CN112352156A - 试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的分析方法、硫酸软骨素或其盐的定量方法及制品的品质管理试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的分析方法，其特征在于，包含将含有酸性粘多糖或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验，上述定性试验包含将上述试验样品提供给使用膜的电泳的电泳工序，用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及由上述染色中所得的带型确认上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序，上述定量试验包含通过使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素的比色法对上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序。

Description

试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的分析方法、硫酸软骨 素或其盐的定量方法及制品的品质管理试验方法

技术领域

本发明涉及试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的分析方法。此外，本发明涉及试验样品中所含的硫酸软骨素或其盐的定量方法。此外，本发明涉及含有酸性粘多糖或其盐的制品的品质管理试验方法。

背景技术

酸性粘多糖为结构中具有羧酸等酸性基的粘多糖。酸性粘多糖，根据构成其二糖单元的糖醛酸(或半乳糖)及氨基糖的种类及组合，分类为硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素等。由于酸性粘多糖在体内表现出生理活性，因此其定性及定量，在对健康食品或医药品所期待的效果进行预测或判定时，或在制品的品质管理等中有用。

硫酸软骨素具有D-葡糖醛酸与N-乙酰-D-半乳糖胺键合而得的二糖单元的重复结构，为N-乙酰-D-半乳糖胺的一部分羟基被硫酸化的酸性粘多糖。

作为硫酸软骨素的定量法，已知有用硫酸软骨素酶ABC对硫酸软骨素进行水解，用HPLC测定所生成的不饱和二糖类的量的HPLC法。作为HPLC法以外的硫酸软骨素量的定量方法，有检测具有硫酸基的化合物的硫酸钡重量法、检测葡糖醛酸或脱硫化物的咔唑硫酸法、检测酸性粘多糖的阿尔新蓝比色法等分析方法。

作为分离多种酸性粘多糖的方法，探讨有膜电泳法。非专利文献1中记载有，用硝化纤维素膜Immobilon(制品名，Millipore)对含有硫酸软骨素等酸性粘多糖的样品进行电泳，通过实施阿尔新蓝染色来实施酸性粘多糖的分离及鉴定。于该非专利文献1中使用的膜为硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜。

非专利文献

非专利文献1：VolpiN.,Anal.Biochem.,240,114-118(1996)。

发明内容

将酸性粘多糖作为健康食品或医药品的有效成分调配时，制品中所含的酸性粘多糖的种类及量的确定较为重要。然而，由于酸性粘多糖构成单元的结构类似，特异性也类似的情况较多，为难以分析的成分之一。如上所述，作为硫酸软骨素的定量法，已知有HPLC法，但用HPLC法对制品等进行分析时，存在容易受制品中调配的赋形剂或其他原料(例如阻碍酶的多酚等)的影响的问题。此外在HPLC法中，需要昂贵且大型的HPLC装置等，用于硫酸软骨素的分解的水解酶，或用于鉴定硫酸软骨素的标准品也昂贵，还存在因来源而适合的标准品并无销售的情况。由此，期望可以不使用这样的大型的装置，以更低成本，简便地分析酸性粘多糖或其盐的方法。如上所述，还已知HPLC法以外的定量方法，然而就硫酸钡重量法而言，由于酸性粘多糖以外的硫酸基也得到定量，在特异性方面存在课题。在基于咔唑硫酸法及阿尔新蓝比色法的定量中，也无法确认样品中所含的酸性粘多糖的种类。在非专利文献1中，通过电泳分离多种酸性粘多糖，并用密度计测定膜上的条带密度，但认为在该条带的密度测定中，健康食品等酸性粘多糖的定量很难以高精度来实施。

本发明的目的在于，提供可以简便的工序，实施含有酸性粘多糖或其盐的样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类的确认及定量的分析方法。

本发明者等为了解决上述课题进行深入研究，其中，注目于作为对酸性粘多糖进行定量的方法之一的阿尔新蓝比色法等比色法(比色定量法)。且发现，如果组合以下试验：即，将含有酸性粘多糖或其盐的试验样品提供给膜电泳来展开后，用阿尔新蓝进行染色，由所得的带型确认该样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类的定性试验，和通过比色法对试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的定量试验，可以简便的工序，评价试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的总量和质(种类)。如此组合定性试验和定量试验的分析方法，当试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种时，也可用于该酸性粘多糖或其盐的定量。如此组合定性试验和基于比色定量法的定量试验来分析试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的方法，至今尚未有报告。

即，本发明涉及以下分析方法等。

[1]一种试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的分析方法，其特征在于，包含将含有酸性粘多糖或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验，上述定性试验包含将上述试验样品提供给使用膜的电泳的电泳工序，用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及由上述染色中所得的带型确认上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序，上述定量试验包含通过比色法对上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素。

[2]根据上述[1]所述的分析方法，其特征在于，上述酸性粘多糖为选自硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、肝素及硫酸乙酰肝素中的1种以上。

[3]根据上述[1]或[2]所述的分析方法，其特征在于，上述酸性粘多糖为硫酸软骨素。

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的分析方法，其特征在于，可检测上述酸性粘多糖或其盐的色素为阿尔新蓝或咔唑。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的分析方法，其特征在于，可检测上述酸性粘多糖或其盐的色素为阿尔新蓝。

[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的分析方法，其特征在于，通过上述定性试验，确认上述试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种时，将通过上述定量试验而得的定量结果作为上述酸性粘多糖或其盐的含量。

[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的分析方法，其特征在于，上述膜为硝化纤维素膜、醋酸纤维素膜或硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜。

[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的分析方法，其特征在于，上述膜为硝化纤维素膜或醋酸纤维素膜。

[9]一种试验样品中所含的硫酸软骨素或其盐的定量方法，其特征在于，包含将含有硫酸软骨素或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验，上述定性试验包含将上述试验样品提供给使用膜的电泳的电泳工序，用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及由上述染色中所得的带型确认上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序，上述定量试验包含通过比色法对上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素，根据上述定性试验，确认上述试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐仅为硫酸软骨素或其盐时，将通过上述定量试验而得的定量结果作为上述硫酸软骨素或其盐的含量。

[10]一种含有酸性粘多糖或其盐的制品的品质管理试验方法，其特征在于，包含，将上述制品作为试验样品，通过上述[1]～[8]中任一项上述的分析方法进行分析的试验样品分析工序，通过上述分析方法对含有浓度及种类已知的酸性粘多糖或其盐的标准样品进行分析的标准样品分析工序，及将上述分析中所得的试验样品的定性试验结果及定量试验结果与标准样品的定性试验结果及定量试验结果进行对比来评价上述制品的品质的评价工序。

根据本发明，提供可以简便的工序，实施含有酸性粘多糖或其盐的样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类的确认及定量的分析方法。本发明的分析方法在食品、医药品等中所含的酸性粘多糖或其盐的分析、含有酸性粘多糖或其盐的制品的品质管理等方面有用。

附图说明

图1为显示通过使用醋酸纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)的带型的照片。

图2为显示通过使用醋酸纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)的带型的照片。

图3为显示通过使用硝化纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)的带型的照片。

图4为显示通过使用硝化纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)的带型的照片。

图5为显示通过使用醋酸纤维素膜或硝化纤维素膜的电泳而得的鲨鱼软骨原料的酶处理物及酸性粘多糖样本的酶处理物的带型的照片((a)：醋酸纤维素膜，(b)：硝化纤维素膜)。

图6为显示通过醋酸纤维素膜对鲨鱼软骨原料及硫酸软骨素C钠的无酶处理样本、链霉蛋白酶处理样本，以及链霉蛋白酶E及硫酸软骨素酶ABC处理样本进行电泳而得的带型的照片。

图7为图1中所示照片的带型的示意图((a)：图1(a)的示意图，(b)：图1(b)的示意图)。

图8为图2中所示照片的带型的示意图((a)：图2(a)的示意图，(b)：图2(b)的示意图)。

图9为图3中所示照片的带型的示意图((a)：图3(a)的示意图，(b)：图3(b)的示意图)。

图10为图4中所示照片的带型的示意图((a)：图4(a)的示意图，(b)：图4(b)的示意图)。

图11为图5中所示照片的带型的示意图((a)：图5(a)的示意图，(b)：图5(b)的示意图)。

图12为图6中所示照片的带型的示意图。

具体实施方式

＜酸性粘多糖或其盐的分析方法＞

本发明的分析方法为试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的分析方法，其特征在于，包含将含有酸性粘多糖或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验。在本发明中，定性试验包含以下工序：将上述试验样品提供给使用膜的电泳的电泳工序，用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及由上述染色中所得的带型确认上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序。定量试验包含以下工序：通过比色法对上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素。

本说明书中，也将可检测酸性粘多糖或其盐的色素简单地称为色素。

酸性粘多糖为具有糖醛酸(艾杜糖醛酸或葡糖醛酸)或半乳糖与氨基糖键合而成的二糖单元的重复结构，并在其结构中具有酸性基(羧基、硫酸基)的酸性多糖。酸性粘多糖通常具有无分支的直链状的骨架。作为酸性粘多糖，可列举硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素等。本发明的分析方法中的试验样品只要含有1种以上酸性粘多糖或其盐即可。盐并无特别限定，可列举钠、钾等碱金属盐；钙、镁等碱土金属盐等。优选为碱金属盐，更优选钠盐。

在本发明中，酸性粘多糖优选为选自硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、肝素及硫酸乙酰肝素中的1种以上。本发明的分析方法适合用于含有这些的1种或2种以上的酸性粘多糖或其盐的试验样品的分析。其中，作为酸性粘多糖，更优选硫酸软骨素或透明质酸，进一步优选硫酸软骨素。本发明的分析方法更适合用于含有硫酸软骨素或其盐的试验样品的分析。在本发明中，硫酸软骨素是指硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E，可为这些的1种，也可为2种以上。硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)不包含于本发明中的硫酸软骨素中。作为硫酸软骨素，优选硫酸软骨素C。另外在本发明中，硫酸软骨素C含有硫酸软骨素C作为主成分，也包含含有1种以上其他的硫酸软骨素的情况。

作为含有酸性粘多糖或其盐的试验样品，例如可列举食品(包含健康食品)、医药品、化妆品、它们的原料(例如鲨鱼软骨萃取物，猪软骨萃取物、乌贼软骨萃取物、鲑鱼软骨萃取物等)等。

在本发明的分析方法中，通过组合上述定性试验和定量试验，可以简便的工序，实施试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的确认及定量。本说明书中，酸性粘多糖或其盐的种类是指酸性粘多糖或其盐中所含的酸性粘多糖的种类。

本发明的分析方法可实施例如，试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种或2种以上的确认，及该试验样品中的酸性粘多糖或其盐的定量。酸性粘多糖或其盐为1种(或2种以上)是指酸性粘多糖或其盐中所含的酸性粘多糖为1种(或2种以上)。例如，试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种时，可实施该酸性粘多糖或其盐的种类的确认(鉴定)及该试验样品中的该酸性粘多糖或其盐的定量。试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为2种以上时，本发明的分析方法可用于试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类的确认及它们的总量的定量。

在本发明中，实施定性试验及定量试验的顺序无特别限定。可在实施定性试验，确认试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类后实施定量试验，也可在通过定量试验对试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量后，实施定性试验，还可同时实施定性试验及定量试验。在一种方式中，优选在实施定性试验后实施定量试验。

在上述定性试验中，可通过以电泳工序、染色工序及检测工序的顺序实施，来确认试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类。

在电泳工序中，将试验样品提供给使用膜的电泳(膜电泳)。对于膜，可使用可用于电泳的多孔膜。作为这样的膜，可列举硝化纤维素膜、醋酸纤维素膜、硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜等。在一种方式中，作为上述膜，优选硝化纤维素膜、硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜。若使用这些膜，在通过电泳而得的带型中，酸性粘多糖或其盐的带形尖，分离良好。此外，若使用硝化纤维素膜、硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜，硫酸软骨素或其盐与其以外的酸性粘多糖或其盐的分离尤其良好。因此使用硝化纤维素膜或硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜的电泳在硫酸软骨素或其盐的检测中有利。试验样品含有硫酸软骨素或其盐时，或确认试验样品中存在硫酸软骨素或其盐时，优选使用硝化纤维素膜或硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜。

此外，在一种其他方式中，优选使用醋酸纤维素膜。若使用醋酸纤维素膜，透明质酸或其盐与其以外的酸性粘多糖或其盐的分离良好。例如，试验样品中含有透明质酸或其盐时，或确认试验样品中存在透明质酸或其盐时，优选使用醋酸纤维素膜。此外，若使用醋酸纤维素膜，硫酸软骨素或其盐与其以外的酸性粘多糖或其盐的分离良好。硫酸软骨素或其盐的检测中使用醋酸纤维素膜时，例如，优选如后所述，对试验样品实施硫酸软骨素酶ABC处理，并对比酶处理物的带型和未进行硫酸软骨素酶ABC处理的试验样品的带型。

膜的孔隙大小等并无特别限定，例如可使用孔隙大小为0.1～0.6μm的膜。膜上实施有疏水性的涂层时，优选在使用膜之前用亲水性溶剂进行清洗。

试验样品可根据期望溶解或悬浊于溶剂中，作为试验样品溶液提供给膜电泳。试验样品溶液的制备中所用溶剂并无特别限定，可使用水、电泳液等。电泳的电泳条件等并无特别限定，可使用一般的方法。电泳中所用电泳液或通电条件，优选考虑所得的带型的分辨率等来适当设定。电泳可以恒电流法实施，也可以恒电压法实施，优选以恒电流法实施。电泳时的电流例如可设置为5～100mA。电泳时间可根据电流大小等适当设定。

从酸性粘多糖或其盐的分离的观点出发，电泳液优选使用pH3～7的缓冲液。作为可作为电泳液使用的缓冲液，例如可列举醋酸钡缓冲液、醋酸-吡啶缓冲液等醋酸缓冲液等。由于酸性粘多糖或其盐的分离良好，使用硝化纤维素膜、硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜时，优选醋酸钡缓冲液，使用醋酸纤维素膜时，优选醋酸-吡啶缓冲液。pH可用市售的pH计来测定。

在一种方式中，从电泳图型更稳定的观点出发，电泳优选于小于10℃下进行，更优选于0～7℃，进一步优选于0～5℃下进行。电泳时，优选将电泳槽设置为上述温度来实施电泳。

上述电泳后的膜用阿尔新蓝进行染色(染色工序)。由于阿尔新蓝与酸性粘多糖或其盐键合，可以良好的灵敏度检测试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐。使用阿尔新蓝的染色，有操作简便的优点。此外，在定性试验中于酸性粘多糖或其盐的检测中使用阿尔新蓝，在后述定量试验中也通过使用阿尔新蓝的比色法(阿尔新蓝比色法)实施定量时，所得的定量结果反映定性试验中确认的酸性粘多糖或其盐的含量。

染色可通过将膜在阿尔新蓝溶液中浸渍规定时间，例如5～60分钟来实施。

染色后，使用脱色液对膜进行脱色。脱色液可使用通常的脱色液，优选酸性水溶液。作为酸性水溶液，例如可列举醋酸水溶液、甲酸水溶液等。脱色后的膜，显示由根据酸性粘多糖或其盐而移动度(也可称移动距离)有所不同的1种或2种以上的条带构成的带型(也可称电泳图型)。试验样品中不含酸性粘多糖或其盐时，通常检测不到条带。

在检测工序中，通过上述染色中所得的带型，确认上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类。带型可以目视来确认。酸性粘多糖或其盐的种类的确认中，包含确定(鉴定)试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类，确定试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种或2种以上。在一种方式中，试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种或2种以上可通过条带的数量来确认。

在定性试验中，除试验样品以外，优选使用酸性粘多糖或其盐的样本(标准物质)，或所含酸性粘多糖或其盐的种类已知的标准样品获得带型。酸性粘多糖或其盐的种类的确认，例如可通过比较酸性粘多糖或其盐的样本的条带的移动距离来实施。此外在其他方式中，也可以针对所含酸性粘多糖或其盐的种类已知的标准样品，以相同的方法实施定性试验，通过比较标准样品的带型和试验样品的带型来确认试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类。在一种方式中，预测到试验样品中的酸性粘多糖或其盐的来源时，作为样本，优选使用来源相同的酸性粘多糖或其盐的样本或含有来源相同的酸性粘多糖或其盐的标准样品。例如，试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐预测为鲨鱼软骨来源时，优选使用鲨鱼软骨来源的酸性粘多糖或其盐的样本或含有鲨鱼软骨来源的酸性粘多糖或其盐的标准样品。

此外，除试验样品以外，准备如后所述的试验样品的酶处理物，也可通过比较试验样品及该酶处理物的带型，确认试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类。

在一种方式中，本发明的分析方法适合鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素或其盐的分析。实施上述膜电泳时，可良好地分离硫酸软骨素以外的酸性粘多糖或其盐与鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素或其盐。因此，定性试验在鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素或其盐的检测中有利。本发明的分析方法特别适合用于试验样品中所含的鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素或其盐的分析。在电泳中，使用硝化纤维素膜或硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜时，硫酸软骨素以外的酸性粘多糖或其盐与鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素或其盐的分离尤其良好。

定性试验也可含有上述电泳工序、染色工序及检测工序以外的工序。在一种方式中，也可实施以分解试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的酶(以下，简单地称作酸性粘多糖分解酶)对试验样品进行处理而制备酶处理物(也可称酶处理样品)的工序。此时，优选用酸性粘多糖分解酶处理试验样品，针对所得酶处理物也实施电泳工序及染色工序来获得带型，并比较试验样品(未进行酶处理的试验样品)及酶处理物的带型。在本发明中，针对试验样品(未进行酶处理的样品)，可通过将如上所述的电泳中所得的条带的移动距离或带型与样本或标准样品比较，来确认试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类，进一步，通过比较试验样品(未进行酶处理的样品)及其酸性粘多糖分解酶处理物的电泳的带型，可更确切地确定试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类。根据试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类选择酸性粘多糖分解酶即可，例如在硫酸软骨素或其盐的情况下，可使用硫酸软骨素酶ABC。试验样品中检测的特定的酸性粘多糖或其盐的条带在以分解该酸性粘多糖或其盐的酶进行处理而得的酶处理物中消失(检测不出)时，确认试验样品中含有该酸性粘多糖或其盐。

在一种方式中，试验样品中含有硫酸软骨素或其盐时，或确认试验样品中存在硫酸软骨素或其盐时，也可实施用硫酸软骨素酶ABC对试验样品进行处理(分解)制备酶处理物的工序。除试验样品以外，用硫酸软骨素酶ABC对含有酸性粘多糖或其盐的试验样品进行处理，针对获得的酶处理物，实施电泳工序及染色工序获得带型，通过比较试验样品(未进行酶处理的试验样品)及酶处理物的带型，可以更好精度确认试验样品中是否含有硫酸软骨素或其盐。例如，试验样品中检测的酸性粘多糖或其盐的条带，在基于硫酸软骨素酶ABC的酶处理物中消失时，确认试验样品中含有硫酸软骨素或其盐。试验样品及酶处理物的带型的比较，可组合与上述样本的条带的移动距离的比较或与标准样品的带型的比较来实施。在一种方式中，分析含有硫酸软骨素或其盐的试验样品时，或确认硫酸软骨素或其盐的存在时，如上所述，优选用硫酸软骨素酶ABC对试验样品进行处理制备酶处理物，并对试验样品及酶处理物的带型进行比较。

在一种方式中，本发明的分析方法优选针对试验样品(未用酸性粘多糖分解酶进行处理的试验样品)、试验样品的酶处理物及样本(或标准样品)，实施电泳工序及染色工序获得带型，实施试验样品与样本(或标准样品)的带型的比较，及该试验样品与酶处理物的带型的比较，来确认试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类。此时，例如优选首先由试验样品及样本的带型的比较，确认试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类，接下来用酸性粘多糖分解酶对试验样品进行处理制备酶处理物，获得酶处理物的带型，与试验样品的带型进行比较。酸性粘多糖分解酶，根据由与样本的比较而确认的酸性粘多糖或其盐的种类，使用可分解该酸性粘多糖或其盐的酶即可。试验样品中检测的酸性粘多糖或其盐的条带在酶处理物中检测不到时，确认该酸性粘多糖或其盐的种类为通过与样本的比较确认的种类。

本发明的分析方法也可包含除蛋白质处理工序。例如，用酸性粘多糖分解酶处理试验样品时，在该处理前也可实施除蛋白质处理。实施除蛋白质处理时，基于酸性粘多糖分解酶的酸性粘多糖或其盐的分解发展更快。除蛋白质处理，在不损害本发明的效果的范围为并无特别限定，可列举用蛋白酶对试验样品进行处理的方法；使试验样品的pH变化的方法(例如，使pH为12以上)；通过有机溶剂的添加将蛋白质作为沉淀来去除的方法等。其中，由于操作简便，且之后的硫酸软骨素酶ABC等的酶处理简便，优选用蛋白酶进行处理的方法。蛋白酶可使用不分解酸性粘多糖或其盐的物质，优选链霉蛋白酶E。

实施上述硫酸软骨素酶ABC处理时，在硫酸软骨素酶ABC处理前，优选事先用链霉蛋白酶E对试验样品进行处理。

通过链霉蛋白酶E分解试验样品中的蛋白质，然后用硫酸软骨素酶ABC进行处理时，基于酶的硫酸软骨素或其盐的分解发生更快，从而优选。

硫酸软骨素酶ABC等酸性粘多糖分解酶、链霉蛋白酶E等的酶处理，可通过一般的方法来实施，根据酶的种类选择即可。例如，链霉蛋白酶E、硫酸软骨素酶ABC等的酶处理时的pH优选为7～9，温度优选为25～50℃。基于链霉蛋白酶E的处理时间，例如可设置为10～24小时。基于硫酸软骨素酶ABC的处理，例如可设置为0.5～2小时。实施酶处理时，根据需要使酶失活，以离心分离等公知的方法从样品中去除酶，提供给膜电泳即可。

定量试验包含通过比色法对上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素。

在使用色素的比色法中，例如，可向试验样品中添加色素，用分光光度计测定呈色液等溶液的吸光度，并由通过样本制作的校准曲线求得酸性粘多糖或其盐的含量。在基于比色法的定量中，试验样品中的酸性粘多糖或其盐的含量通常作为样本中使用的酸性粘多糖或其盐的含量来求取。可将如此获得的酸性粘多糖或其盐的含量，作为通过定量试验而得的定量结果使用。样本根据酸性粘多糖或其盐选择即可。定量试验中所使用色素中，可使用可用于酸性粘多糖或其盐的检测的色素(试剂)。优选为与酸性粘多糖或其盐键合的色素，更优选与酸性粘多糖或其盐键合且可在光学上进行检测的色素。从分析的精度等观点出发，作为色素，优选阿尔新蓝、咔唑，更优选阿尔新蓝。

作为上述色素使用阿尔新蓝时，通过阿尔新蓝比色法实施酸性粘多糖或其盐的定量。阿尔新蓝比色法可以通常的方法来实施。在阿尔新蓝比色法中，向试验样品中添加阿尔新蓝的溶液时，阿尔新蓝与酸性粘多糖或其盐形成复合体并沉淀。将该沉淀再次溶解于碱性的溶液中，用分光光度计测定所得溶液的吸光度。测定波长优选为570～660nm，更优选为590～640nm。由该吸光度，可基于事先通过样本制作的校准曲线计算酸性粘多糖或其盐的量。使用阿尔新蓝时，例如，用实施例中记载的方法，可实施试验样品中的酸性粘多糖或其盐的定量。阿尔新蓝比色法作为酸性粘多糖的定量方法，有操作简便，重现性高的优点。

作为上述色素使用咔唑时，酸性粘多糖或其盐的定量可通过咔唑硫酸法来实施。咔唑硫酸法可以通常的方法来实施。向试验样品中添加咔唑溶液和浓硫酸时，试验样品中若含有糖醛酸则呈现紫红色。用分光光度计测定呈色液的吸光度，由样本的校准曲线计算糖醛酸含量，求得硫酸软骨素或其盐的量。测定波长优选为500～600nm，更优选520～550nm。在定量试验中，也可根据需要用蛋白酶等对试验样品进行处理。蛋白酶可使用不分解酸性粘多糖或其盐的物质，优选为上述链霉蛋白酶E等。

在本发明中，于定量试验中，作为色素更优选使用阿尔新蓝。在定性试验及定量试验中，通过使用阿尔新蓝，在对含有酸性粘多糖或其盐以外的成分(以下，也称其他的成分)的制品等进行分析时，有分析精度更高的优点。此外，使用阿尔新蓝时，也在定量试验中的操作更简便的方面优选。在定性试验及定量试验中，使用阿尔新蓝时，在这些试验中仅酸性粘多糖或其盐可被检测或定量。即，定量试验中所得的定量结果，可作为反映定性试验中确定的酸性粘多糖或其盐的含量的结果。例如，在定性试验中，确认试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种时，使用该试验样品的定量试验中所得的定量结果，可判断为试验样品中所含的该酸性粘多糖或其盐的含量。从而，这样组合定性试验和定量试验，在这些试验中，通过在酸性粘多糖或其盐的检测中使用相同色素(阿尔新蓝)，可以简便的工序，精度良好地实施试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的确认及定量。

在一种方式中，通过上述定性试验，确认上述试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种时，可将通过上述定量试验而得的定量结果作为上述酸性粘多糖或其盐的含量。从而，本发明的分析方法，在试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种的情况下，可作为该酸性粘多糖或其盐的定量方法使用。根据本发明的分析方法，可以简便的工序对含有酸性粘多糖或其盐的食品、医药品、化妆品等，或它们的原料中所含的酸性粘多糖或其盐的种类及量进行分析确定。本发明的分析方法，在例如这样的食品、医药品、化妆品、其原料等的品质管理等中有用。

本发明的分析方法可作为试验样品中所含的硫酸软骨素或其盐的分析方法使用。作为含有硫酸软骨素或其盐的试验样品的分析方法时，优选在检测工序中，由上述染色中所得的带型，确认上述试验样品中的硫酸软骨素或其盐的存在。

本发明的分析方法可为一种试验样品中所含的硫酸软骨素或其盐的分析方法，其特征在于，包含将含有硫酸软骨素或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验，上述定性试验包含将上述试验样品提供给使用膜电泳的电泳工序，用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及由上述染色所得带型确认上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序，上述定量试验包含通过比色法对上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素。在这样的分析方法中，于定性试验中，确认上述试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐仅为硫酸软骨素或其盐时，可将通过上述定量试验而得的定量结果作为硫酸软骨素或其盐的含量。上述硫酸软骨素或其盐的分析方法可作为试验样品中的硫酸软骨素或其盐的定量方法使用。

本发明还包含以下试验样品中的硫酸软骨素或其盐的定量方法。

一种试验样品中的硫酸软骨素或其盐的定量方法，其特征在于，包含将含有硫酸软骨素或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验，上述定性试验包含将上述试验样品提供给使用膜的电泳的电泳工序，用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及由上述染色中所得的带型确认上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序，上述定量试验包含通过比色法对上述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素，根据上述定性试验，确认上述试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐仅为硫酸软骨素或其盐时，将通过上述定量试验而得的定量结果作为上述硫酸软骨素或其盐的含量。

在上述硫酸软骨素或其盐的定量方法中，定性试验及定量试验以及其优选方式与上述分析方法相同。硫酸软骨素及其优选方式等与上述分析方法相同。

＜含有酸性粘多糖或其盐的样品的品质管理试验方法＞

在本发明的含有酸性粘多糖或其盐的制品的品质管理试验方法中，包含将含有酸性粘多糖或其盐的制品作为试验样品，通过上述本发明的分析方法对该试验样品进行分析的试验样品分析工序，通过上述分析方法对含有浓度及种类已知的酸性粘多糖或其盐的标准样品进行分析的标准样品分析工序，及对上述分析中所得的试验样品的定性试验结果及定量试验结果和标准样品的定性试验结果及定量试验结果进行对比，来评价上述试验样品的品质的评价工序。

含有酸性粘多糖或其盐的制品并无特别限定，可列举作为上述分析方法中的试验样品使用的含有酸性粘多糖或其盐的食品、医药品、化妆品、它们的原料等。在本发明中，试验样品分析工序及标准样品分析工序任一工序均可首先进行。定性试验及定量试验以及它们的优选方式等，与上述分析方法中相同。酸性粘多糖或其盐，与上述分析方法相同。标准样品含有酸性粘多糖或其盐，为该酸性粘多糖或其盐的浓度(含量)及种类已知的样品。标准样品根据试验样品适当选择即可。例如，将含有标准量规定的酸性粘多糖或其盐的食品、医药品、化妆品等或其原料作为标准样品使用即可。

通过分别将试验样品分析工序中所得的试验样品的定性试验结果及定量试验结果与标准样品的定性试验结果及定量试验结果进行对比，可确认试验样品(制品)中所含的酸性粘多糖或其盐的种类及量是否与标准样品相同。在一种方式中，例如，当试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类与标准样品相同，试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的量与标准样品相同或比其多时，可判断作为该试验样品的制品满足品质标准。此外，在一种方式中，由于标准样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类为已知，从而通过比较定性试验结果，可确认试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类。在含有酸性粘多糖或其盐的制品的品质管理中，该制品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类及量的管理较为重要。根据本发明，可简便且客观地分析制品中所含的酸性粘多糖或其盐，并可评价该制品的品质。这样的品质管理方法，在含有酸性粘多糖或其盐的食品、医药品、化妆品、它们的原料等的品质管理中有用。

实施例

以下，基于实施例详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。

＜实施例1＞

将酸性粘多糖及鲨鱼软骨原料提供给电泳后，通过阿尔新蓝进行染色，由其条带的移动距离实施鲨鱼软骨原料中的酸性粘多糖的定性。

(1)分析所用机器等

·膜电泳装置(日本EIDO公司制，NA-4700)

·电源装置AE-3121LINEAR-POWER 2000(ATTO公司制)

·醋酸纤维素膜(制品名：SELECA-VSP，6×11cm，研华公司制)

·硝化纤维素膜(制品名：Nitrocellulose membranes，0.45μm，6×11cm或7×8.5cm，Bio-rad公司制)

·硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜(制品名：Nitrocellulose membrane，产品编号：MF membrane filters(0.45μm HA)，默克株式会社)

(2)分析所用试剂及原料

·透明质酸钠(MCH Medchemexpress公司制)

·硫酸软骨素C钠(Nacalai Tesque株式会社制)

·硫酸乙酰肝素(MCH Medchemexpress公司制)

·肝素钠(Santa Cruz Biotechnology公司制)

·硫酸皮肤素(Tronto res.Chem公司制)

·鲨鱼软骨原料(I)(制品名：鲨鱼软骨提取物粉末，日本药品株式会社制)

·鲨鱼软骨原料(II)(制品名：SCP，玛鲁哈日鲁株式会社制)

·阿尔新蓝8GX(Funakoshi株式会社制)

·吡啶、醋酸、醋酸钡(均为特级，Nacalai Tesque株式会社制)

·链霉蛋白酶E(科研制药株式会社制)

·硫酸软骨素酶ABC(Sigma-Aldrich公司制)

鲨鱼软骨原料(I)及鲨鱼软骨原料(II)含有鲨鱼软骨萃取物。鲨鱼软骨原料(I)及鲨鱼软骨原料(II)中含有20重量％的硫酸软骨素C(厂商的报告值)。

上述透明质酸钠、硫酸软骨素C钠、硫酸乙酰肝素、肝素钠及硫酸皮肤素作为样本使用。

(3)试剂的制备

1)25％甲醇水溶液

向250mL的甲醇中加入蒸馏水制成1L。

2)1.0M醋酸/吡啶缓冲液(醋酸-吡啶缓冲液)(pH3.5)

向醋酸60g中加入800mL的蒸馏水后用吡啶调整至pH3.5，制成1L。

3)0.1M醋酸钡缓冲液(pH5.0)

向醋酸钡25.5g中加入800mL的蒸馏水后用醋酸调整至pH5.0，制成1L。

4)阿尔新蓝溶液(染色液)

向阿尔新蓝8GX 5.0g中加入0.3％醋酸水溶液制成1L。

5)1％醋酸水溶液

向醋酸(10mL)中加入蒸馏水制成1L。

6)5％醋酸水溶液

向醋酸(50mL)中加入蒸馏水制成1L。

7)链霉蛋白酶E液(I)

向链霉蛋白酶E中加入蒸馏水，制备链霉蛋白酶E浓度3.4mg/mL的溶液。

8)链霉蛋白酶E液(II)

向链霉蛋白酶E中加入蒸馏水，制备链霉蛋白酶E浓度1.0mg/mL的溶液。

9)硫酸软骨素酶ABC液

在蒸馏水中溶解硫酸软骨素酶ABC，调整制备至10U/mL。

(4)分析用样品的制备

针对酸性粘多糖样本5种(透明质酸钠、硫酸软骨素C钠、硫酸乙酰肝素、肝素钠、硫酸皮肤素)，分别用蒸馏水制备0.1mg/mL水溶液。针对鲨鱼软骨原料(I)及(II)，分别用蒸馏水制备1.0mg/mL水溶液。将所得的样本水溶液、鲨鱼软骨原料水溶液作为分析用样品。

(5)分析步骤

(5-1)使用醋酸纤维素膜的评价

1)用铅笔向醋酸纤维素膜上绘入用于滴加分析用样品的线(5mm)。更具体而言，滴加用的线与膜的下边缘平行，以5mm的间隔，绘于距离膜的下边缘1cm的地方。滴加用的线离膜的右边缘及左边缘1cm以上。

2)将醋酸纤维素膜于25％甲醇水溶液中浸渍10分钟以上。

3)将醋酸纤维素膜于电泳液(1.0M醋酸/吡啶缓冲液)中浸渍30分钟。

4)从电泳液(1.0M醋酸/吡啶缓冲液)中取出膜，轻微干燥。

5)将分析用样品分别以带状滴加至醋酸纤维素膜。

6)向电泳槽的阴极侧及阳极侧注入电泳液(1.0M醋酸/吡啶缓冲液)后，以样品斑块位于阴极侧的方式，将醋酸纤维素膜设置于电泳槽中。

7)关闭电泳槽的盖，静置10分钟，使内部平衡化。

8)用11mA的恒电流进行10分钟电泳。

9)电泳结束后，取出膜，风干，并于阿尔新蓝溶液中浸渍10分钟进行染色。

10)用1％醋酸水溶液对膜进行脱色。

(5-2)使用硝化纤维素膜的评价

1)与上述醋酸纤维素膜的情况相同，用铅笔向硝化纤维素膜上绘入用于滴加分析用样品的线(5mm)。

2)将硝化纤维素膜(6×11cm或7×8.5cm)于电泳液(0.1M醋酸钡缓冲液)中浸渍10分钟以上。

3)从电泳液(0.1M醋酸钡缓冲液)中取出膜，轻微干燥。

4)将分析用样品分别以带状滴加至硝化纤维素膜。

5)向电泳槽的阴极侧及阳极侧注入电泳液(0.1M醋酸钡缓冲液)后，以样品斑块位于阴极侧的方式，将硝化纤维素膜设置于电泳槽中。

6)关闭电泳槽的盖，静置10分钟，使内部平衡化。

7)用17mA的恒电流进行40分钟电泳。

8)电泳结束后，取出膜，轻微干燥，并于阿尔新蓝溶液中浸渍10分钟进行染色。

9)用5％醋酸水溶液对膜进行脱色。

电泳时，当将电泳槽的温度设置为小于10℃(例如4℃)时，电泳结果更稳定。

(5-3)使用硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜的评价

在上述(5-2)使用硝化纤维素膜的评价方法中，除了代替硝化纤维素膜使用硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜以外，以同样的方法进行实验。

(5-4)基于硫酸软骨素酶ABC而酶水解的硫酸软骨素的确认

(5-4-1)酸性粘多糖样本的酶分解(酶处理)

1)向酸性粘多糖样本即硫酸软骨素C钠及肝素钠中加入蒸馏水，分别制备4mg/mL水溶液。

2)向酸性粘多糖样本水溶液60μL中加入链霉蛋白酶E液(I)75μL及蒸馏水150μL，于40℃下使其酶分解17小时得到链霉蛋白酶E处理液。

3)将链霉蛋白酶E处理液于沸腾水浴中静置10分钟，使酶失活。

4)将3)中所得的溶液冷却至室温后，加入硫酸软骨素酶ABC液15μL，于37℃下使其酶分解1小时，得到硫酸软骨素酶处理液。

5)将硫酸软骨素酶处理液于沸腾水浴中静置10分钟，使酶失活，作为酶处理物。

6)将5)中所得的酶处理物冷却至室温后，离心分离并用蒸馏水对上清液进行3倍稀释，根据上述使用醋酸纤维素膜及硝化纤维素膜的评价方法进行分析。

(5-4-2)鲨鱼软骨原料的酶分解

1)分别向鲨鱼软骨原料(I)及(II)500mg中加入蒸馏水，制成10mL，获得原料溶解液(鲨鱼软骨原料(I)的溶液及鲨鱼软骨原料(II)的溶液)。

2)向1)中所得的原料溶解液100μL中加入链霉蛋白酶E液(II)850μL，于40℃下使其酶分解17小时得到链霉蛋白酶E处理液。

3)将链霉蛋白酶E处理液于沸腾水浴中静置10分钟，使酶失活。

4)将3)中所得的溶液冷却至室温后，加入硫酸软骨素酶ABC液50μL，于37℃下使其酶分解1小时，得到硫酸软骨素酶处理液。

5)将硫酸软骨素酶处理液于沸腾水浴中静置10分钟，使酶失活，作为酶处理物。

6)将5)中所得的酶处理物冷却至室温后，离心分离并用蒸馏水对上清液进行3倍稀释，根据上述使用醋酸纤维素膜及硝化纤维素膜的评价方法实施分析。

针对无酶分解(酶处理)的样本，在上述(5-4-1)及(5-4-2)的步骤2)及4)中，不加入酶液而加入等量的蒸馏水，其他步骤实施与酶处理物(酶分解样本)相同的操作来制备。

(6)结果

将对酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料进行膜电泳而得的结果示于图1～4。将对用上述(5-4)的方法制备的酸性粘多糖样本的酶处理物及鲨鱼软骨原料的酶处理物进行膜电泳而得的结果示于图5。

(6-1)使用醋酸纤维素膜的评价结果

图1为显示通过使用醋酸纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)的带型的照片。图1(a)为分别对酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)进行电泳的结果，图1(b)为将酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)重叠滴加而进行电泳的结果。图1(a)的泳道1～9及图1(b)的泳道10～15的样本示于表1。泳道6～9的鲨鱼软骨原料(I)的批次各不相同，泳道10～15中使用的鲨鱼软骨原料(I)与泳道6批次相同。在图1及后述的图2～4中，就滴加的样本量而言，酸性粘多糖样本为0.3μg，鲨鱼软骨原料为2.0μg。作为参考，图7示出图1中所示照片的带型的示意图((a)：图1(a)的示意图，(b)：图1(b)的示意图)。

[表1]

图2为显示通过使用醋酸纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)的带型的照片。图2(a)为分别对酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)进行电泳的结果。图2(b)为将酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)重叠滴加而进行电泳的结果。图2(a)的泳道1～9及图2(b)的泳道10～15的样本示于表2。泳道6～9的鲨鱼软骨原料(II)的批次各不相同，泳道10～15中使用的鲨鱼软骨原料(II)与泳道6批次相同。作为参考，图8示出图2中所示照片的带型的示意图((a)：图2(a)的示意图，(b)：图2(b)的示意图)。

[表2]

(6-2)使用硝化纤维素膜的评价结果

图3为显示通过使用硝化纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)的带型的照片。图3(a)为分别对酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)进行电泳的结果，图3(b)为将酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(I)重叠滴加而进行电泳的结果。图3(a)的泳道1～8及图3(b)的泳道9～14的样本示于表3。泳道6～8的鲨鱼软骨原料(I)的批次各不相同，泳道9～14中使用的鲨鱼软骨原料(I)与泳道6批次相同。作为参考，图9示出图3中所示照片的带型的示意图((a)：图3(a)的示意图，(b)：图3(b)的示意图)。

[表3]

图4为显示通过使用硝化纤维素膜的电泳而得的酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)的带型的照片。图4(a)为分别对酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)进行电泳的结果。图4(b)为将酸性粘多糖样本及鲨鱼软骨原料(II)重叠滴加而进行电泳的结果。图4(a)的泳道1～8及图4(b)的泳道9～14的样本示于表4。泳道6～8的鲨鱼软骨原料(II)的批次各不相同，泳道9～14中使用的鲨鱼软骨原料(II)与泳道6批次相同。作为参考，图10示出图4中所示照片的带型的示意图((a)：图4(a)的示意图，(b)：图4(b)的示意图)。

[表4]

(6-3)硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜

使用硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜时，也得到与图3及图4中所示的使用硝化纤维素膜时同样的结果(带型)。

(6-4)基于酶水解的硫酸软骨素的确认的结果

图5为显示通过使用醋酸纤维素膜或硝化纤维素膜的电泳而得的鲨鱼软骨原料的酶处理物及酸性粘多糖样本的酶处理物的带型的照片((a)：醋酸纤维素膜，(b)：硝化纤维素膜)。图5(a)及(b)的泳道1～8的样本示于表5。表5中，有酶处理为上述酶处理物(酶分解样本)，无酶处理为上述未进行链霉蛋白酶E及硫酸软骨素酶ABC处理的样本。就电泳时滴加的样本量而言，鲨鱼软骨原料或其酶处理物为2.0μg，酸性粘多糖样本或其酶处理物为0.8μg。作为参考，图11示出图5中所示照片的带型的示意图((a)：图5(a)的示意图，(b)：图5(b)的示意图)。

[表5]

泳道	样本	酶处理
			1	鲨鱼软骨原料(I)	无
2	鲨鱼软骨原料(I)	有
			3	鲨鱼软骨原料(II)	无
4	鲨鱼软骨原料(II)	有
			5	硫酸软骨素C钠	无
6	硫酸软骨素C钠	有
			7	肝素钠	无
8	肝素钠	有

鲨鱼软骨原料(厂商及批次不同)均如图1～2的泳道6～10及图3～4的泳道6～9中所示，膜电泳后通过阿尔新蓝染色的条带为1个。在使用醋酸纤维素膜的电泳中，将鲨鱼软骨原料和酸性粘多糖样本重叠滴加时，明确了鲨鱼软骨原料中观察到的条带与透明质酸钠、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素的条带的移动距离不一致(图1及2的泳道11、13及15)。将鲨鱼软骨原料和酸性粘多糖样本重叠滴加时，鲨鱼软骨原料的条带与样本的硫酸软骨素钠一致(图1及2的泳道12)，但是与肝素钠重叠的斑块的条带扩散(图1及2的泳道14)。在实施使用硝化纤维素膜的电泳时，鲨鱼软骨原料的条带仅与样本的硫酸软骨素钠的条带一致，与其他的酸性粘多糖的条带不一致(图3及4的泳道10～14)。由此，确认鲨鱼软骨来源原料中含有的酸性粘多糖仅为硫酸软骨素，不含有其他的酸性粘多糖。

如上所述，在醋酸纤维素膜电泳中，来自鲨鱼软骨原料(I)及(II)的条带与硫酸软骨素钠的条带重叠。此外，将鲨鱼软骨原料与肝素钠重叠的斑块的条带扩散。针对鲨鱼软骨原料(I)及(II)及硫酸软骨素钠与肝素钠的样本，用上述(5-4)中记载的方法实施基于硫酸软骨素酶ABC的酶水解，实施上述膜电泳时，确认了仅鲨鱼软骨原料(I)及(II)及硫酸软骨素钠的样本的条带消失(图5)。

至今为止，报告有鲨鱼软骨中，作为酸性粘多糖含有硫酸软骨素，以及透明质酸或硫酸皮肤素(Higashi K.,et al,PloS One,10(6),e0131502(2015).)。除此以外，向样本中加入作为代表性的酸性粘多糖的硫酸乙酰肝素、肝素钠，实施鲨鱼软骨原料(I)及(II)的膜电泳。当用醋酸纤维素膜进行评价时，从本原料中检测的条带为1个，与硫酸软骨素的条带的移动距离一致，对于肝素条带也有一部分重叠。将支撑体换成硝化纤维素膜进行评价时，本原料的条带与硫酸软骨素的移动距离一致。进一步，为了确认鲨鱼软骨原料的酸性粘多糖，实施基于硫酸软骨素酶ABC的酶水解时，由于确认了鲨鱼软骨原料及硫酸软骨素的样本的条带的消失，因此可确认鲨鱼软骨原料中所含的酸性粘多糖为受到基于硫酸软骨素酶ABC的分解的性质。由于通过阿尔新蓝染色的条带为一个及其移动距离与硫酸软骨素一致，因此确认了本原料中含有的酸性粘多糖仅为硫酸软骨素，不含有其他的酸性粘多糖。进一步，由于上述条带为因硫酸软骨素酶ABC而分解的性质，从而印证了本原料中含有的酸性粘多糖仅为硫酸软骨素，不含有其他的酸性粘多糖。一般而言，基于比色法的定量，由于利用化合物中所含的官能团的特性来实施，因此特异性成为问题的情况较多。然而，由于此次评价的鲨鱼软骨原料中通过阿尔新蓝试剂染色的条带仅为硫酸软骨素，因此可以说针对该原料，通过阿尔新蓝比色定量而得的定量结果反映了硫酸软骨素或其盐的含量。

＜实施例2＞

针对实施例1中使用的鲨鱼软骨原料(I)及(II)，用阿尔新蓝比色法对硫酸软骨素或其盐的含量进行定量。基于阿尔新蓝比色法的定量，依照食品卫生学杂志(矢部芳枝等，食品中添加的硫酸软骨素钠的分析，28(1)，p13-18(1987))中记载的方法实施。

(1)试剂的制备

1)链霉蛋白酶E溶液

向链霉蛋白酶E(科研制药株式会社)0.5g中加入磷酸缓冲液制成50mL。

2)阿尔新蓝试剂

向阿尔新蓝8GX 1g中加入盐酸4.2mL、磷酸二氢钠1.38g及水制备为100mL。

3)磷酸缓冲液

将0.2mol/L磷酸氢二钠溶液305mL与0.2mol/L磷酸二氢钠溶液195mL混和，加入水制成1000mL。该溶液的pH为7。

(2)标准溶液及校准曲线用标准溶液的制备

正确称量硫酸软骨素钠(特级)100mg，用水溶解并定容为100mL(浓度：1000μg/mL)。分配1mL该溶液，将用水正确制成10mL的溶液作为标准溶液(浓度：100μg/mL)。

将对该标准溶液以达到1.0μg/mL、4.0μg/mL、7.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的方式依次用水进行稀释的溶液作为校准曲线用标准溶液。

(3)试验溶液的制备

向粉碎的样品2g中加入pH7.0磷酸缓冲液40mL。进一步，加入链霉蛋白酶E溶液(10mg/mL)5mL进行振动操作。之后，于40℃下放置一晚后，用水定容为100mL。将用滤纸进行过滤的溶液作为试验溶液。

(4)比色定量法

向试验溶液1mL中加入阿尔新蓝试剂0.2mL并放置20分钟。析出的沉淀以3000rpm进行5分钟离心。扔掉上清液，接着将沉淀于水3mL中清洗，再次重复离心分离。将所得沉淀溶解于单乙醇胺10mL作为吸光度测定用样品。针对吸光度测定用样品，用分光光度计测定615nm处的吸光度。针对校准曲线用标准溶液使用以同样操作进行发色的溶液。使用由校准曲线用标准溶液的吸光度中得到的校准曲线，计算试验溶液中的硫酸软骨素或其盐的量。在此，所求的硫酸软骨素或其盐的含量为作为硫酸软骨素钠的量。

(5)结果

鲨鱼软骨原料(I)的硫酸软骨素或其盐的含量为20.6g/100g，鲨鱼软骨原料(II)的硫酸软骨素或其盐的含量为20.9g/100g。

基于上述内容，通过定性试验(实施例1)，确认鲨鱼软骨原料(I)及(II)中所含的酸性粘多糖全部为硫酸软骨素(硫酸软骨素100％)。此外，通过基于比色法的定量试验(实施例2)，确认这些鲨鱼软骨原料(I)及(II)的硫酸软骨素或其盐的含量分别为20.6g/100g、20.9g/100g。由于在定性试验(实施例1)中鲨鱼软骨原料(I)及(II)中所含的酸性粘多糖或其盐确认仅为硫酸软骨素或其盐，因此通过定量试验(实施例2)所得的定量结果为鲨鱼软骨原料(I)及(II)中的硫酸软骨素或其盐的含量。

从而，通过实施将样品提供给膜电泳，由阿尔新蓝染色中所得的带型来确认该样品中所含的酸性粘多糖或其盐的种类的定性试验，和基于比色法的酸性粘多糖或其盐的定量试验，可以简便的工序，实施样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的确认及定量。

＜试验例1＞

为了确认硫酸软骨素或其盐不因链霉蛋白酶E而分解，实施以下试验。硫酸软骨素C钠、鲨鱼软骨原料(I)及(II)等试剂、原料等与实施例1相同。

(1)分析用样本的制备

(1-1)鲨鱼软骨原料的酶分解样本(链霉蛋白酶(+)、硫酸软骨素酶(+))

用实施例1的(5-4-2)(鲨鱼软骨原料的酶分解)中记载的方法，制备鲨鱼软骨原料(I)的酶处理样本及鲨鱼软骨原料(II)的酶处理样本(以链霉蛋白酶E及硫酸软骨素酶ABC处理的样本)。

(1-2)鲨鱼软骨原料的链霉蛋白酶处理样本(链霉蛋白酶(+)、硫酸软骨素酶(-))

除未用硫酸软骨素酶ABC对鲨鱼软骨原料进行处理以外，以与上述(1-1)相同的方法制备样本。具体而言，在实施例1的(5-4-2)中记载的方法中，于步骤4)中，代替硫酸软骨素酶ABC液加入等量的蒸馏水。除上述以外，以实施例1的(5-4-2)中记载的方法，制备鲨鱼软骨原料(I)的链霉蛋白酶处理样本及鲨鱼软骨原料(II)的链霉蛋白酶处理样本(实施链霉蛋白酶E处理但未实施硫酸软骨素酶ABC处理的样本)。

(1-3)鲨鱼软骨原料的无酶处理的样本(链霉蛋白酶(-)、硫酸软骨素酶(-))

除未用链霉蛋白酶E及硫酸软骨素酶ABC对鲨鱼软骨原料进行处理以外，以与上述(1-1)相同的方法制备样本。具体而言，在实施例1的(5-4-2)中记载的方法中，于步骤2)及4)中，代替链霉蛋白酶E液(II)及硫酸软骨素酶ABC液加入等量的蒸馏水。除上述以外，以实施例1的(5-4-2)中记载的方法，制备鲨鱼软骨原料(I)的无酶处理样本及鲨鱼软骨原料(II)的无酶处理样本(未实施链霉蛋白酶E处理及硫酸软骨素酶ABC处理的样本)。

(1-4)硫酸软骨素C钠的酶处理样本(链霉蛋白酶(+)、硫酸软骨素酶(+))

以实施例1的(5-4-1)(酸性粘多糖样本的酶分解)中记载的方法，用链霉蛋白酶E及硫酸软骨素酶ABC对样本的硫酸软骨素C钠进行处理，制备硫酸软骨素C钠的酶处理样本。

(1-5)硫酸软骨素C钠的链霉蛋白酶处理样本(链霉蛋白酶(+)、硫酸软骨素酶(-))

除未用硫酸软骨素酶ABC对硫酸软骨素C钠进行处理以外，以与上述(1-4)相同的方法制备样本。具体而言，在实施例1的(5-4-1)中记载的方法中，于步骤4)中代替硫酸软骨素酶ABC液加入等量的蒸馏水。除上述以外，以实施例1的(5-4-1)中记载的方法，制备硫酸软骨素C钠的链霉蛋白酶处理样本。

(1-6)硫酸软骨素C钠的无酶处理样本(链霉蛋白酶(-)、硫酸软骨素酶(-))

除未用链霉蛋白酶E及硫酸软骨素酶ABC对硫酸软骨素C钠进行处理以外，以与上述(1-4)相同的方法制备样本。具体而言，在实施例1的(5-4-1)中记载的方法中，使用硫酸软骨素C钠(样本)，于步骤2)及4)中代替链霉蛋白酶E液(I)及硫酸软骨素酶ABC液加入等量的蒸馏水。除上述以外，以实施例1的(5-4-1)中记载的方法，制备硫酸软骨素C钠的无酶处理的样本。

(2)使用醋酸纤维素膜的评价

使用上述(1)的(1-1)～(1-6)中制备的样本，以实施例1的(5-1)的使用醋酸纤维素膜的评价方法进行分析。

膜电泳的结果示于图6。

图6为显示通过醋酸纤维素膜对鲨鱼软骨原料及硫酸软骨素C钠的无酶处理样本、链霉蛋白酶处理样本，以及酶处理样本进行电泳而得的带型的照片。表6中示出图6的泳道1～9的样本。实施链霉蛋白酶E处理的样本在链霉蛋白酶处理一栏记载“+”，未实施的样本记载“-”。实施硫酸软骨素酶ABC处理的样本在硫酸软骨素酶处理一栏记载“+”，未实施的样本记载“-”。就向膜上滴加的样本量而言，泳道1～6为5.0μg，泳道7～9为0.8μg。作为参考，图12中示出图6中所示照片的带型的示意图。

[表6]

泳道	原料或酸性粘多糖样本	链霉蛋白酶处理	硫酸软骨素酶处理
				1	鲨鱼软骨原料(II)	-	-
2	鲨鱼软骨原料(II)	+	-
				3	鲨鱼软骨原料(II)	+	+
4	鲨鱼软骨原料(I)	-	-
				5	鲨鱼软骨原料(I)	+	-
6	鲨鱼软骨原料(I)	+	+
				7	硫酸软骨素C钠	-	-
8	硫酸软骨素C钠	+	-
				9	硫酸软骨素C钠	+	+

图6的泳道1、4及7为无酶处理的样本。泳道2、5及8为链霉蛋白酶处理样本。图6的泳道1、2、4、5及8中，在与泳道7(硫酸软骨素C钠的样本)相同的位置检测到条带。泳道3、6及9为用链霉蛋白酶E及硫酸软骨素酶ABC处理的酶处理样本。泳道3、6及9中硫酸软骨素C钠来源的条带消失。由这些结果，确认硫酸软骨素或其盐被硫酸软骨素酶ABC分解，但未被链霉蛋白酶E分解。

Claims (10)

1.一种试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐的分析方法，其特征在于，包含，

将含有酸性粘多糖或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验，

所述定性试验包含将所述试验样品提供给使用膜的电泳的电泳工序，

用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及，

由所述染色中所得的带型确认所述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序，

所述定量试验包含通过比色法对所述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述酸性粘多糖为选自硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、肝素及硫酸乙酰肝素中的1种以上。

3.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于，所述酸性粘多糖为硫酸软骨素。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的分析方法，其特征在于，可检测所述酸性粘多糖或其盐的色素为阿尔新蓝或咔唑。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的分析方法，其特征在于，可检测所述酸性粘多糖或其盐的色素为阿尔新蓝。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的分析方法，其特征在于，通过所述定性试验，确认所述试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐为1种时，将通过所述定量试验而得的定量结果作为所述酸性粘多糖或其盐的含量。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述膜为硝化纤维素膜、醋酸纤维素膜或硝化纤维素和醋酸纤维素的混合膜。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述膜为硝化纤维素膜或醋酸纤维素膜。

9.一种试验样品中所含的硫酸软骨素或其盐的定量方法，其特征在于，包含，

将含有硫酸软骨素或其盐的试验样品提供给定性试验及定量试验，

所述定性试验包含将所述试验样品提供给使用膜的电泳的电泳工序，

用阿尔新蓝对电泳后的膜进行染色的染色工序，及，

由所述染色中所得的带型确认所述试验样品中的酸性粘多糖或其盐的种类的检测工序，

所述定量试验包含通过比色法对所述试验样品中的酸性粘多糖或其盐进行定量的比色定量工序，其中该比色法使用可检测酸性粘多糖或其盐的色素，

根据所述定性试验，确认所述试验样品中所含的酸性粘多糖或其盐仅为硫酸软骨素或其盐时，将通过所述定量试验而得的定量结果作为所述硫酸软骨素或其盐的含量。

10.一种含有酸性粘多糖或其盐的制品的品质管理试验方法，其特征在于，包含，

将所述制品作为试验样品，通过权利要求1～8中任一项所述的分析方法进行分析的试验样品分析工序，

通过所述分析方法对含有浓度及种类已知的酸性粘多糖或其盐的标准样品进行分析的标准样品分析工序，及，

将所述分析中所得的试验样品的定性试验结果及定量试验结果与标准样品的定性试验结果及定量试验结果进行对比来评价所述制品的品质的评价工序。

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