JP2005016989A - コンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】コンドロイチン硫酸又はその塩の新規分析法として、インキャピラリー酵素反応法による泳動分離する方法を提供する。
【解決手段】コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素を電気泳動用キャピラリーに導入する酵素導入工程と、試料を前記電気泳動用キャピラリーに導入する試料導入工程と、前記酵素及び前記試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程と、を備えた。
【選択図】なし
【解決手段】コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素を電気泳動用キャピラリーに導入する酵素導入工程と、試料を前記電気泳動用キャピラリーに導入する試料導入工程と、前記酵素及び前記試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程と、を備えた。
【選択図】なし
Description
【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、コンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法に関し、特に、インキャピラリー酵素反応法を用いたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
コンドロイチン硫酸又はその塩は、複合糖質の主要成分の一つであるグリコサミノグリカンの一種であり軟骨、骨などの人体のいたるところに存在し、組織の維持、強化及び柔軟性の保持に寄与している。
【0003】
【化1】
【0004】
前記化学式1において、R1、R2、及びR3は独立して、それぞれ水素原子またはスルホン酸基である。nは、2〜10000の整数であり、好ましくは2〜5000の整数である。
【0005】
前記化学式1において、コンドロイチン硫酸の塩というのは、カルボキシル基又はスルホン酸基が、テトラアルキルアンモニウム塩等の有機塩又は、アルカリ金属塩、アルカリ度類金属塩等の無機塩に置換されたものを指す。
【0006】
前記化学式1に示すように、コンドロイチン硫酸は、長い直鎖状のヘテロ多糖ポリマーでありグルクロン酸とN−アセチルガラクトサミンにより構成されている。N−アセチルガラクトサミンのC−4位(R1)もしくはC−6位(R2)が硫酸化、さらにグルクロン酸のC−2位(R3)が硫酸化されたものがあり、これらの総称をコンドロイチン硫酸という。また、コンドロイチン硫酸の用途は、医薬品、化粧品など多岐に渡っている。そのため、特に製薬分野ではコンドロイチン硫酸又はその塩を、より迅速で簡便かつ正確に分析する方法の開発が求められている。
【0007】
コンドロイチン硫酸又はその塩を定量化する方法は大きく分けて二種類に分かれる。一つは、カルバゾール反応を利用した比色法に代表されるようにコンドロイチン硫酸を構成糖に分解して分析する方法(非特許文献1参照)であり、もう一つはコンドロイチン硫酸をそのまま、もしくは銅(Cu)イオンと錯体を形成させて高速液体クロマトグラフィー(HPLC:High performance liquid chromatography)(非特許文献2参照)により分析する方法であり、従来は主に比色法が利用されてきた。
【0008】
【非特許文献1】
Beaty,N.B.; Mello, R.J. J.Chromatogr. 1987,418,187−222
【非特許文献2】
Toida, T.;Linhardt, R.J. Electrophoresis 1996,17,341−346
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
コンドロイチン硫酸又はその塩は、異性体を有するため大きさ、及び電価が不均一である。そのため、高速液体クロマトグラフィーを用いたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析においては、ピークの形状が悪く、改善の余地があった。また試料中に含まれるコンドロイチン硫酸又はその塩の異性体を含むコンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量を測定する場合、比色法や高速液体クロマトグラフィーによる分析では操作が煩雑になってしまうという問題点もあった。
【0010】
また、高速液体クロマトグラフィーを用いたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析においては、酵素によりコンドロイチン硫酸又はその塩を形成している分子鎖を切断し、精製した構成糖を組成分析することが知られている。しかし、異性体を含むコンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量を定量する場合、クロマトグラム上の二糖類の集合体を分析するにはそれぞれの標準物質を用意する必要があり、操作が比色法よりも煩雑になってしまう。
【0011】
一般に酵素は高額で、少量のみしか手に入らない場合が多い。そのため、より少ない量でコンドロイチン硫酸又はその塩の定量を行うことができる分析方法の開発が求められている。
【0012】
本発明では、従来法よりも少量の試料で、より迅速で簡便かつ正確に試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析を行うことが可能なコンドロイチン硫酸又はその塩の新規分析方法を提供することを課題としている。
【0013】
【課題を解決するための手段】
本発明の特徴は、コンドロイチン硫酸又はその塩を含む試料の分析において、初めてインキャピラリー酵素反応法を用いたことである。これによって、試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩を、より簡単に定量することが可能となった。また酵素の組み合わせによっては、コンドロイチン硫酸又はその塩の組成分析や、コンドロイチン硫酸又はその塩の2以上の異性体を含む試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量の測定を行うことが可能となった。
【0014】
本発明は、より具体的には以下のようなものを提供する。
【0015】
(1) コンドロイチン硫酸又はその塩に対して反応をする酵素を電気泳動用キャピラリーに導入する酵素導入工程と、この酵素導入工程と同時もしくは前後して、試料を前記電気泳動用キャピラリーに導入する試料導入工程と、前記酵素導入工程と前記試料導入工程とを経た後に、これらの各工程で前記電気泳動用キャピラリーに導入された前記酵素及び前記試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程と、を備えたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0016】
(2) 前記酵素がコンドロイチン硫酸又はその塩の分解酵素である(1)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0017】
(3) 前記分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼからなる群の少なくとも1種または2種以上のものを含む(2)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0018】
(4) 前記分解酵素がコンドロイチナーゼABCである(2)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0019】
(5) 前記酵素導入工程の後に前記試料導入工程が行われる(1)〜(4)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0020】
(6) 前記試料がコンドロイチン硫酸又はその塩を含むものである(1)〜(5)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0021】
(7) 前記酵素導入工程、前記試料導入工程及び前記電気泳動工程をオンラインで行う(1)〜(6)のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0022】
(8) 前記電気泳動用キャピラリーから流出した泳動液を検出する検出工程を更に有する(1)〜(7)のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0023】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0024】
本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素を電気泳動用キャピラリーに投入する酵素導入工程を有する。「コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素」としては、好ましくはコンドロイチン硫酸又はその塩の分解酵素が用いられる。コンドロイチン硫酸又はその塩の分解酵素には、例えばコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼがある。これらの酵素は脱硫反応を起こすものもあれば、コンドロイチン硫酸又はその塩を不飽和コンドロ二糖に分解するものもある。前記酵素は過剰に導入される方が好ましい。
【0025】
「キャピラリー」とは毛細管のことをいい、直径2〜100μm、好ましくは直径10〜80μm、更に好ましくは直径50μmの毛細管が用いられる。本発明では、キャピラリー電気泳動の原理を応用した。キャピラリー電気泳動とは、このキャピラリーの両端に高電圧をかけることにより、一般には、溶液である泳動液中の各種イオンや有機酸等の荷電粒子が分離、移動する原理を応用した極めて分解能が高い分析方法である。また電気泳動用キャピラリー中には泳動液が含まれる。泳動液が、キャピラリー内において酵素溶液の溶媒も兼ねる場合には全ての酵素にとって最も反応効率の良い緩衝液を泳動液に適用することが好ましい。
【0026】
また、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、試料を前記電気泳動用キャピラリーに投入する試料導入工程を有する。「試料」には、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素と反応する成分と、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素と反応しない成分とが同時に含まれていてもよい。あるいは、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素と反応する成分のみが含まれていてもよい。あるいは、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する成分が含まれていなくてもよい。
【0027】
更にまた、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、酵素及び試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程を有する。この混合工程では、試料中にコンドロイチン硫酸又はその塩が含まれている場合には、前記酵素と前記試料とが反応し、生成物を生じる方が好ましい。反応は、異なる速度で移動してきた前記酵素と、前記試料とが混ざり合う箇所で起こる。混合する際には低い電圧で電気泳動させ、その後高い電圧で電気泳動させ分離することが好ましい。
【0028】
更にまた、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、好ましくは前記電気泳動用キャピラリーから流出した泳動液を検出する検出工程を有し、更に好ましくは生成物を検出できる工程を有する。
【0029】
検出手段は限定されるものではなく、好ましくは公知の検出手段が用いられる。例えば紫外可視吸収検出器、フォトダイオードアレイ検出器を用いることができる。
【0030】
インキャピラリー酵素反応法とは、まず試料と酵素とを別々に注入した後電気泳動分離を開始し、それぞれ異なる速度で移動する試料と酵素とが混合する場所で反応を起こさせ、続けて、移動してきた反応生成物を分析するというものである。
【0031】
図1(A)から図1(C)にインキャピラリー酵素反応法の概略を示す。図1(A)では、キャピラリー10に泳動液12が充填されている。前記キャピラリー10に酵素溶液11を流入口16から導入した場合を示している。
【0032】
図1(B)は、前記キャピラリー10中で酵素溶液11と試料溶液13とが流入口16から導入された後の混合工程を示す。酵素溶液とは、一般には酵素を泳動液に溶解した溶液であり、試料溶液とは、一般には試料を泳動液に溶解した溶液である。このときの電圧は後の電気泳動よりも低い電圧であることが好ましい。また、生成物である不飽和コンドロ二糖は負電荷を帯びているため、流入口16に陰極18を、流出口17に陽極19を設け、電流を陰極18から陽極19に向かって電気泳動を行うことが好ましい。酵素反応は速く移動するゾーン、(例えば、試料溶液13)が遅く移動するゾーン、(例えば、酵素溶液11)を追い越すことを利用して、両者が混合した際に反応ゾーン14にて反応を起こさせる)。従って、図1(A)の導入工程では、試料溶液13と酵素溶液11とで電気泳動の移動度を比較し遅く移動する方(例えば酵素溶液11)を先にキャピラリーに導入し、電気泳動で速く移動する方(例えば試料溶液13)を後にキャピラリーに導入することが好ましい。試料溶液13と酵素溶液11とを導入する際には、間隔が空いてもよいが、間隔が空かなくてもよい。好ましくは間隔が空かない。
【0033】
図1(C)の段階では、混合工程よりも高い電圧をかけることが好ましい。電気泳動は、陰極18から陽極19に進行し、流出口17より生成物15が分離される。生成物15は酵素溶液11よりも移動度の速い場合がある。
【0034】
【実施例】
[装置]
フォトダイオードアレイ検出器(検出波長:232nm)を接続したキャピラリー電気泳動装置(アジレントCE、アジレントテクノロジー社)を用いた。キャピラリー温度は37℃、印加電圧は−30kv、試料注入はすべて加圧注入法(50mbar)を用いた。キャピラリー内壁への酵素の吸着を防ぐためにポリビニルアルコール(PVA)コーティングを施したキャピラリー(50μm内径;375μm外径;有効長56cm;全長64.5cm)はアジレントテクノロジー社製のものを用い、検出感度向上のためバブルセルキャピラリーを用いた。キャピラリーは、毎分解析前に泳動液でフラッシング(3分間)を行った。すべてのデータは、ケムステーションソフトウェア(アジレントテクノロジー社)にて、解析を行った。
【0035】
[試薬及び試液]
医薬品原料コンドロイチン硫酸ナトリウム塩(サメ)、コンドロイチン硫酸Cナトリウム塩(サメ軟骨)SSG、コンドロイチン硫酸Aナトリウム塩(クジラ軟骨)SSG、コンドロイチン硫酸Dナトリウム塩(サメ軟骨)、コンドロイチン硫酸Eナトリウム塩(イカ軟骨)は、生化学工業株式会社(日本)より購入した。
【0036】
コンドロイチナーゼABC(Proteus vulgaris)、コンドロ−4−スルファターゼ(Proteus vulgaris)は、生化学工業株式会社より購入した。2−O−スルファターゼ(Flavobacterium heparinum)は、シグマ社(アメリカ)より購入した。不飽和コンドロ二糖類(2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−D−ガラクトース:ΔDi−nonS、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−4−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−4S、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−6−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−6S、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(2−O−スルフォーβ−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−6−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−diSD、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−4,6−ビス−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−diSE)は、生化学工業株式会社より購入したものをピーク同定に使用した。
【0037】
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、フタル酸水素カリウム、カルバゾール、四ホウ酸ナトリウム十水和物及び硫酸は、和光純薬(日本)製のものを用いた。酢酸は国産化学(日本)より購入した。全ての試薬は特級を用いた。
【0038】
コンドロイチン硫酸溶液は、コンドロイチン硫酸を10mmol/Lの、トリス−酢酸緩衝液(pH7.0)に溶解させて調製した。同様に、酵素溶液も酵素を10mmol/Lの、トリス−酢酸緩衝液(pH7.0)に溶解させて調製した。調製した泳動液は、0.45μm水系メンブランフィルター(日本ポール株式会社、日本)にてろ過後使用した。
【0039】
[参考例1]
インキャピラリー酵素反応法において、生成する生成物のピークの帰属を決定するために、不飽和コンドロ二糖類の分離条件の検討を行った(図1(A)から(C)参照)。泳動液12はキャピラリー内において酵素溶液の溶媒も兼ねるため、全ての酵素にとって最も反応効率の良い緩衝液を泳動液12に適用する必要がある。そこで、10mmol/Lトリス−酢酸緩衝液(pH7.0)を選択した。キャピラリーは、酵素の吸着を防ぐためポリビニルアルコールコーティングを施したものを用いた。上記緩衝液中では不飽和コンドロ二糖類は負電荷を帯びているため、印加電圧を逆転させ陰極16から陽極17に向かって電気泳動を行った。
【0040】
上記の条件で分離を行った不飽和コンドロ二糖類のエレクトロフェログラムを図2に示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク21からピーク25は、不飽和コンドロ二糖類のピークである。ピーク21のΔDi−diSDと、ピーク22のΔDi−diSEについてはベースライン分離が達成されていない。しかし、本研究の最終目標はすべての不飽和コンドロ二糖類をピーク25のΔDi−nonSに変換して分析することであるため、この分離条件で問題はないと判断した。図2のピークの帰属を基準とし、インキャピラリー酵素反応法における生成物のピークの帰属を行った。
【0041】
[参考例2]
オフライン酵素反応法は、以下の手順で行った。コンドロイチン硫酸ナトリウム水溶液(1mg/mL)1mLに内標準溶液1mLを加え、10mmol/Lトリス−酢酸緩衝液(pH7.0)を加えて10mLとし、孔径0.45μm水系メンブランフィルターでろ過した。内標準物質は塩酸フェニレフリン20mgを水に溶かし、100mLとしたものを用いた。ろ液500μLを取り、コンドロイチナーゼABC溶液(12.5units/mL)2μLを加え、37℃で60分間インキュベーションを行い、酵素反応を進行させた。この混合溶液から50μLをとり、加圧注入法(50mbar×5秒間)で導入し、印加電圧−30kVで電気泳動を行った。電気泳動開始前の試料溶液中のコンドロイチン硫酸の量と開始後の生成物のトータル量とを比較して、コンドロイチン硫酸のトータル量に変化は無いことを確かめた。次に、コンドロイチナーゼABC反応後の試料溶液50μLをとり、コンドロ−4−スルファターゼ溶液(1.25units/mL)2μL、コンドロ−6−スルファターゼ溶液(1.25units/mL)2μL、及び2−O−スルファターゼ溶液(12.5units/mL)2μL、を加え、37℃で90分間インキュベーションを行った。ここから50μLをとり加圧注入法(50mbar×5秒間)で導入し、印加電圧−30kVで電気泳動を行った。それぞれの酵素反応を止めるためには反応チューブを100℃で1分間加熱した。このときのエレクトロフェログラムでは、内標準物質のピーク、並びに、異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピークが確認された。
【0042】
[実施例1]
インキャピラリー酵素反応法は以下の手順で行った。酵素溶液(コンドロイチナーゼABC0.25units/mL、コンドロ−6−スルファターゼ0.25units/mL、コンドロ−4−スルファターゼ0.25units/mL、2−O−スルファターゼ2.5units/mL、10mmol/Lトリス−アセテート(pH7.0)、緩衝溶液)とコンドロイチン硫酸ナトリウム塩又は不飽和コンドロ二糖類を含む試料溶液13(0.1mg/mL、10mmol/Lトリス−アセテート(pH7.0))とを、続けて加圧注入法(酵素10sec、試料溶液5sec)でキャピラリーに注入した(図1(A)及び図1(B)参照)。印加電圧−0.2kVで混合時間を20分間とった後、−30kVで電気泳動を行った。このときのエレクトロフェログラムでは内標準物質のピーク及び、異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピークが確認された。
【0043】
[実施例2]
インキャピラリー酵素反応法における導入順序の検討を行った。インキャピラリー酵素反応法では、酵素と基質の移動度が異なることがキャピラリー内での両者の混合を可能にする。すなわち電気泳動において、速く移動するゾーンが遅く移動するゾーンを追い越すときを利用して反応を起こさせるからである(図1(A)から(C)参照)。そこで、実際に各酵素と基質の導入順序を変えたときの変換効率への影響を調べた。
【0044】
実施例1の試料溶液と酵素溶液とを用いて酵素反応を行った。まずコンドロイチナーゼABCについて調べたところ、酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0045】
[実施例3]
実施例2と同様に、酵素にコンドロ−4−スルファターゼを用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0046】
[実施例4]
実施例2と同様に、酵素にコンドロ−6−スルファターゼを用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0047】
[実施例5]
実施例2と同様に、酵素に2−O−スルファターゼを用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0048】
[実施例6]
実施例2と同様に、酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合溶液を用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0049】
実施例2から実施例6の結果の比較を行った結果、いずれの酵素においても、酵素を先に基質を後にという順番のほうが反応効率が良いことが示された。参考例2のオフライン法にて酵素反応した溶液を電気泳動分析した結果と比較して、ΔDi−nonSの生成量は、酵素−基質の順で注入した場合48.3%であったのに対して、その逆は6.8%にとどまった。以上の結果から、全ての酵素を一度に注入し、その後注入したコンドロイチン硫酸ナトリウム塩がキャピラリー内で酵素群を追い抜く間に反応を起こさせることが可能であることが示された。
【0050】
[実施例7及び比較例1]
インキャピラリー酵素反応法における酵素変換率を上げる検討を行った。参考例2の酵素の変換効率と、実施例1の混合時間を20分から30分に増やしたときの酵素の変換効率と、を比較した。その結果、混合時間を20分から30分に増やすことにより、参考例2のオフライン酵素反応と比較して99.2%の変換効率を達成した。そのときのエレクトロフェログラムを図3に示す。
【0051】
図3(A)は、参考例2のオフライン酵素反応を行ったときのエレクトロフェログラムを、図3(B)は、混合時間を20分から30分に増やして酵素反応を行った(オンライン)とき、すなわち実施例7のエレクトロフェログラムを示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク25は、不飽和コンドロ二糖であるΔDi−nonSのピークである。なお、インキャピラリー酵素反応法におけるベースラインのドリフトは酵素溶液に含まれる牛血清アルブミン(BSA)由来であることを確認した。
【0052】
[実施例8]
インキャピラリー酵素反応法の有用性を確かめるため、様々なコンドロイチン硫酸の分析を行った。
【0053】
コンドロイチン硫酸を含む様々な試料を実施例1の条件で酵素反応を行った。試料溶液には、サメ由来のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩(以下CS)、を実施例1の試料溶液と同様に調製したものを用いた。酵素にはコンドロイチナーゼABCのみを用いインキャピラリー酵素反応法にてこれらの試料溶液の分析を行った。このときのエレクトロフェログラムを図4に示す。
【0054】
[実施例9]
試料溶液に、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Cナトリウム塩(以下CS―C)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図5に示す。
【0055】
[実施例10]
試料溶液に、クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩(以下CS―A)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図6に示す。
【0056】
[実施例11]
試料溶液に、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Dナトリウム塩(以下CS―D)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図7に示す。
【0057】
[実施例12]
試料溶液に、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Eナトリウム塩(以下CS―E)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図8に示す。
【0058】
実施例8から実施例12の結果をそれぞれ図4から図8に示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク21からピーク25は、不飽和コンドロ二糖類のピークである。ここではそれぞれの種におけるコンドロイチン硫酸構成糖の種類及びその比率を知ることができた。図4よりCSでは、その構成糖はΔDi−6Sが最も多く、ΔDi−4S及びΔDi−diSDが続いて多く含まれることがわかった。図5より高純度精製品であるCS―Cでは、CSよりもさらにΔDi−6Sが多く含まれることがわかった。図6よりCS−Aでは、その構成糖はΔDi−4Sが最も多く、その他にΔDi−6Sが含まれることがわかった。図7よりCS−Dでは、他のコンドロイチン硫酸と比較してΔDi−diSDが多く含まれることがわかった。またピーク26、ピーク27で表されたピークは未知ピークであり、硫酸基がさらに異なる位置に結合した異性体か、不完全切断オリゴ糖由来であると推定される。図8よりCS−Eでは、他のコンドロイチン硫酸と比較してΔDi−diSEが多く含まれることがわかった。またここでもさらなる未知ピークが確認された。
【0059】
[実施例13]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCSをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図9に示す。
【0060】
[実施例14]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Cをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図10に示す。
【0061】
[実施例15]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Aをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図11に示す。
【0062】
[実施例16]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Dをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図12に示す。
【0063】
[実施例17]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Eをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図13に示す。
【0064】
実施例13から実施例17の結果をそれぞれ図9から図13に示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク21からピーク25は、不飽和コンドロ二糖類のピークである。5種のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩を調べたが、4酵素系でのインキャピラリー酵素反応法を行ったところ、CS−Eを除いて、いずれも生成ピークはΔDi−nonSのみとなりコンドロイチン硫酸トータル量の定量法として有用であることが示された。なお、CS−Eに関しては、その構成糖に複雑な硫酸基組成を持った異性体が含まれる可能性、あるいは製造過程での不純物の存在なども考えられ、設定した分析法をそのまま適用するのは難しいと考えられる。ただし医薬品に配合されるコンドロイチン硫酸ナトリウム塩は、そのほとんどがCS―Cであるため、実際の運用に関しては問題ないと考える。
【0065】
[実施例18]
市販製剤のインキャピラリー酵素反応法は、以下の手順で行った。点眼剤2mLをとり、内標準溶物質2mLと10mmol/Lトリス−酢酸緩衝液(pH7.0)を加えて20mLとした。これを孔径0.45μm水系メンブランフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。実施例2と同様に印加電圧−0.2kVで混合時間を20分間とった後、−30kVで電気泳動を行った。基準物質(コンドロイチン硫酸ナトリウム塩(サメ))は、対応量を量り、内標準物質2mLを加え、10mmol/Lトリス‐酢酸緩衝液(pH7.0)を加えて20mLとし、孔径0.45μm水系メンブランフィルターでろ過し、ろ液を標準溶液とした。内標準物質には塩酸フェニレフリン20mgを水に溶かし、100mLとしたものを用い、実施例1と同様に、印加電圧−0.2kVで混合時間を20分間とった後、−30kVで電気泳動を行った。このときのエレクトロフェログラムでは内標準物質のピーク及び、異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピーク及び他成分のピークが確認された。
【0066】
[参考例3]
カルバゾール法による製剤分析法は、以下の手順で行った。カルバゾール法は、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩をホウ酸ナトリウム硫酸試液により加水分解を行う。加水分解によって生成したグルクロン酸とカルバゾールとの反応で生じる生成物を525nmにて吸光度測定を行う方法である。なお、夾雑物による妨害を取り除くため、あらかじめ固相抽出カラムにてクリーンアップした試料を反応に用いた。装置にスペクトロフォトメーター(日立製作所日本)を用いた。このときの分析結果では異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピークが確認された。
【0067】
[実施例19]
市販点眼剤中のコンドロイチン硫酸の定量を行い、分析法のバリデーションを検討した。
【0068】
実施例2の手順で試料溶液を調整した。なお、このときの内標準物質としてフタル酸水素カリウムを用い、標準溶液、試料溶液及び各成分抜き試料を用いて特異性を確認した。代表的なエレクトロフェログラムを図14に示す。ピーク20は標準溶液のピークであり、ピーク25は、不飽和コンドロ二糖類ΔDi−nonSのピークである。ΔDi−nonS及び内標準物質の移動時間には妨害となるピークは認められなかった。なお、クロマトグラム上に認められたピークは他配合成分由来である。
【0069】
標準溶液、試料溶液及び酵素溶液の安定性を確認したところ、遮光容器中で少なくとも室温24時間までは酵素反応は問題なく行われ、安定性は確保できることを確かめた。
【0070】
S/N=3より求めた検出限界を表1に示す。
【0071】
【表1】
【0072】
表1よりコンドロイチン硫酸濃度25μg/mL〜150g/mLの範囲の標準溶液で直線性を確認したところ、ほぼ原点を通り、かつ相関係数0.999以上の良好な直線が得られた。
【0073】
成分抜き試料に、定量濃度の80、100、120%になるように各成分標準溶液を添加し(n=3)、回収率及び精度を確認した。その結果、回収率は100.0〜100.5%と良好な値が得られた。また、精度に関しても、0.2〜0.6%RSDであり良好な結果であった。
【0074】
また市販点眼剤中の成分の定量をインキャピラリー酵素反応法で行うと同時に、カルバゾール法との比較も行った。
【0075】
実施例18及び参考例3の分析結果の比較を行った。なお、カルバゾール法では夾雑物による妨害を取り除くため、予め固相抽出カラムにてクリーンアップした試料を反応に用いた。その結果、いずれの成分の定量値も同等な値が得られ、インキャピラリー酵素反応法の妥当性を示した。また、精度の面においてもカルバゾール法に比較して良好な結果であった(表2参照)。
【0076】
【表2】
【0077】
以上の結果より、インキャピラリー酵素反応法の従来法に置き換わる医薬品品質管理法としての利用可能性が示された。
【0078】
【発明の効果】
本発明は、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素を電気泳動用キャピラリーに導入する酵素導入工程と、試料を前記電気泳動用キャピラリーに導入する試料導入工程と、前記酵素及び前記試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程と、を備えたコンドロイチン硫酸又はその塩を分析する方法であり、これによりコンドロイチン硫酸又はその塩の定性分析又は定量分析に適用できる。
【0079】
本発明は、比色法と比較して操作の簡便さ、安全性、迅速性、自動化の面で有用性が高い。また酵素消費量の大幅な削減が可能である。従来の高速液体クロマトグラフィーでは高価な酵素溶液をμLレベルで調製しなければならないが、本発明ではnLレベルでの調製が可能であると考えられる。
【0080】
酵素としてコンドローチナーゼABCのみを用いることにより、コンドロイチン硫酸又はその塩の構成糖の組成分析が可能になった。又、酵素としてコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼの混合溶液を用いた場合には、コンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量の分析が可能になった。従って、コンドローチナーゼABCのみの酵素バイアルと、コンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼの混合溶液を用いた酵素バイアルと、を用意するだけで、コンドロイチン硫酸トータル量分析と組成分析の両者が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明によるインキャピラリー酵素反応法の概略の断面図を示す図である。図1(A)は、酵素溶液11を注入した直後の断面を示す図である。図1(B)は、更に試料溶液13を注入した直後の断面を示す図である。図1(C)は生成物15が酵素溶液11より先行している状態の断面を示す図である。
【図2】本発明の参考例1による不飽和コンドロ二糖類のエレクトロフェログラムを示す図である。
【図3】図3(A)は、参考例2又は比較例1のエレクトロフェログラムであり、図3(B)は、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図4】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図5】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図6】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図7】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図8】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図9】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図10】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図11】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図12】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図13】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図14】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【符号の説明】
10・・・キャピラリー
11・・・酵素溶液
12・・・泳動液
13・・・試料溶液
14・・・反応ゾーン
15・・・生成物
16・・・流入口
17・・・流出口
18・・・陰極
19・・・陽極
20・・・標準溶液のピーク
21・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−diSDのピーク
22・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−diSEのピーク
23・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−4Sのピーク
24・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−6Sのピーク
25・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−nonSのピーク
26,27・・・未知ピーク
【産業上の利用分野】
本発明は、コンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法に関し、特に、インキャピラリー酵素反応法を用いたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
コンドロイチン硫酸又はその塩は、複合糖質の主要成分の一つであるグリコサミノグリカンの一種であり軟骨、骨などの人体のいたるところに存在し、組織の維持、強化及び柔軟性の保持に寄与している。
【0003】
【化1】
【0004】
前記化学式1において、R1、R2、及びR3は独立して、それぞれ水素原子またはスルホン酸基である。nは、2〜10000の整数であり、好ましくは2〜5000の整数である。
【0005】
前記化学式1において、コンドロイチン硫酸の塩というのは、カルボキシル基又はスルホン酸基が、テトラアルキルアンモニウム塩等の有機塩又は、アルカリ金属塩、アルカリ度類金属塩等の無機塩に置換されたものを指す。
【0006】
前記化学式1に示すように、コンドロイチン硫酸は、長い直鎖状のヘテロ多糖ポリマーでありグルクロン酸とN−アセチルガラクトサミンにより構成されている。N−アセチルガラクトサミンのC−4位(R1)もしくはC−6位(R2)が硫酸化、さらにグルクロン酸のC−2位(R3)が硫酸化されたものがあり、これらの総称をコンドロイチン硫酸という。また、コンドロイチン硫酸の用途は、医薬品、化粧品など多岐に渡っている。そのため、特に製薬分野ではコンドロイチン硫酸又はその塩を、より迅速で簡便かつ正確に分析する方法の開発が求められている。
【0007】
コンドロイチン硫酸又はその塩を定量化する方法は大きく分けて二種類に分かれる。一つは、カルバゾール反応を利用した比色法に代表されるようにコンドロイチン硫酸を構成糖に分解して分析する方法(非特許文献1参照)であり、もう一つはコンドロイチン硫酸をそのまま、もしくは銅(Cu)イオンと錯体を形成させて高速液体クロマトグラフィー(HPLC:High performance liquid chromatography)(非特許文献2参照)により分析する方法であり、従来は主に比色法が利用されてきた。
【0008】
【非特許文献1】
Beaty,N.B.; Mello, R.J. J.Chromatogr. 1987,418,187−222
【非特許文献2】
Toida, T.;Linhardt, R.J. Electrophoresis 1996,17,341−346
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
コンドロイチン硫酸又はその塩は、異性体を有するため大きさ、及び電価が不均一である。そのため、高速液体クロマトグラフィーを用いたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析においては、ピークの形状が悪く、改善の余地があった。また試料中に含まれるコンドロイチン硫酸又はその塩の異性体を含むコンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量を測定する場合、比色法や高速液体クロマトグラフィーによる分析では操作が煩雑になってしまうという問題点もあった。
【0010】
また、高速液体クロマトグラフィーを用いたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析においては、酵素によりコンドロイチン硫酸又はその塩を形成している分子鎖を切断し、精製した構成糖を組成分析することが知られている。しかし、異性体を含むコンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量を定量する場合、クロマトグラム上の二糖類の集合体を分析するにはそれぞれの標準物質を用意する必要があり、操作が比色法よりも煩雑になってしまう。
【0011】
一般に酵素は高額で、少量のみしか手に入らない場合が多い。そのため、より少ない量でコンドロイチン硫酸又はその塩の定量を行うことができる分析方法の開発が求められている。
【0012】
本発明では、従来法よりも少量の試料で、より迅速で簡便かつ正確に試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析を行うことが可能なコンドロイチン硫酸又はその塩の新規分析方法を提供することを課題としている。
【0013】
【課題を解決するための手段】
本発明の特徴は、コンドロイチン硫酸又はその塩を含む試料の分析において、初めてインキャピラリー酵素反応法を用いたことである。これによって、試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩を、より簡単に定量することが可能となった。また酵素の組み合わせによっては、コンドロイチン硫酸又はその塩の組成分析や、コンドロイチン硫酸又はその塩の2以上の異性体を含む試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量の測定を行うことが可能となった。
【0014】
本発明は、より具体的には以下のようなものを提供する。
【0015】
(1) コンドロイチン硫酸又はその塩に対して反応をする酵素を電気泳動用キャピラリーに導入する酵素導入工程と、この酵素導入工程と同時もしくは前後して、試料を前記電気泳動用キャピラリーに導入する試料導入工程と、前記酵素導入工程と前記試料導入工程とを経た後に、これらの各工程で前記電気泳動用キャピラリーに導入された前記酵素及び前記試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程と、を備えたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0016】
(2) 前記酵素がコンドロイチン硫酸又はその塩の分解酵素である(1)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0017】
(3) 前記分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼからなる群の少なくとも1種または2種以上のものを含む(2)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0018】
(4) 前記分解酵素がコンドロイチナーゼABCである(2)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0019】
(5) 前記酵素導入工程の後に前記試料導入工程が行われる(1)〜(4)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0020】
(6) 前記試料がコンドロイチン硫酸又はその塩を含むものである(1)〜(5)に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0021】
(7) 前記酵素導入工程、前記試料導入工程及び前記電気泳動工程をオンラインで行う(1)〜(6)のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0022】
(8) 前記電気泳動用キャピラリーから流出した泳動液を検出する検出工程を更に有する(1)〜(7)のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
【0023】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0024】
本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素を電気泳動用キャピラリーに投入する酵素導入工程を有する。「コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素」としては、好ましくはコンドロイチン硫酸又はその塩の分解酵素が用いられる。コンドロイチン硫酸又はその塩の分解酵素には、例えばコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼがある。これらの酵素は脱硫反応を起こすものもあれば、コンドロイチン硫酸又はその塩を不飽和コンドロ二糖に分解するものもある。前記酵素は過剰に導入される方が好ましい。
【0025】
「キャピラリー」とは毛細管のことをいい、直径2〜100μm、好ましくは直径10〜80μm、更に好ましくは直径50μmの毛細管が用いられる。本発明では、キャピラリー電気泳動の原理を応用した。キャピラリー電気泳動とは、このキャピラリーの両端に高電圧をかけることにより、一般には、溶液である泳動液中の各種イオンや有機酸等の荷電粒子が分離、移動する原理を応用した極めて分解能が高い分析方法である。また電気泳動用キャピラリー中には泳動液が含まれる。泳動液が、キャピラリー内において酵素溶液の溶媒も兼ねる場合には全ての酵素にとって最も反応効率の良い緩衝液を泳動液に適用することが好ましい。
【0026】
また、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、試料を前記電気泳動用キャピラリーに投入する試料導入工程を有する。「試料」には、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素と反応する成分と、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素と反応しない成分とが同時に含まれていてもよい。あるいは、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素と反応する成分のみが含まれていてもよい。あるいは、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する成分が含まれていなくてもよい。
【0027】
更にまた、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、酵素及び試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程を有する。この混合工程では、試料中にコンドロイチン硫酸又はその塩が含まれている場合には、前記酵素と前記試料とが反応し、生成物を生じる方が好ましい。反応は、異なる速度で移動してきた前記酵素と、前記試料とが混ざり合う箇所で起こる。混合する際には低い電圧で電気泳動させ、その後高い電圧で電気泳動させ分離することが好ましい。
【0028】
更にまた、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、好ましくは前記電気泳動用キャピラリーから流出した泳動液を検出する検出工程を有し、更に好ましくは生成物を検出できる工程を有する。
【0029】
検出手段は限定されるものではなく、好ましくは公知の検出手段が用いられる。例えば紫外可視吸収検出器、フォトダイオードアレイ検出器を用いることができる。
【0030】
インキャピラリー酵素反応法とは、まず試料と酵素とを別々に注入した後電気泳動分離を開始し、それぞれ異なる速度で移動する試料と酵素とが混合する場所で反応を起こさせ、続けて、移動してきた反応生成物を分析するというものである。
【0031】
図1(A)から図1(C)にインキャピラリー酵素反応法の概略を示す。図1(A)では、キャピラリー10に泳動液12が充填されている。前記キャピラリー10に酵素溶液11を流入口16から導入した場合を示している。
【0032】
図1(B)は、前記キャピラリー10中で酵素溶液11と試料溶液13とが流入口16から導入された後の混合工程を示す。酵素溶液とは、一般には酵素を泳動液に溶解した溶液であり、試料溶液とは、一般には試料を泳動液に溶解した溶液である。このときの電圧は後の電気泳動よりも低い電圧であることが好ましい。また、生成物である不飽和コンドロ二糖は負電荷を帯びているため、流入口16に陰極18を、流出口17に陽極19を設け、電流を陰極18から陽極19に向かって電気泳動を行うことが好ましい。酵素反応は速く移動するゾーン、(例えば、試料溶液13)が遅く移動するゾーン、(例えば、酵素溶液11)を追い越すことを利用して、両者が混合した際に反応ゾーン14にて反応を起こさせる)。従って、図1(A)の導入工程では、試料溶液13と酵素溶液11とで電気泳動の移動度を比較し遅く移動する方(例えば酵素溶液11)を先にキャピラリーに導入し、電気泳動で速く移動する方(例えば試料溶液13)を後にキャピラリーに導入することが好ましい。試料溶液13と酵素溶液11とを導入する際には、間隔が空いてもよいが、間隔が空かなくてもよい。好ましくは間隔が空かない。
【0033】
図1(C)の段階では、混合工程よりも高い電圧をかけることが好ましい。電気泳動は、陰極18から陽極19に進行し、流出口17より生成物15が分離される。生成物15は酵素溶液11よりも移動度の速い場合がある。
【0034】
【実施例】
[装置]
フォトダイオードアレイ検出器(検出波長:232nm)を接続したキャピラリー電気泳動装置(アジレントCE、アジレントテクノロジー社)を用いた。キャピラリー温度は37℃、印加電圧は−30kv、試料注入はすべて加圧注入法(50mbar)を用いた。キャピラリー内壁への酵素の吸着を防ぐためにポリビニルアルコール(PVA)コーティングを施したキャピラリー(50μm内径;375μm外径;有効長56cm;全長64.5cm)はアジレントテクノロジー社製のものを用い、検出感度向上のためバブルセルキャピラリーを用いた。キャピラリーは、毎分解析前に泳動液でフラッシング(3分間)を行った。すべてのデータは、ケムステーションソフトウェア(アジレントテクノロジー社)にて、解析を行った。
【0035】
[試薬及び試液]
医薬品原料コンドロイチン硫酸ナトリウム塩(サメ)、コンドロイチン硫酸Cナトリウム塩(サメ軟骨)SSG、コンドロイチン硫酸Aナトリウム塩(クジラ軟骨)SSG、コンドロイチン硫酸Dナトリウム塩(サメ軟骨)、コンドロイチン硫酸Eナトリウム塩(イカ軟骨)は、生化学工業株式会社(日本)より購入した。
【0036】
コンドロイチナーゼABC(Proteus vulgaris)、コンドロ−4−スルファターゼ(Proteus vulgaris)は、生化学工業株式会社より購入した。2−O−スルファターゼ(Flavobacterium heparinum)は、シグマ社(アメリカ)より購入した。不飽和コンドロ二糖類(2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−D−ガラクトース:ΔDi−nonS、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−4−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−4S、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−6−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−6S、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(2−O−スルフォーβ−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−6−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−diSD、2−アセトアミド−2−デオキシ−3−O−(β−グルコ−4−エノピラノシルロニック アシド)−4,6−ビス−O−スルフォ−D−ガラクトース:ΔDi−diSE)は、生化学工業株式会社より購入したものをピーク同定に使用した。
【0037】
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、フタル酸水素カリウム、カルバゾール、四ホウ酸ナトリウム十水和物及び硫酸は、和光純薬(日本)製のものを用いた。酢酸は国産化学(日本)より購入した。全ての試薬は特級を用いた。
【0038】
コンドロイチン硫酸溶液は、コンドロイチン硫酸を10mmol/Lの、トリス−酢酸緩衝液(pH7.0)に溶解させて調製した。同様に、酵素溶液も酵素を10mmol/Lの、トリス−酢酸緩衝液(pH7.0)に溶解させて調製した。調製した泳動液は、0.45μm水系メンブランフィルター(日本ポール株式会社、日本)にてろ過後使用した。
【0039】
[参考例1]
インキャピラリー酵素反応法において、生成する生成物のピークの帰属を決定するために、不飽和コンドロ二糖類の分離条件の検討を行った(図1(A)から(C)参照)。泳動液12はキャピラリー内において酵素溶液の溶媒も兼ねるため、全ての酵素にとって最も反応効率の良い緩衝液を泳動液12に適用する必要がある。そこで、10mmol/Lトリス−酢酸緩衝液(pH7.0)を選択した。キャピラリーは、酵素の吸着を防ぐためポリビニルアルコールコーティングを施したものを用いた。上記緩衝液中では不飽和コンドロ二糖類は負電荷を帯びているため、印加電圧を逆転させ陰極16から陽極17に向かって電気泳動を行った。
【0040】
上記の条件で分離を行った不飽和コンドロ二糖類のエレクトロフェログラムを図2に示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク21からピーク25は、不飽和コンドロ二糖類のピークである。ピーク21のΔDi−diSDと、ピーク22のΔDi−diSEについてはベースライン分離が達成されていない。しかし、本研究の最終目標はすべての不飽和コンドロ二糖類をピーク25のΔDi−nonSに変換して分析することであるため、この分離条件で問題はないと判断した。図2のピークの帰属を基準とし、インキャピラリー酵素反応法における生成物のピークの帰属を行った。
【0041】
[参考例2]
オフライン酵素反応法は、以下の手順で行った。コンドロイチン硫酸ナトリウム水溶液(1mg/mL)1mLに内標準溶液1mLを加え、10mmol/Lトリス−酢酸緩衝液(pH7.0)を加えて10mLとし、孔径0.45μm水系メンブランフィルターでろ過した。内標準物質は塩酸フェニレフリン20mgを水に溶かし、100mLとしたものを用いた。ろ液500μLを取り、コンドロイチナーゼABC溶液(12.5units/mL)2μLを加え、37℃で60分間インキュベーションを行い、酵素反応を進行させた。この混合溶液から50μLをとり、加圧注入法(50mbar×5秒間)で導入し、印加電圧−30kVで電気泳動を行った。電気泳動開始前の試料溶液中のコンドロイチン硫酸の量と開始後の生成物のトータル量とを比較して、コンドロイチン硫酸のトータル量に変化は無いことを確かめた。次に、コンドロイチナーゼABC反応後の試料溶液50μLをとり、コンドロ−4−スルファターゼ溶液(1.25units/mL)2μL、コンドロ−6−スルファターゼ溶液(1.25units/mL)2μL、及び2−O−スルファターゼ溶液(12.5units/mL)2μL、を加え、37℃で90分間インキュベーションを行った。ここから50μLをとり加圧注入法(50mbar×5秒間)で導入し、印加電圧−30kVで電気泳動を行った。それぞれの酵素反応を止めるためには反応チューブを100℃で1分間加熱した。このときのエレクトロフェログラムでは、内標準物質のピーク、並びに、異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピークが確認された。
【0042】
[実施例1]
インキャピラリー酵素反応法は以下の手順で行った。酵素溶液(コンドロイチナーゼABC0.25units/mL、コンドロ−6−スルファターゼ0.25units/mL、コンドロ−4−スルファターゼ0.25units/mL、2−O−スルファターゼ2.5units/mL、10mmol/Lトリス−アセテート(pH7.0)、緩衝溶液)とコンドロイチン硫酸ナトリウム塩又は不飽和コンドロ二糖類を含む試料溶液13(0.1mg/mL、10mmol/Lトリス−アセテート(pH7.0))とを、続けて加圧注入法(酵素10sec、試料溶液5sec)でキャピラリーに注入した(図1(A)及び図1(B)参照)。印加電圧−0.2kVで混合時間を20分間とった後、−30kVで電気泳動を行った。このときのエレクトロフェログラムでは内標準物質のピーク及び、異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピークが確認された。
【0043】
[実施例2]
インキャピラリー酵素反応法における導入順序の検討を行った。インキャピラリー酵素反応法では、酵素と基質の移動度が異なることがキャピラリー内での両者の混合を可能にする。すなわち電気泳動において、速く移動するゾーンが遅く移動するゾーンを追い越すときを利用して反応を起こさせるからである(図1(A)から(C)参照)。そこで、実際に各酵素と基質の導入順序を変えたときの変換効率への影響を調べた。
【0044】
実施例1の試料溶液と酵素溶液とを用いて酵素反応を行った。まずコンドロイチナーゼABCについて調べたところ、酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0045】
[実施例3]
実施例2と同様に、酵素にコンドロ−4−スルファターゼを用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0046】
[実施例4]
実施例2と同様に、酵素にコンドロ−6−スルファターゼを用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0047】
[実施例5]
実施例2と同様に、酵素に2−O−スルファターゼを用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0048】
[実施例6]
実施例2と同様に、酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合溶液を用いた酵素溶液の場合における導入順序の検討を行った。その結果、実施例2と同様に酵素を先に導入し基質(試料溶液)を続けて導入する順番のほうが、その逆よりも不飽和コンドロ二糖類の生成量が多いことがわかった。
【0049】
実施例2から実施例6の結果の比較を行った結果、いずれの酵素においても、酵素を先に基質を後にという順番のほうが反応効率が良いことが示された。参考例2のオフライン法にて酵素反応した溶液を電気泳動分析した結果と比較して、ΔDi−nonSの生成量は、酵素−基質の順で注入した場合48.3%であったのに対して、その逆は6.8%にとどまった。以上の結果から、全ての酵素を一度に注入し、その後注入したコンドロイチン硫酸ナトリウム塩がキャピラリー内で酵素群を追い抜く間に反応を起こさせることが可能であることが示された。
【0050】
[実施例7及び比較例1]
インキャピラリー酵素反応法における酵素変換率を上げる検討を行った。参考例2の酵素の変換効率と、実施例1の混合時間を20分から30分に増やしたときの酵素の変換効率と、を比較した。その結果、混合時間を20分から30分に増やすことにより、参考例2のオフライン酵素反応と比較して99.2%の変換効率を達成した。そのときのエレクトロフェログラムを図3に示す。
【0051】
図3(A)は、参考例2のオフライン酵素反応を行ったときのエレクトロフェログラムを、図3(B)は、混合時間を20分から30分に増やして酵素反応を行った(オンライン)とき、すなわち実施例7のエレクトロフェログラムを示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク25は、不飽和コンドロ二糖であるΔDi−nonSのピークである。なお、インキャピラリー酵素反応法におけるベースラインのドリフトは酵素溶液に含まれる牛血清アルブミン(BSA)由来であることを確認した。
【0052】
[実施例8]
インキャピラリー酵素反応法の有用性を確かめるため、様々なコンドロイチン硫酸の分析を行った。
【0053】
コンドロイチン硫酸を含む様々な試料を実施例1の条件で酵素反応を行った。試料溶液には、サメ由来のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩(以下CS)、を実施例1の試料溶液と同様に調製したものを用いた。酵素にはコンドロイチナーゼABCのみを用いインキャピラリー酵素反応法にてこれらの試料溶液の分析を行った。このときのエレクトロフェログラムを図4に示す。
【0054】
[実施例9]
試料溶液に、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Cナトリウム塩(以下CS―C)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図5に示す。
【0055】
[実施例10]
試料溶液に、クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩(以下CS―A)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図6に示す。
【0056】
[実施例11]
試料溶液に、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Dナトリウム塩(以下CS―D)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図7に示す。
【0057】
[実施例12]
試料溶液に、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Eナトリウム塩(以下CS―E)を用い、実施例8と同様の測定を行った。このときのエレクトロフェログラムを図8に示す。
【0058】
実施例8から実施例12の結果をそれぞれ図4から図8に示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク21からピーク25は、不飽和コンドロ二糖類のピークである。ここではそれぞれの種におけるコンドロイチン硫酸構成糖の種類及びその比率を知ることができた。図4よりCSでは、その構成糖はΔDi−6Sが最も多く、ΔDi−4S及びΔDi−diSDが続いて多く含まれることがわかった。図5より高純度精製品であるCS―Cでは、CSよりもさらにΔDi−6Sが多く含まれることがわかった。図6よりCS−Aでは、その構成糖はΔDi−4Sが最も多く、その他にΔDi−6Sが含まれることがわかった。図7よりCS−Dでは、他のコンドロイチン硫酸と比較してΔDi−diSDが多く含まれることがわかった。またピーク26、ピーク27で表されたピークは未知ピークであり、硫酸基がさらに異なる位置に結合した異性体か、不完全切断オリゴ糖由来であると推定される。図8よりCS−Eでは、他のコンドロイチン硫酸と比較してΔDi−diSEが多く含まれることがわかった。またここでもさらなる未知ピークが確認された。
【0059】
[実施例13]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCSをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図9に示す。
【0060】
[実施例14]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Cをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図10に示す。
【0061】
[実施例15]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Aをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図11に示す。
【0062】
[実施例16]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Dをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図12に示す。
【0063】
[実施例17]
酵素にコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼ混合物を用いてCS―Eをインキャピラリー酵素反応法にて分析を行った。このときの測定条件は実施例8と同様である。得られたエレクトロフェログラムを図13に示す。
【0064】
実施例13から実施例17の結果をそれぞれ図9から図13に示す。ピーク20は内標準物質のピークであり、ピーク21からピーク25は、不飽和コンドロ二糖類のピークである。5種のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩を調べたが、4酵素系でのインキャピラリー酵素反応法を行ったところ、CS−Eを除いて、いずれも生成ピークはΔDi−nonSのみとなりコンドロイチン硫酸トータル量の定量法として有用であることが示された。なお、CS−Eに関しては、その構成糖に複雑な硫酸基組成を持った異性体が含まれる可能性、あるいは製造過程での不純物の存在なども考えられ、設定した分析法をそのまま適用するのは難しいと考えられる。ただし医薬品に配合されるコンドロイチン硫酸ナトリウム塩は、そのほとんどがCS―Cであるため、実際の運用に関しては問題ないと考える。
【0065】
[実施例18]
市販製剤のインキャピラリー酵素反応法は、以下の手順で行った。点眼剤2mLをとり、内標準溶物質2mLと10mmol/Lトリス−酢酸緩衝液(pH7.0)を加えて20mLとした。これを孔径0.45μm水系メンブランフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。実施例2と同様に印加電圧−0.2kVで混合時間を20分間とった後、−30kVで電気泳動を行った。基準物質(コンドロイチン硫酸ナトリウム塩(サメ))は、対応量を量り、内標準物質2mLを加え、10mmol/Lトリス‐酢酸緩衝液(pH7.0)を加えて20mLとし、孔径0.45μm水系メンブランフィルターでろ過し、ろ液を標準溶液とした。内標準物質には塩酸フェニレフリン20mgを水に溶かし、100mLとしたものを用い、実施例1と同様に、印加電圧−0.2kVで混合時間を20分間とった後、−30kVで電気泳動を行った。このときのエレクトロフェログラムでは内標準物質のピーク及び、異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピーク及び他成分のピークが確認された。
【0066】
[参考例3]
カルバゾール法による製剤分析法は、以下の手順で行った。カルバゾール法は、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩をホウ酸ナトリウム硫酸試液により加水分解を行う。加水分解によって生成したグルクロン酸とカルバゾールとの反応で生じる生成物を525nmにて吸光度測定を行う方法である。なお、夾雑物による妨害を取り除くため、あらかじめ固相抽出カラムにてクリーンアップした試料を反応に用いた。装置にスペクトロフォトメーター(日立製作所日本)を用いた。このときの分析結果では異性体を含むコンドロイチン硫酸由来のピークが確認された。
【0067】
[実施例19]
市販点眼剤中のコンドロイチン硫酸の定量を行い、分析法のバリデーションを検討した。
【0068】
実施例2の手順で試料溶液を調整した。なお、このときの内標準物質としてフタル酸水素カリウムを用い、標準溶液、試料溶液及び各成分抜き試料を用いて特異性を確認した。代表的なエレクトロフェログラムを図14に示す。ピーク20は標準溶液のピークであり、ピーク25は、不飽和コンドロ二糖類ΔDi−nonSのピークである。ΔDi−nonS及び内標準物質の移動時間には妨害となるピークは認められなかった。なお、クロマトグラム上に認められたピークは他配合成分由来である。
【0069】
標準溶液、試料溶液及び酵素溶液の安定性を確認したところ、遮光容器中で少なくとも室温24時間までは酵素反応は問題なく行われ、安定性は確保できることを確かめた。
【0070】
S/N=3より求めた検出限界を表1に示す。
【0071】
【表1】
【0072】
表1よりコンドロイチン硫酸濃度25μg/mL〜150g/mLの範囲の標準溶液で直線性を確認したところ、ほぼ原点を通り、かつ相関係数0.999以上の良好な直線が得られた。
【0073】
成分抜き試料に、定量濃度の80、100、120%になるように各成分標準溶液を添加し(n=3)、回収率及び精度を確認した。その結果、回収率は100.0〜100.5%と良好な値が得られた。また、精度に関しても、0.2〜0.6%RSDであり良好な結果であった。
【0074】
また市販点眼剤中の成分の定量をインキャピラリー酵素反応法で行うと同時に、カルバゾール法との比較も行った。
【0075】
実施例18及び参考例3の分析結果の比較を行った。なお、カルバゾール法では夾雑物による妨害を取り除くため、予め固相抽出カラムにてクリーンアップした試料を反応に用いた。その結果、いずれの成分の定量値も同等な値が得られ、インキャピラリー酵素反応法の妥当性を示した。また、精度の面においてもカルバゾール法に比較して良好な結果であった(表2参照)。
【0076】
【表2】
【0077】
以上の結果より、インキャピラリー酵素反応法の従来法に置き換わる医薬品品質管理法としての利用可能性が示された。
【0078】
【発明の効果】
本発明は、コンドロイチン硫酸又はその塩と反応する酵素を電気泳動用キャピラリーに導入する酵素導入工程と、試料を前記電気泳動用キャピラリーに導入する試料導入工程と、前記酵素及び前記試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程と、を備えたコンドロイチン硫酸又はその塩を分析する方法であり、これによりコンドロイチン硫酸又はその塩の定性分析又は定量分析に適用できる。
【0079】
本発明は、比色法と比較して操作の簡便さ、安全性、迅速性、自動化の面で有用性が高い。また酵素消費量の大幅な削減が可能である。従来の高速液体クロマトグラフィーでは高価な酵素溶液をμLレベルで調製しなければならないが、本発明ではnLレベルでの調製が可能であると考えられる。
【0080】
酵素としてコンドローチナーゼABCのみを用いることにより、コンドロイチン硫酸又はその塩の構成糖の組成分析が可能になった。又、酵素としてコンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼの混合溶液を用いた場合には、コンドロイチン硫酸又はその塩のトータル量の分析が可能になった。従って、コンドローチナーゼABCのみの酵素バイアルと、コンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼの混合溶液を用いた酵素バイアルと、を用意するだけで、コンドロイチン硫酸トータル量分析と組成分析の両者が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明によるインキャピラリー酵素反応法の概略の断面図を示す図である。図1(A)は、酵素溶液11を注入した直後の断面を示す図である。図1(B)は、更に試料溶液13を注入した直後の断面を示す図である。図1(C)は生成物15が酵素溶液11より先行している状態の断面を示す図である。
【図2】本発明の参考例1による不飽和コンドロ二糖類のエレクトロフェログラムを示す図である。
【図3】図3(A)は、参考例2又は比較例1のエレクトロフェログラムであり、図3(B)は、本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図4】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図5】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図6】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図7】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図8】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図9】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図10】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図11】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図12】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図13】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【図14】本発明のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法で得られたエレクトロフェログラムを示す図である。
【符号の説明】
10・・・キャピラリー
11・・・酵素溶液
12・・・泳動液
13・・・試料溶液
14・・・反応ゾーン
15・・・生成物
16・・・流入口
17・・・流出口
18・・・陰極
19・・・陽極
20・・・標準溶液のピーク
21・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−diSDのピーク
22・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−diSEのピーク
23・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−4Sのピーク
24・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−6Sのピーク
25・・・不飽和コンドロ二糖であるΔDi−nonSのピーク
26,27・・・未知ピーク
Claims (8)
- コンドロイチン硫酸又はその塩に対して反応をする酵素を電気泳動用キャピラリーに導入する酵素導入工程と、
この酵素導入工程と同時もしくは前後して、試料を前記電気泳動用キャピラリーに導入する試料導入工程と、
前記酵素導入工程と前記試料導入工程とを経た後に、これらの各工程で前記電気泳動用キャピラリーに導入された前記酵素及び前記試料を前記電気泳動用キャピラリー中で電気泳動させ、前記酵素及び前記試料を混合する混合工程と、
を備えたコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。 - 前記酵素がコンドロイチン硫酸又はその塩の分解酵素である請求項1に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
- 前記分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロ−4−スルファターゼ、コンドロ−6−スルファターゼ及び2−O−スルファターゼからなる群から選ばれる1種又は2種以上のものを含む請求項2に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
- 前記分解酵素がコンドロイチナーゼABCである請求項2に記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
- 前記酵素導入工程の後に前記試料導入工程が行われる請求項1から4のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
- 前記試料がコンドロイチン硫酸又はその塩を含むものである請求項1から5のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
- 前記酵素導入工程、前記試料導入工程及び前記電気泳動工程をオンラインで行う請求項1から6のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
- 前記電気泳動用キャピラリーから流出した泳動液を検出する検出工程を更に有する請求項1から7のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法。
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