WO2005075646A1

WO2005075646A1 - ストレス誘導抗アポトーシス分子（ｉｅｘ−１）由来ペプチド

Info

Publication number: WO2005075646A1
Application number: PCT/JP2005/001508
Authority: WO
Inventors: Kyogo Itoh; Shigeki Shichijo; Tetsuro Sasada
Original assignee: Kurume University
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2005-02-02
Publication date: 2005-08-18
Also published as: JP4925033B2; WO2005075646A8; JPWO2005075646A1

Abstract

　ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対する癌ワクチン候補ペプチドを提供すること。　本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に認識され、特異的ＣＴＬを誘導できるストレス誘導アポトーシス関連遺伝子（ＩＥＸ−１）由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよび該ペプチドを含むポリペプチド、それらをコードする核酸分子、ならびにそれらを含有する医薬組成物等に関する。

Description

明細書

ストレス誘導抗アポトーシス分子（IEX— 1)由来ペプチド

技術分野

[0001] 本発明は、癌患者に対する免疫療法に利用可能なストレス誘導抗アポトーシス分子 (IEX— 1)由来ペプチドに関する。詳細には、細胞傷害性 T細胞 (CTL)により認識され、特異的な CTLを誘導する、 IEX— 1由来ペプチド、該ペプチドを含むポリぺプチドおよびこれらペプチドを含む癌ワクチン等に関する。

背景技術

[0002] 胃癌は、世界で最も普遍的に発生する悪性腫瘍の一つである（文献 1 6)。本疾患は、早期では予後は一般的に良好であるが、進行癌においては、外科的切除、化学療法、および放射線療法などの既存の治療法が最近顕著に進歩しているにも係らず、予後が非常に悪い。それゆえ、進行段階の胃癌患者を処置するため、新しい特異的免疫療法のような新規な治療法の開発が必要とされている。

[0003] 近年、ヒト腫瘍が CTLに認識される抗原性ペプチドを発現していることが明らかになってきており、このようなペプチドは HLA— A2または A24アレルを有する癌患者に対するペプチドワクチンとして使用されている（文献 1 7)。 HLA— A2または A24拘束性 CTLにより認識されるェピトープペプチドについては多くの報告がなされており (文献 8— 11)、本発明者らも、最近、ペプチドワクチン処置が HLA— A2または A24 重症胃癌患者の全体的生存率を延長することを報告した (文献 4)。

一方、 HLA— A33アレルは世界中の様々な人種において比較的広く発現しているにも拘わらず (文献 14、 15)、 HLA-A33拘束性 CTLにより認識される抗原およびペプチドについての報告は非常に限られている（文献 12、 13)。このことは、 HLA- A33+癌患者に対するペプチド基盤特異的免疫療法の開発を妨げている。

[0004] IEX-1 (immediate early response gene X-l)(p22/PRGl (文献 20)、 Dif— 2 (文献 21)、またはマウスホモログ gyl96 (文献 22)としてもまた知られる）は、ストレス誘導遺伝子であり、細胞周期進行およびアポトーシスの調節に関与する。 IEX— 1は、 TN Fおよび Fasのような様々なアポトーシス誘発因子により誘導されるアポトーシスに対する細胞抵抗性に重要な役割を果たすこと（文献 23)、およびいくつかの細胞株において細胞周期進行を加速すること（文献 24— 26)が報告されている。また、 in vivo における Tリンパ球の活性ィ匕誘導細胞死に対する IEX— 1の抗アポトーシス効果も報告されている（文献 27)。

IEX— 1の発現は、放射線照射、成長因子、ウィルス感染、 TNF— αおよび IL 1 β のような炎症性サイト力イン、リポポリサッカライド、およびステロイドホルモンを含むいくつかの細胞ストレスによって急速に活性ィ匕され得る（文献 27)。 ΙΕΧ— 1はもともと Ν F— κ BZrel標的遺伝子として同定されたが（文献 23)、 IEX— 1プロモーターには例えば p53、 SP—1および c Mycのような他の転写因子のためのコンセンサス配列がいくつか含まれる（文献 7)。例えば、腫瘍細胞に共通する癌抑制遺伝子 p53の変異力 EX— 1発現を上昇させることが示されて、る（文献 29)。

以上のように、 IEX— 1は腫瘍細胞の悪性形質転換に関与することが示唆されている力腫瘍細胞にぉ、て抗原性ペプチドとして機能する IEX— 1ェピトープペプチドは知られていなかった。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、 HLA— A33+癌患者に対する癌ワクチンの開発に有用な抗原ペプチドを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者らは、重症胃癌患者の腫瘍組織浸潤リンパ球 (TIL)力も HLA— A33拘束性 CTL株を榭立し、 IEX— 1由来の三つの HLA— A33結合ェピトープを、本細胞株により認識される腫瘍抗原として同定した。さらに、これらの抗原性ェピトープが悪性腫瘍疾患患者の PBMC (末梢血単核細胞）におヽてペプチド特異的 CTLを誘導することを確認したことにより、本発明を完成した。

[0007] 即ち本発明は、以下を包含する。

( 1)細胞傷害性 T細胞 (CTL)によって認識され、特異的な CTLを誘導する、ストレス誘導抗アポトーシス分子 (IEX— 1)由来のペプチドまたはその変異ペプチド。

(2) CTLが HLA-A33拘束性に認識する、 ( 1)記載のペプチド。 (3)連続する 8— 11個のアミノ酸残基力もなる、（1)または（2)に記載のペプチド。

(4)配列番号 1一 3の、ずれかに示されるアミノ酸配列力なるペプチド、または配列番号 1一 3の、ずれかに示されるアミノ酸配列にお!、て 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ HLA— A33分子と結合して特異的な CTLを誘導するペプチドである、 (1)一 (3)のいずれかに記載のぺプチド。

(5)上記（1)一（4)の、ずれかに記載のペプチドを含むポリペプチド。

(6)単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、 HLA— A33分子と（1)一（4)の Vヽずれかに記載のペプチドとの複合体を提示させてなる、抗原提示細胞。

(7)上記（1)一（4)の、ずれかに記載のペプチド、または（5)記載のポリペプチドをコードする核酸分子。

(8)上記（7)記載の核酸分子を含有するベクター。

(9)上記（1)一（4)のいずれかに記載のペプチド、（5)記載のポリペプチド、（6)記載の抗原提示細胞、（7)記載の核酸分子、または（8)記載のベクターを含む、特異的な CTLを誘導するための医薬組成物。

(10)癌ワクチンである、（9)記載の医薬組成物。

(11)上記（1)一（4)の、ずれかに記載のペプチドと HLAとの複合体、または（6)記載の抗原提示細胞に提示された複合体を認識する、 IEX— 1反応性 CTL。

(12)上記（1)一（4)のいずれかに記載のペプチド、（5)記載のポリペプチド、または (6)記載の抗原提示細胞を用いて IEX - 1反応性 CTLを誘導する方法。

(13)上記（1)一（4)の、ずれかに記載のペプチドまたは（5)記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。

(14)次の 1)または 2)に記載のポリペプチドを含む、特異的な CTLを誘導するための医薬組成物：

1)配列番号 4に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド、または

2)配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ HLA— A33分子と結合して特異的な CTLを誘導するペプチドを与えるポリペプチド。 (15)癌ワクチンである、（14)記載の医薬組成物。

発明の効果

[0008] 本発明は、悪性腫瘍、特に HLA— A33陽性の癌患者の治療に適した IEX— 1基盤免疫療法を可能にする。

図面の簡単な説明

[0009] [図 1]胃腺癌患者（HLA— A*2402ZA*3303、 B7/B44, Cw7ZCwl4)の腫瘍浸潤生リンパ球 (TIL)から樹立した、 HLA-A33拘束性 850B-CTL細胞株の特性を示す図である。 Aは種々の標的細胞に対する認識能を、様々な E :T比（ェフエクタ一細胞:標的細胞）における IFN γの産生に基づき検討した結果を示す。 Βは種々の標的細胞に対する細胞傷害活性を、相異なる Ε :Τ比における 6時間⁵¹ Cr放出試験により試験した結果を示す。 Cは種々の mAbを用いた阻害実験における、 850B- CTLの HLA— A33+LC— 1細胞に対する反応性の差異を示す図である。

[図 2]850B-CTL細胞株による、同定された腫瘍抗原遺伝子の HLA-A33拘束性認識を示す図である。 LC 1肺腺癌細胞 cDNAライブラリ一力ゝら遺伝子発現クロー- ング法で得たクローンと、 HLA— A3303または HLA— A2601遺伝子を共にトランスフエタトした COS7細胞に対する 850B— CTLの反応性を IFN—γ産生に基づいて検 B、Jした。

[図 3]mRNAおよびタンパク質レベルにおける IEX— 1の発現を示す図である。 Aは、様々な正常組織における IEX— lmRNAの発現を、 ³²P標識 IEX— 1プローブを用いるノーザンプロット解析によって調べた結果を示す写真の模写図である。 Bは正常および癌細胞における IEX— 1遺伝子の mRNA発現のノーザンブロット解析におけるォ一トラジオグラフィーを示す写真の模写図である。 C一 Eは様々な腫瘍組織における I EX— 1の発現をタンパク質レベルで免疫組織ィ匕学的に検討した結果を示す顕微鏡写真の模写図である。 Cは胃癌組織、 Dは乳癌、 Eは肺癌における染色を示している

[図 4]IEX— 1における抗原性ェピトープの同定を示す図である。 IEX— 1の推定アミノ酸配列の HLA— A33結合性モチーフに基づくコンピュータ解析で HLA— A33に対して強い結合活性を有しうる 8個の候補ペプチドを選択し、試験した。 Aは、これら 8 個の候補ペプチドを C1R— A33細胞（HLA— A*3303cDNAをトランスフエタトして安定的に発現させた C1Rヒト多発性骨髄腫細胞）とともに培養し、さらに 850B-CTL を添加して培養した後、培養上清中の IFN γの産生を ELISAにより測定した結果を示す。 Βは、有意なレベルの IFN— γ産生を誘導した 3つのペプチド（ΙΕΧ47— 56、 IEX61— 69、および ΙΕΧ65— 73ペプチド）及び 1つの対照ペプチドの濃度と、 ΙΕΧ— 1反応性 CTL誘導活性との関係を検討した結果を示す。

[図 5]ペプチドに対する細胞性応答を示す図である。 ΙΕΧ47— 56、 IEX61— 69、および ΙΕΧ65— 73ペプチドで HLA - Α33+上皮癌患者および HLA - Α33+健常人の ΡΒ MCを刺激し、対応するペプチドでパルスした C1R— Α33細胞または陰性対照の HI Vペプチドでパルスした C1R— A33細胞で刺激し、 IFN— γ産生活性に基づいて細胞応答を試験した。

[図 6]はペプチド誘導 CTLの細胞傷害性を示す図である。 LC-1 (HLA-A33+IE X— 1+)、 QG56 (HLA— Α33— ΙΕΧ— 1+)および HGC27 (HLA— Α33—ΙΕΧ— Γ)細胞を IL 2単独で培養し、相異なる Ε :Τ比で 6時間⁵¹ Cr放出試験を行い、細胞障害活性を検討した。

[図 7]モノクローナル抗体による細胞傷害性阻害試験の結果を示す図である。抗 H LAクラス I、抗 HLAクラス II、抗 CD8 (Nu—TsZc、 IgG2a)、抗 CD4 (Nu—ThZi、 I gGl)と対照としての抗 CD14 (JML— H14、 IgG2a) mAbを用い、ペプチド刺激 PB MCの細胞傷害性に対する阻害作用を検討した。

[図 8]特異的細胞傷害性の競合試験の結果を示す図である。非標識 C1R細胞を対応ペプチドまたは HIVペプチド（陰性対照)でパルスし、 ⁵¹Cr放出試験に供した (非標識細胞対標識細胞 = 10 : 1)。 EZT比 10 : 1で⁵¹ Cr放出試験を行った。

発明を実施するための最良の形態

本発明についてさらに詳細に説明する。

HLA枸亩件 CTL株

HLA拘束性 CTL株は、目的とする HLAアレルを有する癌患者の腫瘍組織に浸潤して、るリンパ球 (TIL)を採取し、 T細胞の増殖を促すサイト力インである IL 2と共に培養して増殖させることにより得られる。本方法は当業界において周知である。遣伝子発現クローニング法

HLA拘束性 CTL株によって認識される腫瘍抗原は、遺伝子発現クローニング法により同定する。本方法は、 cDNAライブラリーにコードされるタンパク質を哺乳類細胞で一過性に発現させ、榭立した CTL株が特異的に認識する目的のタンパク質をコードする cDNAをスクリーニングし、当該タンパク質をコードする遺伝子を単離するものである。本発明では、榭立した CTL株がタンパク質発現細胞を認識した際に産生する IFN- γを指標としてスクリーニングを行う。

[0011] ペプチドおよびポリペプチド

本発明の IEX— 1由来ペプチドは、 HLAと結合して特異的 CTLを誘導しうるべプチドである。本発明ペプチドは IEX— 1の連続する 8— 11個のアミノ酸残基力なることが好ましい。このような IEX— 1の部分ペプチドの具体例として、 IEX47— 56、（配列番号： 1)、 IEX61-69 (配列番号： 2)、または IEX65— 73 (配列番号： 3)が挙げられる。 IEX— 1遺伝子の全ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列は、受入番号 NM— 003897として GeneBank〖こ登録されている（配列番号: 4)。特異的な CTLを誘導する他の IEX— 1由来ペプチドは、本明細書の実施例に準じた方法により容易に決定および選択できる。

[0012] 「HLAと結合して特異的な CTLを誘導しうる」とは、本発明のペプチドが HLAと結合して複合体を形成し、カゝかる複合体を CTLが認識できることをいう。換言すれば、本発明のペプチドが、 HLAとの結合活性を有し、かつ、 HLAとの複合体の形で、ぺプチド特異的な CTLを誘導する活性を有することを意味する。本発明におヽて好ましい HLAは、 HLA— A33である。

[0013] また、本発明は、 HLAと結合して特異的な CTLを誘導しうる IEX— 1由来ペプチドの変異ペプチドであって、同等の CTL誘導能を有する変異ペプチドも包含する。変異は、本発明の IEX— 1由来ペプチドに対して一個または数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、挿入などを行うことにより導入することができ、その手段は当業界にて周知である。変異が他のアミノ酸による置換または付加を含む場合、他のアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよぐアミノ酸アナログとしては、種々のアミノ酸の N—ァシル化物、 O—ァシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のペプチドの変異体を得るには、例えば、配列番号 1一 3に記載のアミノ酸配列の 1一数個、好ましくは 1一 4個、より好ましくは 1一 3個、さらに好ましくは 1個または 2個のアミノ酸残基が欠失している力他のアミノ酸残基またはアミノ酸アナログで置換された、またはそれが付加された候補ペプチドを合成し、該候補ペプチドと HLA— A33分子との複合体が CTLにより認識されるか否かをアツセィすることにより、同定することができる。

[0014] アツセィは例えば、後述する CTL誘導法に準じて行うことができる。即ち、 in vitroで候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスした HLA— A33 陽性細胞を特異的に認識する CTLが誘導されるカゝ否かを調べる。ここで、 CTL誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応して CTLが産生する種々のサイト力イン (IFN- y等)の量を酵素免疫測定法 (ELISA)等により測定することによって調ベることができる。または、 ⁵¹Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対する CTLの傷害性を測定する方法（⁵¹Crリリースアツセィ、 Int. J. Cancer, 58:p317,1994)によっても調べることができる。前記アツセィで用いる HLA-A33陽性細胞としては、実施例に記載の HLA-A33陽性細胞が挙げられる。

変異ペプチドのアミノ酸残基数は、抗原提示細胞表面上に提示され、かつ CTL認識ェピトープとしての性質を有する数であればよぐ通常少なくとも約 8個以上であり、好ましくは約 9個以上であって、 12個以下、好ましくは 11以下、さらに好ましくは 10 個以下である。特に好ましアミノ酸残基数は 9個な、し 10個である。

[0015] 本発明はさらに、特異的な CTLの誘導活性を有する、本発明の IEX— 1由来ぺプチドまたはその変異ペプチドを含有するポリペプチドを包含する。ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、特に限定されず、本発明が属する分野での技術常識に従う。通常、アミノ酸残基数約 100個以下の長さであり、好ましくは約 50個以下、より好ましくは約 30個以下程度である。

本発明のポリペプチドは HLA— A33陽性細胞内で断片化されて特異的 CTL誘導活性を有するペプチド断片を与えることができるものである。そのようなポリペプチドは、配列番号： 1、配列番号: 2、または配列番号 : 3で示される本発明のペプチドに相当する部分配列、または本発明ペプチドの変異体に相当する配列を含有することが特に好ましい。

[0016] また、機能を著しく障害しない程度に構成アミノ酸またはカルボキシル基などを修飾して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを改変することもできる。例えば、 N末端や遊離のァミノ基には、ホルミル基、ァセチル基、 t ブトキシカルボ-ル (t Boc)基等が結合していてもよぐ抗原ペプチドの C末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、ェチル基、 t ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。さらに、本発明のペプチドは、生体内への導入を容易にするように、修飾されていてもよい。

一般に、 HLA分子と結合する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列には、 HLAの型により異なるモチーフ (規則的配列）が存在することが知られており、変異または改変は、そのモチーフ上、許容されるものであることが好ましい。変異の導入において、ぺプチドまたはポリペプチドの基本的な性質 (物性、機能、生理活性または免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。

本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチドィ匕学における一般的な公知方法により製造できる。

[0017] 「抗原提示細胞 (APC)」とは、 HLAと抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示する細胞を意味する。従って、抗原提示細胞は、本発明の腫瘍抗原ペプチドと HLA A33分子との複合体を細胞表面に提示することにより、 HLA— A33拘束性 CTLの活性ィ匕をもたらす機能を有する。そのような細胞には、 CTL細胞障害作用の標的である腫瘍細胞も含まれる。

本発明の抗原提示細胞は、単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、 HLA A33分子と本発明の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を提示している。そのような細胞は、 in vitroで誘導することもでき、具体的には、 HLA— A33陽性の抗原提示能を有する細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドをパルスして HLA— A33と該ペプチドとの複合体をその細胞表面に提示させることにより得られる。「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドを提示可能な HLA-A24抗原を細胞表面に発現して、る細胞であれば特に限定されな、が、特に抗原提示能が高、とされる榭状細胞が好ましい。特に、 HLA-A33陽性腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、 HLA— A33分子と本発明の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞が好ましヽ。

[0018] 核酸分子

本発明の核酸分子は、本発明の IEX— 1由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよび該ペプチドを含むポリペプチドの、アミノ酸配列をコードする一本鎖 (相補鎖を含む )および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸分子は DNAであっても RNA であってもよい。これら核酸分子がコードするアミノ酸配列を有するペプチドは、それ自体が CTLにより認識され、該 CTLを活性ィ匕するカゝ、そのような活性を有するぺプチド断片を与えることができ、腫瘍抗原として機能し得る。

また、本発明の核酸分子は、本発明のペプチドをコードする領域に対応する少なくとも 24個以上の塩基力もなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖であってよ、。このようなポリヌクレオチドは、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現ペプチドを確認すること〖こより選択できる。

[0019] 雄

本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の、ずれであってもよい。本発明の IEX— 1由来ペプチドまたはポリペプチドの中力も選ばれる 1つのべプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列中、連続する少なくとも 5個のアミノ酸残基からなるェピトープペプチドまたはポリペプチドを特異的に認識するものである。

抗体はそれらのェピトープペプチドを使用して作製でき、そのェピトープペプチドは少なくとも 5個、好ましくは少なくとも 8— 10個のアミノ酸で構成される。本発明は、この少なくとも 5個のアミノ酸残基力なるペプチドおよびそれをコードする核酸分子も包含する。

本発明の抗体は、ェピトープペプチドを単独で、または担体と結合した形で、アジュバントの存在または非存在下に例えばマウス、ラット、ゥサギ、ャギ等に免疫し産生を誘導することができる。得られたポリクローナル抗体は、公知の方法により血清から回収することができる。

一方、モノクローナル抗体は、上記のように免疫応答を誘導した動物から回収した抗体産生細胞を、永久増殖性細胞と融合することで生産できる。本方法は当業界において周知である。

これらのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、標識マーカー等として利用することができる。また、ヒト型化して治療用に供する場合もあり得る。

0020] .m

本発明の医薬組成物は、本発明の IEX— 1由来ペプチド、変異体ペプチド、ポリべプチド、 HLA分子とペプチドとの複合体を細胞表面に提示してヽる抗原提示細胞、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子、該核酸分子の塩基配列情報に基づき作製した組換えベクター、または本発明の抗体を、単独または複数組み合わせて利用することにより調製できる。

具体的には、本発明の IEX— 1由来ペプチドまたはその変異体、該ペプチドを含むポリペプチド、抗原提示細胞は癌ワクチンとして使用することができる。一種類のぺプチドでも癌ワクチンとして有効である力複数種類のペプチドを組み合わせて使用するのが好ましい。これは、癌患者の CTLが複数の異なる種類の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、複数種類の腫瘍抗原を組み合わせて癌ワクチンとして使用する方がより効果的であると期待されるからである。本発明に係るペプチド等を他のペプチドと共に複数種類組み合わせて使用してもよい。

[0021] 本発明の癌ワクチンは、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で、または製薬的に許容される担体と結合して使用することができる。担体は、人体に有害な作用を起こさない限り限定されるものではなぐ例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。剤形は、ペプチド製剤について周知の剤形が選択可能である。投与量は、 CTLによる認識性、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等により変化するが、ペプチドの場合、活性本体として、通常、 O.OOOlmg— 1000mg、好ましくは O.OOlmg— 1000mg、より好ましくは O.lmg— 100mg、さらに好ましくは 0.1— 10mg/ 日 Z成人ヒトである。これを数日ないし数周あるいは数ケ月に一回投与する。

[0022] 本発明の医薬組成物はまた、本発明に係るペプチドをコードする核酸配列を適当なベクターに組み込み、 in vivoまたは ex vivoで導入するのに利用することができる。ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる力レトロウイルス系が好ましい。投与量は、 CTLによる認識性により変化する 1S DNA含量として 0. 1 μ g-100mg/日 Z成人ヒト、好ましくは 1 μ g— 50mgZ日 Z成人ヒトである。これを数日ないし数ケ月に一回投与する。

[0023] IEX - 1反応性 CTLおよびその誘導方法

「IEX— 1反応性 CTL」とは、本発明の IEX— 1由来ペプチドまたはその変異体と HL Aとの複合体を認識し、誘導される CTLを意味する。該 CTLは HLA-A33拘束性 C TLである。

そのような CTLは、例えば HLA— A33+胃癌患者の末梢血単核球（PBMC)から本発明に係るペプチドを用いて誘導することができる。

つまり、本発明のペプチドでパルスした抗原提示細胞 (APC)ととも〖こ HLA— A33+ 胃癌患者の PBMCをインキュベートして CTLを誘導し、 IFN- γ産生を指標として評価する。さら〖こ、誘導された CTLの活性は、 ⁵¹Cr放出試験等により腫瘍細胞傷害性を指標として確認できる。

[0024] 上記の方法は、 in vitroで誘導した抗原特異的 CTLを患者体内に戻し腫瘍細胞を傷害する、養子免疫療法に利用できる。すなわち、メラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J. Natl.Cancer.Inst.,86:1159、 1994)。またマウスのメラノ一マにおいては、脾細胞を in vitroで腫瘍抗原ペプチド TRP-2で刺激し、腫瘍抗原べプチドに特異的な CTLを増殖させ、該 CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Exp.Med., 185:453, 1997) ₀これは、抗原提示細胞の HLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する CTLを in vitroで増殖させた結果に基づくものである。本発明の腫瘍抗原ペプチドを用いて、 in vitro で患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的 CTLを増やした後、この CTLを患者に戻すことにより腫瘍を治療することが可能である。

[0025] 以下、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明は下記実施例によつて、かなる意味にぉ、ても制限されるものではな!/、。

実施例 [0026] 本発明には、以下の癌細胞株を使用した。

胃腺癌 MKN—28、 MKN - 45、 SSTW - 9、 KATO - III、 KWS、および HGC - 27 ;肺腺癌 LC 1 ;肺偏平上皮癌 QG— 56 ;頭頸部癌 KUMA— 1 ;大腸腺癌 S W620および COLO 201 ;脾臓腺癌 Pane— 1；ヒト慢性骨髄性白血病 K562。これらの腫瘍細胞の HLAクラス I遺伝子型は以前に示されてヽる（文献 10、 11)。

これらの細胞上の HLAクラス Iまたは HLA— Α33抗原の発現は、抗 HLAクラス I (W 6Ζ32)モノクローナル抗体 (mAb) (HLAクラス I分子の単一形領域を認識）、または抗 HLA - A33mAb (HLA - A33分子の多形領域を認識）（IgM、 One Lamda, Canoga Park, CA)を用いて、 FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA)でのフロ一サイトメトリーによって測定した。

統計学的解析には、本発明すべてにおいて両側 Student t検定を用いた。

[0027] ¾細

(850B— CTL株の榭立）

HLA-A33拘束性および腫瘍特異的 CLT株（850B-CTL)は、重症胃腺癌患者 (HLA— A*2402ZA* 3303、 B7/B44, Cw7/Cwl4)の TILを 10%FCS ( Equitech Bio, Ingram, TX)、 100U, mllL— 2 (Shionogi Pharmaceutical, Osaka, Japan)、および 10 /z gZmlPHA Difco, Detroit, MI)含有培養培地（45%RPIM16 40培地、 45%AIM— V培地； Life Technologies, Walkersville, MA)で 14日間インキュペートし、続ヽて支持細胞としての放射線照射（30Gy)ァロジェニック末梢血単核細胞（PBMC)の存在下でさらに 30日より長く培養することにより榭立した。本 CTL株の表現型を FITC結合抗 CD3、 CD4、または CD8モノクローナル抗体 (mAb)を用いて免疫学的蛍光試験により検討したところ、 CD3+CD4— CD8+ ( > 95%)であった（データ非提示)。

[0028] (850B— CTL株の特性）

文献記載の方法に従ヽ、 850B— CTL株を特性ィ匕した (文献 9)。

標的細胞を認識することにより IFN— γを産生する能力について、様々な Ε :Τ比（エフェクター細胞：標的細胞）において 850Β— CTL細胞株を試験した。値は ELISA (検出限界 lOpgZml)によるトリプリケート測定の平均を表す。図 1Aに示すように、この CTL株は HLA— A33 上皮癌細胞、 LC— 1および KUMA— 1を認識することにより有意なレベルの IFN— γを産生したが、 HLA— A33—標的細胞に対しては反応しなかった。

[0029] 次に、様々な標的細胞に対する 850B-CTLの細胞傷害活性を、相異なる Ε :Τ比において 6時間⁵¹ Cr放出試験により試験した。本方法は既知である（文献 9)。値はトリプリケート測定の平均を表す。 850B— CTLは、 HLA— A33+LC— 1および KUMA— 1細胞に対してより強い細胞傷害性を示したが、 HLA— A33—標的細胞、 COS7細胞、 NK標的細胞株、 K562、または健常提供者の PBMCから得た HLA— Α33+ΡΗΑ 活性化正常 T細胞 (PHA幼若化細胞）の、ずれに対しても示さなカゝつた。

[0030] さらに mAbを用いた阻害実験によって、 850B— CTLの反応性を検討した。抗 HL Aクラス I (W6Z32、 IgG2a)、抗 CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a)、抗 HLA— A24 (0041 HA、 IgG2a)、抗 CD4 (Nu-Th/i, IgGl)、抗 HLAクラス IB,C (Bl— 23、 IgG2a) 、および抗 HLAクラス II (H—DR、 IgG2a) mAb (20 μ g/ml)を文献記載の方法と同様に使用した (文献 10、 11)。アイソタイプ適合対照 mAbとして、抗 CD14 (JML— H14、 IgGl)または抗 CD13 (MCS2、 IgG2a)を準備した。

HLA— A33^TLC— 1細胞の認識による 850B— CTLからの IFN— γ産生は、抗 HL Αクラス Iおよび抗 CD8mAb (20 μ g/ml)によって阻害された力抗 HLA— B, C、抗 HLAクラス II、抗 HLA— A24、抗 CD4、または無関係なアイソタイプ適合抗 CD 1 3または抗 CD14mAbによっては阻害されなかった（図 1C)。

これらの結果は、 850B— CTL株が腫瘍細胞に対しては HLA— A33拘束性細胞傷害性を示す力正常細胞に対しては示さな、ことを意味して、る。

[0031] 実施例 2

(IEX— 1遺伝子の同定）

遺伝子発現クローユング法 (文献 9)により、 850B— CTL株によって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子を同定した。

LC— 1肺腺癌細胞のポリ（A) +RNAを cDNAに変換し、 Sailアダプターをライゲートし、そして発現ベクター pSV— SPORT— 6 (Invitrogen, San Diego, CA)に挿入した。 HLA— A* 3303または HLA— A* 2601の cDNAをそれぞれ KUMA— 1または KE 4細胞より回収した RNA力 RT— PCRによって作製し、真核細胞発現ベクター pCR 3 (Invitrogen)へ挿入してクローユングした。 LC—lcDNAライブラリーのプラスミド D NAプールまたはクローン（200ng)、および HLA— A* 3303または HLA— A* 2601 (陰性対照） cDNA (200ng)、の両方を、 1 μ 1のリポフエクタミン（Invitrogen)と 120 μ 1の Opti— MEM (Invitrogen)中で 40分間混合した。 COS7細胞（5xl0³)をこの混合物 50 μ 1と 6時間インキュベートし、続いて 10%FCS含有 RPMI1640培地 150 μ 1を添カロした。 2日間培養した後 850B-CTL (2xl0⁵細胞/ゥエル）を添カ卩し、その後 18 時間インキュベートし、上清 100 μ 1を回収して ELISAによりデュプリケート試験で IF N— γを測定した (文献 9)。

[0032] 一次スクリーニングにおいて、 LC—lcDNAライブラリーから得た lxlO⁵クローンすベてを、 HLA— A*3303cDNAとともに COS7細胞にトランスフエクシヨンした後に、 8 50B— CTLによる IFN— γ産生を刺激する能力について試験した。すなわち、 cDN Aプール（lxlO⁵クローン）を 96平底プレート中の約 2000の相違するゥエルにデュプリケートで分割した（各ゥエルの期待されるクローン数： 100クローン Zゥエル)。一次スクリーニングでは、 10の異なるゥエルで有意なレベルの IFN—γ産生が得られた。二次スクリーニングとして、陽性ゥエルからクローン化して得た各 cDNAプールを 96 平底プレートの約 200の異なるゥエルにデュプリケートで分割し、 IFN-γ産生刺激活性について試験した。

二次スクリーニングの後、更なるアツセィのための二つの陽性クローンを同定した。 DN Aシークェンスキットおよび ABI PRISM 377 DNAシークェンサ一（Perkin- Elmer, Foster, CA)を使用したジデォキシヌクレオチドシークェンス法により DNAシークェンスを行った。単離された遺伝子の一つにつ!、て以下の検討を行った。

[0033] 図 2に示されるように、クローン 1および HLA— A*3303をトランスフエタトした COS7 細胞は、用量依存的に 850B— CTLにおける IFN— γ産生を誘導した力陰性対照としてクローン 1と HLA— Α*2601をトランスフエタトした細胞は誘導しなかった。それに対し、クローン 1または HLA— Α* 3303のいずれかを単独でトランスフエタトした CO S7細胞は 850B— CTLに認識されなかった（データ非提示）。さらに、 LC—lcDNA ライブラリ一力も得られた陰性対照として使用した他のクローンは、 HLA— A*3303とともに COS7細胞にトランスフエタトした場合に 850B— CTLにおける IFN— γ産生を誘導できな力つた (データ非提示)。このことはクローン 1が 850Β— CTLによって特異的に認識される腫瘍抗原をコードすることを示唆している。

GeneBankの検索によって、クローン 1のヌクレオチド配列は、ストレス誘導抗ァポト一シス遺伝子として報告されている IEX— 1 (文献 17)の配列と同一であることがわかつた o

[0034] 実施例 3

(正常および癌組織における IEX— lmRNAおよびタンパク質の発現）

様々な腫瘍または正常糸且織（Multiple Tissue Northern Blots, Clontech, Tokyo, Japan)における IEX— lmRNAの発現を、以前に記載した方法に従い³² P標識 IEX— 1プローブを用いてノーザンブロット解析によって調べた（文献 9) (図 3A、レーン 1: 脳、レーン 2:心臓、レーン 3:骨格筋、レーン 4:大腸、レーン 5:胸腺、レーン 6:脾臓、レーン 7:腎臓、レーン 8:肝臓、レーン 9:小腸、レーン 10:胎盤、レーン 11:肺、レーン 12:PBL)。 j8-ァクチンプローブを対照として使用した。図 3Aに示すように、脳（レーン 1)を除き試験したすべての正常組織において約一 1.3kbのバンドがはっきりと検出され、心臓 (レーン 2)、腎臓 (レーン 7)、肺 (レーン 11)、または末梢血リンパ球 (PBL) (レーン 12)において特に発現が高ぐ胸腺 (レーン 5)、脾臓 (レーン 6)、肝臓 (レーン 8)、または小腸 (レーン 9)においては発現が低力つた。

[0035] 次に、正常および癌細胞における IEX— 1遺伝子の mRNA発現をノーザンブロット解析により検討した（図 3B、レーン 1:PBL、レーン 2:MKN45、レーン 3:MKN28、レーン 4:SSTW、レーン 5:HGC27、レーン 6:LC—1、レーン 7:QG56、レーン 8:K UMA— 1、レーン 9: Pane— 1、レーン 10:SW620、レーン 11 :COLO201、レーン 1 2:KATO-IIl)o IEX— 1は、 HCG27胃癌細胞株（レーン 5)を除き、胃（レーン 2— 4 、 12)、肺（レーン 6、 7)、頭頸部（レーン 8)、脾臓（レーン 9)、および大腸（レーン 10 、 11)を含む様々な臓器に由来する、被験腺癌および SCC細胞株のほとんどにおいて高発現していた。

これらの結果は、この遺伝子があらゆる癌および正常組織にぉ、て発現して、ることを意味する。 [0036] さらに、様々な腫瘍組織におけるこの遺伝子の発現をタンパク質レベルで検討した。 IEX— 1タンパク質の発現は、抗 IEX— 1抗体（Santa- Cruz biotechnology,

Santa-Cruz, CA)とともに Ventana Medical Systems 自動化装置（Tucson, AZ)を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片上で免疫組織ィ匕学によって評価した。胃癌組織における代表的染色を示す（図 3C)。胃癌にぉ、て IEX-1タンパク質の発現は癌細胞で選択的に増強されていたが、周囲の正常上皮または結合組織においては増強されていなかった。 IEX— 1タンパク質は、乳癌（図 3D)、肺癌（図 3E)、および大腸癌 (データ非提示)を含む様々な型の癌組織にぉ、てもまた、高くかつ選択的に発現していた。なお、図 3C— Eにおいて、 IEX— 1タンパク質は茶色に染まっており、正常細胞および結合組織は茶色に染まっていない。これら、茶色に染まった数箇所を、便宜上、矢印で示した。

以上の結果より、 IEX— 1は癌の治療において理想的な標的分子の一つであるといえる。

[0037] 実施例 4

(850— B CTLによって認識される IEX— 1由来抗原性ペプチドの同定）

IEX— 1の抗原性ェピトープとして CTLに認識され得るペプチドを同定するため以下の実験を行った。

IEX-1の推定アミノ酸配列にお、て HLA— A33分子に結合するためのモチーフ（文献 18、 19)を有する可能性のあるペプチド配列の中で、コンピューター解析（ Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS), NIH, Bethesda, MD)では H LA— A33に対してより強い結合活性を有する 8の相異なるペプチドを使用した。 BioSynthesis, Lewisville, TXより純度 > 95%のペプチドを得た。ペプチド結合アツセィには、 RMA— S— Α33細胞（HLA— A* 3303cDNAを安定的にトランスフエタトした RMA— Sタップ（ペプチドプロセシングに関与するトランスポーター）欠損マウスリンパ 1£ホ田胞 (hiroko Takedatsu, et ai., Identification of Peptide Vaccineし anmdates Sharing Among HLA— A3, -Al l,— A31, and -A33 Cancer Patients., Clin Can Res, 2004, in press) (lxlO⁴細胞 Zゥヱル）を使用した。簡単に言うと、細胞を 26°Cで 18 時間インキュベートした。 PBSで洗浄した後、細胞（lxlO⁶細胞）を Opti-MEM (ヒト j8 2-ミクログロブリン 3 μ gZmlおよびペプチド 10 μ gZml含有）に懸濁し、続いて 26 °Cで 3時間そして 37°Cで 3時間インキュベートした。 PBSで洗浄した後、細胞を抗 H LA— A33mAbと 4°Cで 30分間インキュベートし、続!、て FITC結合ゥサギ抗マウス Ig M抗体（Cappel, Aurora, OH)と 4°Cで 30分間インキュベートした。細胞を FACScan で解析し、平均蛍光強度 (MFI)により結合活性を評価した。 26°Cで、 TRP2-197 ペプチド (参考ペプチド)でパルスした細胞、およびパルスして、な、細胞も使用した。表 1に示すように、若干親和性は異なるが、 8ペプチド全てカ¾^1八 S— A33細胞に結合できた。

[表 1]

[0038] 850B- CTL株によって認識される抗原性ペプチドの検出のため、 C1R— A33細胞

(HLA— A*3303cDNAをトランスフエタトして安定的に発現させた C1Rヒト多発性骨髄腫細胞（Hiroko Takedatsu, et al., Clin Can Res, 2004, in press)を指示濃度のぺプチドとともに培養した。二時間後、 850B— CTL (2xl0⁵細胞/ゥエル)を添加し、さらに 18時間インキュベートした。培養上清中の IFN— γの産生は ELISAにより測定した。

ペプチド非ロード C1R— Α33細胞に応答した 850Β— CTLによる IFN— γ産生をバックグラウンドとして、その値力も差し引いた。値はトリプリケート試験の平均を示す。

[0039] これらペプチドのうち 3つ、 ΙΕΧ47— 56、 IEX61— 69、および ΙΕΧ65— 73が、有意なレベルの IFN—γ産生を用量依存的に誘導した（図 4A、 4B)。 HLA— Α33トランスフエタト C1R細胞上にロードするのに最適な三つのペプチドの濃度は、各ペプチドにおいて 0. 1-1 μ Μの範囲にわたり様々であったが（図 4Β)、 RMA— S Α33細胞により決定された HLA— Α33分子に対するそれらの結合親和性 (表 1)には依存していなかった。

以上の結果に基づき、 ΙΕΧ47— 56、 IEX61— 69、および ΙΕΧ65— 73を、 850Β— C TL株によって認識される ΙΕΧ— 1由来抗原性ペプチドとして同定した。

[0040] 実施例 5

(IEX-1由来ペプチドによる CTLの誘導）

ΙΕΧ47 - 56、 IEX61 - 69、および ΙΕΧ65— 73ペプチドの HLA—A33拘束性および腫瘍特異的 CTL誘導能について、 HLA - Α33+上皮癌患者 (η=4、胃癌患者（2 )、肺癌患者（1)、前立腺癌（1) )および HLA-A33+健常人 (HD)の PBMCにおいて試験した。

HLA - Α33+癌患者および HLA - Α33+健常人 PBMC (1χ10⁵Ζゥエル）を、 96 穴マイクロカルチャープレート (Nunc, Roskiide, Denmark)において IL 2含有培養液 200 1中で各ペプチド（10 M)とインキュベートした（文献 13)。 14日目に各ゥエル力も別個にペプチド刺激 PBMC (80— 120xl0⁴Zゥエル）を回収し、洗浄し、 4等分した。 2つは対応するペプチドをロードした C1R— A33細胞で、残りの二つは陰性対照の HIVペプチドをロードした C1R— A33細胞で刺激した。 18時間後、上清を回収しそれらの IFN— γ産生活性について試験した。

4人の患者の代表例を図 5に示す。 HIVペプチドに対する IFN— γ産生（く 50pg /ml)をバックグラウンドとして差し引いた。これら 3つのペプチドで刺激した癌患者由来 PBMCは、ほとんどの場合において対応するペプチドをロードした HLA— A33 トランスフエタト C1R細胞を認識して有意な量の IFN— γを産生した（図 5)。それに対して、 5人の HDから得た PBMCはそれらに対して有意な量の IFN—γを産生しなかつた (データ非提示)。

[0041] 次に、ペプチド誘導 CTLの腫瘍細胞傷害活性を検討した。

有意な量の IFN γを産生できた細胞を回収し、 IL 2単独でさらに 10— 14日間培養し、相異なる Ε :Τ比で 6時間⁵¹ Cr放出試験を行った (文献 13)。 LC— 1 (HLA— A3 3 IEX-1 )、 QG56 (HLA— A33— IEX— 1 )、および HGC27 (HLA— A33— IEX— Γ)に対する細胞傷害活性を計測した。対照として、非抗原性 IEX - 1由来ペプチド、 IEX43— 51によって刺激した癌患者の PBMCを使用した。値はトリプリケート測定の平均を示す。

図 6に示すように、 IEX— 1由来ペプチドで刺激された PBMCは、 HLA— A33+IEX — 1+LC— 1腫瘍細胞に対して有意なレベルの細胞傷害性を示した力 HLA— A33— HGC27または QG56細胞に対しては示さなかった。また、 IEX43— 51 (陰性対照べプチド）は特異的 CTL活性を示さなかった。この結果は、 IEX47— 56、 IEX61— 69、および IEX65—73力上皮癌患者の PBMCにお!/、て HLA— A33拘束性に特異的 CTLを誘導できる抗原性ェピトープペプチドであることを示唆している。

[0042] さらに、細胞傷害性の拘束性およびペプチド特異性を阻害試験および競合試験により確認した。

阻害試験には、抗 HLAクラス I(W6Z32、 IgG2a)、抗 HLAクラス II (H— DR、 IgG 2a)、抗 CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a)、抗 CD4 (Nu-Th/i, IgGl) (20 μ g/ml)を使用した。抗 CD14 (JML— H14、 IgG2a) mAbを対照として使用した。

これらペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性は、試験したすべてのケースで抗 HLAクラスほたは抗 CD8抗体によって有意に阻害された力他の mAbよっては阻害されなかった（図 7)。

競合試験では、対応ペプチドまたは HIVペプチド (陰性対照)でノルスした非標識 C1R細胞を⁵¹ Cr放出試験に非標識細胞対標識細胞の比率を 10対 1で添加した。 1 0 : 1の EZT比で⁵¹ Cr放出試験を行った。値は特異的傷害活性 (％)の平均士 SDを示す。

対応ペプチドパルス C1R— A33細胞を添加することにより細胞傷害性は阻害されたが、 HIVペプチドパルス細胞では阻害されなかった（図 8)。

以上の結果は、ペプチド特異的 CTL活性力主として HLA— Aクラス I拘束性に C D8+T細胞によって発揮されることを示唆している。

産業上の利用可能性

[0043] 本発明は、 IEX— 1が、胃腺癌に浸潤している T細胞より榭立された HLA拘束性および腫瘍特異的 CTLにより認識される腫瘍抗原性ェピトープをコードしていることを開示するものである。また、本発明は IEX— 1由来抗原性ペプチドが癌患者の PBMC 培養において HLA拘束性に腫瘍特異的 CTLを誘導できることをも開示するものである。

IEX— 1は、正常組織、特に、心臓、腎臓、肺および PBLにおいても発現しているので、これらの臓器は IEX— 1由来抗原性ェピトープによる特異的免疫療法の有害事象となる恐れがある。しかしながら、本発明は 850— BCTL株および IEX— 1由来べプチドにより誘導された CTLの、ずれも HLA— A33+腫瘍細胞を溶解する一方、過剰量の対応ペプチドが培養中に存在するにも拘わらず PHA活性ィ匕正常 HLA— A33+T 細胞は傷害しないことを明らかにした。また、発明者らが行っている腫瘍抗原由来べプチドワクチンを用いる臨床試験では、腫瘍抗原のいくつかは正常組織または臓器に広く発現してヽるにも拘わらず、深刻な有害事象は観察されてヽな、 (文献 4 7) 従って、以上の結果は、本発明の IEX— 1由来ペプチドが癌治療に適したペプチドワクチンとして使用可能であることを示唆して、る。

[0044] また、放射線照射および!/、くつかの化学療法薬が、比較的高!、レベルで IEX— 1発現を誘導することが報告されているので (文献 26、 30)、本発明の IEX— 1分子を標的とした特異的免疫療法は、特に化学療法または放射線療法抵抗性癌を患う患者の処置にとって新規で魅力的な方法となり得る。

HLA— A33は、アジア人および黒人にお!、て最も一般的な HLA— Aアレルの一つであり、日本人の 13%、韓国人の 14%、白人の 14%、および黒人の 16%に見られる（文献 14、 15)。また IEX— 1は癌組織に高発現している。従って、本発明の抗原べプチドは、 HLA - A33+癌患者に対する特異的免疫療法に広く利用可能であろう。

[0045] «リスト

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196-200, 2001. 文献 27 : Zhang， Υ·， Schlossman, S. F.， Edwards, R. A., Ou, C. Ν·， Gu, J., and Wu, M. X. Impaired apoptosis, extended duration of immune responses, and a lupus-like autoimmune disease in IEX—1— transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 878-883, 2002.

文献 28 : Garcia， J., Ye, Υ·， Arranz, V.， Letourneux, C.， Pezeron, G.， and Porteu, F. IEX—1: a new ERK substrate involved in both ERK survival activity and ERK activation. Embo J, 21: 5151-5163, 2002.

文献 29 : Huang, Y. Η·， Wu, J. Υ·， Zhang, Υ·， and Wu, M. X. Synergistic and opposing regulation of the stress-responsive gene IEX—1 by p53， c-Myc, and multiple NF— kappaB/rel complexes. Oncogene, 21: 6819—6828， 2002.

文献 30 : Kondratyev， A. D.， Chung, K. Ν·， and Jung, M.〇. Identification and characterization of a radiation— inducible glycosylated human early-response gene. Cancer Res, 56: 1498—1502， 1996.

文献 31 : Kittlesen， D. J., Thompson, L. W.， Gulden, P. Η·， Skipper, J. C.， Colella, T. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F.， Engelhard, V. Η·， Slingluif, C. L., Jr., and Shabanowitz, J. A. Human melanoma patients recognize an HLA— A 1— restricted CT L epitope from tyrosinase containing two cysteine residues: implications for tumor vaccine development. J Immunol, 160: 2099—2106， 1998.

Claims

請求の範囲

[I] 細胞傷害性 T細胞 (CTL)によって認識され、特異的な細胞傷害性 Τ細胞 (CTL) を誘導する、ストレス誘導抗アポトーシス分子 (ΙΕΧ— 1)由来のペプチドまたはその変異ペプチド。

[2] CTLが HLA-A33拘束性に認識する、請求項 1記載のペプチド。

[3] 連続する 8— 11個のアミノ酸残基力もなる、請求項 1または 2に記載のペプチド。

[4] 配列番号 1一 3のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号 1一 3のヽずれかに示されるアミノ酸配列にお!ヽて 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ HLA— Α33分子と結合して特異的な CTLを誘導するペプチドである、請求項 1一 3の、ずれかに記載のぺプチド。

[5] 請求項 1一 4のいずれかに記載のペプチドを含むポリペプチド。 *請求項 1一 3は、 9あるいは 10アミノ酸残基よりなるペプチドでポリペプチドではな!/、 *

[6] 単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、 HLA - Α33分子と請求項 1一 4の V、ずれかに記載のペプチドとの複合体を提示させてなる、抗原提示細胞。

[7] 請求項 1一 4のいずれかに記載のペプチド、または請求項 5記載のポリペプチドをコードする核酸分子。

[8] 請求項 7記載の核酸分子を含有するベクター。

[9] 請求項 1一 4の、ずれかに記載のペプチド、請求項 5記載のポリペプチド、請求項 6 記載の抗原提示細胞、請求項 7記載の核酸分子、または請求項 8記載のベクターを含む、特異的な CTLを誘導するための医薬組成物。

[10] 癌ワクチンである、請求項 9記載の医薬組成物。

[II] 請求項 1一 4のいずれかに記載のペプチドと HLAとの複合体、または請求項 6記載の抗原提示細胞に提示された複合体を認識する、 ΙΕΧ— 1反応性 CTL。

[12] 請求項 1一 4のいずれかに記載のペプチド、請求項 5記載のポリペプチドまたは請求項 6記載の抗原提示細胞を用いて IEX - 1反応性 CTLを誘導する方法。

[13] 請求項 1一 4の、ずれかに記載のペプチドまたは請求項 5記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。

[14] 次の（1)または（2)に記載のポリペプチドを含む、特異的な CTLを誘導するための医薬組成物：

(1)配列番号 4に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド、または

(2)配列番号 4に示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ HLA— A33分子と結合して特異的な CTLを誘導するペプチドを与えるポリペプチド。

[15] 癌ワクチンである、請求項 14記載の医薬組成物。