JP2004537736A - 新規癌マーカーおよび癌の診断におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
ヒトおよびヒト以外の哺乳類の被験者における癌の診断用の新規癌マーカー、特に約９９１の質量/電荷（ｍ/ｚ）比の負に荷電した分子を含む癌マーカーを提供する。本発明の癌マーカーを使用して、生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌細胞または腫瘍の存在を、該癌マーカーのレベルの低下について同サンプルをアッセイすることにより決定することができる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトおよびヒト以外の哺乳類の被験者における癌の診断用の新規癌マーカー、特に約９９１の質量/電荷（ｍ/ｚ）比の負に荷電した分子を含む癌マーカーに関する。当明細書で述べる癌マーカーを使用して、例えば体液のような、被験者からの生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌細胞または腫瘍の存在を、該癌マーカーのレベルの低下について該被験者の生物学的サンプルをアッセイすることにより決定することができる。
【背景技術】
【０００２】
医学的研究における数々の進歩にもかかわらず、癌は依然として世界レベルでの主要な死亡原因であり、外科的切除、放射線治療、化学的治療、または他の公知の治療法による適当な医療行為を促進するために、迅速で簡単な癌の早期診断法が必要とされている。癌の良い診断法が利用できることはまた、治療に対する患者の反応を評価するために、あるいは原発部位での再成長または転移による再発を評価するためにも重要である。
【０００３】
癌マーカー、例えば腫瘍遺伝子産生物、成長因子および成長因子受容体、脈管形成因子、プロテアーゼ、癒着因子、および腫瘍サプレッサー遺伝子産生物等の特徴を明らかにすることで、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌のリスク、存在、状態、または今後の動向に関する重要な情報を提供することができる。１つまたはそれ以上の癌マーカーの存在または発現または活性をレベル決定することは、例えば悪性の異常を良性の異常から識別することにより、不確定な臨床的異常を伴う患者を区別する診断の一助とすることができる。さらに悪性が明らかになった患者において、癌マーカーは今後の再発のリスクまたは選択された治療コースに対する特定の患者の反応の可能性を予測するために有用となり得る。特異的な薬剤または任意の治療に対する患者の反応性を予測することのできる、高度に特異的な癌マーカーを分析することにより、またはマーカーを組み合わせることにより、さらに特異的な情報を得ることができる。
【０００４】
糖鎖付加の異常はほとんどのタイプの癌に共通する特徴であり、セリン/スレオニンに結合したグリカン（すなわちＯ−グリカン）のレベルの劇的な変化が癌患者に起こり得ることは、よく知られている。“Ｏ−グリカン”は、未完成タンパク質のセリン残基および/またはスレオニン残基にＮアセチルガラクトサミンが付加した糖タンパク質である。癌患者は例えば、普通のＯ−グリカンのコア構造のレベルが低下し、シアル酸化されたグリカンもしくはガングリオシドのレベルが増加し、またはシアル酸に対する修飾が減少する可能性がある。Ｏ−グリカンの特異的なペプチド部分の合成もまた癌患者では変化する可能性があり、糖タンパク質のペプチド部分がＯ−グリカンの合成を部分的に指示しているために、ペプチド部分の変化によりＯ−グリカンのレベルが変異することになる。あるいは癌患者ではシアル酸転移酵素活性が亢進し、それにより過度にシアル酸化されたＯ−グリカンが産生される。
【０００５】
一般に腫瘍特異的な抗原は高分子量または高質量の分子（＞１０，０００Ｄａ）であるが、これらは癌細胞で特異的に発現されるか、または正常細胞に比して癌細胞では高レベルで発現されるかのいずれかである。しかし低分子量（＜１０，０００Ｄａ）の腫瘍特異的な抗原もあり、これらはしばしば糖脂質、さらに特にスフィンゴ脂質であり、これらはポリラクトサミン構造を含む。“糖脂質”は単に１つまたはそれ以上の糖質部分を有する脂質分子または脂肪酸分子である。
【０００６】
“スフィンゴ脂質”は脂肪酸残基、極性の末端基、およびスフィンゴシン（４−スフィンゲニン）または関連する塩基を含む脂質であり、セラミドおよびその誘導体であるスフィンゴミエリン（すなわちヒドロキシル基上にホスホコリン部分を含むセラミド）、またはガングリオシドを含むスフィンゴ糖脂質（すなわちヒドロキシル基上に糖質部分を含むセラミド）を含む。
【０００７】
“ガングリオシド”はシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質（すなわちスフィンゴシンで置換された脂肪酸が、Ｄグルコース、Ｄガラクトース、Ｎアセチルガラクトサミンおよび/またはＮアセチルノイラミン酸を含むオリゴ糖に結合している糖脂質）であり、大多数の哺乳類の細胞膜で発現される。ガングリオシドはシアル酸を伴う糖鎖付加の程度に依存して、モノ−、ジ−、トリ−、またはポリ−シアロガングリオシドがある。標準的な用語に従って“ＧＭｎ”“ＧＤｎ”“ＧＴｎ”という用語を用いるが、ここで “Ｇ”はガングリオシドを示し、“Ｍ”はモノシアリルガングリオシドを示し、“Ｄ”はジシアリルガングリオシドを示し、“Ｔ”はトリシアリルガングリオシドを示す；そしてここで“ｎ”は少なくとも１を意味する数字、または少なくとも１ａ（例えば１ａ、１ｂ、１ｃ等）を意味する英数字であり、分子に認められる結合パターンを示す[Lehninger, In: Biochemistry（生化学）、 pp. 294-296(Worth Publishses, 1981); Wiegandt, In: Glycolipids（糖脂質）: New Comprehensive Biochemistry（新たな総合的生化学）, pp. 199-260(Neuberger et al.著, Elsevier, 1985 )]。
【０００８】
ポリラクトサミンは、通常そのポリラクトサミンのユニット構造により２つの種類、特にガラクトシル−（∃１−３，）Ｎ−アセチルグルコサミンを含むタイプ１のポリラクトサミン、あるいはガラクトシル−（∃１−４）Ｎ−アセチルグルコサミンを含むタイプ２のポリラクトサミン、に分類される。
【０００９】
ガングリオシド、例えばＧＭ２（Livingston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2911-2915, 1987）、ＧＤ２（Schulz, et al., Cancer Res. 44, 5914-5920, 1984）、またはＧＤ３（Cheresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5767-5771, 1984; Reisfeld et al., In: Immunity to Cancer（癌に対する免疫）(M. S. Mitchell著),pp69-84, 1985）は、神経外胚葉由来の様々な腫瘍、例えば悪性黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、軟組織肉腫および肺小細胞癌の、顕著な細胞表面の構成要素として同定された。これらのガングリオシドはほとんどの正常な組織には存在しないか、存在しても低レベルに過ぎない。腫瘍特異的な抗原としてのガングリオシドの役割もまた、例えば以下の文献Ritter and Livingston, et al., Sem. Canc. Biol. 2, 401-409, 1991; Chatterjee et al., USSN 5, 977, 316, 1999年11月2日発行; Hakomori, Cancer Res. 45, 2405-2414, 1985; Miraldi In: Seminars in Nuclear Medicine（核医学におけるセミナー） XIX, 282-294, 1989; およびHamilton et al., Int. J. Cancer 53, 1-8, 1993で考察されている。
【００１０】
主な癌に見出される腫瘍に関連する共通の抗原は、タイプ２の糖鎖のポリラクトサミン構造、あるいはフコース化した形を含むガングリオシドである。例えばガングリオシドのシアルルイスＡおよびシアリルルイスＸは血管内皮細胞への癌細胞の接着に関与し、癌の血行性転移に寄与する。シアリルルイスＡは、結腸、膵臓および胆管の癌でしばしば発現され、一方シアリルルイスＸは乳房、肺、肝臓および卵巣の癌で共通して発現される。癌細胞表面でのシアリルルイスＡまたはシアリルルイスＸのリガンドの糖質の発現の程度は、癌の患者の血行性転移頻度および予後の結果とよく相関する。
【００１１】
他方、タイプ１のポリラクトサミン構造を含むガングリオシド、例えば２−３シアリルルイスＡは、正常な細胞および組織に豊富に存在するが、癌にも関与する。Leveryら（USSN 6.083,929, 2000年7月2日発行）は、シアリル残基および/またはフコシル残基を伴う場合も伴わない場合も、ラクト系のタイプ１の糖鎖の伸長した形が、癌組織中に存在することを示している。Leveryら（同書）は、結腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５の糖脂質分画から単離されたアイソフォームが、以下のスフィンゴ糖脂質ユニット：すなわちホモダイマーのルイスＡ、ヘテロダイマーのルイスＢ−ルイスＡ、および伸長したシアリルルイスＡ−ルイスＡ（後者は腫瘍に関連するスフィンゴ糖脂質および腫瘍マーカーの可能性があるものとして示唆されている）を含むことを示した。
【００１２】
しかし癌の検出に関するシアル酸化された抗原の同定における進歩にもかかわらず、癌の診断および特異的な癌のタイプの検出の手助けとなる癌マーカーは、依然として明らかに必要とされている。特に癌において糖鎖の乱れが観察されているにもかかわらず、公知のガンマーカーはほとんどなく、あるとしても必ずしもシアル酸化化合物またはＯ結合型糖タンパク質ではない、および/または腫瘍特異的な抗原ではない癌マーカーに過ぎない。
【００１３】
癌マーカーの好ましい特徴は、迅速なまたはハイスループットの分析方法、例えば質量分析法、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−質量分析法を用いて、検出が十分に容易にできることである。
【００１４】
さらに適切な癌マーカーは、体液（例えば血液、血清、尿、粘液、唾液、汗、涙、または他の分泌液）での検出が容易にできることが望ましく、それによりルーチーン検査用の非侵襲的アッセイの使用を促進することができる。
【発明の開示】
【００１５】
（発明の概要）
本発明に至るまでの研究において、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の被験者の体液中の高分子量/質量および低分子量/質量の双方の癌マーカーを同定し、体液中のこのような癌マーカーのレベルの低下に関与する悪性腫瘍を検出するための、関連するハイスループットの診断法を開発することを追求してきた。その際、このような診断は分子のプローブ、例えば抗体または核酸プローブの単離に依存することなく、および/またはこのような分子プローブを用いた時間のかかる結合ステップを必要としないものとした。
【００１６】
したがって本発明の第一の側面として、健常な被験者に比して癌の被験者では低レベルで存在する、約９９１のｍ/ｚ比の負に荷電した分子、または負に荷電した該分子の誘導体を含む癌マーカーを提供する。
【００１７】
本発明の第２の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌の診断または検出する、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、または健常な被験者として定められたレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際健常な被験者のレベルまたは健常な被験者として定められたレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が、癌を示すものとする。
【００１８】
本発明の第３の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌を診断または検出する、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）検査サンプルに添加した内部標準のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際内部標準のレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が癌を示すものとする。
【００１９】
本発明の第４の側面として、癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；同検査サンプル中のもうひとつのマーカーのレベルと相対して、その際もうひとつのマーカーに対しての癌マーカーの比率の変化が癌を示すものとすること、を含むヒトまたはヒト以外の被験者における癌を診断または検出する方法を提供する。
【００２０】
本発明の第５の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌の治療をモニターする、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌の治療を行っている被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、健常な被験者として定められたレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際レベルの増加が治療の成功を示すものとする。
【００２１】
本発明の第６の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における治療成功後の癌の再発を診断する、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌の治療を行った被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含むものとする；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、健常な被験者として定められたレベル、または癌の治療に成功した後の被験者からのサンプル中のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際レベルの低下が癌の再発を示すものとする。
【００２２】
（定義）
本明細書を通して本文中に他の要求がなければ、“含む(comprise)”という言葉、またはそのバリエーション、例えば “含む(comprises)”または“含んでいる(comprising)”という言葉は、他のいかなる段階もしくは要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群も除外されていなければ、規定された段階もしくは要素もしくは整数、または段階もしくは要素もしくは整数の群を、包含することを意味すると理解されるだろう。
【００２３】
当業者は、当明細書に記述した本発明は、限定的に述べたもの以外にバリエーションおよび修飾を認めることを理解するだろう。本発明はこのようなバリエーションおよび修飾のすべてを含むものと理解されなければならない。本発明はまた、本明細書で述べたまたは示したすべての段階、特徴、組成物および化合物を個別にまたは集合的に含み、したがって前記の段階、特徴、組成物および化合物のいずれかのおよびすべての組み合わせ、またはいずれか２つまたはそれ以上を含む。
【００２４】
本発明は当明細書で述べた限定的な態様により範囲を限定するものではなく、これらの態様は単に例示する目的で意図しているに過ぎない。機能的に均等な産生物、組成物および方法は、当明細書で述べたように、明確に本発明の範疇に含まれる。
【００２５】
本明細書におけるあらゆる先行技術の（複数の）公開公報に対する参照は、単に本発明をさらに説明する目的で行っており、該（複数の）公開公報がオーストラリアまたは他の地域の当業者の共通の一般知識の一部となっていることを指示または承認するものとして取り上げているのではない。
【００２６】
本明細書で使用する場合“〜からの”“〜の”という単語、および“由来の”という用語は限定された産生物、特に例えばポリペプチド、タンパク質、遺伝子、もしくは核酸分子のような分子、抗体分子、Ｉｇ分画、またはその他の分子、または前記分子を含む生物学的サンプルを、特定の素材、有機体、組織、器官または細胞から必ずしも直接でなくてもよいが、その素材、有機体、組織、器官または細胞から得ることができることを示すものとする。
【００２７】
当明細書で使用する場合 “癌”は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の体またはその一部を通して、例えばリンパ系および/または血流を介して侵襲的成長および転移ができるものを含む、広範囲の良性腫瘍または悪性腫瘍のいずれか１つまたはそれ以上を意味するものとする。本発明では悪性腫瘍および固形癌の診断または検出を特に定めているのではあるが、当明細書で使用する場合“腫瘍”という用語は、良性腫瘍および悪性腫瘍の双方または固形の成長を含む。典型的な癌として、癌腫、リンパ腫または肉腫、例えば卵巣癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、尿路の癌、子宮癌、急性リンパ性白血病、ホジキンス病、黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、および軟組織の肉腫を含むが、これに限定されない。
【００２８】
本発明の内容において当明細書に記述し請求項により定義する場合、“癌マーカー”という用語は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者からの生物学的サンプル、例えば体液（血液、尿、粘液、唾液、汗、涙、または他の分泌液）において検出可能なあらゆる分子、そして被験者の癌を示すあらゆる分子、限定的には健常な被験者の体液中のレベルに比して癌の被験者の体液中ではそのレベルが低下する分子を意味するものとする。“癌マーカー”という用語はまた、正常な細胞によりもしくは正常な細胞で発現するが癌細胞では発現しない、または正常な細胞に比して癌細胞によりもしくは癌細胞ではその発現が低下する分子を含むものとする。
【００２９】
“負に荷電した分子”という用語は本発明の内容において、“負に荷電した糖質を含む分子”または“糖質を含む分子”という用語と互換性を持って使用し、同マーカーがその分子の一部として実際に糖質を含んでいるか否かにかかわらず、約９９１のｍ/ｚ比を有する本発明の癌マーカーをいう。この用語はまたその範囲に、同分子の誘導体、例えばリン酸または硫酸を含む誘導体も含む。
【００３０】
同分子が糖質を含む場合、好ましくは単糖、二糖、またはオリゴ糖（すなわち少なくとも３つおよび約９つ以下の単糖ユニット）を含む。
（好ましい態様の詳細な説明）
本発明の１つの側面として、健常な被験者に比して癌の被験者では低レベルで存在する、約９９１のｍ/ｚ比の負に荷電した分子、または前記の負に荷電した分子の誘導体を含む癌マーカーを提供する。
【００３１】
好ましくは本発明の負に荷電した分子は単離した形で提供する。“単離した”により、例えば当明細書で定義した条件下で質量分析法により決定される、同種の糖脂質、二糖、単糖、またはオリゴ糖から実質的に遊離していることを意味する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの高度の分離度により、ｍ/ｚ９９１のイオン分子種のポストソース分解のイオン化フラグメントの質量分析の特性が同分子の“フィンガープリント”に対応することは、当業者に理解されるだろう。
【００３２】
好ましくは糖質部分は、存在する場合にはヘキソースリン酸またはヘキソース硫酸を含む。この点に関してポストソース分解のフラグメント化のデータは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでの算出の場合、単離された負に荷電した分子がヘキソースリン酸、例えばホスファチジルイノシトール（すなわちイノシトールー１，２サイクリックリン酸）に特徴付けられる、約２４１のｍ/ｚ比を有するフラグメントを生成することを明らかにした。
【００３３】
さらにより好ましくは、糖質部分はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を含む。
なおより好ましくは糖質を含む分子は、少なくとも１つのヘキソースリン酸、ホスファチジルイノシトールまたはＧＰＩユニットを含む二糖またはオリゴ糖部分を含む。
【００３４】
また本内容において“負に荷電した糖質を含む分子”という用語、または先に述べたその互換性のある用語は、糖質を含む分子が十分に親水性で、疎水性のマトリックス、特にＣ−１８マトリックスとは強く結合せず、好ましくは１つまたはそれ以上のリン原子またはイオウ原子を含むことを意味するものとする。この点に関して、質量分析計、特にマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計 (ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ)による本発明の癌マーカーのイオン化では、単離した本発明の癌マーカーが負に荷電したイオンであることを示している。したがって“負に荷電した糖質を含む分子”という用語は、リン脂質、ホスホグリセリド、リン酸を含むＮ結合型糖タンパク質、リン酸を含むＯ結合型糖タンパク質、ホスファチジルイノシトールを含む脂質もしくはタンパク質、またはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を含む脂質もしくはタンパク質、を含む。
【００３５】
当明細書で述べた癌マーカーをその特性を選択して分析を行うと、該癌マーカーの糖質部分はin situで他の官能基と結合できると考えることができる。例えば単糖、二糖、またはオリゴ糖部分はタンパク質性の部分（例えばアミノ酸、ペプチド、またはポリペプチド）とin situでＯ結合またはＮ結合して、糖ペプチド/糖タンパク質を形成することができる、あるいはその代わりにまたはさらに脂質部分、例えば脂肪酸（特にパルミチン酸および/もしくはオレイン酸および/もしくはミリスチン酸および/もしくはアラキドン酸）；トリアシルグリセロール；リン脂質；ホスホグリセリド（例えば特にホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、もしくはホスファチジルエタノールアミン）；スフィンゴ脂質；スフィンゴシン；またはコレステロールホルモンとin situで結合することができる。このようなバリアントはすべて本明細書で述べた内容に含まれる癌マーカーとして使用することができる。したがって本発明は、糖質部分のペプチドバリアントまたは脂質バリアントを明確に包含するが、唯一必要なのはこのようなバリアントがｍ/ｚ９９１のイオン種を含むことだけである。
【００３６】
なおより好ましくは癌マーカーは糖脂質を含み、さらにより好ましくは糖脂質はホスファチジルイノシトール、ならびに１つまたはそれ以上のミリスチン酸、パルミチン酸およびオレイン酸からなる群から選択される１つまたはそれ以上の脂肪酸を含む。当明細書で述べた癌マーカーの脂質部分の構造は、予備実験を行わずに当業者に公知のいくつかの技術、特に高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、衝突活性化法（ＣＡＤ）、タンデム質量分析法（本質的にはLadisch et al., J. Biol. Chem. 264, 12097-12105, 1989 に記載されている）、または特にＰ−ＮＭＲ技術のいずれか１つまたはそれ以上を用いて解明できる。
【００３７】
本発明の本態様は、該糖脂質の誘導体、例えばその検出を促進するためにｍ/ｚ９９１イオンに共有結合させた、蛍光リガンド、酵素のリガンド、放射性リガンド、ペプチドリガンド（例えばＦＬＡＧ）、または抗体のリガンドの１つまたはそれ以上を含む誘導体まで明確に拡大する。
【００３８】
本発明の特に好ましい態様において、癌マーカーは付加的な脂肪酸、例えばパルミチン酸またはオレイン酸により任意にアシル化したミリストイルホスファチジルイノリトール（すなわちジミリストイル−ＰＩ）を含む。本発明の糖質を含む癌マーカーを特徴付けるものとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでの本来の分子に関するｍ/ｚ９９１イオン値、およびポストソース分解のフラグメント化の分析でのｍ/ｚ２４１のピークの出現、の双方に一致するものとする。本発明の本態様は該糖脂質の誘導体、例えばその検出を促進するために同糖脂質に共有結合させた、蛍光リガンド、酵素のリガンド、放射性リガンド、ペプチドリガンド（例えばＦＬＡＧ）、または抗体のリガンドの１つまたはそれ以上を含む誘導体まで明確に拡大する。
【００３９】
本発明の糖質を含む分子の質量および/または質量電荷比または他の物理学的特性は、ゲル濾過、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析法、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣを含む当該技術分野で認められているいずれかの方法、または組成物もしくは構造のデータから化合物の分子質量を予測することにより、決定することができる。好ましくは質量電荷比は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、タンデムＭＳ、エレクトロスプレーＭＳ等を含む質量分析法により決定する。
【００４０】
質量/電荷比またはｍ/ｚ比について、限定された数値に“約”をつけて当明細書で言及する場合、さらに定義していなくても受容可能な変動を含むことを当業者は理解するだろう。好ましくはｍ/ｚ比の算出値は、当明細書で述べたサンプルの質量分析計により決定する場合、受容可能なエラーとしてｍ/ｚ±５、より好ましくはｍ/ｚ±４、さらにより好ましくはｍ/ｚ±３、まだより好ましくはｍ/ｚ±２、そしてさらにまだより好ましくはｍ/ｚ±１を含む。したがって約９９１と算出されたｍ/ｚ比は、９８６−９９６の範囲のｍ/ｚ比、好ましくは９８７−９９５の範囲、より好ましくは９８８−９９４の範囲、さらにより好ましくは９８９−９９３、そしてまだより好ましくは９９０−９９２の範囲を含む約９９１、または９９１に等しいと理解されるだろう。
【００４１】
当明細書で使用する場合“誘導体”という用語は、当明細書で述べた約９９１のｍ/ｚ比のペアレント分子である糖質を含む分子から生成されるあらゆる物質を意味するものとする。
【００４２】
したがって本発明の誘導体は、本発明の糖質を含む分子のフラグメントのいずれかおよびすべて、および癌マーカーとしてのそれらの使用を含み、唯一必要なのは、同フラグメントが癌検出アッセイに関与するペアレント分子の特異性を保持していることだけである。当明細書で提供される開示から明らかになるように（特に図４Ａ，４Ｂおよび４Ｃ）、本発明の糖質を含む分子はポストソース分解のイオン化において、ｍ/ｚが約２４１、約６４４、約７０５、約７４９、約９４７のフラグメントの生成を伴う、特異的な“フィンガープリント”を示す。サンプル中の単糖またはイノシトールリン酸のバックグラウンドが高いと、１つまたはそれ以上の特徴的なフラグメントのピークが覆われることが起こり得る。このような場合には２つのフラグメント、好ましくは３つのフラグメント、より好ましくは４つのフラグメント、そしてより好ましくは５つすべてのフラグメントの存在を、ペアレント分子の特異性を有する癌マーカーとして使用できることを当業者は知っているだろう。
【００４３】
負の糖質を含む分子の好ましい誘導体は、例えば糖鎖生物学の業者に公知の標準的な方法により製造される該分子の糖質部分のフラグメントを含む。このような分析はそれらの検出を促進するための化学的修飾にしばしば依存するため、本発明はまた、過メチル化、過ヨウ素酸酸化、ＮａＢＨ4還元、還元によるアミノ化（例えば２−アミノピリジンを用いて）により製造される、または特にペルフルオロベンジルアミノベンゾエートもしくはアルキルアミノベンゾエートとのインキュベーションにより製造される、本発明のｍ/ｚ９９１の癌マーカーの、化学的に修飾されたいずれかのフラグメントを含むことまで拡大する。誘導体はさらに、先の方法を組み合わせて製造されるいかなる糖質を含む分子も含む。
【００４４】
当業者は本題の癌マーカーの糖質部分の詳細な構造を決定するためのいくつかの公知の方法を知っているだろうが、その場合は誘導体を製造することができる（例えば酵素分解、またはフィンガープリント法の技術、質量分析法、タンデム質量分析法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）―質量分析法、分子モデリング、レクチンアフィニティークロマトグラフィー（特に高速液体アフィニティークロマトグラフィー、以下“レクチン−ＨＰＬＡＣ”とする、と組み合わせて）、逆相法、サイズ排除クロマトグラフィー等）。
【００４５】
糖質全体の組成は、単糖残基の数およびタイプを提供する、またはＮアセチルガラクトサミンもしくはＯグリカンの存在を決定するため、例えば各々還元糖またはメチルグリコシドとして単糖を放出する酸加水分解またはメタリシスにより決定する。次に低圧または高圧下でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および/または液体クロマトグラフィーを使用して、放出された単糖を分離、定量する。ＧＣに関しておよび任意に液体クロマトグラフィーに関しては、単糖は一般に例えばペルメチル化により誘導体化する。パルス電流検出法を用いた高ｐＨの陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ/ＰＡＤ）もまた使用することができる（本質的にはHardy, Methods Enzymol. 179,76-82,1989 に記載されている）。
【００４６】
糖タンパク質の糖質部分を解明するには、より小さな糖質ユニット（単糖、二糖、オリゴ糖）を、例えば化学的方法および/または酵素による方法を用いて放出することが必要である。酵素分解の方法は、放出を達成するために、有効量のペプチドＮグリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８，）または他のエンドグリコシダーゼまたはグリコアミダーゼ（Takahashi, N. and Muramatsu, T.著 (1992) In: CRC Handbook of Endoglycosidases and Glycoamidases（エンドグリコシダーゼおよびグリコアミダーゼのＣＲＣハンドブック）, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL を参照のこと）、またはエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグリコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）またはグリコシダーゼ、例えばEndo HもしくはEndo F（Maley, F. et al., Anal. Biochem. 180, 195-204, 1989 を参照のこと）と共にインキュベーションすることを含む。化学的方法は、無水ヒドラジン、または強アルカリを還元剤と組み合わせて、任意にＮａＢＨ4と組み合わせて、糖質の放出に十分な時間および条件下でインキュベーションすることを含む。
【００４７】
放出された糖質の構造は、例えばエキソグリコシダーゼを用いた配列にそっての分解、位置特異的な化学的分解、メチル化分析（ＧＣ−ＭＳ）、ＦＡＢ−ＭＳ、および/または高磁場プロトンおよび多次元ＮＭＲ法により決定する。生成された糖質を含むフラグメントの分離を促進するため、これらを発色団、蛍光標識、または放射性化学により誘導体化する。パルス電流検出法（ＰＡＤ）を用いて、誘導体化していない糖質の分離を促進することもできる。
【００４８】
糖質を含む分子の複合混合物を分離するためには、分析技術、例えば質量分析法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはこれらを組み合わせた技術、例えばタンデム質量分析法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−質量分析法が好ましい。たいへん良い総説として以下の文献がある（例えばHonda, Anal. Biochem. 140, 1-47, 1984; Townsend. (1993) In: Chromatography in Biotechnology(バイオテクノロジーにおけるクロマトグラフィー): ACS Symposium Series （ＡＣＳシンポジウムシリーズ）529(Horva'th, C. and Ettre, L. S.著）、American Chemical Society, Washington, D. C; Scott (1992) In:Food Analysis by HPLC （ＨＰＬＣによる食品分析）(L. M. L. Nollet,著)、Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.)；およびLee, Anal. Biochem. 179, 404-412, 1990）。
【００４９】
例えばアミンを結合させたシリカマトリックスを用いた順相ＨＰＬＣは、誘導体化していない糖および放射能標識したアルジトールの分離に有用である（Mellis and Baenziger, Anal. Biochem. 114, 276-280, 1981）。ＯＤＳシリカを用いる逆相法は、誘導体化した糖の分離に有用である（Tomiya et al., Anal. Biochem. 163, 489-499, 1987）。例えばＤＥＡＥ（Pharmacia）またはＭｏｎｏ−Ｑ（Pharmacia）を用いる陰イオン交換法、は、シアル酸化、リン酸化、または硫酸化した糖の分離に有用である（Watson and Bhide, Liq. Chrom/Gas Chrom. 11, 216-220, 1993）。高いｐＨ値での強陰イオン交換体を用いる高圧陰イオン交換クロマトグラフィー法もまた、この点に関して有用である（Townsend and Hardy, Glycobiol. 1, 139-147, 1991）。
【００５０】
固定化レクチンリガンドの認識範囲を利用した一連のレクチンアフィニティークロマトグラフィーは、特にＨＰＬＡＣと組み合わせた場合、多数の糖、例えばガラクトース、フコース、Ｎアセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース、グルコース、またはＮアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の分離に有用である（Cummings et al., Methods Cell Biol. 32, 141-183, 1989;およびVirgilio (1998) In: Lectins, Biology, Biochemistry, Clinical Biochmistry（レクチン、生物学、生化学、臨床医学）, Vol. 12, the 17th Int. Lectin Meeting, Wurzburg, 1997 の会報を含む(van Driessche, E., Beeckmans, S.および Bog-Hansen, T.,著)、Textop publishers, Hellerup, Denmark (ISBN 87-984583-0-2)を参照のこと）。代表的なレクチンとして以下を含む、Canavalia ensiformis（タチナタマネ）コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ガレクチン−Ｉ、Phytolacca americana(ヨウシュヤマゴボウ)ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、P. americana（ヨウシュヤマゴボウ）Ｐａ−２、および以下からのアグルニチンのいずれか１つまたはそれ以上、すなわちAgaricus bisporus（ツクリタケ）（ＡＢＡ−Ｉ）、Aleuria aurantia（ヒイロチャワンンタケ）（ＡＡＡ）、Allomyrina dichotoma（日本カブトムシ）（Ａｌｌｏ−Ａ−Ｉ/ＩＩ）、Arachis hypogea（ラッカセイ）（ＰＮＡ）、Bauhinia purpurea（ムラサキソシンカ）（ＢＰＡ）、Datura stramonium（ヨウシュチョウセンアサガオ）（ＤＳＡ）、Dolichos biflorus（ホースグラム）（ＤＢＡ）、Erythrina cristagalli（アメリカデイゴ）（ＥｃＩＡ）、Erythrina corallodendron（エリスナコラロデンドロン）（ＥｃｏＡ）、Erythrinia variegata（サンデイゴ）（ＥＶＡ）、Galanthus nivalis（スノードロップ）（ＧＮＡ）、Griffonia simplicifolia（グリフォニアシンプリシフォニア）（ＩＡ４またはＧＳＡ−Ａ４；ＩＢ４またはＧＳＡ−Ｂ４；ＩＩまたはＧＳＡ−ＩＩ）、Lens culinaris（レンズマメ）（ＬＣＡ）、Lotus tetragonolobus（ロツス テトレゴロノブス）（ＬＴＡ）、Lycopersicon esculentum（ミニトマト）（ＬＥＡ）、Maakia amurensis（イヌエンジュ）（ＭＡＡ）、Oryza sativa（イネカリ）（ＯＳＡ）、Phaseolus vulgaris（インゲンマメ）（erythroagglutininまたはＥ−ＰＨＡ；白血球凝集素(leukoaggulutinin)またはＬ−ＰＨＡ）、Pisum sativum（エンドウ）（ＰＳＡ）、Ricinus communis（トウゴマ）（ＲＣＡ−Ｉ，ＲＣＡ−ＩＩ）、Sambucus nigra（エルグー）（ＳＮＡ）、Sophora japonica（シダレエンジュ）（ＳＪＡ）、Triticum vulgaris wheat germ（ＷＧＡ）、Ulex europeaus (UEA-I)、Vicia faba （ソラマメ）(VFA)、Vicia graminea (VGA)、Vicia villosa（ヘアリーベッチ）（ＶＶＡ−Ｂ４）、またはWisteria floribunda（フジ）（ＷＦＡ）。
【００５１】
その代わりに、あるいはさらに高圧陰イオン交換クロマトグラフィー法、例えばＨＰＡＥＣ/ＰＡＤを使用して、複合糖質を含む混合物、特に本発明の陰イオン糖質を含む分子、またはリン酸を含むもしくは硫酸を含むそのフラグメントを分離する。
【００５２】
その代わりに、あるいはさらにサイズ排除クロマトグラフィー(Kobata et al., Methods Enzymol. 138, 84-94, 1987; Oxford GlycoSystem's GlycoMap 1000)をフラグメントの分離に使用するが、この分離はそれらのサイズに基づいて行われる。
【００５３】
本発明はまた、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が、より疎水性の他の分子、例えば疎水性ガングリオシドおよび疎水性セラミドから、本発明の癌マーカーを分離するのに有用であることを示した。これは糖質部分が親水性であるためである。事実親水性ではあるが、特に糖質部分のフラグメントを化学的に誘導体化し、例えば２−アミノピリジンを用いての還元的アミノ化により疎水性の発色団または蛍光標識を導入した場合には、ＲＰ−ＨＰＬＣはそれらフラグメントの分離に有用である。２−アミノピリジンでラベルした糖類はマッピングに容易に利用できる（本質的にはTomiya et al., Anal. Biochem. 171, 73-90,1988 に記載されている）。
【００５４】
電気泳動法、例えば濾紙電気泳動、キャピラリー電気泳動、および好ましくは高比率のポリアクリルアミドスラブゲルを用いたゲル電気泳動を利用して、糖質を含むフラグメントの蛍光性誘導体を分離する（例えば蛍光標識糖鎖電気泳動法（ＦＡＣＥ）、Millipore）ことができる。
【００５５】
質量分析法（ＭＳ）、またはタンデムＭＳ（例えばＭＳ/ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ/エレクトロスプレーＭＳ、エレクトロスプレーＭＳ/ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ/ポストソースＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ等）は、特にＮＭＲ、化学的分解、またはエキソグリコシダーゼによる分解と組み合わせた場合、糖質を含むフラグメントの分離に特に好ましく、分離したあらゆる単糖、二糖、またはオリゴ糖を含む、糖質を含むフラグメントの同定、結合位置、およびアノマー(anomericity)を決定することができる。質量分析法が、分子量の正確な決定、化学的構造の同定、混合物の組成の決定、および定性的要素の分析のための分析技術であることは、当業者は知っているだろう。作動にあたって、質量分析計は調べるサンプル分子のイオンを生成し、それらの質量対電荷比にしたがってイオンを分離し、各イオンの相対量を測定する。好ましくは質量分析システムはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳまたはエレクトロスプレーＭＳまたはそれらのポストソース分解のフラグメント化の方法を使用する。質量分析による分析を行う上での一般的なステップは以下のとおりである：
（ｉ）サンプルから気相のイオンを作成する；
（ｉｉ）イオンの質量対電荷比に基づいて空間または時間においてイオンを分離する
（ｉｉｉ）各々の選択された質量対電荷比のイオンを定量する。
【００５６】
飛行時間型（ＴＰＦ）質量分析法は、例えばＵＳＳＮ５，０４５，６９４およびＵＳＳＮ５，１６０，８４０に記載されているが、調べるサンプル素材のイオンを作成し、作成したイオンが検出器まで飛行するのにかかる時間を測定することによる、イオンの質量対電荷比に従ってこれらのイオンを分離する。ＴＯＦ質量分析計は、比較的簡単な高価ではない装置で、質量対電荷比の範囲が事実上限定されないため有利である。ＴＯＦ質量分析計は、各イオン化操作で作成されたすべてのイオンを記録することができるため、スキャン式の装置より高い感度を得ることができる。ＴＯＦ質量分析計は、従来の磁場型分析計で感度の出せなかった大きな有機分子の質量対電荷比の測定に特に有用である。与えられた電位により加速されたイオンの飛行時間は、その質量対電荷比に比例する。したがって１つのイオンの飛行時間はその質量対電荷比の関数となり、質量対電荷比の平方根にほぼ比例する。価数１のみの荷電イオンが存在すると仮定すると、最も軽いイオンが検出器に最初に到達し、次々により重い質量の群が続く。したがってＴＯＦ質量分析計は調べる分子種の質量/電荷比を非常に正確に算出し、しかも一般にはｍ/ｚ±５に過ぎないエラーは、ぴったり同じ時間では検出器に到達しない、質量と電荷の等しいイオンによるものと大方考えられる。このエラーは質量分析のピークの拡がりをもたらす、作成されたイオンの初期の時間、空間および運動エネルギーの分布によって主に起こり、そのためにＴＯＦ質量分析計の分解能が限定される。初期の時間分布は、イオンが形成される時間の不確実性に起因する。イオン形成時間の確実性は、パルス式のイオン化技術、例えばプラズマ脱離およびレーザー脱離により高めることができる。この方法は非常に短い時間間隔でイオンを作成し、その結果初期の空間分布を最小にするものであるが、これはサンプル表面上の十分に限定された領域からイオンが発生するため、イオン形成初期の空間の不確実性を無視できるからである。パルス式イオン化法、例えばプラズマ脱離（ＰＤ）イオン化法およびレーザー脱離（ＬＤ）イオン化法は、空間および時間のにおいては不確実性を最小にしてイオンを生成するが、初期のエネルギー分布は比較的広い。長いパルス長では質量の分離度がかなり限定され得るため、従来のＬＤは時間の不確実性を最小に抑えるために、典型的には十分に短いパルス（しばしば１０ナノ秒未満）を使用している。ＬＤの機能は、サンプル素材にレーザー波長で高度に吸収する小さな有機マトリックスを添加することにより高められる（すなわちマトリックス支援レーザー脱離イオン化法、以下“ＭＡＬＤＩ”）。マトリックスはサンプルの脱離およびイオン化を促進する。ＭＤＬＤＩは、分子質量１００，０００Ｄａ以上の大きな生体分子の脱離およびイオン化を、それらを分画化せずに促進するため、生物学的適用には特に有利である。本発明を行うための好ましいマトリックスは、４−ヒドロキシベンゼン−２−カルボン酸としても知られている２−（４−ヒドロキシフェニラゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）を含む。ＭＡＬＤＩにおいて、サンプルを通常滑らかな金属表面上にのせ、パルス状のレーザー光線をサンプル表面に照射すると、気相中に脱離する。したがってイオンは、レーザーのパルス間隔にほぼ対応する短い時間間隔で、そしてレーザーから十分なエネルギーを吸収して蒸発する個体のマトリックスおよびサンプルの照射部分に対応する非常に小さい空間領域で、生成される。ＭＡＬＤＩは、特にイオンの初速が小さい場合には、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析法のためのほぼ理想的なイオン源を提供する。ＭＡＬＤＩイオン源におけるパルス的なイオン抽出を用いることで、質量の分離にかなりの改善が得られる。イオンリフレクター（イオンミラーおよびリフレクトロンともいい、１つまたはそれ以上の均一な抑止型の静電場を含む）もまた、特に分析物質のイオンが自由に飛行する領域の端に位置する場合、同イオンの初期運動エネルギーの分布の影響を補正することが知られている。サンプル表面からのイオン生成について、分離を改良し、質量の正確さを高め、シグナル強度を高め、そしてバックグラウンドのノイズを抑えることにより、ＭＡＬＤＩがさらに改良されることは当該技術分野で知られており、例えばこれらの改良はＵＳＳＮ６，０５７，５４３に記載されている。
【００５７】
エレクトロスプレーＭＳ、またはエレクトロスプレーイオン化ＭＳを使用すると、液体サンプルマトリックスから気相のイオンを生成し、サンプルを質量分析計に導入することができる。したがってエレクトロスプレーＭＳは、液体クロマトグラフおよび質量分析計との間を仲介するために有用である。エレクトロスプレーＭＳにおいて、液体の分析物質はキャピラリーチューブ（以下“ニードル”）を通して押し出されるため、位置による差（例えば３０００から４０００ボルト）がニードル先端と反対の壁側、キャピラリー導入部、または類似構造との間にできる。ニードル先端から出て行く流出液は、電場により高度に荷電された微小液滴として拡散され、エレクトロスプレーを形成する。不活性乾燥ガス、例えば乾燥窒素ガスをニードルを取り囲むキャピラリーから導入することも、流出液の噴霧形成を高めることができる。エレクトロスプレーの微小液滴は電場の中を移動し、高真空に保たれている質量分析計に注入される。乾燥ガスと真空とを組み合わせた効果により微小液滴中の担体液は徐々に蒸発し、より小さな、ますます不安定な微小液滴となり、その表面からイオンが分析のための真空中に放たれる。脱溶媒されたイオンはサンプルコーンおよびスキマーレンズを通り、ＲＦレンズで集束された後、質量分析計の高真空領域に入り、そこで質量にしたがって分離され、適当な検出器（例えば光電子増倍管）により検出される。好ましい流出液の流速は、溶媒の組成により２０−３０マイクロリットル/分とする。液体の流速がより早いと、溶かしたサンプルのイオン化は不安定に、非効率的になる可能性があり、その場合には空気支援型の(pneumatically-assisted)エレクトロスプレーニードルを使用してもよい。
ＭＳの環境内に導入するためのサンプルの調製は、少なくとも１回の標準的なクロマトグラフィーによる分離または精製のステップによる分析の前に、一般的に脱塩（本質的には実施例１に記載した）、好ましくは、例えば逆相法によるさらなる分画化を含む。糖質を含むフラグメントの表面の活性を高めるための、例えば連続的な過ヨウ素酸塩への酸化、ＮａＢＤ4の還元、およびペルメチル化（Nilsson, 1993, In: Glycoprotein Analysis in Biomedicine（生物医学における糖タンパク質の分析）(E. F. Housell著)Humana Press, Totowa, NJ, pp35-46）によるそれらフラグメントの誘導体化、またはペルフルオロベンジルアミノベンゾエートによる誘導体化、またはアルキルアミノベンゾエートによる還元末端の修飾は、同方法の感度および/または分解能を改善することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する場合、サンプルは適当なマトリックスと混合して乾燥するが、一方エレクトロスプレーＭＳの場合は、サンプルは適当な担体溶液中の液体サンプルとして直接注入することになる。
【００５８】
さらに当明細書で述べた癌マーカーまたはそのフラグメントの誘導体はまた、１つまたはそれ以上の蛍光リガンド、発色団、酵素のリガンド、放射性リガンド、ペプチドリガンド（例えばＦＬＡＧ）、または抗体のリガンドを該分子の糖質部分に付加することにより生成される、あらゆる糖質を含む分子も含むものとする。糖質へのこのようなリガンドの付加の方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００５９】
糖質および糖質のポリマーを分析する方法、ならびにそれらから製造され得る誘導体のタイプのさらなるまとめとして、Hounsell, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 50, 311-350, 1994; Hounsell, (1997) In: Glycoscience: Status and Perspectives（糖質科学 現状と展望）(H. J. Gabius and S. Gabius著)、Chapman and Hall. pp15-29; およびHounsell著（1997）In: Glycoscience Protocols Methods in Molecular Biology（分子生物学における糖質科学のプロトコルの方法）, Humana Pressを参照のこと。
理論または作用方式に拘束されるものではないが、本発明の糖質を含む分子が、その発現のために活性化されたまたは機能的な免疫系の存在を必要とする、および/または健常な被験者の血中および他の体液中に分泌される限り、該分子は免疫系に依存する可能性がある。したがって腫瘍形成中、例えば転移前には、腫瘍形成が、該分子が通常産生される細胞からの該分子の発現および/または分泌を低減する、および/または該分子の放出の原因となり得る。
本発明によるこのｍ/ｚ９９１イオンの癌マーカーの決定、特に正常細胞および癌細胞の双方におけるその発現特性の解明、およびその検出のためのアッセイシステムの提供は、ヒトおよびヒト以外の哺乳類双方における癌の診断法の範囲の拡大を促進する。
【００６０】
したがって本発明のもうひとつの側面において、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者において癌を診断するまたは検出する、以下を含む方法を提供する：（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際健常な被験者のレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が癌を示すものとする。
【００６１】
しかしコントロールの健常な被験者の数値範囲が既に定められている場合には、コントロールサンプルを使用する必要はなく、その結果検査サンプルで行った測定をコントロールの範囲と比較することができる。また、サンプル内部のコントロールを使用して、癌マーカーのレベル低下の程度を評価することもできる。例えば、検査サンプルおよびコントロールサンプル双方において安定したレベルを示す、検査サンプルに含まれるもうひとつの分子（すなわちもう１つのマーカー）を選択して比率を算出することができ、この場合にはもう１つのマーカーに対する癌マーカーの比率の変化が癌を示すことになる。あるいは検査サンプルに適切なスタンダードのマーカーを加えることで、内部標準を提供することができる。このようなマーカーは多数あり、質量分析の分野の業者により容易に導入することができる。
【００６２】
当該技術分野で認められているあらゆる方法、例えば免疫による検出、クロマトグラフィー（特に疎水性相互作用クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー）を用いて、健常な被験者のレベルに相対しての被験者の癌マーカーのレベルをアッセイすることができる。必ずしも必要ではないが、好ましくは質量分析計を診断に利用する。本発明の糖質を含む分子またはそのフラグメントを検出または測定するこれらの方法は、当明細書において上に広範囲に述べている。
【００６３】
本発明は、神経外胚葉由来の癌、好ましくは癌腫、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択される癌、例えば卵巣癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、尿路の癌、子宮癌、急性リンパ性白血病、ホジキンス病、黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、および軟組織の肉腫の診断に対して特に指示する。本発明の特に好ましい態様において、癌は黒色腫、腺癌および結腸癌からなる群から選択する。
【００６４】
当明細書で述べた診断法は癌の診断に限定せず、特定の被験者の癌マーカーのレベルを時間をかけて比較することにより、同被験者における同疾患の進行のモニターに適用することができることは明らかであろう。緩解期の患者の場合は、緩解初期に採取したサンプルを、その後のサンプルに対する比較用のスタンダードとして使用することができる。被験者の状態を決定するために、好ましくは以前のサンプルと同じ体液から採取する、というのは癌マーカーのレベルのその後のどのような変異でも緩解期が終了したことを示唆できるからである。同様に治療が成功して緩解または治癒に至った患者、またはいかなる転移も示さなかった患者については、治療後直後または転移前に採取したサンプルを、その後のサンプルに対して比較するスタンダードとして使用して、同患者が腫瘍を再発または転移したかどうかを決定することができる。というのはいかなる癌マーカーレベルの変異も再発または転移を示唆できるからである。
【００６５】
“癌の疑われる被験者”という用語は、緩解期が終了に向かっていると疑われるまたはモニターされる癌の緩解期の被験者を含め、被験者が癌に伴う１つまたはそれ以上の症状を示していた、または本発明の方法の検査サンプルとして使用した検査サンプルを採取した時点で既に癌であると診断された、ことを意味するものと理解されるだろう。
【００６６】
当明細書で使用する場合“健常な被験者”という用語は、コントロールサンプルを採取した時に癌に伴ういかなる症状も示していなかった被験者、またはコントロールサンプルを採取した時に癌に伴う症状から緩解している被験者、または血液分画を採取した時点で血液もしくは血清もしくはその他の体液中に、過去に診断された腫瘍のいかなる転移も示していなかった被験者を意味するものとする。したがって“健常な被験者”は癌の疑われる被験者と区別する必要はない。例えば患者個人、例えば癌を発症するリスクのある人が、別な時に体液のサンプルを提供することができ、その場合何らかの症状の発症前に採取した初期のサンプルを、その後に検査するサンプルに対するコントロールサンプルとして使用することができる。あるいは、緩解期または治療後の被験者から採取した体液のサンプルを、それ以前または以後に採取した同じ被験者のサンプルに対するコントロールとして、例えば同疾患の進行をモニターすることができる。
【００６７】
“コントロールサンプル”により、検査サンプルとの比較を行う、特定の完全な物質(integer)の公知の組成物または内容物を有するサンプルを意味する。コントロールサンプルの素材に必要なのは、同サンプルが疾患の状態と一致すると検出される一定レベルの癌マーカーを含んでいないことだけである。
【００６８】
当明細書で述べたアッセイに使用する検査サンプルまたはコントロールサンプルは、癌の疑われる被験者または健常な被験者からのあらゆる体液のサンプル、例えば特に血液分画、血清分画、尿、唾液、粘液、精液、または涙とすることができる。特に好ましい態様においてコントロールサンプルまたは検査サンプルは、血液分画、好ましくは血清分画である。
【００６９】
当明細書で使用する場合“血液分画”はあらゆる血液由来物質を意味し、血液の上清または沈殿物、血清分画または血漿分画、白血球層、Ｔ細胞が濃縮された分画、血小板が濃縮された分画、血小板および赤血球が濃縮された分画、好塩基球が濃縮された分画、好酸球が濃縮された分画、リンパ球が濃縮された分画、単球が濃縮された分画、好中球が濃縮された分画、または血液のあらゆる他の血液成分を添加したかどうかにかかわらず、部分的に精製したまたは精製したあらゆる血液成分を含むものとする。血液分画は、例えば血液の沈殿処理により（例えば低温、酸、塩基、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等）、またはクロマトグラフィー（例えばサイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、質量分析法、等）による分画化により得ることができる。
【００７０】
本内容において“血清分画”という用語は、血清由来のサンプルを意味する。典型的な血清分画は血漿タンパク質分画（例えばアルブミン分画、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）分画、血清グロブリン分画、第Ｖ因子分画、第ＶＩＩＩ因子分画、もしくは第ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ因子を含むプロトロンビン複合体分画）、血漿の凍結上清もしくは凍結沈殿、新鮮凍結血漿の凍結上清もしくは凍結沈殿、血漿分画の凍結上清もしくは凍結沈殿、または他の血清成分を添加したかどうかにかかわらず、部分的に精製したもしくは精製したあらゆる血清成分を含む。血清分画は、例えば血清の沈殿処理により（例えば低温、酸、塩基、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等）、またはクロマトグラフィー（例えばサイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、質量分析法、等）による分画化により得ることができる。
本発明の方法は体液のサンプルで行うため、簡便に行うことができ非侵襲的である。
【００７１】
使用する分析技術に依存して、体液のサンプルは当業者に公知の標準的な方法により、または不適切な実験をせずに当明細書に記載した方法に従って、調製することができる。本発明は、当明細書で述べた診断アッセイにかけるサンプルの調整および取り扱いを明確に包含する。
【００７２】
“健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること”により、本発明の分子の癌マーカーまたは誘導体の量または濃度を、コントロールサンプルおよび検査サンプルとの間で比較することを意味する。この比較は、例えば質量分析法を使用して、２つのサンプル中の癌マーカーの相対量を最も多量のピークのパーセントとして分析することで、容易に行うことができる。例えばサンプルの質量分析の条件を調整して、特定の分子種のピークの高さまたは特定のピークの面積が、サンプル中の同分子種の量に確実に比例するようにすることができる。したがって集められたピークのサンプルのアッセイをさらに行って、その中の分子種の量を決定することは、厳密には必要ない、というのは２つのサンプルのスペクトルが重なっているので、ピークの高さの差を決定することができるからである。その代わりに、または癌マーカーの相対的なレベルを決定することに加えて、ピークの高さを積分することにより、または癌マーカーに対応するピークのさらなる生化学的アッセイまたはイムノアッセイにより癌マーカーの絶対的な濃度を決定することができる。しかし定量には、粗のサンプルの調製物のままで行うことが好ましい。
【００７３】
本発明は、検査サンプルまたはコントロールサンプルのいずれかにおける、本発明の癌マーカーの量、および/または前記サンプル中の癌マーカーの相対量を決定するステップを明確に含む。このことは、あらゆる血液分画または血清分画の由来する血液または血清中の、癌マーカーの量または相対量を決定することを含む。標準的なアッセイ、例えばピーク分画の免疫化学的分析をこの目的に使用することができる。
【００７４】
好ましくは本発明のこの側面は、体液サンプル、またはそれに由来するあらゆる中間体の分画（例えばグリカン、糖脂質および糖質の粗混合物の沈殿）を得る最初のステップをさらに含む。
【００７５】
好ましくは本発明の本側面に従っての方法は、癌マーカーまたは誘導体のさらなる特徴づけを行うこと、特にその質量/電荷比、および/または分子の質量および/または構造によりその同定を立証することを含む。先の考察から明らかなように、これらの特性は当該技術分野で認められている方法を用いて容易に決定できる。特に好ましい態様において、本発明の糖質を含む分子の質量/電荷比、またはそのポストソース分解のイオン化フラグメントの１つまたはそれ以上の質量/電荷比、またはポストソース分解のイオン化フラグメントの特性を決定して、例えば校正されたマーカーに対しての質量分析により、質量/電荷比の算出値の最大エラー±５、より好ましくは±４、さらにより好ましくは±３、まだより好ましくは±２、そしてさらになおより好ましくは±１で、同癌マーカーとの同定を立証する。
【００７６】
本発明の癌マーカーの免疫学的アッセイのため、癌マーカーに対して、より好ましくは精製した分子またはその誘導体、例えば質量分析からの分画に対してモノクローナル抗体を作成し、次に続いての癌の診断用の標準的なイムノアッセイの技術に使用する。
【００７７】
モノクローナル抗体を作製するため、マウスまたは他の動物に低投与量のシクロホスファミド（１５ｍｇ/Ｋｇヒト以外の哺乳類の体重）を注射して前処置し、そのサプレッサー細胞の活性を低下させ、次に短い間隔（すなわち３-４日および１週間の間）で糖質を含む分子の様々な投与量での免疫感作を行う。グリコホスホイノシトール部分の効果により、糖質を含む分子をリポソーム内に導入することができ、これを続いての動物の免疫感作に使用する（本質的にはＵＳＳＮ５，８１７，５１３に記載されている）。免疫感作は、標準的な内容にしたがって皮下、静脈内、または腹腔への注射により行う。免疫感作期間前および免疫感作期間中に、抗原として使用する糖質を含む分子に対して産生される抗体価を、抗原抗体反応を検出するための公知のいずれかのイムノアッセイ法によりモニターするため、動物から血液、血清サンプルを採取する。一般に短い間隔でのリポソーム製剤の約５−９回投与の蓄積で、糖質を含む分子への抗体反応が促進される。糖質を含む分子に対して血清抗体価をもつマウスには、抗体産生細胞を獲得するまでの約３日間、リポソーム製剤による新たな免疫感作を行い、その後抗体産生細胞、好ましくは脾臓細胞を単離する。これらの細胞を骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体を作製する標準的な方法に従ってハイブリドーマを作製する。次にハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体の力価をイムノアッセイ法により調べる。
【００７８】
好ましくはイムノエンザイムアッセイを行うが、この場合ハイブリドーマ上清を検査サンプルの含む抗原と結合させ、次にモノクローナル抗体と結合する抗体をラベルした第２の酵素を用いて抗原―抗体結合を検出する。一度所望のハイブリドーマを選択し、例えば限界希釈法によりサブクローニングすれば、得られたモノクローナル抗体を適当な培地で、適当な期間、in vitroで増殖し、その後上清から所望の抗体を回収することができる。培地の選択および適当な培養時間は当業者に公知であり、容易に決定することができる。
【００７９】
もうひとつの製造法として、同系のマウスへのハイブリドーマの注射を含む。これらの条件下では、ハイブリドーマは非固形腫瘍の形成の原因となり、このことから同マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）中に所望の抗体が高濃度で産生されることになる。
【００８０】
次に標準的なイムノアッセイを用いて、検査サンプルおよび/またはコントロールサンプル中の糖質を含む分子の存在をアッセイする。
本発明の第３の側面として、本発明の糖質を含む分子、またはその糖質部分、脂質部分、またはタンパク質部分との交差反応性のあるモノクローナル抗体を、明確に意図する。
【００８１】
本発明の第４の側面として、ヒトおよびその他の哺乳類の被験者における癌の検出用の診断キットを意図するが、該キットは校正用スタンダードとしての使用に適する、一定量の単離された本発明の糖質を含む分子、および使用に適する１つまたはそれ以上のバッファーを含むものとする。
【００８２】
“校正用スタンダード”により、規定された完全な物質の量および/または前記の完全な物質の１つまたはそれ以上の物理学的特性を決定する手助けとなる参照サンプルであることを意味する。一般に校正用スタンダードは、不純物に起因する疑わしい結果を最小とするため、単離した形とする。したがって当明細書で述べた診断アッセイのコントロールサンプルは、校正用スタンダードとなり得る。
【００８３】
バッファーは、免疫学的方法、質量分析法、または他の検出法による続いてのアッセイ用に、校正用スタンダードまたはコントロールサンプル、および/または検査サンプルを懸濁するのに適する、いかなるバッファーとすることもできる。あるいは、または加えてバッファーは、本発明の糖質を含む分子の免疫検出アッセイの間の抗体抗原結合反応を行うために適するいかなるバッファーでもよい。
【００８４】
代わりの態様において、本発明はヒトまたは他の哺乳類の被験者における癌の検出用の診断キットを意図するが、該キットは単離された本発明の糖質を含む分子に特異的に結合する一定量の抗体、および使用に適する１つまたはそれ以上のバッファーを含むものとする。
【００８５】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
さらなる代わりの態様において、本発明はヒトまたは他の哺乳類の被験者における癌の検出用の診断キットを意図するが、該キットは校正用スタンダードとしての使用に適する、一定量の単離された本発明の糖質を含む分子、単離された糖質を含む分子に特異的に結合する抗体、および使用に適する１つまたはそれ以上のバッファーを含むものとする。
【００８６】
先の態様のいずれか１つまたはそれ以上によるキットは、好ましくは使用の指示書を添付する。これらのキットの使用は、本明細書で提供した記述に基づいて、当業者に理解されるだろう。
【００８７】
以下に示した非限定的実施例は、単離された本発明の糖質を含む分子、ならびにヒトおよび他の哺乳類における様々な癌の範囲の検出におけるその使用について、さらに述べることを意図するものである。
【実施例】
【００８８】
実施例１：腫瘍を有する動物およびヒトの血液からの、糖質を含むｍ/ｚ９９１のイオンの消失
（材料および方法）
１．腫瘍モデル
ラット：ラットは高度転移性ラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴ（Parish et al., Int. J. Cancer 40, 511-518, 1987）を有するメスのFischer３４４ラットとした。腫瘍細胞は先に述べたようにin vitroで維持した（Parish et al., Int. J. Cancer 40, 511-518, 1987）。ラットに腫瘍を誘発するため、動物（１０−１３週齢）に１０6１３７６２ＭＡＴ細胞を皮下注射し、約１３日後に腫瘍（直径１５−１７ｍｍ）を認めた。
マウス：高度の悪性および転移性のＢ１６Ｆ１黒色腫細胞株を、メスのＣ５７ＢＬ/６マウスに皮下注射し（細胞数１０6個/マウス）、約１５日後に腫瘍（直径１２−１４ｍｍ）を認めた。
ヒト：結腸癌と診断された被験者を使用し、クエン酸塩加血漿を採取した。
２．血清および血漿のサンプル
血液は、抗凝固剤（クエン酸−リン酸−デキストラーゼ）を加えてまたは加えずに、健常なヒトの被験者および結腸癌の被験者、または健常なマウスなおよび腫瘍のあるＣ５７ＢＬ/６マウス、または健常なラットおよび腫瘍のあるFischer３４４ラットから、採取した。採血後、抗凝固剤を加えていない血液を３７℃で３０分間インキュベーションし、４℃でオーバーナイト保存した後、血清を集めた。血漿サンプルは抗凝固剤を加えた血液を遠心（４０００ｘｇ、１２分）して得た。
【００８９】
３．血清分画−硫酸アンモニウム / ピリジン法
血清または血漿（２−３ｍｌ）を塩酸（ＨＣｌ）で酸性にした（ｐＨ５．５からｐＨ５．８）。血清を等量の過飽和硫酸アンモニウムと共に３時間、４℃で撹拌することにより、一部のタンパク質が沈殿した。混合液を１０，０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心し、上清を集めた。粉末の硫酸アンモニウムを９０−９５％飽和となるように加えることにより、さらに脱タンパク質を行い、その後４℃でオーバーナイト撹拌した。混合液を１０，０００ｘｇで１時間、４℃で遠心し、上清を集めた。次に４℃で継続的に撹拌しながら、上清にアセトニトリル（４倍量）を加えた。混合液を５分間静置し、アセトニトリル層をデカントして集めた。残りの混合液を１５００ｘｇで５分間遠心し、残っているアセトニトリル層を集めた。アセトニトリル分画を合わせて、溶媒を蒸発させた。残渣をクロロホルム/メタノール/水（ＣＭＷ；２/４３/５５；１ｍｌ）に再度懸濁し、予め平衡にしておいたＣ18Seppakカートリッジ（Waters, Taunton, MA）に２回かけた。溶出液（吸着されなかった分画）を集めた。容器をＣＭＷ（１ｍｌ）で洗浄し、洗浄液をカートリッジに通した。溶出液を吸着されなかった分画と共に集めた。次にカートリッジを各２ｍｌの水、メタノール/水、メタノール、クロロホルム/メタノール、およびクロロホルムで順次溶出させた。すべての分画を別々に集めた。分画を真空下で乾燥させた（SpeedVac）。吸着されなかった分画および水の分画を最小量の水に再度懸濁させ、１ｋＤａ分子量カットの透析膜にて水に十分に透析した。透析内液を真空下（SpeedVac）で乾燥させた。分画を適切な溶媒１０μｌに再度溶解し、以下に述べるようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【００９０】
４．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
質量分析用のサンプルを調製するため、分画を真空下で乾燥させた。流出分画およびメタノール/水分画を水（２００μｌ）に溶かし、１ｋＤａ分子量カットの透析膜にて水に十分に透析し、蒸発乾燥させた。すべての分画を質量分析計内への設置に適する溶媒１０μｌに再度溶解させた。
上述のように調製した分画（１μｌ）を、マトリックス溶液[メタノール中の２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）３．５ｍｇ/ｍｌ溶液、２μｌ]と共にボルテックスで混合した。混合液（１μｌ）を９６穴サンプルプレートに載せ、室温で乾燥させた。次にサンプルプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（TofSpeco-2e; Micromass, Manchester, UK または Voyager Elite-DE; BioPerceptive）にセットした。イオン化には窒素レーザー（３３７ｎｍ）を使用し、分析は線形型または反射型の負イオンモードで行った。ポストソース分解（ＰＳＤ）のフラグメント化を当該イオンを含むサンプルの一部について行った。データは、各ピークの質量電荷比を示すｍ/ｚ比の特性として、サンプル中に検出された最も多量の分子種のピークの高さのパーセントとして表示したピークの高さにより表した。
【００９１】
（結果）
健常なラット、マウスまたはヒトの血清からの流出分画（すなわちＣ18Seppakカラムに吸着しなかった分画）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析の際、約９９１のｍ/ｚ比を有する非常に顕著な負イオン種を含むことを発見した（図１Ａ，２Ａおよび３Ａ）。この負イオンは腫瘍のあるラットの血清（図１Ｂ）、腫瘍のあるマウスの血清(図２Ｂ)、および結腸癌の患者の血漿（図３Ｂ）からは認められなかった。
【００９２】
ｍ/ｚ９９１イオンのポストソース分解は、検査した３種のすべてにおいて本質的に等しく（図４Ａ，図４Ｂ，および図４Ｃ）、この分子がラット、マウスおよびヒトにおいて同一であることを示唆している。
【００９３】
さらなる研究は、１０6Ｂ１６黒色腫細胞の皮下注射後わずか２日で、ｍ/ｚ９９１イオンがマウスの血清に認められなくなることを明らかにした。この時点ではマウスには明白な腫瘍は存在しておらず、このことはさらに、癌の早期診断でのこの癌マーカーの使用の可能性を示している。
【００９４】
本発明は、特定の好ましい態様および実施例を参照して述べてきたが、一般的な原則および本発明の精神を保持している上での、本発明のバリエーションおよび修飾もまた、当明細書に包含されることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１Ａは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される未処理のラットの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は腺癌の被験者では減少する（図１Ｂ）顕著な負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【００９６】
図１Ｂは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される腫瘍のラットの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。腫瘍のラットは、高度な悪性および転移性のラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴの皮下注射（細胞数１０6個/ラット）後１３日にアッセイを行った。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は未処理のラットのスペクトルでは顕著な（図１Ａ）負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【図２】図２Ａは、溶出液としてメタノールを用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される正常な未処理のラットの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は腫瘍のマウスでは減少する（図２Ｂ）顕著な負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【００９７】
図２Ｂは、溶出液としてメタノールを用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される腫瘍マウスの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。腫瘍のマウスは、高度な悪性および転移性のＢ１６Ｆ１黒色腫の皮下注射（細胞数１０6個/ラット）後１５日にアッセイを行った。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は未処理のマウスのスペクトルでは顕著な（図２Ａ）負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【図３】図３Ａは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される正常な未処理のヒトの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は結腸癌の患者では減少する（図３Ｂ）顕著な負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【００９８】
図３Ｂは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される結腸癌の患者の血漿分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は未処理の正常なヒトの被験者のスペクトルでは顕著な（図３Ａ）負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【図４】図４Ａは、ポストソース分解のフラグメント化に基づいてのマトリックス支援レーザー脱離イオン−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて得られた、正常な未処理のマウスの血清からの負イオン（ｍ/ｚ９９１）のフラグメント（図１Ａ）の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は各フラグメントの量を示す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。ｍ/ｚ比を有する主なフラグメントは、図の右から左へ２４１、６４４、７０５、７４９および９４７である。分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオン種の位置もまた、スペクトルの右端に示す。ｍ/ｚ２４１イオンフラグメントは、ヘキソースリン酸部分、例えばイノシトールリン酸、またはヘキソース硫酸と一致する。
【００９９】
図４Ｂは、ポストソース分解のフラグメント化に基づいてのマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて得られた、正常な未処理のラットの血清からの負イオン（ｍ/ｚ９９１）のフラグメント（図２Ａ）の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は各フラグメントの量を示す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。ｍ/ｚ比を有する主なフラグメントは、図の右から左へ２４１、６４４、７０５、７４９および９４７である。分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオン種の位置もまた、スペクトルの右端に示す。ｍ/ｚ２４１イオンフラグメントは、ヘキソースリン酸部分、例えばイノシトールリン酸、またはヘキソース硫酸と一致する。バックグラウンドが高いのは、サンプル中の分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオンの量が少ないことに主に起因すると思われる。
【０１００】
図４Ｃは、ポストソース分解のフラグメント化に基づいてのマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて得られた、健常なヒトの血清からの負イオン（ｍ/ｚ９９１）のフラグメント（図２Ａ）の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は各フラグメントの量を示す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。ｍ/ｚ比を有する主なフラグメントは、図の右から左へ２４１、６４４、７０５、７４９および９４７である。分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオン種の位置もまた、スペクトルの右端に示す。ｍ/ｚ２４１イオンフラグメントは、ヘキソースリン酸部分、例えばイノシトールリン酸、またはヘキソース硫酸と一致する。
【０００１】
本発明はヒトおよびヒト以外の哺乳類の被験者における癌の診断用の新規癌マーカー、特に約９９１の質量/電荷（ｍ/ｚ）比の負に荷電した分子を含む癌マーカーに関する。当明細書で述べる癌マーカーを使用して、例えば体液のような、被験者からの生物学的サンプル中の１つまたはそれ以上の癌細胞または腫瘍の存在を、該癌マーカーのレベルの低下について該被験者の生物学的サンプルをアッセイすることにより決定することができる。
【背景技術】
【０００２】
医学的研究における数々の進歩にもかかわらず、癌は依然として世界レベルでの主要な死亡原因であり、外科的切除、放射線治療、化学的治療、または他の公知の治療法による適当な医療行為を促進するために、迅速で簡単な癌の早期診断法が必要とされている。癌の良い診断法が利用できることはまた、治療に対する患者の反応を評価するために、あるいは原発部位での再成長または転移による再発を評価するためにも重要である。
【０００３】
癌マーカー、例えば腫瘍遺伝子産生物、成長因子および成長因子受容体、脈管形成因子、プロテアーゼ、癒着因子、および腫瘍サプレッサー遺伝子産生物等の特徴を明らかにすることで、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌のリスク、存在、状態、または今後の動向に関する重要な情報を提供することができる。１つまたはそれ以上の癌マーカーの存在または発現または活性をレベル決定することは、例えば悪性の異常を良性の異常から識別することにより、不確定な臨床的異常を伴う患者を区別する診断の一助とすることができる。さらに悪性が明らかになった患者において、癌マーカーは今後の再発のリスクまたは選択された治療コースに対する特定の患者の反応の可能性を予測するために有用となり得る。特異的な薬剤または任意の治療に対する患者の反応性を予測することのできる、高度に特異的な癌マーカーを分析することにより、またはマーカーを組み合わせることにより、さらに特異的な情報を得ることができる。
【０００４】
糖鎖付加の異常はほとんどのタイプの癌に共通する特徴であり、セリン/スレオニンに結合したグリカン（すなわちＯ−グリカン）のレベルの劇的な変化が癌患者に起こり得ることは、よく知られている。“Ｏ−グリカン”は、未完成タンパク質のセリン残基および/またはスレオニン残基にＮアセチルガラクトサミンが付加した糖タンパク質である。癌患者は例えば、普通のＯ−グリカンのコア構造のレベルが低下し、シアル酸化されたグリカンもしくはガングリオシドのレベルが増加し、またはシアル酸に対する修飾が減少する可能性がある。Ｏ−グリカンの特異的なペプチド部分の合成もまた癌患者では変化する可能性があり、糖タンパク質のペプチド部分がＯ−グリカンの合成を部分的に指示しているために、ペプチド部分の変化によりＯ−グリカンのレベルが変異することになる。あるいは癌患者ではシアル酸転移酵素活性が亢進し、それにより過度にシアル酸化されたＯ−グリカンが産生される。
【０００５】
一般に腫瘍特異的な抗原は高分子量または高質量の分子（＞１０，０００Ｄａ）であるが、これらは癌細胞で特異的に発現されるか、または正常細胞に比して癌細胞では高レベルで発現されるかのいずれかである。しかし低分子量（＜１０，０００Ｄａ）の腫瘍特異的な抗原もあり、これらはしばしば糖脂質、さらに特にスフィンゴ脂質であり、これらはポリラクトサミン構造を含む。“糖脂質”は単に１つまたはそれ以上の糖質部分を有する脂質分子または脂肪酸分子である。
【０００６】
“スフィンゴ脂質”は脂肪酸残基、極性の末端基、およびスフィンゴシン（４−スフィンゲニン）または関連する塩基を含む脂質であり、セラミドおよびその誘導体であるスフィンゴミエリン（すなわちヒドロキシル基上にホスホコリン部分を含むセラミド）、またはガングリオシドを含むスフィンゴ糖脂質（すなわちヒドロキシル基上に糖質部分を含むセラミド）を含む。
【０００７】
“ガングリオシド”はシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質（すなわちスフィンゴシンで置換された脂肪酸が、Ｄグルコース、Ｄガラクトース、Ｎアセチルガラクトサミンおよび/またはＮアセチルノイラミン酸を含むオリゴ糖に結合している糖脂質）であり、大多数の哺乳類の細胞膜で発現される。ガングリオシドはシアル酸を伴う糖鎖付加の程度に依存して、モノ−、ジ−、トリ−、またはポリ−シアロガングリオシドがある。標準的な用語に従って“ＧＭｎ”“ＧＤｎ”“ＧＴｎ”という用語を用いるが、ここで “Ｇ”はガングリオシドを示し、“Ｍ”はモノシアリルガングリオシドを示し、“Ｄ”はジシアリルガングリオシドを示し、“Ｔ”はトリシアリルガングリオシドを示す；そしてここで“ｎ”は少なくとも１を意味する数字、または少なくとも１ａ（例えば１ａ、１ｂ、１ｃ等）を意味する英数字であり、分子に認められる結合パターンを示す[Lehninger, In: Biochemistry（生化学）、 pp. 294-296(Worth Publishses, 1981); Wiegandt, In: Glycolipids（糖脂質）: New Comprehensive Biochemistry（新たな総合的生化学）, pp. 199-260(Neuberger et al.著, Elsevier, 1985 )]。
【０００８】
ポリラクトサミンは、通常そのポリラクトサミンのユニット構造により２つの種類、特にガラクトシル−（∃１−３，）Ｎ−アセチルグルコサミンを含むタイプ１のポリラクトサミン、あるいはガラクトシル−（∃１−４）Ｎ−アセチルグルコサミンを含むタイプ２のポリラクトサミン、に分類される。
【０００９】
ガングリオシド、例えばＧＭ２（Livingston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2911-2915, 1987）、ＧＤ２（Schulz, et al., Cancer Res. 44, 5914-5920, 1984）、またはＧＤ３（Cheresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5767-5771, 1984; Reisfeld et al., In: Immunity to Cancer（癌に対する免疫）(M. S. Mitchell著),pp69-84, 1985）は、神経外胚葉由来の様々な腫瘍、例えば悪性黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、軟組織肉腫および肺小細胞癌の、顕著な細胞表面の構成要素として同定された。これらのガングリオシドはほとんどの正常な組織には存在しないか、存在しても低レベルに過ぎない。腫瘍特異的な抗原としてのガングリオシドの役割もまた、例えば以下の文献Ritter and Livingston, et al., Sem. Canc. Biol. 2, 401-409, 1991; Chatterjee et al., USSN 5, 977, 316, 1999年11月2日発行; Hakomori, Cancer Res. 45, 2405-2414, 1985; Miraldi In: Seminars in Nuclear Medicine（核医学におけるセミナー） XIX, 282-294, 1989; およびHamilton et al., Int. J. Cancer 53, 1-8, 1993で考察されている。
【００１０】
主な癌に見出される腫瘍に関連する共通の抗原は、タイプ２の糖鎖のポリラクトサミン構造、あるいはフコース化した形を含むガングリオシドである。例えばガングリオシドのシアルルイスＡおよびシアリルルイスＸは血管内皮細胞への癌細胞の接着に関与し、癌の血行性転移に寄与する。シアリルルイスＡは、結腸、膵臓および胆管の癌でしばしば発現され、一方シアリルルイスＸは乳房、肺、肝臓および卵巣の癌で共通して発現される。癌細胞表面でのシアリルルイスＡまたはシアリルルイスＸのリガンドの糖質の発現の程度は、癌の患者の血行性転移頻度および予後の結果とよく相関する。
【００１１】
他方、タイプ１のポリラクトサミン構造を含むガングリオシド、例えば２−３シアリルルイスＡは、正常な細胞および組織に豊富に存在するが、癌にも関与する。Leveryら（USSN 6.083,929, 2000年7月2日発行）は、シアリル残基および/またはフコシル残基を伴う場合も伴わない場合も、ラクト系のタイプ１の糖鎖の伸長した形が、癌組織中に存在することを示している。Leveryら（同書）は、結腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５の糖脂質分画から単離されたアイソフォームが、以下のスフィンゴ糖脂質ユニット：すなわちホモダイマーのルイスＡ、ヘテロダイマーのルイスＢ−ルイスＡ、および伸長したシアリルルイスＡ−ルイスＡ（後者は腫瘍に関連するスフィンゴ糖脂質および腫瘍マーカーの可能性があるものとして示唆されている）を含むことを示した。
【００１２】
しかし癌の検出に関するシアル酸化された抗原の同定における進歩にもかかわらず、癌の診断および特異的な癌のタイプの検出の手助けとなる癌マーカーは、依然として明らかに必要とされている。特に癌において糖鎖の乱れが観察されているにもかかわらず、公知のガンマーカーはほとんどなく、あるとしても必ずしもシアル酸化化合物またはＯ結合型糖タンパク質ではない、および/または腫瘍特異的な抗原ではない癌マーカーに過ぎない。
【００１３】
癌マーカーの好ましい特徴は、迅速なまたはハイスループットの分析方法、例えば質量分析法、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−質量分析法を用いて、検出が十分に容易にできることである。
【００１４】
さらに適切な癌マーカーは、体液（例えば血液、血清、尿、粘液、唾液、汗、涙、または他の分泌液）での検出が容易にできることが望ましく、それによりルーチーン検査用の非侵襲的アッセイの使用を促進することができる。
【発明の開示】
【００１５】
（発明の概要）
本発明に至るまでの研究において、ヒトおよびヒト以外の哺乳類の被験者の体液中の高分子量/質量および低分子量/質量の双方の癌マーカーを同定し、体液中のこのような癌マーカーのレベルの低下に関与する悪性腫瘍を検出するための、関連するハイスループットの診断法を開発することを追求してきた。その際、このような診断は分子のプローブ、例えば抗体または核酸プローブの単離に依存することなく、および/またはこのような分子プローブを用いた時間のかかる結合ステップを必要としないものとした。
【００１６】
したがって本発明の第一の側面として、健常な被験者に比して癌の被験者では低レベルで存在する、約９９１のｍ/ｚ比の負に荷電した分子、または負に荷電した該分子の誘導体を含む癌マーカーを提供する。
【００１７】
本発明の第２の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌の診断または検出する、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、または健常な被験者として定められたレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際健常な被験者のレベルまたは健常な被験者として定められたレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が、癌を示すものとする。
【００１８】
本発明の第３の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌を診断または検出する、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）検査サンプルに添加した内部標準のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際内部標準のレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が癌を示すものとする。
【００１９】
本発明の第４の側面として、癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；同検査サンプル中のもうひとつのマーカーのレベルと相対して、その際もうひとつのマーカーに対しての癌マーカーの比率の変化が癌を示すものとすること、を含むヒトまたはヒト以外の被験者における癌を診断または検出する方法を提供する。
【００２０】
本発明の第５の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌の治療をモニターする、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌の治療を行っている被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、健常な被験者として定められたレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際レベルの増加が治療の成功を示すものとする。
【００２１】
本発明の第６の側面として、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における治療成功後の癌の再発を診断する、以下を含む方法を提供する：
（ｉ）癌の治療を行った被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含むものとする；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、健常な被験者として定められたレベル、または癌の治療に成功した後の被験者からのサンプル中のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際レベルの低下が癌の再発を示すものとする。
【００２２】
（定義）
本明細書を通して本文中に他の要求がなければ、“含む(comprise)”という言葉、またはそのバリエーション、例えば “含む(comprises)”または“含んでいる(comprising)”という言葉は、他のいかなる段階もしくは要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群も除外されていなければ、規定された段階もしくは要素もしくは整数、または段階もしくは要素もしくは整数の群を、包含することを意味すると理解されるだろう。
【００２３】
当業者は、当明細書に記述した本発明は、限定的に述べたもの以外にバリエーションおよび修飾を認めることを理解するだろう。本発明はこのようなバリエーションおよび修飾のすべてを含むものと理解されなければならない。本発明はまた、本明細書で述べたまたは示したすべての段階、特徴、組成物および化合物を個別にまたは集合的に含み、したがって前記の段階、特徴、組成物および化合物のいずれかのおよびすべての組み合わせ、またはいずれか２つまたはそれ以上を含む。
【００２４】
本発明は当明細書で述べた限定的な態様により範囲を限定するものではなく、これらの態様は単に例示する目的で意図しているに過ぎない。機能的に均等な産生物、組成物および方法は、当明細書で述べたように、明確に本発明の範疇に含まれる。
【００２５】
本明細書におけるあらゆる先行技術の（複数の）公開公報に対する参照は、単に本発明をさらに説明する目的で行っており、該（複数の）公開公報がオーストラリアまたは他の地域の当業者の共通の一般知識の一部となっていることを指示または承認するものとして取り上げているのではない。
【００２６】
本明細書で使用する場合“〜からの”“〜の”という単語、および“由来の”という用語は限定された産生物、特に例えばポリペプチド、タンパク質、遺伝子、もしくは核酸分子のような分子、抗体分子、Ｉｇ分画、またはその他の分子、または前記分子を含む生物学的サンプルを、特定の素材、有機体、組織、器官または細胞から必ずしも直接でなくてもよいが、その素材、有機体、組織、器官または細胞から得ることができることを示すものとする。
【００２７】
当明細書で使用する場合 “癌”は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の体またはその一部を通して、例えばリンパ系および/または血流を介して侵襲的成長および転移ができるものを含む、広範囲の良性腫瘍または悪性腫瘍のいずれか１つまたはそれ以上を意味するものとする。本発明では悪性腫瘍および固形癌の診断または検出を特に定めているのではあるが、当明細書で使用する場合“腫瘍”という用語は、良性腫瘍および悪性腫瘍の双方または固形の成長を含む。典型的な癌として、癌腫、リンパ腫または肉腫、例えば卵巣癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、尿路の癌、子宮癌、急性リンパ性白血病、ホジキンス病、黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、および軟組織の肉腫を含むが、これに限定されない。
【００２８】
本発明の内容において当明細書に記述し請求項により定義する場合、“癌マーカー”という用語は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者からの生物学的サンプル、例えば体液（血液、尿、粘液、唾液、汗、涙、または他の分泌液）において検出可能なあらゆる分子、そして被験者の癌を示すあらゆる分子、限定的には健常な被験者の体液中のレベルに比して癌の被験者の体液中ではそのレベルが低下する分子を意味するものとする。“癌マーカー”という用語はまた、正常な細胞によりもしくは正常な細胞で発現するが癌細胞では発現しない、または正常な細胞に比して癌細胞によりもしくは癌細胞ではその発現が低下する分子を含むものとする。
【００２９】
“負に荷電した分子”という用語は本発明の内容において、“負に荷電した糖質を含む分子”または“糖質を含む分子”という用語と互換性を持って使用し、同マーカーがその分子の一部として実際に糖質を含んでいるか否かにかかわらず、約９９１のｍ/ｚ比を有する本発明の癌マーカーをいう。この用語はまたその範囲に、同分子の誘導体、例えばリン酸または硫酸を含む誘導体も含む。
【００３０】
同分子が糖質を含む場合、好ましくは単糖、二糖、またはオリゴ糖（すなわち少なくとも３つおよび約９つ以下の単糖ユニット）を含む。
（好ましい態様の詳細な説明）
本発明の１つの側面として、健常な被験者に比して癌の被験者では低レベルで存在する、約９９１のｍ/ｚ比の負に荷電した分子、または前記の負に荷電した分子の誘導体を含む癌マーカーを提供する。
【００３１】
好ましくは本発明の負に荷電した分子は単離した形で提供する。“単離した”により、例えば当明細書で定義した条件下で質量分析法により決定される、同種の糖脂質、二糖、単糖、またはオリゴ糖から実質的に遊離していることを意味する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの高度の分離度により、ｍ/ｚ９９１のイオン分子種のポストソース分解のイオン化フラグメントの質量分析の特性が同分子の“フィンガープリント”に対応することは、当業者に理解されるだろう。
【００３２】
好ましくは糖質部分は、存在する場合にはヘキソースリン酸またはヘキソース硫酸を含む。この点に関してポストソース分解のフラグメント化のデータは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでの算出の場合、単離された負に荷電した分子がヘキソースリン酸、例えばホスファチジルイノシトール（すなわちイノシトールー１，２サイクリックリン酸）に特徴付けられる、約２４１のｍ/ｚ比を有するフラグメントを生成することを明らかにした。
【００３３】
さらにより好ましくは、糖質部分はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を含む。
なおより好ましくは糖質を含む分子は、少なくとも１つのヘキソースリン酸、ホスファチジルイノシトールまたはＧＰＩユニットを含む二糖またはオリゴ糖部分を含む。
【００３４】
また本内容において“負に荷電した糖質を含む分子”という用語、または先に述べたその互換性のある用語は、糖質を含む分子が十分に親水性で、疎水性のマトリックス、特にＣ−１８マトリックスとは強く結合せず、好ましくは１つまたはそれ以上のリン原子またはイオウ原子を含むことを意味するものとする。この点に関して、質量分析計、特にマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計 (ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ)による本発明の癌マーカーのイオン化では、単離した本発明の癌マーカーが負に荷電したイオンであることを示している。したがって“負に荷電した糖質を含む分子”という用語は、リン脂質、ホスホグリセリド、リン酸を含むＮ結合型糖タンパク質、リン酸を含むＯ結合型糖タンパク質、ホスファチジルイノシトールを含む脂質もしくはタンパク質、またはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を含む脂質もしくはタンパク質、を含む。
【００３５】
当明細書で述べた癌マーカーをその特性を選択して分析を行うと、該癌マーカーの糖質部分はin situで他の官能基と結合できると考えることができる。例えば単糖、二糖、またはオリゴ糖部分はタンパク質性の部分（例えばアミノ酸、ペプチド、またはポリペプチド）とin situでＯ結合またはＮ結合して、糖ペプチド/糖タンパク質を形成することができる、あるいはその代わりにまたはさらに脂質部分、例えば脂肪酸（特にパルミチン酸および/もしくはオレイン酸および/もしくはミリスチン酸および/もしくはアラキドン酸）；トリアシルグリセロール；リン脂質；ホスホグリセリド（例えば特にホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、もしくはホスファチジルエタノールアミン）；スフィンゴ脂質；スフィンゴシン；またはコレステロールホルモンとin situで結合することができる。このようなバリアントはすべて本明細書で述べた内容に含まれる癌マーカーとして使用することができる。したがって本発明は、糖質部分のペプチドバリアントまたは脂質バリアントを明確に包含するが、唯一必要なのはこのようなバリアントがｍ/ｚ９９１のイオン種を含むことだけである。
【００３６】
なおより好ましくは癌マーカーは糖脂質を含み、さらにより好ましくは糖脂質はホスファチジルイノシトール、ならびに１つまたはそれ以上のミリスチン酸、パルミチン酸およびオレイン酸からなる群から選択される１つまたはそれ以上の脂肪酸を含む。当明細書で述べた癌マーカーの脂質部分の構造は、予備実験を行わずに当業者に公知のいくつかの技術、特に高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、衝突活性化法（ＣＡＤ）、タンデム質量分析法（本質的にはLadisch et al., J. Biol. Chem. 264, 12097-12105, 1989 に記載されている）、または特にＰ−ＮＭＲ技術のいずれか１つまたはそれ以上を用いて解明できる。
【００３７】
本発明の本態様は、該糖脂質の誘導体、例えばその検出を促進するためにｍ/ｚ９９１イオンに共有結合させた、蛍光リガンド、酵素のリガンド、放射性リガンド、ペプチドリガンド（例えばＦＬＡＧ）、または抗体のリガンドの１つまたはそれ以上を含む誘導体まで明確に拡大する。
【００３８】
本発明の特に好ましい態様において、癌マーカーは付加的な脂肪酸、例えばパルミチン酸またはオレイン酸により任意にアシル化したミリストイルホスファチジルイノリトール（すなわちジミリストイル−ＰＩ）を含む。本発明の糖質を含む癌マーカーを特徴付けるものとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでの本来の分子に関するｍ/ｚ９９１イオン値、およびポストソース分解のフラグメント化の分析でのｍ/ｚ２４１のピークの出現、の双方に一致するものとする。本発明の本態様は該糖脂質の誘導体、例えばその検出を促進するために同糖脂質に共有結合させた、蛍光リガンド、酵素のリガンド、放射性リガンド、ペプチドリガンド（例えばＦＬＡＧ）、または抗体のリガンドの１つまたはそれ以上を含む誘導体まで明確に拡大する。
【００３９】
本発明の糖質を含む分子の質量および/または質量電荷比または他の物理学的特性は、ゲル濾過、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析法、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣを含む当該技術分野で認められているいずれかの方法、または組成物もしくは構造のデータから化合物の分子質量を予測することにより、決定することができる。好ましくは質量電荷比は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、タンデムＭＳ、エレクトロスプレーＭＳ等を含む質量分析法により決定する。
【００４０】
質量/電荷比またはｍ/ｚ比について、限定された数値に“約”をつけて当明細書で言及する場合、さらに定義していなくても受容可能な変動を含むことを当業者は理解するだろう。好ましくはｍ/ｚ比の算出値は、当明細書で述べたサンプルの質量分析計により決定する場合、受容可能なエラーとしてｍ/ｚ±５、より好ましくはｍ/ｚ±４、さらにより好ましくはｍ/ｚ±３、まだより好ましくはｍ/ｚ±２、そしてさらにまだより好ましくはｍ/ｚ±１を含む。したがって約９９１と算出されたｍ/ｚ比は、９８６−９９６の範囲のｍ/ｚ比、好ましくは９８７−９９５の範囲、より好ましくは９８８−９９４の範囲、さらにより好ましくは９８９−９９３、そしてまだより好ましくは９９０−９９２の範囲を含む約９９１、または９９１に等しいと理解されるだろう。
【００４１】
当明細書で使用する場合“誘導体”という用語は、当明細書で述べた約９９１のｍ/ｚ比のペアレント分子である糖質を含む分子から生成されるあらゆる物質を意味するものとする。
【００４２】
したがって本発明の誘導体は、本発明の糖質を含む分子のフラグメントのいずれかおよびすべて、および癌マーカーとしてのそれらの使用を含み、唯一必要なのは、同フラグメントが癌検出アッセイに関与するペアレント分子の特異性を保持していることだけである。当明細書で提供される開示から明らかになるように（特に図４Ａ，４Ｂおよび４Ｃ）、本発明の糖質を含む分子はポストソース分解のイオン化において、ｍ/ｚが約２４１、約６４４、約７０５、約７４９、約９４７のフラグメントの生成を伴う、特異的な“フィンガープリント”を示す。サンプル中の単糖またはイノシトールリン酸のバックグラウンドが高いと、１つまたはそれ以上の特徴的なフラグメントのピークが覆われることが起こり得る。このような場合には２つのフラグメント、好ましくは３つのフラグメント、より好ましくは４つのフラグメント、そしてより好ましくは５つすべてのフラグメントの存在を、ペアレント分子の特異性を有する癌マーカーとして使用できることを当業者は知っているだろう。
【００４３】
負の糖質を含む分子の好ましい誘導体は、例えば糖鎖生物学の業者に公知の標準的な方法により製造される該分子の糖質部分のフラグメントを含む。このような分析はそれらの検出を促進するための化学的修飾にしばしば依存するため、本発明はまた、過メチル化、過ヨウ素酸酸化、ＮａＢＨ4還元、還元によるアミノ化（例えば２−アミノピリジンを用いて）により製造される、または特にペルフルオロベンジルアミノベンゾエートもしくはアルキルアミノベンゾエートとのインキュベーションにより製造される、本発明のｍ/ｚ９９１の癌マーカーの、化学的に修飾されたいずれかのフラグメントを含むことまで拡大する。誘導体はさらに、先の方法を組み合わせて製造されるいかなる糖質を含む分子も含む。
【００４４】
当業者は本題の癌マーカーの糖質部分の詳細な構造を決定するためのいくつかの公知の方法を知っているだろうが、その場合は誘導体を製造することができる（例えば酵素分解、またはフィンガープリント法の技術、質量分析法、タンデム質量分析法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）―質量分析法、分子モデリング、レクチンアフィニティークロマトグラフィー（特に高速液体アフィニティークロマトグラフィー、以下“レクチン−ＨＰＬＡＣ”とする、と組み合わせて）、逆相法、サイズ排除クロマトグラフィー等）。
【００４５】
糖質全体の組成は、単糖残基の数およびタイプを提供する、またはＮアセチルガラクトサミンもしくはＯグリカンの存在を決定するため、例えば各々還元糖またはメチルグリコシドとして単糖を放出する酸加水分解またはメタリシスにより決定する。次に低圧または高圧下でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および/または液体クロマトグラフィーを使用して、放出された単糖を分離、定量する。ＧＣに関しておよび任意に液体クロマトグラフィーに関しては、単糖は一般に例えばペルメチル化により誘導体化する。パルス電流検出法を用いた高ｐＨの陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ/ＰＡＤ）もまた使用することができる（本質的にはHardy, Methods Enzymol. 179,76-82,1989 に記載されている）。
【００４６】
糖タンパク質の糖質部分を解明するには、より小さな糖質ユニット（単糖、二糖、オリゴ糖）を、例えば化学的方法および/または酵素による方法を用いて放出することが必要である。酵素分解の方法は、放出を達成するために、有効量のペプチドＮグリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８，）または他のエンドグリコシダーゼまたはグリコアミダーゼ（Takahashi, N. and Muramatsu, T.著 (1992) In: CRC Handbook of Endoglycosidases and Glycoamidases（エンドグリコシダーゼおよびグリコアミダーゼのＣＲＣハンドブック）, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL を参照のこと）、またはエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグリコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）またはグリコシダーゼ、例えばEndo HもしくはEndo F（Maley, F. et al., Anal. Biochem. 180, 195-204, 1989 を参照のこと）と共にインキュベーションすることを含む。化学的方法は、無水ヒドラジン、または強アルカリを還元剤と組み合わせて、任意にＮａＢＨ4と組み合わせて、糖質の放出に十分な時間および条件下でインキュベーションすることを含む。
【００４７】
放出された糖質の構造は、例えばエキソグリコシダーゼを用いた配列にそっての分解、位置特異的な化学的分解、メチル化分析（ＧＣ−ＭＳ）、ＦＡＢ−ＭＳ、および/または高磁場プロトンおよび多次元ＮＭＲ法により決定する。生成された糖質を含むフラグメントの分離を促進するため、これらを発色団、蛍光標識、または放射性化学により誘導体化する。パルス電流検出法（ＰＡＤ）を用いて、誘導体化していない糖質の分離を促進することもできる。
【００４８】
糖質を含む分子の複合混合物を分離するためには、分析技術、例えば質量分析法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはこれらを組み合わせた技術、例えばタンデム質量分析法、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−質量分析法が好ましい。たいへん良い総説として以下の文献がある（例えばHonda, Anal. Biochem. 140, 1-47, 1984; Townsend. (1993) In: Chromatography in Biotechnology(バイオテクノロジーにおけるクロマトグラフィー): ACS Symposium Series （ＡＣＳシンポジウムシリーズ）529(Horva'th, C. and Ettre, L. S.著）、American Chemical Society, Washington, D. C; Scott (1992) In:Food Analysis by HPLC （ＨＰＬＣによる食品分析）(L. M. L. Nollet,著)、Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.)；およびLee, Anal. Biochem. 179, 404-412, 1990）。
【００４９】
例えばアミンを結合させたシリカマトリックスを用いた順相ＨＰＬＣは、誘導体化していない糖および放射能標識したアルジトールの分離に有用である（Mellis and Baenziger, Anal. Biochem. 114, 276-280, 1981）。ＯＤＳシリカを用いる逆相法は、誘導体化した糖の分離に有用である（Tomiya et al., Anal. Biochem. 163, 489-499, 1987）。例えばＤＥＡＥ（Pharmacia）またはＭｏｎｏ−Ｑ（Pharmacia）を用いる陰イオン交換法、は、シアル酸化、リン酸化、または硫酸化した糖の分離に有用である（Watson and Bhide, Liq. Chrom/Gas Chrom. 11, 216-220, 1993）。高いｐＨ値での強陰イオン交換体を用いる高圧陰イオン交換クロマトグラフィー法もまた、この点に関して有用である（Townsend and Hardy, Glycobiol. 1, 139-147, 1991）。
【００５０】
固定化レクチンリガンドの認識範囲を利用した一連のレクチンアフィニティークロマトグラフィーは、特にＨＰＬＡＣと組み合わせた場合、多数の糖、例えばガラクトース、フコース、Ｎアセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース、グルコース、またはＮアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の分離に有用である（Cummings et al., Methods Cell Biol. 32, 141-183, 1989;およびVirgilio (1998) In: Lectins, Biology, Biochemistry, Clinical Biochmistry（レクチン、生物学、生化学、臨床医学）, Vol. 12, the 17th Int. Lectin Meeting, Wurzburg, 1997 の会報を含む(van Driessche, E., Beeckmans, S.および Bog-Hansen, T.,著)、Textop publishers, Hellerup, Denmark (ISBN 87-984583-0-2)を参照のこと）。代表的なレクチンとして以下を含む、Canavalia ensiformis（タチナタマネ）コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ガレクチン−Ｉ、Phytolacca americana(ヨウシュヤマゴボウ)ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、P. americana（ヨウシュヤマゴボウ）Ｐａ−２、および以下からのアグルニチンのいずれか１つまたはそれ以上、すなわちAgaricus bisporus（ツクリタケ）（ＡＢＡ−Ｉ）、Aleuria aurantia（ヒイロチャワンンタケ）（ＡＡＡ）、Allomyrina dichotoma（日本カブトムシ）（Ａｌｌｏ−Ａ−Ｉ/ＩＩ）、Arachis hypogea（ラッカセイ）（ＰＮＡ）、Bauhinia purpurea（ムラサキソシンカ）（ＢＰＡ）、Datura stramonium（ヨウシュチョウセンアサガオ）（ＤＳＡ）、Dolichos biflorus（ホースグラム）（ＤＢＡ）、Erythrina cristagalli（アメリカデイゴ）（ＥｃＩＡ）、Erythrina corallodendron（エリスナコラロデンドロン）（ＥｃｏＡ）、Erythrinia variegata（サンデイゴ）（ＥＶＡ）、Galanthus nivalis（スノードロップ）（ＧＮＡ）、Griffonia simplicifolia（グリフォニアシンプリシフォニア）（ＩＡ４またはＧＳＡ−Ａ４；ＩＢ４またはＧＳＡ−Ｂ４；ＩＩまたはＧＳＡ−ＩＩ）、Lens culinaris（レンズマメ）（ＬＣＡ）、Lotus tetragonolobus（ロツス テトレゴロノブス）（ＬＴＡ）、Lycopersicon esculentum（ミニトマト）（ＬＥＡ）、Maakia amurensis（イヌエンジュ）（ＭＡＡ）、Oryza sativa（イネカリ）（ＯＳＡ）、Phaseolus vulgaris（インゲンマメ）（erythroagglutininまたはＥ−ＰＨＡ；白血球凝集素(leukoaggulutinin)またはＬ−ＰＨＡ）、Pisum sativum（エンドウ）（ＰＳＡ）、Ricinus communis（トウゴマ）（ＲＣＡ−Ｉ，ＲＣＡ−ＩＩ）、Sambucus nigra（エルグー）（ＳＮＡ）、Sophora japonica（シダレエンジュ）（ＳＪＡ）、Triticum vulgaris wheat germ（ＷＧＡ）、Ulex europeaus (UEA-I)、Vicia faba （ソラマメ）(VFA)、Vicia graminea (VGA)、Vicia villosa（ヘアリーベッチ）（ＶＶＡ−Ｂ４）、またはWisteria floribunda（フジ）（ＷＦＡ）。
【００５１】
その代わりに、あるいはさらに高圧陰イオン交換クロマトグラフィー法、例えばＨＰＡＥＣ/ＰＡＤを使用して、複合糖質を含む混合物、特に本発明の陰イオン糖質を含む分子、またはリン酸を含むもしくは硫酸を含むそのフラグメントを分離する。
【００５２】
その代わりに、あるいはさらにサイズ排除クロマトグラフィー(Kobata et al., Methods Enzymol. 138, 84-94, 1987; Oxford GlycoSystem's GlycoMap 1000)をフラグメントの分離に使用するが、この分離はそれらのサイズに基づいて行われる。
【００５３】
本発明はまた、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が、より疎水性の他の分子、例えば疎水性ガングリオシドおよび疎水性セラミドから、本発明の癌マーカーを分離するのに有用であることを示した。これは糖質部分が親水性であるためである。事実親水性ではあるが、特に糖質部分のフラグメントを化学的に誘導体化し、例えば２−アミノピリジンを用いての還元的アミノ化により疎水性の発色団または蛍光標識を導入した場合には、ＲＰ−ＨＰＬＣはそれらフラグメントの分離に有用である。２−アミノピリジンでラベルした糖類はマッピングに容易に利用できる（本質的にはTomiya et al., Anal. Biochem. 171, 73-90,1988 に記載されている）。
【００５４】
電気泳動法、例えば濾紙電気泳動、キャピラリー電気泳動、および好ましくは高比率のポリアクリルアミドスラブゲルを用いたゲル電気泳動を利用して、糖質を含むフラグメントの蛍光性誘導体を分離する（例えば蛍光標識糖鎖電気泳動法（ＦＡＣＥ）、Millipore）ことができる。
【００５５】
質量分析法（ＭＳ）、またはタンデムＭＳ（例えばＭＳ/ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ/エレクトロスプレーＭＳ、エレクトロスプレーＭＳ/ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ/ポストソースＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ等）は、特にＮＭＲ、化学的分解、またはエキソグリコシダーゼによる分解と組み合わせた場合、糖質を含むフラグメントの分離に特に好ましく、分離したあらゆる単糖、二糖、またはオリゴ糖を含む、糖質を含むフラグメントの同定、結合位置、およびアノマー(anomericity)を決定することができる。質量分析法が、分子量の正確な決定、化学的構造の同定、混合物の組成の決定、および定性的要素の分析のための分析技術であることは、当業者は知っているだろう。作動にあたって、質量分析計は調べるサンプル分子のイオンを生成し、それらの質量対電荷比にしたがってイオンを分離し、各イオンの相対量を測定する。好ましくは質量分析システムはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳまたはエレクトロスプレーＭＳまたはそれらのポストソース分解のフラグメント化の方法を使用する。質量分析による分析を行う上での一般的なステップは以下のとおりである：
（ｉ）サンプルから気相のイオンを作成する；
（ｉｉ）イオンの質量対電荷比に基づいて空間または時間においてイオンを分離する
（ｉｉｉ）各々の選択された質量対電荷比のイオンを定量する。
【００５６】
飛行時間型（ＴＰＦ）質量分析法は、例えばＵＳＳＮ５，０４５，６９４およびＵＳＳＮ５，１６０，８４０に記載されているが、調べるサンプル素材のイオンを作成し、作成したイオンが検出器まで飛行するのにかかる時間を測定することによる、イオンの質量対電荷比に従ってこれらのイオンを分離する。ＴＯＦ質量分析計は、比較的簡単な高価ではない装置で、質量対電荷比の範囲が事実上限定されないため有利である。ＴＯＦ質量分析計は、各イオン化操作で作成されたすべてのイオンを記録することができるため、スキャン式の装置より高い感度を得ることができる。ＴＯＦ質量分析計は、従来の磁場型分析計で感度の出せなかった大きな有機分子の質量対電荷比の測定に特に有用である。与えられた電位により加速されたイオンの飛行時間は、その質量対電荷比に比例する。したがって１つのイオンの飛行時間はその質量対電荷比の関数となり、質量対電荷比の平方根にほぼ比例する。価数１のみの荷電イオンが存在すると仮定すると、最も軽いイオンが検出器に最初に到達し、次々により重い質量の群が続く。したがってＴＯＦ質量分析計は調べる分子種の質量/電荷比を非常に正確に算出し、しかも一般にはｍ/ｚ±５に過ぎないエラーは、ぴったり同じ時間では検出器に到達しない、質量と電荷の等しいイオンによるものと大方考えられる。このエラーは質量分析のピークの拡がりをもたらす、作成されたイオンの初期の時間、空間および運動エネルギーの分布によって主に起こり、そのためにＴＯＦ質量分析計の分解能が限定される。初期の時間分布は、イオンが形成される時間の不確実性に起因する。イオン形成時間の確実性は、パルス式のイオン化技術、例えばプラズマ脱離およびレーザー脱離により高めることができる。この方法は非常に短い時間間隔でイオンを作成し、その結果初期の空間分布を最小にするものであるが、これはサンプル表面上の十分に限定された領域からイオンが発生するため、イオン形成初期の空間の不確実性を無視できるからである。パルス式イオン化法、例えばプラズマ脱離（ＰＤ）イオン化法およびレーザー脱離（ＬＤ）イオン化法は、空間および時間のにおいては不確実性を最小にしてイオンを生成するが、初期のエネルギー分布は比較的広い。長いパルス長では質量の分離度がかなり限定され得るため、従来のＬＤは時間の不確実性を最小に抑えるために、典型的には十分に短いパルス（しばしば１０ナノ秒未満）を使用している。ＬＤの機能は、サンプル素材にレーザー波長で高度に吸収する小さな有機マトリックスを添加することにより高められる（すなわちマトリックス支援レーザー脱離イオン化法、以下“ＭＡＬＤＩ”）。マトリックスはサンプルの脱離およびイオン化を促進する。ＭＤＬＤＩは、分子質量１００，０００Ｄａ以上の大きな生体分子の脱離およびイオン化を、それらを分画化せずに促進するため、生物学的適用には特に有利である。本発明を行うための好ましいマトリックスは、４−ヒドロキシベンゼン−２−カルボン酸としても知られている２−（４−ヒドロキシフェニラゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）を含む。ＭＡＬＤＩにおいて、サンプルを通常滑らかな金属表面上にのせ、パルス状のレーザー光線をサンプル表面に照射すると、気相中に脱離する。したがってイオンは、レーザーのパルス間隔にほぼ対応する短い時間間隔で、そしてレーザーから十分なエネルギーを吸収して蒸発する個体のマトリックスおよびサンプルの照射部分に対応する非常に小さい空間領域で、生成される。ＭＡＬＤＩは、特にイオンの初速が小さい場合には、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析法のためのほぼ理想的なイオン源を提供する。ＭＡＬＤＩイオン源におけるパルス的なイオン抽出を用いることで、質量の分離にかなりの改善が得られる。イオンリフレクター（イオンミラーおよびリフレクトロンともいい、１つまたはそれ以上の均一な抑止型の静電場を含む）もまた、特に分析物質のイオンが自由に飛行する領域の端に位置する場合、同イオンの初期運動エネルギーの分布の影響を補正することが知られている。サンプル表面からのイオン生成について、分離を改良し、質量の正確さを高め、シグナル強度を高め、そしてバックグラウンドのノイズを抑えることにより、ＭＡＬＤＩがさらに改良されることは当該技術分野で知られており、例えばこれらの改良はＵＳＳＮ６，０５７，５４３に記載されている。
【００５７】
エレクトロスプレーＭＳ、またはエレクトロスプレーイオン化ＭＳを使用すると、液体サンプルマトリックスから気相のイオンを生成し、サンプルを質量分析計に導入することができる。したがってエレクトロスプレーＭＳは、液体クロマトグラフおよび質量分析計との間を仲介するために有用である。エレクトロスプレーＭＳにおいて、液体の分析物質はキャピラリーチューブ（以下“ニードル”）を通して押し出されるため、位置による差（例えば３０００から４０００ボルト）がニードル先端と反対の壁側、キャピラリー導入部、または類似構造との間にできる。ニードル先端から出て行く流出液は、電場により高度に荷電された微小液滴として拡散され、エレクトロスプレーを形成する。不活性乾燥ガス、例えば乾燥窒素ガスをニードルを取り囲むキャピラリーから導入することも、流出液の噴霧形成を高めることができる。エレクトロスプレーの微小液滴は電場の中を移動し、高真空に保たれている質量分析計に注入される。乾燥ガスと真空とを組み合わせた効果により微小液滴中の担体液は徐々に蒸発し、より小さな、ますます不安定な微小液滴となり、その表面からイオンが分析のための真空中に放たれる。脱溶媒されたイオンはサンプルコーンおよびスキマーレンズを通り、ＲＦレンズで集束された後、質量分析計の高真空領域に入り、そこで質量にしたがって分離され、適当な検出器（例えば光電子増倍管）により検出される。好ましい流出液の流速は、溶媒の組成により２０−３０マイクロリットル/分とする。液体の流速がより早いと、溶かしたサンプルのイオン化は不安定に、非効率的になる可能性があり、その場合には空気支援型の(pneumatically-assisted)エレクトロスプレーニードルを使用してもよい。
ＭＳの環境内に導入するためのサンプルの調製は、少なくとも１回の標準的なクロマトグラフィーによる分離または精製のステップによる分析の前に、一般的に脱塩（本質的には実施例１に記載した）、好ましくは、例えば逆相法によるさらなる分画化を含む。糖質を含むフラグメントの表面の活性を高めるための、例えば連続的な過ヨウ素酸塩への酸化、ＮａＢＤ4の還元、およびペルメチル化（Nilsson, 1993, In: Glycoprotein Analysis in Biomedicine（生物医学における糖タンパク質の分析）(E. F. Housell著)Humana Press, Totowa, NJ, pp35-46）によるそれらフラグメントの誘導体化、またはペルフルオロベンジルアミノベンゾエートによる誘導体化、またはアルキルアミノベンゾエートによる還元末端の修飾は、同方法の感度および/または分解能を改善することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する場合、サンプルは適当なマトリックスと混合して乾燥するが、一方エレクトロスプレーＭＳの場合は、サンプルは適当な担体溶液中の液体サンプルとして直接注入することになる。
【００５８】
さらに当明細書で述べた癌マーカーまたはそのフラグメントの誘導体はまた、１つまたはそれ以上の蛍光リガンド、発色団、酵素のリガンド、放射性リガンド、ペプチドリガンド（例えばＦＬＡＧ）、または抗体のリガンドを該分子の糖質部分に付加することにより生成される、あらゆる糖質を含む分子も含むものとする。糖質へのこのようなリガンドの付加の方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００５９】
糖質および糖質のポリマーを分析する方法、ならびにそれらから製造され得る誘導体のタイプのさらなるまとめとして、Hounsell, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 50, 311-350, 1994; Hounsell, (1997) In: Glycoscience: Status and Perspectives（糖質科学 現状と展望）(H. J. Gabius and S. Gabius著)、Chapman and Hall. pp15-29; およびHounsell著（1997）In: Glycoscience Protocols Methods in Molecular Biology（分子生物学における糖質科学のプロトコルの方法）, Humana Pressを参照のこと。
理論または作用方式に拘束されるものではないが、本発明の糖質を含む分子が、その発現のために活性化されたまたは機能的な免疫系の存在を必要とする、および/または健常な被験者の血中および他の体液中に分泌される限り、該分子は免疫系に依存する可能性がある。したがって腫瘍形成中、例えば転移前には、腫瘍形成が、該分子が通常産生される細胞からの該分子の発現および/または分泌を低減する、および/または該分子の放出の原因となり得る。
本発明によるこのｍ/ｚ９９１イオンの癌マーカーの決定、特に正常細胞および癌細胞の双方におけるその発現特性の解明、およびその検出のためのアッセイシステムの提供は、ヒトおよびヒト以外の哺乳類双方における癌の診断法の範囲の拡大を促進する。
【００６０】
したがって本発明のもうひとつの側面において、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者において癌を診断するまたは検出する、以下を含む方法を提供する：（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること、ただし該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること、その際健常な被験者のレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が癌を示すものとする。
【００６１】
しかしコントロールの健常な被験者の数値範囲が既に定められている場合には、コントロールサンプルを使用する必要はなく、その結果検査サンプルで行った測定をコントロールの範囲と比較することができる。また、サンプル内部のコントロールを使用して、癌マーカーのレベル低下の程度を評価することもできる。例えば、検査サンプルおよびコントロールサンプル双方において安定したレベルを示す、検査サンプルに含まれるもうひとつの分子（すなわちもう１つのマーカー）を選択して比率を算出することができ、この場合にはもう１つのマーカーに対する癌マーカーの比率の変化が癌を示すことになる。あるいは検査サンプルに適切なスタンダードのマーカーを加えることで、内部標準を提供することができる。このようなマーカーは多数あり、質量分析の分野の業者により容易に導入することができる。
【００６２】
当該技術分野で認められているあらゆる方法、例えば免疫による検出、クロマトグラフィー（特に疎水性相互作用クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー）を用いて、健常な被験者のレベルに相対しての被験者の癌マーカーのレベルをアッセイすることができる。必ずしも必要ではないが、好ましくは質量分析計を診断に利用する。本発明の糖質を含む分子またはそのフラグメントを検出または測定するこれらの方法は、当明細書において上に広範囲に述べている。
【００６３】
本発明は、神経外胚葉由来の癌、好ましくは癌腫、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択される癌、例えば卵巣癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、尿路の癌、子宮癌、急性リンパ性白血病、ホジキンス病、黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、および軟組織の肉腫の診断に対して特に指示する。本発明の特に好ましい態様において、癌は黒色腫、腺癌および結腸癌からなる群から選択する。
【００６４】
当明細書で述べた診断法は癌の診断に限定せず、特定の被験者の癌マーカーのレベルを時間をかけて比較することにより、同被験者における同疾患の進行のモニターに適用することができることは明らかであろう。緩解期の患者の場合は、緩解初期に採取したサンプルを、その後のサンプルに対する比較用のスタンダードとして使用することができる。被験者の状態を決定するために、好ましくは以前のサンプルと同じ体液から採取する、というのは癌マーカーのレベルのその後のどのような変異でも緩解期が終了したことを示唆できるからである。同様に治療が成功して緩解または治癒に至った患者、またはいかなる転移も示さなかった患者については、治療後直後または転移前に採取したサンプルを、その後のサンプルに対して比較するスタンダードとして使用して、同患者が腫瘍を再発または転移したかどうかを決定することができる。というのはいかなる癌マーカーレベルの変異も再発または転移を示唆できるからである。
【００６５】
“癌の疑われる被験者”という用語は、緩解期が終了に向かっていると疑われるまたはモニターされる癌の緩解期の被験者を含め、被験者が癌に伴う１つまたはそれ以上の症状を示していた、または本発明の方法の検査サンプルとして使用した検査サンプルを採取した時点で既に癌であると診断された、ことを意味するものと理解されるだろう。
【００６６】
当明細書で使用する場合“健常な被験者”という用語は、コントロールサンプルを採取した時に癌に伴ういかなる症状も示していなかった被験者、またはコントロールサンプルを採取した時に癌に伴う症状から緩解している被験者、または血液分画を採取した時点で血液もしくは血清もしくはその他の体液中に、過去に診断された腫瘍のいかなる転移も示していなかった被験者を意味するものとする。したがって“健常な被験者”は癌の疑われる被験者と区別する必要はない。例えば患者個人、例えば癌を発症するリスクのある人が、別な時に体液のサンプルを提供することができ、その場合何らかの症状の発症前に採取した初期のサンプルを、その後に検査するサンプルに対するコントロールサンプルとして使用することができる。あるいは、緩解期または治療後の被験者から採取した体液のサンプルを、それ以前または以後に採取した同じ被験者のサンプルに対するコントロールとして、例えば同疾患の進行をモニターすることができる。
【００６７】
“コントロールサンプル”により、検査サンプルとの比較を行う、特定の完全な物質(integer)の公知の組成物または内容物を有するサンプルを意味する。コントロールサンプルの素材に必要なのは、同サンプルが疾患の状態と一致すると検出される一定レベルの癌マーカーを含んでいないことだけである。
【００６８】
当明細書で述べたアッセイに使用する検査サンプルまたはコントロールサンプルは、癌の疑われる被験者または健常な被験者からのあらゆる体液のサンプル、例えば特に血液分画、血清分画、尿、唾液、粘液、精液、または涙とすることができる。特に好ましい態様においてコントロールサンプルまたは検査サンプルは、血液分画、好ましくは血清分画である。
【００６９】
当明細書で使用する場合“血液分画”はあらゆる血液由来物質を意味し、血液の上清または沈殿物、血清分画または血漿分画、白血球層、Ｔ細胞が濃縮された分画、血小板が濃縮された分画、血小板および赤血球が濃縮された分画、好塩基球が濃縮された分画、好酸球が濃縮された分画、リンパ球が濃縮された分画、単球が濃縮された分画、好中球が濃縮された分画、または血液のあらゆる他の血液成分を添加したかどうかにかかわらず、部分的に精製したまたは精製したあらゆる血液成分を含むものとする。血液分画は、例えば血液の沈殿処理により（例えば低温、酸、塩基、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等）、またはクロマトグラフィー（例えばサイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、質量分析法、等）による分画化により得ることができる。
【００７０】
本内容において“血清分画”という用語は、血清由来のサンプルを意味する。典型的な血清分画は血漿タンパク質分画（例えばアルブミン分画、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）分画、血清グロブリン分画、第Ｖ因子分画、第ＶＩＩＩ因子分画、もしくは第ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ因子を含むプロトロンビン複合体分画）、血漿の凍結上清もしくは凍結沈殿、新鮮凍結血漿の凍結上清もしくは凍結沈殿、血漿分画の凍結上清もしくは凍結沈殿、または他の血清成分を添加したかどうかにかかわらず、部分的に精製したもしくは精製したあらゆる血清成分を含む。血清分画は、例えば血清の沈殿処理により（例えば低温、酸、塩基、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等）、またはクロマトグラフィー（例えばサイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、質量分析法、等）による分画化により得ることができる。
本発明の方法は体液のサンプルで行うため、簡便に行うことができ非侵襲的である。
【００７１】
使用する分析技術に依存して、体液のサンプルは当業者に公知の標準的な方法により、または不適切な実験をせずに当明細書に記載した方法に従って、調製することができる。本発明は、当明細書で述べた診断アッセイにかけるサンプルの調整および取り扱いを明確に包含する。
【００７２】
“健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること”により、本発明の分子の癌マーカーまたは誘導体の量または濃度を、コントロールサンプルおよび検査サンプルとの間で比較することを意味する。この比較は、例えば質量分析法を使用して、２つのサンプル中の癌マーカーの相対量を最も多量のピークのパーセントとして分析することで、容易に行うことができる。例えばサンプルの質量分析の条件を調整して、特定の分子種のピークの高さまたは特定のピークの面積が、サンプル中の同分子種の量に確実に比例するようにすることができる。したがって集められたピークのサンプルのアッセイをさらに行って、その中の分子種の量を決定することは、厳密には必要ない、というのは２つのサンプルのスペクトルが重なっているので、ピークの高さの差を決定することができるからである。その代わりに、または癌マーカーの相対的なレベルを決定することに加えて、ピークの高さを積分することにより、または癌マーカーに対応するピークのさらなる生化学的アッセイまたはイムノアッセイにより癌マーカーの絶対的な濃度を決定することができる。しかし定量には、粗のサンプルの調製物のままで行うことが好ましい。
【００７３】
本発明は、検査サンプルまたはコントロールサンプルのいずれかにおける、本発明の癌マーカーの量、および/または前記サンプル中の癌マーカーの相対量を決定するステップを明確に含む。このことは、あらゆる血液分画または血清分画の由来する血液または血清中の、癌マーカーの量または相対量を決定することを含む。標準的なアッセイ、例えばピーク分画の免疫化学的分析をこの目的に使用することができる。
【００７４】
好ましくは本発明のこの側面は、体液サンプル、またはそれに由来するあらゆる中間体の分画（例えばグリカン、糖脂質および糖質の粗混合物の沈殿）を得る最初のステップをさらに含む。
【００７５】
好ましくは本発明の本側面に従っての方法は、癌マーカーまたは誘導体のさらなる特徴づけを行うこと、特にその質量/電荷比、および/または分子の質量および/または構造によりその同定を立証することを含む。先の考察から明らかなように、これらの特性は当該技術分野で認められている方法を用いて容易に決定できる。特に好ましい態様において、本発明の糖質を含む分子の質量/電荷比、またはそのポストソース分解のイオン化フラグメントの１つまたはそれ以上の質量/電荷比、またはポストソース分解のイオン化フラグメントの特性を決定して、例えば校正されたマーカーに対しての質量分析により、質量/電荷比の算出値の最大エラー±５、より好ましくは±４、さらにより好ましくは±３、まだより好ましくは±２、そしてさらになおより好ましくは±１で、同癌マーカーとの同定を立証する。
【００７６】
本発明の癌マーカーの免疫学的アッセイのため、癌マーカーに対して、より好ましくは精製した分子またはその誘導体、例えば質量分析からの分画に対してモノクローナル抗体を作成し、次に続いての癌の診断用の標準的なイムノアッセイの技術に使用する。
【００７７】
モノクローナル抗体を作製するため、マウスまたは他の動物に低投与量のシクロホスファミド（１５ｍｇ/Ｋｇヒト以外の哺乳類の体重）を注射して前処置し、そのサプレッサー細胞の活性を低下させ、次に短い間隔（すなわち３-４日および１週間の間）で糖質を含む分子の様々な投与量での免疫感作を行う。グリコホスホイノシトール部分の効果により、糖質を含む分子をリポソーム内に導入することができ、これを続いての動物の免疫感作に使用する（本質的にはＵＳＳＮ５，８１７，５１３に記載されている）。免疫感作は、標準的な内容にしたがって皮下、静脈内、または腹腔への注射により行う。免疫感作期間前および免疫感作期間中に、抗原として使用する糖質を含む分子に対して産生される抗体価を、抗原抗体反応を検出するための公知のいずれかのイムノアッセイ法によりモニターするため、動物から血液、血清サンプルを採取する。一般に短い間隔でのリポソーム製剤の約５−９回投与の蓄積で、糖質を含む分子への抗体反応が促進される。糖質を含む分子に対して血清抗体価をもつマウスには、抗体産生細胞を獲得するまでの約３日間、リポソーム製剤による新たな免疫感作を行い、その後抗体産生細胞、好ましくは脾臓細胞を単離する。これらの細胞を骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体を作製する標準的な方法に従ってハイブリドーマを作製する。次にハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体の力価をイムノアッセイ法により調べる。
【００７８】
好ましくはイムノエンザイムアッセイを行うが、この場合ハイブリドーマ上清を検査サンプルの含む抗原と結合させ、次にモノクローナル抗体と結合する抗体をラベルした第２の酵素を用いて抗原―抗体結合を検出する。一度所望のハイブリドーマを選択し、例えば限界希釈法によりサブクローニングすれば、得られたモノクローナル抗体を適当な培地で、適当な期間、in vitroで増殖し、その後上清から所望の抗体を回収することができる。培地の選択および適当な培養時間は当業者に公知であり、容易に決定することができる。
【００７９】
もうひとつの製造法として、同系のマウスへのハイブリドーマの注射を含む。これらの条件下では、ハイブリドーマは非固形腫瘍の形成の原因となり、このことから同マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）中に所望の抗体が高濃度で産生されることになる。
【００８０】
次に標準的なイムノアッセイを用いて、検査サンプルおよび/またはコントロールサンプル中の糖質を含む分子の存在をアッセイする。
本発明の第３の側面として、本発明の糖質を含む分子、またはその糖質部分、脂質部分、またはタンパク質部分との交差反応性のあるモノクローナル抗体を、明確に意図する。
【００８１】
本発明の第４の側面として、ヒトおよびその他の哺乳類の被験者における癌の検出用の診断キットを意図するが、該キットは校正用スタンダードとしての使用に適する、一定量の単離された本発明の糖質を含む分子、および使用に適する１つまたはそれ以上のバッファーを含むものとする。
【００８２】
“校正用スタンダード”により、規定された完全な物質の量および/または前記の完全な物質の１つまたはそれ以上の物理学的特性を決定する手助けとなる参照サンプルであることを意味する。一般に校正用スタンダードは、不純物に起因する疑わしい結果を最小とするため、単離した形とする。したがって当明細書で述べた診断アッセイのコントロールサンプルは、校正用スタンダードとなり得る。
【００８３】
バッファーは、免疫学的方法、質量分析法、または他の検出法による続いてのアッセイ用に、校正用スタンダードまたはコントロールサンプル、および/または検査サンプルを懸濁するのに適する、いかなるバッファーとすることもできる。あるいは、または加えてバッファーは、本発明の糖質を含む分子の免疫検出アッセイの間の抗体抗原結合反応を行うために適するいかなるバッファーでもよい。
【００８４】
代わりの態様において、本発明はヒトまたは他の哺乳類の被験者における癌の検出用の診断キットを意図するが、該キットは単離された本発明の糖質を含む分子に特異的に結合する一定量の抗体、および使用に適する１つまたはそれ以上のバッファーを含むものとする。
【００８５】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
さらなる代わりの態様において、本発明はヒトまたは他の哺乳類の被験者における癌の検出用の診断キットを意図するが、該キットは校正用スタンダードとしての使用に適する、一定量の単離された本発明の糖質を含む分子、単離された糖質を含む分子に特異的に結合する抗体、および使用に適する１つまたはそれ以上のバッファーを含むものとする。
【００８６】
先の態様のいずれか１つまたはそれ以上によるキットは、好ましくは使用の指示書を添付する。これらのキットの使用は、本明細書で提供した記述に基づいて、当業者に理解されるだろう。
【００８７】
以下に示した非限定的実施例は、単離された本発明の糖質を含む分子、ならびにヒトおよび他の哺乳類における様々な癌の範囲の検出におけるその使用について、さらに述べることを意図するものである。
【実施例】
【００８８】
実施例１：腫瘍を有する動物およびヒトの血液からの、糖質を含むｍ/ｚ９９１のイオンの消失
（材料および方法）
１．腫瘍モデル
ラット：ラットは高度転移性ラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴ（Parish et al., Int. J. Cancer 40, 511-518, 1987）を有するメスのFischer３４４ラットとした。腫瘍細胞は先に述べたようにin vitroで維持した（Parish et al., Int. J. Cancer 40, 511-518, 1987）。ラットに腫瘍を誘発するため、動物（１０−１３週齢）に１０6１３７６２ＭＡＴ細胞を皮下注射し、約１３日後に腫瘍（直径１５−１７ｍｍ）を認めた。
マウス：高度の悪性および転移性のＢ１６Ｆ１黒色腫細胞株を、メスのＣ５７ＢＬ/６マウスに皮下注射し（細胞数１０6個/マウス）、約１５日後に腫瘍（直径１２−１４ｍｍ）を認めた。
ヒト：結腸癌と診断された被験者を使用し、クエン酸塩加血漿を採取した。
２．血清および血漿のサンプル
血液は、抗凝固剤（クエン酸−リン酸−デキストラーゼ）を加えてまたは加えずに、健常なヒトの被験者および結腸癌の被験者、または健常なマウスなおよび腫瘍のあるＣ５７ＢＬ/６マウス、または健常なラットおよび腫瘍のあるFischer３４４ラットから、採取した。採血後、抗凝固剤を加えていない血液を３７℃で３０分間インキュベーションし、４℃でオーバーナイト保存した後、血清を集めた。血漿サンプルは抗凝固剤を加えた血液を遠心（４０００ｘｇ、１２分）して得た。
【００８９】
３．血清分画−硫酸アンモニウム / ピリジン法
血清または血漿（２−３ｍｌ）を塩酸（ＨＣｌ）で酸性にした（ｐＨ５．５からｐＨ５．８）。血清を等量の過飽和硫酸アンモニウムと共に３時間、４℃で撹拌することにより、一部のタンパク質が沈殿した。混合液を１０，０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心し、上清を集めた。粉末の硫酸アンモニウムを９０−９５％飽和となるように加えることにより、さらに脱タンパク質を行い、その後４℃でオーバーナイト撹拌した。混合液を１０，０００ｘｇで１時間、４℃で遠心し、上清を集めた。次に４℃で継続的に撹拌しながら、上清にアセトニトリル（４倍量）を加えた。混合液を５分間静置し、アセトニトリル層をデカントして集めた。残りの混合液を１５００ｘｇで５分間遠心し、残っているアセトニトリル層を集めた。アセトニトリル分画を合わせて、溶媒を蒸発させた。残渣をクロロホルム/メタノール/水（ＣＭＷ；２/４３/５５；１ｍｌ）に再度懸濁し、予め平衡にしておいたＣ18Seppakカートリッジ（Waters, Taunton, MA）に２回かけた。溶出液（吸着されなかった分画）を集めた。容器をＣＭＷ（１ｍｌ）で洗浄し、洗浄液をカートリッジに通した。溶出液を吸着されなかった分画と共に集めた。次にカートリッジを各２ｍｌの水、メタノール/水、メタノール、クロロホルム/メタノール、およびクロロホルムで順次溶出させた。すべての分画を別々に集めた。分画を真空下で乾燥させた（SpeedVac）。吸着されなかった分画および水の分画を最小量の水に再度懸濁させ、１ｋＤａ分子量カットの透析膜にて水に十分に透析した。透析内液を真空下（SpeedVac）で乾燥させた。分画を適切な溶媒１０μｌに再度溶解し、以下に述べるようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【００９０】
４．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
質量分析用のサンプルを調製するため、分画を真空下で乾燥させた。流出分画およびメタノール/水分画を水（２００μｌ）に溶かし、１ｋＤａ分子量カットの透析膜にて水に十分に透析し、蒸発乾燥させた。すべての分画を質量分析計内への設置に適する溶媒１０μｌに再度溶解させた。
上述のように調製した分画（１μｌ）を、マトリックス溶液[メタノール中の２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）３．５ｍｇ/ｍｌ溶液、２μｌ]と共にボルテックスで混合した。混合液（１μｌ）を９６穴サンプルプレートに載せ、室温で乾燥させた。次にサンプルプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（TofSpeco-2e; Micromass, Manchester, UK または Voyager Elite-DE; BioPerceptive）にセットした。イオン化には窒素レーザー（３３７ｎｍ）を使用し、分析は線形型または反射型の負イオンモードで行った。ポストソース分解（ＰＳＤ）のフラグメント化を当該イオンを含むサンプルの一部について行った。データは、各ピークの質量電荷比を示すｍ/ｚ比の特性として、サンプル中に検出された最も多量の分子種のピークの高さのパーセントとして表示したピークの高さにより表した。
【００９１】
（結果）
健常なラット、マウスまたはヒトの血清からの流出分画（すなわちＣ18Seppakカラムに吸着しなかった分画）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析の際、約９９１のｍ/ｚ比を有する非常に顕著な負イオン種を含むことを発見した（図１Ａ，２Ａおよび３Ａ）。この負イオンは腫瘍のあるラットの血清（図１Ｂ）、腫瘍のあるマウスの血清(図２Ｂ)、および結腸癌の患者の血漿（図３Ｂ）からは認められなかった。
【００９２】
ｍ/ｚ９９１イオンのポストソース分解は、検査した３種のすべてにおいて本質的に等しく（図４Ａ，図４Ｂ，および図４Ｃ）、この分子がラット、マウスおよびヒトにおいて同一であることを示唆している。
【００９３】
さらなる研究は、１０6Ｂ１６黒色腫細胞の皮下注射後わずか２日で、ｍ/ｚ９９１イオンがマウスの血清に認められなくなることを明らかにした。この時点ではマウスには明白な腫瘍は存在しておらず、このことはさらに、癌の早期診断でのこの癌マーカーの使用の可能性を示している。
【００９４】
本発明は、特定の好ましい態様および実施例を参照して述べてきたが、一般的な原則および本発明の精神を保持している上での、本発明のバリエーションおよび修飾もまた、当明細書に包含されることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１Ａは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される未処理のラットの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は腺癌の被験者では減少する（図１Ｂ）顕著な負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【００９６】
図１Ｂは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される腫瘍のラットの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。腫瘍のラットは、高度な悪性および転移性のラット乳腺癌１３７６２ＭＡＴの皮下注射（細胞数１０6個/ラット）後１３日にアッセイを行った。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は未処理のラットのスペクトルでは顕著な（図１Ａ）負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【図２】図２Ａは、溶出液としてメタノールを用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される正常な未処理のラットの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は腫瘍のマウスでは減少する（図２Ｂ）顕著な負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【００９７】
図２Ｂは、溶出液としてメタノールを用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される腫瘍マウスの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。腫瘍のマウスは、高度な悪性および転移性のＢ１６Ｆ１黒色腫の皮下注射（細胞数１０6個/ラット）後１５日にアッセイを行った。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は未処理のマウスのスペクトルでは顕著な（図２Ａ）負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【図３】図３Ａは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される正常な未処理のヒトの血清分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は結腸癌の患者では減少する（図３Ｂ）顕著な負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【００９８】
図３Ｂは、溶出液として水を用いてＣ18固相Seppakカートリッジより溶出される結腸癌の患者の血漿分画の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は最も多量の分子種の量のパーセントとして各分子種の相対量を表す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。矢印は未処理の正常なヒトの被験者のスペクトルでは顕著な（図３Ａ）負イオンの位置（ｍ/ｚ９９１）を示す。
【図４】図４Ａは、ポストソース分解のフラグメント化に基づいてのマトリックス支援レーザー脱離イオン−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて得られた、正常な未処理のマウスの血清からの負イオン（ｍ/ｚ９９１）のフラグメント（図１Ａ）の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は各フラグメントの量を示す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。ｍ/ｚ比を有する主なフラグメントは、図の右から左へ２４１、６４４、７０５、７４９および９４７である。分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオン種の位置もまた、スペクトルの右端に示す。ｍ/ｚ２４１イオンフラグメントは、ヘキソースリン酸部分、例えばイノシトールリン酸、またはヘキソース硫酸と一致する。
【００９９】
図４Ｂは、ポストソース分解のフラグメント化に基づいてのマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて得られた、正常な未処理のラットの血清からの負イオン（ｍ/ｚ９９１）のフラグメント（図２Ａ）の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は各フラグメントの量を示す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。ｍ/ｚ比を有する主なフラグメントは、図の右から左へ２４１、６４４、７０５、７４９および９４７である。分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオン種の位置もまた、スペクトルの右端に示す。ｍ/ｚ２４１イオンフラグメントは、ヘキソースリン酸部分、例えばイノシトールリン酸、またはヘキソース硫酸と一致する。バックグラウンドが高いのは、サンプル中の分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオンの量が少ないことに主に起因すると思われる。
【０１００】
図４Ｃは、ポストソース分解のフラグメント化に基づいてのマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて得られた、健常なヒトの血清からの負イオン（ｍ/ｚ９９１）のフラグメント（図２Ａ）の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での特性をグラフで表したものである。ｘ軸は質量/電荷比（ｍ/ｚ）を示し、縦軸は各フラグメントの量を示す。各ピークの先端の数値はそのピークのｍ/ｚ比を表す。ｍ/ｚ比を有する主なフラグメントは、図の右から左へ２４１、６４４、７０５、７４９および９４７である。分解されていないｍ/ｚ９９１の負イオン種の位置もまた、スペクトルの右端に示す。ｍ/ｚ２４１イオンフラグメントは、ヘキソースリン酸部分、例えばイノシトールリン酸、またはヘキソース硫酸と一致する。
Claims (28)
- 健常な被験者に比して癌の被験者では低レベルで存在する、約９９１のｍ/ｚ比の負に荷電した分子、または前記の負に荷電した分子の誘導体を含む癌マーカー。
- 単離された形の請求項１に記載の癌マーカー。
- 負に荷電した分子が糖質、リン酸または硫酸を含む、請求項１または請求項２に記載の癌マーカー。
- 負に荷電した分子が、in situでタンパク質性部分にＯ結合またはＮ結合した、またはin situで脂質部分に結合した糖質部分を含む、請求項３に記載の癌マーカー。
- 誘導体が負に荷電した分子のフラグメントを含む、請求項１に記載の癌マーカー。
- フラグメントが約２４１、約６４４、約７０５、約７４９、および約９４７からなる群から選択されるｍ/ｚ比を有する、請求項５に記載の癌マーカー。
- 前記フラグメントの少なくとも２つを含む請求項６に記載の癌マーカー。
- 前記フラグメントの少なくとも３つを含む請求項６に記載の癌マーカー。
- 前記フラグメントの少なくとも４つを含む請求項６に記載の癌マーカー。
- 前記フラグメントのすべてのフィンガープリントを含む請求項６に記載の癌マーカー。
- 誘導体が、蛍光リガンド、酵素のリガンド、放射性リガンド、ペプチドリガンド、または抗体のリガンドと共有結合した負に荷電した分子を含む、請求項１に記載の癌マーカー。
- ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌を診断または検出する方法であって、以下の内容を含む前記方法：
（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること［該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む]；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、または健常な被験者として定められたレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること［その際健常な被験者のレベル、または健常な被験者として定められたレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が癌を示すものとする］。 - ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌を診断または検出する方法であって、以下の内容を含む前記方法：
（ｉ）癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること［該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む］；および
（ｉｉ）検査サンプルに添加した内部標準のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること［その際内部標準のレベルに相対しての、前記の癌マーカーまたは誘導体のレベルの低下が癌を示すものとする］。 - 癌を疑われる被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること［該マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む］；同検査サンプル中のもうひとつのマーカーのレベルと相対させ［その際もうひとつのマーカーに対しての該癌マーカーの比率の変化が癌を示すものとする］を含むヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌を診断または検出する方法。
- 癌マーカー、内部標準、またはもうひとつのマーカーのレベルを、質量分析法またはクロマトグラフィーの技術により決定する、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
- 癌が神経外胚葉由来である請求項１５に記載の方法。
- 癌が癌腫、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
- 癌が黒色腫である請求項１５に記載の方法。
- 癌が腺癌である請求項１５に記載の方法。
- 癌が結腸癌である請求項１５に記載の方法。
- 検査サンプルおよび/またはコントロールサンプルが体液またはその分画である請求項１５に記載の方法。
- 体液が血液である請求項２１に記載の方法。
- 分画が血清または血清由来の分画である請求項２１に記載の方法。
- 検査サンプルまたはコントロールサンプルのいずれかにおける癌マーカーの量、および/または該サンプルにおける癌マーカーの相対量を決定することをさらに含む、請求項１２から２３のいずれか１項に記載の方法。
- サンプルを得る第一のステップをさらに含む請求項１２から２３のいずれか１項に記載の方法。
- 癌マーカーの同定を、そのフラグメンテーションの特性を決定することにより立証することをさらに含む、請求項１２から２３のいずれか１項に記載の方法。
- ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における癌の治療をモニターする方法であって、以下の内容を含む前記方法：
（ｉ）癌の治療を行っている被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること［該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む］；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、健常な被験者として定められたレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること［その際レベルの増加が治療の成功を示すものとする］。 - ヒトまたはヒト以外の哺乳類の被験者における治療成功後の癌の再発を診断する方法であって、以下の内容を含む前記方法：
（ｉ）癌の治療を行った被験者からの検査サンプル中の癌マーカーのレベルを決定すること［該癌マーカーは約９９１のｍ/ｚ比を有する負に荷電した分子、またはその誘導体を含む］；および
（ｉｉ）健常な被験者からのコントロールサンプル中の癌マーカーまたは誘導体のレベル、健常な被験者として定められたレベル、または癌の治療に成功した後の被験者からのサンプル中のレベルに対して、（ｉ）の癌マーカーまたは誘導体のレベルを比較すること［その際レベルの低下が癌の再発を示すものとする］。
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