JP2004536615A - 抗原提示細胞、その調製方法およびその癌ワクチンのための使用 - Google Patents
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- C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
-
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- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
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- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Abstract
Description
【0001】
本発明は医学分野、特にヒトまたは動物の対象の治療方法に有用な製品、物質および組成物に関し、より具体的には癌の診断、治療、および予防に関する。本発明は、癌ワクチンおよびその調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
種々のヒストタイプ(histotype)の形質転換細胞によって構成的に発現される数々の腫瘍関連抗原(TAA)が近年同定されている(Renkvist N. et al. Cancer Immunol. Immunother. 50: 3-15、2001)。
【0003】
これらTAAの多くは、特定のHLAクラスI同種特異体(allospecifities)に関してCD8+細胞障害性Tリンパ球(CTL)によって認識される複数の免疫優性抗原ペプチドを提供し得る(Renkvist N. et al. Cancer Immunol. Immunother. 50: 3-15、2001);さらに選択されたTAA、例えば、MAGE(Jager E. et al.、J. Exp. Med. 、187 :265-270、1998)、NY−ESO−1(Jager E. et al.、J. Exp. Med. 、187 : 265- 270、1998)、SSX(Tureci O, et al. Cancer Res; 56 (20) : 4766-72 1996)、チロシナーゼ(Topalian S. L. et al.、J. Exp. Med. 、183 : 1965-1971、1996.)、Melan−A/MART−1(Zarour H. M. et al. Proc. Natl. Acad. Ssi. USA、97 : 400-405,2000)は、特定のHLAクラスII同種特異体に関して同時にCD4+Tリンパ球によって認識されるエピトープを含み、したがって、TAA−特異的(directed)体液性免疫応答を誘導することができる(Wang R. F. 、Trends Immunol.、22 : 269-276、2001)。
【0004】
治療標的として主要な役割を果たす様々なクラスのTAAが同定されている:
i)癌−精巣抗原(CTA)、これは様々な組織の腫瘍で発現するが、精巣および胎盤を除く正常組織では発現せず、例えば、MAGE、GAGE、SSX SART−1、BAGE、NY−ESO−1、XAGE−1、TRAG−3およびSAGEが挙げられ、これらのなかには複数のファミリーを表すものもある(Traversari C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999);
ii)分化−特異的抗原、これは正常および腫瘍性メラニン細胞で発現し、例えば、チロシナーゼ、Melan−A/MART−1、gp100/Pmell7、TRP−1/gp75、TRP−2が挙げられる(Traversari C.、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999);
iii)様々な組織の悪性腫瘍組織に過剰発現するが、その良性の対応物にも存在する抗原、例えば、PRAME(Ikeda H. et al., Immunity、6 : 199-208, 1997)、HER−2/neu(Traversari C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999)、CEA、MUC−1(Monges G. M. et al., Am. J. Clin Pathol.、112 : 635-640、1999)、アルファ−フェトプロテイン(Meng W. S. et al., Mol. Immunol.、37 : 943-950、2001)が挙げられる;
iv)偏在的に発現するタンパク質をコードする遺伝子の点突然変異に由来する抗原、例えば、MUM−1、β−カテニン、HLA−A2、CDK4およびカスパーゼ8が挙げられる(Traversati C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999);
v)ウイルス抗原(Traversari C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、 1999)。
【0005】
TAAに加えて、有効な免疫原性および効率的な宿主Tリンパ球による認識に重要な細胞要素には、HLAクラスIおよびHLAクラスII抗原、および同時刺激/アクセサリー分子が含まれる(例えば、CD40、CD54、CD58、CD80、CD81)(Fleuren G. J. et al.、Immunol. Rev.、145 : 91-122、1995)。
【0006】
既知のクラスのTAAのなかで、CTAは、癌患者の特に好適な有効な特異的免疫療法の治療標的である。というのはそれらの正常組織における発現は限られており、それらの生体対象、特にヒトを含む哺乳類におけるインビボ免疫原性が知られているからである(Jager E. et al., J. Exp. Med., 187: 265- 270、1998 ; Rejnolds S. R. et al., Int. J. Cancer、72 : 972-976、1997)。
【0007】
しかし、異なる患者の腫瘍性病変での特異的CTAの不均一な発現により、その生物学的適格性は、CTA−特異的治療用ワクチン接種に制限される。実際、特定の癌患者の悪性腫瘍病変はしばしば選択されたCTAのみ発現することがあり得(Sahin U. et al., Clin. Cancer Res. 、6 : 3916-3922、2000)、さらに下方制御された(Lethz B. et al., Melanoma Res., 7 : S83- S88、1997)および/または不均一な(dos Santos N. R. et al., Cancer Res., 60 : 1654-1662、2000)特異的CTAの個々の腫瘍性病変における発現も報告されている(Jungbluth A. A. et al., Br. J. Cancer、83 : 493-497、2000)。これらの現象はインビボで別々にまたは同時に起こりうるが、おそらく疾患が進行しやすい悪性腫瘍細胞の免疫原性が構成的に乏しいことに寄与している可能性があり(Speiser D. E et al., J. Exp. Med. 、186 : 645-653、1997)、また、特異的CTAに対する免疫療法の過程におけるCTA−陰性クローンの出現により、腫瘍性細胞のインビボ免疫選択が起こりうる。したがって、単一のCTAの特定の免疫原性エピトープを免疫学的標的とする免疫療法アプローチは、標的CTAのその腫瘍性病変における発現が無いことまたは下方制御されていることにより、多くの癌患者には適用することができない;さらに、インビボで単一のCTAを免疫学的標的とすることは、治療により誘導/増幅されたCTA−特異的免疫応答を効率的に回避するCTA−欠損腫瘍変異体を生み出す可能性がある。単一のCTAを標的とする治療アプローチのさらなる限界は、その不均一な病変内での発現に由来し( Schultz-Thater E. et al., Br. J. Cancer、83 : 204-208,2000)、さらに、特異的HLAクラスIまたはHLAクラスII同種特異体による単一のCTAの特定の免疫原性エピトープの提示により、特定の規定されたHLA表現型を有する患者の治療のみしか可能とならない。
【0008】
こういった限界を部分的に避けるため、最近の治療戦略では1まはた複数のCTAの2以上の免疫原性エピトープか、またはCTAタンパク質全体をワクチン接種剤として利用する(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M.and Belardelli F. 、Rome-Italy、November 15-16、1999 ; http://www. cancerresearch.org)。
【0009】
したがって、当該技術分野の現状の欠点、特に免疫原性が弱いことおよびインビボ免疫選択を克服できる癌ワクチンが強く求められており、多数の癌患者に対する癌ワクチンであって、特定の単一の標的とされたCTAまたはTAAに制限されないものの実用可能性が望まれている。この点で、求められる癌ワクチンは、選択されたHLAクラスIおよび/またはHLAクラスII抗原に「拘束」されないのもである。
【0010】
最近のインビトロでの証拠により、今までに知られているもののなかで調査されたすべてのCTA遺伝子の発現が、DNA低メチル化剤に曝された後、様々な組織の腫瘍性細胞において誘導または上方制御されることが示された(dos Santos N. R. et al., Cancer Res., 60: 1654-1662、2000 ; Weber J. et al, Cancer Res.、54 : 1766-1771、1994)。CTA誘導は持続的であり、治療後数週間検出可能であることが見出された。これらの知見は、CTAが総合的にDNAメチル化により制御されるTAAのクラスに属することを支持する。さらに、DNA低メチル化剤による腫瘍性細胞の処理は、そのHLAクラスI抗原の発現および調査したHLAクラスI同種特異体の同時かつ持続的な上方制御を誘導し、そして同時刺激/アクセサリー分子であるCD54およびCD58の発現を上方制御した(Coral S. et al., J. Immunother.、22: 16-24、1999)。
【0011】
有望な治療的側面であるにもかかわらず、CTAは多くの欠点を示す。例えば、今までに調査された特定のCTAは特定の腫瘍性病変の間で不均一な発現を示し、CTA−陽性悪性腫瘍細胞とCTA−陰性悪性腫瘍細胞が共存する;また、今までに同定されたもののなかで選択されたCTAのみが、特定の腫瘍性病変において、その組織学的起源とは独立に発現し得る;腫瘍性細胞上の特異的CTAの発現の閾値が、CTA−特異的CTLによる認識のために必要とされ、特異的CTAに対するワクチン接種には、患者の適当なHLAクラスI表現型が要求され、選択されたCTAにはまた、患者の適当なHLAクラスII表現型が要求される。
【0012】
その特有の生物学的特徴のために、選択されたCTAは、様々な組織の悪性腫瘍疾患を患う患者におけるCTA−特異的免疫応答を誘導または増強する目的の様々な臨床的試みに用いられている。臨床での治療的CTAのインビボ投与のため、あるいは前臨床段階でのより強力なワクチン接種手段を作成するために、現在、当業者に知られている様々な戦略が用いられている(dos Santos N. R. et al., Cancer Res.、60: 1654-1662、2000; Weber J. et al.、Cancer Res. 、54 : 1766-1771、1994)。注目すべきことに、主に数々の技術的および実践的制限により、限られた数の特異的CTAの免疫原性エピトープのみ、あるいは単一の全CTAタンパク質のみが現在治療目的で臨床で利用されているにすぎない。
【0013】
以下は、すでに利用されているかあるいは今までに提案されている、CTAを癌患者に投与するための主な戦略を含むリストである;いままでに知られているTAAのその他のクラスに属するTAAを患者に投与するのにも同一の戦略が利用されており、また、様々なアジュバントおよび/またはキャリアを用いて治療薬の免疫原性を増強させることがあることに注意されたい。
【0014】
CD8+T細胞によって認識される単一または複数のCTAの1または複数の免疫原性エピトープを提示する、合成ペプチド(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. and Belardelli F.、Rome- Italy、November 15-16、1999 ; http ://www. cancerresearch. org)。
単一または複数のCTAの1または複数の免疫原性エピトープを提示する、リポソームに封入された合成ペプチド(Steller M. A. et al., Clin. Cancer Res.、4: 2103-2109、1998)。
単一のCTAの全体の合成タンパク質(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. and Belardelli F. 、Rome-Italy、November 15-16、1999; http ://www. cancerresearch. org)。
CD8+T細胞によって認識される単一または複数のCTAのエピトープを発現する組換えウイルスベクター(Jenne L. et al.、Trends Immunol.、22 : 102-107、2001)。
裸の(Naked)DNAシューティング(Park J. H. et al., Mol. Cells、9 : 384-391、 1999)。
CD8+T細胞によって認識される単一または複数のCTAのエピトープを提示する合成ペプチドを生体外で与えられた自己PBMC/マクロファージ(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. and Belardelzi F.、Rome-Italy、November 15-16, 1999 ; http ://www. cancerresearch. org)。
CD8+T細胞によって認識される単一または複数のCTAのエピトープを提示する合成ペプチドまたは単一のCTAの全合成タンパク質または全腫瘍細胞調製物を生体外で与えられた自己樹状細胞(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. And Belardelli F. 、Rome- Italy、November 15-16、1999 ; http ://www. cancerresearch. org; Jenne L. et al.、Trends Immunol.、22 : 102-107、2001)。
全長CTAを発現するようにDNA/RNAを生体外で形質移入または形質導入されたか、あるいは全腫瘍細胞に融合された自己樹状細胞(Jenne L. et al.、Trends Immunol.、22: 102-107、2001);
全長CTAを発現するようにDNA/RNAを生体外で形質移入または形質導入された自己Tリンパ球。
【0015】
本発明の主な目的である自己癌ワクチンに関しては、数多くの特許文献が引用される。国際特許出願第WO99/42128号には、適切な治療の選択および/または腫瘍の進行のモニタリングのための、固形腫瘍のHLA転写または発現プロフィールの測定方法が開示されている。この文献の目的はHLA−Gのいくつかのアイソフォームを阻害して自然の抗腫瘍応答を増加させることである。該方法は腫瘍サンプルから細胞を抽出し、それを溶解し、溶解物をHLAクラスI抗原に対する抗体と反応させることを含む。
【0016】
ドイツ国特許第29913522号には、腫瘍細胞の表面をそのままにしたまま腫瘍細胞を殺すか損傷を与えるために、患者から抽出した腫瘍細胞を200−9000バールの圧力にかけ、そして細胞を患者に再注入することによる癌ワクチンの調製装置が提供されている。
【0017】
国際特許出願第WO00/02581号には、発癌遺伝子または突然変異腫瘍抑制タンパク質あるいはペプチドに対するT細胞応答を誘導することができるテロメラーゼタンパク質またはペプチドが開示されている。該ペプチドは癌ワクチンに有用である。
【0018】
国際特許出願第WO00/18933号には、機能的に不活性な、改変された抗原の発現を引き起こすDNAコンストラクトが開示されており、該抗原はDNA、RNAの転写および翻訳の効率または抗原ペプチドの生成に関しては変化していないものである。癌を患う患者は改変されたヒト癌関連抗原、特にPSMA抗原をコードするRNAまたはプラスミドDNAの投与によって治療される。別の態様において、インビトロで該RNAまたはプラスミドDNAに曝された自己樹状細胞がワクチンとして用いられる。
【0019】
国際特許出願第WO00/20581号には、新たに単離されたMAGE−A3ヒト白血球抗原(HLA)クラスII−結合ペプチドを含む癌ワクチンが開示されている。該ペプチドを用いてTリンパ球の集団を選択的に濃縮して該ペプチドに特異的なCD4+Tリンパ球を得ることができる。該濃縮されたリンパ球は癌ワクチンとしても利用できる。
【0020】
国際特許出願第WO00/25813号には、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合する普遍的な腫瘍関連抗原(TAA)が開示されている。治療方法は、該TAAをコードする核酸分子を投与する工程を含み、TAAは抗原提示細胞によってプロセシングされ、抗原提示細胞は細胞障害性リンパ球を活性化し、TAAを発現する細胞は殺される。特異的hTERTペプチド以外に、様々なTAAの同定が複雑なコンピュータ化された方法により可能となり、コンピュータにより設計されたペプチドの合成および該ペプチドの有効性の確認のための生物学的アッセイが可能となる。
【0021】
国際特許出願第WO00/26249号には、ヒトWT−1タンパク質またはヒトgata−1タンパク質の断片が開示されている。これらのペプチド断片は細胞障害性Tリンパ球(CTL)の活性化を介して癌ワクチンとして用いられる。
【0022】
米国特許第6077519号には、腫瘍組織からの酸によるエピトープの溶出により回収されたT細胞エピトープの組成物を含む癌ワクチンが提供されている。
【0023】
国際特許出願第WO00/46352号には、機能性のCD86分子を発現するヒトTリンパ球を含む癌ワクチンが提供されている。Tリンパ球はT細胞を少なくとも2回の連続刺激に曝すことによって得られ、各刺激は少なくとも1つのアクチベーター(抗体、抗CD2、3または28)およびT細胞増殖を刺激するサイトカイン(インターロイキン)を含む。
【0024】
Coral S. et al. Journal of Immunotherapy 22 (1) : 16-24,1999には、黒色腫細胞の免疫原性能力およびその宿主細胞障害性細胞による認識が、ヒト白血球抗原(HLA)クラスI抗原、同時刺激分子および腫瘍性細胞上の黒色腫関連抗原(MAA)の発現の存否とレベルに依存することが教示されている。5−AZA−CdRの活動性および/または受動性のヒト黒色腫のためのその全身投与による特異的免疫療法における使用が、細胞障害性細胞による黒色腫細胞認識を促進することが示唆される。
【0025】
Momparler、Anticancer Drugs Apr ; 8 (4) : 358-68、1997は、化学療法剤としての5−AZA−CdRについて言及している。
【0026】
Shichijo S. et al Jpn. J. Cancer Res. 87、751-756、July 1996は、脱メチル剤5−AZA−CdRが正常および悪性腫瘍リンパ球においてMAGE1、2、3および6を誘導するか否かを調査し、細胞におけるそれらの発現機構をより明かにした。著者らは試験した選択されたサンプルにおける調査したCTAの誘導を示し、すべての場合において脱メチル反応がMAGE遺伝子の誘導のために十分な刺激であるわけではないと論じ、その結果細胞におけるMAGE遺伝子の発現機構がより明らかになった。治療上の見通しに付いての示唆は無かった。
(発明の概要)
【0027】
このたび新たに抗原提示細胞の作成方法が見出された。該方法は以下の工程を含む。
a)該細胞を対象から収集する工程、
b)該収集した細胞を活性化させる工程;
c)該活性化した細胞を生体外で培養および所望により増加させる工程;
d)該培養および所望により増加させた細胞をDNA低メチル化剤で処理して該細胞から同時に複数の腫瘍関連抗原を発現させる工程。
【0028】
本発明の方法によって得られる細胞およびその細胞成分は、単独でまたは該細胞と組合せて、該細胞において発現される複数の腫瘍関連抗原の1または複数を構成的に発現する様々なヒストタイプの悪性腫瘍の予防および治療、特に哺乳類、ヒトの予防および治療に有用である。
【0029】
本発明の以下の記載において、該細胞をADHAPI−細胞と略称する。
もっとも便宜的には、本方法により得られる細胞は癌ワクチンの形態で用いられる。
以下の記載において、本発明を実施例と図面によってより詳細に開示する。図面において:
【0030】
図1は、ADHAPI−細胞/B−EBVまたは対照B−EBV細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
図2は、ADHAPI−細胞/PWM−Bまたは対照PWM−B細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
図3は、ADHAPI−細胞/CD40L−Bまたは対照CD40L−B細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
図4は、ADHAPI−細胞/PWM−PBMCまたは対照PWM−PBMC細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
図5は、ADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMCによって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
図6は、ADHAPI−細胞/PHA−+PWM−PBMCまたは対照PHA−+PWM−PBMC(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
(発明の詳細な開示)
【0031】
本発明によると、抗原提示細胞を作成するために処理される細胞のタイプに実質的に制限はないが、ただし、低メチル化剤によって好適に活性化および処理されるものである。
【0032】
本発明によると、対象から収集される細胞は、具体的には哺乳類、より好ましくはヒトである。本発明の可能な態様において、該ヒトは癌患者である。
【0033】
本発明の第1の好適な態様によると、本方法により得られる抗原提示細胞は免疫細胞である。
【0034】
本発明の第2の好適な態様において、本方法により得られる抗原提示細胞は非免疫細胞である。
【0035】
本発明により得られる細胞は共有(shared)免疫優性癌抗原を発現してもよく、共有非免疫優性癌抗原を発現してもよい。
【0036】
本発明の特定の態様において、本方法に好適な細胞は以下のものである:
エプスタイン・バーウイルスで不死化され、DNA低メチル化剤で処理されたB−リンパ芽球腫細胞系。これは疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の末梢血単核細胞(PBMC)から作成したものである(ADHAPI−細胞/B−EBV)。
ヤマゴボウマイトジェン(PWM)で活性化され、DNA低メチル化剤で処理されたB−リンパ球。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のPBMCから精製したB−リンパ球から作成したものである(ADHAPI−細胞/PWM−B)。
CD40で活性化され、DNA低メチル化剤で処理されたB−リンパ球。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のPBMCから精製したB−リンパ球から作成したものである(ADHAPI−細胞/CD40−B)。
ヤマゴボウマイトジェン(PWM)で活性化され、DNA低メチル化剤で処理されたPBMC。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の精製PBMCから作成した(ADHAPI−細胞/PWM−PBMC)。
フィトヘマグルチニン(PHA)+組換えヒトインターロイキン−2(rhIL−2)で活性化され、DNA低メチル化剤で処理されたPBMC。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の精製PBMCから作成した(ADHAPI−細胞/PHA−rhIL2−PBMC)。
フィトヘマグルチニン(PHA)+組換えヒトインターロイキン−2(rhIL−2)+ヤマゴボウマイトジェン(PWM)で活性化され、DNA低メチル化剤で処理されたPBMC。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の精製PBMCから作成した(ADHAPI−細胞/PHA−rhIL2−PWM−PBMC)。
樹状細胞、単球、マクロファージ。
CD34+細胞、線維芽細胞、幹細胞、線維芽細胞および角化細胞。
【0037】
本発明の方法によって得られる細胞は、免疫優性であれ非免疫優性であれ、1または複数の癌抗原を構成的に発現する様々なヒストタイプの悪性腫瘍の予防薬および治療薬としての使用に好適である。
【0038】
本発明の別の可能な態様は、ワクチン接種する細胞の直接の抗原提示能力の利用が望ましくないか必要でない場合に適用できる。この場合、本発明の方法により得られるワクチン接種する細胞またはその細胞成分はワクチン接種される患者に対してプールされた癌抗原の「貯蔵所」として利用できる。
【0039】
本発明の好適な態様において、選択されたTAAはCTAである。
【0040】
本発明のこの態様は当業者に以下の利点を提供する。
CTAは免疫原性である。というのはそれらはHLAクラスI−拘束CTA−特異的CD8+CTLによって認識されるエピトープを含むからである。
CTAは免疫原性である。というのはそれらはHLAクラスII−拘束CTA−特異的CD4+Tリンパ球によって認識されるエピトープを含むからである。
選択されたCTAは同時にHLAクラスIおよびHLAクラスII抗原によって提示されるエピトープを含む。したがって、選択されたCTAはCD8+CTLおよびCD4+Tリンパ球反応を同時に誘導できる。
CTAは精巣と胎盤を除き、良性の組織では発現しない。
異なるCTAが固形および造血性悪性腫瘍の腫瘍性細胞に同時に発現し得、形質転換細胞に同時発現している複数の治療標的を提供し得る。
特定のCTAは、所与の患者の同時のおよび逐次の転移性病変に均一に発現する。
特定のCTAは、異なる組織起源の悪性腫瘍組織に発現し得、その特異的ヒストタイプに関わらずヒト腫瘍症に共有される共通の治療標的を提供する。
特定のCTAは、様々なHLAクラスIおよびHLAクラスII同種特異体において提示される複数の免疫原性ペプチドをコードし得る。
【0041】
本発明のさらなる態様において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤がDNA低メチル化剤と協同してCTA、HLA抗原、および様々な組織の腫瘍性細胞の同時刺激/アクセサリー分子の発現を誘導/上方制御し得る。実際、DNAメチル化およびヒストン脱アセチル化は、癌における後成的なジーンサイレンシングの相乗作用の層として作用し(Fuks F. et al., Nat. Genet.、24 : 88-91、2000)、腫瘍抑制機能を有する選択された過剰メチル化遺伝子の強い再活性化が、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤での処理後、最初の最小限のDNA脱メチル反応に続いて結腸直腸癌細胞において観察された(Cameron E. E. et al., Nat. Genet.、21 : 103-107、1999)。
【0042】
本発明による方法における活性化工程は、一般的知識にしたがって行われ、いかなる場合もCurrent Protocols in Immunology、Coligan J. E. et al Eds、Wileyを参照すればよい。
【0043】
本発明による方法における脱メチル反応処理は、一般的に周知であり、文献に一般的手順が記載されている。さらなる詳細な情報についてはSantini V. et al., Ann. Intern. Med. 、134 : 573-586, 2001を参照されたい。
【0044】
本発明の目的に有用な当該技術分野で脱メチル剤としても知られている低メチル化剤は、当該技術分野で周知である。DNA脱メチル剤は文献に広く開示されている。例えば、国際特許出願第WO01/29235号、米国特許第5851773号を参照されたい。好適なDNA脱メチル剤は5−アザ−シチジンであり、より好適には、5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AZA−CdR)である。
【0045】
本発明による抗原提示細胞は癌ワクチンの調製に好適である。本発明の好適な態様において、該ワクチンは自己ワクチンである。
【0046】
本発明の別の好適な態様において、該ワクチンは同種(allogeneic)ワクチンである。この態様において、本発明の方法により得られる細胞は、それが細胞であれ、その細胞成分であれ、抗原提示細胞として、そして、プールされた癌抗原の「貯蔵所」の形態として利用できる。
【0047】
本発明のさらに好適な別の態様において、細胞および/または細胞成分は、エフェクター免疫細胞の作成方法に利用できる。該エフェクター免疫細胞は周知の養子免疫治療において有用な産物の調製に利用される。本発明のさらなる態様において、ここに記載するワクチンは、例えばデシタビンなどの低メチル化剤による癌患者の全身的前処理と組合せて用いることができる。この態様は例えば、本発明のワクチンと例えばデシタビンなどの低メチル化剤の全身投与に好適な医薬組成物とを含むキットなどの製品を用いて行なうことができる。
【0048】
ワクチンは当業者に周知の技術によって、一般的知識によって調製することができる。例えば、本明細書において言及した特許文献は癌ワクチンの調製について十分開示している。例えば、国際特許出願第WO00/25813号または第WO00/46352号を参照されたい。
【0049】
当業者であれば、特に投与プロトコールに関して、本発明によるワクチンを使用するための好適な方法を簡単に確立できるであろう。
【0050】
以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例1】
【0051】
ADHAPI−細胞/B−EBV
PBMC精製
PBMCは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から標準的フィコール−ハイパック(Ficoll-Hypaque)密度勾配遠心分離によって精製した。
【0052】
エプスタイン・バーウイルス(EBV)によるPBMCの不死化による自己B−リンパ芽球腫細胞系の作成
B−EBV+リンパ芽球腫細胞系は、B95.8マーモセット細胞系からの上清とともに、PBMCを、37℃、5%CO2加湿雰囲気で、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(またはヒトAB血清)および2mM L−グルタミンを追加したRPMI1640培地中でインキュベートすることによって作成した。
【0053】
ADHAPI−細胞/B−EBVおよび対照B−EBV細胞の作成
B−EBV+リンパ芽球腫細胞系(7.5x105細胞/ml)を10%熱不活性化ウシ胎仔血清(または10%熱不活性化ヒトAB血清)および2mM L−グルタミンを追加したRPMI1640培地中で37℃、5%CO2加湿雰囲気で培養し、12時間ごとに4回、1μMの5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AZA−CdR)によるパルス刺激を与えた;次いで培地の半分を新鮮な培地で交換し、培養をさらに48時間続けた。次いで細胞を実験手順に使用および/または生存条件下で凍結した。対照細胞(B−EBV細胞)を同様の実験条件下で培養したが、5−AZA−CdRによるパルス刺激は与えなかった。
【0054】
ADHAPI−細胞/B−EBVおよび対照B−EBV−細胞の最終的な収集
この結果に付いては表1を参照されたい。
【0055】
自己混合リンパ球反応(aMLR)およびMLR
ADHAPI−細胞/B−EBVおよび対照B−EBV細胞(刺激細胞=S)を収集し、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、x−線で処理した(75Gy)。aMLRおよびMLRのために、スカラー濃度(1x106細胞/mlから6x104細胞/ml)のADHAPI−細胞/B−EBVまたは対照B−EBV細胞を、熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地中の自己または同種PBMC(1x106細胞/ml)(反応細胞=R)に添加した。そして96ウェルU底プレートに最終容積が200μl/ウェルとなるように播いた。37℃、5%CO2加湿雰囲気での24時間のインキュベーションの後、100μlの培養上清を収集し、すぐに−80℃でサイトカインアッセイに使用するまで保存した。次いで100μlの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養をさらに5日間続けた後、培養物に3H−TDR(1μLCi/ウェル)でO/Nパルス刺激を与えた。次いでプレートを回収しR細胞による3H−TDR取りこみをβ−カウンターによって測定した。
【0056】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/B−EBVまたは対照B−EBV細胞(S)によって刺激された自己PBMC(R)の増殖
図1を参照されたい。
【0057】
ADHAPI−細胞/B−EBVおよび対照B−EBV細胞の表現型の特性
結果については表2を参照されたい。
【0058】
ADHAPI−細胞/B−EBVおよび対照B−EBV細胞によって発現されるCTAのRT−PCR分析
調査する細胞上のCTA発現を評価するために用いた実験条件およびプライマーは以下の通りである:
MAGE−1、−2、−3、−4については、Brasseur、F. 、et al. Int. J. Cancer 63: 375- 380、1995 ;GAGE1−6については、Van den Eynde、B. 、et al. J. Exp. Med. 182 : 689-698、1995 ; NY−ESO−1については、 Stockert、E. et al. J. Exp. Med. 187 : 265- 270、1998 ;SSX−2については; Sahin、U. 、et al. Clin. Cancer Res. 6 : 3916- 3922、2000。
【0059】
【化1】
【0060】
a陽性/被験;NT、試験せず。
【0061】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/B−EBVまたは対照B−EBV細胞(S)によって刺激されたPBMC(R)によって放出されたIFN−γのELISA評価
結果については表3を参照されたい。
【実施例2】
【0062】
ADHAPI−細胞/PWM−B
B−リンパ球精製
PBMCを疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から標準的フィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製し、精製したBリンパ球をノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球を用いた常套のEロゼット形成技術によって得た。
【0063】
PWM−活性化B細胞の作成
精製B−リンパ球(1.5x106細胞/ml)にPWM(3μg/ml)を添加し、37℃で48時間、5%CO2加湿雰囲気下で、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μG/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地で培養した。
【0064】
ADHAPI−細胞/PWM−Bおよび対照PWM−B細胞の作成
PWM−活性化B−リンパ球に12時間ごとに1μMの5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AZA−CdR)で4回パルス刺激を与えた;次いで培地の半分を新鮮な培地で交換し、さらに48時間培養を続けた。次に細胞を実験手順に使用および/または生存条件下で凍結した。対照細胞(PWM−B)を同様の実験条件下で培養したが5−AZA−CdRでのパルス刺激は与えなかった。
【0065】
ADHAPI−細胞/PWM−Bおよび対照PWM−B細胞の最終的な収集
結果については表1を参照されたい。
【0066】
自己混合リンパ球反応(aMLR)およびMLR
ADHAPI−細胞/PWM−Bおよび対照PWM−B細胞(刺激細胞=S)を収集し、0.5%α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で3回洗浄し、x−線処理した(30Gy)。aMLRおよびMLRのためにスカラー濃度(1x106細胞/mlから6x104細胞/ml)のADHAPI−細胞/PWM−Bまたは対照PWM−B細胞を、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地中の自己または同種PBMC(1x106細胞/ml)(反応細胞=R)に添加し、96ウェルU−底プレートに最終容積が200μl/ウェルとなるように播いた。37℃で5%CO2加湿雰囲気下での6日間のインキュベーションの後、100μlの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインアッセイに使用するまで−80℃で保存した。
【0067】
次いで、100μlの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養に3H−TdR(1μCi/ウェル)でO/Nパルス刺激を与えた;そして、プレートを収集しR細胞による3H−TdR取りこみをβ−カウンターで測定した。
【0068】
ADHAPI−細胞/PWM−Bおよび対照PWM−B細胞の表現型の特性
結果については表2を参照されたい。
【0069】
ADHAPI−細胞/PWM−Bおよび対照PWM−B細胞によって発現されるCTAのRT−PCR分析
【化2】
【0070】
a陽性/被験;NT、試験せず。
【0071】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/PWM−Bまたは対照PWM−B細胞(S)によって刺激された自己PBMC(R)の増殖
結果については図2を参照されたい。
【0072】
ADHAPI−細胞/PWM−Bまたは対照PWM−B細胞(S)によって刺激された同種(MLR)および自己(aMLR)PBMC(R)により放出されたIFN−γのELISA評価
結果については表3を参照されたい。
【実施例3】
【0073】
ADHAPI−細胞/CD40L−B
PBMC精製
PBMCを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置または酸性クエン酸デキストロース(ACD)−抗凝固処理した末梢血から、標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【0074】
NIH3T3−CD40L−活性化PBMCの作成
PBMC(2x106細胞/ml)を、半集密的な、x−線処理した(75Gy)NIH3T3−CD40Lと、37℃で5%CO2加湿雰囲気下で、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、2ng/ml組換えヒト(rh)インターロイキン4(rhIL−4)、50μg/mlヒトトランスフェリン、5μg/ml rhインスリン、5.5x10−7MシクロスポリンA(CsA)、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地(完全培地)中で共培養した。インキュベーションの6日後、PBMCを収集し、HBSSで2回洗浄し、完全培地に1x106細胞/mlとなるように再懸濁し、上記のようにして新たに調製したNIH3T3−CD40Lと、さらに3日間37℃で5%CO2加湿雰囲気下で共培養した。この手順を2−3日毎に繰り返し、最大培養時間を16−18日とした。
【0075】
ADHAPI−細胞/CD40L−Bおよび対照CD40L−B細胞の作成
16−18日間の培養後、活性化PBMCを収集し、上記のようにしてNIH3T3−CD40Lで再刺激した;37℃、5%CO2加湿雰囲気でのO/Nインキュベーションの後、培養に12時間ごとに1μM 5−アザ−デオキシシチジン(5−AZA−CdR)で4回パルス刺激を与えた;次いで、細胞を収集し、上記のようにNIH3T3−CD40Lで再刺激し、さらに48時間培養を続けた。次いで細胞を実験手順に使用および/または生存条件下で凍結した。対照細胞(CD40L−B細胞)を同様の実験条件で培養したが、5−AZA−CdRによるパルス刺激は与えなかった。
【0076】
最終的なADHAPI−細胞/CD40L−Bおよび対照CD40L−B細胞の収集
結果については表1を参照されたい。
【0077】
自己混合リンパ球反応(aMLR)およびMLR
ADHAPI−細胞/CD40L−Bおよび対照CD40L−B細胞(刺激細胞=S)を収集し、ハンクス平衡塩類溶液で3回洗浄し、x−線処理した(50Gy)。aMLRおよびMLRのために、スカラー濃度(1x106細胞/mlから6x104細胞/ml)のADHAPI−細胞/CD40L−Bまたは対照CD40L−B細胞を、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地中で、自己または同種PBMC(1x106細胞/ml)(反応細胞=R)に添加し、96ウェルU−底プレートに最終容積が200μl/ウェルとなるように播いた。37℃でのCO2加湿雰囲気下での24時間のインキュベーション後、100μlの培養上清を収集し、すぐにサイトカインアッセイに使用するまで−80℃で保存した。次いで、100μlの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養をさらに5日間続け、そして培養に3H−TdR(1μCi/ウェル)でO/Nパルス刺激を与えた;次いでプレートを収集し、R細胞による3H−TdR取りこみをβ−カウンターで測定した。
【0078】
ADHAPI−細胞/CD40L−Bおよび対照CD40L−B細胞の表現型の特性
結果については表2を参照されたい。
【0079】
ADHAPI−細胞/CD40L−Bおよび対照CD40L−B細胞によって発現されるCTAのRT−PCR分析
【0080】
【化3】
【0081】
a陽性/被験
【0082】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/CD40L−Bまたは対照CD40L−B細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖
結果については図3を参照されたい。
【0083】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/CD40L−Bまたは対照CD40L−B細胞S(S)によって刺激されたPBMC(R)によって放出されたIFN−γのELISA評価
結果については表3を参照されたい。
【実施例4】
【0084】
ADHAPI−細胞/PWM−PBMC
PBMC精製
PBMCを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【0085】
PWM−活性化PBMCの作成
PBMC(1.5x106細胞/ml)にPWM(3μg/ml)を添加し、48時間37℃で5%CO2加湿雰囲気で、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地中で培養した。
【0086】
ADHAPI−細胞/PWM−PBMCおよび対照PWM−PBMC細胞の作成
PWM−活性化PBMCに、12時間ごとに4回、1μMの5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AZA−CdR)でパルス刺激を与えた;次いで、培地の半分を新鮮な培地で交換し、培養をさらに48時間続けた。次いで細胞を実験手順に使用および/または生存条件下で凍結した。対照細胞(PWM−PBMC)を同様の実験条件下で培養したが、5−AZA−CdRによる刺激は与えなかった。
【0087】
ADHAPI−細胞/PWM−PBMCおよび対照PWM−PBMC細胞の最終的な収集
結果については表1を参照されたい。
【0088】
自己混合リンパ球反応(aMLR)およびMLR
ADHAPI−細胞/PWM−PBMCおよび対照PWM−PBMC細胞(刺激細胞=S)を収集し、0.5%α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で3回洗浄し、x−線処理した(30Gy)。aMLRおよびMLRのために、スカラー濃度(1x106細胞/mlから6x104細胞/ml)のADHAPI−細胞/PWM−PBMCまたは対照PWM−PBMC細胞を、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地中で、自己または同種PBMC(1x106細胞/ml)(反応細胞=R)に追加し、96ウェルU−底プレートに最終容積が200μl/ウェルとなるように播いた。37℃で5%CO2加湿雰囲気下での6日間のインキュベーションの後、100μlの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインのために使用するまで−80℃で保存した。100μlの新鮮な培地を各ウェルに添加し、3H−TdR(1μCi/ウェル)でN/Oパルス刺激を与えた;次いで収集し、R細胞による3H−TdR取りこみをβ−カウンターにより測定した。
【0089】
ADHAPI−細胞/PWM−PBMCおよび対照PWM−PBMC細胞の表現型の特性
結果については表2を参照されたい。
【0090】
ADHAPI−細胞/PWM−PBMCおよび対照PWM−PBMC細胞によって発現するCTAのRT−PCR分析
【0091】
【化4】
【0092】
a陽性/被験;NT、試験せず。
【0093】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/PWM−PBMCまたは対照PWM−PBMC細胞によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖
結果については図4を参照されたい。
【0094】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/PWM−PBMCまたは対照PWM−PBMC細胞(S)によって刺激された自己PBMC−(R)によって放出されたIFN−γのELISA評価
結果については表3を参照されたい。
【実施例5】
【0095】
ADHAPI−細胞/PHA−PBMC
PBMC精製
PBMCを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から、標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【0096】
PHA−活性化PBMCの作成
PBMC(1.5x106細胞/ml)にPHA−M(10μg/ml)および100UI/mlのrhIL−2を添加し、48時間37℃で5%CO2加湿雰囲気下で、10%熱不活性化ウシ胎仔血清を追加したRPMI1640培地(または10%熱不活性化ヒトAB血清を追加した基本Iscove培地)(これらには、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩が追加されている(完全培地))中で培養した。
【0097】
ADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMCの作成
PHA−活性化PBMCに、12時間ごとに4回、1μMの5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AZA−CdR)によってパルス刺激を与えた;次いで培地の半分を新鮮なPHA−Mを含有しない完全培地と交換し、さらに48時間培養を続けた。次いで細胞を実験手順に使用および/または生存条件下で凍結した。対照細胞(PHA−PBMC)を同様の実験条件下で培養したが、5−AZA−CdRによるパルス刺激は与えなかった。
【0098】
ADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMCの最終的な収集
結果については表1を参照されたい。
【0099】
自己混合リンパ球反応(aMLR)およびMLR
ADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMC(刺激細胞=S)を収集し、0.5%α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で3回洗浄し、x−線処理した(50Gy)。aMLRおよびMLRのために、スカラー濃度(1x106細胞/mlから6x104細胞/ml)のADHAPI−細胞/PHA−PBMCまたは対照PHA−PBMCを、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地中、自己または同種PBMC(1x106細胞/ml)(反応細胞=R)に添加し、96ウェルU−底プレートに最終容量が200μl/ウェルとなるように播いた。37℃、5%CO2加湿雰囲気下での24時間のインキュベーション後、100μlの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインアッセイでの使用まで−80℃で保存した。次いで、100μlの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養をさらに5日間続け、そして培養に3H−TdR(1μCi/ウェル)によってO/Nパルス刺激を与えた;次いでプレートを収集し、R細胞による3H−TdR取りこみをβ−カウンターによって測定した。
【0100】
ADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMCの表現型の特性
結果については表2を参照されたい。
【0101】
ADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMCにより発現するCTAのRT−PCR分析
【0102】
【化5】
【0103】
a陽性/被験;NT、試験せず。
【0104】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMCによって刺激された自己PBMC(R)の増殖
結果については図5を参照されたい。
【0105】
ADHAPI−細胞/PHA−PBMCまたは対照PHA−PBMC(S)によって刺激された同種(MLR)および自己(aMLR)PBMC(R)によって放出されたIFN−γのELISA評価
結果については表3を参照されたい。
【実施例6】
【0106】
ADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMC
PBMC精製
PBMCを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置またはACD−抗凝固処理した末梢血から、標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【0107】
PHA+PWM−活性化PBMCの作成
PBMC(1.5x106細胞/ml)に、PHA−M(10μg/ml)、PWM(3μg/ml)、100UI/mlのrhIL−2を添加し、37℃で48時間5%CO2加湿雰囲気下で、10%熱不活性化ヒトAB血清(または10%熱不活性化自己血清)、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地(完全培地)中で培養した。
【0108】
ADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMCおよび対照PHA+PWM−PBMCの作成
PHA+PWM−活性化PBMCに、12時間ごとに4回、1μMの5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−AZA−CdR)によりパルス刺激を与えた;次いで培地の半分をPHAまたはPWMを含有しない新鮮な完全培地と交換し、培養をさらに48時間続けた。次いで細胞を実験手順に使用および/または生存条件下で凍結した。対照細胞(PHA+PWM−PBMC)を同様の実験条件下で培養したが、5−AZA−CdRでのパルス刺激は与えなかった。
【0109】
ADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMCおよび対照PHA+PWM−PBMCの最終的な収集
結果については表1を参照されたい。
【0110】
自己混合リンパ球反応(aMLR)およびMLR
ADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMCおよび対照PHA+PWM−PBMC(刺激細胞=S)を収集し、0.5%α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で3回洗浄し、x−線処理した(50Gy)。aMLRおよびMLRのためにスカラー濃度(1x106細胞/mlから6x104細胞/ml)のADHAPI−細胞/PHA−rhIL2−+PWM−PBMCまたは対照PHA+PWM−PBMCを、10%熱不活性化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Iscove培地中で、自己または同種PBMC(1x106細胞/ml)(反応細胞=R)に添加し、96ウェルU−底プレートに最終容積が200μl/ウェルとなるように播いた。37℃で5%CO2加湿雰囲気下での6日間のインキュベーション後、100μlの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインアッセイに使用するまで−80℃で保存した。次いで、100μlの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養に3H−TdR(1μCi/ウェル)でO/Nパルス刺激を与えた;次いでプレートを収集し、R細胞による3H−TdR取りこみをβ−カウンターにより測定した。
【0111】
ADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMCおよび対照PHA+PWM−PBMCの表現型の特性
結果については表2を参照されたい。
【0112】
ADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMCおよび対照PHA+PWM−PBMCによって発現されるCTAのRT−PCR分析
【0113】
【化6】
【0114】
a陽性/被験
【0115】
aMLRにおいてADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMCまたは対照PHA+PWM−PBMCによって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖
結果については図6を参照されたい。
【0116】
ADHAPI−細胞/PHA+PWM−PBMCまたは対照PHA+PWM−PBMC(S)によって刺激された同種(MLR)および自己(aMLR)PBMC(R)によって放出されたIFN−γのELISA評価
結果については表3を参照されたい。
【0117】
ADHAPI−細胞のインビボ腫瘍形成能
生ADHAPI−細胞/PHA−rhIL2−PWM−PBMC(12x106)およびその対照細胞(14x106)、ADHAPI−細胞/CD40L−B(8x106)およびその対照細胞(8x106)またはx−線処理した(30Gy)ADHAPI−細胞/PHA−rhIL2−PWM−PBMC(12x106)およびその対照細胞(14x106)、x−線処理した(50Gy)ADHAPI−細胞/CD40L−B(15x106)およびその対照細胞(18x106)の単一の皮下異種移植は、注入部位でも離れた(臨床調査可能な)部位でも腫瘍形成を誘導せず、ADHAPI−細胞投与後180日のBALB/c nu/nuマウスの総合的な健康状態および体重に影響を与えなかった。
【0118】
生ADHAPI−細胞/B−EBV(5x106/第1回注入;lx107/第2回およびその後の注入)および対照B−EBV細胞(5x106/第1回注入;lx107/第2回およびその後の注入)またはx−線処理したADHAPI−細胞/B−EBV(75Gy)(5x106/第1回注入;lx107/第2回およびその後の注入)およびx−線処理した(75Gy)対照B−EBV細胞(5x106/第1回注入;lx107/第2回およびその後の注入)の0、33、63および96日目の繰り返し皮下異種移植は、注入部位でも離れた(臨床調査可能な)部位でも腫瘍形成を誘導せず、第1回投与後180日のBALB/c nu/nuマウスの総合的な健康状態および体重に影響を与えなかった。ADHAPI−細胞で処理された動物の総合的な健康状態および体重は、未処理またはB−EBV細胞を移植された対照動物と同等であった。
【0119】
多価細胞CTAワクチンとしてのADHAPI−細胞の利点
公知のCTAを癌患者にもっとも効率的に投与するための既に利用あるいは提案されている主な戦略と比較して、ADHAPI−細胞は全体として新規で革新的なアプローチであり、数多くの顕著な注目すべき利点を含む。これらのなかには以下のものがある:
【0120】
ADHAPI−細胞対遺伝的に未改変の細胞CTAワクチン
ADHAPI−細胞は、同時に複数の/すべてのメチル化−制御されたCTAを発現することから新規で独特のAPCワクチンである;内因的に合成されるため、CTAは直接および同時にADHAPI−細胞中のHLAクラスIおよびHLAクラスIIの両方の抗原プロセシング経路にアクセスすることができる(Jenne L. et al., Trends Immunol.、22: 102-107、2001)。
【0121】
したがって、HLAクラスIおよびHLAクラスII抗原の両方が細胞膜に構成的に発現することから、ADHAPI−細胞は、内因的に合成されたCTAの免疫原性エピトープを同時にCD8+およびCD4+T自己リンパ球の両方に提示することができる;それゆえ、ADHAPI−細胞は同時にCTA−特異的CTLおよび体液性免疫応答を誘導/増幅させることができる。さらに、ADHAPI−細胞は、今までに同定、特徴づけがされていないメチル化−制御されたCTAを発現し、宿主T細胞に提示することができる(既知または未知のCTAの非免疫優性エピトープと同様である)。
【0122】
ADHAPI−細胞とは反対に、合成CTAペプチドによりパルス刺激を与えた、合成CTA全タンパク質によりパルス刺激を与えた、または全腫瘍細胞調製物によりパルス刺激を与えた自己APCワクチン(例えば、樹状細胞、PBMC)、および電気融合で作成した腫瘍細胞樹状細胞ハイブリッド(Kugler A. et al., Nat. Med., 6: 332-336、2000. Tureci O. et al., Cancer Res.、56 : 4766-4772、1996. Eds)はともに以下の主要な制限を有する:
i)生体外で与えられた合成CTAペプチド、全合成CTAタンパク質または腫瘍由来CTAは、インビボでの振る舞いが知られていないために、宿主免疫系の抗原提示の寿命に重大な影響を与える可能性がある;
ii)細胞ワクチンのHLAクラスIおよび/またはHLAクラスII抗原に生体外で与えられる合成CTAペプチド、全合成CTAタンパク質または腫瘍由来CTAの量が制限されているため、投与したCTAの免疫原性をひどく妨害してしまう可能性がある;
iii)患者のHLA表現型による拘束があり、いまだに比較的既知のHLAクラスI抗原の数が少なく、今までに同定されたCTAのHLAクラスII抗原に拘束される免疫原性エピトープの数が少ない;
iv)十分な量の新鮮な腫瘍組織が入手しにくく、その腫瘍組織は腫瘍性病変において発現される様々なCTAを十分に代表するものでなければならない(Jenne L. et al., Trends Immunol.、22: 102-107、2001)。
【0123】
ADHAPI−細胞によって内因的に合成されたCTAの発現は長期間持続する;したがって、生体外で合成されたCTAペプチドによりパルス刺激を与えたか、合成CTA全タンパク質によりパルス刺激を与えたか、または全腫瘍細胞調製物によりパルス刺激を与えた自己APCワクチンと異なり、ADHAPI−細胞によると宿主免疫応答のインビボでの刺激を長期にすることができ、患者への投与回数を少なくすることができる。
【0124】
この仮説はADHAPI−細胞はインビボでの長期腫瘍形成能が無いことによりADHAPI−細胞を生きた、x−線処理されていない細胞ワクチンとして投与することが可能であろうということにより支持される。
【0125】
さらに、ADHAPI−細胞は一旦インビボで生理的な死を経ると、それらは内因的に合成されるCTAペプチドおよびタンパク質の「貯蔵所」として機能し、これによってさらにクロスプライミングの免疫機構を介して患者の樹状細胞によるCD8+T細胞に対するCTAのHLAクラスI−拘束エピトープの効率的な追加的提示が可能となり、また、周知の抗原プロセシングの外来経路を介してCD4+T細胞に対するCTAのHLAクラスII−拘束エピトープの提示も可能となる。
【0126】
ADHAPI−細胞はそのAPC機能を保持している;実際、それは効率的に自己および同種PBMCの増殖およびIFN−γ放出を刺激する;さらに、ADHAPI−細胞は多くの場合、それらに対応する対照細胞と比較してより強力な刺激細胞である。この点に関して、CTAに加えて、ADHAPI−細胞はHLAクラスI抗原および/または様々な同時刺激細胞/アクセサリー分子を、対応する対照細胞と比較してより高レベルに同時に発現することができる。これらの証拠により免疫原性が低く、いくつかの同時刺激/アクセサリー分子を構成的に発現しない自己腫瘍細胞と比べて、ADHAPI−細胞は自己細胞ワクチンとして明かに大きな利点を有する。さらに、生体外で作成して増加させた自己樹状細胞と比較して、ADHAPI−細胞ワクチンは完全に成熟した免疫適格性のAPCにより作成される;この側面により細胞ワクチンの作成に利用されてきた樹状細胞の成熟段階によって表れる、免疫原性能力よりも寛容に対して影響を与える可能性のある潜在的な制限が克服される。
【0127】
その他の細胞ワクチンと比較して、複数の/全てのメチル化−制御されたCTAを同時に発現するADHAPI−細胞ワクチンの生体外での作成は、簡単であり多くの場合迅速に行なえ、困難なインビトロの細胞操作を必要とせず、遺伝子操作を伴わず、自己腫瘍組織を必要とせず、健康な個人および癌患者のPBMCの両方から高い再現性をもって行なうことができる。
【0128】
さらに、100%に近いADHAPI−細胞調製物がAPCにおいて脱メチル反応が誘導できるすべての調査したCTAを発現する。これらの特徴により、ADHAPI−細胞ワクチンの作成は標準化しやすく質(例えば選択された細胞表面分子のためのフローサイトメトリーや選択されたCTAのためのRT−PCRによる)および効力(例えば選択されたCTAのための定量的RT−PCRによる)を制御しやすい。さらに、その他の今日までの細胞ワクチンは患者に投与するたびに新たに調製しなければならず、明かに調製物の間に変動があったのに対し(例えば細胞生存度、ワクチン接種する細胞の表現型の特性、与える合成CTAペプチドまたは合成CTA全タンパク質または全腫瘍細胞調製物の量、電気融合による腫瘍細胞−樹状細胞ハイブリッドの作成効率など)、ADHAPI−細胞ワクチンは、一旦調製して生存度、質および効力について確認したら、アリコットに保存し、適宜凍結し、生存条件下で治療用に用いるまで保存することができる。さらに、自己細胞ワクチンにパルス刺激を与えるため、または生体外で腫瘍細胞−樹状細胞ハイブリッドを作成するために自己腫瘍組織の生存度が必要とされないため、また繰り返し白血球血漿交換(leukaphereses)を行なうことによって大量に迅速に調製することができるため、ADHAPI−細胞ワクチンは各患者のための治療薬の実践的な無制限のソースである。
【0129】
内因的に合成され、HLAクラスIおよびHLAクラスII抗原プロセシング経路に直接かつ同時にアクセスすることができる複数の/すべてがメチル化−制御されたCTAの同時発現を鑑みると、それらがいまだに同定および特徴づけされていないメチル化制御されたCTA(および既知および未知のCTAの非免疫優性エピトープ)を発現して宿主T細胞に提示する能力により、また、患者のHLA表現型に応じた治療用途にしか用いることができなかった今までに同定されたCTAの、HLAクラスI抗原−およびHLAクラスII抗原−拘束免疫原性エピトープは限られた数しか知られていないため、ADHAPI−細胞のさらなる利点はあらゆる複数のHLAクラスIおよびHLAクラスII同種特異体に関する様々なCTAの既知のおよび未知の免疫原性エピトープを同時に提示することができるであろうということである。したがって、合成CTAペプチドによりパルス刺激を与えた、または合成CTA全タンパク質によりパルス刺激を与えた細胞ワクチンと比較して、ADHAPI−細胞ワクチンによる治療は特定のHLA表現型の患者に制限されない;したがってその腫瘍性病変が1または複数のCTAを発現するすべての癌患者が、そのHLA表現型にかかわらずADHAPI−細胞ワクチンによる治療の候補となりうる。この点で、今までに知られているCTAのなかの1または複数は、様々なヒストタイプの調査した悪性腫瘍のほとんどにおいて一般的に発現している;それゆえ、ADHAPI−細胞によるワクチン接種は癌患者の大多数において好適である。MAGE、GAGEまたはNY−ESO−1がヒト腫瘍の96%において発現しているということは重要な情報である(Cancer Immunol. Immunother.50 : 3-15、2001)。
【0130】
合成CTAペプチドによりパルス刺激を与えた細胞ワクチンおよび合成CTA全タンパク質によりパルス刺激を与えた細胞ワクチンは、細胞ワクチンのHLAクラスIおよび/またはHLAクラスII抗原に対して生体外で限られた量のタンパク質しか与えることができず、投与されたCTAの免疫原性が大幅に低減されるのに対して、複数のすべてのメチル化−制御されたCTAが同時発現することにより、ADHAPI−細胞ワクチンは、1または数個のCTAに対する治療過程に生じるCTA−陰性腫瘍変異体の免疫選択という欠点を克服し、また、特定の腫瘍性病変においておこる特定のCTAの構成的に不均一な、またときには下方制御された発現という欠点を克服することができる。
【0131】
ADHAPI−細胞ワクチンは、同時に複数の/すべての既知のメチル化−制御されたCTAを発現し、その発現がDNAメチル化によって制御されるいまだに同定されていないCTAを発現する自己の機能的なAPCによって構成される;さらに、ADHAPI−細胞ワクチンは様々なヒストタイプのCTA−陽性腫瘍を患う患者に利用できる。これらの機能的および表現型の特性は、現在まで用いられてきた同種腫瘍細胞ワクチン(例えば、全プール(pooled)腫瘍性細胞系の溶解液またはその非精製抽出物、プール腫瘍性細胞系からの脱落(shed)抗原)と比べて明かに有利である。実際、これらの腫瘍細胞ワクチンは既知のおよびいまだに未知の免疫学的に関連するCTAを含まないか、含むとしても不充分な量であり、免疫応答に関してCTAと競合する不適切な細胞性分を含み、毒性が強いであろう。また同種であるため、患者の免疫系による効率的なプロセシングが要求され、同じ組織タイプの悪性腫瘍を患う患者においてのみしか利用できない。
【0132】
ADHAPI−細胞対遺伝的に改変された細胞CTAワクチン
ADHAPI−細胞の作成は生体外での自己樹状細胞またはその他の自己APCの遺伝子操作を伴わず、一方、遺伝的に改変されたワクチンの作成には遺伝子操作が要求され、これは形質移入または形質導入の後に選択されたCTAを発現させるものである。さらにADHAPI−細胞と比較して、遺伝的に改変された細胞ワクチンには数々の問題点がある;それらには以下のものが挙げられる:
i)利用可能な形質移入方法の効率が比較的低い。
ii)細胞形質導入に利用されるウィルスベクターの抗原に対する細胞の免疫応答が誘導され、遺伝的に改変されたワクチン細胞の破壊が起こる。
iii)ワクチン投与を妨害する、既存のまたはワクチン接種により誘導される中和抗体が存在する。
iv)形質導入細胞の生存、成熟および抗原提示能力に対してウイルスベクターが直接影響を与える(Jenne L. et al.、Trends Immuno Z.、22 : 102-107、2001)。
【0133】
【表1】
【0134】
aデータは収集した細胞の、3回の(a)、4回の(b)、4回の(c)、4回の(d)、7回の(e)および5回の(f)の独立した実験においてその作成に用いた細胞数(100%)に対する平均%±SDである。
【0135】
【表2】
【0136】
*データは、6回の(a)、6回の(b)、4回の(c)、4回の(d)、6回の(e)、および2回の(f)の独立の実験においてフローサイトメトリーによって得た平均蛍光強度の平均値の対応スチューデントt−検定による比較によって得た。統計的有意差は、自己対照細胞と比較してADHAPI−細胞上の調査した抗原の発現が常に上方制御されていることを示した。
f有意差無し
gp値
h試験せず;
+ADHAPI−細胞/CD40L−B=82−100% CD20+;対照CD40L−B細胞=87−99% CD20+。
【0137】
【表3】
【0138】
*データは2回の(a)、4回の(b)、4回の(c)、4回の(d)、3回の(e)および4回の(f)の独立した実験において放出されたIFN−γ(pg/ml)の平均値±SDを表す。S/R比は、以下の通り:3:1(a)、1:1(b)、1:2(e)、1:1(d)、1:1(e)、1:2(f)。IFN−γ放出は培養開始から24時間後(a)、6日間後(b)、24時間後(c)、6日間後(d)、24時間後(e)および6日間後(f)にアッセイした。
g対応スチューデントt−検定によって得た対照細胞に対するp値。
h試験せず。
【図面の簡単な説明】
【0139】
【図1】図1は、ADHAPI−細胞/B−EBVまたは対照B−EBV細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
【図2】図2は、ADHAPI−細胞/PWM−Bまたは対照PWM−B細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
【図3】図3は、ADHAPI−細胞/CD40L−Bまたは対照CD40L−B細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
【図4】図4は、ADHAPI−細胞/PWM−PBMCまたは対照PWM−PBMC細胞(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
【図5】図5は、ADHAPI−細胞/PHA−PBMCおよび対照PHA−PBMCによって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
【図6】図6は、ADHAPI−細胞/PHA−+PWM−PBMCまたは対照PHA−+PWM−PBMC(S)によって刺激された自己(aMLR)PBMC(R)の増殖を示す。
Claims (31)
- 以下の工程を含む抗原提示細胞の作成方法:
a)対象から該細胞を収集する工程、
b)該収集した細胞を活性化する工程、
c)生体外で該活性化した細胞を培養および所望により増加させる工程、
d)該培養および所望により増加させた細胞をDNA低メチル化剤で処理して該細胞から同時に複数の腫瘍関連抗原を発現させる工程。 - 該対象が哺乳類である請求項1に記載の方法。
- 該対象がヒトである請求項2に記載の方法。
- 該対象が癌患者である請求項2に記載の方法。
- 該細胞が免疫細胞である請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 該細胞が非免疫細胞である請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 該細胞が共有免疫優性癌抗原を発現する請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 該細胞が共有非免疫優性癌抗原を発現する請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 該細胞がエプスタイン・バーウイルス−不死化B−リンパ芽球腫細胞系である、請求項1から5、7、8のいずれかに記載の方法。
- 該細胞がヤマゴボウマイトジェン(PWM)−活性化B−リンパ球である、請求項1から5、7、8のいずれかに記載の方法。
- 該細胞がCD40活性化B−リンパ球である、請求項1から5、7、8のいずれかに記載の方法。
- 該細胞がフィトヘマグルチニン(PHA)+組換えヒトインターロイキン−2(rhIL−2)−活性化PBMCである、請求項1から5、7、8のいずれかに記載の方法。
- 該細胞がフィトヘマグルチニン(PHA)+組換えヒトインターロイキン−2(rhIL−2)+ヤマゴボウマイトジェン(PWM)−活性化PBMCである、請求項1から5、7、8のいずれかに記載の方法。
- 該細胞が樹状細胞、単球、マクロファージである、請求項1から4、6から8のいずれかに記載の方法。
- 該細胞がCD34+細胞、線維芽細胞、幹細胞、線維芽細胞および角化細胞である、請求項1から4、6から8のいずれかに記載の方法。
- 工程d)においてヒストン脱アセチル酵素阻害剤を使用する、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- DNA低メチル化剤が5−アザ−シチジンまたは5−アザ−2’−デオキシシチジンから選択される、請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から17のいずれかに記載の方法によって得られる細胞。
- 1または複数の癌抗原を構成的に発現する様々なヒストタイプの悪性腫瘍の予防および治療のための、請求項18に記載の細胞および/またはその細胞成分の使用。
- 該共有癌抗原が免疫優性癌抗原である、請求項19に記載の使用。
- 該共有癌抗原が非免疫優性である、請求項18に記載の使用。
- 該癌抗原が癌精巣抗原である、請求項18に記載の使用。
- 該細胞がプールされた抗原の貯蔵所として保存される、請求項19から22のいずれかに記載の使用。
- 癌ワクチン用の請求項23に記載のプールされた抗原。
- 請求項18に記載の細胞を含む癌ワクチン。
- 該ワクチンが自己由来である請求項25に記載のワクチン。
- 該ワクチンが同種由来である請求項25に記載のワクチン。
- 細胞が請求項23に記載のように使用される、請求項27に記載のワクチン。
- 請求項19に記載の細胞成分が使用される、請求項27または28に記載のワクチン。
- エフェクター免疫細胞の作成方法における請求項18に記載の細胞および/またはその細胞成分の使用であって、該エフェクター免疫細胞が養子免疫治療に有用な産物の調製のために用いられる使用。
- 請求項25から29のいずれかに記載のワクチンおよび低メチル化剤の全身的投与に好適な医薬組成物を含む製品。
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