JPWO2020004216A1 - 被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の分析方法、コンドロイチン硫酸又はその塩の定量方法及び製品の品質管理試験方法 - Google Patents
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Abstract
Description
コンドロイチン硫酸の定量法として、コンドロイチン硫酸をコンドロイチナーゼABCで加水分解し、生じる不飽和二糖類量をHPLCで測定するHPLC法が知られている。HPLC法以外のコンドロイチン硫酸量の定量方法として、硫酸基を持つ化合物を検出する硫酸バリウム重量法、グルクロン酸や脱硫化物を検出するカルバゾール硫酸法、酸性ムコ多糖を検出するアルシアンブルー比色法などの分析方法がある。
〔1〕酸性ムコ多糖又はその塩を含む被検試料を、定性試験及び定量試験に供することを含み、上記定性試験は、上記被検試料を、膜を用いた電気泳動に供する電気泳動工程、電気泳動後の膜を、アルシアンブルーで染色する染色工程、及び、上記染色で得られるバンドパターンから、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する検出工程を含み、上記定量試験は、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩を、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を用いる比色法により定量する比色定量工程を含む、上記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の分析方法。
〔2〕上記酸性ムコ多糖が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸からなる群より選択される1以上である上記〔1〕に記載の分析方法。
〔3〕上記酸性ムコ多糖が、コンドロイチン硫酸である上記〔1〕又は〔2〕に記載の分析方法。
〔4〕上記酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素が、アルシアンブルー又はカルバゾールである上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の分析方法。
〔5〕上記酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素が、アルシアンブルーである上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の分析方法。
〔6〕上記定性試験によって、上記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩が1種であることが確認された場合に、上記定量試験により得られる定量結果を、上記酸性ムコ多糖又はその塩の含量とする、上記〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の分析方法。
〔7〕上記膜は、ニトロセルロース膜、セルロースアセテート膜又はニトロセルロースとセルロースアセテートとの混合膜である上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の分析方法。
〔8〕上記膜は、ニトロセルロース膜又はセルロースアセテート膜である上記〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の分析方法。
〔9〕コンドロイチン硫酸又はその塩を含む被検試料を、定性試験及び定量試験に供することを含み、上記定性試験は、上記被検試料を、膜を用いた電気泳動に供する電気泳動工程、電気泳動後の膜を、アルシアンブルーで染色する染色工程、及び、上記染色で得られるバンドパターンから、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する検出工程を含み、上記定量試験は、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩を、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を用いる比色法により定量する比色定量工程を含み、上記定性試験によって、上記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩がコンドロイチン硫酸又はその塩のみであることが確認された場合に、上記定量試験により得られる定量結果を、上記コンドロイチン硫酸又はその塩の含量とする、上記被検試料に含まれるコンドロイチン硫酸又はその塩の定量方法。
〔10〕酸性ムコ多糖又はその塩を含む製品の品質管理試験方法であって、
上記製品を被検試料として、上記〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の分析方法により分析する被検試料分析工程、濃度及び種類が既知の酸性ムコ多糖又はその塩を含む標準試料を、上記分析方法により分析する標準試料分析工程、及び、上記分析で得られる被検試料の定性試験結果及び定量試験結果と、標準試料の定性試験結果及び定量試験結果とを対比して、上記製品の品質を評価する評価工程を含む、酸性ムコ多糖又はその塩を含む製品の品質管理試験方法。
本発明の分析方法は、酸性ムコ多糖又はその塩を含む被検試料を、定性試験及び定量試験に供することを含む、被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の分析方法である。本発明において、定性試験は、上記被検試料を、膜を用いた電気泳動に供する電気泳動工程、電気泳動後の膜を、アルシアンブルーで染色する染色工程、及び、上記染色で得られるバンドパターンから、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する検出工程を含む。定量試験は、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩を、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を用いる比色法により定量する比色定量工程を含む。
本明細書中、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を、単に色素ともいう。
酸性ムコ多糖又はその塩を含む被検試料としては、例えば、食品(健康食品を含む)、医薬品、化粧品、これらの原料(例えば、サメ軟骨抽出物、ブタ軟骨抽出物、イカ軟骨抽出物、サケ軟骨抽出物等)等が挙げられる。
本発明の分析方法は、例えば、被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩が1種又は2種以上であることの確認、及び、該被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の定量を行うことができる。酸性ムコ多糖又はその塩が1種(又は2種以上)であるとは、酸性ムコ多糖又はその塩に含まれる酸性ムコ多糖が1種(又は2種以上)であることを指す。例えば、被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩が1種である場合には、当該酸性ムコ多糖又はその塩の種類の確認(同定)、及び、該被検試料中の該酸性ムコ多糖又はその塩の定量を行うことができる。本発明の分析方法は、被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩が2種以上である場合には、被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の種類の確認、及び、それらの合計量の定量に使用することができる。
また、別の一態様においては、セルロースアセテート膜を使用することが好ましい。セルロースアセテート膜を使用すると、ヒアルロン酸又はその塩と、これ以外の酸性ムコ多糖又はその塩との分離が良好である。例えば、被検試料にヒアルロン酸又はその塩が含まれる場合、又は、被検試料中のヒアルロン酸又はその塩の存在を確認する場合は、セルロースアセテート膜を用いることが好ましい。また、セルロースアセテート膜を使用すると、コンドロイチン硫酸又はその塩と、これ以外の酸性ムコ多糖又はその塩との分離が良好である。コンドロイチン硫酸又はその塩の検出にセルロースアセテート膜を用いる場合には、例えば、後述するように被検試料にコンドロイチナーゼABC処理を行い、得られる酵素処理物のバンドパターンと、コンドロイチナーゼABC処理を行っていない被検試料のバンドパターンとを比較することも好ましい。
染色後は、脱色液を用いて膜を脱色する。脱色液には、通常の脱色液を使用することができ、酸性水溶液が好ましい。酸性水溶液として、例えば酢酸水溶液、ギ酸水溶液等が挙げられる。脱色後の膜は、酸性ムコ多糖又はその塩によって移動度(移動距離ともいうこともできる)が異なる、1又は2以上のバンドから構成されるバンドパターン(電気泳動パターンということもできる)を示す。被検試料に酸性ムコ多糖又はその塩が含まれない場合は、通常、バンドは検出されない。
定性試験においては、被検試料に加えて、酸性ムコ多糖又はその塩の標品(標準物質)、又は、含まれている酸性ムコ多糖又はその塩の種類が既知である標準試料を使用してバンドパターンを得ることが好ましい。酸性ムコ多糖又はその塩の種類の確認は、例えば、酸性ムコ多糖又はその塩の標品のバンドの移動距離との比較から行うことができる。また別の態様においては、含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の種類が既知の標準試料について、同じ方法で定性試験を行い、標準試料のバンドパターンと、被検試料のバンドパターンとを比較することにより、被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認することもできる。一態様において、被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の由来が予測される場合は、標品として、由来が同じ酸性ムコ多糖又はその塩の標品を使用するか、又は、由来が同じ酸性ムコ多糖又はその塩を含む標準試料を使用することが好ましい。例えば、被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩がサメ軟骨由来であると予測される場合は、サメ軟骨由来の酸性ムコ多糖又はその塩の標品を使用するか、又は、サメ軟骨由来の酸性ムコ多糖又はその塩を含む標準試料を使用することが好ましい。
また、被検試料に加えて、後記のように被検試料の酵素処理物を準備し、被検試料及び該酵素処理物のバンドパターンを比較することによって、被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認してもよい。
色素を用いる比色法においては、例えば、被検試料に色素を添加し、呈色液等の溶液の吸光度を分光光度計で測定し、標品により作成した検量線から酸性ムコ多糖又はその塩の含量を求めることができる。比色法による定量では、被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の含量は、通常、標品に使用した酸性ムコ多糖又はその塩の含量として求められる。このように得られる酸性ムコ多糖又はその塩の含量を、定量試験により得られる定量結果として使用することができる。標品は酸性ムコ多糖又はその塩に応じて選択すればよい。
定量試験で使用する色素には、酸性ムコ多糖又はその塩の検出に使用できる色素(試薬)を用いることができる。好ましくは、酸性ムコ多糖又はその塩と結合する色素であり、酸性ムコ多糖又はその塩と結合し、光学的に検出可能な色素がより好ましい。分析の精度等の観点から、色素として、アルシアンブルー、カルバゾールが好ましく、アルシアンブルーがより好ましい。
上記色素としてカルバゾールを用いる場合、酸性ムコ多糖又はその塩の定量は、カルバゾール硫酸法により行うことができる。カルバゾール硫酸法は、通常の方法で行うことができる。被検試料にカルバゾール溶液と濃硫酸とを添加すると、被検試料にウロン酸が含まれていれば赤紫色に呈色する。呈色液の吸光度を分光光度計で測定し、標品の検量線からウロン酸含量を算出し、コンドロイチン硫酸又はその塩の量を求める。測定波長は、500〜600nmが好ましく、520〜550nmがより好ましい。定量試験においては、必要に応じて被検試料をプロテアーゼ等で処理してもよい。プロテアーゼは、酸性ムコ多糖又はその塩を分解しないものを使用でき、上記のアクチナーゼE等が好ましい。
本発明の分析方法は、コンドロイチン硫酸又はその塩を含む被検試料を、定性試験及び定量試験に供することを含み、上記定性試験は、上記被検試料を、膜を用いた電気泳動に供する電気泳動工程、電気泳動後の膜を、アルシアンブルーで染色する染色工程、及び、上記染色で得られるバンドパターンから、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する検出工程を含み、上記定量試験は、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩を、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を用いる比色法により定量する比色定量工程を含む、被検試料に含まれるコンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法であってよい。このような分析方法においては、定性試験において、上記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩がコンドロイチン硫酸又はその塩のみであることが確認された場合には、上記定量試験により得られる定量結果を、コンドロイチン硫酸又はその塩の含量とすることができる。上記コンドロイチン硫酸又はその塩の分析方法は、被検試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩の定量方法として使用され得る。
コンドロイチン硫酸又はその塩を含む被検試料を、定性試験及び定量試験に供することを含み、上記定性試験は、上記被検試料を、膜を用いた電気泳動に供する電気泳動工程、電気泳動後の膜を、アルシアンブルーで染色する染色工程、及び、上記染色で得られるバンドパターンから、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する検出工程を含み、上記定量試験は、上記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩を、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を用いる比色法により定量する比色定量工程を含み、上記定性試験によって、上記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩がコンドロイチン硫酸又はその塩のみであることが確認された場合に、上記定量試験により得られる定量結果を、上記コンドロイチン硫酸又はその塩の含量とする、被検試料中のコンドロイチン硫酸又はその塩の定量方法。
上記コンドロイチン硫酸又はその塩の定量方法において、定性試験及び定量試験並びにその好ましい態様は、上記の分析方法と同様である。コンドロイチン硫酸及びその好ましい態様などは上記の分析方法と同様である。
本発明の酸性ムコ多糖又はその塩を含む製品の品質管理試験方法においては、酸性ムコ多糖又はその塩を含む製品を被検試料として、該被検試料を、上述した本発明の分析方法により分析する被検試料分析工程、濃度及び種類が既知の酸性ムコ多糖又はその塩を含む標準試料を、上記分析方法により分析する標準試料分析工程、及び、上記分析で得られる被検試料の定性試験結果及び定量試験結果と、標準試料の定性試験結果及び定量試験結果とを対比して、上記被検試料の品質を評価する評価工程を含む。
酸性ムコ多糖又はその塩を含む製品は特に限定されず、上記の分析方法で被検試料として使用される、酸性ムコ多糖又はその塩を含む食品、医薬品、化粧品、これらの原料等が挙げられる。本発明において、被検試料分析工程及び標準試料分析工程は、いずれの工程を先に行ってもよい。定性試験及び定量試験並びにこれらの好ましい態様などは、上述した分析方法におけるものと同じである。酸性ムコ多糖又はその塩は、上述した分析方法と同じである。標準試料は、酸性ムコ多糖又はその塩を含み、該酸性ムコ多糖又はその塩の濃度(含量)及び種類が既知の試料である。標準試料は、被検試料に応じて適宜選択すればよい。例えば、所定の酸性ムコ多糖又はその塩を基準量含む食品、医薬品、化粧品等や、その原料を標準試料として使用すればよい。
酸性ムコ多糖及びサメ軟骨原料を電気泳動に供したのち、アルシアンブルーにより染色し、そのバンドの移動距離からサメ軟骨原料中の酸性ムコ多糖の定性を行った。
・膜電気泳動装置(日本エイドー社製、NA−4700)
・電源装置AE−3121 リニアパワー2000(ATTO社製)
・セルロースアセテート膜(製品名:SELECA−VSP、6×11cm、アドバンテック社製)
・ニトロセルロース膜(製品名:Nitrocellulose membranes,0.45μm、6×11cm又は7×8.5cm、Bio−rad社製)
・ニトロセルロースとセルロースアセテートとの混合膜(製品名:Nitrocellulose membrane、品番:MF membrane filters(0.45μm HA)、メルク株式会社)
・ヒアルロン酸ナトリウム(MCH Medchemexpress社製)
・コンドロイチン硫酸Cナトリウム(ナカライテスク株式会社製)
・ヘパラン硫酸(MCH Medchemexpress社製)
・ヘパリンナトリウム(Santa Cruz Biotechnology社製)
・デルマタン硫酸(Tronto res. Chem社製)
・サメ軟骨原料(I)(製品名:サメ軟骨エキスパウダー、日本薬品株式会社製)
・サメ軟骨原料(II)(製品名:SCP、マルハニチロ株式会社製)
・アルシアンブルー 8GX(フナコシ株式会社製)
・ピリジン、酢酸、酢酸バリウム(いずれも特級、ナカライテスク株式会社製)
・アクチナーゼE(科研製薬株式会社製)
・コンドロイチナーゼABC(Sigma−Aldrich社製)
サメ軟骨原料(I)及びサメ軟骨原料(II)は、サメ軟骨抽出物を含有する。サメ軟骨原料(I)及びサメ軟骨原料(II)には、コンドロイチン硫酸Cが20重量%含まれる(メーカーの報告値)。
上記のヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸Cナトリウム、ヘパラン硫酸、ヘパリンナトリウム及びデルマタン硫酸は、標品として使用した。
1)25%メタノール水溶液
250mLのメタノールに蒸留水を加えて1Lとした。
2)1.0M酢酸/ピリジン緩衝液(酢酸−ピリジン緩衝液)(pH3.5)
酢酸60gに800mLの蒸留水を加えたのちピリジンにてpH3.5に調整し、1Lとした。
3)0.1M酢酸バリウム緩衝液(pH5.0)
酢酸バリウム25.5gに800mLの蒸留水を加えたのち酢酸にてpH5.0に調整し、1Lとした。
4)アルシアンブルー溶液(染色液)
アルシアンブルー 8GX 5.0gに0.3%酢酸水溶液を加えて1Lとした。
5)1%酢酸水溶液
酢酸(10mL)に蒸留水を加えて1Lとした。
6)5%酢酸水溶液
酢酸(50mL)に蒸留水を加えて1Lとした。
7)アクチナーゼE液(I)
アクチナーゼEに蒸留水を加えて、アクチナーゼE濃度3.4mg/mLの溶液を調製した。
8)アクチナーゼE液(II)
アクチナーゼEに蒸留水を加えて、アクチナーゼE濃度1.0mg/mLの溶液を調製した。
9)コンドロイチナーゼABC液
コンドロイチナーゼABCを蒸留水で溶解し、10U/mLに調整して調製した。
酸性ムコ多糖標品5種(ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸Cナトリウム、ヘパラン硫酸、ヘパリンナトリウム、デルマタン硫酸)については、それぞれ蒸留水にて0.1mg/mL水溶液を調製した。サメ軟骨原料(I)及び(II)については、それぞれ蒸留水にて1.0mg/mL水溶液を調製した。得られた標品水溶液、サメ軟骨原料水溶液を分析用試料とした。
(5−1)セルロースアセテート膜を用いた評価
1)セルロースアセテート膜に、分析用試料をスポットするための線(5mm)を鉛筆で入れた。より具体的には、スポット用の線は、膜の下辺と平行に、5mm間隔で、膜の下辺から1cmの場所に引いた。スポット用の線は、膜の右辺及び左辺から1cm以上離した。
2)セルロースアセテート膜を25%メタノール水溶液に10分以上浸した。
3)セルロースアセテート膜を泳動液(1.0M酢酸/ピリジン緩衝液)に30分浸した。
4)泳動液(1.0M酢酸/ピリジン緩衝液)から膜を取り出し、軽く乾かした。
5)セルロースアセテート膜に分析用試料をそれぞれバンド状にスポットした。
6)泳動槽の陰極側及び陽極側に泳動液(1.0M酢酸/ピリジン緩衝液)を注いだのち、陰極側に試料スポットがくるように、セルロースアセテート膜を泳動槽にセットした。
7)泳動槽の蓋を閉め、10分間静置し、内部を平衡化した。
8)11mAの定電流で10分間電気泳動を行った。
9)電気泳動終了後、膜を取り出し、風乾し、アルシアンブルー溶液に10分間浸し、染色した。
10)1%酢酸水溶液で膜を脱色した。
1)上記したセルロースアセテート膜の場合と同様に、ニトロセルロース膜に、分析用試料をスポットするための線(5mm)を鉛筆で入れた。
2)ニトロセルロース膜(6×11cm又は7×8.5cm)を泳動液(0.1M酢酸バリウム緩衝液)に10分以上浸した。
3)泳動液(0.1M酢酸バリウム緩衝液)から膜を取り出し、軽く乾かした。
4)ニトロセルロース膜に分析用試料をそれぞれバンド状にスポットした。
5)泳動槽の陰極側及び陽極側に泳動液(0.1M酢酸バリウム緩衝液)を注いだのち、陰極側に試料スポットがくるように、ニトロセルロース膜を泳動槽にセットした。
6)泳動槽の蓋を閉め、10分間静置し、内部を平衡化した。
7)17mAの定電流で40分間電気泳動を行った。
8)電気泳動終了後、膜を取り出し、軽く乾かし、アルシアンブルー溶液に10分間浸し、染色した。
9)5%酢酸水溶液で膜を脱色した。
電気泳動の際に、泳動槽の温度を10℃未満(例えば4℃)とすると、泳動結果がより安定した。
上記(5−2)のニトロセルロース膜を用いた評価の方法において、ニトロセルロース膜の代わりにニトロセルロースとセルロースアセテートとの混合膜を用いた以外は、同じ方法で実験を行った。
(5−4−1)酸性ムコ多糖標品の酵素分解(酵素処理)
1)酸性ムコ多糖標品のコンドロイチン硫酸Cナトリウム及びヘパリンナトリウムに蒸留水を加え、それぞれ4mg/mL水溶液を調製した。
2)酸性ムコ多糖標品水溶液60μLにアクチナーゼE液(I)75μL及び蒸留水150μLを加え、40℃で17時間酵素分解させてアクチナーゼE処理液を得た。
3)アクチナーゼE処理液を沸騰水浴中に10分間静置し、酵素を失活させた。
4)3)で得た溶液を室温まで冷却後、コンドロイチナーゼABC液を15μL加え、37℃で1時間酵素分解させて、コンドロイチナーゼ処理液を得た。
5)コンドロイチナーゼ処理液を沸騰水浴中に10分間静置し、酵素を失活させて、酵素処理物とした。
6)5)で得た酵素処理物を室温まで冷却後、遠心分離して上清を蒸留水で3倍希釈し、上記のセルロースアセテート膜及びニトロセルロース膜を用いた評価の方法に則り分析を行った。
1)サメ軟骨原料(I)及び(II)のそれぞれ500mgに蒸留水を加え、10mLとして、原料溶解液(サメ軟骨原料(I)の溶液及びサメ軟骨原料(II)の溶液)を得た。
2)1)で得た原料溶解液100μLにアクチナーゼE液(II)850μLを加え、40℃で17時間酵素分解させてアクチナーゼE処理液を得た。
3)アクチナーゼE処理液を沸騰水浴中に10分間静置し、酵素を失活させた。
4)3)で得た溶液を室温まで冷却後、コンドロイチナーゼABC液50μLを加え、37℃で1時間酵素分解させて、コンドロイチナーゼ処理液を得た。
5)コンドロイチナーゼ処理液を沸騰水浴中に10分間静置し、酵素を失活させて、酵素処理物とした。
6)5)で得た酵素処理物を室温まで冷却後、遠心分離して上清を蒸留水で3倍希釈し、上記のセルロースアセテート膜及びニトロセルロース膜を用いた評価の方法に則り分析を行った。
酵素分解(酵素処理)なしのサンプルについては、上記(5−4−1)及び(5−4−2)の手順2)及び4)において酵素液ではなく同量の蒸留水を加え、その他の手順は酵素処理物(酵素分解サンプル)と同様に操作を行って調製した。
酸性ムコ多糖標品及びサメ軟骨原料を膜電気泳動した結果を、図1〜4に示す。上記(5−4)の方法で調製した酸性ムコ多糖標品の酵素処理物及びサメ軟骨原料の酵素処理物を膜電気泳動した結果を、図5に示す。
図1は、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動で得られた酸性ムコ多糖標品及びサメ軟骨原料(I)のバンドパターンを示す写真である。図1(a)は、酸性ムコ多糖標品及びサメ軟骨原料(I)をそれぞれ電気泳動した結果であり、図1(b)は、酸性ムコ多糖標品及びサメ軟骨原料(I)を重ねてスポットして電気泳動した結果である。図1(a)のレーン1〜9及び図1(b)のレーン10〜15のサンプルを表1に示す。レーン6〜9のサメ軟骨原料(I)はそれぞれロットが異なり、レーン10〜15で使用したサメ軟骨原料(I)は、レーン6と同じロットのものである。図1及び後述する図2〜4において、スポットしたサンプル量は、酸性ムコ多糖標品が0.3μg、サメ軟骨原料が2.0μgであった。参考として、図7に、図1に示す写真のバンドパターンの模式図を示す((a):図1(a)の模式図、(b):図1(b)の模式図)。
図3は、ニトロセルロース膜を用いた電気泳動で得られた酸性ムコ多糖標品及びサメ軟骨原料(I)のバンドパターンを示す写真である。図3(a)は、酸性ムコ多糖標品及びサメ軟骨原料(I)をそれぞれ電気泳動した結果であり、図3(b)は、酸性ムコ多糖標品及びサメ軟骨原料(I)を重ねてスポットして電気泳動した結果である。図3(a)のレーン1〜8及び図3(b)のレーン9〜14のサンプルを表3に示す。レーン6〜8のサメ軟骨原料(I)はそれぞれロットが異なり、レーン9〜14で使用したサメ軟骨原料(I)は、レーン6と同じロットのものである。参考として、図9に、図3に示す写真のバンドパターンの模式図を示す((a):図3(a)の模式図、(b):図3(b)の模式図)。
ニトロセルロースとセルロースアセテートとの混合膜を使用した場合も、図3及び図4に示すニトロセルロース膜を使用した場合と同様の結果(バンドパターン)が得られた。
図5は、セルロースアセテート膜又はニトロセルロース膜を用いた電気泳動で得られた、サメ軟骨原料の酵素処理物及び酸性ムコ多糖標品の酵素処理物のバンドパターンを示す写真である((a):セルロースアセテート膜、(b):ニトロセルロース膜)。図5(a)及び(b)のレーン1〜8のサンプルを表5に示す。表5中、酵素処理有は、上記の酵素処理物(酵素分解サンプル)、酵素処理無は、上記でアクチナーゼE及びコンドロイチナーゼABC処理をしなかったサンプルである。電気泳動の際にスポットしたサンプル量は、サメ軟骨原料又はその酵素処理物は、2.0μg、酸性ムコ多糖標品又はその酵素処理物は、0.8μgである。参考として、図11に、図5に示す写真のバンドパターンの模式図を示す((a):図5(a)の模式図、(b):図5(b)の模式図)。
実施例1で使用したサメ軟骨原料(I)及び(II)について、アルシアンブルー比色法にてコンドロイチン硫酸又はその塩の含量を定量した。アルシアンブルー比色法による定量は、食品衛生学雑誌(矢部芳枝他、食品中に添加したコンドロイチン硫酸ナトリウムの分析、28(1),p13−18(1987))に記載の方法に準じて行った。
1)アクチナーゼE溶液
アクチナーゼE(科研製薬株式会社)0.5gにリン酸緩衝液を加え50mLとした。
2)アルシアンブルー試液
アルシアンブルー 8GX 1gに塩酸4.2mL、リン酸二水素ナトリウム1.38g及び水を加え100mLとして調製した。
3)リン酸緩衝液
0.2mol/Lリン酸二ナトリウム溶液305mLと0.2mol/Lリン酸一ナトリウム溶液195mLを混和し、水を加え1000mLとした。この液のpHは7であった。
コンドロイチン硫酸ナトリウム(特級)100mgを正確に量り、水で溶解し100mLに定容した(濃度:1000μg/mL)。この溶液を1mL分取し、水で正確に10mLとしたものを標準溶液とした(濃度:100μg/mL)。
この標準溶液を、1.0μg/mL、4.0μg/mL、7.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mLになるように水で順次希釈したものを検量線用標準溶液とした。
粉砕した試料2gにpH7.0リン酸緩衝液を40mL加えた。さらに、アクチナーゼE溶液(10mg/mL)を5mL加えて振とう操作を行った。その後、40℃で一晩放置した後、水で100mLに定容した。ろ紙でろ過を行った溶液を、試験溶液とした。
試験溶液1mLにアルシアンブルー試液を0.2mL加えて20分間放置した。析出した沈殿は、3000rpmで5分間遠心した。上澄液は捨て、次いで沈殿を水3mLで洗浄し、再び遠心分離を繰返した。得られた沈殿は、モノエタノールアミン10mLに溶解させて吸光度測定用試料とした。吸光度測定用試料について、分光光度計で615nmにおける吸光度を測定した。検量線用標準溶液についても同様の操作で発色を行ったものを使用した。検量線用標準溶液の吸光度から得られる検量線を用いて、試験溶液中のコンドロイチン硫酸又はその塩の量を算出した。ここで求められるコンドロイチン硫酸又はその塩の含量は、コンドロイチン硫酸ナトリウムとしての量である。
サメ軟骨原料(I)のコンドロイチン硫酸又はその塩の含量は、20.6g/100g、サメ軟骨原料(II)のコンドロイチン硫酸又はその塩の含量は、20.9g/100gであった。
従って、試料を膜電気泳動に供して、アルシアンブルー染色で得られるバンドパターンから当該試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する定性試験と、比色法による酸性ムコ多糖又はその塩の定量試験を行うことにより、簡便な工程で、試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類の確認及び定量を行うことができた。
コンドロイチン硫酸又はその塩がアクチナーゼEによって分解されないことを確認するため、以下の試験を行った。コンドロイチン硫酸Cナトリウム、サメ軟骨原料(I)及び(II)等の試薬、原料等は実施例1と同じである。
(1−1)サメ軟骨原料の酵素分解サンプル(アクチナーゼ(+)、コンドロイチナーゼ(+))
実施例1の(5−4−2)(サメ軟骨原料の酵素分解)に記載の方法で、サメ軟骨原料(I)の酵素処理サンプル及びサメ軟骨原料(II)の酵素処理サンプル(アクチナーゼE及びコンドロイチナーゼABCで処理したサンプル)を調製した。
サメ軟骨原料をコンドロイチナーゼABCで処理しなかった以外は、上記(1−1)と同じ方法でサンプルを調製した。具体的には、実施例1の(5−4−2)に記載の方法において、手順4)においてコンドロイチナーゼABC液の代わりに同量の蒸留水を加えた。上記以外は、実施例1の(5−4−2)に記載の方法で、サメ軟骨原料(I)のアクチナーゼ処理サンプル及びサメ軟骨原料(II)のアクチナーゼ処理サンプル(アクチナーゼE処理を行い、コンドロイチナーゼABC処理を行わなかったサンプル)を調製した。
サメ軟骨原料をアクチナーゼE及びコンドロイチナーゼABCで処理しなかった以外は、上記(1−1)と同じ方法でサンプルを調製した。具体的には、実施例1の(5−4−2)に記載の方法において、手順2)及び4)においてアクチナーゼE液(II)及びコンドロイチナーゼABC液の代わりに同量の蒸留水を加えた。上記以外は、実施例1の(5−4−2)に記載の方法で、サメ軟骨原料(I)の酵素処理なしサンプル及びサメ軟骨原料(II)の酵素処理なしサンプル(アクチナーゼE処理及びコンドロイチナーゼABC処理を行わなかったサンプル)を調製した。
実施例1の(5−4−1)(酸性ムコ多糖標品の酵素分解)に記載の方法で、標品のコンドロイチン硫酸CナトリウムをアクチナーゼE及びコンドロイチナーゼABCで処理して、コンドロイチン硫酸Cナトリウムの酵素処理サンプルを調製した。
コンドロイチン硫酸CナトリウムをコンドロイチナーゼABCで処理しなかった以外は、上記(1−4)と同じ方法でサンプルを調製した。具体的には、実施例1の(5−4−1)に記載の方法において、手順4)においてコンドロイチナーゼABC液の代わりに同量の蒸留水を加えた。上記以外は、実施例1の(5−4−1)に記載の方法で、コンドロイチン硫酸Cナトリウムのアクチナーゼ処理サンプルを調製した。
コンドロイチン硫酸CナトリウムをアクチナーゼE及びコンドロイチナーゼABCで処理しなかった以外は、上記(1−4)と同じ方法でサンプルを調製した。具体的には、実施例1の(5−4−1)に記載の方法において、コンドロイチン硫酸Cナトリウム(標品)を使用して、手順2)及び4)においてアクチナーゼE液(I)及びコンドロイチナーゼABC液の代わりに同量の蒸留水を加えた。上記以外は、実施例1の(5−4−1)に記載の方法で、コンドロイチン硫酸Cナトリウムの酵素処理なしサンプルを調製した。
上記(1)の(1−1)〜(1−6)で調製したサンプルを用いて、実施例1の(5−1)のセルロースアセテート膜を用いた評価の方法で分析を行った。
膜電気泳動の結果を、図6に示す。
Claims (10)
- 酸性ムコ多糖又はその塩を含む被検試料を、定性試験及び定量試験に供することを含み、
前記定性試験は、前記被検試料を、膜を用いた電気泳動に供する電気泳動工程、
電気泳動後の膜を、アルシアンブルーで染色する染色工程、及び、
前記染色で得られるバンドパターンから、前記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する検出工程を含み、
前記定量試験は、前記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩を、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を用いる比色法により定量する比色定量工程を含む、
前記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の分析方法。 - 前記酸性ムコ多糖が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸からなる群より選択される1以上である請求項1に記載の分析方法。
- 前記酸性ムコ多糖が、コンドロイチン硫酸である請求項1又は2に記載の分析方法。
- 前記酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素が、アルシアンブルー又はカルバゾールである請求項1〜3のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素が、アルシアンブルーである請求項1〜4のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記定性試験によって、前記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩が1種であることが確認された場合に、前記定量試験により得られる定量結果を、前記酸性ムコ多糖又はその塩の含量とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記膜は、ニトロセルロース膜、セルロースアセテート膜又はニトロセルロースとセルロースアセテートとの混合膜である請求項1〜6のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記膜は、ニトロセルロース膜又はセルロースアセテート膜である請求項1〜7のいずれか一項に記載の分析方法。
- コンドロイチン硫酸又はその塩を含む被検試料を、定性試験及び定量試験に供することを含み、
前記定性試験は、前記被検試料を、膜を用いた電気泳動に供する電気泳動工程、
電気泳動後の膜を、アルシアンブルーで染色する染色工程、及び、
前記染色で得られるバンドパターンから、前記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩の種類を確認する検出工程を含み、
前記定量試験は、前記被検試料中の酸性ムコ多糖又はその塩を、酸性ムコ多糖又はその塩を検出可能な色素を用いる比色法により定量する比色定量工程を含み、
前記定性試験によって、前記被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩がコンドロイチン硫酸又はその塩のみであることが確認された場合に、前記定量試験により得られる定量結果を、前記コンドロイチン硫酸又はその塩の含量とする、
前記被検試料に含まれるコンドロイチン硫酸又はその塩の定量方法。 - 酸性ムコ多糖又はその塩を含む製品の品質管理試験方法であって、
前記製品を被検試料として、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分析方法により分析する被検試料分析工程、
濃度及び種類が既知の酸性ムコ多糖又はその塩を含む標準試料を、前記分析方法により分析する標準試料分析工程、及び、
前記分析で得られる被検試料の定性試験結果及び定量試験結果と、標準試料の定性試験結果及び定量試験結果とを対比して、前記製品の品質を評価する評価工程を含む、
酸性ムコ多糖又はその塩を含む製品の品質管理試験方法。
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