的にで発現する新規遺伝子を取得し、該遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質あるいはその蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることは、細胞内で該蛋白質が他の蛋白質との結合を阻害する化合物を、あるいはシグナル伝達等に影響及ぼす化合物をスクリーニングするのに重要である。
【０００７】
従って、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子に関連する新規遺伝子を取得し、新規モチ−フを取得し、同遺伝子の組織特異的発現パターンを得て、本発明の新規遺伝子がコードする蛋白質の機能に関する情報を得ることは、本発明のポリペプチドの特異的結合蛋白質や、アゴニスト、アンタゴニストを検索する際の非常に重要な手段となる。上記のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質が見出されなくても、本発明のポリペプチドの不活化実験（例えばノックアウト動物の作製）からそのポリペプチドの生理作用を解析することにより、本発明のポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することが可能であり、本発明のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、各種臓器に関わる疾患の患者の機能不全に関連する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬として活用することが可能となる。生体での本発明のポリペプチドの機能の低下または昂進が、各種臓器に関わる疾患の原因となっている場合が考えられる場合がある。この場合には、そのポリペプチド該蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、そのポリペプチドの各種臓器をターゲットとした本発明のポリペプチド投与や、そのポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸の投与、あるいは該遺伝子を用いた遺伝子治療に応用することもできる。この場合には本発明のポリペプチドをコードする塩基配列は、本発明のポリペプチドの各種臓器に関わる疾患の患者の遺伝子欠失や変異の有無を調べるために必要な情報であり、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明のポリペプチドの機能不全に関与する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬に応用することが出来る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、マウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、その遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側及びＣ−末端側にヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子になかった全く新しい配列が付加していること、また、得られた遺伝子が各種臓器に普遍的に発現していることを発見した。更に、得られた遺伝子情報を解析することにより、本発明のその遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側にヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子と同様にＦＨＡドメインが、また、Ｃ−末端側にはＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインが存在すること、それに加えて本発明のポリペプチドのＣ−末端側に付加された新規配列の中には、Ｄ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインが存在することを発見し、更にその遺伝子情報をもとに新規ポリペプチドとそれに特異的な抗体を得て、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部（例えば、以下に示すＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有する配列の少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において３１番目（メチオニン）〜７４９番目（グリシン）の７１９個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、に係る。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列（配列番号：２の塩基対第３〜２，２４９番目）の一部（例えば、以下に示すＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有する配列の少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において３１番目（メチオニン）〜７４９番目（グリシン）の７１９個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに係る。以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明のＤＮＡ」ともいう。本発明のＤＮＡは、新規ポリペプチドをコードするものである。又、本発明はこれらＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、哺乳動物が齧歯類である齧歯類由来遺伝子、特に齧歯類がマウスであるマウス遺伝子にも係る。特に、マウス遺伝子は「マウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子」ともいう。
更に、本発明は本発明のＤＮＡ又は遺伝子（ＫＩＡＡ０６４６遺伝子）にコードされるポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」ともいう。）、例えば、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質であるポリペプチド（以下、「ＫＩＡＡ０６４６蛋白質」ともいう）に係る。
また、本発明は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を含む組換えベクター、及び、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩に特異的に結合する抗体に係る。
【００１０】
また、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、該ポリペプチドに対する抗体を用いることによって、該蛋白質の発現量を変化させる化合物、該蛋白質に結合する蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法などを提供する。更に、本発明ポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩を用いることを特徴とする、それら物質と特異的に結合する物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニング用キット等も提供する。
【００１１】
更に、本発明は、本発明のＤＮＡ、本発明のＤＮＡを含有する組換えベクター又は発現ベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又はその塩の製造方法、及び、こうして得られる本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質またはその塩を提供する。又、本発明は、本発明のＤＮＡを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質をコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド又はそれらを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を含有してなる医薬を提供する。
更に、本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて得られる、所謂、ＤＮＡチップ（アレイ）、プロテインチップにも係る。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、本発明者により採取されたマウス胎児尾芽由来ｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，９：４７−５７）に従って調製したマウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、約１６，６０８個の組換え体を選択し、その全ての３’末端ＤＮＡ配列を決定し、その中から、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子に高い相同性を有するクローンを選択し全塩基配列の決定を行なった。次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（ＧＣＧ，Ｆａｓｔａ＆Ｂｌａｓｔ）を用いてホモロジー検索を行なった。その結果、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子がコードするアミノ酸配列（４８６アミノ酸長）のほぼ全長（１−４８２番目，４８２アミノ酸長）と本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列（７４９アミノ酸長）の３０番目から５１４番目までの４８５アミノ酸について比較したところ、アミノ酸レベルで約７０．９％という有意な相同性を有する、配列番号：２に示される塩基配列を有するクローンを取得した（クローン名：ｍｐｆ０１０２９）。
【００１３】
取得したｍｐｆ０１０２９にコードされるポリペプチド（本発明のポリペプチド）のアミノ酸配列は７４９アミノ酸であり、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＢ０１４５４６）にコードされている蛋白のアミノ酸配列の４８６アミノ酸（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８５：１６９−１７６では４８５アミノ酸で記述）に比較しＮ−末端側及びＣ−末端側の両方向に長く伸びていた。得られた「本発明のポリペプチド」のアミノ酸配列について、以下の実施例に記載したようにホモロジー検索を行った結果、「本発明のポリペプチド」ではヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子にコードされているポリペプチドに比較し、Ｎ−末端側１−２９番目の２９個のアミノ酸配列、及びＣ−末端側の５１５−７４９番目の２３５個のアミノ酸配列が新規に付加されていることが判明した。マウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子にコードされているポリペプチドの全長アミノ酸に対し、公共のデーターベースを用いてホモロジー検索を行った。
その結果、欧州特許公開番号ＥＰ１０７４６１７−Ａ２（発明の名称：ＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３、Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＥＬＩＸＲＥＳＩＮＳＴ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：７，Ｆｅｂ．２００１のＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３，４８１アミノ酸長）の１−４８１番目の４８１アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のポリペプチド（７４９アミノ酸長）の３１番目から５１４番目の４８４アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、比較的高いホモロジーが認められた（約７０．９％）。
本発明の７４９アミノ酸配列は、公開されたＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３（４８１アミノ酸長）配列に対し、Ｎ−末端側に３０アミノ酸長の新規配列が、Ｃ−末端側に２３５アミノ酸長の新規配列が付加されている。ＥＰ１０７４６１７−Ａ２のＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列について各種疾病処置用蛋白質として記載しているのみで、その機能については不明である。４８１アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチドの７４９アミノ酸配列は長く、後に述べるようにその機能についても推定可能で有用である。
また、国際公開番号ＷＯ０１／３４７６７（発明の名称：Ｈｕｍａｎｇｅｎｅ１８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＤＰＭＬ２３ｖａｒｉａｎｔ，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＵＭＡＮＧＥＮＯＭＥＳＣＩＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：１７，Ｊｕｌ．２００１のＨｕｍａｎｇｅｎｅ１８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＤＰＭＬ２３ｖａｒｉａｎｔ，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１，８３５アミノ酸長）の１−２５９番目の配列（２５９アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（７４９アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列４６４−７２８（２６５アミノ酸長）の配列とでやや高いホモロジーが認められた（約７８．２％）。ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１（８３５アミノ酸長）は、Ｈｕｍａｎｇｅｎｅ１８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＤＰＭＬ２３のｖａｒｉａｎｔであるとされていて、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列について各種疾病処置用蛋白質として記載されているが、その機能については不明である。この蛋白質は本発明の蛋白質の７４９アミノ酸長のうち２６５アミノ酸長に対しホモロジーが認められるだけで、全く異なる蛋白質分子であり、本発明の７４９アミノ酸配列は長く、後に述べるように機能についても推定可能で有用である。
本発明のポリペプチドアミノ酸配列（７４９アミノ酸長）について、上記に示したように、今までに出願された配列における４８１アミノ酸長、及び２５９アミノ酸長についてやや高いホモロジーが認められたが、それらの配列は、本発明のポリペプチドアミノ酸配列（７４９アミノ酸長）の全長をカバーするものでなく、断片的に関連があるのみで、本発明の長鎖配列の解明により、ようやく新規配列蛋白とその機能を述べること可能となった。
尚、配列番号：２に示される塩基配列を有する本発明のＤＮＡを含むプラスミド（プラスミド表示名：ｍｐｆ０１０２９）は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年１２月１８日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９１６１が付されている。
【００１４】
ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子の配列は５，５４５ｂｐ（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８５：１６９−１７６，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０６４６／）であるが、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは４８６アミノ酸である（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＢ０１４５４６，ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８５：１６９−１７６では４８５アミノ酸で記述）。ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子ホモログを詳細に研究することにより、Ｎ−末端側にはさらにポリペプチドがコードされている可能性について検証される可能性がある。本発明のＤＮＡにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは７４９アミノ酸であるが、本発明のＤＮＡに対するホモログについて更に詳細に研究することにより、Ｎ−末端側に更に伸張してポリペプチドがコードされていることを見つける可能性がある。
【００１５】
尚、当業者であれば、本明細書によって初めて開示された配列番号：２に示した塩基配列に基づいてクローンの５’側に適当なプライマー（例えば、配列番号：２の塩基対第６１〜８０番目５’− ＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴ−３に対応させて合成した配列５’− ＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＴＴＣＡＧＣＡＡ−３’ ）を調製し、該プライマーと市販されている哺乳動物由来のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なった後に逆転写反応を行なうことにより本発明のＤＮＡの上流側（遺伝子の５’側）の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片を特異的に合成することができる。合成した５’側の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した後、配列番号２の一部分をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来ＫＩＡＡ０６４６遺伝子の全領域を調製することが可能である。あるいは他の方法で、例えば次のような方法を用いても遺伝子の５’側が更に伸張した塩基配列を得ることが出来る。すなわち、本発明のＤＮＡをプローブとして用いれば、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ０６４６遺伝子の５’末端領域を調製することができる。更に、本発明のＤＮＡ配列及び本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が開示されている以上、当業者であれば、これらの情報に基づき、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ０６４６遺伝子の５’末端領域を容易に取得することが出来る。又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ０６４６遺伝子の全領域を調製することが可能である。
【００１６】
本発明のＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。各種哺乳動物由来の各種臓器、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、等の細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１７】
配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。従って、本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。又、本発明のポリペプチドには、例えば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１〜３０番目のアミノ酸）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドも含まれる。
【００１８】
更に、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、好ましくは更に配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと同質の生物学的活性を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。かかる条件下で、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ（ベーリンガー・マンハイム社製ＣａｔＮｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧＥａｓｙＨｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製ＣａｔＮｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１９】
本発明のＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２０】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明のＤＮＡ又は本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、ＣＭＶウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した発現ベクター等を利用することが出来る。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＨＳＰプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００２１】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
【００２２】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、あるいはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｂ株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル腎臓細胞由来ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞あるいはヒトミエローマ細胞などが用いられる。
【００２３】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２４】
このようにして得られた、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２５】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明のポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことが出来る。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することも出来る。更に、トリプシン、キモトリプシン、ＦａｃｔｏｒＸａ、トロンビン、又は、ＫＥＸ２プロテアーゼのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００２６】
本発明のポリペプチド（蛋白質）は、Ｃ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ−末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
【００２７】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）がＣ−末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ−末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの一部からなるペプチドとしては、前記した本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明の組換え蛋白質と実質的に同質の生物学的活性を有するするペプチドなどが用いられる。このような部分ペプチドの具体例としては、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の中の、ＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有する配列の少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において３１番目（メチオニン）〜７４９番目（グリシン）の７１９個のアミノ酸から成るポリペプチドを挙げることが出来る。
又、本発明の部分ペプチドはＣ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ−末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２９】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）又はその一部からなるペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００３０】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することも出来る。例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００３１】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルオキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００３２】
本発明の一部からなるペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当な蛋白質限定分解酵素で切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（２）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（３）矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成広川書店。
又は、一部からなるペプチドは、例えば、Ｃ−末端から十数残基の配列或いは配列番号：１で示されるアミノ酸配列の任意の場所の十数残基の部分を公知のペプチド合成装置等を用いて合成することが出来る。更に、このような部分ぺプチドは例えば約５０から５００アミノ酸長までの長さの適当な部位のポリペプチド、または約５００アミノ酸長から全長までの長さの適当な場部位のポリペプチドを選択して、組換え蛋白質として前述の遺伝子組換え技術を用いて製造しても良い。
反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３３】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩と特異的に結合する抗体は、それらを特異的に認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドを抗原として用い、当業者に公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、ポリクローナル抗体の場合には、上記抗原を単独、又は、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等の適当な担体に結合させて、アジュバントの存在又は非存在下で、例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの適当な動物に対して免疫誘導することによって容易に得ることが出来る。ポリクローナル抗体は免疫された動物の血清から公知の様々な方法によって回収及び精製することが出来る。
一方、モノクローナル抗体を製造するためには、例えば、上記の免疫された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、公知の不死化増殖細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等の骨髄腫細胞株）との細胞融合により、ハイブリドーマを作成する。これを更にクローニングし、本発明のポリペプチド等に特異的に認識する抗体を生産しているハイブリドーマのクローンを選別し、該ハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を回収し精製することによって容易に得ることが出来る。
更に、当業者には公知である様々な遺伝子工学的手法により、こうして得られた抗体の抗原決定基等を含む、ヒト化抗体等の各種キメラ抗体も容易に製造することが出来る。
本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチド（蛋白質）等を検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチド（蛋白質）の検出、被検細胞内における本発明のポリペプチド（蛋白質）の挙動の分析などのために使用することができる。
【００３４】
更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明のポリペプチド（蛋白質）等の定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、及び組織染色等による検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）等が関与する疾病の診断を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることが出来る。
【００３５】
これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＡ））、同書Ｖｏｌ．７３（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．７４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＣ））、同書Ｖｏｌ．８４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＥ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＧｅｎｅｒａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＩ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３６】
本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３７】
更に、本発明のポリペプチド（蛋白質）等は、これら物質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチド（蛋白質）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、該物質又はそれらの塩の活性を阻害する化合物（以下、「阻害剤」ともいう）のスクリーニング方法、及びその為のスクリーニング用キットを提供する。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物である。該化合物またはその塩は、本発明の蛋白質等の活性を直接阻害するものであってもよいし、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の発現を阻害することによって間接的に本発明のポリペプチド（蛋白質）等の活性を阻害するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。
【００３８】
本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子をプローブとして使用することにより、ヒトにおける本発明のポリペプチド又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。更に、本発明のＫＩＡＡ０６４６遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明のポリペプチド（蛋白質）等を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。前者の場合、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を適当なベクターをベヒクルとして使用し、ベクターにのせた形の該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
【００３９】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００４０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：７４９）を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を含む、クローンｍｐｆ０１０２９の全塩基配列（６，５２１塩基対）を示す。
【００４１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている方法に従った。
【００４２】
（１）マウス胎児尾芽由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ａｔｔＢ１部位を有するオリゴヌクレオチド：５’−ＦｇｃＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）_１８−３’（Ｆ、ｇおよびｃは、それぞれフルオレッセイン基、フォスフォロチオエイト修飾Ｇ、フォスフォロチオエイト修飾Ｃ残基を表す）をプライマーとして、マウス胎児尾芽（ＩＣＲマウス受精１１．５日目のＳ１，Ｓ０，Ｓ−１，及びＳ−２に関わる前体節中胚葉及び体節中胚葉）由来ｍＲＮＡを鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにａｔｔＢ１部位を有するアダプターをｃＤＮＡにライゲーションした。その後、アガロースゲルで１ｋｂ−２ｋｂ、２ｋｂ−３ｋｂ、３ｋｂ−４ｋｂ、４ｋｂ−５ｋｂ、と５ｋｂ−７ｋｂにｃＤＮＡをサイズ分画した。これらを、サイズを小さくしたａｔｔＰｐＳＰＯＲＴ−１エントリーベクター（インビトロジェン社製）にＢＰ反応により移し換えた後、大腸菌ＥｌｅｃｔｏｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポーレーション法により導入した。プレートに出現した１０^６個以上の形質転換体を集め、液体培地中で、３７℃で２−３時間培養した後プラスミドを調製した。スーパーコイルドプラスミドの形でサイズ分画した後、ＬＲ反応によりａｔｔＲｐＢＣデスティネーションベクター（インビトロジェン社製）にｃＤＮＡを移し換えた。このプラスミドを精製後、ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポーレーション法により導入し、各分画が期待されるサイズになるまで、上記の分画操作を２−３回繰り返した。最後に各分画ごとにＤＨ１０Ｂ株にプラスミドを導入した。なお、ここで用いた試験管内での相同組み換え反応を利用したクローニングシステムは小原等の方法（ＮｕｃｒｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２９，ｅ２２（２００１）およびＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ．９，４７−５７（２００２））に従った。
次に、全ての画分に含まれる約１６，６０８個のクローンの末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、ヒトＫＩＡＡ０６４６に相同性が高いクローンのｃＤＮＡに関して全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７００）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
【００４３】
（２）ホモロジー検索による本発明ＤＮＡを含むクローンの決定
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（Ｆａｓｔａ＆Ｂｌａｓｔ）を用いたホモロジー検索を実施したところ、公開されているデータベースの中のヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子と高いホモロジーを示す候補クローンｍｐｆ０１０２９が見出された。更に、別のＤＮＡ解析プログラム（ＢＥＳＴＦＩＴ）を用いて、このクローンｍｐｆ０１０２９とヒトＫＩＡＡ０６４６のアミノ酸配列と塩基配列について比較したところ、アミノ酸配列のレベルでは、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列番号：１で示されるアミノ酸配列のうち３０番目から５１４番目までの４８５アミノ酸について約７０．９％のホモロジーを示を示すことが判明した。
公開されたポリペプチドのアミノ酸配列に関するデーターベースを検索すると、その結果、欧州特許公開番号ＥＰ１０７４６１７−Ａ２（発明の名称：ＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３、Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＥＬＩＸＲＥＳＩＮＳＴ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：７，Ｆｅｂ．２００１のＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３（４８１アミノ酸長）の１−４８１番目の４８１アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のポリペプチド（７４９アミノ酸長）の３１番目から５１４番目の４８４アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、比較的高いホモロジーが認められた（約７０．９％）。
本発明の７４９アミノ酸配列は、公開されたＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３（４８１アミノ酸長）配列に対し、Ｎ−末端側に３０アミノ酸長の新規配列が、Ｃ−末端側に２３５アミノ酸長の新規配列が付加されている。ＥＰ１０７４６１７−Ａ２のＨｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＮＯ：１６７２３（４８１アミノ酸長）の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列について各種疾病処置用蛋白質として記載しているのみで、その機能については不明である。４８１アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチドの７４９アミノ酸配列はホモロジーがある４８４アミノ酸長を差し引いた２６５アミノ酸長かった。
また、国際公開番号ＷＯ０１／３４７６７（発明の名称：Ｈｕｍａｎｇｅｎｅ１８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＤＰＭＬ２３ｖａｒｉａｎｔ，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＵＭＡＮＧＥＮＯＭＥＳＣＩＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：１７，Ｊｕｌ．２００１のＨｕｍａｎｇｅｎｅ１８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＤＰＭＬ２３ｖａｒｉａｎｔ，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１（８３５アミノ酸長）の１−２５９番目の配列（２５９アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（７４９アミノ酸長）の一部の配列、すなわちアミノ酸配列４６４−７２８（２６５アミノ酸長）の配列とでやや高いホモロジーが認められた（約７８．２％）。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８１（８３５アミノ酸長）は、Ｈｕｍａｎｇｅｎｅ１８ｅｎｃｏｄｅｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＤＰＭＬ２３のｖａｒｉａｎｔであり、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列について各種疾病処置用蛋白質として記載しているが、その機能については不明である。この蛋白質は本発明のポリペプチドの７４９アミノ酸長のうち２６５アミノ酸長に対しホモロジーが認められるだけで、全く異なる蛋白質分子である。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（７４９アミノ酸長）について、上記に示したように、今までに出願された配列に対して４８１アミノ酸長である断片について、及び２５９アミノ酸長である断片について、それぞれやや高いホモロジーが認められたが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（７４９アミノ酸長）の全長をカバーするものでなく、一部のより短い配列に関連があるのみであった。
【００４４】
公開された遺伝子の塩基酸配列に関するデーターベースを検索すると、本発明のｍｐｆ０１０２９塩基配列（６，５２１塩基）の一部の配列とホモロジーを有する部分配列について複数の報告があったが、配列全体をカバーする報告はなかった。詳しくには、次に示す公開された塩基配列に対し、本発明の６，５２１塩基長の塩基配列は長く、新規配列の付加が認められた。
１）国際公開番号ＷＯ０２／２９１０３（発明の名称：Ｇｅｎｅ＃１６５９ｕｓｅｄｔｏｄｉａｇｎｏｓｅｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ，Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＧＥＮＥＬＯＧＩＣＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：Ａｐｒ−１１−２００２）のＧｅｎｅ＃１６５９（全３，１８６塩基長）の配列１５２−１，００３（８２５塩基長）と、本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列２，１８６−３，０３７，８５２塩基長）とで、また、配列１，０２２−１，８１１（７９０塩基長）と本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列４，６４５−５，４３４，７９０塩基長）とで、また、配列２，８９３−３，０５２（１６０塩基長）と、本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列６，２３４−６，３９４，１６１塩基長）とで、また、配列５−９４（９０塩基長）と本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列２，０９７−２，１８６，９０塩基長）とで、更に配列３，１０２−３，１７１，７０塩基長）と本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列６，４３７−６，５０６，７０塩基長）とで、それぞれ約８７．８％、約８６．８％、約９３．８％、約９３．３及び約９０．０％という比較的高いホモロジーが認められた。
２）国際公開番号ＷＯ０１／３４７６７：Ｈｕｍａｎｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅ１８ｃＤＮＡｃｌｏｎｅＨＤＰＭＬ２３，ＳＥＱＩＤＮＯ：２８．（Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：ＨＵＭＡＮＧＥＮＯＭＥＳＣＩＩＮＣ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｄａｔｅ：Ｍａｙ−１７−２００１）のＳＥＱＩＤＮＯ：２８（全４，０６２塩基長）の配列９６６−１，８１７（８５２塩基長）と、本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列２，１８６−３，０３７，８５２塩基長）とで、また、配列４，６４５−５，４３４（７９０塩基長）と本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列１，８３６−２，６２５，７９０塩基長）とで、また、配列２６３−９０８（６４６塩基長）と、本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列１，５４１−２，１８６，６４５塩基長）とで、また、配列号３，７０７−３，８６６（１６０塩基長）と本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列６，２３４−６，３９４，１６１塩基長）とで、更に配列３，９１６−３，９８５，７０塩基長）と本発明の塩基配列（６，５２１塩基長）の一部（配列６，４３７−６，５０６，７０塩基長）とで、それぞれ約８７．８％、約８６．７％、約８８．２％、約９０．０及び約９０．０％という比較的高いホモロジーが認められた。
１）と２）については、全長の長さが違うが基本的に相同配列を多く含む関係にあり、１）と２）の配列と本発明の遺伝子の配列とは、上記に示したように断片的にやや高いホモロジーが認められるものの全く異なる新規な配列と判断される。
【００４５】
以上のホモロジー検索の結果から、候補クローンｍｐｆ０１０２９はヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子と高いホモロジーを示し、かつヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子に対し新規配列が付加された構成となっていること、また、部分的には類似遺伝子が存在するが全長については既知配列の例がない、全く新規遺伝子であることが判明した。
【００４６】
（３）モチ−フ検索
本発明のＤＮＡに関して、ＰＲＯＳＩＴＥｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムであるｐｆｔｏｏｌｓ（ＢａｉｒｏｃｈＡ，ＢｕｃｈｅｒＰ，ＨｏｆｍａｎｎＫ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９７Ｊａｎ１；２５（１）：２１７−２１）、及びＰｆａｍｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムｈｍｍｅｒ２．１（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．，Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｒｎｅｙ，Ｅ．，Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．，ａｎｄＤｕｒｂｉｎ，Ｒ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９９８；２６，３２０−３２２）を用いてモチ−フ検索を行なった（Ｓｕｙａｍａｅｔ．ａｌ．１９９９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２７：３３８−３３９）。本発明のＤＮＡは、６，５２１塩基対あり、７４９個のアミノ酸からなるリペプチドをコードしている。本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列には、Ｎ−末端側にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが、また、Ｃ−末端部分にはＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有することが判明した（図１）。詳しくは、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側の６８−１２２番目にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが、更にＨＭＭＰｆａｍ検索法及びＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によっても、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち各々６８−１３９番目、６７−１２２番目にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが見出された。
Ｃ−末端側には、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち４３６−４７４番目にＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインが、ＨＭＭＰｆａｍ検索法及びＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によると、双方共に４３６−４７３番目にＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインが見出された。更に、Ｃ−末端側には、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち５５６−６０２番目にＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインが、ＨＭＭＰｆａｍ検索法及びＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によると各々５５６−６００番目、５５４−６００番目に同じくＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインが見出された。
【００４７】
（４）ｍＲＮＡレベルでの発現頻度
ｍＲＮＡレベルでのヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子の発現については、脳、胎児脳、脊随、精巣で中程度の発現が認められていたが、特徴的な所見はなかった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０６４６／、ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８５：１６９−１７６）。そこで、本発明の遺伝子の一つであるマウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスにおける同遺伝子の組織特異的及び発生段階特異的発現を解析した。マウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅して検出するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を５’−ＣＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ −３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−ＴＴＴＴＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧ−３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子の転写産物をＲＴ−ＰＣＲ法で増幅すると、約５２５ｂｐＤＮＡ断片が得られる設計にした。マウス各組織から調製されたｍＲＮＡを材料とし、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により１ｓｔストランドｃＤＮＡまで調製が終了しているＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅｃＤＮＡＰａｎｅｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｋ１４２３−１，＃Ｋ１４３０−１）を用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社が示す方法により以下のようにして解析を行った。すなわち、各マウス組織１ｓｔストランドｃＤＮＡと上記プライマーをそれぞれ混合し、各々についてＰＣＲを行い、マウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子の転写産物のうち約５２５ｂｐＤＮＡ長のＤＮＡ断片の増幅を図った。ＰＣＲは、ＴａｑポリメラーゼとしてＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（宝酒造，＃ＲＰ００１Ａ）を用い、上述のＤＮＡ混合液を９５°Ｃ（２．５分）で加熱した後、９５°Ｃ（３０秒）／６０°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（３０秒）のサイクルを３０回繰り返して行った。コントロールとしてＣｌｏｎｔｅｃｈ社が提供するＧ３ＰＤＨプライマー（＃５４０６−１）を使用したＧ３ＰＤＨ転写産物由来約９３８ｂｐＤＮＡ断片の増幅も同様にして行った。増幅を終えたＰＣＲ産物を、サイズマーカーとともに２％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、＃５００７０）を用いて電気泳動で分画し、分画したＰＣＲ産物の量を半定量的に比較した（図２）。その結果、調べた組織別あるいは発生過程のｃＤＮＡパネルの内、各種臓器に於いて、あるいは各発生過程に於いて普遍的に、マウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子に由来する約５２５ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、中程度の濃さのバンドとして検出された。
尚、図２において、下段のＧ３ＰＤＨはコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現パターンを示す。従って、以上の結果から、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは各種臓器に普遍的に発生・分化や機能保全に関わっている可能性が高いといえる。
【００４８】
（５）本発明遺伝子の機能推定
本発明のｍｐｆ０１０２９遺伝子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列には、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子と同様に、そのＮ−末端側にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、及びそのＣ−末端側にＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインが存在すること、それに加えてＣ−末端側に付加された新規配列には、Ｄ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインが存在することに大きな特徴を有する。ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒはＺｎｆｉｎｇｅｒの変形であり、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメイン内のシステイン、ヒスチジンの存在パターンがＣ３Ｈ４であるＣ３Ｈ４タイプのＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒは、そのモチーフ内で２個のＺｎと結合し高次構造を形成すると考えられる（宮内康弘等、実験医学、２０００，１８：２５８１−２５８６）。Ｃ３Ｈ４タイプのＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒは、それ自身Ｅ３ユビキチン−蛋白リガーゼ活性を有する（Ｂａｒｉｎａｇａ，Ｍ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：２２３−２２５）。ユビキチン−プロテアソーム系は、特定の蛋白質を分解することにより生体内の重要な反応系を調節することから、哺乳動物における各種細胞の増殖・分化に極めて重要な役割を果たしている。ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ蛋白質は、発癌、シグナル伝達、発生、アポトーシス、細胞周期に関わる各種遺伝子産物として報告されているので、ヒトの病気、老化に深い関係がある。例えば、家族性パーキンソン病の原因遺伝子であるＰａｒｋｉｎ蛋白質はＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒモチーフを有し、このモチーフがその蛋白質の活性に必須であることが示されている（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ，ａｌ，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，２０００，２５：３０２−３０５，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２６３−２６９）。
ＦＨＡドメイン（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．ａｎｄＢｕｃｈｅｒ，Ｐ．，１９９５，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０：３４７−３４９）を有するＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ蛋白質として、酵母Ｙｈｒ１１５Ｃ蛋白質（全４１６アミノ酸）が知られている（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ＤａｎｄＪａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，２００２，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ，５１３：５８−６６）。ＦＨＡドメインは８つのβ−ｓｈｅｅｔが折れたたまれたサンドイッチ構造が特徴的で、その構造は、リン酸化スレオニン含有ペプチド部位（ｐ−Ｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ）を認識する。リン酸化スレオニンエピトープを有する状態が存在する活性化蛋白質として、キナーゼ、ホスファターゼ、キネシン転写因子、ＲＮＡ−結合蛋白、及び代謝酵素といった生体内の調節に関わっている重要蛋白質が知られており、リン酸化され活性化されている状態の検知にＦＨＡドメインが関わっている（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ＤａｎｄＪａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，２００２，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ，５１３：５８−６６）。ＦＨＡドメインは、リン酸化ペプチドと結合しシグナル伝達等に関与すること、また、本発明のポリペプチドで認められるＣ３Ｈ４タイプのＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインは、ユビキチネーションによる特異的蛋白質の分解に関係することが報告（宮内康弘等，実験医学，２０００，１８：２５８１−２５８６，Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ＤａｎｄＪａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，２００２，ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ，５１３：５８−６６）されているので、本発明のポリペプチドは細胞内の重要な機能に係わっていることは明らかである。
それに加えて、本発明のポリペプチドのＣ−末端付近に認められるＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインは、グリシンに富む約４０残基長の新規ＲＮＡ結合モジュールであることが最近になって判明し、ＲＮＡあるいはＤＮＡに結合して癌抑制、ＤＮＡのダメージ修復等に係わること、また、ＲＮＡのプロセシング等核内でのｍＲＮＡ成熟に係わることにより重要な調節機能を受け持つことが報告されている（Ａｒａｖｉｎｄ，Ｌ．，＆Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２４：３４２−３４４）。これらにより、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、主に核内にあってＤＮＡ修復、ｍＲＮＡスプライシング、シグナル伝達、蛋白分解といった細胞内の重要なプロセスに関係していることが容易に推定される。
【００４９】
これまでに、ＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインの３つのドメインを有するポリペプチドについては報告がない。また、これらＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有するアミノ酸配列をコードする本発明の遺伝子配列は、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析の結果であらゆる組織において普遍的な発現が認められ、更に、発生の全過程に於いて発現していることが見出され、本発明の遺伝子がコードする蛋白質が全組織に於いて細胞の増殖・分化を制御する重要な働きに関わっている可能性が今回初めて示された。
本発明のポリペプチドにおいて見出されたＣ３Ｈ４タイプのＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒドメインは、上記で示したようにユビキチネーションに関わるドメインと考えられ、本発明のポリペプチドは特定の蛋白質の細胞内含有量調節に関わる分子と推定される。ＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有する本発明の蛋白質は、リン酸化された特定蛋白の検出する機能と、特定蛋白質を分解する機能とＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインのＲＮＡ結合活性を兼ね備えることから、活性化蛋白質の検出、特定蛋白質の分解による調節及びＤＮＡ修復、ｍＲＮＡの成熟に関わる重要機能を担う新規蛋白質といえ、それら重要機能に関わる各種臓器における生体内の複合蛋白質の中心をなしているといえる。
本発明のポリペプチドは、全組織に置いて強く発現していることを特徴とする新規なＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有するポリペプチドであり、それら組織に於いて発育、機能保全、あるいは全身の臓器に関わる病態（例えば癌化・老化）解明、それによる予防薬、治療薬、検査薬の開発に有用であることが明らかで、それが本発明の優れた点である。また、本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる点が優れている。
【００５０】
ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現について調べられたが、特徴的な発現臓器が認められなかった（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８５：３１−３９）。本発明のｍｐｆ０１０２９遺伝子は、各種臓器に普遍的に発現量していることから、普遍的に各種臓器において発育、機能保全、あるいは各種臓器における癌・自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖に関わる疾患や老化あるいは先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療薬、検査薬の開発に有用である。本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる。
【００５１】
このように細胞の増殖・分化や老化に極めて重要なＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、それ自身も直接疾患原因遺伝子となりうる。例えば、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ蛋白質をコードするヒトＢｒｅｓｔｃａｎｃｅｒ−１遺伝子は卵巣癌、乳癌−卵巣癌と関係する（Ｓｅｒｏｖａ，Ｏ．，ｅｔ．ａｔ．，１９９６，ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ．５８：４２−５１）。また、家族性パーキンソン病の原因遺伝子であるＰａｒｋｉｎ蛋白質はＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒモチーフを有し、このモチーフがその蛋白質の活性に必須であることが示されている（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ，ａｌ，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，２０００，２５：３０２−３０５，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２６３−２６９）。更に、ＦＨＡとＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒの両方を含むＣＨＦＲ遺伝子は癌の進行に関与する（Ａｒａｖｉｎｄ，Ｌ．，＆Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２４：３４２−３４４）。また、Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有するＬＵＣＡ１５遺伝子は肺癌に関係する（Ａｒａｖｉｎｄ，Ｌ．，＆Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２４：３４２−３４４）
これらの知見から、本発明のＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを有するポリペプチドに関わるＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質については、それらが各種臓器に普遍的に細胞の増殖あるいは分化の調節などに、また、それら臓器の機能保全や老化に関わる病態の解明に関わることが強く示唆される。
【００５２】
【発明の効果】
ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子にはその機能を類推するモチ−フ構造が無く、その機能を推定すること困難で全く未知であった。今回、本発明者はマウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ０６４６遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、Ｎ−末端側及びＣ−末端側に新たにＤＮＡ配列が付加されている新規ＤＮＡ配列、すなわちマウスＫＩＡＡ０６４６遺伝子を取得することに成功した。
【００５３】
これまでに記載したことから、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドあるいは本発明の抗体は、癌・自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖に関わる疾患や先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療上、また、各種臓器の機能保全や老化の防止に必要不可欠な役割を果たすと考えられる。また、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析のよる各組織及び発生段階での発現のパターン情報は、各種臓器に普遍的にで特に発現量が高く、及び各発生過程に於いて普遍的に発現が高いことを明らかとし、本発明の遺伝子が特に各種臓器に普遍的にの発生・分化やその機能保全また老化において重要性であること明らかにした。
従って、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、それらがコードするポリペプチドの一部又は全長、該ポリペプチドの一部又は全長に対する抗体、アンチセンスＤＮＡ等は、癌や先天奇形を含めたヒト疾患を治療する為のモデル動物であるマウスを用いた各種治療・予防方法開発において、医薬として使用することが可能である。
【００５４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチドに新規に認められたＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメイン（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｇｉｏｎ）を示す（ａａ：アミノ酸配列で数字はアミノ酸数、ボックス：上から、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法、またＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法、によるそれぞれ異なった検索法にて同定したＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを示す）。
これらの結果から、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、及びＨＭＭＳｍａｒｔ検索法により、ＦＨＡ、ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ及びＤ１１１／Ｇ−ｐａｔｃｈドメインを、それぞれ新たに同定した。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍｐｆ０１０２９（マウスＫＩＡＡ０６４６）遺伝子のマウス各組織、及び各発生段階における発現強度の比較。上段はｍｐｆ０１０２９遺伝子の発現強度、下段はコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現強度を、アガロース電気泳動で分画した後のエチジウムブロミド染色パターンについての写真で示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel DNA having FHA, RING finger, and D111 / G-patch domains and being universally expressed in various organs, a gene containing the DNA, a novel polypeptide encoded by the DNA, and a novel polypeptide. The present invention relates to a recombinant protein containing a peptide, an antibody against a novel polypeptide, and the like.
[0002]
[Prior art]
The recent success of the human genome and cDNA projects has led to the identification or estimation of many human disease-related genes. However, on the other hand, research using human genes is limited due to ethical problems, and new research directions are being explored. From such a viewpoint, identification of a homologous gene in a model organism is considered to be a very important step in terms of advancing research. In particular, mice are the most studied model organisms, and relatively large amounts of genomic information and information on mutants are accumulated, but the accumulated genomic information is not yet sufficient. On the other hand, as a means for analyzing a gene expressed in a living body, a study of randomly analyzing a cDNA sequence has been conducted, and a fragment sequence of the obtained cDNA has been registered and published in a database as an Expressed Sequence Tag (EST). Was. However, many ESTs have only short base sequence information such as 100 to 500 bases in length, and it is difficult to estimate their functions.
[0003]
In various organs, physiological functions are regulated under the regulation by many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In addition, the regulation of functions in various organs involves the proliferation or activation of specific cells responsible for the functions. Therefore, obtaining a novel gene that is universally and strongly expressed in various organs and obtaining a protein encoded by the gene that controls universal and complex functions in various organs is useful for drug development. It is. Further, in order to efficiently screen for agonists and antagonists to the obtained protein and to develop a drug, the function of the gene of the protein expressed in the living body is estimated from homology search, and based on the information, It was necessary to express the protein in an appropriate expression system to obtain a recombinant protein, and further to obtain an antibody that specifically binds to the protein.
[0004]
In the long-chain human cDNA project, the human KIAA0646 gene derived from human brain (Ishikawa, K., Nagase, T., Suyama, M., Miyajima, N., Tanaka, A., Kotani, H., Nomura, N., et al. and Ohara, O. Prediction of the coding sequences of unique human genes, X. The complete sequences of 100 new cDNA clones in the outline of the new cDNA clones. However, its function was unknown. The human KIAA0646 gene is present on chromosome 6p21.3, and several SNPs of the human KIAA0646 gene have been reported (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db). = Nucleotide & cmd = Display & drop = nucleotide_snp & from_uid = 3327105), considering that most human diseases are not caused by mere gene deletion, but by partial changes in protein function or activity by amino acid substitution. The human KIAA0646 gene is involved in the differentiation of various organs and maintenance of its function, or in diseases related to cell proliferation and differentiation such as cancer, autoimmune diseases, and allergies. A possibility that is considered to. The polypeptide encoded by the human KIAA0646 gene was found to have FHA and RING finger domains, indicating that the polypeptide belongs to a gene family having a RING finger domain that is a variant of Zn-finger. However, the protein encoded by the human KIAA0646 gene has no characteristic motif other than the FHA and RING finger domains, and is insufficient in genetic information, and the function of the human KIAA0646 gene can be sufficiently estimated. Did not.
[0005]
[Non-patent document 1]
1. Yasuhiro Miyauchi et al., Experimental Medicine, 2000, 18: 2581-2586, RING finger domain and ubiquitin ligase activity
[Non-patent document 2]
2. Shimura, H .; , Et al, Nature Genet. , 2000, 25: 302-305, Family Parkinsonisease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase.
[Non-Patent Document 3]
3. Shimura, H .; , Et al. , 2001, Science, 293: 224-225 Ubiquitination of a new form of alpha-syn- clein by parkin from human brain: implications for Parkinson's disease.
[Non-patent document 4]
4. Durocher, D and Jackson, S.M. P. , 2002, FEBS letters, 513: 58-66, The FHA domain.
[Non-Patent Document 5]
5. Aravind, L .; , & Koonin, E .; V. , 1999, Trends Biochem. Sci. , 24: 342-344, G-patch: a new conserved domain in eukaryotic RNA-processing proteins and type D retroviral proteins.
[Non-Patent Document 6]
6. Serova, O .; , Et al. , Am. J. Hum. Genet. , 1996, 58: 42-51, A high inci- dence of BRCA1 mutations in 20 breast- ovarian cancer families.
[Non-Patent Document 7]
7. Barinaga, M .; , 1999, Science, 286: 223-225, A new finger on the protein destruction button.
[Non-Patent Document 8]
8. Hofmann, K .; and Bucher, P .; , 1995, Trends Biochem. Sci. , 20: 347-349, The FHA domain a putative nuclear signaling domain found in in protein kinases and transcription factors.
[0006]
[Problems to be solved by the present invention]
Conventionally, the human KIAA0646 gene has been obtained by the human long-chain cDNA project, but the gene information is not complete and its function is unknown. On the other hand, obtaining a novel gene that is universally expressed in various organs and obtaining the gene, a protein encoded by the gene, or an antibody that specifically binds to the protein requires that the protein be converted into another protein in a cell. It is important to screen for a compound that inhibits the binding to a compound or a compound that affects signal transduction and the like.
[0007]
Therefore, obtaining a novel gene related to the human KIAA0646 gene, obtaining a novel motif, obtaining a tissue-specific expression pattern of the gene, and obtaining information regarding the function of the protein encoded by the novel gene of the present invention. Is a very important means for searching for a specific binding protein, agonist or antagonist of the polypeptide of the present invention. Even if a specific binding protein to the above-mentioned polypeptide is not found, the polypeptide of the present invention can be analyzed by analyzing the physiological action of the polypeptide from an inactivation experiment of the polypeptide of the present invention (for example, production of a knockout animal). It is possible to prepare an agonist or antagonist for the peptide, and specific binding proteins, agonists or antagonists for the polypeptide of the present invention may be used as preventive or therapeutic agents for diseases related to dysfunction of patients with diseases related to various organs. And can be used as diagnostics. In some cases, a decrease or increase in the function of the polypeptide of the present invention in a living body may cause diseases relating to various organs. In this case, not only administration of an antagonist or agonist to the polypeptide but also administration of the polypeptide of the present invention targeting various organs of the polypeptide, or administration of an antisense nucleic acid to a gene encoding the polypeptide. It can also be applied to administration or gene therapy using the gene. In this case, the nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention is information necessary for examining the presence or absence of a gene deletion or mutation in a patient with a disease relating to various organs of the polypeptide of the present invention. The gene encoding the polypeptide can be applied to a preventive or therapeutic agent or a diagnostic agent for a disease associated with dysfunction of the polypeptide of the present invention.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have cloned a gene (DNA) exhibiting high homology to the human KIAA0646 gene from a cDNA library derived from mouse fetal tail buds, and N-terminally encoded the polypeptide encoded by the gene. It was found that a completely new sequence that was not present in the human KIAA0646 gene was added to the side and the C-terminal side, and that the obtained gene was universally expressed in various organs. Further, by analyzing the obtained gene information, the polypeptide encoded by the gene of the present invention has an FHA domain on the N-terminal side similarly to the human KIAA0646 gene, and a RING finger domain on the C-terminal side. And that the novel sequence added to the C-terminal side of the polypeptide of the present invention contains a D111 / G-patch domain. Then, a novel polypeptide and an antibody specific thereto were obtained, thereby completing the present invention.
[0009]
That is, as a first aspect, the present invention provides a DNA comprising a base sequence encoding the following polypeptide (a) or (b): (a) identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Part of the same amino acid sequence (for example, one having at least one of the following sequences having FHA, RING finger and D111 / G-patch domain, or the 31st amino acid sequence (methionine A) a polypeptide consisting of 719 amino acids from position 7 to position 749 (glycine)) or a polypeptide consisting entirely of them; or (b) some amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A polypeptide having substantially the same biological activity as part or all of the polypeptide of (a). Peptide.
As a second embodiment of the present invention, the following DNA of (a), (b) or (c): (a) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (base sequence represented by SEQ ID NO: 2); A portion having at least one of the following sequences having FHA, RING finger and D111 / G-patch domain, or SEQ ID NO: 1 (B) a nucleotide sequence complementary to the DNA of (a), or a DNA encoding all or a polypeptide consisting of 719 amino acids from position 31 (methionine) to position 749 (glycine) in the amino acid sequence represented by A DNA that hybridizes with DNA under stringent conditions; or (c) a DNA that has a base sequence complementary to the DNA of (a) and a stringent DNA. The present invention relates to a DNA that hybridizes under conditions and encodes a protein having substantially the same biological activity as part or all of the polypeptide of (a). The above-mentioned DNAs according to the first and second aspects of the present invention are collectively referred to as “DNA of the present invention” hereinafter. The DNA of the present invention encodes a novel polypeptide. The present invention also relates to a gene derived from a mammal containing the DNA, a gene derived from a rodent in which the mammal is a rodent, particularly a mouse gene in which the rodent is a mouse. In particular, the mouse gene is also referred to as “mouse KIAA0646 gene”.
Furthermore, the present invention relates to a polypeptide encoded by the DNA or gene (KIAA0646 gene) of the present invention (hereinafter, also referred to as “polypeptide of the present invention”), for example, a host cell into which the DNA or gene of the present invention has been introduced. The present invention relates to a polypeptide which is a recombinant protein to be produced (hereinafter, also referred to as “KIAA0646 protein”).
In addition, the present invention provides a recombinant vector containing the DNA or gene of the present invention, and an antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof. According to.
[0010]
In addition, the expression level of the protein is changed by using the DNA of the present invention, a gene containing the DNA, a novel polypeptide encoded by the DNA, a recombinant protein containing the polypeptide, and an antibody against the polypeptide. Provided are a compound, a method for screening a compound (antagonist, agonist) that changes the binding property to a protein that binds to the protein, a screening kit, the screening method, and the like. Furthermore, a method of screening for a substance that specifically binds to the polypeptide of the present invention, a partial peptide thereof, or a recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof, and a screening kit, etc. Also provide.
[0011]
Further, the present invention provides a DNA of the present invention, a recombinant vector or an expression vector containing the DNA of the present invention, a transformant carrying the vector, culturing the transformant, and a portion of the polypeptide of the present invention. Alternatively, a method for producing a polypeptide of the present invention or a recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof, comprising producing and accumulating a recombinant protein containing the full-length polypeptide, and collecting the same, and The present invention provides a recombinant protein containing a part of the polypeptide of the present invention or a full-length polypeptide or a salt thereof. Further, the present invention provides a medicament comprising the DNA of the present invention, a polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a nucleotide sequence substantially complementary to a DNA encoding a recombinant protein containing the polypeptide. Provided are a medicament containing an antisense nucleotide or a medicament containing them, a polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof, or a recombinant protein containing the polypeptide.
Furthermore, the present invention comprehensively prepares the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide, or an antibody against the DNA or gene of the present invention, and accumulates them. The present invention also relates to a so-called DNA chip (array) and protein chip obtained by the above method.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The DNA of the present invention was identified by identifying the nucleotide sequence after isolating it as a cDNA fragment from a cDNA library prepared by the present inventors using mRNA derived from the mouse fetal tail bud collected by the present inventors as a starting material. Things. Specifically, about 16,608 recombinants were selected from a mouse fetal tail bud-derived cDNA library prepared according to the method of Ohara et al. (DNA Research, 2002, 9: 47-57), All the 3 ′ terminal DNA sequences were determined, and a clone having high homology to the human KIAA0646 gene was selected from the DNA sequences, and the entire nucleotide sequence was determined. Next, a homology search was performed using a DNA analysis program (GCG, Fasta & Blast) based on the entire base sequence thus obtained. As a result, almost the entire amino acid sequence (486 amino acids in length) encoded by the human KIAA0646 gene (1-482 amino acids and 482 amino acids in length) and the 30th amino acid sequence (749 amino acids in length) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention. As a result of comparison of 485 amino acids from the 485th amino acid to the 514th amino acid, a clone having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 having a significant homology of about 70.9% at the amino acid level was obtained (clone name: mpf01029).
[0013]
The amino acid sequence of the polypeptide encoded by the obtained mpf01029 (polypeptide of the present invention) is 749 amino acids, and the amino acid sequence of the protein encoded by the human KIAA0646 gene (NCBI-GenBank Accession No. AB014546) is 486 amino acids ( DNA Research, 1998 5: 169-176, which is described as 485 amino acids) and extended in both N-terminal and C-terminal directions. The obtained amino acid sequence of the "polypeptide of the present invention" was subjected to homology search as described in the following Examples. As a result, the "polypeptide of the present invention" showed that the polypeptide encoded by the human KIAA0646 gene As a result, it was found that the 29 amino acid sequences at the N-terminal side at positions 1-29 and the 235 amino acid sequences at the C-terminal side at positions 515-749 were newly added. Homology search was performed on the full-length amino acids of the polypeptide encoded by the mouse KIAA0646 gene using a public database.
As a result, European Patent Publication No. EP 1074617-A2 (Title of Invention: Human protein sequence SEQ NO: 16723, Application: HELIX RES INST., Publication date: 7, Amino acid sequence of Feb. 2001, SEQ. Relatively high homology was observed between the amino acid sequence of the 481 amino acid length at position 1-481 and the amino acid sequence of the 484 amino acid length from position 31 to position 514 of the polypeptide (749 amino acid length) of the present invention. (About 70.9%).
The 749 amino acid sequence of the present invention is based on the published Human protein sequence SEQ NO: 16723 (481 amino acids long) sequence, with a new sequence having a length of 30 amino acids on the N-terminal side and a new sequence having a length of 235 amino acids on the C-terminal side. An array has been added. In the application of Human protein sequence SEQ NO: 16723 of EP 1074617-A2, the amino acid sequence of a polypeptide fragment is simply described as a protein for treating various diseases, and its function is unknown. The 749 amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is longer than the 481 amino acid long amino acid sequence, and its function can be estimated and useful as described later.
In addition, International Publication No. WO 01/34767 (Title of Invention: Human gene 18 encoded secured protein HDPML23 variant, SEQ ID NO: 181, Applicant: HUMAN GENEME SCI INC., Pub. SEQ ID NO: 1-259th sequence (259 amino acids in length) of the protected protein HDPML23 variant, SEQ ID NO: 181,835 amino acids, and a partial amino acid sequence 464-728 (265 amino acids in the polypeptide of the present invention (749 amino acids in length)) A little higher homology was recognized (approximately 78.2%). SEQ ID NO: 181 (835 amino acids in length) is considered to be a variant of Human gene 18 encoded secured protein HDPML23, and the amino acid sequence of the polypeptide fragment is simply described as a protein for treating various diseases. Is unknown. This protein is completely different from the protein of the present invention only in homology to 265 amino acids in length of 749 amino acids, and is a completely different protein molecule. The 749 amino acid sequence of the present invention is long and its function can be estimated as described later. Useful in
Regarding the polypeptide amino acid sequence (749 amino acids in length) of the present invention, as shown above, somewhat higher homology was recognized for the 481 amino acids in length and 259 amino acids in the previously filed applications. Does not cover the entire length of the polypeptide amino acid sequence (749 amino acids in length) of the present invention, but is only fragmentally related. By elucidating the long chain sequence of the present invention, a novel sequence protein and its function are finally obtained. It became possible to state.
The plasmid containing the DNA of the present invention having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (plasmid designation: mpf01029) is a 6th National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan. Deposited with the Patent Organism Depositary on December 18, 2002, and given the accession number FERM P-19161.
[0014]
The sequence of the human KIAA0646 gene is 5,545 bp (DNA Research, 1998 5: 169-176, http://www.kazusa.or.jp/huge/gfpage/KIAA0646/), but the encoded polypeptide is The length of the amino acid sequence is 486 amino acids (described as 485 amino acids in NCBI-GenBank Accession No. AB014546, DNA Research, 1998 5: 169-176). By studying the human KIAA0646 gene homologue in detail, it is possible that the possibility of further encoding the polypeptide at the N-terminal side may be verified. Although the length of the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA of the present invention is 749 amino acids, the homologue to the DNA of the present invention will be further studied in detail to extend the polypeptide to the N-terminal side. May be found to be coded.
[0015]
It should be noted that those skilled in the art will recognize that a suitable primer (for example, base pairs 61 to 61 of SEQ ID NO: 2) may be added to the 5 ′ side of the clone based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 disclosed for the first time by this specification. A sequence 5′-ACTGGGGCAGCGTTCAGCAA-3 ′) synthesized corresponding to the 80th 5′-TTGCTTGAACGCTGCCCCAGT-3) was prepared, the primer was hybridized with a commercially available mammalian mRNA, and then a reverse transcription reaction was performed. By doing so, a new cDNA fragment containing a region on the upstream side (5 ′ side of the gene) of the DNA of the present invention can be specifically synthesized. After inserting a new cDNA fragment containing the synthesized 5 'region into a plasmid, a mammalian KIAA0646 containing the DNA of the present invention is homologously cloned by colony hybridization using a part of SEQ ID NO: 2 as a probe. It is possible to prepare the entire region of the gene. Alternatively, a nucleotide sequence in which the 5 'side of the gene is further extended can be obtained by another method, for example, by using the following method. That is, when the DNA of the present invention is used as a probe, the 5 ′ terminal region of the KIAA0646 gene derived from various mammals including humans can be prepared by homologous cloning such as colony hybridization. Furthermore, since the DNA sequence of the present invention and the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention are disclosed, those skilled in the art can use the information to obtain the 5'-terminal region of the KIAA0646 gene derived from various mammals including humans. Can be easily obtained. Also, by using a PCR method such as RACE with sufficient care not to cause artificial errors in the short fragments and the obtained sequence, the entire KIAA0646 gene derived from various mammals including humans can be obtained. Regions can be prepared.
[0016]
The DNA of the present invention may be any DNA as long as it comprises a base sequence encoding the polypeptide of the present invention described above. Various organs derived from various mammals, for example, any of cDNAs identified and isolated from cDNA libraries derived from cells and tissues such as heart, lung, liver, spleen, kidney, testis, etc., or any of synthetic DNAs Good. The vector used for the library construction may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, a total RNA fraction or an mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues may be used and directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”).
[0017]
An amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 means that the degree of homology with the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 60% or more on average, preferably about 60% or more. An amino acid sequence that is 80% or more, more preferably about 90% or more. Accordingly, a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention has, for example, the above-mentioned homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a polypeptide having substantially the same biological activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Here, “substantially the same quality” means that their activities are the same in nature. Further, the polypeptide of the present invention includes, for example, a part (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Or an amino acid sequence in which amino acids 1 to 30 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted or added, or an amino acid sequence obtained by combining the amino acid sequences, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Also included are polypeptides having substantially the same biological activity as a polypeptide consisting of
[0018]
Furthermore, the DNA of the present invention may be, for example, a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Any DNA that encodes a polypeptide (protein) that hybridizes under gentle conditions and preferably has the same biological activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Good. Under such conditions, the DNA capable of hybridizing with the DNA consisting of the nucleotide sequence complementary to the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes, for example, the DNA DNA having a base sequence having a degree of homology with the entire base sequence of about 60% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more on the average. . Hybridization was performed using Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001), or a method known in the art or a method analogous thereto. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Here, “stringent conditions” means, for example, when a probe is labeled with DIG DNA Labeling (Cat No. 1175033 manufactured by Boehringer Mannheim), a DIG Easy Hyb solution at 32 ° C. (Cat manufactured by Boehringer Mannheim) No. 1603558), and washing the membrane in a 0.1 × SSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) at 40 ° C. (1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M citric acid) (Sodium is used for hybridization) to the human DNA probe of the present invention by Southern blot hybridization.
[0019]
As a means for cloning the DNA of the present invention, the DNA of the present invention is amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having an appropriate nucleotide sequence such as a portion of the polypeptide of the present invention, or the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector. Can be selected by hybridization with a DNA fragment coding for a part or the entire region of the polypeptide or labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods are described, for example, in Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. The DNA base sequence can be converted using a known kit, for example, a SuperScript II reverse transcriptase kit (Gibco BRL) or the like, according to a known method such as the Gapped Duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto. it can. The DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
[0020]
The expression vector for the polypeptide of the present invention can be prepared according to a method known in the art. For example, it is produced by (1) cutting out a DNA fragment containing the DNA of the present invention or a gene derived from a mammal containing the DNA of the present invention, and (2) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. can do. Examples of expression vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC118), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. Or an expression vector using a sequence derived from an animal virus such as SV40, CMV virus, retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, bovine papilloma virus, and the like. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when the host is Escherichia coli, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, and the like are used. When the host is Bacillus subtilis, the host is yeast, such as the SPO1, SPO2, and penP promoters. In some cases, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When animal cells are used as hosts, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, HSP promoter, metallothionein promoter and the like can be mentioned.
[0021]
In addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like known in the art may be added to the expression vector, if desired. be able to. Further, if necessary, the protein encoded by the DNA of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein (eg, glutathione S-transferase, histidine tag, calmodulin binding protein, protein A, etc.). is there. Such a fusion protein can be cleaved using an appropriate protease and separated into respective proteins.
[0022]
Examples of the host cell include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like. Specific examples of Escherichia bacteria include DH1 derived from Escherichia coli K12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 9). (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), and HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), or Escherichia coli (Escher). Used. As the Bacillus bacterium, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used. Examples of yeasts include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizoscharomyces pombi, Nippon Caspica, Nippon Casp. . Examples of animal cells include monkey kidney cell-derived COS-1, COS-7, Vero cells, Chinese hamster CHO cells (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter, CHO (dhfr-)). Cells, mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, human Hela cells, human myeloma cells, and the like.
[0023]
Transformation of these host cells can be performed according to methods known in the art. For example, the following documents can be referred to. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978); Cell Engineering Annex 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha); and Virology, 52, 456 (1973).
[0024]
The thus obtained transformant transformed with the expression vector containing the mammalian gene containing the DNA of the present invention can be cultured according to a method known in the art. For example, when the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added. When culturing a transformant in which the host is yeast, culturing is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours using a medium adjusted to a pH of about 5 to 8, and if necessary, aeration and stirring may be performed. Can also be added. When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours using a medium whose pH is adjusted to about 6 to 8, and if necessary, aeration and stirring may be performed. Can also be added.
[0025]
In order to separate and purify the polypeptide of the present invention from the above culture, for example, after culturing, cells or cells are collected by a known method, suspended in a suitable buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freezing. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a crude protein extract is obtained by centrifugation or filtration. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. ^TM And the like. When the protein is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the cells or cells are separated from the supernatant by a known method, and the supernatant is collected. The protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. The polypeptide (protein) of the present invention thus obtained can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto. Conversely, when the polypeptide (protein) is obtained as a salt, the polypeptide (protein) is released by a known method or a method analogous thereto. Can be converted to body or other salts. Further, the protein produced by the recombinant, before or after purification, methionine aminopeptidase to remove the N-terminal methionine, myristoyl transfer of the N-terminal amino acid using myristoyltransferase, The N-terminal amino acid can be acetylated using transferase, or the amino acid can be arbitrarily modified using other modifying enzymes. Also, the C-terminal amino acid can be modified by the action of a processing carboxyl peptidase or a C-terminal amidating enzyme that modifies the C-terminal. Furthermore, the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate proteolytic enzyme such as trypsin, chymotrypsin, Factor Xa, thrombin, or KEX2 protease.
When produced as a fusion protein, unnecessary polypeptide portions can be removed using an appropriate proteolytic enzyme.
The presence of the polypeptide (protein) of the present invention or a salt thereof can be measured by various binding assays, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
[0026]
In the polypeptide (protein) of the present invention, the C-terminal is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminal is an amide (—CONH). ₂ ) Or an ester (—COOR). Here, as R in the ester, for example, a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl, α A C6-12 aryl group such as -naphthyl, for example, a phenyl-C1-2 alkyl group such as benzyl and phenethyl or a C7-14 aralkyl group such as an α-naphthyl-C1-2 alkyl group such as α-naphthylmethyl; Pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, is used.
[0027]
When the polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein) has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the present invention. Contained in proteins. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used. Furthermore, the protein of the present invention includes a protein in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group and an acetyl group), and which is cleaved in vivo. N-terminal glutamic acid residue produced by pyroglutamination, on the side chain of an amino acid in the molecule, for example, OH, COOH, NH ₂ , SH, and the like are protected with an appropriate protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group and an acetyl group), and a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
[0028]
The peptide comprising a part of the polypeptide of the present invention is a partial peptide of the above-described polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein), as long as it has substantially the same activity. It may be. For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the polypeptide (protein) of the present invention. For example, a peptide having substantially the same biological activity as the recombinant protein of the present invention is used. Specific examples of such partial peptides include those having at least one of FHA, RING finger, and a sequence having a D111 / G-patch domain in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: In the amino acid sequence represented by 1, a polypeptide consisting of 719 amino acids from the 31st (methionine) to the 749th (glycine) can be mentioned.
The partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—) at the C-terminus, but has an amide (—CONH) ₂ ) Or an ester (—COOR). Furthermore, the partial peptide of the present invention has a structure in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and the N-terminal side is cleaved in vivo as in the case of the protein of the present invention. Glutamyl groups are pyroglutamine-oxidized, those in which the substituents on the side chains of the amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, and those in which sugar chains are bonded, such as so-called glycopeptides, are also included. .
[0029]
As a salt of the polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein) or a peptide composed of a part thereof, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
[0030]
The polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein), a peptide composed of a part thereof, a salt thereof, or an amide thereof can also be prepared by a chemical synthesis method known in the art. For example, using a commercially available resin for protein synthesis, an amino acid appropriately protected with an α-amino group and a side chain functional group is subjected to various condensation methods known per se in the art according to the sequence of the target protein. And condensation on the resin. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin and, at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein, its partial peptide or an amide thereof. Regarding the condensation of the protected amino acids described above, for example, protein synthesis represented by carbodiimides such as DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide is useful. Various activating reagents that can be used can be used. For activation by these, the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a control acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. After performing, it can be added to the resin.
[0031]
Solvents used for activation of protected amino acids and condensation with resins include acid amides, halogenated hydrocarbons, alcohols, sulfoxides, and ethers, which can be used in the art for protein condensation reactions. It can be appropriately selected from known solvents. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about −20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole so that the subsequent reaction is not affected. As a protecting group such as each amino group, carboxyl group, and serine hydroxyl group of the raw material, a group usually used in the art can be used. The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
[0032]
The peptide comprising a part of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se in the art, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate protease. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. Examples of known condensation methods and elimination of protecting groups include the methods described in the following (1) to (3).
(1) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments on Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(2) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Biochemistry Experiments Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(3) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten.
Alternatively, a peptide consisting of a part can be obtained by, for example, using a known peptide synthesizer or the like to obtain a sequence of dozens of residues from the C-terminus or any part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 at any position. Can be used for synthesis. Further, such partial peptides may be selected, for example, from about 50 to 500 amino acids in length at a suitable site or from about 500 amino acids to full length at a suitable site. Then, the recombinant protein may be produced by using the above-mentioned gene recombination technique.
The partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of a method known per se, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc., after the reaction. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
[0033]
Antibodies that specifically bind to the polypeptide of the present invention (the existence state of which is a protein), a peptide composed of a part thereof, or a salt thereof are polyclonal antibodies, as long as they can specifically recognize them. Any of monoclonal antibodies may be used. The antibody against the polypeptide (protein) of the present invention, its partial peptide or a salt thereof can be prepared by using the polypeptide (protein) or its partial peptide of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known to those skilled in the art. Can be manufactured.
For example, in the case of a polyclonal antibody, the above antigen is used alone or in the presence or absence of an adjuvant by binding to an appropriate carrier such as cellulose, polymerized amino acid, or albumin, for example, rat, rabbit, sheep, goat, etc. And can be easily obtained by immunizing appropriate animals such as horses. Polyclonal antibodies can be recovered and purified from the serum of the immunized animal by various known methods.
On the other hand, in order to produce a monoclonal antibody, for example, antibody-producing cells (for example, spleen or lymph node-derived) are collected from the above immunized animal, and a known immortalized proliferating cell (for example, bone marrow such as P3X63Ag8 strain) is used. (Hymanoma cell line) to produce a hybridoma. This is further cloned, a clone of a hybridoma producing an antibody that specifically recognizes the polypeptide of the present invention is selected, and the monoclonal antibody is easily obtained by recovering and purifying a monoclonal antibody from a culture solution of the hybridoma. Can be done.
Furthermore, various chimeric antibodies, such as humanized antibodies, containing antigenic determinants and the like of the thus obtained antibodies can be easily produced by various genetic engineering techniques known to those skilled in the art.
The antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide (protein) of the present invention and the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying these, detection of the polypeptide (protein) of the present invention in each fraction at the time of purification, and behavior of the polypeptide (protein) of the present invention in the test cells. Can be used for analysis and the like.
[0034]
Further, the antibody of the present invention can be used for quantification of the polypeptide (protein) of the present invention in a test solution by a known method, in particular, quantification by a sandwich immunoassay using a monoclonal antibody, and detection by tissue staining and the like. Can be used for Thereby, for example, a disease involving the polypeptide (protein) of the present invention or the like can be diagnosed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any method can be used as long as it is a method for detecting the amount of the compound by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but it is preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity. As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, and the like known in the art can be used.
[0035]
For details of general technical means relating to these measurement / detection methods, a review, a book, and the like can be referred to. For example, edited by Hiro Irie, “Sequence Radio Immunoassay” (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical Publishing, published in 1987), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. . 70 (Immunochemical Technologies (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), ibid., Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all published by Academic Press) can be referred to.
[0036]
The antisense DNA having a base sequence substantially complementary to the DNA encoding the polypeptide (protein) of the present invention or a peptide comprising a part thereof may be a base sequence substantially complementary to the base sequence of the DNA. Any antisense DNA may be used as long as it has the effect of suppressing the expression of the DNA. The substantially complementary nucleotide sequence is, for example, a nucleotide sequence having about 95% or more, most preferably 100% homology with the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention. Is mentioned. Nucleic acid sequences (modified RNA or DNA) having the same action as these antisense DNAs are also included in the antisense DNA of the present invention. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
[0037]
Furthermore, the polypeptides (proteins) and the like of the present invention are useful as reagents for screening compounds that inhibit the activity of these substances or salts thereof. That is, the present invention uses a polypeptide (protein) of the present invention, a peptide consisting of a part thereof, or a salt thereof, and a compound that inhibits the activity of the substance or a salt thereof (hereinafter referred to as “inhibition”). Agent), and a screening kit therefor. The compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound selected from the test compounds described above, and a compound that inhibits a biological activity such as the polypeptide (protein) of the present invention. It is. The compound or a salt thereof may directly inhibit the activity of the protein of the present invention, or may indirectly inhibit the expression of the polypeptide (protein) of the present invention by indirectly inhibiting the expression of the polypeptide of the present invention. (Protein) and the like may be inhibited. As the salt of the compound, for example, a pharmaceutically acceptable salt or the like is used. Examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. Compounds that inhibit biological activities such as the polypeptides (proteins) of the present invention may also be used as medicaments such as therapeutic / prophylactic agents for the above various diseases.
[0038]
Using the DNA of the present invention and a gene derived from a mammal containing the DNA as a probe to detect an abnormality in DNA or mRNA (gene abnormality) encoding the polypeptide of the present invention or a peptide comprising a part thereof in humans Therefore, it is useful as a diagnostic agent for a gene, for example, for damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA. The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States). of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)). Furthermore, when the KIAA0646 gene of the present invention has an abnormality, is defective, or has a reduced expression level, patients who cannot exert normal functions in vivo can be treated according to known means (1) retrospectively. The DNA of the present invention or a gene derived from a mammal is introduced into a patient by gene therapy using a suitable vector such as a viral vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector as a vehicle, or expressed, or 2) It is considered that the function of the protein or the like of the present invention can be exhibited in the patient by injecting the polypeptide (protein) or the like of the present invention into the patient. In the former case, the DNA of the present invention or a gene derived from a mammal is used as an appropriate vector as a vehicle, and the DNA in a form attached to the vector is used alone or together with an auxiliary for promoting uptake, a gene gun or a hydrogel. It is also possible to administer by catheter, such as a catheter.
[0039]
In the present specification and drawings, when bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations, the abbreviations are based on abbreviations by IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature or abbreviations commonly used in the art, and when an amino acid can have an optical isomer, Unless otherwise specified, it indicates the L-form.
[0040]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence (amino acid number: 749) of the polypeptide of the present invention.
[SEQ ID NO: 2] This shows the entire base sequence (6,521 base pairs) of clone mpf01029 including the base sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0041]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. In addition, various genetic operations in Examples are described in Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001).
[0042]
(1) Construction of cDNA library derived from mouse fetal tail bud
Oligonucleotide with attB1 site: 5′-FgcGCACCACTTTTGTACAAGAAAGCTGGGCGGCCGC (T) ₁₈ -3 ′ (F, g and c represent a fluorescein group, a phosphorothioate-modified G and a phosphorothioate-modified C residue, respectively) as a primer and a mouse embryo tail bud (ICR mouse fertilization 11.5). Synthesizing double-stranded cDNA using SuperScript II reverse transcriptase kit (manufactured by Invitrogen) using mRNA derived from pre-segment mesoderm and somite mesoderm related to S1, S0, S-1, and S-2 on day did. An adapter having an attB1 site was ligated to the cDNA. Thereafter, the size of the cDNA was fractionated on an agarose gel into 1 kb-2 kb, 2 kb-3 kb, 3 kb-4 kb, 4 kb-5 kb, and 5 kb-7 kb. These were transferred to a reduced-size attP pSPORT-1 entry vector (manufactured by Invitrogen) by BP reaction, and then introduced into Escherichia coli ElectroMax DH10B (manufactured by Invitrogen) by electroporation. 10 appeared on the plate ⁶ More than one transformant was collected and cultured in a liquid medium at 37 ° C for 2-3 hours to prepare a plasmid. After size fractionation in the form of a supercoiled plasmid, the cDNA was transferred to an attR pBC destination vector (Invitrogen) by LR reaction. After the plasmid was purified, it was introduced into the DH10B strain by an electroporation method, and the above-described fractionation operation was repeated 2-3 times until each fraction became an expected size. Finally, the plasmid was introduced into the DH10B strain for each fraction. The cloning system using a homologous recombination reaction in a test tube used here is based on the method of Ohara et al. (Nucleic Acids Res., 29, e22 (2001) and DNA Research Vol. 9, 47-57 (2002)). Followed.
Next, the terminal DNA sequences of about 16,608 clones contained in all the fractions were determined. From these, the entire nucleotide sequence of the cDNA of the clone having high homology to human KIAA0646 was determined. For sequencing, a DNA sequencer (ABI PRISM3700) manufactured by Applied Biosystems and a reaction kit manufactured by Applied Biosystems were used. Most sequences were determined from shotgun clones using the dye terminator method. For some base sequences, oligonucleotides were synthesized based on the determined base sequences and determined by the primer walking method.
[0043]
(2) Determination of a clone containing the DNA of the present invention by homology search
Next, a homology search was performed using a DNA analysis program (Fasta & Blast) based on the entire nucleotide sequence thus obtained. As a result, a candidate clone mpf01029 showing high homology with the human KIAA0646 gene in a public database was obtained. Was found. Further, when the amino acid sequence and the nucleotide sequence of this clone mpf01029 and human KIAA0646 were compared using another DNA analysis program (BESTFIT), the amino acid sequence encoded by the human KIAA0646 gene and SEQ ID NO: 1 Of the 485 amino acids from the 30th position to the 514th position in the amino acid sequence represented by, showed about 70.9% homology.
A search of the database relating to the amino acid sequences of the published polypeptides revealed that as a result, European Patent Publication No. EP 1074617-A2 (Title of Invention: Human protein sequence SEQ NO: 16723, Application: HELIX RES INST., Publication date: 7) 2001, Human protein sequence SEQ NO: 16723 (481 amino acids in length), 481 amino acids in length from 481 to 481 amino acids, and the polypeptide of the present invention (749 amino acids in length), from 484 amino acids in positions 31 to 514. Relatively high homology was observed for the long amino acid sequence (about 70.9%).
The 749 amino acid sequence of the present invention is based on the published Human protein sequence SEQ NO: 16723 (481 amino acids long) sequence, with a new sequence having a length of 30 amino acids on the N-terminal side and a new sequence having a length of 235 amino acids on the C-terminal side. An array has been added. In the application of Human protein sequence SEQ NO: 16723 (481 amino acids long) in EP 1074617-A2, the amino acid sequence of a polypeptide fragment is simply described as a protein for treating various diseases, and its function is unknown. In contrast to the 481 amino acid sequence, the 749 amino acid sequence of the polypeptide of the present invention was 265 amino acids longer than the 484 amino acids having homology.
In addition, International Publication No. WO 01/34767 (Title of Invention: Human gene 18 encoded secured protein HDPML23 variant, SEQ ID NO: 181, Applicant: HUMAN GENEME SCI INC., Pub. secreted protein HDPML23 variant, SEQ ID NO: 181 (835 amino acids long), sequence 1-259 (259 amino acids long), and partial sequence of polypeptide of the present invention (749 amino acids long), ie, amino acid sequence 464- Slightly higher homology was observed with the sequence of 728 (265 amino acids long) (about 78.2%).
SEQ ID NO: 181 (835 amino acids in length) is a variant of Human gene 18 encoded secured protein HDPML23, and merely describes the amino acid sequence of a polypeptide fragment as a protein for treating various diseases, but its function is unknown. is there. This protein is a completely different protein molecule, with only homology to 265 amino acids out of the 749 amino acids length of the polypeptide of the present invention.
Regarding the amino acid sequence (749 amino acids in length) of the polypeptide of the present invention, as described above, the fragment having a length of 481 amino acids and the fragment having a length of 259 amino acids with respect to the previously applied sequence were respectively Although somewhat high homology was observed, it did not cover the entire length of the amino acid sequence (749 amino acids in length) of the polypeptide of the present invention, and was only related to some shorter sequences.
[0044]
Searching the database on the base acid sequence of the published gene revealed that there were several reports of partial sequences having homology with a part of the sequence of the mpf01029 base sequence (6,521 bases) of the present invention. There were no reports to cover. Specifically, the nucleotide sequence having a length of 6,521 bases of the present invention was longer than the published nucleotide sequence shown below, and addition of a new sequence was recognized.
1) International Publication No. WO 02/29103 (Title of the Invention: Gene # 1659 used to diagnosis river cancer, Application: GENE LOGIC INC., Publication date: All lengths of Gene 18 and # 1659 of Apr-11-2002) ) And a part (sequence 2,186-3,037,852 bases) of the base sequence (6,521 bases) of the present invention. 1,022-1,811 (790 base length) and a part of the base sequence (6,521 base length) of the present invention (sequence 4,645-5,434,790 base length); 893-3,052 (160 bases long) and a part of the base sequence (6,521 bases long) of the present invention (sequence 6,234 -6,394,161 bases long), and a part of the base sequence (6,521 bases long) of the sequence 5-94 (90 bases long) (sequence 2,097-2,186,90 bases long). Base length) and a part of the base sequence (6,521 base length) of the present invention (sequence 3,437-6,506,70 base length). And a relatively high homology of about 87.8%, about 86.8%, about 93.8%, about 93.3 and about 90.0%, respectively.
2) International Publication No. WO 01/34767: Human secreted protein-encoding gene 18 cDNA clone HDPML23, SEQ ID NO: 28. (Applicant: HUMAN GENOME SCI INC., Publication date: May-17-2001) SEQ ID NO: 28 (total 4,062 nucleotides in length) Sequence 966-1,817 (852 nucleotides in length) and the base of the present invention A part of the sequence (6,521 bases) (sequence 2,186-3,037,852 bases) and the sequence 4,645-5,434 (790 bases) and the nucleotide sequence of the present invention ( 6,521 base length) (sequence 1, 833-2, 625, 790 base length) and the sequence 263-908 (646 base length) and the base sequence (6,521 base length) of the present invention. ) (SEQ ID NO: 3, 541-2, 186, 645 bases) and SEQ ID NO: 3,707-3,866 (160 bases) and the nucleotide sequence of the present invention (6,521 salt) Length) (sequence 6, 234-6, 394, 161 nucleotides in length), and further the sequence 3,916-3, 985, 70 nucleotides in length) and the nucleotide sequence of the present invention (6,521 nucleotides in length). About 87.8%, about 86.7%, about 88.2%, about 90.0, and about 90.0% of a part (sequence 6,437-6,506, 70 bases long) High homology was observed.
Regarding 1) and 2), the total length is different but basically contains many homologous sequences. The sequences 1) and 2) and the sequence of the gene of the present invention are, as shown above, Although a somewhat high homology is observed in a fragmentary manner, it is judged to be a completely different novel sequence.
[0045]
From the results of the above homology search, the candidate clone mpf01029 shows a high homology with the human KIAA0646 gene, has a structure in which a new sequence has been added to the human KIAA0646 gene, and has a partially similar gene. However, it has been found that the gene is a completely novel gene for which there is no known sequence for the full length.
[0046]
(3) Motive search
Regarding the DNA of the present invention, pftools (Bairoch A, Bucher P, Hofmann K, Nucleic Acids Res. 1997 Jan 1; 25 (1): 217-21), and Pfams, which are protein analysis programs for searching for PROSITE database. A protein analysis program hmmer 2.1 for searching (Sonhammer, ELL, Eddy, SR, Birney, E., Bateman, A., and Durbin, R., Nucleic Acids Res 1998; 26; , 320-322) for motif search (Suyama et. Al. 1999 Nucleic Acids Res. 27: 338-339). The DNA of the present invention has 6,521 base pairs and encodes a repeptide consisting of 749 amino acids. The amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA of the present invention may have an FHA (Forkhead-associated) domain on the N-terminal side and a RING finger and a D111 / G-patch domain on the C-terminal portion. It turned out (FIG. 1). In detail, according to the ProfileScan search method, the FHA (Forkhead-associated) domain is located at the N-terminal side at positions 68 to 122 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the sequence is also determined by the HMMPfam search method and the HMMSmart search method. In the amino acid sequence shown in No. 1, FHA (Forkhead-associated) domains were found at positions 68-139 and 67-122, respectively.
On the C-terminal side, according to the ProfileScan search method, the RING finger domain is located at positions 436 to 474 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and both are located at positions 436 to 473 according to the HMMPfam search method and the HMMSmart search method. The RING finger domain was found. Furthermore, on the C-terminal side, the D111 / G-patch domain is located at positions 556 to 602 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 according to the ProfileScan search method, and 556-602 each according to the HMMPfam search method and the HMMSmart search method. The D111 / G-patch domain was also found at the 600th and 554th to 600th positions.
[0047]
(4) Expression frequency at mRNA level
Regarding the expression of the human KIAA0646 gene at the mRNA level, moderate expression was observed in the brain, fetal brain, spinal cord, and testis, but there was no characteristic finding (http: //www.kazusa.or). Jp / huge / gfpage / KIAA0646 /, DNA Research, 1998 5: 169-176). Therefore, for the mouse KIAA0646 gene, which is one of the genes of the present invention, the tissue-specific and developmental stage-specific expression of the mouse KIAA0646 gene was analyzed by RT-PCR. Forward primers and reverse primers necessary for amplifying and detecting the transcript of the mouse KIAA0646 gene by PCR were synthesized using a commercially available automatic DNA synthesizer. The sequence of the forward primer was 5'-CCAGTGTCTGGTTTCTTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 3) and the sequence of the reverse primer was 5'-TTTTTAGGCTGCTCTCCCCTG-3' (SEQ ID NO: 4). The design was such that a 525 bp DNA fragment was obtained when the transcript was amplified by the RT-PCR method. Using the mRNA prepared from each mouse tissue as a material, Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech Cat. No. # K1432-1, manufactured by Clontech) which has been prepared by reverse transcriptase (RT) up to the first strand cDNA. Using # K1430-1), analysis was performed as follows by the method shown by Clontech. That is, the first strand cDNA of each mouse tissue and the above-mentioned primers were mixed respectively, and PCR was performed for each of them to amplify a DNA fragment of about 525 bp DNA length in the transcript of the mouse KIAA0646 gene. PCR was performed by using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo, # RP001A) as a Taq polymerase, heating the above DNA mixture at 95 ° C (2.5 minutes), and then heating at 95 ° C (30 seconds) / 60 ° C ( A cycle of (30 seconds) / 72 ° C. (30 seconds) was repeated 30 times. A G3PDH transcript-derived approximately 938 bp DNA fragment was amplified in the same manner using a G3PDH primer (# 5406-1) provided by Clontech as a control. The amplified PCR product was fractionated by electrophoresis using a 2% agarose gel (manufactured by Rockland, # 50070) together with a size marker, and the amount of the fractionated PCR product was compared semi-quantitatively (FIG. 2). ). As a result, about 525 bp DNA fragment derived from the mouse KIAA0646 gene was specifically amplified in various organs or universally in each developmental process among the examined cDNA panels of each tissue or developmental process. It was detected as a band of moderate intensity.
In FIG. 2, G3PDH at the bottom shows the expression pattern of the housekeeping gene (G3PDH) used as a control. Therefore, from the above results, it can be said that the polypeptide encoded by the gene of the present invention is highly likely to be universally involved in development / differentiation and functional maintenance in various organs.
[0048]
(5) Function estimation of the gene of the present invention
The amino acid sequence of the polypeptide encoded by the mpf01029 gene of the present invention has FHA (Forkhead-associated) at its N-terminal side and RING finger domain at its C-terminal side, similarly to the human KIAA0646 gene. In addition, the novel sequence added to the C-terminal side is characterized by the presence of the D111 / G-patch domain. RING finger is a modification of Zn finger. C3H4 type RING finger whose cysteine and histidine patterns are C3H4 in the RING finger domain is thought to bind to two Zn atoms in the motif to form a higher-order structure. (Yasuhiro Miyauchi et al., Experimental Medicine, 2000, 18: 2581-2586). The RING finger of the C3H4 type itself has E3 ubiquitin-protein ligase activity (Barinaga, M., 1999, Science, 286: 223-225). The ubiquitin-proteasome system plays an extremely important role in the growth and differentiation of various cells in mammals because it regulates important reaction systems in vivo by decomposing specific proteins. Since the RING finger protein has been reported as various gene products related to carcinogenesis, signal transduction, development, apoptosis, and cell cycle, it is closely related to human diseases and aging. For example, the Parkin protein, which is a causative gene of familial Parkinson's disease, has a RING finger motif, and it has been shown that this motif is essential for the activity of the protein (Shimura, H., et. Al, Nature Genet). , 2000, 25: 302-305, Shimura, H., et al., 2001, Science, 293: 263-269).
As a RING finger protein having an FHA domain (Hofmann, K. and Bucher, P., 1995, Trends Biochem. Sci., 20: 347-349), a yeast Yhr115C protein (all 416 amino acids) is known (Durocher, 1993). D and Jackson, SP, 2002, FEBS letters, 513: 58-66). The FHA domain is characterized by a sandwich structure in which eight β-sheets are folded, and the structure recognizes a phosphorylated threonine-containing peptide site (p-T containing peptide). Important proteins involved in regulation in vivo such as kinases, phosphatases, kinesin transcription factors, RNA-binding proteins, and metabolic enzymes are known as activating proteins in which a state having a phosphorylated threonine epitope exists. The FHA domain is involved in the detection of activated and activated states (Durocher, D and Jackson, SP, 2002, FEBS letters, 513: 58-66). The FHA domain binds to a phosphorylated peptide and participates in signal transduction and the like, and the C3H4 type RING finger domain found in the polypeptide of the present invention is involved in the degradation of specific proteins by ubiquitination. Since it has been reported (Yasuhiro Miyauchi et al., Experimental Medicine, 2000, 18: 2581-2586, Durocher, D and Jackson, SP, 2002, FEBS letters, 513: 58-66), the polypeptide of the present invention is Obviously, it is involved in important functions in the cell.
In addition, the D111 / G-patch domain found near the C-terminus of the polypeptides of the present invention has recently been found to be a novel glycine-rich, approximately 40 residue long RNA binding module, Alternatively, it has been reported that they bind to DNA and are involved in cancer suppression, repair of DNA damage, and the like, and that they are involved in mRNA maturation in the nucleus such as processing of RNA, thereby having important regulatory functions (Aravind, L.). , & Koonin, EV, 1999, Trends Biochem. Sci., 24: 342-344). From these, it is easily presumed that the gene encoding the polypeptide of the present invention is mainly located in the nucleus and is involved in important intracellular processes such as DNA repair, mRNA splicing, signal transduction and proteolysis. You.
[0049]
To date, there is no report on a polypeptide having three domains, FHA, RING finger, and D111 / G-patch domain. In addition, the gene sequence of the present invention encoding the amino acid sequence having the FHA, RING finger and D111 / G-patch domain was found to be universally expressed in all tissues as a result of expression frequency analysis at the mRNA level. Was found to be expressed in all stages of development, suggesting that the protein encoded by the gene of the present invention may play an important role in controlling cell growth and differentiation in all tissues. This was shown for the first time.
The C3H4-type RING finger domain found in the polypeptide of the present invention is considered to be a domain involved in ubiquitination as described above, and the polypeptide of the present invention is used for regulating the intracellular content of a specific protein. Presumed to be involved. The protein of the present invention having FHA, RING finger and D111 / G-patch domain has both a function of detecting a phosphorylated specific protein, a function of degrading the specific protein, and an RNA binding activity of the D111 / G-patch domain. Therefore, it can be said that it is a novel protein that plays important functions related to the detection of activating proteins, regulation by degradation of specific proteins, DNA repair, and maturation of mRNA, and forms the center of in vivo complex proteins in various organs involved in those important functions. It can be said that.
The polypeptide of the present invention is a polypeptide having a novel FHA, RING finger and D111 / G-patch domain, which is characterized by being strongly expressed in all tissues. It is clear that the present invention is useful for preservation and elucidation of pathological conditions related to systemic organs (for example, canceration and aging) and the development of preventive drugs, therapeutic drugs, and test drugs thereby, which is an excellent point of the present invention. In addition, the use of the recombinant protein of the present invention or a recombinant expressing the recombinant protein is excellent in that it can be used for agonist and antagonist screening or drug design research.
[0050]
Examination of the expression of the mRNA level of the human KIAA0646 gene revealed no characteristic expression organ (DNA Research, 1998 5: 31-39). Since the mpf01029 gene of the present invention is ubiquitously expressed in various organs, it is universally used for growth and functional maintenance in various organs, or for proliferation of cells such as cancer, autoimmune disease and allergy in various organs. It is useful for elucidating the mechanisms of related diseases and human diseases including abnormalities of differentiation such as aging or congenital malformation, and developing diagnostic / therapeutic drugs and test drugs. By using the recombinant protein of the present invention or a recombinant expressing the recombinant protein, it can be used for screening of agonists and antagonists or for drug design research.
[0051]
As described above, the gene encoding the polypeptide having the FHA, RING finger, and D111 / G-patch domains, which are extremely important for cell proliferation / differentiation and aging, can itself be directly a disease-causing gene. For example, the human Breastcancer-1 gene encoding the RING finger protein is associated with ovarian, breast-ovarian cancer (Serova, O., et. At., 1996, AmJ Hum Genet. 58: 42-51). The Parkin protein, which is a causative gene of familial Parkinson's disease, has a RING finger motif, and it has been shown that this motif is essential for the activity of the protein (Shimura, H., et. Al, Nature Genet). , 2000, 25: 302-305, Shimura, H., et al., 2001, Science, 293: 263-269). In addition, the CHFR gene, including both FHA and RING finger, is involved in cancer progression (Aravind, L., & Koonin, EV, 1999, Trends Biochem. Sci., 24: 342-344). Further, the LUCA15 gene having a G-patch domain is associated with lung cancer (Aravind, L., & Koonin, EV, 1999, Trends Biochem. Sci., 24: 342-344).
From these findings, DNA relating to the polypeptide having the FHA, RING finger and D111 / G-patch domain of the present invention, a gene containing the DNA, a polypeptide encoded by the DNA, and a recombinant protein containing the polypeptide It is strongly suggested that they are universally involved in the regulation of cell proliferation or differentiation in various organs, as well as in elucidating pathological conditions related to the function maintenance and aging of these organs.
[0052]
【The invention's effect】
The human KIAA0646 gene does not have a motif structure for estimating its function, and it was difficult to estimate its function and it was completely unknown. Here, the present inventors cloned a gene (DNA) showing high homology to the human KIAA0646 gene from a cDNA library derived from mouse fetal tail bud, and newly added DNA sequences to the N-terminal side and the C-terminal side. KIAA0646 gene was successfully obtained.
[0053]
From what has been described above, the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention, or the antibody of the present invention include diseases related to cell proliferation such as cancer, autoimmune diseases and allergies, and abnormalities of differentiation such as congenital malformations. It is considered to play an indispensable role in elucidating the mechanism of human diseases and in diagnosing and treating them, and in preserving the functions of various organs and preventing aging. In addition, expression pattern information at each tissue and developmental stage by expression frequency analysis at the mRNA level is universal and particularly high in expression level in various organs, and is universally high in each developmental process. The present inventors have clarified that the gene of the present invention is particularly important in the universal development and differentiation of various organs, its function maintenance, and aging.
Accordingly, the DNA of the present invention and a gene derived from a mammal containing the DNA, a part or the full length of a polypeptide encoded by the DNA, an antibody against the part or the full length of the polypeptide, an antisense DNA, etc. can cause cancer or congenital malformation. It can be used as a medicine in the development of various treatment / prevention methods using mice, which are model animals for treating human diseases, including humans.
[0054]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows FHA, RING finger and D111 / G-patch domain (proline-rich region) newly recognized in the polypeptide of the present invention (aa: number of amino acids in amino acid sequence, box: from top) The FHA, RING finger and D111 / G-patch domains identified by different search methods using the HMMPfam search method, the HMMSmart search method, and the ProfileScan search method are shown).
From these results, the FHA, RING finger, and D111 / G-patch domains were newly identified by the ProfileScan search method, the HMMPfam search method, and the HMMSmart search method, respectively.
FIG. 2 is a comparison of the expression intensity of the mpf01029 (mouse KIAA0646) gene in each mouse tissue and each developmental stage by RT-PCR. The upper part shows the expression intensity of the mpf01029 gene, and the lower part shows the expression intensity of the housekeeping gene (G3PDH) used as a control as a photograph of ethidium bromide staining pattern after fractionation by agarose electrophoresis.

Claims

DNA consisting of the following nucleotide sequence encoding the polypeptide of (a) or (b): (a) consisting of part or all of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide; or (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which some amino acids are deleted, substituted or added, and are substantially the same as the polypeptide of (a). A polypeptide having a biological activity.

DNA of the following (a), (b) or (c): (a) DNA encoding part or all of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2; b) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA of (a); or (c) a DNA that is stringent with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA of (a). A DNA that hybridizes under the conditions and encodes a protein having substantially the same biological activity as the polypeptide encoded by the DNA of (a).

A mammal-derived gene comprising the DNA according to claim 1.

A gene derived from a rodent, wherein the mammal according to claim 3 is a rodent.

A mouse gene wherein the rodent of claim 4 is a mouse.

A polypeptide of the following (a) or (b): (a) a polypeptide consisting of part or all of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; or (b) a sequence In the amino acid sequence represented by No. 1, part or all of the amino acid sequence in which some amino acids have been deleted, substituted or added, has substantially the same biological activity as the polypeptide of (a). Polypeptide.

The polypeptide according to claim 6, which is a recombinant protein produced in a host cell into which the DNA according to claim 1 or 2 or the gene according to any one of claims 3 to 5 has been introduced.

A recombinant vector comprising the DNA according to claim 1 or 2, or the gene according to any one of claims 3 to 5.

An antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 6.