JP2004173637A

JP2004173637A - New gene and protein encoded thereby

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Publication number: JP2004173637A
Application number: JP2002346611A
Authority: JP
Inventors: Daisuke Nakajima; 大輔中島; Osamu Obara; 收小原; Takahiro Nagase; 隆弘長瀬
Original assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation
Current assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2002-11-29
Publication date: 2004-06-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To directly clone a new DNA containing a region encoding a protein from a cDNA library derived from the human adult whole brain and human fetal whole brain, determine the base sequence and identify the functions of the sequences. <P>SOLUTION: The DNA contains a base sequence encoding the polypeptide of the following (a) or (b): (a) a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as a specific amino acid sequence derived from human brain; and (b) a polypeptide having a specific amino acid sequence of the human brain provided that a part of the amino acids are deleted, substituted or added and having substantially the same biological activities as the functions of the polypeptide (a). The invention further provides a recombinant polypeptide encoded by the DNA and a protein containing the polypeptide. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、並びに該ＤＮＡにコードされる組換えポリペプチド及び該ポリペプチドを含む新規組換え蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム計画における大規模シークエンシングによって、２００１年２月にヒトゲノムドラフト配列が公開された。
ヒトゲノム計画の最終目的は単にゲノム全塩基配列を決定することではなく、その構造情報、即ち、ＤＮＡの塩基配列情報からヒトのさまざまな生命現象を読み解くことにあろう。
ヒトゲノム配列中で蛋白質をコードしている領域はそのごく一部であり、現在は、ニューラルネットワークや隠れマルコフモデルと呼ばれる情報科学の手法を用いて、そのコード領域の予測が行われている。しかしながら、それらの予測精度はまだ充分なものではない。
【０００３】
【非特許文献１】
ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ．４，５３−５９（１９９７）
【非特許文献２】
ＮｕｃｒｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２９，ｅ２２（２００１）
【非特許文献３】
ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ．９，４７−５７（２００２）
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
今回、本発明者は新規な遺伝子を見出すべく、ヒト成人全脳及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、蛋白質をコードしている領域を含む新規なＤＮＡを直接クローニングすることに成功し、それらの塩基配列を決定して本発明を完成させた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号：１乃至４のいずれか一つで示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号：１乃至４のいずれか一つで示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号：１乃至４のいずれか一つで示される塩基配列において、夫々の配列で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう。又、本発明はこれらＤＮＡを含む遺伝子にも係る。
更に、本発明は上記ＤＮＡ又は遺伝子にコードされる組換えポリペプチド（以下、「本発明ポリペプチド」ともいう。）、及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質に係る。
【０００６】
本発明ＤＮＡを有するクローンの名称、本発明ポリペプチド又は蛋白質の長さ、その機能については、表１に示されている。
本発明ＤＮＡは、市販されている（クロンテック社製）、ヒト成人全脳及びヒト胎児全脳のｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。
即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ．４，５３−５９（１９９７），ＮｕｃｒｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２９，ｅ２２（２００１）及びＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ．９，４７−５７（２００２））に従って調製したヒト成人全脳及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーからクローンをランダムに単離する。
これらの末端塩基配列を解析後、これらの配列をクエリーとして既知遺伝子のデータベースにて相同性検索を行い、その結果、新規であることが判明したクローンについて、ｃＤＮＡの５’および３’の末端配列をヒトのゲノム配列に対応させ、それらが挟む領域に未知の長鎖遺伝子が確認された場合には、そのｃＤＮＡの全長解析をおこなう。
ｃＤＮＡライブリーから単離した約１０万個のクローンの５’及び３’の末端配列と約２０００個のクローンの全長配列をアッセンブルし、同じ遺伝子由来のｃＤＮＡクローンのグループ化を行い、５’や３’末端欠損クローンやフレームシフトクローンを相補させることにより、完全な遺伝子を分取することが可能である。
このようにして既知の遺伝子に依存した従来のクローニング方法では得られなかった未知の遺伝子も、システマチックにクローニングを行なうことができる。又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、本発明ＤＮＡを含むヒト由来遺伝子の全領域を調製することも可能である。
更にＲＡＣＥ法とＬｉｃ（ｌｉｇａｓｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｌｏｎｉｎｇ）法（ＮｕｃｒｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２５，４１６５−４１６６（１９９７）を組み合わせることにより、一回のＲＡＣＥ法で、複数のクローンのＮ末が分取され、かつ、これが元のクローンに連結された完全長クローンを得ることができる。
【０００７】
更に、本発明は、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又はその塩の製造方法、及び、こうして得られる本発明ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質又はその塩を提供する。
【０００８】
又、本発明は、本発明ＤＮＡ又は遺伝子を含有してなる医薬、本発明ポリペプチド若しくはその部分ポリペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、それら塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド、該ポリヌクレオチド又はアンチセンスヌクレオチドを含有してなる医薬、本発明ポリペプチド若しくはその部分ポリペプチド、及び、該ポリペプチド又はそれらを含む組換え蛋白質を含有してなる医薬に係る。
更に、本発明は、本発明ポリペプチド若しくはその部分ポリペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質又はそれらの塩に対する抗体、及び、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質又はそれらの塩、又はそれらに対する抗体を用いることを特徴とする、それら物質と特異的に相互作用する物質のスクリーニング方法、スクリーニング用キット、並びに、該スクリーニング方法によって同定される物質（化合物）自体等にも係る。
【０００９】
更に、本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて得られる、所謂、ＤＮＡチップ（アレイ）、プロテインチップにも係る。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明ＤＮＡとしては、前述した本発明ポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。また、ヒトの脳、又は、それ以外の組織、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、等の細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応：ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｃｏｕｐｌｅｄＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１１】
配列番号：１乃至４のいずれか一つで示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１乃至４のいずれか一つで示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上であるアミノ酸配列を意味する。
従って、本発明の配列番号：１乃至４のいずれか一つで示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の各配列番号で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、各配列番号で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドを挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性（機能）が性質的に同質であることを示す。
又、本発明ポリペプチドには、例えば、配列番号：１乃至４のいずれか一つで示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１乃至４のいずれか一つで示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドも含まれる。
【００１２】
上記の配列番号：１乃至４のいずれか一つで示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同質の生物学的活性を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同質の生物学的活性の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００１３】
更に、本発明ＤＮＡは、配列番号：１乃至４のいずれか一つで示される塩基配列において、夫々の配列で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、即ち、より具体的には、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、各配列で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡを包含する。
かかる条件下で、配列番号：１乃至４のいずれか一つで示される塩基配列において、夫々の配列で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。
ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃の１ｍＭＥＤＴＡナトリウム、０．５Ｍリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ水溶液中でハイブリダイズさせ、６５℃の１ｍＭＥＤＴＡナトリウム、４０ｍＭリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ水溶液中でメンブレンを洗浄する条件でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１４】
本発明ＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明ポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明ポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、上記のＣｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８７）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００１５】
本発明の蛋白質の発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス等を利用することが出来る。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００１６】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（オリジン）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
【００１７】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））等が用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキアパストリス（Ｐｉｃｊｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００１８】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００１９】
このようにして得られた、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２０】
上記培養物から本発明ポリペプチド又は蛋白質を分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭ（商標）などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
こうして得られた本発明ポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００２１】
本発明ポリペプチド（蛋白質）は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
【００２２】
本発明ポリペプチド（蛋白質）がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００２３】
本発明の蛋白質の部分ポリペプチドとしては、前記した本発明ポリペプチド（蛋白質）の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明ポリペプチド（蛋白質）の構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。本発明の部分ポリペプチドとしては、例えば、各機能ドメインを含むものが好ましい。又、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発明の部分ペプチドは、例えば、試薬、実験の際の標準物質、又は免疫原若しくはその一部として使用することが出来る。
【００２４】
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２５】
本発明ポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することも出来る。
例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００２６】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルホキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２７】
本発明の部分ペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（２）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（３）矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成広川書店
反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２８】
本発明ポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、それらを認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明ポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明ポリペプチド（蛋白質）等を検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明ポリペプチド（蛋白質）の検出、被検細胞内における本発明ポリペプチド（蛋白質）の挙動の分析などのために使用することができる。
【００２９】
更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明ポリペプチド（蛋白質）等の定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、及び組織染色等による検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明ポリペプチド（蛋白質）等が関与する疾病の診断を行なうことができる。
これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることが出来る。
【００３０】
これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＡ））、同書Ｖｏｌ．７３（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．７４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＣ））、同書Ｖｏｌ．８４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＥ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＧｅｎｅｒａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＩ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３１】
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）としては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３２】
更に、本発明ポリペプチド（蛋白質）等は、これら物質と特異的に相互作用する化合物をスクリーニングする為の試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明ポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチド若しくはそれらの塩、又はそれらに対する抗体を用いることを特徴とする、該物質又はそれらの塩と特異的に相互作用する化合物のスクリーニング方法、及びその為のスクリーニング用キットを提供する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて同定される化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明ポリペプチド（蛋白質）等と相互作用し、その生物学的活性を調節、阻害、促進、又は拮抗等する化合物である。該化合物またはその塩は、本発明の蛋白質等の活性に直接作用するものであってもよいし、本発明ポリペプチド（蛋白質）等の発現に作用することによって間接的に本発明ポリペプチド（蛋白質）等の活性に作用するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明ポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。
【００３３】
本発明ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子をプローブとして使用することにより、本発明ポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
更に、本発明ＤＮＡ又は遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明ＤＮＡ又は遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明の蛋白質等を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。
本発明ＤＮＡ又は遺伝子を、該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
【００３４】
本明細書および表面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記のＣｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，
１９８７）に記載されている方法に従った。
【００３６】
（１）ヒト成人全脳及びヒト胎児全脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築（その１）
ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）_１５）（インビトロジェン）をプライマーとして、ヒト成人全脳びヒト胎児全脳由来ｍＲＮＡ（クローンテック社製）を鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（インビトロジェン社製）をｃＤＮＡとライゲーションした。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融解アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。
精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポレーション法によりこの組換えプラスミドを導入した。
【００３７】
（２）スクリーニング
ランダムに単離したクローンの末端塩基配列を決定し、得られた配列をクエリーとして相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．２．３（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳｔｅｐｈｅｎＦ．，ＴｈｏｍａｓＬ．Ｍａｄｄｅｎ，ＡｌｅｊａｎｄｒｏＡ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＪｉｎｇｈｕｉＺｈａｎｇ，ＺｈｅｎｇＺｈａｎｇ，ＷｅｂｂＭｉｌｌｅｒ，ａｎｄＤａｖｉｄＪ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）， ”ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ”，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて、ｎｒ（ＡｌｌＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｂｕｔｎｏＥＳＴ，ＳＴＳ，ＧＳＳ，ｏｒｐｈａｓｅ０，１ｏｒ２ＨＴＧＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））データベースに対して相同検索を行った。その結果、相同遺伝子が存在しなかったもの、即ち、新規遺伝子であるものについて、その５’および３’の末端配列を、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．２．３を用いて、ヒトのゲノム配列（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）に対応させた。次に、それらが挟むゲノム領域から、Ｇｅｎｓｃａｎプログラム（Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．ａｎｄＫａｒｌｉｎ，Ｓ．１９９７，ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ，ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８，７８−９４、ゲノムから遺伝子を予測するコンピューターソフト）を用いて、コードされる遺伝子を抜き出した。これをクエリーとして、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．２．３を用いて、ｍｅｒｇｅｄｂ（かずさＤＮＡ研究所で決定したヒトのｃＤＮＡの配列とＧｅｎＢａｎｋのｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓデータベースからＥＳＴとゲノムを除いたものを重複なく混ぜ合わせた、かずさＤＮＡ研究所で独自に作成したＤＮＡ配列データベース）に対応させ、新規の長鎖（Ｇｅｎｓｃａｎ予想ｃｄｓが１２００ｂｐ以上）遺伝子が確認された場合には、ｃＤＮＡの全長解析をおこなった。
配列決定には、ＰＥアプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
このようにして新規ＤＮＡ又は遺伝子のスクリーニングを行なった。その結果、配列表の配列番号１乃至４のいずれか一つに示された新規ＤＮＡ又は遺伝子が検出された。
これらの新規ＤＮＡ又は遺伝子について、上記の配列決定方法によりその塩基配列を決定した。本発明ＤＮＡ又は遺伝子を有するクローンの名称は表１に示されている。
【００３８】
（３）本発明ＤＮＡの相同性検索
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、クローンのアミノ酸配列を既知配列ライブラリーｎｒに対して解析プログラムＢＬＡＳＴＰ２．２．３（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳｔｅｐｈｅｎＦ．，ＴｈｏｍａｓＬ．Ｍａｄｄｅｎ，ＡｌｅｊａｎｄｒｏＡ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＪｉｎｇｈｕｉＺｈａｎｇ，ＺｈｅｎｇＺｈａｎｇ，ＷｅｂｂＭｉｌｌｅｒ，ａｎｄＤａｖｉｄＪ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）， ”ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ”，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて検索したところ表２に示した各相同遺伝子と相同性を示すことが明らかになった。尚、表２には、これら相同遺伝子に関する情報、即ち、その名称、データベースＩＤ、生物種、蛋白質長、及び記載文献が挙げられている。又、これら各表中の「生物種」の略号の意味は表３で説明されている。
【００３９】
更に、各クローンに含まれる本発明ＤＮＡ又は遺伝子と表２に示した各相同遺伝子との相同性に関する各種データを表４にまとめた。これら表中の各項目の意味は以下の通りである。
「相同領域クローン」クローンの相同領域の起点及び終点
「相同領域相同遺伝子」相同遺伝子の相同領域の起点及び終点
「Ｓｃｏｒｅ」この値が高いほど信頼度が高い
「Ｅ−ｖａｌｕｅ」この値が０に近いほど信頼度が高い
「相同性」相同領域のアミノ酸残基の一致の割合
「相同範囲率」相同遺伝子中の相同領域の割合
【００４０】
（４）各種ドメインの検索
次に、クローンに含まれるＤＮＡがコードするアミノ酸配列中から、Ｐｆａｍ７．７に含まれる検索ツールＰｆａｍＨＭＭｖｅｒ２．１Ｓｅａｒｃｈ（ＨＭＭＰＦＡＭ）（ＳｏｎｎｈａｍｍｅｒＥＬＬ，ＥｄｄｙＳＲ，ＢｉｒｎｅｙＥ，ＢａｔｅｍａｎＡ，ＤｕｒｂｉｎＲ（１９９８）Ｐｆａｍ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓａｎｄＨＭＭ−ｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２６：３２０−３２２）を用いて機能ドメインを検索した。
更に、膜蛋白予測プログラムであるＳＯＳＵＩｓｙｓｔｅｍ（ｖｅｒ．１．０／１０，Ｍａｒ．，１９９６）（ＴａｋａｔｓｕｇｕＨｉｒｏｋａｗａ，ＳｅａｈＢｏｏｎ−ＣｈｉｅｎｇａｎｄＳｈｉｇｅｋｉＭｉｔａｋｕ，ＳＯＳＵＩ：ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｅｃｏｎｄａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｆｏｒｍｅｒｌｙＣＡＢＩＯＳ）１９９８Ｍａｙ；１４（４）：３７８−３７９．）を用いて膜貫通ドメインを検索した。
これらの検出された機能ドメイン及び膜貫通ドメインを表５にそれぞれのクローンについて示した。
これら表中の各項目の意味は以下の通りである。
「機能ドメイン」ＰｆａｍＳＯＳＵＩにより検出されたドメイン
「クローンｆｒｏｍ」クローン機能ドメインの起点
「クローンｔｏ」クローン機能ドメインの終点
「相同遺伝子ｆｒｏｍ」相同遺伝子機能ドメインの起点
「相同遺伝子ｔｏ」相同遺伝子機能ドメインの終点
「Ｓｃｏｒｅ（Ｐｆａｍのみ）」この値が高いほど信頼度が高い
「Ｅｘｐ（Ｐｆａｍのみ）」この値が０に近いほど信頼度が高い
又、各機能ドメインの完全標記を表６に示した。
【００４１】
（５）発現部位
ＲＴ−ＰＣＲＥＬＩＳＡを用いて、配列番号１乃至４のクローンについて、組織と脳の部位での発現を調べた結果を表７に示した（ＮａｇａｓｅＴ，ＩｓｈｉｋａｗａＫ，ＳｕｙａｍａＭ，ＫｉｋｕｎｏＲ，ＭｉｙａｊｉｍａＮ，ＴａｎａｋａＡ，ＫｏｔａｎｉＨ，ＮｏｍｕｒａＮ，ＯｈａｒａＯ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｈｕｍａｎｇｅｎｅｓ．ＸＩ．Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１００ｎｅｗｃＤＮＡｃｌｏｎｅｓｆｒｏｍｂｒａｉｎｗｈｉｃｈｃｏｄｅｆｏｒｌａｒｇｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＤＮＡＲｅｓ．１９９８Ｏｃｔ３０；５（５）：２７７−８６．）。
発現量（単位（ｆｇ）ｐｅｒｎｇｏｆｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ）が０．１未満を「＋」、０．１以上１００未満を「＋＋」、１００以上を「＋＋＋」で示した。なお、調べていないものについては、「− 」で示した。
組織及び脳の部位の完全標記を表８に示した。
【００４２】
（６）染色体位置
クローンのＤＮＡ配列を、相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ２．２．３を用いてヒトゲノムをコードするクローンのライブラリー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／）に対応させた。対応したクローンの説明（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）の中からこのクローンが由来した染色体の番号を抽出し、これを表９に示した。
【００４３】
以上の、相同性、相同性遺伝子に関する情報、各種ドメイン、発現部位、及び染色体位置等に基づき、当業者であれば、本発明のＤＮＡ又は遺伝子が有する各機能を科学的に十分な蓋然性をもって予測することが出来る。
【００４４】
本発明で得られた新規なＤＮＡ又は遺伝子を所謂ＤＮＡチップ等に集積させ、これに、例えば、精神病等の脳が関与する疾患の患者と対照としての正常人の血液又は組織等から作成したプローブをハイブリダイゼーションさせることによって、これら疾患の診断、治療等に役立てることが出来る。
又、本発明のＤＮＡ若しくは遺伝子又はそれらの一部の塩基配列に基づき作成した合成ＤＮＡプライマーを使用し、ヒトの血液又は組織から抽出した染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、その産物の塩基配列を決定することにより、本発明のＤＮＡ又は遺伝子中にある個体によって異なる一塩基の変異、即ち、ｃＳＮＰｓを見出すことが出来る。これにより、個体の体質等が予測され、各自に適した医薬の開発等が可能となる。
【００４５】
又、クロスハイブリダイゼーションにより、マウス等のモデル生物における本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対するオルソログ（ホモログ、カウンターパート）遺伝子を単離し、例えば、これら遺伝子をノックアウトすることによってヒトの疾患モデル動物を作成し、ヒトの病因となる遺伝子を探索・同定することも可能である。
更に、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて所謂プロテインチップを作成し、患者と正常人との蛋白質発現量の差異を検出する等のプロテオーム解析から、病気の診断・治療等に役立てることが出来る。
【００４６】
【表１】

【００４７】
【表２】

【００４８】
【表３】

【００４９】
【表４】

【００５０】
【表５】

【００５１】
【表６】

【００５２】
【表７】

【００５３】
【表８】

【００５４】
【表９】

【００５５】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to DNA, a gene containing the DNA, a recombinant polypeptide encoded by the DNA, and a novel recombinant protein containing the polypeptide.
[0002]
[Prior art]
The human genome draft sequence was published in February 2001 by large-scale sequencing in the Human Genome Project.
The ultimate goal of the Human Genome Project is not simply to determine the entire nucleotide sequence of the genome, but to interpret various human phenomena from its structural information, that is, the nucleotide sequence information of DNA.
The region encoding a protein in the human genome sequence is only a small part, and the coding region is currently predicted using a neural network or an information science technique called a hidden Markov model. However, their prediction accuracy is not yet sufficient.
[0003]
[Non-patent document 1]
DNA Research Vol. 4, 53-59 (1997)
[Non-patent document 2]
Nucleic Acids Res. , 29, e22 (2001)
[Non-Patent Document 3]
DNA Research Vol. 9, 47-57 (2002)
[0004]
[Problems to be solved by the present invention]
This time, the present inventors succeeded in directly cloning a novel DNA containing a region encoding a protein from a cDNA library derived from human adult whole brain and human fetal whole brain in order to find a novel gene, The present invention was completed by determining their nucleotide sequences.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
That is, as a first aspect, the present invention relates to a DNA comprising a base sequence encoding the following polypeptide (a) or (b):
(A) a polypeptide consisting of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4,
(B) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, wherein the amino acid sequence has an amino acid sequence in which some amino acids have been deleted, substituted or added, and substantially has the function of the polypeptide of (a). A polypeptide having the same biological activity as the above.
According to a second aspect of the present invention, there is provided the following DNA (a) or (b):
(A) a DNA comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by any one of the nucleotide sequences represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4,
(B) a protein which hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA of (a) under stringent conditions and has a biological activity substantially the same as the function of the polypeptide of (a); DNA encoding.
The above DNAs according to the first and second aspects of the present invention are collectively referred to as “DNA of the present invention” hereinafter. The present invention also relates to genes containing these DNAs.
Furthermore, the present invention relates to a recombinant polypeptide encoded by the above DNA or gene (hereinafter, also referred to as “the polypeptide of the present invention”), and a recombinant protein containing the polypeptide.
[0006]
Table 1 shows the name of the clone having the DNA of the present invention, the length of the polypeptide or protein of the present invention, and the function thereof.
The DNA of the present invention is commercially available (manufactured by Clontech), using human adult whole brain and human fetal whole brain mRNA as a starting material, after isolating as a cDNA fragment from a cDNA library prepared by the present inventors, It was determined by determining the nucleotide sequence.
That is, specifically, the method of Ohara et al. (DNA Research Vol. 4, 53-59 (1997), Nucleic Acids Res., 29, e22 (2001) and DNA Research Vol. 9, 47-57 (2002)) Clones are randomly isolated from cDNA libraries derived from human adult whole brain and human fetal whole brain prepared according to the above.
After analyzing these terminal base sequences, a homology search was performed in a database of known genes using these sequences as a query, and as a result, the 5 ′ and 3 ′ terminal sequences of cDNA were determined for the clones that were found to be novel. Corresponds to the human genomic sequence, and if an unknown long-chain gene is found in the region flanked by them, full-length analysis of the cDNA is performed.
Assembling the 5 'and 3' terminal sequences of about 100,000 clones isolated from the cDNA library and the full-length sequence of about 2000 clones, grouping cDNA clones derived from the same gene, and performing 5 ' By complementing a 3'-terminal deletion clone or a frameshift clone, a complete gene can be isolated.
In this way, an unknown gene that cannot be obtained by a conventional cloning method depending on a known gene can be systematically cloned. The entire region of the human-derived gene including the DNA of the present invention can also be obtained by using a PCR method such as RACE while paying sufficient attention not to cause an artificial error in the short fragment or the obtained sequence. It is also possible to prepare.
Furthermore, by combining the RACE method and the Lic (ligase independent cloning) method (Nucleic Acids Res., 25, 4165-4166 (1997)), N-terminals of a plurality of clones can be separated by one RACE method, and This gives a full-length clone ligated to the original clone.
[0007]
Furthermore, the present invention provides a recombinant vector containing the DNA of the present invention or a gene containing the DNA of the present invention, a transformant carrying the recombinant vector, culturing the transformant, and the polypeptide of the present invention or the polypeptide. Producing, accumulating, and collecting the recombinant protein containing the polypeptide of the present invention, a method for producing the recombinant protein containing the polypeptide, or a salt thereof, and the present invention thus obtained. A peptide or a recombinant protein containing the polypeptide or a salt thereof is provided.
[0008]
The present invention also relates to a pharmaceutical comprising the DNA or gene of the present invention, a polynucleotide (DNA) containing a base sequence encoding the polypeptide of the present invention or a partial polypeptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide; An antisense nucleotide having a nucleotide sequence substantially complementary to the nucleotide sequence, a medicament comprising the polynucleotide or the antisense nucleotide, the polypeptide of the present invention or a partial polypeptide thereof, and the polypeptide or a mixture thereof The present invention relates to a medicine containing a recombinant protein.
Furthermore, the present invention provides an antibody against the polypeptide of the present invention or a partial polypeptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide or a salt thereof, and a recombinant polypeptide containing the polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof or the polypeptide. A method for screening for a substance that specifically interacts with a protein or a salt thereof, or an antibody against the substance, a screening kit, and a substance (compound) itself identified by the screening method Etc.
[0009]
Furthermore, the present invention comprehensively prepares the DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide, or an antibody against the DNA or gene of the present invention, and accumulates them. The present invention also relates to a so-called DNA chip (array) and protein chip obtained by the above method.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The DNA of the present invention may be any DNA as long as it comprises a base sequence encoding the polypeptide of the present invention described above. In addition, human brain, or other tissues, for example, heart, lung, liver, spleen, kidney, testis, cDNA identified and isolated from cells and tissues derived from cells and tissues such as, or, Any of synthetic DNAs may be used.
The vector used for the library construction may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, a reverse transcription transcriptase-polymerase chain reaction (Reverse Transcription coupled Polymerase Chain Reaction) (hereinafter abbreviated as "RT-PCR method") using a total RNA fraction or an mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues. ).
[0011]
An amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 means the degree of homology with the entire amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4. Mean an amino acid sequence that is on average about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more.
Therefore, the polypeptide of the present invention consisting of the amino acid sequence substantially the same as any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 includes, for example, Polypeptides having the above-mentioned homology and having substantially the same biological activity (function) as the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. Here, “substantially the same quality” means that their activities (functions) are the same in nature.
In addition, the polypeptide of the present invention includes, for example, a part (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, (Preferably, several amino acids) consisting of an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted or added, or an amino acid sequence obtained by combining them, and a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4. Also included are polypeptides having a biological activity (function) that is substantially the same as the function.
[0012]
A polypeptide consisting of an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence shown in any one of the above SEQ ID NOs: 1 to 4, or a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which some amino acids have been deleted, substituted or added The peptide can be easily prepared by appropriately combining well-known methods such as site-directed mutagenesis, gene homologous recombination, primer extension, and PCR.
In this case, in order to have substantially the same biological activity, among the amino acids constituting the polypeptide, homologous amino acids (polar / non-polar amino acids, hydrophobic / hydrophilic amino acids, positive / negative amino acids) Substitution between charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) is considered as a possibility. In order to maintain substantially the same biological activity, it is desirable that amino acids in the functional domains contained in each polypeptide of the present invention be retained.
[0013]
Further, the DNA of the present invention includes, in the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, a DNA containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by each sequence, and a stringent DNA with the DNA. Under specific conditions, that is, more specifically, the function of a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by each sequence which hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA under stringent conditions. And DNA encoding a polypeptide (protein) having the same biological activity (function).
Under such conditions, in the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, as a DNA capable of hybridizing with a DNA containing a base sequence encoding the amino acid sequence represented by each sequence, for example, A DNA containing a base sequence having a degree of homology with the entire base sequence of DNA of about 80% or more, preferably about 90% or more, and more preferably about 95% or more on the average on the whole may be mentioned. .
Hybridization can be performed by a method known in the art, such as a method described in Current protocols in molecular biology (edited by Frederic M. Ausubel et al., 1987) or a method similar thereto. It can be performed according to the method. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
Here, "stringent conditions" refers to, for example, hybridization in an aqueous solution of 1 mM sodium EDTA, 0.5 M sodium hydrogen phosphate (pH 7.2), 7% SDS at 65 ° C., and 1 mM sodium EDTA at 65 ° C. These conditions are such that they hybridize to the DNA probe of the present invention by Southern blot hybridization under conditions that wash the membrane in an aqueous solution of 40 mM sodium hydrogen phosphate (pH 7.2) and 1% SDS.
[0014]
As a means for cloning the DNA of the present invention, the DNA of the present invention can be amplified by PCR using a synthetic DNA primer having an appropriate nucleotide sequence such as a portion of the polypeptide of the present invention, or the DNA incorporated into an appropriate vector can be Can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the DNA or a DNA fragment labeled with a synthetic DNA.
Hybridization can be carried out, for example, according to the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
The DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
[0015]
The expression vector for the protein of the present invention can be prepared according to a method known in the art. For example, it can be produced by cutting out (1) a DNA fragment containing the DNA of the present invention or a gene containing the DNA of the present invention, and (2) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC118), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. Animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus can be used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when the host is Escherichia coli, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, and the like are used. When the host is Bacillus subtilis, the host is yeast, such as the SPO1, SPO2, and penP promoters. In some cases, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When animal cells are used as hosts, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
[0016]
In addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 origin of replication (origin) and the like known in the art can be added to the expression vector, if desired. Further, if necessary, the protein encoded by the DNA of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein (eg, glutathione S-transferase and protein A). Such a fusion protein can be cleaved using an appropriate protease and separated into respective proteins.
[0017]
Examples of the host cell include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12.DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 30). 1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)) and the like.
As the Bacillus bacterium, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizosacciamyces pombiCiPiCi, and YC, Nippon Caspica, Nippon, Japan). Can be
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient CHO cells, mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, Human FL cells and the like are used.
[0018]
Transformation of these host cells can be performed according to methods known in the art. For example, the following documents can be referred to.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978); Cell Engineering Annex 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha); and Virology, 52, 456 (1973).
[0019]
The thus obtained transformant transformed with the expression vector containing the DNA of the present invention or a gene containing the DNA of the present invention can be cultured according to a method known in the art.
For example, when the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, culturing is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours using a medium adjusted to a pH of about 5 to 8, if necessary, by aeration or the like. Stirring can also be added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours using a medium whose pH is adjusted to about 6 to 8, and if necessary, aeration or the like is carried out. Stirring can also be added.
[0020]
In order to separate and purify the polypeptide or protein of the present invention from the above culture, for example, after culturing, cells or cells are collected by a known method, suspended in a suitable buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or After disrupting the cells or cells by freeze-thawing or the like, a crude extract of the protein is obtained by centrifugation or filtration. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. ^TM A surfactant such as (trademark) may be included. When the protein is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the cells or cells are separated from the supernatant by a known method, and the supernatant is collected. The protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
The polypeptide (protein) of the present invention thus obtained can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto. Conversely, when the polypeptide (protein) is obtained as a salt, the free form can be converted by a known method or a method analogous thereto. Or it can be converted to other salts. Further, before or after purification of the protein produced by the recombinant, an appropriate protein modification enzyme such as trypsin and chymotrypsin is allowed to act on the protein to modify it arbitrarily or to partially remove the polypeptide. You can also.
The presence of the polypeptide (protein) of the present invention or a salt thereof can be measured by various binding assays, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
[0021]
In the polypeptide (protein) of the present invention, the C-terminus is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminus is an amide (—CONH). ₂ ) Or an ester (—COOR). Here, as R in the ester, for example, a C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl, α A C6-12 aryl group such as -naphthyl, for example, a phenyl-C1-2 alkyl group such as benzyl and phenethyl or a C7-14 aralkyl group such as an α-naphthyl-C1-2 alkyl group such as α-naphthylmethyl; Pivaloyloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, is used.
[0022]
When the polypeptide (protein) of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used. Furthermore, the protein of the present invention may be one in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group or an acetyl group), or that is cleaved in vivo. N-terminal glutamic acid residue generated by pyroglutamination, on the side chain of an amino acid in the molecule, for example, OH, COOH, NH ₂ , SH, and the like are protected with an appropriate protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group and an acetyl group), and a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
[0023]
The partial polypeptide of the protein of the present invention may be any of the partial peptides of the polypeptide (protein) of the present invention described above, as long as they have substantially the same activity. For example, at least 10 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the polypeptide (protein) of the present invention. For example, a peptide having substantially the same biological activity as the function of the polypeptide of the present invention is used. As the partial polypeptide of the present invention, for example, those containing each functional domain are preferable. The partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—) at the C-terminus, but has an amide (—CONH) at the C-terminus as in the protein of the present invention described above. ₂ ) Or an ester (—COOR). Further, similar to the above-mentioned protein of the present invention, the partial peptide of the present invention includes a peptide in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and a glutamyl formed by cleavage of the N-terminal side in vivo. Examples include those in which the group is pyroglutamine-oxidized, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bound, such as a so-called glycopeptide. The partial peptide of the present invention can be used, for example, as a reagent, a standard substance for experiments, or an immunogen or a part thereof.
[0024]
As a salt of the polypeptide (protein) of the present invention or a partial peptide thereof, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
[0025]
The polypeptide (protein) of the present invention, a partial peptide thereof, a salt thereof, or an amide thereof can also be prepared by a chemical synthesis method known in the art.
For example, using a commercially available resin for protein synthesis, an amino acid appropriately protected with an α-amino group and a side chain functional group is subjected to various condensation methods known per se in the art according to the sequence of the target protein. And condensation on the resin. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin and, at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein, its partial peptide or an amide thereof. Regarding the condensation of the protected amino acids described above, for example, protein synthesis represented by carbodiimides such as DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide is useful. Various activating reagents that can be used can be used. For activation by these, the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a control acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. After performing, it can be added to the resin.
[0026]
Solvents used for activation of protected amino acids and condensation with resins include acid amides, halogenated hydrocarbons, alcohols, sulfoxides, and ethers, which can be used in the art for protein condensation reactions. It can be appropriately selected from known solvents. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole so that the subsequent reaction is not affected.
As a protecting group such as each amino group, carboxyl group, and serine hydroxyl group of the raw material, a group usually used in the art can be used.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
[0027]
The partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se in the art, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. Examples of known condensation methods and elimination of protecting groups include the methods described in the following (1) to (3).
(1) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments on Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(2) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(3) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten
The partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of a method known per se, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc., after the reaction. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
[0028]
Antibodies against the polypeptide (protein) of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as they can recognize them. Antibodies against the polypeptide (protein) of the present invention, its partial peptide or a salt thereof can be produced by using the polypeptide (protein) of the present invention or its partial peptide as an antigen according to a known antibody or antiserum production method. .
The antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide (protein) of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying these, detection of the polypeptide of the present invention (protein) in each fraction during purification, analysis of the behavior of the polypeptide of the present invention (protein) in test cells, etc. Can be used for
[0029]
Further, the antibody of the present invention can be used for quantification of the polypeptide (protein) of the present invention in a test solution by a known method, particularly for quantification by a sandwich immunoassay using a monoclonal antibody, and detection by tissue staining and the like. Can be used. Thereby, for example, a disease involving the polypeptide (protein) of the present invention or the like can be diagnosed.
For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any method can be used as long as it is a method for detecting the amount of the compound by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but it is preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity. As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, and the like known in the art can be used.
[0030]
For details of general technical means relating to these measurement / detection methods, a review, a book, and the like can be referred to. For example, edited by Hiro Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (3rd edition) (Medical Publishing, published in 1987), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. . 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), ibid., Vol. 84 (Immunochemical Technologies (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Technologies) (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), ibid., Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all published by Academic Press) can be referred to.
[0031]
The antisense oligonucleotide (DNA) having a base sequence substantially complementary to the DNA encoding the polypeptide (protein) of the present invention or a partial polypeptide thereof includes a base substantially complementary to the base sequence of the DNA. Any antisense DNA may be used as long as it has a sequence and has an action capable of suppressing the expression of the DNA. The substantially complementary base sequence is, for example, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, and most preferably 100% or more, of the entire base sequence or a partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention. % Homology, and the like. Nucleic acid sequences (modified RNA or DNA) having the same action as these antisense DNAs are also included in the antisense DNA of the present invention. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
[0032]
Further, the polypeptide (protein) of the present invention and the like are useful as reagents for screening compounds that specifically interact with these substances. That is, the present invention uses a polypeptide (protein) of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or an antibody against the same, and screens for a compound that specifically interacts with the substance or a salt thereof. Provided are a method and a screening kit therefor.
The compound identified by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound selected from the test compounds described above, interacts with the polypeptide (protein) of the present invention and the like, A compound that regulates, inhibits, promotes, or antagonizes activity. The compound or a salt thereof may directly act on the activity of the protein of the present invention, or may indirectly act on the expression of the polypeptide (protein) of the present invention, etc. ) And the like. As the salt of the compound, for example, a pharmaceutically acceptable salt or the like is used. Examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. Compounds that inhibit biological activities such as the polypeptides (proteins) of the present invention may also be used as medicaments such as therapeutic / prophylactic agents for the above-mentioned various diseases.
[0033]
By using the DNA of the present invention and a gene containing the DNA as a probe, abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof can be detected. It is useful as a gene diagnostic agent for mRNA damage, mutation, or decreased expression, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA. The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States). States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) and the like.
Furthermore, when the DNA or gene of the present invention is abnormal, defective, or has a reduced expression level, patients who cannot exert normal functions in vivo are subject to (1) retrofit according to known means. The DNA or gene of the present invention is introduced and expressed in the patient by gene therapy using a suitable vector such as a viral vector, an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector as a vehicle, or (2) the present invention. It is considered that the function of the protein or the like of the present invention can be exhibited in the patient by injecting the protein or the like into the patient.
The DNA or gene of the present invention can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter, using the DNA alone or together with an auxiliary agent for promoting uptake.
[0034]
In the present specification and the surface, when bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations, the abbreviations are based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations commonly used in the art, and when amino acids may have optical isomers Unless otherwise specified, L-form is shown.
[0035]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. In addition, various genetic manipulations in Examples are described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M. Ausubel et al.,
1987).
[0036]
(1) Construction of cDNA libraries derived from human adult whole brain and human fetal whole brain (part 1)
Oligonucleotides having NotI site (GACTAGTTCTAGATCGCGAGGCGGCCGCCC (T) _Fifteen ) (Invitrogen) as a primer, and double-stranded cDNA was synthesized using SuperScript II reverse transcriptase kit (Invitrogen) using mRNA from human adult whole brain and human fetal whole brain (Clontech) as a template. An adapter having a SalI site (Invitrogen) was ligated to the cDNA. Thereafter, NotI digestion was performed, and a DNA fragment of 3 kb or more was purified by low-melting agarose electrophoresis at a concentration of 1%.
The purified cDNA fragment was ligated with pBluescript IISK + plasmid treated with SalI-NotI restriction enzyme. This recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli ElectroMax DH10B (manufactured by Invitrogen) by electroporation.
[0037]
(2) Screening
The terminal base sequence of a randomly isolated clone was determined, and the obtained sequence was used as a query to search for the homology search program BLASTN 2.2.3 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein data from the online database. GenBank + EMBL + DDBJ + PDB sequences (but n EST, STS, GSS, the homology search against or phase 0,1 or 2 HTGS sequences)) database was conducted. As a result, for those in which no homologous gene was present, that is, in the case of a novel gene, the 5 ′ and 3 ′ terminal sequences were determined using the homology search program BLASTN 2.2.3, using the human genomic sequence (ftp //Ncbi.nlm.nih.gov/genomes/H_sapiens/)ftp://ncbi. nlm. nih. gov / genomes / H_sapiens /). Next, from the genomic region sandwiched between them, the Genscan program (Burge, C. and Karlin, S. 1997, Prediction of complete gene structures in human genomic DNA, J Mol. Biol. The encoded gene was extracted using predictive computer software). Using this as a query, using the homology search program BLASTN 2.2.3, merged human cDNA sequence determined by the Kazusa DNA Research Institute and the EST and genome from GenBank's homo sapiens database without duplication. In addition, when a new long chain (Genscan predicted cds is 1200 bp or more) gene was confirmed in correspondence with a DNA sequence database originally created by Kazusa DNA Research Institute, full-length analysis of cDNA was performed.
For sequencing, a DNA sequencer (ABI PRISM377) manufactured by PE Applied Biosystems and a reaction kit manufactured by the company were used. Most sequences were determined from shotgun clones using the dye terminator method. For some base sequences, oligonucleotides were synthesized based on the determined base sequences and determined by the primer walking method.
Thus, a novel DNA or gene was screened. As a result, a novel DNA or gene shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing was detected.
The nucleotide sequence of these novel DNAs or genes was determined by the above-described sequencing method. The names of the clones having the DNA or gene of the present invention are shown in Table 1.
[0038]
(3) Homology search of DNA of the present invention
Next, based on the total nucleotide sequence thus obtained, the amino acid sequence of the clone was analyzed against the known sequence library nr using the analysis program BLASTP 2.2.3 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer. , Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of employment agreement, a new generation of employment agreement. As a result, it was revealed that the homologous gene showed homology with each homologous gene shown in Table 2. Table 2 lists information on these homologous genes, that is, their names, database IDs, species, protein lengths, and references. The meanings of the abbreviations of “organism species” in these tables are described in Table 3.
[0039]
Further, Table 4 summarizes various data on the homology between the DNA or gene of the present invention contained in each clone and each homologous gene shown in Table 2. The meaning of each item in these tables is as follows.
"Homologous region clone" Origin and end point of homologous region of clone
"Homologous region homologous gene" origin and end point of homologous region of homologous gene
"Score" The higher the value, the higher the reliability
“E-value” The closer this value is to 0, the higher the reliability
"Homology" Percentage identity of amino acid residues in homologous regions
"Homologous range ratio" Percentage of homologous regions in homologous genes
[0040]
(4) Search for various domains
Next, from the amino acid sequence encoded by the DNA contained in the clone, a search tool Pfamm HMM ver 2.1 Search (HMMPAM) included in Pfam 7.7 (Sonhammer ELL, Eddy SR, Birney E, Bateman A, Durbin R) (1998) Pfam: A function domain was searched using multiple sequence alignments and HMM-profiles of protein domains, Nucleic Acids Research 26: 320-322).
In addition, SOSUI system is a membrane protein prediction program (ver 1.0 / 10, Mar., 1996.) (Takatsugu Hirokawa, Seah Boon-Chieng and Shigeki Mitaku, SOSUI: Classification and Secondary Structure Prediction System for Membrane Proteins, Bioinformatics ( (formerly CABIOS) 1998 May; 14 (4): 378-379.).
These detected functional domains and transmembrane domains are shown in Table 5 for each clone.
The meaning of each item in these tables is as follows.
"Functional domain" domain detected by Pfam SOSUI
"Clone from" Origin of clone functional domain
"Clone to" end point of clone functional domain
"Homologous gene from" Origin of functional domain of homologous gene
"Homologous gene to" End point of homologous gene functional domain
“Score (Pfam only)” The higher this value, the higher the reliability
“Exp (Pfam only)” The closer this value is to 0, the higher the reliability
Table 6 shows the complete title of each functional domain.
[0041]
(5) Expression site
Table 7 shows the results of examining the expression of the clones of SEQ ID NOS: 1 to 4 in the tissue and brain regions using RT-PCR ELISA (Nagase T, Ishikawa K, Suyama M, Kikuno R, Miyajima N). , Tanaka A, Kotani H, Nomura N, Ohara O. Prediction ofthe coding sequences of unidentified human genes XI The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins invitro DNA Res 1998 Oct 30;.... 5 ( 5): 277-86.).
The expression level (unit (fg) per ng of poly (A) + RNA) is indicated by “+” when less than 0.1, “++” when 0.1 or more and less than 100, and “++++” when 100 or more. In addition, what was not examined was shown by "-".
Table 8 shows the complete notation of the tissue and brain sites.
[0042]
(6) Chromosome location
Using the homology search program BLASTN 2.2.3, the DNA sequence of the clone was cloned into a library of clones encoding the human genome (ftp://ncbi.nlm.nih.gov/genomes/H_sapiens/)ftp://ncbi. nlm. nih. gov / genomes / H_sapiens /). The number of the chromosome from which this clone was derived was extracted from the description (Definition) of the corresponding clone, and is shown in Table 9.
[0043]
Based on the above homology, information on homologous genes, various domains, expression sites, chromosome positions, etc., those skilled in the art can predict each function of the DNA or gene of the present invention with a scientifically sufficient probability. You can do it.
[0044]
A probe prepared by accumulating the novel DNA or gene obtained in the present invention on a so-called DNA chip or the like, for example, from blood or tissue of a normal patient as a control and a patient with a disease involving the brain such as mental illness The hybridization can be used for diagnosis, treatment and the like of these diseases.
In addition, PCR is performed using chromosomal DNA extracted from human blood or tissue using a synthetic DNA primer prepared based on the DNA or gene of the present invention or a partial nucleotide sequence thereof, and the nucleotide sequence of the product is determined. By making the determination, a single base mutation that differs in the DNA or gene of the present invention depending on the individual, that is, cSNPs can be found. As a result, the constitution and the like of the individual are predicted, and the development of a medicine suitable for each individual becomes possible.
[0045]
In addition, an ortholog (homolog, counterpart) gene for the DNA or gene of the present invention in a model organism such as a mouse is isolated by cross-hybridization, and for example, a human disease model animal is prepared by knocking out these genes, It is also possible to search for and identify genes that cause human pathogenesis.
Furthermore, the polypeptide of the present invention, a partial polypeptide thereof or a recombinant protein containing the polypeptide, or an antibody against the DNA or gene of the present invention is comprehensively prepared, and a so-called protein chip is prepared by accumulating them. Proteome analysis, such as detecting the difference in protein expression level between a patient and a normal person, can be used for diagnosis and treatment of diseases.
[0046]
[Table 1]

[0047]
[Table 2]

[0048]
[Table 3]

[0049]
[Table 4]

[0050]
[Table 5]

[0051]
[Table 6]

[0052]
[Table 7]

[0053]
[Table 8]

[0054]
[Table 9]

[0055]
[Sequence list]

Claims

DNA comprising a base sequence encoding the following polypeptide (a) or (b):
(A) a polypeptide consisting of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4,
(B) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, wherein the amino acid sequence has an amino acid sequence in which some amino acids have been deleted, substituted or added, and substantially has the function of the polypeptide of (a). A polypeptide having the same biological activity as the above.

DNA of the following (a) or (b):
(A) a DNA comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by any one of the nucleotide sequences represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4,
(B) a protein which hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA of (a) under stringent conditions and has a biological activity substantially the same as the function of the polypeptide of (a); DNA encoding.

A gene comprising the human DNA according to claim 1.

The following (a) or (b) recombinant polypeptide:
(A) a polypeptide consisting of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4,
(B) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, wherein the amino acid sequence has an amino acid sequence in which some amino acids have been deleted, substituted or added, and substantially has the function of the polypeptide of (a). A polypeptide having the same biological activity as the above.

A recombinant protein encoded by the gene according to claim 3.