JP2004537268A - 腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシスおよび／またはウイルス耐性の現象に関与する配列、ならびに医薬品としてのそれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は特に、腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシスおよび／またはウイルス耐性の分子経路に関与する、新規配列に関する。本発明はまた、診断および試験される化合物のスクリーニング方法の実施においてと同様に、配列の使用または癌、ウイルス性疾患、神経変性疾患に対する治療に関する。本発明はさらに、生物学的試料中の本発明による配列またはそれらの発現産物の、検出および／またはアッセイのための方法に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍抑制、腫瘍復帰変異（tumor reversion）、アポトーシスおよび／またはウイルス耐性の分子経路に関与する遺伝子の証明に関する。
【発明の開示】
【０００２】
本発明は腫瘍抑制、腫瘍復帰変異および／またはアポトーシスの過程で発現されるかまたは抑制される、伝令RNAに対応するcDNAの単離により可能となった。
【０００３】
腫瘍復帰変異の際に活性化または阻害される遺伝子を単離するため、悪性細胞株（U937）および悪性表現型の発現が抑制された派生細胞株（US4）における遺伝子発現を、包括的に組み合わせた。発現した遺伝子（2つの細胞種で発現した伝令RNA）の比較により、示差的に発現した遺伝子、即ち前記細胞のうち一方で発現しているが他方では発現していない遺伝子（その遺伝子は活性化または阻害されている可能性がある）を証明することが可能となった。
【０００４】
このことから、これらの遺伝子が、ある場合にはこれらが存在しないことにより、および他の場合にはこれらの存在により、少なくとも癌化の過程に関与すると容易に推測される。
【０００５】
この示差研究のために用いられる方法は、1992年、LiangおよびPardeeにより記載された方法（ポリメラーゼ連鎖反応による真核細胞mRNAのディファレンシャル・ディスプレイ）である。
【０００６】
モデル作製のため、本発明者らは以下の仮説をまとめた：H-1パルボウイルスの細胞変性効果に感受性の腫瘍から、細胞変性効果に耐性の細胞を選択することが可能であれば、この耐性はこれらの悪性表現型における変化によるものであるかもしれない。U937癌細胞から選択されたUS4細胞の場合に関して、これを証明できた。親細胞株U937と違い、US4クローン（および本発明には関係しないUS3クローンも）はH-1パルボウイルスの細胞変性効果に耐性である。
【０００７】
分子レベルで、悪性表現型のこの抑制は、p53遺伝子発現に非依存的に、p21waf1遺伝子発現の活性化と関係していることを観察することができた。
【０００８】
本発明による問題に対する研究方法により、幾つかの正確な機能と直接結びついた配列を単離することができた。故に、ESTのランダム配列決定とは異なり、前記配列は、それらが悪性表現型の腫瘍復帰変異もしくはアポトーシスの抑制過程、および／またはウイルス耐性に関与しているという事実により、その機能が既知の配列である。
【０００９】
腫瘍復帰変異は、それが腫瘍抑制遺伝子の範囲よりもより広い範囲を包含するという事実において、腫瘍抑制とは異なる。言い換えれば、腫瘍復帰変異は、腫瘍抑制遺伝子が関与する代謝の分子経路に限定されない、代謝および／または分子経路の実施を介して起こる。
【００１０】
従って、本発明は特に新規配列、ならびに診断におけるこれらの配列の使用、および試験される化合物のスクリーニング方法を実施するためのこれらの配列の使用にも関する。本発明はまた、生物学的試料中の、本発明の配列またはそれらの発現産物を検出および／またはアッセイするための方法に関する。
【００１１】
本発明は第一に、以下の群より選択される核酸配列を含む、精製された核酸に関する：
a）配列番号：1から配列番号：2280；
b）a）に定義される配列の、少なくとも15個の連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
c）a）またはb）に定義される配列と、最適アライメントの後、少なくとも80％の同一性の割合を有するヌクレオチド配列；
d）a）またはb）に定義される配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
e）a）、b）、c）またはd）に定義される配列に対応する、相補的なヌクレオチド配列またはRNA配列。
【００１２】
c）に定義される本発明によるヌクレオチド配列は、上記のa）またはb）に定義される配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有する。
【００１３】
「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、本明細書中にて差別なく使用され、正確なヌクレオチド鎖を示すことを意図する。これらは核酸の断片または領域を定義することを可能とするよう、修飾されてもまたは修飾されなくてもよく、天然ヌクレオチドを含んでも含まなくてもよく、かつ二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびこれらのDNAの転写産物に等しく対応する可能性がある。従って、本発明による核酸配列にはまた、PNA（ペプチド核酸）なども包含される。
【００１４】
本発明のヌクレオチド配列の断片は、少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。優先的に、これらは少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含み、さらに優先的に、少なくとも30個の連続するヌクレオチドを含む。
【００１５】
本発明は、天然の染色体環境、すなわち天然の状態にあるヌクレオチド配列には関係しないと理解されるべきである。これらは、単離されたおよび／または精製された配列であり、すなわちそれらは直接的または間接的に採取され、例えば複製により、それらの環境は少なくとも部分的に変更される。化学合成により得られる核酸もまた、意味することを意図する。
【００１６】
本発明の目的上、2つの核酸またはアミノ酸配列間における、「同一性の割合」という用語は、比較する2つの配列間で、最良アライメント後に得られる、同一のアミノ酸残基のヌクレオチドの割合を示すことを意図し、この割合は単純に統計にもとづくものであり、2つの配列間の差異はランダムにそれらの全長に渡って分布する。「最良アライメント」または「最適アライメント」という用語は、下記のように決定される同一性の割合が最高となるアライメントを示すことを意図する。2つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は、従来はこれらを最適に整列させた後、これらの配列を比較することにより行われ、この比較は配列類似性の局所領域を同定して比較するため、セグメントにより、または「比較ウィンドウ（window of comparison）」により行われる。比較に関する配列の最適アライメントは、手動の他、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム（1981）を用いて、NeddlemanおよびWunschの局所的相同性アルゴリズム（1970）を用いて、PearsonおよびLipmanの類似性検索法（1988）を用いて、これらのアルゴリズムを使用したコンピューター・ソフトウェア（Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI）を用いて行うことができる。最適アライメントを得るため、BLOSUM 62マトリックスを用いたBLASTプログラムが好ましく使用される。PAMまたはPAM250マトリックスも同様に使用することができる。
【００１７】
2つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性の割合は、これら2つが最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これら2つの配列間の最適アライメントのための参照配列と比べて、付加または欠失を含む可能性がある。同一性の割合は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基がこの2つの配列間で同一である同一位置の数を決定する段階、この同一位置数を、比較する位置の総数で割る段階、およびこれら2つの配列間における同一性の割合を得るため、結果に100を乗じる段階により算出される。
【００１８】
「参照配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を示す核酸配列」という表現は、参照核酸配列と比較して、特に欠失、切断、伸張、キメラ融合および／または置換、特に点型置換のような、ある種の改変を示す核酸配列、ならびに参照核酸配列との最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を有する核酸配列を表すことを意図する。好ましくは、特異的または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、この2つの配列のうちの一方と、もう一方に相補的な配列間で、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を確実にするものであると考えられる。
【００１９】
高ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、2つの相補的な核酸断片間のハイブリダイゼーションの維持を可能とするように、温度およびイオン強度の条件を選択することを意味する。例として、上述のヌクレオチド配列を規定するための、ハイブリダイゼーションの段階における高ストリンジェントな条件は、下記が有利である。
【００２０】
DNA-DNAまたはDNA-RNA間のハイブリダイゼーションは、2段階で行われる：（1） 5×SSC（1×SSCは0.15M NaCl + 0.015Mクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、50％ホルムアミド、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、10×デンハルト（Denhardt's）、5％硫酸デキストラン、および1％サケ精子DNAを含有するリン酸緩衝液（20mM、pH7.5）中、3時間、42℃でのプレハイブリダイゼーション；（2） 本質的には20時間、プローブの長さに依存する温度（すなわち：100ヌクレオチドより長いプローブでは42℃）でのハイブリダイゼーション、引き続き2×SSC + 2％SDS中、20℃で、20分間の洗浄を2回、さらに0.1×SSC + 0.1％SDS中、20℃で、20分間の洗浄を1回。最後の洗浄は、100ヌクレオチドより長いプローブに対しては、0.1×SSC + 0.1％SDS中、30分間、60℃にて行う。明確な長さのポリヌクレオチドに対する、上記の高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、1989の教示に従い、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに関して、当業者が調整することができる。
【００２１】
本発明による配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有する核酸配列の中で、本発明の配列の、またはそれらの断片の変異体である核酸配列、すなわち、対立遺伝子変異体、すなわち本発明の配列の個々の変異に相当する核酸配列の全てもまた、好ましい。
【００２２】
「変異型ヌクレオチド配列」という用語は、本発明のヌクレオチド配列に相当するゲノムDNAのスプライス部位の突然変異および／または変化から生じる、任意のRNAまたはcDNAを示すことを意図する。
【００２３】
本発明の対象はまた、本発明によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである。
【００２４】
本発明の目的において、「ポリペプチド」という用語は、等しくタンパク質またはペプチドを示すことを意図する。
【００２５】
特定の態様に従えば、本発明によるポリペプチドは以下より選択されるポリペプチドを含む：
a）本発明によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、
b）a）に定義されるポリペプチドと、少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド、
c）a）またはb）に定義されるポリペプチドの少なくとも5個のアミノ酸の断片、
d）a）、b）、またはc）に定義されるポリペプチドの生物学的に活性な断片、および
e）a）、b）、c）またはd）に定義されるポリペプチドの、改変されたポリペプチド。
【００２６】
同一性の割合の評価は、関連する配列の最適アライメント後に行われると理解される。「最適アライメント後、そのアミノ酸配列が参照配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有するポリペプチド」という表現は、参照となるポリペプチドと比較して、特に、1つもしくは複数の欠失または切断、伸張、キメラ融合および／または1つもしくは複数の置換のような、ある種の改変を示すポリペプチドを表すことを意図する。
【００２７】
最適アライメント後、そのアミノ酸配列が本発明によるポリペプチドのような参照配列と、またはその断片のうちの1つと、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有するポリペプチドの中で、以前に定義された変異型ヌクレオチド配列によりコードされる変異型ポリペプチド、特に本発明のポリペプチド配列またはそれらの断片のうち1つと比較して、そのアミノ酸配列が特に、少なくとも1残基の切断、欠失、置換および／または付加に相当する、少なくとも1つの変異を示すポリペプチドが好ましい。
【００２８】
本発明はまた、本発明によるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするか、または本発明によるポリペプチドをコードすることを特徴とする、クローニングおよび／または細胞発現ベクターに関する。このようなベクターはまた、宿主細胞中でその発現、および選択的に、前記ポリペプチドの分泌に必要とされる要素を含むことができる。このような宿主細胞はまた、本発明の対象である。
【００２９】
プロモーターおよび／または調節配列を含むベクターはまた、本発明の一部である。これらのベクターは好ましくは、プロモーター、翻訳開始および停止シグナル、ならびに転写調節に適した領域も含む。これらのベクターは細胞中で安定に維持され得る必要があり、かつそれらはまた、翻訳されたタンパク質の分泌を可能とする特定のシグナルを持つことができる。
【００３０】
これらの種々の制御シグナルは、使用する細胞宿主の機能として選択される。この趣旨で、本発明による核酸配列は、選択した宿主中で自己複製するベクター、または選択した宿主中に組み込むベクター中に挿入することができる。
【００３１】
プラスミドまたはウイルス型の系、ウイルスベクターは、自己複製する系の中では宿主細胞に依存して、特に、アデノウイルス（5）、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスもしくはヘルペスウイルス（5a）において、好ましく使用される可能性がある。当業者は、これらの系のそれぞれに対して使用できる方法を認識している。
【００３２】
有利なことに、本発明によるベクターは、組織特異的ターゲティングおよび／または発現のための配列を含む。
【００３３】
宿主細胞の染色体への、配列の組込みが望まれる場合、例えば、プラスミドまたはウイルス型の系を使用することができる；このようなウイルスは、例えば、レトロウイルス（6）またはAAV（7）である。
【００３４】
非ウイルスベクターの中で、VICAL社により開発された手法による、裸のDNAまたは裸のRNAのような裸のポリヌクレオチド、酵母での発現に対しては細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、マウス細胞での発現に対してはマウス人工染色体（MAC）および、好ましくは、ヒト細胞での発現に対してはヒト人工染色体（HAC）が好ましい。
【００３５】
このようなベクターは当業者により共通に使用される方法によって調製され、かつそれにより得られたクローンは、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショック、細胞膜の化学的透過処理後の形質転換、または細胞融合のような標準的方法により、適切な宿主に導入されうる。
【００３６】
本発明にはまた、宿主細胞、特に本発明によるベクターで形質転換した真核または原核細胞、およびその形質転換動物、好ましくは本発明による形質転換細胞の1つを含むヒトを除く哺乳類も含まれる。これらの動物は、炎症および／もしくは免疫疾患、ならびに特に消化管の炎症疾患の病因を研究するための、または癌を研究するための、モデルとして使用することができる。
【００３７】
本発明の目的に使用することができる細胞の中では、細菌細胞（8）だけでなく、酵母細胞（9）もまた、動物細胞、特に哺乳類の培養細胞（10）、特にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞と共に挙げられる。同じく、昆虫細胞も挙げられ、この細胞では例えば、バキュロウイルス（11）を用いた方法を使用可能である。本発明のタンパク質の発現に関して好ましい細胞宿主は、COS細胞からなる。
【００３８】
本発明による哺乳類の中で、本発明によるポリペプチドを発現している齧歯動物、特にマウス、ラットまたはウサギのような動物が好ましい。
【００３９】
これらの形質転換動物は、例えば、胚幹細胞上の相同組換え、これらの幹細胞の胚への導入、生殖系列中で影響を受けたキメラの選択、およびこれらのキメラの発育により得られる。
【００４０】
従って、本発明による形質転換動物は、本発明に基づくタンパク質をコードする遺伝子、もしくはそれらの相同遺伝子を過剰発現することができ、または突然変異が導入されたその遺伝子を発現することができる。これらの形質転換動物、特にマウスは、例えば強力な偏在性プロモーター、もしくは組織種に対して選択性のプロモーターの制御下にあるこの遺伝子の複製物のトランスフェクションにより、またはウイルスの転写後に得られる。
【００４１】
本発明による哺乳類の細胞は、下記のように、本発明によるポリペプチドを産生するための方法において使用することができ、かつ分析モデルとしても使用することができる。
【００４２】
上記のように形質転換された細胞または哺乳類はまた、本発明によるポリペプチドと、本発明によるポリペプチドの活性に直接的にまたは間接的に関与する化合物、またはタンパク質化合物間の相互作用を研究するための、関わりのある種々の機構および相互作用を研究するためのモデルとして使用することができる。
【００４３】
それらは特に、本発明によるポリペプチド、もしくはそれらの[空隙（lacuna）]と、補助因子もしくは阻害因子、特に競合的阻害因子として相互作用するか、または本発明によるポリペプチドの活性に関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する生成物を選択するのに使用することができる。好ましくは、形質転換細胞または形質転換動物は特に、この遺伝子の異常発現に関連する病的状況に対抗する生成物を選択するためのモデルとして使用される。
【００４４】
本発明の対象はまた、本発明によるポリペプチドを特異的に認識することができる、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、この抗体の断片、またはキメラ抗体である。
【００４５】
特異的モノクローナル抗体は、当業者に周知である、従来のハイブリドーマ培養法により得ることができる。
【００４６】
本発明による抗体は、例えばヒト化抗体、またはFabもしくはF（ab'）2断片である。それらはまた、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るため、標識された免疫複合体または抗体の[空隙]内にありうる。
【００４７】
したがって、本発明による抗体、また免疫複合体は、本発明によるポリペプチドを特異的に認識することができる。
【００４８】
特異的ポリクローナル抗体は特に、遺伝子組換えによりまたはペプチド合成により産生される、本発明のポリペプチドに対して免疫された動物の血清から、通例の手順に従って得ることができる。
【００４９】
本発明によるポリペプチド、それらの変異体、またはそれらの免疫原性断片を特異的に認識する抗体の利点が、特に注目される。
【００５０】
本発明の対象はまた、核酸配列を検出、同定、アッセイまたは増幅するためのプローブまたはプライマーとしての、本発明によるヌクレオチド配列の使用である。
【００５１】
本発明によれば、核酸配列を検出、同定、アッセイおよび／または増幅するための方法における、プローブまたはプライマーとして使用可能なヌクレオチド配列は、その長さが最低15塩基、好ましくは20塩基、またはさらに好ましくは25から30塩基である。
【００５２】
本発明によるプローブおよびプライマーは、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るために、当業者に周知の方法により、放射性または非放射性化合物で直接的または間接的に標識することができる。
【００５３】
本発明による非標識の核酸配列は、プローブまたはプライマーとして直接的に使用することができる。
【００５４】
多数の応用に使用可能な配列を得るため、一般的に配列は標識される。本発明によるプライマーまたはプローブは、放射性元素または非放射性分子を用いて標識される。
【００５５】
使用される放射性同位体の中で、32P、33P、35S、3Hまたは125Iに言及する。非放射性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、および放射線発光試薬、化学発光試薬、生物発光試薬、蛍光性試薬またはリン光性試薬のような発光試薬から選択される。
【００５６】
従って、本発明によるヌクレオチド配列は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法（11a）を利用する方法において、プライマーおよび／またはプローブとして使用することができる。この技法では、増幅する必要のある断片を組み立てるオリゴヌクレオチドプライマー対の選択が必要となる。例えば、米国特許第4,683,202号に記載の技法を参照してもよい。増幅される断片は、例えば、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、またはゲルろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法の後、同定し、次いで配列決定することができる。増幅の特異性は、本発明のヌクレオチド配列をプライマーとして使用し、かつこれらの配列を含むプラスミド、またはその生成された増幅産物を鋳型として使用することにより調節することができる。増幅されたヌクレオチド断片は、生物学的試料中における、増幅されたヌクレオチド断片の配列に相補的な配列からなる標的核酸の存在を実証するため、ハイブリダイゼーション反応における試薬として使用することができる。
【００５７】
本発明はまた、本発明によるプライマーを用いて増幅により得られる核酸配列にも向けられる。
【００５８】
本発明によるヌクレオチド配列のプライマー対を用い、標的とする核酸を増幅する他の手法を、PCRに対する代替法（PCR様の）として有利に使用できる。「PCR様の」という用語は、核酸配列の直接的もしくは間接的複製物を使用する全ての方法、または標識系が増幅される方法を示すことを意図し、；これらの方法は勿論、公知である。一般的に、これはポリメラーゼを用いたDNA増幅を伴い；最初の試料がRNAである場合、予め逆転写を行うのが賢明である。この増幅に関して現在、例えば、SDA（鎖置換増幅）法（12）、（13）により説明されたTAS（転写に基づく増幅系）法、（14）により説明された3SR（自己維持配列複製）法、（15）により説明されたNASBA（核酸配列に基づく増幅）法、（16）により説明されたTMA（転写介在増幅）法、LCR（リガーゼ連鎖反応）法、（17）により説明されたRCR（修復連鎖反応）法、（18）により説明されたCPR（サイクリングプローブ反応）法、および（19）により説明されたQ-β-レプリカーゼ増幅法、のような方法が数多く存在する。これらの方法の幾つかは、その後改善されている。
【００５９】
検出すべき標的ポリヌクレオチドがmRNAである場合、生物学的試料中に含まれるmRNAからcDNAを得るため、本発明によるプライマーを用いた増幅反応を行う前に、または本発明のプローブを用いた検出法を行う前に、逆転写型酵素型の酵素を有利に使用できる。その後、得られたcDNAは、本発明による増幅法または検出法で使用される、プライマーまたはプローブに対する標的として役立つと思われる。
【００６０】
プローブのハイブリダイゼーション法は、種々の方法（20）で行うことができる。最も一般的な方法は、種々の組織の細胞からまたは培養細胞から抽出された核酸を、支持体（ニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレンのような）上に固定する段階、および確定した条件下で、固定化された標的核酸をプローブと共にインキュベートする段階である。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去し、形成された雑種分子を適当な方法（プローブに結合している放射能、蛍光または酵素活性を測定する）により検出する。
【００６１】
本発明による核酸プローブの別の態様によれば、後者は捕捉プローブ（capture probes）として使用することができる。この場合、「捕捉プローブ」と命名されたプローブは支持体上に固定化され、生物学的試料から得られた試験すべき標的核酸を、特異的ハイブリダイゼーションにより、捕捉するために使用され、次いで標的核酸は、容易に検出可能な成分で標識されている「検出プローブ」と命名された、第二プローブを用いて検出される。
【００６２】
本発明によるヌクレオチド配列はさらに、それらがアンチセンスヌクレオチド、即ち、その構造が、その標的配列とのハイブリダイゼーションにより、対応する産物の発現を阻害するヌクレオチドとして使用される場合、価値がある。それらはまた、その対応産物の発現制御に関与するタンパク質との相互作用により、この発現の阻害または活性化のどちらか一方を誘導するセンスヌクレオチドとしても、使用することができる。
【００６３】
本発明の対象はまた、組換え型ポリペプチドを産生または合成するための、本発明によるヌクレオチド配列の使用である。
【００６４】
本発明のポリペプチドを組換え型として産生するための方法は、それ自体、本発明に含まれるが、形質転換細胞、特に本発明の細胞または哺乳類細胞が、本発明によるヌクレオチド配列によりコードされる組換え型ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養されること、およびその組換え型ポリペプチドが回収されることを特徴とする。
【００６５】
このような産生方法を用いて得ることができることを特徴とする、組換え型ポリペプチドはまた、本発明の一部である。
【００６６】
前述の通り得られた組換え型ポリペプチドは、グルコシル化型でも非グルコシル化型でもよく、かつその天然型三次構造を持っていてもまたは持っていなくてもよい。
【００６７】
組換え型ポリペプチドの配列はまた、特に水性溶媒中における溶解度を改善するために、改変することができる。
【００６８】
例えば、疎水性領域の除去、または疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸への置換のような改変は、当業者に周知である。
【００６９】
これらのポリペプチドは当業者に周知の、組換え型ポリペプチドを産生するための方法に従い、上記の核酸配列から産生することができる。この場合、使用される核酸配列は、細胞性宿主中でその発現を可能とするシグナルの制御下に置かれる。
【００７０】
組換え型ポリペプチドを産生するための効果的な系は、本発明によるベクターおよび宿主細胞を有する必要がある。
【００７１】
これらの細胞は、上記のベクター中に挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能とする条件下でこれらの細胞を培養することにより、得ることができる。
【００７２】
組換え型ポリペプチドの精製のために使用される方法は、当業者に周知である。組換え型ポリペプチドは、分画、クロマトグラフィー法、特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いた免疫親和性法等のような方法を、単独でまたは組み合わせて用いることにより、細胞の溶解液および抽出液から、またはその培地上清から精製することができる。
【００７３】
本発明によるポリペプチドはまた、多数ある公知のペプチド合成法の一つを使用する化学合成、例えば固相を使用した方法（21）もしくは部分的に固相を使用する方法により、断片縮合により、または溶液中における従来型の合成により、得ることができる。
【００７４】
化学合成により得られるポリペプチド、および対応する非天然型アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００７５】
本発明の対象はまた、本発明によるヌクレオチド配列を少なくとも1つ含むことを特徴とする、DNAチップである。
【００７６】
詳細には、核酸配列を検出、同定、アッセイためおよび／または増幅するための、プローブまたはプライマーとして使用されることが意図される、本発明によるヌクレオチド配列は、DNAチップまたは高密度フィルターである支持体に、共有結合的にまたは非共有結合的に固定化できる。
【００７７】
「DNAチップ」または「高密度フィルター」という用語は、DNA配列の各々がその地理的位置によって正確に位置を特定され得るように結合された支持体を示すことを意図する。これらのチップまたはフィルターは、主にその大きさ、支持体の材料、および選択的に、それに結合している配列数が異なる。
【００７８】
特に、インサイチュー合成は、光化学アドレッシング（photochemical addressing）またはインクジェットにより行うことができる。その他の方法は、機械的もしくは電気的アドレッシングまたはインクジェットにより、エクスサイチュー（ex situ）合成を実施すること、およびプローブをDNAチップの支持体に結合させることにある。これらの種々の方法は当業者に周知である。
【００７９】
本発明の対象はまた、本発明によるポリペプチドまたは抗体を含む、タンパク質チップである。
【００８０】
このようなタンパク質チップにより、本発明によるポリペプチドと他のタンパク質または化合物間の相互作用を調べることが可能となり、従ってこのようなタンパク質チップは、本発明によるポリペプチドと相互作用する化合物のスクリーニングに有用である。
【００８１】
本発明によるタンパク質チップはまた、試験される患者血清中の、本発明によるポリペプチドに対する抗体の存在を検出するために使用できる。本発明による抗体を含むタンパク質チップはまた、今度は、抗体により認識され得る、患者血清中の、ポリペプチドの存在を検出するために使用することができる。
【００８２】
本発明の対象はまた、医薬品を調製するための、本発明によるヌクレオチド配列、ポリペプチド、ベクター、細胞または抗体より選択される化合物の使用である。
【００８３】
さらに具体的に標的とされる病的状況は、ウイルス性疾患、および腫瘍細胞の発達、またはアルツハイマー病もしくは精神分裂症のような細胞変性を特徴とする疾患である。従って、上記の医薬品はこれらの疾患の予防および／または治療に向けられる。特に、標的とされる疾患は癌である。
【００８４】
本発明の利点の1つは、腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシスおよび／またはウイルス耐性の現象に非常に多くのヌクレオチド配列が関与していることを証明したことである。従って、これら上記の過程の1つが発動される場合、これらの配列は示差的に発現する。故に、これらの過程のうち1つの誘発が疑われるか、またはこのような誘発がないことの検証が望まれる患者がいる場合、この患者由来の生物学的試料を用いて、本発明による1つもしくは複数の配列の発現を決定、または定量することさえできるのは有利である。選択的に、これらの配列の1つまたは複数の発現解析は、健常な個体の対応する発現の参照レベルとの比較を伴うことができる。
【００８５】
その結果として、本発明にはまた、試験される患者由来の生物学的試料を用いて、本発明の配列の少なくとも1つの発現解析を含む、ウイルス性疾患または腫瘍増殖もしくは細胞変性を特徴とする疾患の、診断および／または予後評価のための方法が含まれる。
【００８６】
好ましい態様に従えば、方法は以下の段階を含む：
試験される患者由来の生物学的試料から伝令RNAを単離する段階、
その伝令RNAから相補的なcDNAを調製する段階、
選択的に、本発明の配列の少なくとも1つに対応する相補的DNAの一部を増幅する段階、および
増幅された可能性のある相補的DNAを検出する段階。
【００８７】
特に、配列の発現解析は、上述のようにDNAチップを用いて行うことができる。
【００８８】
本発明の配列の中で、あるものは細胞表面で発現している受容体であるという特徴を持ち、かつ上述の過程と関連したその機構を理解するため、この受容体と相互作用することができる、即ち本発明によるポリペプチドと相互作用することができる化合物を探索することが有利である；その分泌タンパク質を提供することもまた必要である。これはまた、分泌タンパク質（その表面または細胞外にある）、ホルモン様タンパク質等に相当する、本発明によるポリペプチドにも適用される。故に、本発明の対象はまた、以下の段階を含む、本発明によるペプチドと結合できる化合物をスクリーニングするための方法である：
本発明によるポリペプチドまたは細胞を、候補化合物と接触させる段階、および
候補化合物とポリペプチドまたは細胞間の複合体形成を検出する段階。
【００８９】
化合物をスクリーニングするための方法はまた、本発明によるヌクレオチド配列、またはこれらの配列の発現もしくは制御に必要な配列とさえも、相互作用することができる化合物に対して有利であり得る。詳細には、化合物は問題の配列の発現を減少させる、阻害する、または反対に、増強する効果によって、配列と相互作用することができる。このような方法は、以下の段階を含む：
本発明によるヌクレオチド配列または細胞を、候補化合物と接触させる段階、および
候補化合物とヌクレオチド配列または細胞間の複合体形成を検出する段階。
【００９０】
従って上述の理由により、試験される患者由来の生物学的試料または標本において、本発明によるヌクレオチド配列の存在を探索および／またはアッセイすることが有利でありうる。このような検出および／またはアッセイ方法には、以下の段階が含まれる：
雑種形成に必要な条件下で、本発明による標識されたヌクレオチド配列を、試験される生物学的試料と接触させる段階、および
ヌクレオチド配列と生物学的試料中に存在する核酸間で形成される可能性のある雑種を、検出および／またはアッセイする段階。
【００９１】
この方法にはまた、本発明によるヌクレオチド配列より選択されるプライマーを用いて、生物学的試料の核酸を増幅するための段階が含まれていてもよい。
【００９２】
特に、本方法は上述のDNAチップを用いて行うことができる。
【００９３】
当業者はこのような方法を実施することができ、特に以下を含む試薬キットを使用することができる：
a）プローブとして使用される、本発明によるヌクレオチド配列、
b）プローブと生物学的試料の核酸間のハイブリダイゼーション反応を行うために必要な試薬、
c）プローブと生物学的試料の核酸間で形成される雑種を、検出および／またはアッセイするために必要な試薬。
【００９４】
このようなキットはまた、得られた結果の質を確実にするため、陽性または陰性対照を含んでもよい。
【００９５】
同様に本明細書では、本発明によるポリペプチドを検出および／またはアッセイすることを想定することもまた可能であり、従って本方法には以下の段階が含まれる：
生物学的試料を、本発明による標識抗体と接触させる段階、および
試料中に存在するポリペプチドの、抗体により形成される複合体を、検出および／またはアッセイする段階。
【００９６】
本方法は上述のタンパク質チップを用いて有利に行うことができる。この場合も同様に、当業者はこのような方法を実行することができ、かつ特に、以下を含む試薬キットを使用することができる：
a）本発明によるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；
b）選択的に、抗原／抗体反応に適した培地を構成するための試薬；
c）抗原／抗体複合体を検出するための試薬。
【００９７】
最後に、本発明の対象はまた、コンピュータ可読の媒体、または請求項1記載の少なくとも1つのヌクレオチド配列、および／もしくは請求項3もしくは4記載の少なくとも1つのポリペプチド配列が記録された、コンピュータ媒体である。特に、この媒体は以下を含む群より選択される：
a）ディスク、
b）ハードディスク、
c）ランダム・アクセス・メモリ（RAM）、
d）リード・オンリー・メモリー（ROM）、
e）CD-ROM。
【００９８】
本発明は本明細書に限定されるものではなく、一方、全ての変異体を包含し、かつ以下の実験データに鑑みて、より明確に理解されるものと思われる。
【００９９】
1-U937 および US4 細胞に関するデータ
上述で明らかなように、本発明は親細胞U937および「派生」細胞US4を使用する。実際に、US4細胞およびUS3細胞（この細胞は本明細書には関与しない）はある種の特徴を共有する。それらの細胞を得るための方法およびそれらの特性も以下に報告する。
【０１００】
US3 および US4 細胞の選択および特徴付け
U937細胞を単一クローン集団が得られるまで、2回連続して限界希釈にかけた。これらの細胞にH-1パルボウイルスを感染させた。ウイルスの細胞変性効果により大量の細胞が死滅し、連続培養して3ヶ月後、2つの耐性クローン、即ちUS3およびUS4が残った。細胞の生存は、再感染の4日後に測定される、H-1パルボウイルスを感染させた培養物中の生存細胞の、非処置培養物と比較した相対数として定義される。造腫瘍性の測定のため、U937、US3またはUS4細胞107個をscid/scidマウス（4週または5週齢）に皮下注射した。造腫瘍性はその注入後2ヶ月間に、マウスで発達した腫瘍数により表される。
【０１０１】
研究方法は下記の通りとした：悪性細胞のクローン集団から、造腫瘍性表現型の抑制を示すサブクローンを得た。H-1パルボウイルスによって為されたこの選択は、腫瘍細胞の消失（好ましくは死滅させる）により実現され、その一方で同時に正常細胞が残る。H-1パルボウイルスの細胞変性効果に対して、感受性のある腫瘍を除いた、耐性細胞の選択により、悪性表現型の減少した細胞を得ることができる。
【０１０２】
これに基づき、U937細胞のクローン集団が単離され、これらの細胞はH-1パルボウイルスの細胞変性効果に感受性であり、US3およびUS4クローンに関して、それらはウイルスに耐性である。パルボウイルスを感染させたscid/scidマウスの中で、親細胞U937では事例の80％において腫瘍が発達している一方、US3およびUS4クローンでは造腫瘍性表現型が強力に抑制される；107個の細胞を接種した20匹につき、US3細胞では腫瘍は一つのみ形成され、US4細胞では一つの腫瘍が発達する。その結果を下記の表に示す。
【０１０３】
H-1 パルボウイルスに対する耐性、ならびに U937 、 US3 および US4 細胞の造腫瘍性
【０１０４】
2- 材料および方法
これは、形質転換されたU937およびUS4ヒト白血病細胞株の皮下注射により誘導された、SCIDマウスの皮下腫瘍の増殖を比較する段階を含む。
【０１０５】
A. 白血病細胞株および培養条件
U937（ATCC）およびUS4細胞株の全注入細胞は、2mM L-グルタミン、10％ウシ胎児血清およびゲンタマイシンを添加した、RPMI-1640培地を充填したフラスコ中で、細胞懸濁液の形態で提供された。
【０１０６】
U937細胞株は、びまん性組織球性リンパ腫の患者に由来する、CD4+ヒト単球細胞株である（1）。
【０１０７】
細胞は血球計算板で計数し、それらの生存を0.25％トリパンブルー色素排除で試験した。U937細胞およびUS4細胞に関する生存率は、それぞれ95.5％および90.5％であった。SCIDマウスに注入する前に、U937およびUS4細胞を遠心し、次いでRPMI培地に懸濁した。
【０１０８】
B. 動物
31週齢で体重20 gから25 gの、健康な雌SCIDマウス（CB17/IcrHsd）10匹は、Harlan France社（Gannat、France）より供給された。マウスは処理前に、特定病原体除去（SPF）の動物飼育設備である、本出願人が所属する特別施設で7日間観察された。動物飼育設備（INRA、Dijon、France）は、フランス農林研究大臣（the French Ministers for Agriculture and for Research）により認可されている（承認番号A21100）。動物実験は、動物実験倫理に関する欧州ガイドライン（2）、および実験的新生物における動物の福祉に関する英国ガイドライン（3）に従い、実施した。
【０１０９】
B.1. 環境
動物は、温度（24±1℃）、湿度（55±1％）、光周期（12時間明/12時間暗）および換気を伴う、制御条件下にある室内で管理した。動物をSPF条件下で管理し、かつ室内の温度および湿度を継続して監視した。換気装置は再循環なしで1時間あたり換気を14回行うようにプログラムされた。外部から入る新鮮な空気は、各室内に均一に拡散される前に、連続フィルターを通過する。マウスコロニー内への病原体の汚染または拡散を防ぐために、実験室内は高圧（2mm）に維持された。SPF条件下で働く全職員とも、動物飼育区域に立ち入る場合、衛生および衣類に配慮した特別なガイドラインに従う。
【０１１０】
B.2. 動物飼育
動物は、それらに飼料および水を供給するために装備されたポリカーボネートケージ（UAR、Epinay sur Orge、France）中に収容した。使用されたケージの標準的な大きさは、標準的な内部作業手順に従い、マウス10匹に対し637cm2である。動物用寝わらは無菌の経木（UAR）で構成され、これを1週間に2回交換する。
【０１１１】
B.3. 飼料および飲料
動物飼料はExtralabo社（Provins、France）から購入した。飼料は自由摂取とし、ケージ上の金属蓋に置いた。水も同様に、ゴム栓を装備した水瓶から自由摂取させた。水瓶は1週間に1回、洗浄、滅菌して交換した。供給水は、0.2μmの絶対フィルターでろ過滅菌した。
【０１１２】
B.4. 動物およびケージ識別
無作為配分後、動物は両耳に入墨された2つの異なる数字により識別した。各ケージを特定コードで標識した。
【０１１３】
C- 実験データおよび処置
C.1. SCID マウスへの腫瘍の導入
細胞の注入前に、SCIDマウスを1群につき5匹の割合で、無作為に2群に配分した。RPMI培地0.2ml中のUS4またはU937腫瘍細胞107個を、各注入の時点として0時間に、SCIDマウスに皮下接種した。各動物に、腫瘍細胞を異なる部位に4回注入した；1回は各脇腹および1回は各肩。
【０１１４】
C.2. 腫瘍回収
腫瘍が体積1500mm3に到達した時点で、マウスを屠殺してその腫瘍を回収し、体重を測定し、液体窒素で凍結し、-80℃に保管し、次いで明確に標識しておいた。
【０１１５】
C.3. マウスの管理
屠殺のための細胞注入の前に、動物を麻酔するためにイソフルレン・フォーレン（Minerve、Bondouble、France）を使用した。腫瘍細胞の注入後、そのマウスを5時間観察した。そのマウスの生存率、挙動および体重、ならびに皮下腫瘍の増殖を1週間に2回、記録した。
【０１１６】
実験の間、下記の兆候のうちの1つが現れた場合は、イソフルレンでの麻酔下で動物を頸椎脱臼により屠殺した：
苦痛の兆候（悪液質、衰弱、移動困難または摂食困難）、
体重の10％までの腫瘍増殖、
腫瘍性潰瘍および持続暴露（persistent exposure）、
移動および／または摂食を妨げる位置の腫瘍、
連続する3日間で20％の体重減少。
【０１１７】
転移の可能性または形態学的異常の存在を検出するため、各動物に対して剖検を実施した。
【０１１８】
D- データの提示
D.1. 生存パラメータ
中央値および平均生存時間に関する計算は、下記のように表される：
【０１１９】
平均生存時間＝S1/（S2 - NT）
ここで：
S1＝0日目から実験終了日までの一日の生存マウスの合計（「考慮に入れられない」＊生存マウス以外）
S2＝開始時の動物数
NT＝「考慮に入れられない」＊動物数
＊「考慮に入れられない」：これらは腫瘍の不完全移植の結果生じたと考えられる、規定限度よりも小さい腫瘍を有する動物である。
【０１２０】
D.2. 腫瘍阻害系
腫瘍の大きさはコンパスを用いて1週間に2回測定し、その腫瘍体積（mm3で）を次式により概算した：（長さ×幅2）/2 （4）。マウスの腫瘍の大きさが1500mm3に達した時に、実験を中止した。
屠殺後、腫瘍を切除し、重量を測定した。
US4およびU937群に関する腫瘍増殖曲線を、腫瘍体積の平均値を用いてグラフに示した。
US4およびU937群に関する腫瘍倍加時間は、増殖期間に、200％の平均腫瘍体積に達するまでの所要時間と定義した。
細胞注入から1回または2回の倍加時間（TD）に渡る特異的増殖期は、下記のように定義される：
特異的増殖期＝（TD US4 - TD U937）/TD U937
増殖期は同じ腫瘍の大きさに達するまでの、US4群およびU937群の増殖時間の中央値における相違として計算した。
【０１２１】
D.3. 統計的検査法
全統計解析はStatView（登録商標）ソフトウェア（Abacus concept、Berkeley、USA）を用いて行った。平均体重変化、腫瘍倍加時間、および到達時間「V」の統計解析は、ボンフェローニ/ダン（Bonferroni/Dunn）検定を用いて行った。0.05より小さいp値（p＜0.05）は有意であると考えた。全群を相互に比較した。
【０１２２】
E- 結果
腫瘍体積および平均体重曲線を図1および図2にそれぞれ示す。
【０１２３】
この2群に基づいて、SCIDマウスの有意な体重減少は、8日目から19日目の間に観察されなかった。
【０１２４】
平均の体重変化（19日目-8日目）および倍加時間に関して、有意差は観察されなかったのに対し、到達時間「V」に関しては、SCIDマウスの2群間で有意差が観察された。
【０１２５】
実施された剖検により、転移の存在または結節発達は示されなかった。腫瘍回収は麻酔および頸椎脱臼後、屠殺した動物について行った。腫瘍は直ぐにチューブに入れ、液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。切除された腫瘍は卵形であって、適度な粘度がありかつ色はピンクがかっていた。環境（皮膚および筋組織）と腫瘍との相互関係は限定的であり、かつ表面的であった。
【０１２６】
F- 結論
US4細胞株はU937細胞株と比較して、SCIDマウスで有意に低い定着率を示した。
【０１２７】
US4およびU937腫瘍間の増殖の遅延は23.5日であり、その倍加速度は同等であった。
【０１２８】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】SCIDマウスにおける、U937およびUS4群に対する腫瘍増殖曲線を表す。
【図２】U937またはUS4腫瘍を持つマウスの体重曲線を表す。
【０００１】
本発明は腫瘍抑制、腫瘍復帰変異（tumor reversion）、アポトーシスおよび／またはウイルス耐性の分子経路に関与する遺伝子の証明に関する。
【発明の開示】
【０００２】
本発明は腫瘍抑制、腫瘍復帰変異および／またはアポトーシスの過程で発現されるかまたは抑制される、伝令RNAに対応するcDNAの単離により可能となった。
【０００３】
腫瘍復帰変異の際に活性化または阻害される遺伝子を単離するため、悪性細胞株（U937）および悪性表現型の発現が抑制された派生細胞株（US4）における遺伝子発現を、包括的に組み合わせた。発現した遺伝子（2つの細胞種で発現した伝令RNA）の比較により、示差的に発現した遺伝子、即ち前記細胞のうち一方で発現しているが他方では発現していない遺伝子（その遺伝子は活性化または阻害されている可能性がある）を証明することが可能となった。
【０００４】
このことから、これらの遺伝子が、ある場合にはこれらが存在しないことにより、および他の場合にはこれらの存在により、少なくとも癌化の過程に関与すると容易に推測される。
【０００５】
この示差研究のために用いられる方法は、1992年、LiangおよびPardeeにより記載された方法（ポリメラーゼ連鎖反応による真核細胞mRNAのディファレンシャル・ディスプレイ）である。
【０００６】
モデル作製のため、本発明者らは以下の仮説をまとめた：H-1パルボウイルスの細胞変性効果に感受性の腫瘍から、細胞変性効果に耐性の細胞を選択することが可能であれば、この耐性はこれらの悪性表現型における変化によるものであるかもしれない。U937癌細胞から選択されたUS4細胞の場合に関して、これを証明できた。親細胞株U937と違い、US4クローン（および本発明には関係しないUS3クローンも）はH-1パルボウイルスの細胞変性効果に耐性である。
【０００７】
分子レベルで、悪性表現型のこの抑制は、p53遺伝子発現に非依存的に、p21waf1遺伝子発現の活性化と関係していることを観察することができた。
【０００８】
本発明による問題に対する研究方法により、幾つかの正確な機能と直接結びついた配列を単離することができた。故に、ESTのランダム配列決定とは異なり、前記配列は、それらが悪性表現型の腫瘍復帰変異もしくはアポトーシスの抑制過程、および／またはウイルス耐性に関与しているという事実により、その機能が既知の配列である。
【０００９】
腫瘍復帰変異は、それが腫瘍抑制遺伝子の範囲よりもより広い範囲を包含するという事実において、腫瘍抑制とは異なる。言い換えれば、腫瘍復帰変異は、腫瘍抑制遺伝子が関与する代謝の分子経路に限定されない、代謝および／または分子経路の実施を介して起こる。
【００１０】
従って、本発明は特に新規配列、ならびに診断におけるこれらの配列の使用、および試験される化合物のスクリーニング方法を実施するためのこれらの配列の使用にも関する。本発明はまた、生物学的試料中の、本発明の配列またはそれらの発現産物を検出および／またはアッセイするための方法に関する。
【００１１】
本発明は第一に、以下の群より選択される核酸配列を含む、精製された核酸に関する：
a）配列番号：1から配列番号：2280；
b）a）に定義される配列の、少なくとも15個の連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
c）a）またはb）に定義される配列と、最適アライメントの後、少なくとも80％の同一性の割合を有するヌクレオチド配列；
d）a）またはb）に定義される配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
e）a）、b）、c）またはd）に定義される配列に対応する、相補的なヌクレオチド配列またはRNA配列。
【００１２】
c）に定義される本発明によるヌクレオチド配列は、上記のa）またはb）に定義される配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有する。
【００１３】
「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、本明細書中にて差別なく使用され、正確なヌクレオチド鎖を示すことを意図する。これらは核酸の断片または領域を定義することを可能とするよう、修飾されてもまたは修飾されなくてもよく、天然ヌクレオチドを含んでも含まなくてもよく、かつ二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびこれらのDNAの転写産物に等しく対応する可能性がある。従って、本発明による核酸配列にはまた、PNA（ペプチド核酸）なども包含される。
【００１４】
本発明のヌクレオチド配列の断片は、少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。優先的に、これらは少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含み、さらに優先的に、少なくとも30個の連続するヌクレオチドを含む。
【００１５】
本発明は、天然の染色体環境、すなわち天然の状態にあるヌクレオチド配列には関係しないと理解されるべきである。これらは、単離されたおよび／または精製された配列であり、すなわちそれらは直接的または間接的に採取され、例えば複製により、それらの環境は少なくとも部分的に変更される。化学合成により得られる核酸もまた、意味することを意図する。
【００１６】
本発明の目的上、2つの核酸またはアミノ酸配列間における、「同一性の割合」という用語は、比較する2つの配列間で、最良アライメント後に得られる、同一のアミノ酸残基のヌクレオチドの割合を示すことを意図し、この割合は単純に統計にもとづくものであり、2つの配列間の差異はランダムにそれらの全長に渡って分布する。「最良アライメント」または「最適アライメント」という用語は、下記のように決定される同一性の割合が最高となるアライメントを示すことを意図する。2つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は、従来はこれらを最適に整列させた後、これらの配列を比較することにより行われ、この比較は配列類似性の局所領域を同定して比較するため、セグメントにより、または「比較ウィンドウ（window of comparison）」により行われる。比較に関する配列の最適アライメントは、手動の他、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム（1981）を用いて、NeddlemanおよびWunschの局所的相同性アルゴリズム（1970）を用いて、PearsonおよびLipmanの類似性検索法（1988）を用いて、これらのアルゴリズムを使用したコンピューター・ソフトウェア（Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI）を用いて行うことができる。最適アライメントを得るため、BLOSUM 62マトリックスを用いたBLASTプログラムが好ましく使用される。PAMまたはPAM250マトリックスも同様に使用することができる。
【００１７】
2つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性の割合は、これら2つが最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これら2つの配列間の最適アライメントのための参照配列と比べて、付加または欠失を含む可能性がある。同一性の割合は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基がこの2つの配列間で同一である同一位置の数を決定する段階、この同一位置数を、比較する位置の総数で割る段階、およびこれら2つの配列間における同一性の割合を得るため、結果に100を乗じる段階により算出される。
【００１８】
「参照配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を示す核酸配列」という表現は、参照核酸配列と比較して、特に欠失、切断、伸張、キメラ融合および／または置換、特に点型置換のような、ある種の改変を示す核酸配列、ならびに参照核酸配列との最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を有する核酸配列を表すことを意図する。好ましくは、特異的または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、この2つの配列のうちの一方と、もう一方に相補的な配列間で、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を確実にするものであると考えられる。
【００１９】
高ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、2つの相補的な核酸断片間のハイブリダイゼーションの維持を可能とするように、温度およびイオン強度の条件を選択することを意味する。例として、上述のヌクレオチド配列を規定するための、ハイブリダイゼーションの段階における高ストリンジェントな条件は、下記が有利である。
【００２０】
DNA-DNAまたはDNA-RNA間のハイブリダイゼーションは、2段階で行われる：（1） 5×SSC（1×SSCは0.15M NaCl + 0.015Mクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、50％ホルムアミド、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、10×デンハルト（Denhardt's）、5％硫酸デキストラン、および1％サケ精子DNAを含有するリン酸緩衝液（20mM、pH7.5）中、3時間、42℃でのプレハイブリダイゼーション；（2） 本質的には20時間、プローブの長さに依存する温度（すなわち：100ヌクレオチドより長いプローブでは42℃）でのハイブリダイゼーション、引き続き2×SSC + 2％SDS中、20℃で、20分間の洗浄を2回、さらに0.1×SSC + 0.1％SDS中、20℃で、20分間の洗浄を1回。最後の洗浄は、100ヌクレオチドより長いプローブに対しては、0.1×SSC + 0.1％SDS中、30分間、60℃にて行う。明確な長さのポリヌクレオチドに対する、上記の高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、1989の教示に従い、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに関して、当業者が調整することができる。
【００２１】
本発明による配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有する核酸配列の中で、本発明の配列の、またはそれらの断片の変異体である核酸配列、すなわち、対立遺伝子変異体、すなわち本発明の配列の個々の変異に相当する核酸配列の全てもまた、好ましい。
【００２２】
「変異型ヌクレオチド配列」という用語は、本発明のヌクレオチド配列に相当するゲノムDNAのスプライス部位の突然変異および／または変化から生じる、任意のRNAまたはcDNAを示すことを意図する。
【００２３】
本発明の対象はまた、本発明によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドである。
【００２４】
本発明の目的において、「ポリペプチド」という用語は、等しくタンパク質またはペプチドを示すことを意図する。
【００２５】
特定の態様に従えば、本発明によるポリペプチドは以下より選択されるポリペプチドを含む：
a）本発明によるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、
b）a）に定義されるポリペプチドと、少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド、
c）a）またはb）に定義されるポリペプチドの少なくとも5個のアミノ酸の断片、
d）a）、b）、またはc）に定義されるポリペプチドの生物学的に活性な断片、および
e）a）、b）、c）またはd）に定義されるポリペプチドの、改変されたポリペプチド。
【００２６】
同一性の割合の評価は、関連する配列の最適アライメント後に行われると理解される。「最適アライメント後、そのアミノ酸配列が参照配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有するポリペプチド」という表現は、参照となるポリペプチドと比較して、特に、1つもしくは複数の欠失または切断、伸張、キメラ融合および／または1つもしくは複数の置換のような、ある種の改変を示すポリペプチドを表すことを意図する。
【００２７】
最適アライメント後、そのアミノ酸配列が本発明によるポリペプチドのような参照配列と、またはその断片のうちの1つと、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは少なくとも98％の同一性の割合を有するポリペプチドの中で、以前に定義された変異型ヌクレオチド配列によりコードされる変異型ポリペプチド、特に本発明のポリペプチド配列またはそれらの断片のうち1つと比較して、そのアミノ酸配列が特に、少なくとも1残基の切断、欠失、置換および／または付加に相当する、少なくとも1つの変異を示すポリペプチドが好ましい。
【００２８】
本発明はまた、本発明によるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするか、または本発明によるポリペプチドをコードすることを特徴とする、クローニングおよび／または細胞発現ベクターに関する。このようなベクターはまた、宿主細胞中でその発現、および選択的に、前記ポリペプチドの分泌に必要とされる要素を含むことができる。このような宿主細胞はまた、本発明の対象である。
【００２９】
プロモーターおよび／または調節配列を含むベクターはまた、本発明の一部である。これらのベクターは好ましくは、プロモーター、翻訳開始および停止シグナル、ならびに転写調節に適した領域も含む。これらのベクターは細胞中で安定に維持され得る必要があり、かつそれらはまた、翻訳されたタンパク質の分泌を可能とする特定のシグナルを持つことができる。
【００３０】
これらの種々の制御シグナルは、使用する細胞宿主の機能として選択される。この趣旨で、本発明による核酸配列は、選択した宿主中で自己複製するベクター、または選択した宿主中に組み込むベクター中に挿入することができる。
【００３１】
プラスミドまたはウイルス型の系、ウイルスベクターは、自己複製する系の中では宿主細胞に依存して、特に、アデノウイルス（5）、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスもしくはヘルペスウイルス（5a）において、好ましく使用される可能性がある。当業者は、これらの系のそれぞれに対して使用できる方法を認識している。
【００３２】
有利なことに、本発明によるベクターは、組織特異的ターゲティングおよび／または発現のための配列を含む。
【００３３】
宿主細胞の染色体への、配列の組込みが望まれる場合、例えば、プラスミドまたはウイルス型の系を使用することができる；このようなウイルスは、例えば、レトロウイルス（6）またはAAV（7）である。
【００３４】
非ウイルスベクターの中で、VICAL社により開発された手法による、裸のDNAまたは裸のRNAのような裸のポリヌクレオチド、酵母での発現に対しては細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、マウス細胞での発現に対してはマウス人工染色体（MAC）および、好ましくは、ヒト細胞での発現に対してはヒト人工染色体（HAC）が好ましい。
【００３５】
このようなベクターは当業者により共通に使用される方法によって調製され、かつそれにより得られたクローンは、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショック、細胞膜の化学的透過処理後の形質転換、または細胞融合のような標準的方法により、適切な宿主に導入されうる。
【００３６】
本発明にはまた、宿主細胞、特に本発明によるベクターで形質転換した真核または原核細胞、およびその形質転換動物、好ましくは本発明による形質転換細胞の1つを含むヒトを除く哺乳類も含まれる。これらの動物は、炎症および／もしくは免疫疾患、ならびに特に消化管の炎症疾患の病因を研究するための、または癌を研究するための、モデルとして使用することができる。
【００３７】
本発明の目的に使用することができる細胞の中では、細菌細胞（8）だけでなく、酵母細胞（9）もまた、動物細胞、特に哺乳類の培養細胞（10）、特にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞と共に挙げられる。同じく、昆虫細胞も挙げられ、この細胞では例えば、バキュロウイルス（11）を用いた方法を使用可能である。本発明のタンパク質の発現に関して好ましい細胞宿主は、COS細胞からなる。
【００３８】
本発明による哺乳類の中で、本発明によるポリペプチドを発現している齧歯動物、特にマウス、ラットまたはウサギのような動物が好ましい。
【００３９】
これらの形質転換動物は、例えば、胚幹細胞上の相同組換え、これらの幹細胞の胚への導入、生殖系列中で影響を受けたキメラの選択、およびこれらのキメラの発育により得られる。
【００４０】
従って、本発明による形質転換動物は、本発明に基づくタンパク質をコードする遺伝子、もしくはそれらの相同遺伝子を過剰発現することができ、または突然変異が導入されたその遺伝子を発現することができる。これらの形質転換動物、特にマウスは、例えば強力な偏在性プロモーター、もしくは組織種に対して選択性のプロモーターの制御下にあるこの遺伝子の複製物のトランスフェクションにより、またはウイルスの転写後に得られる。
【００４１】
本発明による哺乳類の細胞は、下記のように、本発明によるポリペプチドを産生するための方法において使用することができ、かつ分析モデルとしても使用することができる。
【００４２】
上記のように形質転換された細胞または哺乳類はまた、本発明によるポリペプチドと、本発明によるポリペプチドの活性に直接的にまたは間接的に関与する化合物、またはタンパク質化合物間の相互作用を研究するための、関わりのある種々の機構および相互作用を研究するためのモデルとして使用することができる。
【００４３】
それらは特に、本発明によるポリペプチド、もしくはそれらの[空隙（lacuna）]と、補助因子もしくは阻害因子、特に競合的阻害因子として相互作用するか、または本発明によるポリペプチドの活性に関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する生成物を選択するのに使用することができる。好ましくは、形質転換細胞または形質転換動物は特に、この遺伝子の異常発現に関連する病的状況に対抗する生成物を選択するためのモデルとして使用される。
【００４４】
本発明の対象はまた、本発明によるポリペプチドを特異的に認識することができる、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、この抗体の断片、またはキメラ抗体である。
【００４５】
特異的モノクローナル抗体は、当業者に周知である、従来のハイブリドーマ培養法により得ることができる。
【００４６】
本発明による抗体は、例えばヒト化抗体、またはFabもしくはF（ab'）2断片である。それらはまた、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るため、標識された免疫複合体または抗体の[空隙]内にありうる。
【００４７】
したがって、本発明による抗体、また免疫複合体は、本発明によるポリペプチドを特異的に認識することができる。
【００４８】
特異的ポリクローナル抗体は特に、遺伝子組換えによりまたはペプチド合成により産生される、本発明のポリペプチドに対して免疫された動物の血清から、通例の手順に従って得ることができる。
【００４９】
本発明によるポリペプチド、それらの変異体、またはそれらの免疫原性断片を特異的に認識する抗体の利点が、特に注目される。
【００５０】
本発明の対象はまた、核酸配列を検出、同定、アッセイまたは増幅するためのプローブまたはプライマーとしての、本発明によるヌクレオチド配列の使用である。
【００５１】
本発明によれば、核酸配列を検出、同定、アッセイおよび／または増幅するための方法における、プローブまたはプライマーとして使用可能なヌクレオチド配列は、その長さが最低15塩基、好ましくは20塩基、またはさらに好ましくは25から30塩基である。
【００５２】
本発明によるプローブおよびプライマーは、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るために、当業者に周知の方法により、放射性または非放射性化合物で直接的または間接的に標識することができる。
【００５３】
本発明による非標識の核酸配列は、プローブまたはプライマーとして直接的に使用することができる。
【００５４】
多数の応用に使用可能な配列を得るため、一般的に配列は標識される。本発明によるプライマーまたはプローブは、放射性元素または非放射性分子を用いて標識される。
【００５５】
使用される放射性同位体の中で、32P、33P、35S、3Hまたは125Iに言及する。非放射性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、および放射線発光試薬、化学発光試薬、生物発光試薬、蛍光性試薬またはリン光性試薬のような発光試薬から選択される。
【００５６】
従って、本発明によるヌクレオチド配列は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法（11a）を利用する方法において、プライマーおよび／またはプローブとして使用することができる。この技法では、増幅する必要のある断片を組み立てるオリゴヌクレオチドプライマー対の選択が必要となる。例えば、米国特許第4,683,202号に記載の技法を参照してもよい。増幅される断片は、例えば、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、またはゲルろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法の後、同定し、次いで配列決定することができる。増幅の特異性は、本発明のヌクレオチド配列をプライマーとして使用し、かつこれらの配列を含むプラスミド、またはその生成された増幅産物を鋳型として使用することにより調節することができる。増幅されたヌクレオチド断片は、生物学的試料中における、増幅されたヌクレオチド断片の配列に相補的な配列からなる標的核酸の存在を実証するため、ハイブリダイゼーション反応における試薬として使用することができる。
【００５７】
本発明はまた、本発明によるプライマーを用いて増幅により得られる核酸配列にも向けられる。
【００５８】
本発明によるヌクレオチド配列のプライマー対を用い、標的とする核酸を増幅する他の手法を、PCRに対する代替法（PCR様の）として有利に使用できる。「PCR様の」という用語は、核酸配列の直接的もしくは間接的複製物を使用する全ての方法、または標識系が増幅される方法を示すことを意図し、；これらの方法は勿論、公知である。一般的に、これはポリメラーゼを用いたDNA増幅を伴い；最初の試料がRNAである場合、予め逆転写を行うのが賢明である。この増幅に関して現在、例えば、SDA（鎖置換増幅）法（12）、（13）により説明されたTAS（転写に基づく増幅系）法、（14）により説明された3SR（自己維持配列複製）法、（15）により説明されたNASBA（核酸配列に基づく増幅）法、（16）により説明されたTMA（転写介在増幅）法、LCR（リガーゼ連鎖反応）法、（17）により説明されたRCR（修復連鎖反応）法、（18）により説明されたCPR（サイクリングプローブ反応）法、および（19）により説明されたQ-β-レプリカーゼ増幅法、のような方法が数多く存在する。これらの方法の幾つかは、その後改善されている。
【００５９】
検出すべき標的ポリヌクレオチドがmRNAである場合、生物学的試料中に含まれるmRNAからcDNAを得るため、本発明によるプライマーを用いた増幅反応を行う前に、または本発明のプローブを用いた検出法を行う前に、逆転写型酵素型の酵素を有利に使用できる。その後、得られたcDNAは、本発明による増幅法または検出法で使用される、プライマーまたはプローブに対する標的として役立つと思われる。
【００６０】
プローブのハイブリダイゼーション法は、種々の方法（20）で行うことができる。最も一般的な方法は、種々の組織の細胞からまたは培養細胞から抽出された核酸を、支持体（ニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレンのような）上に固定する段階、および確定した条件下で、固定化された標的核酸をプローブと共にインキュベートする段階である。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去し、形成された雑種分子を適当な方法（プローブに結合している放射能、蛍光または酵素活性を測定する）により検出する。
【００６１】
本発明による核酸プローブの別の態様によれば、後者は捕捉プローブ（capture probes）として使用することができる。この場合、「捕捉プローブ」と命名されたプローブは支持体上に固定化され、生物学的試料から得られた試験すべき標的核酸を、特異的ハイブリダイゼーションにより、捕捉するために使用され、次いで標的核酸は、容易に検出可能な成分で標識されている「検出プローブ」と命名された、第二プローブを用いて検出される。
【００６２】
本発明によるヌクレオチド配列はさらに、それらがアンチセンスヌクレオチド、即ち、その構造が、その標的配列とのハイブリダイゼーションにより、対応する産物の発現を阻害するヌクレオチドとして使用される場合、価値がある。それらはまた、その対応産物の発現制御に関与するタンパク質との相互作用により、この発現の阻害または活性化のどちらか一方を誘導するセンスヌクレオチドとしても、使用することができる。
【００６３】
本発明の対象はまた、組換え型ポリペプチドを産生または合成するための、本発明によるヌクレオチド配列の使用である。
【００６４】
本発明のポリペプチドを組換え型として産生するための方法は、それ自体、本発明に含まれるが、形質転換細胞、特に本発明の細胞または哺乳類細胞が、本発明によるヌクレオチド配列によりコードされる組換え型ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養されること、およびその組換え型ポリペプチドが回収されることを特徴とする。
【００６５】
このような産生方法を用いて得ることができることを特徴とする、組換え型ポリペプチドはまた、本発明の一部である。
【００６６】
前述の通り得られた組換え型ポリペプチドは、グルコシル化型でも非グルコシル化型でもよく、かつその天然型三次構造を持っていてもまたは持っていなくてもよい。
【００６７】
組換え型ポリペプチドの配列はまた、特に水性溶媒中における溶解度を改善するために、改変することができる。
【００６８】
例えば、疎水性領域の除去、または疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸への置換のような改変は、当業者に周知である。
【００６９】
これらのポリペプチドは当業者に周知の、組換え型ポリペプチドを産生するための方法に従い、上記の核酸配列から産生することができる。この場合、使用される核酸配列は、細胞性宿主中でその発現を可能とするシグナルの制御下に置かれる。
【００７０】
組換え型ポリペプチドを産生するための効果的な系は、本発明によるベクターおよび宿主細胞を有する必要がある。
【００７１】
これらの細胞は、上記のベクター中に挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能とする条件下でこれらの細胞を培養することにより、得ることができる。
【００７２】
組換え型ポリペプチドの精製のために使用される方法は、当業者に周知である。組換え型ポリペプチドは、分画、クロマトグラフィー法、特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いた免疫親和性法等のような方法を、単独でまたは組み合わせて用いることにより、細胞の溶解液および抽出液から、またはその培地上清から精製することができる。
【００７３】
本発明によるポリペプチドはまた、多数ある公知のペプチド合成法の一つを使用する化学合成、例えば固相を使用した方法（21）もしくは部分的に固相を使用する方法により、断片縮合により、または溶液中における従来型の合成により、得ることができる。
【００７４】
化学合成により得られるポリペプチド、および対応する非天然型アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００７５】
本発明の対象はまた、本発明によるヌクレオチド配列を少なくとも1つ含むことを特徴とする、DNAチップである。
【００７６】
詳細には、核酸配列を検出、同定、アッセイためおよび／または増幅するための、プローブまたはプライマーとして使用されることが意図される、本発明によるヌクレオチド配列は、DNAチップまたは高密度フィルターである支持体に、共有結合的にまたは非共有結合的に固定化できる。
【００７７】
「DNAチップ」または「高密度フィルター」という用語は、DNA配列の各々がその地理的位置によって正確に位置を特定され得るように結合された支持体を示すことを意図する。これらのチップまたはフィルターは、主にその大きさ、支持体の材料、および選択的に、それに結合している配列数が異なる。
【００７８】
特に、インサイチュー合成は、光化学アドレッシング（photochemical addressing）またはインクジェットにより行うことができる。その他の方法は、機械的もしくは電気的アドレッシングまたはインクジェットにより、エクスサイチュー（ex situ）合成を実施すること、およびプローブをDNAチップの支持体に結合させることにある。これらの種々の方法は当業者に周知である。
【００７９】
本発明の対象はまた、本発明によるポリペプチドまたは抗体を含む、タンパク質チップである。
【００８０】
このようなタンパク質チップにより、本発明によるポリペプチドと他のタンパク質または化合物間の相互作用を調べることが可能となり、従ってこのようなタンパク質チップは、本発明によるポリペプチドと相互作用する化合物のスクリーニングに有用である。
【００８１】
本発明によるタンパク質チップはまた、試験される患者血清中の、本発明によるポリペプチドに対する抗体の存在を検出するために使用できる。本発明による抗体を含むタンパク質チップはまた、今度は、抗体により認識され得る、患者血清中の、ポリペプチドの存在を検出するために使用することができる。
【００８２】
本発明の対象はまた、医薬品を調製するための、本発明によるヌクレオチド配列、ポリペプチド、ベクター、細胞または抗体より選択される化合物の使用である。
【００８３】
さらに具体的に標的とされる病的状況は、ウイルス性疾患、および腫瘍細胞の発達、またはアルツハイマー病もしくは精神分裂症のような細胞変性を特徴とする疾患である。従って、上記の医薬品はこれらの疾患の予防および／または治療に向けられる。特に、標的とされる疾患は癌である。
【００８４】
本発明の利点の1つは、腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシスおよび／またはウイルス耐性の現象に非常に多くのヌクレオチド配列が関与していることを証明したことである。従って、これら上記の過程の1つが発動される場合、これらの配列は示差的に発現する。故に、これらの過程のうち1つの誘発が疑われるか、またはこのような誘発がないことの検証が望まれる患者がいる場合、この患者由来の生物学的試料を用いて、本発明による1つもしくは複数の配列の発現を決定、または定量することさえできるのは有利である。選択的に、これらの配列の1つまたは複数の発現解析は、健常な個体の対応する発現の参照レベルとの比較を伴うことができる。
【００８５】
その結果として、本発明にはまた、試験される患者由来の生物学的試料を用いて、本発明の配列の少なくとも1つの発現解析を含む、ウイルス性疾患または腫瘍増殖もしくは細胞変性を特徴とする疾患の、診断および／または予後評価のための方法が含まれる。
【００８６】
好ましい態様に従えば、方法は以下の段階を含む：
試験される患者由来の生物学的試料から伝令RNAを単離する段階、
その伝令RNAから相補的なcDNAを調製する段階、
選択的に、本発明の配列の少なくとも1つに対応する相補的DNAの一部を増幅する段階、および
増幅された可能性のある相補的DNAを検出する段階。
【００８７】
特に、配列の発現解析は、上述のようにDNAチップを用いて行うことができる。
【００８８】
本発明の配列の中で、あるものは細胞表面で発現している受容体であるという特徴を持ち、かつ上述の過程と関連したその機構を理解するため、この受容体と相互作用することができる、即ち本発明によるポリペプチドと相互作用することができる化合物を探索することが有利である；その分泌タンパク質を提供することもまた必要である。これはまた、分泌タンパク質（その表面または細胞外にある）、ホルモン様タンパク質等に相当する、本発明によるポリペプチドにも適用される。故に、本発明の対象はまた、以下の段階を含む、本発明によるペプチドと結合できる化合物をスクリーニングするための方法である：
本発明によるポリペプチドまたは細胞を、候補化合物と接触させる段階、および
候補化合物とポリペプチドまたは細胞間の複合体形成を検出する段階。
【００８９】
化合物をスクリーニングするための方法はまた、本発明によるヌクレオチド配列、またはこれらの配列の発現もしくは制御に必要な配列とさえも、相互作用することができる化合物に対して有利であり得る。詳細には、化合物は問題の配列の発現を減少させる、阻害する、または反対に、増強する効果によって、配列と相互作用することができる。このような方法は、以下の段階を含む：
本発明によるヌクレオチド配列または細胞を、候補化合物と接触させる段階、および
候補化合物とヌクレオチド配列または細胞間の複合体形成を検出する段階。
【００９０】
従って上述の理由により、試験される患者由来の生物学的試料または標本において、本発明によるヌクレオチド配列の存在を探索および／またはアッセイすることが有利でありうる。このような検出および／またはアッセイ方法には、以下の段階が含まれる：
雑種形成に必要な条件下で、本発明による標識されたヌクレオチド配列を、試験される生物学的試料と接触させる段階、および
ヌクレオチド配列と生物学的試料中に存在する核酸間で形成される可能性のある雑種を、検出および／またはアッセイする段階。
【００９１】
この方法にはまた、本発明によるヌクレオチド配列より選択されるプライマーを用いて、生物学的試料の核酸を増幅するための段階が含まれていてもよい。
【００９２】
特に、本方法は上述のDNAチップを用いて行うことができる。
【００９３】
当業者はこのような方法を実施することができ、特に以下を含む試薬キットを使用することができる：
a）プローブとして使用される、本発明によるヌクレオチド配列、
b）プローブと生物学的試料の核酸間のハイブリダイゼーション反応を行うために必要な試薬、
c）プローブと生物学的試料の核酸間で形成される雑種を、検出および／またはアッセイするために必要な試薬。
【００９４】
このようなキットはまた、得られた結果の質を確実にするため、陽性または陰性対照を含んでもよい。
【００９５】
同様に本明細書では、本発明によるポリペプチドを検出および／またはアッセイすることを想定することもまた可能であり、従って本方法には以下の段階が含まれる：
生物学的試料を、本発明による標識抗体と接触させる段階、および
試料中に存在するポリペプチドの、抗体により形成される複合体を、検出および／またはアッセイする段階。
【００９６】
本方法は上述のタンパク質チップを用いて有利に行うことができる。この場合も同様に、当業者はこのような方法を実行することができ、かつ特に、以下を含む試薬キットを使用することができる：
a）本発明によるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；
b）選択的に、抗原／抗体反応に適した培地を構成するための試薬；
c）抗原／抗体複合体を検出するための試薬。
【００９７】
最後に、本発明の対象はまた、コンピュータ可読の媒体、または請求項1記載の少なくとも1つのヌクレオチド配列、および／もしくは請求項3もしくは4記載の少なくとも1つのポリペプチド配列が記録された、コンピュータ媒体である。特に、この媒体は以下を含む群より選択される：
a）ディスク、
b）ハードディスク、
c）ランダム・アクセス・メモリ（RAM）、
d）リード・オンリー・メモリー（ROM）、
e）CD-ROM。
【００９８】
本発明は本明細書に限定されるものではなく、一方、全ての変異体を包含し、かつ以下の実験データに鑑みて、より明確に理解されるものと思われる。
【００９９】
1-U937 および US4 細胞に関するデータ
上述で明らかなように、本発明は親細胞U937および「派生」細胞US4を使用する。実際に、US4細胞およびUS3細胞（この細胞は本明細書には関与しない）はある種の特徴を共有する。それらの細胞を得るための方法およびそれらの特性も以下に報告する。
【０１００】
US3 および US4 細胞の選択および特徴付け
U937細胞を単一クローン集団が得られるまで、2回連続して限界希釈にかけた。これらの細胞にH-1パルボウイルスを感染させた。ウイルスの細胞変性効果により大量の細胞が死滅し、連続培養して3ヶ月後、2つの耐性クローン、即ちUS3およびUS4が残った。細胞の生存は、再感染の4日後に測定される、H-1パルボウイルスを感染させた培養物中の生存細胞の、非処置培養物と比較した相対数として定義される。造腫瘍性の測定のため、U937、US3またはUS4細胞107個をscid/scidマウス（4週または5週齢）に皮下注射した。造腫瘍性はその注入後2ヶ月間に、マウスで発達した腫瘍数により表される。
【０１０１】
研究方法は下記の通りとした：悪性細胞のクローン集団から、造腫瘍性表現型の抑制を示すサブクローンを得た。H-1パルボウイルスによって為されたこの選択は、腫瘍細胞の消失（好ましくは死滅させる）により実現され、その一方で同時に正常細胞が残る。H-1パルボウイルスの細胞変性効果に対して、感受性のある腫瘍を除いた、耐性細胞の選択により、悪性表現型の減少した細胞を得ることができる。
【０１０２】
これに基づき、U937細胞のクローン集団が単離され、これらの細胞はH-1パルボウイルスの細胞変性効果に感受性であり、US3およびUS4クローンに関して、それらはウイルスに耐性である。パルボウイルスを感染させたscid/scidマウスの中で、親細胞U937では事例の80％において腫瘍が発達している一方、US3およびUS4クローンでは造腫瘍性表現型が強力に抑制される；107個の細胞を接種した20匹につき、US3細胞では腫瘍は一つのみ形成され、US4細胞では一つの腫瘍が発達する。その結果を下記の表に示す。
【０１０３】
H-1 パルボウイルスに対する耐性、ならびに U937 、 US3 および US4 細胞の造腫瘍性
2- 材料および方法
これは、形質転換されたU937およびUS4ヒト白血病細胞株の皮下注射により誘導された、SCIDマウスの皮下腫瘍の増殖を比較する段階を含む。
【０１０５】
A. 白血病細胞株および培養条件
U937（ATCC）およびUS4細胞株の全注入細胞は、2mM L-グルタミン、10％ウシ胎児血清およびゲンタマイシンを添加した、RPMI-1640培地を充填したフラスコ中で、細胞懸濁液の形態で提供された。
【０１０６】
U937細胞株は、びまん性組織球性リンパ腫の患者に由来する、CD4+ヒト単球細胞株である（1）。
【０１０７】
細胞は血球計算板で計数し、それらの生存を0.25％トリパンブルー色素排除で試験した。U937細胞およびUS4細胞に関する生存率は、それぞれ95.5％および90.5％であった。SCIDマウスに注入する前に、U937およびUS4細胞を遠心し、次いでRPMI培地に懸濁した。
【０１０８】
B. 動物
31週齢で体重20 gから25 gの、健康な雌SCIDマウス（CB17/IcrHsd）10匹は、Harlan France社（Gannat、France）より供給された。マウスは処理前に、特定病原体除去（SPF）の動物飼育設備である、本出願人が所属する特別施設で7日間観察された。動物飼育設備（INRA、Dijon、France）は、フランス農林研究大臣（the French Ministers for Agriculture and for Research）により認可されている（承認番号A21100）。動物実験は、動物実験倫理に関する欧州ガイドライン（2）、および実験的新生物における動物の福祉に関する英国ガイドライン（3）に従い、実施した。
【０１０９】
B.1. 環境
動物は、温度（24±1℃）、湿度（55±1％）、光周期（12時間明/12時間暗）および換気を伴う、制御条件下にある室内で管理した。動物をSPF条件下で管理し、かつ室内の温度および湿度を継続して監視した。換気装置は再循環なしで1時間あたり換気を14回行うようにプログラムされた。外部から入る新鮮な空気は、各室内に均一に拡散される前に、連続フィルターを通過する。マウスコロニー内への病原体の汚染または拡散を防ぐために、実験室内は高圧（2mm）に維持された。SPF条件下で働く全職員とも、動物飼育区域に立ち入る場合、衛生および衣類に配慮した特別なガイドラインに従う。
【０１１０】
B.2. 動物飼育
動物は、それらに飼料および水を供給するために装備されたポリカーボネートケージ（UAR、Epinay sur Orge、France）中に収容した。使用されたケージの標準的な大きさは、標準的な内部作業手順に従い、マウス10匹に対し637cm2である。動物用寝わらは無菌の経木（UAR）で構成され、これを1週間に2回交換する。
【０１１１】
B.3. 飼料および飲料
動物飼料はExtralabo社（Provins、France）から購入した。飼料は自由摂取とし、ケージ上の金属蓋に置いた。水も同様に、ゴム栓を装備した水瓶から自由摂取させた。水瓶は1週間に1回、洗浄、滅菌して交換した。供給水は、0.2μmの絶対フィルターでろ過滅菌した。
【０１１２】
B.4. 動物およびケージ識別
無作為配分後、動物は両耳に入墨された2つの異なる数字により識別した。各ケージを特定コードで標識した。
【０１１３】
C- 実験データおよび処置
C.1. SCID マウスへの腫瘍の導入
細胞の注入前に、SCIDマウスを1群につき5匹の割合で、無作為に2群に配分した。RPMI培地0.2ml中のUS4またはU937腫瘍細胞107個を、各注入の時点として0時間に、SCIDマウスに皮下接種した。各動物に、腫瘍細胞を異なる部位に4回注入した；1回は各脇腹および1回は各肩。
【０１１４】
C.2. 腫瘍回収
腫瘍が体積1500mm3に到達した時点で、マウスを屠殺してその腫瘍を回収し、体重を測定し、液体窒素で凍結し、-80℃に保管し、次いで明確に標識しておいた。
【０１１５】
C.3. マウスの管理
屠殺のための細胞注入の前に、動物を麻酔するためにイソフルレン・フォーレン（Minerve、Bondouble、France）を使用した。腫瘍細胞の注入後、そのマウスを5時間観察した。そのマウスの生存率、挙動および体重、ならびに皮下腫瘍の増殖を1週間に2回、記録した。
【０１１６】
実験の間、下記の兆候のうちの1つが現れた場合は、イソフルレンでの麻酔下で動物を頸椎脱臼により屠殺した：
苦痛の兆候（悪液質、衰弱、移動困難または摂食困難）、
体重の10％までの腫瘍増殖、
腫瘍性潰瘍および持続暴露（persistent exposure）、
移動および／または摂食を妨げる位置の腫瘍、
連続する3日間で20％の体重減少。
【０１１７】
転移の可能性または形態学的異常の存在を検出するため、各動物に対して剖検を実施した。
【０１１８】
D- データの提示
D.1. 生存パラメータ
中央値および平均生存時間に関する計算は、下記のように表される：
【０１１９】
平均生存時間＝S1/（S2 - NT）
ここで：
S1＝0日目から実験終了日までの一日の生存マウスの合計（「考慮に入れられない」＊生存マウス以外）
S2＝開始時の動物数
NT＝「考慮に入れられない」＊動物数
＊「考慮に入れられない」：これらは腫瘍の不完全移植の結果生じたと考えられる、規定限度よりも小さい腫瘍を有する動物である。
【０１２０】
D.2. 腫瘍阻害系
腫瘍の大きさはコンパスを用いて1週間に2回測定し、その腫瘍体積（mm3で）を次式により概算した：（長さ×幅2）/2 （4）。マウスの腫瘍の大きさが1500mm3に達した時に、実験を中止した。
屠殺後、腫瘍を切除し、重量を測定した。
US4およびU937群に関する腫瘍増殖曲線を、腫瘍体積の平均値を用いてグラフに示した。
US4およびU937群に関する腫瘍倍加時間は、増殖期間に、200％の平均腫瘍体積に達するまでの所要時間と定義した。
細胞注入から1回または2回の倍加時間（TD）に渡る特異的増殖期は、下記のように定義される：
特異的増殖期＝（TD US4 - TD U937）/TD U937
増殖期は同じ腫瘍の大きさに達するまでの、US4群およびU937群の増殖時間の中央値における相違として計算した。
【０１２１】
D.3. 統計的検査法
全統計解析はStatView（登録商標）ソフトウェア（Abacus concept、Berkeley、USA）を用いて行った。平均体重変化、腫瘍倍加時間、および到達時間「V」の統計解析は、ボンフェローニ/ダン（Bonferroni/Dunn）検定を用いて行った。0.05より小さいp値（p＜0.05）は有意であると考えた。全群を相互に比較した。
【０１２２】
E- 結果
腫瘍体積および平均体重曲線を図1および図2にそれぞれ示す。
【０１２３】
この2群に基づいて、SCIDマウスの有意な体重減少は、8日目から19日目の間に観察されなかった。
【０１２４】
平均の体重変化（19日目-8日目）および倍加時間に関して、有意差は観察されなかったのに対し、到達時間「V」に関しては、SCIDマウスの2群間で有意差が観察された。
【０１２５】
実施された剖検により、転移の存在または結節発達は示されなかった。腫瘍回収は麻酔および頸椎脱臼後、屠殺した動物について行った。腫瘍は直ぐにチューブに入れ、液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。切除された腫瘍は卵形であって、適度な粘度がありかつ色はピンクがかっていた。環境（皮膚および筋組織）と腫瘍との相互関係は限定的であり、かつ表面的であった。
【０１２６】
F- 結論
US4細胞株はU937細胞株と比較して、SCIDマウスで有意に低い定着率を示した。
【０１２７】
US4およびU937腫瘍間の増殖の遅延は23.5日であり、その倍加速度は同等であった。
【０１２８】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】SCIDマウスにおける、U937およびUS4群に対する腫瘍増殖曲線を表す。
【図２】U937またはUS4腫瘍を持つマウスの体重曲線を表す。
Claims (30)
- 以下を含む群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド配列：
a）配列番号：1から配列番号：2280、
b）a）に定義される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列、
c）a）またはb）に定義される配列と、最適アライメント後に少なくとも80％の同一性の割合を有するヌクレオチド配列、
d）a）またはb）に定義される配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、および
e）a）、b）、c）またはd）に定義される配列に対応する、相補的なヌクレオチド配列またはRNA配列。 - 発現が腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシスおよび／またはウイルス耐性の際に関与することを特徴とする、請求項1記載のヌクレオチド配列。
- 請求項1記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
- 以下より選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項3記載のポリペプチド：
a）請求項3記載のポリペプチド、
b）a）に定義されるポリペプチドと少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド、
c）a）またはb）に定義されるポリペプチドの少なくとも5個の連続するアミノ酸の断片、
d）a）、b）またはc）に定義されるポリペプチドの生物学的に活性な断片、および
e）a）、b）、c）またはd）に定義されるポリペプチドの改変されたポリペプチド。 - 請求項1記載のヌクレオチド配列、または請求項3もしくは4記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、クローニングおよび／または細胞発現ベクター。
- アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスより選択されるウイルスベクターであることを特徴とする、請求項5記載のベクター。
- 裸の核酸ベクターであることを特徴とする、請求項5記載のベクター。
- 組織特異的なターゲティングおよび／または発現のための配列を含むことを特徴とする、請求項5から7のいずれか一項記載のベクター。
- 請求項5から8のいずれか一項記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
- 請求項9記載の細胞を含むことを特徴とする、動物、好ましくはヒトを除く哺乳類。
- 請求項3または4記載のポリペプチドを特異的に認識できることを特徴とする、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、この抗体の断片、またはキメラ抗体。
- 核酸配列を検出、同定、アッセイおよび／または増幅するためのプローブまたはプライマーとしての、請求項1記載のヌクレオチド配列の使用。
- センスまたはアンチセンスヌクレオチドとしての、請求項1記載のヌクレオチド配列の、インビトロにおける使用。
- 組換え型ポリペプチドを産生するための、請求項1記載のヌクレオチド配列の使用。
- 請求項9記載の細胞がポリペプチドの発現を可能とする条件下で使用されること、および組換え型ポリペプチドが回収されることを特徴とする、組換え型ポリペプチドを得るための方法。
- 請求項1記載のヌクレオチド配列を少なくとも1つ含むことを特徴とする、DNAチップ。
- 請求項3もしくは4記載のポリペプチドまたは請求項11記載の抗体を含むことを特徴とする、タンパク質チップ。
- 医薬品を調製するための、以下より選択される化合物の使用：
a）請求項1記載のヌクレオチド配列、
b）請求項3または4記載のポリペプチド、
c）請求項5から8のいずれか一項記載のベクター、
d）請求項9記載の細胞、
e）請求項11記載の抗体。 - 医薬品がウイルス性疾患または腫瘍細胞の発達もしくは細胞変性を特徴とする疾患の、予防および／または治療を目的とすることを特徴とする、請求項18記載の使用。
- 疾患が癌であることを特徴とする、請求項19記載の使用。
- 試験される患者由来の生物学的試料を用いる、配列番号：1から配列番号：2280より選択される少なくとも1つの配列の発現解析を含む、ウイルス性疾患または腫瘍発達もしくは細胞変性を特徴とする疾患の、診断および／または予後評価のための方法。
- 以下の段階を含む、請求項21記載の診断および／または予後評価のための方法：
試験される患者由来の生物学的試料から、伝令RNAを単離する段階、
該伝令RNAからその相補的DNAを調製する段階、
選択的に、配列番号：1から配列番号：2280より選択される少なくとも1つの配列に対応する、相補的DNAの一部を増幅する段階、
増幅された可能性のある相補的DNAを検出する段階。 - 請求項16記載のDNAチップを用いて配列の発現解析を行う、請求項22記載の診断および／または予後評価のための方法。
- 以下の段階を含むことを特徴とする、請求項1記載のヌクレオチド配列と相互作用することができる化合物をスクリーニングするための方法：
請求項1記載のヌクレオチド配列または請求項9記載の細胞を、候補化合物と接触させる段階、および
該候補化合物と該ヌクレオチド配列または該細胞間の複合体形成を検出する段階。 - 以下の段階を含むことを特徴とする、請求項3または4記載のポリペプチドに結合することができる化合物をスクリーニングするための方法：
請求項3もしくは4記載のポリペプチドまたは請求項9記載の細胞を、候補化合物と接触させる段階、および
該候補化合物と該ポリペプチドまたは該細胞間の複合体形成を検出する段階。 - 以下の段階を含むことを特徴とする、生物学的試料中の、請求項1記載のヌクレオチド配列を検出および／またはアッセイするための方法：
雑種形成に必要な条件下で、請求項1記載の標識されたヌクレオチド配列を、試験される生物学的試料と接触させる段階、
該ヌクレオチド配列と該生物学的試料中に存在する核酸間で形成される可能性のある雑種を、検出するおよび／またはアッセイする段階。 - 請求項1に定義されるヌクレオチド配列より選択されるプライマーを用いて、生物学的試料の核酸を増幅するための段階を含むことを特徴とする、請求項26記載の検出および／またはアッセイ方法。
- 請求項16記載のDNAチップを用いて行われることを特徴とする、請求項26または27記載の検出および／またはアッセイ方法。
- 以下の段階を含むことを特徴とする、生物学的試料中の、請求項3または4に定義されるポリペプチドを、検出および／またはアッセイするための方法：
生物学的試料を請求項11に定義される標識された抗体と接触させる段階、
該抗体と該試料中に存在するポリペプチド間で形成された複合体を、検出および／またはアッセイする段階。 - 請求項17に定義されるタンパク質チップを用いて行われることを特徴とする、請求項29記載のポリペプチドを検出および／またはアッセイするための方法。
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