JP5706317B2

JP5706317B2 - 細胞の誘導および促進方法

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Publication number: JP5706317B2
Application number: JP2011509865A
Authority: JP
Inventors: ウェテリング，ファン，サンドラ; デニセグルエイル，デ，ターニャ; マリエクライスベーク，アドリアナ; デ，リーネケフェン，ファン; ヨハネススヘペル，リーケルド
Original assignee: DCPrime BV
Current assignee: Mendus BV
Priority date: 2008-05-19
Filing date: 2008-11-12
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2028-11-12
Also published as: JP2011523360A; EP2281030A2; AU2008285598A1; CA2724018C; PL2281030T3; EP2281030B1; CA2724018A1; AU2008285598B2; WO2009019320A2; WO2009019320A3; US20110117051A1; US8470789B2; DK2281030T3; ES2621406T3

Description

本発明は、機能的樹状細胞の生産方法に関し、ＣＤ３４陽性細胞を、これらＣＤ３４陽性細胞の機能的樹状細胞への分化を誘導および促進する化合物に接触させる。より具体的には、ＣＤ３４陽性細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させる。他の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる細胞に関する。さらなる態様において、本発明は、ＣＤ３４陽性細胞の機能的樹状細胞への分化を誘導および促進する、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンのような化合物の、それが必要であるヒトにおいて免疫反応を誘導するための薬剤の製造における使用に関する。

樹状細胞（ＤＣ）は、最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、免疫応答の惹起において極めて重要な役割を果たしている。それらの特異的性質を考慮して、ＤＣは、病原体に対する免疫を強化するためのツールとして、抗がんワクチン戦略において打ち出された。ここ数年で、ＤＣの発生について広く研究された。

専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）中で、ＤＣは、抗原をピックアップし、主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合するペプチド断片に処理することに特化されている。ＤＣは、ほとんどの組織に局在し、末梢からＴ細胞受容体を介して抗原特異的Ｔリンパ球がＤＣにより提示されたペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する、脾臓およびリンパ節などの二次リンパ器官に遊走する。他の専門的および非専門的なＡＰＣは、活性型Ｔ細胞またはメモリーＴ細胞を刺激することができるのみであるが、ＤＣは、ナイーブＴリンパ球および静止期Ｔリンパ球に対する独特の能力を有する。

免疫の制御における重要な役割を考慮して、ＤＣの治療的役割は、自己免疫疾患および腫瘍性疾患などのＴ細胞活性化に関する多くの疾患について提案された。生体外における腫瘍抗原感作、およびその後のＤＣの再注入は、動物において腫瘍に対する保護を導くことができる。ヒトにおけるＤＣに基づく腫瘍免疫療法の戦略の有効性に取り組むため、ＤＣに関するいくつかの臨床試験が現在進行中である。

ＤＣは、血中の中間前駆細胞、ならびに末梢組織および器官の未成熟ＤＣのような、分化のさまざまな段階を経て、骨髄中の造血前駆細胞から発生する（Banchereauら、2000, Ann. Rev. Immunol. 18, 767-811）。一度組織に到達すれば、未成熟ＤＣは、周囲の培地から抗原を非常に積極的に取り込むことにより特徴付けられる重要なセンサー機能を担う。細菌感染、もしくはウイルス感染、または炎症プロセスのような外部信号（「危険信号」）による刺激に続いて、ＤＣは、末梢リンパ器官に遊走し、そこで成熟ＤＣに分化し、抗原を提示することによってＴ細胞を活性化する。

ＤＣは、様々な分子の影響下にある前駆細胞を分化することにより得られる。例えば、マウス骨髄（ＢＭ）由来の前駆細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下において骨髄ＤＣに分化させることができる。ヒトにおいて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４に腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を追加することは、骨髄、臍帯血（ＣＢ）、および末梢血（ＰＢ）の精製されたＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋細胞）からＤＣの発生を誘導することが示された。

Jacobsら（Horm Metab Res. 2008 Feb;40(2):99-107）は、樹状細胞亜型および樹状細胞のin vitro産生の概要を提供した。論文には、表現型および機能の違いを含めたさまざまなＤＣ集団の識別について、ならびにＤＣを産生するためのプロトコルの最近の進展について記載されている。それには、様々な、サイトカインおよび転写因子が、ＤＣ集団の発生の原因になると知られていることが記載されている。これらの細胞の集団、および成熟の状態に応じて、それらは、広範な細胞傷害性免疫応答を誘導することができ、それにより、ヒトにおける抗がんワクチン療法の有望なツールを表すか、または免疫寛容を誘導し、自己免疫の環境（context）内で重要である。

サイトカインは、免疫、炎症、および造血を、媒介および調節する小型の分泌タンパク質である。それらは、免疫刺激に応答して新規に生産される。それらは、一般的に（ただし、常にではない）短い距離、および短時間、および非常に低濃度で作用する。それらは、その挙動（遺伝子発現）を変更するために、多くの場合チロシンキナーゼであるセカンドメッセンジャーを介して細胞にシグナルを送る特異的膜受容体に結合することによって機能する。サイトカインへの応答は、膜タンパク質（サイトカイン受容体を含む）の発現、増殖、およびエフェクター分子の分泌が、増大または減少することを含む。

サイトカインは、一般的な名称である。その他の名称は、リンホカイン（リンパ球によって作られるサイトカイン）、モノカイン（単球によって作られるサイトカイン）、ケモカイン（遊走活性を有するサイトカイン）、およびインターロイキン（ある白血球で作られるサイトカインであり、他の白血球に作用する）を含む。サイトカインは、細胞に作用でき、前記細胞は、それらを分泌する細胞（自己分泌作用）、近傍細胞（傍分泌作用）、または遠隔細胞（内分泌作用）である。

異なる細胞種が同じサイトカインを分泌すること、または単一のサイトカインが数種の異なる細胞に作用する（多面作用）ことが一般的である。サイトカインは、それらの活性において重複しており、このことは、同様の機能が異なるサイトカインによって刺激されることを意味する。サイトカインは、多くの場合、あるサイトカインが、追加のサイトカインを作製するためにその標的細胞を刺激するようなカスケードで生産される。サイトカインは、相乗的に（二以上のサイトカインが共に作用する）、または拮抗的に（サイトカインが反対の活性を引き起こす）作用する。それらの短い半減期、低血漿中濃度、多面作用、および重複性は、全てサイトカインの分離および特性を複雑にする。

サイトカインは、多くの細胞集団によって作られるが、主要な生産者は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）およびマクロファージである。サイトカインの最大のグループは、免疫細胞の増殖および分化を刺激する。このグループには、Ｔ細胞を活性化するインターロイキン１（ＩＬ−１）、抗原活性化Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖を刺激するＩＬ−２、Ｂ細胞の増殖および分化を刺激するＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−６、マクロファージを活性化するインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、ならびに造血を刺激するＩＬ−３、ＩＬ−７、および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれる。

ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αに加えて、サイトカインの広範なスペクトルは、ＤＣ前駆体の増殖および分化に影響を与えることが示された。幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）のような早期に作用する増殖因子は、ＤＣ前駆細胞の数を維持および増加するが、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせたＩＬ−３は、ＤＣの分化を促進することが示された。さらに、成長因子（ＴＧＦ）−ベータ１の形質転換は、in vitroにおけるランゲルハンス型ＤＣの発生を促進する。

ＭＵＴＺ３細胞株のような特定のヒト樹状細胞株では、細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−αのようなサイトカインの影響下においてＤＣに分化するが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ベータ１、およびＴＮＦ−アルファは、in vitroにおけるランゲルハンス型ＤＣの発生を促進する。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびＩＬ−６のような水溶性の因子は、ＣＤ３４陽性前駆細胞のＤＣへの分化を抑制し、その発生を単球マクロファージ系へ向け直す。全てのこれらの抑制性の水溶性因子が、がん細胞により分泌されることは、ＣＤ３４＋細胞からＤＣが発生することの防止が、腫瘍が免疫応答から逃れるメカニズムである可能性があることを示唆し、注目に値する。

サイトカインのような異なる化合物の影響を受けて、異なる前駆体が様々なＤＣに分化する方法に関する知識は蓄積されているが、通常、培養時間は長い。例えば、ＣＤ３４陽性細胞は、例えば、ＴＮＦ−αを加えたＧＭ−ＣＳＦの存在下における１４日間の液体培養後、一般的に良好な数のＤＣを生じる。

上述したように、ＤＣは、腫瘍性疾患、感染症、および自己免疫疾患を含む様々な疾患の治療に適用することができる。しかし、ＤＣは、そのような治療において使用される初代培養細胞から取り出したとき、ＤＣまたはそれらの前駆体細胞は、患者またはドナーから非常に少量しか得ることができないので、治療の有効性は著しく妨げられる可能性がある。さらに、現在の方法では、回収は多くの時間および高価な試薬の使用を必要とするが、得られるＤＣの収量は非常に少ない場合がある。

ＤＣは、ＤＣを形成するために刺激分子による適切な刺激によってin vitroで成熟する、ＣＤ３４陽性幹細胞または単球のような前駆細胞から得られた。しかし、このような前駆細胞は、血液および組織の両者において極めて希少である。

がんのためのＤＣに基づく治療ワクチンを用いる活性特異的免疫療法に大きな関心が寄せられている。ＤＣは、がんを撃退する免疫システムを備える細胞性アジュバントとして集中して研究されている（例えば、Bull Cancer. 2008 Mar 1;95(3):320-6を参照）。

ＥＰ１４１９２４０は、樹状細胞に分化させることができ、免疫療法剤として、または免疫疾患の治療において免疫療法剤の一部として使用することができるＭＵＴＺ３細胞株の使用を開示している。このような細胞株は、十分な量の細胞の入手可能性の問題を解決し得るが、それでも、実験データは、未成熟ＤＣを取得するために適切な条件下において少なくとも６〜７日間の培養を必要とすること、および成熟ＤＣを得るために高価なサイトカインの使用が要求される少なくとも２日の追加日が必要であることを示す。

ＷＯ２００６／０１２３５９は、血中単球の機能的抗原提示樹状細胞への分化を誘導するための方法を開示している。要するに、細胞は、例えば、疾患エフェクター試薬の任意の存在下において、物理的な摂動（physical perturbation）により処置される。

ＥＰ１３８９２３４は、ヒト造血幹細胞からリンパ球樹状細胞に分化するための他の方法を開示している。細胞は、ＧＭ−ＣＳＦを含む第１培地およびＩＦＮ−ガンマを含む第２培地の２つのステップで分化される。培養は、最大２週間かかり得る。

ＷＯ２００８／０３６４２１は、被験者における、ＣＤ１ａおよびＣＤ８３のような（未成熟な）樹状細胞マーカの発現を増加させるためにreishi抽出物を使用することについて記載している。

ＷＯ２００８／０２８８２は、ランゲルハンス細胞またはＣＤ１４陽性単球から間質樹状細胞を製造するための方法であって、上皮細胞などを含む細胞環境の存在下において前記単球を判別することを含む方法を記載している。

ＷＯ２００４／０７６６５１は、単球樹状細胞の前駆体を未成熟な樹状細胞へ分化するための方法であって、追加のサイトカインの非存在下においてＧＭ−ＣＳＦを補った培地に非活性化樹状細胞の前駆体を接触させることを含む方法を記載している。

ＷＯ２００４／０８３３９２は、プラスチック製のチャンネルを有する装置を介して単球の流れから生じる力を用いて、血中における単球の機能的抗原提示樹状細胞への分化を誘導する方法を開示している。

ＵＳ２００４／０００９５９６は、樹状細胞の分化および成熟のためにインドの緑イガイからの抽出物を使用することを開示しており、前記抽出物はＧＭ−ＣＳＦの代替品として示唆されている。

ＵＳ２００５／０００８６２３は、様々な樹状細胞の種類を得るためにＣＤ１４陽性単球を使用することを記載している。分化は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦベータ１（およびＩＬ１３）によってもたらされる。

上記より、前駆細胞からＤＣを作製するために利用可能な方法について、さらなる改善が必要であることは当業者に明らかであろう。特に、培養のために必要な時間を短縮し、その結果として、培地の量およびそのような機能的なＤＣを得るために要求されるサイトカインなどの量を減らして、そのような培養費用を削減することにより、ＤＣの分化（および成熟）を促進することがそれらの方法に必要であることが明らかである。

上記の問題は、添付の特許請求の範囲のいずれかに述べた主題によって解決される。

驚くべきことに、ＣＤ３４陽性細胞を分化させることができること、および必要に応じて、その後、当該技術分野における公知の方法と比較して有利に短い期間内に様々なＤＣに成熟させることができることを見出した。

特に、上記の問題は、ＣＤ３４陽性細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させる陽性樹状細胞の生産方法によって解決される。このような方法で、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに細胞を接触させない従来技術による方法と比較して増進された細胞の生産は達成される。

本発明の方法では、このように、短期間で分化した細胞を得ることができる。短期間で当該細胞を得ることは、ＤＣに基づく治療ワクチンによる免疫療法におけるこれらの細胞の使用のために重要である。

本発明の方法によって得られる細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ発現の増加を示すことが見出された。したがって、本発明は、本発明の方法によって得ることができる、ＨＬＡ−ＤＲ発現が増加した新規の樹状細胞も提供する。

本発明は、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンを含む組成物がそれを必要とする患者に投与される、疾患の治療に関する。このような患者は、様々な免疫疾患と同様にがんに苦しむ可能性がある。がん治療の場合には、前記組成物は、ＤＣの成熟およびその後のＴ細胞の活性化の点から最適な効果のために、皮内に投与し得る。

従って、本発明は、免疫疾患の治療における、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンを含む組成物の使用に関する。

また、本発明は、皮内投与に適した形態である、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンを含む組成物のがん治療における使用に関する。

本発明の詳細な説明

本発明は、ＣＤ３４陽性細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させる、樹状細胞の製造方法を提供する。

当業者は、用語「ＣＤ３４陽性細胞」の意味を知っている。これは、細胞表面にＣＤ３４を発現している、初代細胞または細胞株を意味する。このような細胞は、ＤＣに分化する能力で知られている。

用語、「接触すること」または「接触させる」は、細胞が、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに、物理的および直接的に接触しており、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンがそれらの促進効果を、誘導するためおよび示すために十分な時間相互に作用させることとして理解される。実際には、例えば、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンは、維持および／または増殖および／またはＣＤ３４陽性細胞をＤＣに分化させるために使用するために培地に添加することができる。

アントラサイクリンおよびアントラセンジオンは、当業者に知られている。アントラサイクリンと同様にアントラセンジオンは、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の塩基対間に挿入されることにより、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を阻害し、急速に増殖するがん細胞の複製を防止する。それらは、ＤＮＡおよび細胞膜を損傷させる鉄媒介性遊離酸素ラジカルも生成する。アントラサイクリンおよびアントラセンジオンは、ＤＮＡ複製中にＤＮＡのねじり応力の逃げを防止するトポイソメラーゼＩＩ酵素を阻害することもできる。

構造面では、アントラサイクリンおよびアントラセンジオンは、以下の式１に示すように、アントラキノン構造を含む分子として定義し得る：

基本的なアントラキノン単量体は、様々な側鎖で修飾することができる。当業者は、機能的に活性である、アントラサイクリンおよびアントラセンジオンを取得するために側鎖を取り付けることができる正確な位置を知っている。機能的である、アントラサイクリンおよびアントラセンジオンを合成するための手順も、当技術分野で知られている。アントラサイクリンおよびアントラセンジオンの機能性を決定するためのin vitroにおける試験システムも当該技術分野において利用可能である。

また、本発明は、アントラサイクリンおよびアントラセンジオン類似体の使用に関する。このような類似体は、用語、アントラサイクリンおよびアントラセンジオン内に含まれる。また、そのような類似体は、本明細書において、記載および例示したように元の機能を保持した、アントラサイクリンおよびアントラセンジオンの化学的に修飾された構造からなり得る。アントラサイクリンおよびアントラセンジオンファミリーにおける既知のメンバーは、例えば、ダウノサミンのような、アミノ糖にグリコシド結合によって結合したテトラヒドロナフタセンディオン（tetrahydronaphthacenedione）環構造を有する化合物である。

ダウノルビシンおよびドキソルビシンのような数種の重要なアントラサイクリンの構造は以下の通りである。

アントラセンジオンも基本的なアントラキノン構造で構成されている。アントラセン環は、ケトン基を除いて任意の位置で置換することができる。臨床的に最も重要なアントラセンジオンであるミトキサントロンの分子構造は、以下の通りである。

本発明の方法は、必要な培養時間を短縮するので、サイトカインのような化学物質、および増殖培地などの必要性を低下させ、細胞の製造をより低価格とし、使用される化学物質および廃棄する化学物質を減らすという利点を提供する。

当業者は、本発明の方法が、実施例に示した例のように、好ましくは培養培地において分離された細胞、すなわち、当該分野における通常の技術を用いて培養された細胞を用いて実行され得ることを理解する。

この点において、用語「分離された細胞」は、培養された細胞または細胞株のような、それらの天然の環境から分離された細胞、好ましくは、同一の系統、表現型、および／または遺伝子型の細胞であると理解される。

したがって、本発明は、分離されたＣＤ３４陽性細胞を培養培地中に存在する、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させる、上述したような方法に関する。

本発明の方法において有利に使用され得る、アントラサイクリンおよびアントラセンジオンの例としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキサウノマイシン、イダルビシン、およびミトキサントロンを含む。

本発明の好ましい方法は、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキサウノマイシン、アンジダルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される方法である。

ミトキサントロン、ダウノルビシン、およびドキソルビシンは、使用される好ましい化合物である。

一般的には、アントラサイクリンの非存在下において細胞を培養した環境と比較して、樹状細胞を取得するために要求される時間を減少させる、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに細胞を接触させる任意の期間は、細胞を接触させるために適した期間である。接触のためのこのような期間は、例えば、前記アントラサイクリンの非存在下において、ある発生段階の樹状細胞を取得するために求められる期間と、前記アントラサイクリンの存在下において同一の発生段階の樹状細胞を取得するために要求される期間とを単に比較することにより、当業者により容易に決定され得る。

本発明の方法における好ましい実施形態では、ＣＤ３４陽性細胞を、１〜７日間、好ましくは１．５〜５日間、さらに好ましくは２〜４日間、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させる。

上述した期間に、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させられた細胞は、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンを添加せずに完全に機能的な樹状細胞に分化することが可能である期間よりも短い時間で、完全に機能的な樹状細胞に分化することができることが見出された。このことは、実施例においてさらに例示される。

本発明の方法で得られる細胞は、実施例から証明されるように完全に機能的な樹状細胞であり得る。本発明の方法で得られる成熟した細胞は、例えば、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に向かう遊走、ならびにナイーブＴ細胞の活性化および増殖に関して機能的であることがそこに示される。

上述の促進効果は、図１および図４に例示されるように、単に、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンをＣＤ３４陽性細胞に接触させることにより得られる。しかし、サイトカインのような追加の分化を誘導する化合物の存在も、ＣＤ３４陽性細胞が様々なＤＣに分化することの促進に寄与し得る。また、樹状細胞の成熟を誘導することができる追加の化合物の存在は、細胞の迅速な成熟を確実にする。

当業者は、用語、「細胞の分化を誘導することができる化合物」または「分化誘導化合物」は、単独または特定の組み合わせで、例えば培養培地中に、十分な量で存在するときに樹状前駆細胞の樹状細胞への分化を誘導できる化合物に関することを知っている。

よく知られている例としては、これらに限定されないが、サイトカイン（ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＰＧＥ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ１）、成長因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）、および抗体またはＬＰＳもしくはポリＩＣのような他の生物学的分子のような、それら自身を刺激する分子の生物学的な効果と比較した効果を誘導する、サイトカインまたは成長因子の代用分子を含む。

したがって、本発明は、上述のような方法に関し、樹状細胞の分化を誘導することができる少なくとも１つの化合物が培養培地中に存在する。樹状細胞の分化を誘導することができるそのような化合物は、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＰＧＥ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ１、およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から有利に選択される。

例えば、ＭＵＴＺ３細胞をサイトカインの存在下においてミトキサントロンとともにインキュベートしたときは、完全に分化した樹状細胞は、４日目において既に得られたが、ＭＵＴＺ３細胞を、サイトカインは存在するが、そのようなアントラサイクリンの非存在下においてインキュベートしたときは、８〜１０日目でしか完全に分化した細胞は得られなかった。系内におけるアントラサイクリンの存在による結果である、この分化促進は、被験者から単離したＣＤ３４陽性前駆細胞でも観察される。

ＣＤ３４−陽性前駆細胞が、単にアントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンとともにインキュベートされたとき、すなわちサイトカインの非存在下においてインキュベートされたときも分化が観察された。このことは、ＣＤ３４−陽性前駆細胞集団がミトキサントロンにさらされたとき、ＣＤ１４−、ＣＤ１ａ−Langerin、およびＣＤ８０−陽性細胞に分化することを示す図１Ｂにおいて説明される。

当業者は、細胞が、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンと同時に（実用的な理由から好ましい）、またはアントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させる前、もしくは接触させた後のどちらもでも細胞の分化を誘導することができる少なくとも１つの化合物に接触され得ることを理解する。

実用的な観点から好ましくはないが、別の方法において、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させること、および樹状細胞に分化することを誘導できる化合物に接触させることが考えられ得る。

特に有利な結果は、本発明の方法で得られ、細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）、ＴＮＦ−アルファ（腫瘍壊死因子アルファ）、ＩＬ−４（インターロイキン４）、ＴＧＦ−ベータ１（トランスフォーミング増殖因子ベータ）、またはそれらの組合せからなる群から選択される細胞の分化を誘導することができる少なくとも１つの化合物に接触させた。

さらには、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−アルファの組み合わせ、またはＴＧＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−アルファの組み合わせが、本発明の方法において有利に使用することができ、その使用は、樹状細胞を得るための、例えばミトキサントロンのような、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンとの組み合わせての使用である。ＣＤ３４陽性細胞が、そのようなアントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触されない方法と比較して、そのような細胞を短時間で得ることができる。

さらに、得られた細胞は、得られた細胞が、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に向かって遊走する、Ｔ細胞の増殖を促進する、および抗原特異的なＴ細胞のプライミングを促進するという事実から導かれるように、樹状細胞として完全に機能的であることを立証された（実施例を参照のこと）。

完全に成熟した樹状細胞を得るために、本発明の方法において、前記細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させた後、または接触させると同時に、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＰＧＥ−２、もしくはＩＬ−１ベータ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を用いて細胞をさらに処置することができる。このような処置により、未成熟な樹状細胞から成熟した樹状細胞を得ることができる。

当業者は、例えば未成熟な樹状細胞から、成熟した樹状細胞を得るための当該分野で利用可能な方法を承知している。例えば、未成熟な樹状細胞（未成熟ランゲルハンス型樹状細胞を含む）は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータ、およびプロスタグランジンＥ２を添加することで成熟させることができるが、当該分野において公知の他の方法が同様に使用できる。

したがって、本発明は、上述した方法に関し、樹状細胞の成熟を誘導することができる少なくとも１つの化合物が培養培地中に存在する。

成熟は、例えば、成熟マーカＣＤ８３の発現（Lechmann M, Berchtold S, Hauber J, Steinkasserer A（2002））によって証明することができる。このように、前記細胞は、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に向かって遊走する、ならびにＴ細胞の増殖を促進するという事実から証明できるように、樹状細胞として完全に機能的である（実施例を参照のこと）。

したがって、本発明の方法の好ましい実施形態は、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンによる処理、ならびに前記細胞の分化を誘導することができるさらなる化合物による任意の処理により処理された細胞を、未成熟ランゲルハンス樹状細胞のような未成熟樹状細胞を成熟させることができる化合物に接触させる。

このように、特に有利な結果は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータ、およびプロスタグランジンＥ２からなる群から選択される化合物を得ることができ、好ましくは、これらの化合物は組み合わせて使用される（実施例を参照のこと）。

本発明の方法の他の好ましい実施形態において、得られた樹状細胞は、間質性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ランゲルハンス樹状細胞、成熟樹状細胞、または未成熟な樹状細胞である。

当業者は、そのような樹状細胞の異なる種類を区別する方法を知っており、そのような方法は、例えばＵＳ２００４２６５９９８、および以下の実施例において詳細に記載されている。

例えば、未成熟な樹状細胞は、細胞表面の未成熟樹状細胞の主な特徴である、ＣＤ１ａおよび／またはＤＣｓｉｇｎの発現誘導により特徴付けることができる。同時に、そのような細胞は、ＣＤ８３の欠如または低発現によって特徴付けることができる。

ランゲルハンス細胞は、LangerinおよびＣＤ１ａの両者の発現により特徴付けられ、ＴＧＦ−ベータ１の影響下において誘導することができる（Cauxら、1997, Blood 90(4), 1458- 1470）。

形質細胞様樹状細胞は、例えば、McKenna K, Beignon A, Bhardwaj N（2005）「Plasmacytoid dendritic Cells: linking innate and adaptive immunity」 J. Virol. 79（1）：17 - 27、に記載されている。例えば、それらはＢＤＣＡ２（ＣＤ３０３）および／またはＣＤ１２３を発現しているが、それらはＣＤＬＣ陰性である。

本発明の方法の他の好ましい実施形態では、ＣＤ３４陽性細胞は、ＣＤ３４陽性ＭＵＴＺ３細胞、ＣＤ３４陽性ヒト細胞、またはＣＤ３４陽性腫瘍細胞である。

これらの細胞は、本発明の方法において、有益に利用することができることが見出された。

ＭＵＴＺ３は、ＣＤ３４陽性前駆体に由来する樹状細胞のサイトカイン誘導分化のためのヒト細胞株モデルであり、詳細は、ＵＳ２００４２６５９９８に記載されている。

ヒトに由来する、すなわち腫瘍に苦しむヒトに由来するＣＤ３４陽性細胞は、実施例に記載されたように、例えば血液から分離することができる。

驚くべきことに、ＭＵＴＺ３のような細胞株、およびヒトに由来する一次細胞は、本発明の方法におけるＣＤ３４陽性細胞として有益に使用することができることが見出された。このように、本発明の方法により得られた成熟細胞が、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に向かって遊走し、Ｔ細胞の増殖と抗原特異的なＴ細胞のプライミングとを促進するという事実から導かれるように、機能的な樹状細胞を得ることができる。例えば、ＣＤ１ａのＣＤ８３のような細胞表面マーカの特徴的な発現も示した。それらの細胞は、前記ＣＤ３４陽性細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させることを含まない、そのような樹状細胞を得るための方法と比較して非常に短い期間で得ることができる。

本発明の好ましい実施形態では、ＭＵＴＺ３細胞を、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、５〜２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、および０．５〜４ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファの存在下において、０．０５ｎＭ〜２０ｎＭのミトキサントロンおよび／または１０〜１２０ｎＭのドキソルビシンに接触させる。このような方法は、間質型樹状細胞をもたらす。

本発明の他の好ましい実施形態では、ＭＵＴＺ３細胞を、５〜２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、および０．５〜４ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファの存在下において、０．０５ｎＭ〜２０ｎＭのミトキサントロンおよび／または１０〜１２０ｎＭのドキソルビシンに接触させる。このような方法は、ランゲルハンス型樹状細胞をもたらす。

このように得られた前記細胞の有する、特性および利点は、以下の実施例に示される。

また、本明細書においては、方法が提供され、前記細胞は、好ましくは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキサウノマイシン、アンジダルビシン（andidarubicin）、およびミトキサントロンからなる群から選択される少なくとも１つの、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させられ、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンは、ＩＣ２０〜ＩＣ８０の範囲、好ましくはＩＣ３０〜ＩＣ７０の範囲の濃度（実施例において設定されたように決定した）で細胞に適用される。

本発明の他の態様において、本発明の方法により得られた樹状細胞の提供がある。これらの細胞は、細胞をアントラサイクリンに接触させない同様の方法により得られる細胞と比較して、それらはＨＬＡ−ＤＲ発現の増加を示す技術で特徴付けられ、そのような細胞と区別することができる。このことは、実施例において例示され、図６に示される。

用語「ＨＬＡ−ＤＲの発現の増加」は、本発明の方法により得られる細胞は、先行技術、すなわち、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンの添加をしない方法において培養された細胞と比較してＨＬＡ-ＤＲを高発現していることを意味していると解釈される。ＨＬＡ−ＤＲ発現は、ヘルパーＴ細胞に関する重要な要素である。

他の態様において、本発明は、好ましくは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキサウノマイシン、アンジダルビシン、ミトキサントロンからなる群から選択される、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンの使用であって、それが必要な対象の免疫疾患を治療するため、特に、免疫応答を促進することにより免疫疾患を治療するための薬剤の製造における使用を提供する。

言い換えれば、本発明は、免疫疾患の治療において使用するための、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンを含む組成物を提供する。

そのような、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンが、例えば、人体に注入することにより局所に適用されるとき、特に、ＤＣに分化することを誘導できるサイトカインと組み合わせたときに、良好で、促進された免疫応答を、治療されるべき被験者に誘導することができることが初めて見出された。

ＤＣは、抗がんワクチンとして使用することができることは当業者に知られている。本発明の方法により得られた細胞は、完全に機能的であり、短期間で、すなわち、促進された様式で得ることができるので、そのような細胞（およびそのような細胞を取得するための方法）は、そのようながんの治療に対する治療において、特に有益である。がんの治療においては、組成物の皮内投与が好ましい。アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンを、リンパ排出を介して、局在している真皮の樹状細胞と同様にリンパ節の樹状細胞に直接さらすのでこの投与経路は最適である。従来の静脈内投与の場合、血液循環中における赤血球のような無関係な細胞の圧倒的な数の存在がこの効果を妨げる。

したがって、本発明は、がんの治療において使用するための、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンを含む組成物に関し、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンは、皮内注射に適した形態である。

また、本発明のこの態様において、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンは、好ましくは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキサウノマイシン、アンジダルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される。

また、本発明のこの態様において、前記組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−４、およびＴＧＦ−ベータ１からなる群から選択される化合物のような、ＣＤ３４陽性細胞の分化を誘導することができる化合物をさらに含む。

本発明の他の態様において、抗がんワクチン治療、または自己免疫治療における、本発明の細胞の使用、またはそのような細胞を得るための本発明の方法の使用が提供される。言い換えれば、本発明の細胞の使用、または本発明の任意の方法から得られた細胞、またはがんもしくは自己免疫疾患の治療のための薬剤の製造における本発明の方法の任意の使用が提供される。

ＭＵＴＺ３前駆細胞は、ミトキサントロンの存在下において７２時間培養し、増殖（図１Ａ）およびＤＣマーカ発現（図１Ｂ）について分析した。ＣＤ１４またはＣＤ３４に基づく磁気ビーズソーティング（ＭＡＣＳ）により分離された、ＭＵＴＺ３の３つの集団内について、ＰＢＳまたはミトキサントロン処置下における、アポトーシスおよび細胞死のレベルである。ＭＵＴＺ３細胞における、ミトキサントロンまたはドキソルビシンの効果の表現型解析である。ＰＢＳまたはミトキサントロンとともに培養されたＬＣの４日目における、ＦＳＣ／ＳＳＣのプロットおよびこれらの培養におけるＣＤ１ａ／Langerin発現。ミトキサントロン処置は、大部分のＣＤ３４陽性細胞の喪失およびＣＤ１４陽性細胞をもたらした（図５Ａ）。ＬＣ−スキューイングサイトカイン（LC-skewing cytokines）の存在下において、１６．７ｎＭのミトキサントロンの添加は、７２時間以内に、ＣＤ１ａ^＋Langerin^＋細胞の割合の増加を強く誘導した（図５Ｂ）。図６は、ＣＤ１ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、Langerin、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＤ８３を発現している細胞の割合と、ミトキサントロンの存在下または非存在下で分化した、成熟７日目のＭＵＴＺ３−ＤＣ／ＬＣおよび成熟４日目のＭＵＴＺ３−ＤＣ／ＬＣにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＨＬＡ−ＤＲの平均蛍光強度とを示す。ミトキサントロンの存在下または非存在下で培養されたＭＵＴＺ３−ＤＣについて、トランスウェルアッセイ（tr ans-well assay）により、ケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に遊走するためのそれらの能力を分析し（図７Ａ）、Ｔ細胞の増殖を刺激するためのそれらの能力についてＭＬＲによって試験した（図７Ｂ）。ミトキサントロンの存在下において４日間培養したＭＵＴＺ３−ＤＣおよびコントロールとして培養７日目のＭＵＴＺ３−ＤＣについて、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための能力について分析した。培養７日目のＭＵＴＺ３−ｍＤＣおよび培養４日目のｍｉｔｏｘ−ｍＤＣは、ＭＡＲＴ１ペプチド（２６−３５Ｌ）を取り込み、ＨＬＡ−Ａ２陽性健常ドナー由来のＣＤ８ベータ陽性として選択されたＴ細胞内におけるＭＡＲＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するそれらの能力について分析した。６つの培養系を、それぞれのＤＣ細胞の種類で開始した。ペプチドを取り込んだＤＣの初回刺激の後、Ｔ細胞を、１０日後および１７日後にペプチドを取り込んだＤＣを用いて再刺激し、ＭＡＲＴ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞は、第１回目および第２回目の再刺激の後にＭＡＲＴ−テトラマ染色法を用いて分析した。２種類のＤＣに由来する、それぞれ６つの培養系内におけるＭＡＲＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が図に示される（点で表される）。ＭＡＲＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激における、培養４日目のｍｉｔｏｘ−ｍＤＣは、伝統的な培養７日目のｍＤＣ培養の分化と同様の能力であった。６つの培養系内におけるＭＡＲＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均割合は、横線により表わされる。

実施例１＜材料および方法＞
化学物質
全ての化学物質および薬剤は、Allen博士（Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, The Netherlands）から快く提供され、以前に記載した（van Loevezijn A.,（2001）Bioorg. Med. Chem. Lett 11, 29-32）Ｋｏ−１４３、およびFarmitalia Carlo Erba（Brussels, Belgium）から購入したドキソルビシンを除いて、Sigma Che mical Co.（St. Louis, MO）から取得した。

細胞培養
急性骨髄性白血病由来であるＣＤ３４陽性のＭＵＴＺ３細胞株は、以前に記載したように培養した（Masterson A.J.（2002）Blood 100, 7 01-703）。簡潔には、ＭＵＴＺ３前駆細胞を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍｌのナトリウムペニシリン、１００ｍｉｃｒｏｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ-グルタミン（pen/strep/glut）、５０ｍｉｃｒｏＭのベータ−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、および１０％の５６３７条件培地（ＭＵＴＺ３常用培地）を含むＭＥＭ−アルファ（Minimum essential medium, Gibco）中において、２０万細胞／ｍｌの濃度で１２ウェルプレート（Co-star）を用いて培養し、一週間に２回継代した。ＬＣは、２０％ＦＣＳ、pen/strep/glut、２ＭＥ、および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１（Biovision, Mountain View, CA）、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Sagramostim, Berlex）、および２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Strathmann Biotec）（ＭＵＴＺ３−ＬＣ培地）を含むＭＥＭ−アルファ中において、１０万細胞／ｍｌの濃度で１２ウェルプレートを用いて１０日間培養し、０日目、４日目、および７日目にサイトカインを添加した。間質性ＤＣは、２０％ＦＣＳ、pen/strep/glut、２ＭＥ、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（R&D）、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ、および２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（ＭＵＴＺ３−ＤＣ培地）を含むＭＥＭ−アルファ（Minimum essential medium, Gibco）であって、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファ、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（Strathmann Biotec）、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ（Strathmann Biotec）、および１ｍｉｃｒｏｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（Sigma Aldrich）を添加することにより、未成熟なＤＣおよびＬＣが、それぞれ成熟することのできるＭＥＭ−アルファ中において４８時間培養した。

ミトキサントロンおよびドキソルビシンの培養のために、１０〜２０万細胞／ｍｌのＭＵＴＺ３前駆細胞、または磁気ビーズソート（ＭＡＣＳ）された、ＣＤ３４＋、ＣＤ１４＋、および二重陰性（ＤＮ）のＭＵＴＺ３集団（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を、ＭＵＴＺ３常用培地またはＭＵＴＺ３−ＤＣ／ＬＣ培地中に、１．０４ｎＭ、２．０８ｎＭ、５．６ｎＭ、１６．７ｎＭのミトキサントロン、または１６．７ｎＭ、もしくは１００ｎＭのドキソルビシンの、存在下または非存在下において１２ウェルプレートに播種し、トリパンブルー排除による生細胞の定量化およびフローサイトメトリによる表現型解析の前に７２〜９６時間培養した。ＤＣおよびＬＣを、３日目または４日目に２４時間（上述のように）成熟させ、混合白血球反応または遊走分析で機能的であるか試験した。ＡＢＣトランスポータ阻害の場合には、２００ｎｍのＫｏ−１４３は、ＢＣＲＰ活性をブロックするために０日目に添加した。

ＣＤ３４＋造血性前駆細胞
ＣＤ３４＋造血性前駆細胞を、以前に記載したように血液から分離し、２５ｎｇ／ｍｌのｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）および１０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）とともに２〜５週間増殖させた（Bontkes HJ., de Gruijl TD., Schuurhuis GJ., Scheper RJ., Meijer C.J., & Hooijberg E.（2002）, Expansion of dendritic cell precursors form human CD34(+) progenitor cells isolated from healthy donor blood; growth factor combination determines proliferation rate and functional outcome. J. Leukoc. Bio. 72, 321-329）。これらの細胞におけるミトキサントロンの効果を検討するために、解凍し、増殖させたＣＤ３４＋前駆体細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３−ＬおよびＳＦＣ（幹細胞因子）の存在下において１６．７ｎＭのミトキサントロンとともに７２時間培養した。ＬＣの分化の効果を検討するために、ＣＤ３４＋前駆細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦベータ、および２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファの存在下において１６．７ｎＭのミトキサントロンとともに培養した。７２時間後、表現型解析をフローサイトメトリにより実行した。

ウエスタンブロット法
細胞ペレットを氷冷溶解緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、１ｍＭのＰＭＳＦ）で溶解させ、氷上に１時間保ち、超音波処理し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Bio-Rad, Richmond, CA）を用いて決定した。タンパク質を８％ポリアクリルアミドゲルで分画し、その後、エレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に転写した。ＢＣＲＰの検出のために、前記膜を一晩ブロック（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ、１％ミルクパウダ、および０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０）し、ブロッキング緩衝液中のＢｘｐ−５３（０．５μｇ／ｍｌ）Ｍａｂ（例えば、J. Vet. Pharmacol. Ther. 2006 Vol 29(4) p279-87を参照）とともに２時間インキュベートした。

ＨＲＰ共役化ウサギ抗ラットイムノグロブリンに続いて、ＰＢＳ中における、０．５ｇｌ^−１の３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸、０．１５ｇｌ^−１のクロロナフトール、および０．０２％の過酸化水素による発色により免疫反応力を可視化した。

フローサイトメトリによるイムノフェノタイプ分析
ＣＤ１ａ（１：２５）、ＣＤ５４（１：２５）、ＣＤ８０（１：２５）、ＣＤ８６（１：２５）、ＣＤ４０（１：１０）（PharMingen, San Diego, CA）、ＣＤ１４（１：２５）、ＨＬＡ−ＤＲ（１：２５）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（１：１０）（BD Biosciences, San Jose, CA）、ＣＤ８３（１：１０）、ＣＤ３４（１：１０）、Langerin（１：１０）（Immunotech, Marseille, France）のような、ＦＩＴＣ−および／またはＰＥ−共役化Ｍａｂｓを用いて細胞をイムノフェノタイプ分析した。
簡潔には、２．５〜５・１０^４個の細胞を、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ_３を添加したＰＢＳで洗浄し、４℃で３０分間、特異的または対応するコントロールＭａｂｓとともにインキュベートした。該当する場合、マーカ染色後、解析の１０分前に、アネキシンＶおよび／またはＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を添加した。細胞を洗浄し、CellQuest解析ソフトウェアを搭載するＦＡＣＳ−キャリバーフローサイトメータ（Becton and Dickinson, San Jose, CA）で解析し、結果は、平均もしくは中央蛍光強度、または陽性細胞の割合として表した。

混合白血球反応（ＭＬＲ）
９６ウェルプレートを用いて１・１０^５末梢血リンパ球とともに４日間、１０％ヒトプール血清（ＨＰＳ）、pen/strep/glut、および２ＭＥを含むＩＭＤＭ（Iscove’s modified dulbecco’s medium）中において１・１０^２〜３・１０^４ＤＣを共培養した。４日目に、２．５μＣｉ／ｍｌの［^３Ｈ］−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、MP Biomedicals, Irvine, CA）をウェル毎に１６時間添加した。プレートは、Skatron Cell harvester（Skatron Instruments, Norway）を用いて、ガラスファイバフィルタマット（Packard Instruments, Groningen, The Netherlands）上に収集し、［^３Ｈ］−チミジンの取り込みをTopcount NXT Microbetacounter（Packard, Meriden, CT）を用いて定量した。

in vitroにおけるＣＴＬ−プライミング
in vitroにおけるＭＡＲＴ１に特異的なＣＴＬのプライミングを、以前に記述したように行った（Santegoets SJAM,（2006）Cancer Immunol Immunother. 55,1480-1490）。簡潔には、１００万細胞／ｍｌの濃度の成熟した７日目のＭＵＴＺ３−ＤＣおよび４日目のｍｉｔｏｘ−ＤＣに、３μｇ／ｍｌのβ２−マイクログロブリン（β２Ｍ）の存在下において、１μｇ／ｍｌのＭＡＲＴ１の２６〜３５Ｌペプチドを無血清のＩＭＤＭ中で３〜４時間取り込ませた。取り込み後、細胞に５０００ｒａｄを照射し、洗浄し、２％ｈＡＢ血清（ICN Biochemicals）、pen/strep/glut、２ＭＥ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ６、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１２を添加した、Yssels培地（Yssel H.（1984年）J Immunol Methods. 72,219-227）中において２０万細胞／ｍｌに濃縮した。取り込みを行った１０万個のＤＣを、Yssels培地中で希釈した、磁気ビーズソーティングによりＨＬＡ−Ａ２＋ドナーから分離した１００万個のＣＤ８β＋Ｔ細胞および同一のドナーに由来する照射されたＣＤ８β細胞の両者とともに共培養した。それぞれのＤＣの条件については、６プライミングウェルで開始し、２人の異なるＨＬＡ−Ａ２＋ドナーで実験を行った。１０日目および１９日目には、ＣＴＬを、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下において、ＭＡＲＴ１の２６〜３５Ｌを取り込んだ、成熟した７日目のＭＵＴＺ３−ＤＣまたは４日目のｍｉｔｏｘ−ＤＣを用いて再刺激した。１２日目および２１日目に、１０ＩＵ/ｍｌのＩＬ−２を各ウェルに添加した。ＭＡＲＴ１四量体（Ｔｍ）解析を、ＰＥ−およびＡＰＣ−標識したＭＡＲＴ１の２６〜３５Ｌ四量体を用いて、１７日目（第１回目の再刺激後）、および２４日目（第２回目の再刺激後）にＣＤ８＋Ｔ細胞について実行した。

統計解析
データの統計解析は、対応のある、または対応のない両側スチューデントt検定（paired or unpaired two-tailed student’s T-test）を用いて行った。ｐ＜０．０５である場合に、相違を統計学的に有意であるとした。

実施例２：ＭＵＴＺ３前駆細胞のミトキサントロンに対する感度
ＭＵＴＺ３前駆細胞について、細胞増殖抑制薬ミトキサントロンに対するそれらの感度の分析を行った。この薬は、数種類のがんまたは多発性硬化症のような他の疾患を治療するためにクリニックで今でも使用されており、ＭＤＲに関連するＡＢＣトランスポータの基質であることが記載されている。９６時間cytotoxアッセイ（トリパンブルー排除）を、ＭＵＴＺ３前駆細胞におけるミトキサントロンのＩＣ５０値を決定するために行った。

ＭＵＴＺ３前駆細胞は、１．５±０．５ｎＭ（ｎ＝３）のＩＣ５０値でミトキサントロンに感受性であった。（そのようなトリパンブルー法の例としては、適したチューブに適当量の細胞懸濁液を入れ、等量の０．４％トリパンブルーを添加して、穏やかに撹拌し、室温で５分間放置する。血球計に１０μｌの染色された細胞を入れ、生細胞（無染色）および死細胞（染色）の数を数える。それぞれの象限における無染色の平均細胞数を計算し、算出された細胞／ｍｌに２・１０^４を乗算する。生存細胞の割合は、死細胞および生細胞の数によって除算した生細胞の数であり、ＩＣ５０を決定することができる。）

実施例３：ミトキサントロンはＭＵＴＺ３前駆細胞の分化を誘導する
ＭＵＴＺ３前駆細胞におけるミトキサントロンの細胞毒性効果の試験において、明白な形態学的変化が、５．６ｎＭ（ＩＣ６０）および１６．７ｎＭ（ＩＣ７０）ミトキサントロンの濃度で観察された。このため、ＭＵＴＺ３前駆細胞は、これらの濃度下において、７２時間培養し、増殖（図１Ａ）および細胞マーカの発現（図１Ｂ）について分析した。この分析は、これらのミトキサントロン濃度は劇的に細胞の分裂を妨げるが、ＣＤ１４＋集団の分化を支持するＣＤ３４^＋／ＣＤ１４^＋率の変化があったように、生き残っているＭＵＴＺ３前駆細胞の分化を促進すること、ミトキサントロン処置は、ＬＣ−特異的マーカである、ＣＤ１ａおよびLangerinの発現を誘導すること、ならびにミトキサントロン処置は、共刺激分子である、ＣＤ８６およびＣＤ８０の発現レベルを増加させること（図１Ｂ）を明らかにした。同様の実験を、薬剤ドキソルビシンを用いて行った。ミトキサントロンのように、ＭＵＴＺ３におけるＩＣ７０（〜１００ｎｍ）のドキソルビシンは、ＭＵＴＺ３前駆細胞のＬＣ分化を誘導した。一方、１６．７ｎＭのドキソルビシン（ミトキサントロンと同じ濃度）を添加したときは、影響は観察されなかった。

図２は、ＣＤ１４またはＣＤ３４に基づく磁気ビーズソーティング（ＭＡＣＳ）より分離された、３つのＭＵＴＺ３集団について、ＰＢＳまたはミトキサントロン処置下における、アポトーシスおよび細胞死のレベルを示す。ＰＢＳコントロールにおいて、アポトーシスまたはネクローシスはほとんど存在しなかった（図２Ａ）。ＣＤ１４⁺の集団は、ＰＢＳまたはミトキサントロン処置の７２時間後において、同様の量のＣＤ１４^＋アネキシンＶ陽性細胞が存在していたように、ミトキサントロンの処置により影響されなかった。ＣＤ３４⁺およびより少ない程度のＤＮ集団は、薬剤に対して感受性であった。しかし、細胞死にもかかわらず、増殖したＣＤ３４＋細胞のある割合は、ミトキサントロン処置を生き残った。１００ｎｍのドキソルビシンを用いて類似の結果が得られた。

実施例４：ＣＤ１４+ではなく、ＣＤ３４＋ＭＵＴＺ３細胞は、薬物誘発性の分化を示す
スキューイング効果（skewing effect）が、変更されたＣＤ３４⁺／ＣＤ１４⁺率を自動的に導くＣＤ３４^＋細胞の細胞死によるものか、ＣＤ３４^＋細胞がＣＤ１４^＋細胞およびＬＣに分化することを誘導するのかを確かめるために、分離された、ＣＤ３４^＋およびＣＤ１４^＋細胞を、１６．７ｎＭミトキサントロンまたは１００ｎｍのドキソルビシンとともに７２時間インキュベートし、分化誘導について分析した。

表現型の解析は、ＭＵＴＺ３細胞における、ミトキサントロンまたはドキソルビシンの効果がＣＤ３４^＋集団に寄与できることを明らかにした（図３）。薬剤処置細胞とＰＢＳコントロールとの間における、ＣＤ１ａ^＋またはLangerin^＋細胞の割合について変化が無かったように、ＣＤ１４^＋細胞は、１６．７ｎＭのミトキサントロンまたは１００ｎｍのドキソルビシンとともにインキュベートした影響は認められなかった（図３Ａ）。両者の薬剤の処置下におけるＣＤ３４^＋細胞に由来する培養にはより多くのＣＤ１４^＋細胞が存在し（図３Ｂ）、薬剤処置はＣＤ３４^＋ソートされた細胞のＣＤ１ａ^＋細胞への分化をもたらし、当該ＣＤ１ａ^＋細胞の約５０％はＬＣ−マーカであるLangerinも発現する（図３Ｂ）。この分化の効果は、前方散乱／側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）により可視化もできる。ＳＳＣにおける明確なシフトは、薬剤処置されたＣＤ３４^＋細胞において観察され、当該シフトは薬剤処置されたＣＤ１４^＋細胞においては存在しなかった（図３Ａ、およびＢ）。図３Ｃにおけるグラフは、ＰＢＳ、ミトキサントロン、およびドキソルビシン処置の７２時間後に２つの分離した集団内における、ＣＤ１ａおよびLangerinの発現の平均的誘導を表す。薬剤処置されたサンプルと、ＰＢＳコントロールサンプルとの間においてＣＤ１４^＋集団内では、ＣＤ１ａまたはLangerin発現について相違は観察されなかった。ＣＤ３４^＋集団では、１６．７ｎＭのミトキサントロンとのインキュベーションは、ＣＤ１ａおよびLangerin発現の両者について顕著な増加を導いた（ＣＤ１ａについてｐ＝０．０２、Langerinについてｐ＝０．０３）。ドキソルビシンは、ＣＤ３４^＋ＭＵＴＺ３細胞において、ＣＤ１ａおよびLangerinの発現も誘導する。

ミトキサントロンは、ＡＢＣトランスポータであるＢＣＲＰ（ＡＢＣＧ２）の最もよく知られている基質であるので、我々は、３つの集団の間におけるＢＣＲＰの異なる発現レベルによって感度の相異を説明できるかどうかを確かめた。ＣＤ１４^＋、ＣＤ３４^＋、またはＤＮの集団におけるウエスタンブロット分析によっては、ＢＣＲＰ発現は検出できなかった（データは示されていない）。ＢＣＲＰ抑制剤であるＫｏ−１４３の添加も、ミトキサントロン処置後のＣＤ３４^＋ＭＵＴＺ３細胞における、ＣＤ１ａおよびLangerin発現の誘導を抑制することができず、観察された効果はＢＣＲＰ活性から独立していることを示唆する。

実施例５：ミトキサントロンおよびドキソルビシンはＬＣの分化を促進させる
次に、我々は、ＭＵＴＺ３−ＬＣ培養の開始時における、ミトキサントロンまたはドキソルビシンの添加は、分化を促進することができるかどうかについて試験した。ＭＵＴＺ３−ＬＣ分化の０日目における１６．７ｎＭのミトキサントロンの単回用量の添加は、４日目に特定のＬＣマーカを高発現した完全に分化した細胞をもたらした。これに対して、コントロール培養においては、通常、完全に分化するために８〜１０日かかる。ＰＢＳまたはミトキサントロンとともに培養した４日目のＬＣのＦＳＣ／ＳＳＣプロットと、これらの培養におけるＣＤ１ａ／Langerinの発現とを図４Ａに示す。ミトキサントロンにより処置されたＬＣは、ＦＳＣ／ＳＳＣプロットにおいてさらに樹状細胞的形態を示し、コントロール細胞における２５％に比較して約７６％の細胞は、ＣＤ１ａ^hiLangerin^＋であったようにさらに分化した。これらの細胞は、ＣＤ１ａおよびLangerinの他に共刺激分子である、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現増強も示し、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ５４を高発現した。図４Ｂは、ＣＤ１ａ、Langerin、およびＣＤ８３についての３つの実験データの組み合わせを示す。既に述べた、ＣＤ１ａおよびlangerinを発現している細胞の割合の大幅な増加（それぞれ、ｐ＝０．０２、およびｐ＝０．０１）の他に、ＣＤ１４^＋およびＣＤ３４^＋細胞の割合の大幅に減少し（それぞれ、ｐ＝０．０４、およびｐ＝０．０２）、ならびに成熟マーカＣＤ８３を発現している細胞の量が大幅に増加した（ｐ＝０．０３）。

ＣＤ３４＋造血性前駆細胞はミトキサントロンに応答する
血液に由来するヒトＣＤ３４^＋前駆体が、ＣＤ３４^＋ＭＵＴＺ３細胞と同様にミトキサントロンに反応するかどうかを確立するために、ヒト血液からＣＤ３４^＋造血前駆体を分離し、液体窒素から解凍した、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン、および幹細胞因子（ＳＣＦ）（Bontkesら、J. Leukoc. Biol. 2002 Vol 72(2)：321）とともに１〜４週間以上増殖させ、ミトキサントロンにより処置した。ミトキサントロン治療は、大部分のＣＤ３４^＋細胞の損失とＣＤ１４^＋細胞（図５Ａ）の増加とをもたらした。ＬＣ−スキューイングサイトカインの存在下において１６．７ｎＭミトキサントロンの添加は、CD1a^＋Langerin^＋細胞の割合の増加を７２時間以内に強く誘導した（図５Ｂ）（ｎ＝２）。対照的に、同様の実験を血液から分離されたＣＤ１４^＋単球について実行したとき、ＣＤ１４^＋ＭＵＴＺ３データと同様に、細胞生存率における影響は認められず、分化誘導も全く認められなかった。

実施例７：ミトキサントロンとともに培養したＤＣは機能的である
このような分化促進能力について、ミトキサントロンは、免疫ワクチン接種戦略のためのＤＣワクチンのin vitroにおける分化を高速にするために適したアジュバントであり得る。したがって、我々は、分化の利点を失うことなく、生細胞の収量の優位性を有したまま、ミトキサントロンの濃度を低減することができるかどうか分析した。ＭＵＴＺ３−ＤＣおよびＭＵＴＺ３−ＬＣ培養において、２段階滴定を１６．７ｎＭのミトキサントロン濃度について実行し、ＤＣ／ＬＣ表現型を７２〜９６時間後に分析した。ＭＵＴＺ３−ＤＣおよびＭＵＴＺ３−ＬＣの分化の強い効果は、分化の間に２．０８ｎＭのミトキサントロンを添加したときまで観察された。興味深いことに、ミトキサントロンを補ったＭＵＴＺ３−ＤＣの培養において、ミトキサントロンのＬＣ−スキュー容量を示唆する、Langerin発現が増加した。図６は、ＣＤ１ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、Langerin、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＤ８３発現細胞の割合を示し、また、成熟７日目におけるＭＵＴＺ３−ＤＣ／ＬＣのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＨＬＡ−ＤＲの平均蛍光強度と、ミトキサントロンの存在下または非存在下で分化した成熟４日目におけるＭＵＴＺ３−ＤＣ／ＬＣの平均蛍光強度とを示す。どちらの場合でも、２．０８ｎＭのミトキサントロンの添加は、ＣＤ１ａ、Langerin、ＣＤ８０、ＣＤ４０、およびＣＤ８３を発現している細胞の量を増加させ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＨＬＡ−ＤＲの発現量の促進もした。ＨＬＡ−ＤＲの発現についてもコントロール培養に比べて高い値を示した（図６）。

このようなミトキサントロンで生成されたＤＣは、将来のワクチン接種戦略に使用する場合、それらの機能は完全に活性化されている必要がある。したがって、ミトキサントロンの非存在下または存在下において培養されたＭＵＴＺ３−ＤＣについて、ケモカインである、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に向かって遊走する能力についてトランスウェルアッセイで分析した（図７Ａ）。また、同種のＴ細胞増殖を刺激するそれらの能力についてＭＬＲで試験した（図７Ｂ）。未処理の成熟４日目の細胞とは異なり、ミトキサントロンで生成された４日目のＤＣは、ＬＮホーミングケモカインに向かって遊走するそれらの能力について、７日目の成熟したコントロールＤＣに匹敵するものであり、Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を備えていた。

実施例８：ミトキサントロンはヒトの皮膚のＤＣ遊走を刺激することができる
ミトキサントロンが局所的なアジュバントとして有益であるかどうかを確立するために、ヒト皮膚片を、２．０８ｎＭ、５．６ｎＭ、または１６．７ｎＭのミトキサントロンと組み合わせて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに皮内注入し、６ｍｍのパンチバイオプシを同一の濃度のミトキサントロンを含む培地に浮かべた。皮膚ＤＣは、２日間前記バイオプシから遊走させておき、その後、収集し、定量し、および表現型を解析した。図７Ｃは、２．０８ｎＭまたは５．６ｎＭのミトキサントロン注入は、約５０〜６０％遊走細胞の量を増加させることを示す。１６．７ｎＭのミトキサントロンの注入は、おそらく、遊走しているＤＣまたは遊走したＤＣにおける細胞死の誘導によって、わずかに遊走細胞の量を増加させたのみであった。

結論として、これらの結果は、細胞傷害性薬剤である、ミトキサントロンおよびドキソルビシンのようなアントラサイクリンを高濃度で使用すれば、ＣＤ３４^＋前駆細胞のＤＣへの分化を促進することが可能であり、ミトキサントロンを低濃度で使用すれば、異なるサイトカインと組み合わせてＤＣの分化を効率よく促進することができる（in vitroにおいて）ことを示す。これらの迅速に分化された（４日）アントラサイクリンにより生成されたＤＣは、ケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に向かう遊走、ならびにＴ細胞の増殖の促進について、従来の長期間培養されたＤＣ（７日）と同様の能力であった。これに加えて、普通培地において、特にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と組み合わせたミトキサントロンの低用量の皮内注入は、皮膚に遊出するＤＣの量を増加することを示した。

実施例９：ミトキサントロン培養されたＤＣは抗原特異的Ｔ細胞を刺激することができる
抗腫瘍ワクチン接種戦略における、ＤＣの非常に重要な機能は、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを刺激する細胞の能力である。したがって、４日目のｍｉｔｏｘ−ｍＤＣおよび７日目のＭＵＴＺ３−ｍＤＣについて、ＭＡＲＴ１特異的なＣＴＬをin vitroで刺激するそれらの能力を分析した。両方の種類のＤＣは、大量培養におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の集団内のＭＡＲＴ１特異的な四量体（Ｔｍ）陽性細胞の存在によって分析したようにＭＡＲＴ１特異的なＣＴＬを誘導することができた（図８）。ＭＡＲＴ１Ｔｍ＋ＣＴＬは、ＣＴＬ刺激がイニシエートされた１２の大量培養から、培養４日目のｍｉｔｏｘ−ＤＣで刺激した１２／１２の培養において検出することができた。それと比較して、７日目のコントロールＭＵＴＺ３−ｍＤＣで刺激した１１／１２の培養において、ＭＡＲＴ１Ｔｍ＋ＣＴＬを検出することができた。図５ｄは、ペプチドを取り込んだＤＣを用いた２回目の再刺激後、１人のＨＬＡ−Ａ２＋ドナーに由来する６つの大量培養についてＴｍ＋ＣＴＬの割合を示す。

これらの結果は、アントラサイクリンである細胞毒性薬ミトキサントロン（および、ドキソルビシン）が、生存しているＣＤ３４^＋ＤＣ前駆体の分化を誘導することを示す。さらに、ＤＣまたはＬＣ−スキューイングサイトカインとの組み合わせを分化の開始時に添加したときに、この薬剤は分化を劇的に促進した。

我々のデータは、ＣＤ１４^＋前駆細胞ではなく、ＣＤ３４^＋前駆細胞をミトキサントロンのようなアントラサイクリンで処理すると細胞死を引き起こすにもかかわらず、ランゲルハンス細胞の分化の誘導および促進を示した。ＣＤ３４^＋前駆細胞は、薬剤感受性であるが、この感度は、分化を誘導するサイトカインが存在するときに減少した。予防接種の目的に使用するための、全てのi n vitroにおいて培養されたＤＣにとって重要なのはＤＣの機能的能力である。アントラサイクリン（例えば、ミトキサントロン）で生成されたＤＣは３日間しか分化せず、標準的なサイトカイン成熟化カクテルを用いて２４時間で成熟するが、ケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１に向かって完全に遊走することができ、Ｔ細胞の増殖を効率的に誘導することができた。このように、このＤＣの分化方法は、予防接種の目的のために（ｃ）ＧＭＰレベルにおいてin vitro培養によりＤＣを生成する、時間消費が少なく費用対効果の高い方法である。

加えて、前記データは、ミトキサントロンのようなアントラサイクリンの局所的な投与は、サイトカインと組み合わせてヒト皮膚切片からの効率的で促進されたＤＣの遊走を誘導することができることを示す。これらの知見は、ミトキサントロンのようなアントラサイクリンは、ＤＣの活性化または局所的な前駆体からの分化を抑制し得る、皮膚（好ましくは、予防接種の部位）または腫瘍のような末梢部位におけるＤＣの活性化を誘導することができることを示す。例えば、悪性黒色腫の皮膚では、腫瘍部位は、簡単に接近可能であり、解剖学的位置（皮膚）は、ターゲット可能／薬剤として使用可能なＬＣ前駆細胞の存在を確実にする。特に細胞増殖抑制剤の局所投与後、数種のメラノーマ細胞の細胞死およびミトキサントロンのようなアントラサイクリンによるＬＣの分化の迅速な誘導を導く腫瘍抗原の豊富な存在は、優れた抗腫瘍免疫反応を生じさせる可能性がある。

Claims

ＣＤ３４陽性細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンにin vitroで接触させ、それによって、前記ＣＤ３４陽性細胞に由来する樹状細胞の産生速度を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに接触させないＣＤ３４陽性細胞に比べて高め、
前記ＣＤ３４陽性細胞を樹状細胞に分化させ、
樹状細胞を回収することを特徴とする、樹状細胞の生産方法。
前記ＣＤ３４陽性細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに培養培地中で接触させることを特徴とする、請求項１に記載の樹状細胞の生産方法。
前記アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、オキサウノマイシン、アンジダルビシン（andidarubicin）、およびミトキサントロンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の樹状細胞の生産方法。
前記ＣＤ３４陽性細胞を、アントラサイクリンおよび／またはアントラセンジオンに、１〜７日間接触させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の樹状細胞の生産方法。
樹状細胞の分化を誘導することができる少なくとも１つの化合物が培養培地中に存在することを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の樹状細胞の生産方法。
樹状細胞の分化を誘導することができる化合物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−４、およびＴＧＦ−ベータ１からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の樹状細胞の生産方法。
樹状細胞の成熟を誘導することができる少なくとも１つの化合物が培養培地中に存在することを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の樹状細胞の生産方法。
樹状細胞の成熟を誘導することができる化合物は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＰＧＥ２、またはＩＬ−１ベータからなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の樹状細胞の生産方法。
前記樹状細胞が、間質樹状細胞、未成熟な樹状細胞、ランゲルハンス樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、および成熟樹状細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の樹状細胞の生産方法。
前記ＣＤ３４陽性細胞が、ＭＵＴＺ３細胞、ヒト細胞、またはヒト腫瘍細胞である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の樹状細胞の生産方法。
前記ＭＵＴＺ３細胞を、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、５〜２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、および０．５〜４ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファの存在下において、０．０５ｎＭ〜２０ｎＭのミトキサントロンおよび／または１０〜１２０ｎＭのドキソルビシンに接触させることを特徴とする、請求項１０に記載の樹状細胞の生産方法。
前記ＭＵＴＺ３を、５〜２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、および０．５〜４ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファの存在下において、０．０５ｎＭ〜２０ｎＭのミトキサントロンおよび／または１０〜１２０ｎＭのドキソルビシンに接触させることを特徴とする、請求項１０に記載の樹状細胞の生産方法。
前記樹状細胞は、ＨＬＡ−ＤＲの発現が増加した樹状細胞であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の樹状細胞の生産方法。