ES2621406T3 - Método de inducción y de aceleración de células - Google Patents

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Abstract

Método in vitro para la producción acelerada de células dendríticas en un medio de cultivo que comprende las etapas de: a) poner en contacto células CD34 positivas con una antraciclina y/o una antracenodiona durante un periodo de entre 1 y 7 días, b) permitir que las células CD34 positivas se diferencien en células dendríticas, c) obtener dichas células dendríticas del medio de cultivo.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de induccion y de aceleracion de celulas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de celulas dendnticas funcionales en el que celulas CD34 positivas se ponen en contacto con compuestos que inducen y que aceleran la diferenciacion de estas celulas CD34 positivas en celulas dendnticas funcionales. Mas en particular, las celulas CD34 positivas se ponen en contacto con antraciclinas y/o antracenodionas. En el presente documento tambien se desvelan celulas obtenibles por el metodo segun la invencion. En el presente documento tambien se describe el uso de compuestos tales como antraciclinas y/o antracenodionas que inducen y aceleran la diferenciacion de celulas CD34 positivas en celulas dendnticas funcionales en la fabricacion de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria en seres humanos en necesidad de la misma.
Antecedentes de la invencion
Las celulas dendnticas (DC) son las celulas presentadoras de antfgenos (APC) mas poderosas y desempenan una funcion crucial en iniciar la respuesta inmunitaria. En vista de sus propiedades unicas, se han propuesto DC como herramienta para potenciar la inmunidad contra agentes infecciosos y en estrategias de vacunas contra el cancer. En los ultimos anos se ha investigado ampliamente el desarrollo de DC.
Entre las celulas presentadoras de antigenos (APC) profesionales, las DC estan especializadas en la recogida y procesamiento de antfgenos en fragmentos de peptido que se unen a moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Localizadas en la mayona de los tejidos, las DC migran desde la periferia hasta los organos linfoides secundarios tales como el bazo y los ganglios linfaticos, donde los linfocitos T espedficos de antigeno reconocen, mediante el receptor de linfocitos T, los complejos de peptido-MHC presentados por DC. Mientras que otras APC profesionales y no profesionales pueden solo estimular los linfocitos T activados o de memoria, las DC tienen la capacidad unica de sensibilizar a linfocitos T intactos y quiescentes.
Dada su funcion crucial en controlar la inmunidad, se ha propuesto la funcion terapeutica de DC para muchas enfermedades que implican la activacion de linfocitos T, tales como enfermedades autoinmunitarias y trastornos neoplasicos. La pulsacion ex vivo con antfgenos tumorales y la posterior reinfusion de DC puede conducir a proteccion contra tumores en animales. Para tratar la eficacia de estrategias de inmunoterapia de tumores basadas en DC en seres humanos, actualmente estan en progreso varios ensayos clmicos que implican a DC.
Las DC se desarrollan a partir de celulas precursoras hematopoyeticas en la medula osea, pasando a traves de etapas secuencialmente diferentes de diferenciacion tales como celulas precursoras intermedias en sangre y DC inmaduras en tejidos y organos perifericos (Banchereau et al. 2000, Ann. Rev. Immunol. 18, 767-811). Una vez que han llegado al tejido, las DC inmaduras asumen una funcion sensora importante que se caracteriza por una alta captacion activa de antfgenos del medio circundante. Tras la estimulacion por senales externas ("senales de peligro") tales como infecciones bacterianas o virales o procesos inflamatorios, las DC migran a los organos linfaticos perifericos, sometiendose allf a diferenciacion en DC maduras, y linfocitos T activantes por presentacion a antfgenos.
Pueden obtenerse DC diferenciando celulas progenitoras bajo la influencia de diversas moleculas. Por ejemplo, celulas progenitoras derivadas de medula osea (BM) murina podnan diferenciarse en DC mieloides en presencia de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF). En seres humanos, se mostro que la adicion de factor de necrosis tumoral a (TNF-a) a GM-CSF e IL-4 induda el desarrollo de DC a partir de celulas CD34 positivas (celulas CD34+) purificadas de medula osea, sangre del cordon (CB) y sangre periferica (PB).
Jacobs et al. (Horm Metab Res. 2008 Feb;40(2):99-107) han dado una vision general de los subtipos de celulas dendnticas y la generacion in vitro de celulas dendnticas. El artfculo describe la identificacion de diferentes subpoblaciones de DC que incluyen diferencias fenotfpicas y funcionales y describe desarrollos recientes sobre protocolos para la generacion de DC. Describe que se conocen diversas citocinas y factores de transcripcion que son responsables del desarrollo de subpoblaciones de DC. Dependiendo de la subpoblacion y el estado de maduracion de estas celulas, son tanto capaces de inducir una amplia respuesta inmunitaria citotoxica, y por tanto representan una herramienta prometedora para las terapias de vacunacion contra el cancer en seres humanos, como de inducir tolerancia inmunitaria y son importantes en el contexto de autoinmunidad.
Las citocinas son protemas secretadas pequenas que median y regulan la inmunidad, inflamacion y hematopoyesis. Se producen de novo en respuesta a un estfmulo inmunitario. Generalmente (aunque no siempre) actuan a distancias cortas y periodos de tiempo cortos y a concentracion muy baja. Actuan uniendose a receptores de membrana espedficos, que entonces senalizan la celula mediante segundos mensajeros, frecuentemente tirosina cinasas, para alterar su comportamiento (expresion genica). Las respuestas a citocinas incluyen aumentar o disminuir la expresion de protemas de la membrana (que incluyen receptores de citocinas), proliferacion y secrecion de moleculas efectoras.
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Citocina es un nombre general; otros nombres incluyen linfocina (citocinas producidas por linfocitos), monocina (citocinas producidas por monocitos), quimiocina (citocinas con actividades quimiotacticas) e interleucina (citocinas producidas por un leucocito y que actuan sobre otros leucocitos). Las citocinas pueden actuar sobre las celulas que las secretan (accion autocrina), sobre celulas proximas (accion paracrina), o en algunos casos sobre celulas distantes (accion endocrina).
Es comun que diferentes tipos de celulas secreten la misma citocina o que una unica citocina actue sobre varios tipos diferentes de celulas (pleiotropfa). Las citocinas son redundantes en su actividad, que significa que funciones similares pueden ser estimuladas por diferentes citocinas. Las citocinas se producen frecuentemente en una cascada, ya que una citocina estimula a sus celulas diana para producir citocinas adicionales. Las citocinas tambien pueden actuar sinergicamente (dos o mas citocinas que actuan juntas) o antagomsticamente (citocinas que causan actividades opuestas). Su corta semivida, bajas concentraciones plasmaticas, pleiotropfa y redundancia complicaron todos el aislamiento y la caracterizacion de las citocinas.
Las citocinas son producidas por muchas poblaciones de celulas, pero los productores predominantes son los linfocitos T cooperadores (Th) y macrofagos. El grupo de citocinas mas grande estimula la proliferacion y diferenciacion celular inmunitaria. Este grupo incluye interleucina 1 (IL-1), que activa linfocitos T; IL-2, que estimula la proliferacion de linfocitos T y B activados por antfgeno; IL-4, IL-5 e IL-6, que estimulan la proliferacion y diferenciacion de linfocitos B; interferon gamma (IFNg), que activa macrofagos; e IL-3, IL-7 y factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos (GM-CSF), que estimulan la hematopoyesis.
Ademas de GM-CSF y TNF-a, se ha mostrado que un amplio espectro de citocinas influye en el crecimiento y la diferenciacion de progenitores de DC. Factores de crecimiento de accion temprana, tales como factor de celulas madre (SCF) y ligando Flt-3 (Flt-3L), apoyan y expanden el numero de progenitores de DC, mientras que se ha mostrado que la IL-3 en combinacion con GM-CSF potencia la diferenciacion de DC. Ademas, el factor de crecimiento transformante (TGF)-betal potencia el desarrollo in vitro de DC tipo Langerhans.
En ciertas lmeas dendnticas humanas como, por ejemplo, la lmea celular MUTZ3, las celulas se diferencian en DC bajo la influencia de citocinas como GM-CSF, IL-4 y TNF-alfa, mientras que GM-CSF, TGF-beta1 y TNF-alfa tambien potencian el desarrollo in vitro de DC tipo Langerhans.
Factores solubles, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) e IL-6, inhiben la diferenciacion de progenitores de CD34 positivas en DC y redirigen su desarrollo hacia el linaje de monocitos-macrofagos. Es de notar que todos estos factores solubles inhibidores son secretados por celulas cancerosas, que sugiere que la prevencion del desarrollo de DC a partir de celulas CD34+ pueden ser un mecanismo de escape tumoral de la respuesta inmunitaria.
Aunque cada vez hay mas conocimiento con respecto a como de diferente se diferencian los progenitores bajo la influencia de diferentes compuestos, como las citocinas en diversos tipos de DC, normalmente, sin embargo, el tiempo de cultivo es largo. Por ejemplo, las celulas CD34 positivas generalmente dan lugar a numeros aceptables de DC despues de, por ejemplo, 14 dfas de cultivo lfquido en presencia de GM-CSF mas TNF-a.
Como se trata anteriormente, pueden aplicarse DC en el tratamiento de diversas enfermedades, que incluyen enfermedades tumorales, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias. Sin embargo, cuando las DC recuperadas de celulas primarias van a usarse en tal tratamiento, la eficacia del tratamiento puede ser gravemente impedida ya que las DC o sus celulas precursoras pueden solo obtenerse de pacientes o donantes en cantidades muy bajas. Ademas, con los metodos actuales, la recuperacion requiere mucho tiempo y el uso de reactivos caros, mientras que el rendimiento de DC obtenido puede ser muy pequeno.
Se han obtenido DC de celulas precursoras, tales como celulas madre o monocitos CD34 positivos, que maduran in vitro por estimulacion adecuada con moleculas estimulantes para formar DC, aunque tales celulas precursoras son extremadamente raras tanto en sangre como tejido.
Hay gran un interes en la inmunoterapia espedfica activa con vacunas terapeuticas basadas en DC para el cancer. Las DC han sido ampliamente investigadas como adyuvantes celulares para emplear el sistema inmunitario para defenderse del cancer (vease, por ejemplo, Bull Cancer. 2008 Mar 1;95(3):320-6.)
El documento EP1419240 desvela el uso de una lmea celular, MUTZ3, que puede diferenciarse en celulas dendnticas y que puede usarse como agente inmunoterapeutico o como parte de agentes inmunoterapeuticos en el tratamiento de enfermedades inmunitarias. Aunque tal lmea celular podna resolver el problema de la disponibilidad de celulas suficientes, datos experimentales muestran que todavfa se requieren al menos 6 a 7 dfas de cultivo bajo las condiciones correctas para obtener DC inmaduras y al menos 2 dfas adicionales para obtener DC maduras, requiriendo que usen citocinas caras.
El documento WO2006/012359 desvela un metodo de induccion de la diferenciacion de monocitos de sangre en celulas dendnticas presentadoras de antfgenos funcionales. En resumen, las celulas se tratan por perturbacion ffsica, opcional en presencia de, por ejemplo, agentes efectores de la enfermedad.
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El documento EP1389234 desvela otro metodo de diferenciacion de celulas dendnticas linfoides de celulas madre hematopoyeticas humanas. Las celulas se diferencian en dos etapas, en un primer medio que comprende GM-CSF y en un segundo medio que contiene IFN-gamma. El cultivo puede durar hasta dos semanas.
El documento WO2008/036421 describe el uso de un extracto de reishi para aumentar la expresion de marcadores de celulas dendnticas (inmaduros) como CD1a y CD83 en un sujeto humano.
El documento WO2008/02882 describe un metodo de produccion de celulas de Langerhans o celulas dendnticas intersticiales a partir de monocitos CD14 positivos que comprende poner dichos monocitos en presencia de un entorno de celulas que comprende celulas epiteliales y similares.
El documento WO2004/076651 describe un metodo de diferenciacion de precursores de celulas dendnticas monodticas en celulas dendnticas inmaduras que comprende poner en contacto precursores de celulas dendnticas no activados con un medio complementado con GM-CSF en ausencia de citocinas adicionales.
El documento WO2004/083392 desvela un metodo de induccion de la diferenciacion de monocitos en sangre en celulas presentadoras de antfgenos dendnticas funcionales, usando fuerzas resultantes del flujo de monocitos a traves de un aparato que tiene canales de plastico.
El documento US2004/0009596 describe el uso de un extracto de un mejillon verde indio para la diferenciacion y maduracion de celulas dendnticas, y el extracto se sugiere como una sustitucion de GM-CSF.
El documento US2005/0008623 describe el uso de monocitos CD14 positivos para obtener diversos tipos de celulas dendnticas. La diferenciacion se efectua por GM-CSF y TGFbeta 1 (e IL13).
A partir de lo anterior sera evidente para el experto en la materia que hay una necesidad de mejora adicional de los metodos disponibles para la produccion de DC a partir de celulas progenitoras. En particular, parece haber una necesidad de metodos que permitan la diferenciacion acelerada (y maduracion) de DC, acortando asf el tiempo requerido para el cultivo y, por consiguiente, reducir los costes de tal cultivo reduciendo la cantidad de medio y, por ejemplo, las citocinas requeridas para obtener tal DC funcional.
Sumario de la invencion
El problema anteriormente mencionado se resuelve por la materia como se expone en cualquiera de las reivindicaciones adjuntas.
Se ha descubierto de manera sorprendente que las celulas CD34 positivas pueden diferenciarse y opcionalmente posteriormente madurar en diversas DC dentro de un periodo de tiempo que es ventajosamente mas corto en comparacion con los metodos conocidos en la tecnica.
En particular, el problema anteriormente mencionado se resuelve por un metodo para la produccion de celulas dendnticas en el que las celulas CD34 positivas se ponen en contacto con una antraciclina y/o una antracenodiona. De esta forma se logra una produccion acelerada en comparacion con metodos segun el estado de la tecnica que no ponen en contacto celulas con una antraciclina y/o una antracenodiona.
Con el metodo segun la invencion, pueden asf obtenerse celulas diferenciadas en periodos de tiempo mas cortos, que puede ser importante para el uso de estas celulas en inmunoterapia con vacunas terapeuticas basadas en DC.
Se encontro que las celulas obtenibles por el metodo segun la invencion presentaban un aumento de la expresion de HLA-DR.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion proporciona un metodo in vitro para la produccion acelerada de celulas dendnticas en un medio de cultivo que comprende las etapas de poner en contacto celulas CD34 positivas con una antraciclina y/o una antracenodiona durante un periodo de entre 1 y 7 dfas, dejar que las celulas CD34 positivas se diferencien en celulas dendnticas y obtener dichas celulas dendnticas del medio de cultivo. El experto en la materia conoce el significado del termino "celulas CD34 positivas". Se refiere a celulas primarias o lmeas celulares que expresan CD34 sobre la superficie celular. Tales celulas son conocidas por su capacidad para diferenciar en DC.
El termino "poner en contacto" o "puestas en contacto" debe entenderse como que las celulas estan en contacto ffsico y directo con la antraciclina y/o antracenodiona y se deja que interaccionen durante un tiempo suficiente para que la antraciclina y/o antracenodiona induzca y/o presente su efecto de aceleracion. En la practica, por ejemplo, la antraciclina y/o antracenodiona pueden anadirse al medio de cultivo usado para mantener y/o cultivary/o diferenciar las celulas CD34 positivas en una DC.
Las antraciclinas y antracenodionas son conocidas para el experto en la materia. Las antraciclinas, ademas de las antracenodionas, inhiben la smtesis de ADN y ARN intercalandose entre pares de bases de una hebra de ADN/ARN, previniendo asf la replicacion de celulas cancerosas que crecen rapidamente. Tambien crean radicales de oxfgeno
libre mediados por hierro que danan el ADN y las membranas celulares. Las antraciclinas y antracenodionas tambien son capaces de inhibir las enzimas topoisomerasas II, previniendo el alivio de estres de torsion en ADN durante la replication del ADN.
En terminos estructurales, las antraciclinas y antracenodionas pueden definirse como moleculas que comprenden 5 una estructura de antraquinona como se representa en la siguiente formula 1:
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La unidad de antraquinona basica puede decorarse con diversas cadenas laterales. El experto conocera las posiciones exactas donde tales cadenas laterales pueden unirse para obtener antraciclinas y antracenodionas funcionalmente activas. Procedimientos para la smtesis de antraciclinas y antracenodionas funcionales tambien se 10 conocen en la tecnica. Tambien estan disponibles en la materia sistemas de prueba in vitro para determinar la funcionalidad de antraciclinas y antracenodionas.
La invention tambien se refiere al uso de analogos de antraciclina y antracenodiona. Tales analogos estan comprendidos dentro del termino antraciclinas y antracenodionas y tales analogos pueden consistir en estructuras qmmicamente modificadas de antraciclinas y antracenodionas como se describen y ejemplifican en el presente 15 documento que todavia retienen su funcionalidad original.
Miembros muy conocidos de la familia de las antraciclinas y antracenodionas son compuestos con una estructura de anillo de tetrahidronaftacenodiona unida por un enlace glucosidico a un amino-azucar, por ejemplo daunosamina.
Estructuras de algunas antraciclinas importantes tales como daunorubicina y doxorubicina se muestran a continuacion.
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Las antracenodionas tambien comprenden una estructura de antraquinona basica. El anillo de antraceno puede estar sustituido en cualquier position, excepto en los grupos cetona. La estructura molecular de la mitoxantrona, la antracenodiona clmicamente mas importante, se muestra a continuation.
imagen4
Ferlini et al., Pharmacology and Toxicology 89: 231-236 (2001) describen el cultivo de celulas CD34+ in vitro en presencia de doxorubicina durante 4 horas (pagina 232, segunda columna, lmea 21). Los resultados muestran que la
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doxorubicina tiene un potente efecto toxico a todas las concentraciones usadas (pagina 235, primera columna, lmea 25).
Zibera et al., Haematologica 84: 924-929 (1999), Bengala et al., Cancer 82: 867-873 (1990) y Ferrari et al., Cancer Immunol. Immunotherapy 52:359-366 92003) describen metodos in vivo para la terapia del cancer.
Neuhaus et al., J. Neuroimmunol. 168: 128-137 (2005) describen los efectos de la mitoxantrona sobre DC en cultivos in vitro. Ensena que la mitoxantrona induce muerte celular apoptosica y necrotica (pagina 133, capttulo 3.4) y que la mitoxantrona inhibe la maduracion de celulas dendnticas (pagina 133, capftulo 3,5).
El documento WO2007/011693 ensena metodos de generacion de composiciones terapeuticamente utiles para el tratamiento de pacientes con cancer. Preparaciones que incluyen celulas CD34+ se administran in vivo a un paciente en necesidad de un tratamiento tal.
El documento WO 2005/026318 desvela un metodo de produccion de una respuesta antigenica en la que celulas dendnticas se ponen en contacto con un antigeno y un agente de activacion tal como doxorubicina con el fin de crear una respuesta antigenica in vitro.
El metodo segun la invencion proporciona la ventaja que, como consecuencia del tiempo de cultivo mas corto requerido, se reduce la necesidad de productos qmmicos como citocinas y medio de crecimiento y similares, haciendo la produccion de las celulas menos costosa y requiriendo menos productos qmmicos que van a usarse y desecharse.
El experto en la materia entendera que el metodo segun la invencion puede realizarse preferentemente usando celulas aisladas en un medio de cultivo, es decir, cultivando celulas usando tecnicas comunes en el campo, y como se muestra, por ejemplo, en los ejemplos.
El termino "celulas aisladas" debe entenderse a este respecto como celulas que se afslan de su entorno natural, preferentemente celulas que son del mismo linaje, fenotipo y/o genotipo, tales como celulas cultivadas o lmeas celulares.
La invencion se refiere, por tanto, a un metodo como se ha descrito anteriormente, en el que celulas CD34 positivas aisladas se ponen en contacto con una antraciclina y/o una antracenodiona en un medio de cultivo.
Ejemplos de antraciclinas y antracenodionas que pueden usarse ventajosamente en el metodo segun la invencion incluyen daunorubicina, doxorubicina, pirarubicina, aclarubicina, epirubicina, oxaunomicina, idarubicina y mitoxantrona.
Un metodo preferido segun la invencion es un metodo en el que la antraciclina y/o una antracenodiona estan seleccionadas del grupo que consiste en daunorubicina, doxorubicina, pirarubicina, aclarubicina, epirubicina, oxaunomicina, andidarubicina y mitoxantrona.
Mitoxantrona, daunorubicina y doxorubicina son los compuestos preferidos que van a usarse.
En general, cualquier periodo de poner en contacto las celulas con una antraciclina y/o una antracenodiona, y que reduzca el tiempo requerido para obtener celulas dendnticas en comparacion con la circunstancia en la que las celulas se cultivaran en ausencia de dicha antraciclina, es un periodo adecuado para poner en contacto las celulas. Tal periodo de poner en contacto puede ser facilmente determinado por el experto en la materia, por ejemplo simplemente comparando el tiempo que se requiere para obtener una cierta etapa de desarrollo de la celula dendntica en ausencia de dicha antraciclina con el tiempo requerido para obtener la misma etapa de desarrollo en presencia de dicha antraciclina.
En una realizacion del metodo segun la invencion, las celulas CD34 positivas se ponen en contacto con una antraciclina y/o una antracenodiona durante un periodo de entre 1 y 7 dfas, preferentemente entre 1,5 y 5 dfas e incluso mas preferentemente entre 2 y 4 dfas.
Se ha encontrado que celulas puestas en contacto con una antraciclina y/o una antracenodiona durante el tiempo anteriormente descrito pueden diferenciarse en celulas dendnticas que pueden ser completamente funcionales, en menos tiempo del que sena posible sin la adicion de antraciclina y/o una antracenodiona. Esto se ejemplifica adicionalmente en los ejemplos.
Las celulas obtenidas con el metodo segun la invencion pueden ser celulas dendnticas completamente funcionales, como se ve de los ejemplos. Se muestra en el presente documento que las celulas maduradas obtenidas con el metodo segun la invencion son funcionales con respecto a, por ejemplo, la migracion hacia CCL19 y CCL21 y la induccion de activacion y proliferacion de linfocitos T intactos.
El efecto de aceleracion anteriormente descrito puede obtenerse unicamente poniendo en contacto una celula CD34 positiva con una antraciclina y/o una antracenodiona, como se ejemplifica en las Figuras 1 y 4. Sin embargo, la presencia de un compuesto inductor de la diferenciacion adicional como una citocina tambien puede contribuir a la
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diferenciacion acelerada de las celulas CD34 positivas en diversas DC. Adicionalmente, la presencia de un compuesto adicional capaz de inducir la maduracion de las celulas dendrfticas garantiza la rapida maduracion de las celulas.
El experto en la materia sabe que el termino "compuesto que es capaz de inducir la diferenciacion de las celulas" o "compuestos inductores de la diferenciacion" se refiere a tal compuesto que, solo o en combinacion espedfica, puede inducir, cuando esta presente en cantidades suficientes en, por ejemplo, medio de cultivo, la diferenciacion de celula precursora dendrftica en o hacia celulas dendrfticas.
Ejemplos muy conocidos incluyen, pero no se limitan a, tales moleculas qmmicas y biologicas que influyen en la diferenciacion de celulas, tales como citocinas (IL-1b, IL-3, IL-4, IL-6, PGE-2, TNF-alfa, TGF-beta 1), factores de crecimiento (por ejemplo, GM-CSF) y moleculas sustitutas para citocinas o factores de crecimiento que inducen un efecto biologico comparable al de las propias moleculas estimulantes, tales como, por ejemplo, anticuerpos u otras moleculas biologicas tales como LPS o polylC.
La invencion, por tanto, se refiere a un metodo como se ha descrito anteriormente en el que al menos un compuesto capaz de inducir la diferenciacion de las celulas dendrfticas esta presente en el medio de cultivo. Ventajosamente, un compuesto tal que es capaz de inducir la diferenciacion de las celulas dendrfticas esta seleccionado del grupo que consiste en IL-1b, IL-3, IL-4, IL-6, PGE-2, TNF-alfa, TGF-beta 1 y GM-CSF.
Por ejemplo, ya se obtuvieron celulas dendrfticas completamente diferenciadas en el dfa 4 cuando celulas MUTZ3 se incubaron con mitoxantrona en presencia de citocinas, mientras que cuando las celulas MUTZ3 se cultivaron en ausencia de tal antraciclina, pero en presencia de citocinas, solo en el dfa 8 - 10 se obtuvieron celulas completamente diferenciadas. Esta aceleracion de la diferenciacion como consecuencia de la presencia de antraciclinas en el sistema tambien se observa para progenitores CD34 positivos aislados de un sujeto humano.
Tambien se observo diferenciacion cuando celulas precursoras CD34 positivas se incubaron con solo antraciclinas y/o antracenodionas, es decir, en ausencia de citocinas. Esto se ilustra en la Figura 1B, donde se muestra que una poblacion de celulas precursoras CD34 positivas se diferencio en celulas CD14, CD1a, langerina y CD80 positivas cuando se expuso a mitoxantrona.
El experto en la materia entendera que las celulas pueden ponerse en contacto con el al menos un compuesto que es capaz de inducir la diferenciacion celular tanto simultaneamente con la antraciclina y/o antracenodiona (y que se prefiere por motivos practicos) como antes o despues de que las celulas se hayan puesto en contacto con la antraciclina y/o antracenodiona. Aunque no se prefiere desde un punto de vista practico, puede incluso preverse que la puesta en contacto con la antraciclina y/o antracenodiona y la puesta en contacto con el compuesto capaz de inducir la diferenciacion hacia celulas dendrfticas se produzca en un modo alternativo.
Se han obtenido resultados particularmente ventajosos con un metodo segun la invencion en el que las celulas se pusieron en contacto con al menos un compuesto que es capaz de inducir la diferenciacion celular seleccionada del grupo que consiste en GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos), TNF-alfa (factor de necrosis tumoral alfa), IL-4 (interleucina 4), TGF-beta 1 (factor de crecimiento transformante beta) o combinaciones de los mismos.
Incluso mas en particular, la combinacion de GM-CSF, IL-4 y TNF-alfa o la combinacion TGF-beta, GM-CSF y TNF- alfa puede usarse ventajosamente en el metodo segun la invencion, es decir, en combinacion con una antraciclina y/o antracenodiona, por ejemplo mitoxantrona, para obtener celulas dendrfticas. Tales celulas pueden obtenerse en un periodo de tiempo mas corto en comparacion con un metodo en el que las celulas CD34 positivas no se ponen en contacto con tal antraciclina y/o antracenodiona.
Ademas, se ha demostrado que las celulas obtenidas son completamente funcionales como celulas dendrfticas, como puede derivarse del hecho de que las celulas obtenidas migran hacia CCL19 y CCL21, promueven la proliferacion de linfocitos T y la sensibilizacion de linfocitos T espedficos de antfgeno (veanse los ejemplos).
Con el fin de obtener celulas dendrfticas completamente maduradas, las celulas pueden, por tanto, despues de o en el momento en que se ponen en contacto con la antraciclina y/o antracenodiona en un metodo segun la invencion, tratarse adicionalmente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en TNF-alfa, IL-6, PGE-2 o IL-1beta o combinaciones de los mismos. Tal tratamiento permitira obtener celulas dendrfticas maduras a partir de celulas dendrfticas inmaduras.
El experto en la materia conoce metodos disponibles en la materia para obtener celulas dendrfticas maduras a partir de, por ejemplo, celulas dendrfticas inmaduras. Por ejemplo, pueden madurarse celulas dendrfticas inmaduras (incluyendo celulas dendrfticas de tipo Langerhans inmaduras) anadiendo TNF-alfa, IL-6, IL-1beta y prostaglandina E2, aunque asimismo pueden emplearse otros metodos conocidos en la tecnica para madurar celulas dendrfticas inmaduras.
La invencion, por tanto, se refiere a un metodo como se ha descrito anteriormente en el que al menos un compuesto capaz de inducir la maduracion de las celulas dendrfticas esta presente en el medio de cultivo.
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La maduracion puede ser vista, por ejemplo, por la expresion del marcador de maduracion CD83 (Lechmann M, Berchtold S, Hauber J, Steinkasserer A (2002)). Las celulas asf obtenidas son completamente funcionales como celulas dendnticas como puede verse del hecho de que las celulas obtenidas migran hacia CCL19 y CCL21, y promueven la proliferacion de linfocitos T (veanse los ejemplos).
Es, por tanto, una realizacion preferida del metodo segun la invencion que las celulas que se tratan con una antraciclina y/o antracenodiona, y opcionalmente con otro compuesto que es capaz de inducir la diferenciacion de las celulas, se pongan en contacto con un compuesto que es capaz de madurar celulas dendnticas inmaduras, tales como celulas dendnticas de Langerhans inmaduras.
Asf pueden obtenerse resultados particularmente ventajosos con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en TNF-alfa, IL-6, IL-1beta y prostaglandina E2, preferentemente cuando estos compuestos se usan en combinacion (veanse los ejemplos).
En otra realizacion preferida del metodo segun la invencion, las celulas dendnticas obtenidas son celulas dendnticas intersticiales, celulas dendnticas plasmatoides, celulas dendnticas de Langerhans, celulas dendnticas maduras o celulas dendnticas inmaduras.
El experto sabe como discriminar entre tales tipos de celulas dendnticas diferentes, un metodo tal se describe en detalle, por ejemplo, en el documento US2004265998 y en los ejemplos de mas adelante.
Por ejemplo, las celulas dendnticas inmaduras pueden caracterizarse por la expresion inducida de CD1a y/o DCsign, una caractenstica importante de celulas dendnticas inmaduras sobre la superficie de la celula. Al mismo tiempo, tales celulas pueden caracterizarse por la ausencia o baja expresion de CD83.
Las celulas de Langerhans se caracterizan por la expresion de tanto langerina como CD1a, y pueden inducirse bajo la influencia de TGF-beta 1 (Caux et al. 1997, Blood 90 (4), 1458-1470).
Celulas dendnticas plasmacitoides se describen, por ejemplo, por McKenna K, Beignon A, Bhardwaj N (2005). "Plasmacytoid dendritic cells: linking innate and adaptive immunity". J. Virol. 79 (1): 17-27. Por ejemplo, expresan BDCA2 (CD303) y/o CD123, mientras que son CDLC negativas.
En otra realizacion preferida del metodo segun la invencion, las celulas CD34 positivas son celulas MUTZ3 CD34 positivas, celulas humanas CD34 positivas o celulas tumorales CD34 positivas.
Se ha encontrado que estas celulas pueden utilizarse ventajosamente en el metodo segun la invencion.
MUTZ3 es un modelo de lmea celular humana para la diferenciacion inducida por citocinas de celula dendntica de precursores CD34 positivos y se describe en detalle en, por ejemplo, el documento US2004265998.
Las celulas CD34 positivas de seres humanos, es decir, de seres humanos que padecen tumores, pueden aislarse de, por ejemplo, sangre como se describe en los ejemplos.
Se ha descubierto de manera sorprendente que las lmeas celulares, como MUTZ3, y celulas primarias de ser humano pueden usarse ventajosamente como celulas CD34 positivas en el metodo segun la invencion. Asf pueden obtenerse celulas dendnticas funcionales, ya que pueden derivarse del hecho de que las celulas maduras obtenidas con un metodo segun la invencion migran hacia CCL19 y CCL21, promueven la proliferacion de linfocitos T y la sensibilizacion de linfocitos T espedficos de antfgeno. Tambien mostraron la expresion caractenstica de marcadores de la superficie celular como, por ejemplo, CD83 de CD1a. Aquellas celulas podnan obtenerse en un periodo que es significativamente mas corto en comparacion con un metodo de obtencion de tales celulas dendnticas, pero que no incluye poner en contacto dichas celulas CD34 positivas con antraciclina y/o antracenodiona.
En una realizacion preferida de la invencion, se ponen en contacto celulas MUTZ3 con mitoxantrona 0,05 nM a 20 nM y/o doxorubicina 10 a 120 nM, en presencia de 50 a 150 ng/ml de GM-CSF, de 5 a 20 ng/ml de IL-4 y de 0,5 a 4 ng/ml de TNF-alfa. Un metodo tal da ventajosamente celulas dendnticas tipo intersticiales.
En otra realizacion preferida de la invencion, las celulas MUTZ3 se ponen en contacto con mitoxantrona 0,05 nM a 20 nM y/o doxorubicina 10 a 120 nM, en presencia de 5 a 20 ng/ml de TGF-beta 1, de 50 a 150 ng/ml de GM-CSF y de 0,5 a 4 ng/ml de TNF-alfa. Un metodo tal da celulas dendnticas de tipo Langerhans.
Las caractensticas y ventajas de las celulas asf obtenidas se muestran en los ejemplos de mas adelante.
En el presente documento tambien se proporciona un metodo en el que las celulas se ponen en contacto con al menos una antraciclina y/o una antracenodiona, seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en daunorubicina, doxorubicina, pirarubicina, aclarubicina, epirubicina, oxaunomicina, andidarubicina y mitoxantrona, y en el que la antraciclina y/o antracenodiona se aplica a las celulas a una concentracion que oscila de la concentracion CI20 a la concentracion CI80, preferentemente que oscila de la concentracion CI30 a la concentracion CI70 (como se determina como explica en los ejemplos).
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En el presente documento tambien se describen celulas dendnticas obtenibles por el metodo segun la invencion. Estas celulas se caracterizan por un aumento de la expresion de HLA-DR, en comparacion con celulas obtenidas por el mismo metodo, pero sin poner en contacto las celulas con una antraciclina. Esto se ejemplifica en la seccion de ejemplos, y se muestra en la Figura 6.
El termino "un aumento de la expresion de HLA-DR" debe interpretarse como que significa que las celulas obtenidas por un metodo segun la invencion tienen una expresion mas alta de HLA-DR en comparacion con las celulas cultivadas en un metodo segun el estado de la tecnica, es decir, sin la adicion de una antraciclina y/o una antracenodiona. La expresion de HLA-DR es un factor importante con respecto a las celulas T colaboradoras.
En el presente documento tambien se describe el uso de una antraciclina y/o antracenodiona, seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en daunorubicina, doxorubicina, pirarubicina, aclarubicina, epirubicina, oxaunomicina, andidarubicina y mitoxantrona, en la fabricacion de un medicamento para tratar trastornos inmunologicos en sujetos en necesidad del mismo, en particular para tratar trastornos inmunologicos acelerando la respuesta inmunitaria.
Se ha encontrado que cuando tal antraciclina y/o antracenodiona se administra por via local, por ejemplo mediante inyeccion en un cuerpo humano, y en particular en combinacion con las citocinas capaces de inducir la diferenciacion hacia DC, puede inducirse una buena respuesta inmunitaria acelerada en el sujeto humano que va a tratarse.
Es muy conocido para el experto en la materia que puedan usarse DC en vacunas contra el cancer. Como las celulas obtenidas por el metodo segun la invencion son completamente funcionales y pueden obtenerse en un periodo de tiempo mas corto, es decir, de un modo acelerado, tales celulas (y los metodos de obtencion de tales celulas) son particularmente ventajosos en terapias dirigidas a tratar tales canceres. En el tratamiento de canceres, se prefiere la administracion intradermica de la composicion. Esta via de administracion es optima, ya que expone la antraciclina y/o la antracenodiona directamente a celulas dendnticas dermicas que residen localmente, ademas de a celulas dendnticas de ganglios linfaticos mediante el drenaje linfatico. Cuando se administran mediante la via intravenosa convencional, la presencia de arrolladores numeros de celulas irrelevantes tales como globulos rojos en la circulacion previene este efecto.
Tambien se describe en el presente documento el uso de las celulas obtenibles por un metodo segun la invencion en las terapias de vacunacion contra el cancer o terapia auto-inmune. En otras palabras, las celulas obtenidas de cualquiera de los metodos segun la invencion pueden usarse para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer o enfermedades autoinmunitarias.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Se cultivaron progenitores de MUTZ3 durante 72 horas en presencia de mitoxantrona y se analizaron para expansion (Figura 1A) y para la expresion de marcadores de DC (Figura 1 B).
Figura 2: Nivel de apoptosis y muerte celular tras el tratamiento con PBS o mitoxantrona dentro de las tres subpoblaciones de MUTZ3, que se habfan separado por clasificacion magnetica con perlas basada en CD14 o CD34 (MACS).
Figura 3: Analisis fenotfpico de los efectos de la mitoxantrona o doxorubicina sobre las celulas MUTZ3.
Figura 4: Representaciones de FSC/SSC de LC de dfa 4 cultivadas con PBS o mitoxantrona y expresion de CDIa/langerina de estos cultivos
Figura 5: El tratamiento con mitoxantrona produjo la perdida de la mayona de las celulas CD34 positivas y un aumento en las celulas CD14 positivas (Figura 5A). En presencia de citocinas distorsionadas hacia LC, la adicion de mitoxantrona 16,7 nM indujo un aumento en el porcentaje de celulas CD1a+ langerina+ en el plazo de 72 horas (Figura 5B).
La Figura 6 muestra los porcentajes de celulas que expresan CD1a, DC-SIGNO, langerina, CD80, CD40 y CD83 y las intensidades medias de fluorescencia de CD80, CD86, CD40 y HLA-DR de MUTZ3-DC/LC de dfa 7 maduras y MUTZ3-DC/LC de dfa 4 maduras diferenciadas en ausencia o presencia de mitoxantrona.
Figura 7: MUTZ3-DC cultivadas en ausencia o presencia de mitoxantrona se analizaron en un ensayo Transwell para su capacidad para migrar hacia las quimiocinas CCL19 y CCL21 (Figura 7A) y se probaron en una MLR para su capacidad para estimular la proliferacion de linfocitos T (Figura 7B).
Figura 8: MUTZ3-DC cultivadas en presencia de mitoxantrona durante 4 dfas y cultivos de MUTZ3-DC de d7 de control se analizaron para su capacidad para sensibilizar linfocitos T espedficos de antfgeno de tumor. Se cargaron MUTZ3-mDC de d7 y mitox-mDC de d4 con peptidos MARTI (26-35L) y se analizaron para su capacidad para sensibilizar linfocitos T CD8+ espedficos de MARTI dentro de linfocitos T seleccionados para CD8beta positivas a partir de un donante sano HLA-A2 positivo. Se empezaron seis cultivos con cada tipo de
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celula DC. Despues de la estimulacion de DC primarias cargadas con peptido, los linfocitos T se re-estimularon con DC cargadas con peptido despues de 10 y 17 dfas y se analizo la presencia de linfocitos T CD8+ espedficos de MART por medio de tincion de tetramero de MART despues de la primera y la segunda re- estimulacion. Los porcentajes de linfocitos T CD8+ espedficos de MARTI dentro de cada uno de los seis cultivos de los dos tipos de DC se representan en la figura (representado por los puntos). d4 mitox-mDC fueron tan capaces como los cultivos de d7-mDC tradicionales en sensibilizar los linfocitos T CD8+ espedficos de MARTI. El porcentaje promedio de linfocitos T CD8+ espedficos de MARTI dentro de los seis cultivos se representa por la raya.
Ejemplos
Ejemplo 1: Materiales y metodos
Productos qumicos:
Todos los productos qmmicos y farmacos se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), excepto Ko-143 que fue amablemente proporcionado por Dr. Allen (Instituto del Cancer de Los Pafses Bajos, Amsterdam, Los Pafses Bajos) y se ha descrito antes (van Loevezijn A., (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 29-32) y la doxorubicina, que se compro de Farmitalia Carlo Erba (Bruselas, Belgica).
Cultivo celular:
Se cultivo la lmea celular MUTZ3 CD34+ derivada de AML como se ha descrito antes (Masterson A.J. (2002) Blood 100, 701-703.). En resumen, se cultivaron progenitores MUTZ3 en MEM-alfa (medio esencial mmimo, Gibco) que contema 20% de suero bovino fetal (FCS), 100 Ul/ml de penicilina sodica, 100 microg/ml de estreptomicina, L- glutamina 2 mM (pen/estrep/glut), beta-mercaptoetanol 50 microM (2ME) y 10% de medio acondicionado 5637 (medio rutinario de MUTZ3) en placas de 12 pocillos (Co-star) a una concentracion de 0,2 millones de celulas/ml y se sometieron a pases dos veces a la semana. Se cultivaron LC en MEM-alfa que contema 20 % de FCS, pen/estrep/glut, 2ME y 10ng/ml de TGF-beta 1 (Biovision, Mountain View, cA), 100ng/ml de rhGM-CSF (Sagramostim, Berlex) y 2,5 ng/ml de TNFalfa (Strathmann Biotec) (medio de MUTZ3-LC) durante 10 dfas en placas de 12 pocillos a una concentracion de 0,1 millones de celulas/ml, anadiendo citocinas en el dfa 0, 4 y 7. Se cultivaron DC intersticiales en MEM-alfa que contema 20 % de FCS, pen/estrep/glut, 2ME y 10 ng/ml de IL-4 (R&D), 100 ng/ml de rhGM-CSF y 2,5 ng/ml de TNFalfa (medio de MUTZ3-DC). Si procede, se maduraron DC y LC inmaduras, respectivamente, anadiendo 50 ng/ml de TNFalfa, 100 ng/ml de IL-6 (Strathmann Biotec), 25 ng/ml de IL-1beta (Strathmann Biotec) y 1 microg/ml de prostaglandina E2 (PGE2) (Sigma Aldrich) durante 48 horas.
Para cultivos de mitoxantrona y doxorubicina, se sembraron 0,1-0,2 millones celulas/ml de progenitores de MUTZ3 o subconjuntos de MUTZ3 de clasificacion magnetica con perlas de CD34+, CD14+ y doble negativas (DN) (MACS) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) en placas de 12 pocillos en medio rutinario de MUTZ3 o medio de MUTZ3-DC/LC en ausencia o presencia de mitoxantrona 1,04 nM, 2,08 nM, 5,6 nM, 16,7 nM o doxorubicina 16,7 nM o 100 nM y se cultivaron durante 72-96 horas antes de la cuantificacion de celulas viables por exclusion con azul de tripano y caracterizacion fenotfpica por citometna de flujo. Se maduraron DC y LC (como antes) en el dfa 3 o 4 durante 24 horas y se probaron funcionalmente en reaccion de leucocitos mixtos o ensayos de migracion. En caso de inhibicion de transportadores de ABC, se anadio Ko-143 200 nM en el dfa 0 para bloquear la actividad de BCRP.
Celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+
Se aislaron celulas progenitoras hematopoyeticas CD34+ de sangre y se expandieron durante 2-5 semanas con 25 ng/ml de ligando de tirosina cinasa-3 tipo fms (Flt3-L) y 10 ng/ml de factor de celulas madre (SCF) como se ha descrito previamente (Bontkes H.J., de Gruijl T.D., Schuurhuis G.J., Scheper R.J., Meijer C.J., & Hooijberg E. (2002) Expansion of dendritic cell precursors from human CD34(+) progenitor cells isolated from healthy donor blood; growth factor combination determines proliferation rate and functional outcome. J. Leukoc. Biol. 72, 321-329). Para estudiar el efecto de la mitoxantrona sobre estas celulas, celulas progenitoras CD34+ expandidas descongeladas se cultivaron con mitoxantrona 16,7 nM durante 72 horas en presencia de 10 ng/ml de Flt3-L y SCF (factor de celulas madre). Para estudiar los efectos sobre la diferenciacion de LC, se cultivaron progenitores CD34+ con mitoxantrona
16,7 nM durante 72 horas en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF, 10 ng/ml de TGFbeta y 2,5 ng/ml de TNFalfa. Despues de 72 horas, se realizo analisis fenotfpico por citometna de flujo.
Transferencia Western
Se lisaron sedimentos de celulas en tampon de lisis fno en hielo (EDTA 1 mM; 1 % de NP-40; PMSF 1 mM), se mantuvo sobre hielo durante una hora, se sonico y se guardo a -20 °C hasta uso posterior. Las concentraciones de protema se determinaron con un ensayo de protema Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA). Las protemas se fraccionaron sobre un gel al 8 % de poliacrilamida y posteriormente se transfirieron a filtro de nitrocelulosa por electrotransferencia. Para la deteccion de BCRP, se bloquearon filtros (PBS que contiene 1 % de BSA, 1 % de leche en polvo y 0,05 % de Tween-20) durante la noche y posteriormente se incubaron con el mAb Bxp-53 (0,5 pg/ml) (vease, por ejemplo, J. Vet. Pharmacol. Ther. 2006 Vol 29(4) p 279-87) en tampon de bloqueo durante dos horas. Se
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visualizo la inmunorreactividad con inmunoglobulina de conejo-anti-rata conjugada con HRP, seguido de desarrollo de color con 0,5 g I-1 de tetraclorhidrato de 3,3'-diamino-bencidina, 0,15 g I-1 de cloronaftol y 0,02 % de H2O2 en PBS.
Analisis immunofenot^picos por citometria de flujo
Se inmunofenotipificaron celulas usando los siguientes mAb conjugados con FITC y/o PE reactivos contra: CD1a (1:25), CD54 (1:25), CD80 (1:25), CD86 (1:25), CD40 (1:10) (PharMingen, San Diego, CA), CD14 (1:25), HLA-DR (l:25), DC-SIGN (1:10) (BD Biosciences, San Jose, CA), CD83 (1:10), CD34 (1:10), langerina (1:10) (Immunotech, Marsella, Francia). En resumen, se lavaron 2,5 a 5104 celulas en PBS complementado con 0,1 % de BSA y 0,02 % de NaN3 y se incubaron con mAb de control espedficos o correspondientes durante 30 minutos a 4 °C. Si procede, se anadieron anexina V y/o PI (yoduro de propidio) despues de la tincion con marcador y 10 minutos antes del analisis. Se lavaron las celulas y se analizaron en un citometro de flujo FACS-calibur (Becton and Dickinson, San Jose, CA) equipado con el software de analisis CellQuest y los resultados se expresaron como la intensidad media de fluorescencia o la mediana o el porcentaje de celulas positivas.
Reaccion de leucocitos mixtos (MLR)
Se co-cultivaron 1 102 - 3 104 DC con 1105 linfocitos de sangre periferica durante 4 dfas en placas de 96 pocillos en IMDM (medio Dulbecco modificado con Iscove) que contema 10 % de suero reunido humano (HPS), pen/estrep/glut y 2ME. En el dfa 4, se anadieron 2,5 pCi/ml de [3H]-timidina (6,7 Ci/mmol, MP Biomedicals, Irvine, CA) por pocillo durante 16 horas. Las placas se recogieron sobre esteras de filtro de fibra de vidrio (Packard Instruments, Groningen, Los Pafses Bajos) usando un recolector de celulas Skatron (Skatron Instruments, Noruega) y se cuantifico la incorporacion de [3H]-timidina usando un contador Topcount NXT Microbeta (Packard, Meriden, CT).
Sensibilizacion de CTL in vitro
Se realizo la sensibilizacion in vitro de CTL espedficos de MART1 como se ha descrito previamente (Santegoets SJAM. (2006) Cancer Immunol Immunother. 55,1480-1490.) En resumen, se cargaron d7 MUTZ3-DC y d4 mitox-DC maduras a una concentracion de 1,0 millon de celulas/ml, con 1 pg/ml de peptido MART1 26-35L en IMDM libre de suero durante 3-4 horas en presencia de 3 pg/ml de p2-microglobulina (p2M). Despues de la carga, las celulas se irradiaron a 5000 rad, se lavaron y se concentraron a 0,2 millones de celulas/ml en medio Yssels (Yssel H. (1984) J Immunol Methods. 72,219-227) complementado con 2% de suero hAB (ICN Biochemicals), pen/estrep/glut, 2ME, 10 ng/ml de IL6 y 10 ng/ml de IL12 en placas de 24 pocillos. Se co-cultivaron 0,1 millones de DC cargadas con 1,0 millon de linfocitos T CD8p+, aisladas de un donante de HLA-A2+ por clasificacion magnetica con perlas, y 0,75-1,0 millones de celulas CD8p-, irradiadas (5000 rad) del mismo donante, ambas se diluyeron en medio Yssels. Para cada condicion de DC, se empezaron 6 pocillos de sensibilizacion y el experimento se realizo con 2 donantes de HLA-A2+ diferentes. En el dfa 10 y 19, las CTL se re-estimularon con 10 ng/ml de d7 MUTZ3-DC o d4 mitox-DC maduras cargadas con MART1 26-35L en presencia de 10 ng/ml de IL-7. En el dfa 12 y 21, se anadieron 10 UI/ml de IL-2 por pocillo. Se realizo el analisis de tetrameros (Tm) de MART1 en linfocitos T CD8+ en el dfa 17 (despues de la 1a re-estimulacion) y 24 (despues de la 2a re-estimulacion) usando Tm de MART1 26-35L marcado con PE y APC.
Analisis estad^stico
Se realizo el analisis estadfstico de los datos usando la prueba de la T de Student bilateral para datos emparejados o independientes. Las diferencias se consideraron estadfsticamente significativas cuando p<0,05.
Ejemplo 2: Sensibilidad de celulas progenitoras de MUTZ3 a mitoxantrona
Se analizaron celulas progenitoras de MUTZ3 para su sensibilidad al farmaco citostatico mitoxantrona. Este farmaco esta todavfa siendo usado en la clmica para tratar varios canceres u otras enfermedades como esclerosis multiple y se ha descrito que es un sustrato para el transportador de ABC relacionado con MDR. Se realizo un ensayo de citotoxicidad de 96 horas (exclusion con azul de tripano) para determinar el valor de CI50 para mitoxantrona en progenitores de MUTZ3. Las celulas progenitoras de MUTZ3 fueron sensibles a mitoxantrona con un valor de CI50 de 1,5 ± 0,5 nM (n=3). (Un ejemplo de tal ensayo de azul de tripano es: poner un volumen adecuado de una suspension de celulas en un tubo apropiado, anadir un volumen igual de 0,4 % de azul de tripano y mezclar suavemente, dejar reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Poner 10 pl de celulas tenidas en un hemocitometro y contar el numero de celulas viables (sin tenir) y muertas (tenidas). Calcular el numero promedio de celulas sin tenir en cada cuadrante y multiplicar por 2*104 para encontrar celulas/ml. El porcentaje de celulas viables es el numero de celulas viables dividido entre el numero de celulas muertas y viables, y puede determinarse la CI50)
Ejemplo 3: La mitoxantrona induce la diferenciacion de progenitores de MUTZ3
Estudiando los efectos citotoxicos de la mitoxantrona sobre los progenitores de MUTZ3, se observaron cambios morfologicos obvios a una concentracion de mitoxantrona 5,6 nM (CI60) y 16,7 nM (CI70). Por lo tanto, se cultivaron progenitores de MUTZ3 durante 72 horas en presencia de estas concentraciones y se analizaron para la expansion (Figura 1A) y para la expresion de marcadores de DC (Figura 1B). El analisis revelo que, aunque comprometiendo espectacularmente la division celular, estas dosis de mitoxantrona condujeron a los progenitores de MUTZ3 supervivientes a diferenciacion, ya que hubo una relacion de CD34+/CD14+ alterada en favor del subconjunto de
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CD14+ de diferenciacion, expresion inducida por el tratamiento con mitoxantrona de los marcadores espedficos de LC CD1a y langerina y elevados niveles de expresion de las moleculas coestimulantes CD86 y CD80 (Figura 1B). Se llevaron a cabo experimented similares con el farmaco doxorubicina. Al igual que la mitoxantrona, la concentracion de CI70 de doxorubicina (~100 mM) en MUTZ3 indujo la diferenciacion de LC de progenitores de MUTZ3, mientras que no se observaron efectos cuando se anadio doxorubicina 16,7 nM (concentracion equimolar a mitoxantrona).
La Figura 2 muestra el nivel de apoptosis y la muerte celular tras el tratamiento con PBS o mitoxantrona dentro de las tres subpoblaciones de MUTZ3, que se habfan separado por clasificacion magnetica con perlas basada en CD14 o CD34 (MACS). Estuvo presente poca apoptosis o necrosis en los controles de PBS (Figura 2A). La poblacion de CD14+ no estuvo afectada por el tratamiento con mitoxantrona, ya que estuvo presente una cantidad similar de celulas CD14+ positivas para anexina V despues de 72 horas del tratamiento con PBS o mitoxantrona. CD34+, y a un menor grado la poblacion de DN, fue sensible al farmaco. Sin embargo, a pesar de la muerte celular, un porcentaje de las celulas CD34+ proliferantes sobrevivio al tratamiento con mitoxantrona. Se obtuvieron resultados comparables con doxorubicina 100 nM.
Ejemplo 4: Celulas MUTZ3 CD34+, pero no CD14+, muestran diferenciacion inducida por farmaco
Para ver si el efecto de distorsion era debido o no a la muerte de celulas CD34+, que conducen automaticamente a una relacion CD34+/CD14+ alterada o si indujo o no la diferenciacion de celulas CD34+ en celulas CD14+ y LC, se incubaron celulas CD34+ y CD14+ aisladas con mitoxantrona 16,7 nM o doxorubicina 100 nM durante 72 horas y se analizaron para la induccion de diferenciacion.
El analisis fenotfpico revelo que los efectos de mitoxantrona o doxorubicina sobre las celulas MUTZ3 podnan ser contribuidos a la poblacion de CD34+ (Figura 3). Las celulas CD14+ no estuvieron afectadas por la incubacion con mitoxantrona 16,7 nM o doxorubicina 100 nM, ya que no hubo alteraciones en los porcentajes de celulas CD1a+ o langerina+ entre las celulas tratadas con farmaco y el control de PBS (Figura 3A). Mas celulas CD14+ estuvieron presentes en los cultivos de celulas CD34+ tras el tratamiento con ambos farmacos (Figura 3B) y el tratamiento con farmaco produjo la diferenciacion de celulas clasificadas CD34+ en celulas CD1a+, de las que aproximadamente el 50 % tambien expreso el marcador de LC langerina (Figura 3B). Este efecto de diferenciacion tambien podna visualizarse por la dispersion frontal/lateral (FSC/SSC), ya que un claro desplazamiento en SSC podna ser reconocido en las celulas CD34+ tratadas con farmaco, que no estaba presente en las celulas CD14+ tratadas con farmaco (Figura 3A y B). Los graficos en la Figura 3C muestran la induccion promedio de CD1a y la expresion de langerina dentro de los dos subconjuntos aislados despues de 72 horas de tratamiento con PBS, mitoxantrona o doxorubicina (n=3). No se observaron diferencias en la expresion de CD1a o langerina dentro del subconjunto de CD14+ entre las muestras tratadas con farmaco y de control de PBS. En el subconjunto de CD34+, la incubacion con mitoxantrona 16,7 nM conduce a un aumento significativo en tanto la expresion de CD1a como de langerina (p= 0,02 para CD1a; p= 0,03 para langerina). La doxorubicina tambien indujo la expresion de CD1a y de langerina sobre celulas MUTZ3 CD34+.
Como la mitoxantrona es el sustrato mejor conocido para el transportador de ABC BCRP (ABCG2), los presentes inventores determinaron si la diferencia en la sensibilidad podna explicarse por un nivel de expresion diferente de BCRP entre las tres poblaciones. No pudo detectarse expresion de BCRP por analisis de transferencia Western en poblaciones de CD14+, CD34+ o DN (datos no mostrados). La adicion del inhibidor de BCRP Ko-143 tampoco pudo suprimir la induccion de CD1a y la expresion de langerina en celulas MUTZ3 CD34+ despues del tratamiento con mitoxantrona (Figura 3D), sugiriendo que los efectos observados fueron independientes de la actividad de BCRP.
Ejemplo 5: Mitoxantrona y doxorubicina aceleran la diferenciacion de LC
A continuacion, los presentes inventores probaron si la adicion de mitoxantrona o doxorubicina al principio de los cultivos de MUTZ3-LC podna reforzar la diferenciacion. La adicion de una dosis unica de mitoxantrona 16,7 nM en el dfa 0 de la diferenciacion de MUTZ3-LC produjo celulas completamente diferenciadas con alta expresion de marcadores de LC espedficos en el dfa 4, mientras que los cultivos de control normalmente necesitaron 8-10 dfas para diferenciarse completamente. En la Figura 4A, se representan representaciones FSC/SSC de LC de dfa 4 cultivadas con PBS o mitoxantrona y la expresion de CD1a/langerina en estos cultivos. Claramente, las LC tratadas con mitoxantrona se habfan diferenciado adicionalmente, ya que presentaron una morfologfa mas dendntica en la representacion de FSC/SSC y ya el 76 % de las celulas fue CD1ahiLangerina+ en comparacion con el 25 % en las celulas de control. Ademas de CD1a y langerina, estas celulas tambien mostraron expresion potenciada de las moleculas co-estimulantes CD80 y CD86 y tuvieron niveles de expresion mas altos de HLA-DR y CD54. La Figura 4B muestra datos combinados de 3 experimentos para CD1a, langerina y CD83. Ademas del aumento significativo ya mencionado en el porcentaje de celulas que expresan CD1a y langerina (p= 0,02 y p= 0,01 respectivamente), tambien hubo una disminucion significativa en el porcentaje de celulas CD14+ y CD34+ (p= 0,04 y p= 0,02, respectivamente) y un aumento significativo en la cantidad de celulas que expresan el marcador de maduracion CD83 (p= 0,03).
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Ejemplo 6: Progenitores hematopoveticos de CD34+ responden a mitoxantrona
Para establecer si precursores de CD34+ humanos de sangre respondieron o no de un modo similar a mitoxantrona como las celulas MUTZ3 CD34+, precursores hamatopoyeticos CD34+ aislados de sangre humana y expandidos durante un periodo de 1-4 semanas con el ligando Flt3 (Flt3L), trombopoyetina y factor de celulas madre (SCF) (Bontkes et al., J. Leukoc. Biol. 2002 Vol 72(2):321) se descongelaron de nitrogeno Kquido y se trataron con mitoxantrona. El tratamiento con mitoxantrona produjo la perdida de la mayona de las celulas CD34+ y un aumento en las celulas CD14+ (Figura 5A). En presencia de citocinas de distorsion hacia LC, la adicion de mitoxantrona
16.7 nM indujo un aumento en el porcentaje de celulas CD1a+ langerina+ en el plazo de 72 horas (Figura 5B) (n=2). A diferencia, cuando se realizaron experimentos similares con monocitos CD14+ aislados de sangre, en analogfa con los datos de MUTZ3 CD14+, no hubo efecto sobre la viabilidad celular, ni se observo ninguna induccion de diferenciacion.
Ejemplo 7: Las celulas cultivadas con mitoxantrona son funcionales
Con tales propiedades de aceleracion de la diferenciacion, la mitoxantrona podna ser un adyuvante adecuado para la rapida diferenciacion in vitro de vacunas de DC para las estrategias de vacunacion inmunoterapeutica. Por lo tanto, los presentes inventores analizaron si la concentracion de mitoxantrona podna reducirse sin perder la ventaja de diferenciacion, pero con la ventaja de rendimiento de celulas viables mas alto. En cultivos de MUTZ3-DC y -LC, se realizo una valoracion de 2 etapas de la concentracion de mitoxantrona 16,7 nM y se analizaron los fenotipos DC/LC despues de 72-96 horas. Todavfa se observo un robusto efecto sobre la diferenciacion de MUTZ3-DC y -LC cuando se anadio mitoxantrona 2,08 nM durante la diferenciacion. De forma interesante, en los cultivos de MUTZ3- DC suministrados con mitoxantrona, la expresion de langerina aumento, sugiriendo una capacidad de distorsion hacia LC de la mitoxantrona. La Figura 6 muestra los porcentajes de celulas que expresan CD1a, DC-SIGN, langerina, CD80, CD40 y CD83 y las intensidades medias de fluorescencia de CD80, CD86, CD40 y HLA-DR de dfa 4 maduras MUTZ3-DC/LC y MUTZ3-DC/LC de dfa 4 maduras diferenciadas en ausencia o presencia de mitoxantrona. En ambos casos, la adicion de mitoxantrona 2,08 nM aumento la cantidad de celulas que expresan CD1a, langerina, CD80, CD40 y CD83 y tambien potencio los niveles de expresion de CD80, CD86, Cd40 y HLA- DR. Para HLA-DR, la expresion fue incluso mas alta que en los cultivos de control (Figura 6).
Si van a usarse tales DC generadas por mitoxantrona para futuras estrategias de vacunacion, necesitan ser funcionalmente completamente activas. Por tanto, las MUTZ3-DC cultivadas en ausencia o presencia de mitoxantrona se analizaron en un ensayo Transwell para su capacidad para migrar hacia las quimiocinas CCL19 y CCL21 (Figura 7A) y se probaron en una MLR para su capacidad para estimular la proliferacion de linfocitos T alogenos (Figura 7B). A diferencia de las DC de 4 dfas maduras sin tratar, las DC generadas con mitoxantrona de dfa 4 fueron comparables a las DC de control maduras de dfa 7 en su capacidad para migrar hacia las quimiocinas de recirculacion de LN y estuvieron capacitadas para inducir la proliferacion de linfocitos T.
Ejemplo 8: La mitoxantrona puede estimular la migracion de DC de piel humana
Para establecer si la mitoxantrona podna o no ser beneficiosa como adyuvante local, se inyectaron por via intradermica explantes de piel humana con GM-CSF e IL-4 en combinacion con mitoxantrona 2,08 nM, 5,6 nM o
16.7 nM y se flotaron biopsias en sacabocados de 6 mm en medio que contema la misma concentracion de mitoxantrona. Se dejo que DC de piel migraran de las biopsias durante 2 dfas, despues de lo cual se recogieron, se cuantificaron y se fenotipicaron. La Figura 7C muestra que la inyeccion de mitoxantrona 2,08 nM o 5,6 nM aumento la cantidad de celulas migradas aproximadamente el 50-60 %. La inyeccion de mitoxantrona 16,7 nM solo aumento ligeramente la cantidad de celulas migradas, posiblemente debido a la induccion de muerte celular en las DC migrantes o migradas.
En conclusion, los resultados muestran que altas concentraciones de la antraciclinas, como los farmacos citotoxicos mitoxantrona y doxorubicina, pueden conducir celulas precursoras CD34+ a la diferenciacion de DC y que bajas concentraciones de mitoxantrona pueden acelerar eficientemente (in vitro) la diferenciacion de DC en combinacion con citocinas de diferenciacion. Estas DC generadas por antraciclina rapidamente diferenciadas (dfa 4) se distorsionaron hacia un fenotipo mas similar a LC y fueron tan capaces como las cultivadas a largo plazo convencionales (dfa 7) en migrar hacia las quimiocinas CCL19 y CCL21 y en promover la proliferacion de linfocitos T. Ademas, se mostro que la inyeccion intradermica de dosis baja de mitoxantrona en medio puro, pero especialmente en combinacion con GM-CSF e IL-4, aumento la cantidad de DC que emigran de la piel.
Ejemplo 9: Las DC cultivadas con mitoxantrona pueden sensibilizar los linfocitos T especificos de antigeno
Una funcion muy crucial de las DC en las estrategias de vacunacion antitumoral es la capacidad de las celulas a sensibilizar CTL especificos de antigeno tumoral. Por lo tanto, se analizaron d4 mitox-mDC y d7 MUTZ3-mDC para su capacidad para sensibilizar CTL especificos de MART1 in vitro. Ambos tipos de DC fueron capaces de inducir CTL especificos de MART1, como se analizaron por la presencia de celulas positivas para tetramero (Tm) espedfico de MART1 dentro del subconjunto de linfocitos T CD8+ en los cultivos en masa (Figura 8). A partir de los 12 cultivos en masa en los que se inicio la sensibilizacion de CTL, pudieron detectarse CTL MART1 Tm+ en 12/12 cultivos sensibilizados con d4 mitox-DC en comparacion con 11/12 cultivos sensibilizados con d7 MUTZ3-mDC de control. La
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Figura 5d muestra el porcentaje de CTL Tm+ para 6 cultivos en masa de un donante HLA-A2+ despues de la segunda re-estimulacion con DC cargadas con peptido.
Los resultados muestran as^ que las antraciclinas, el farmaco citotoxico mitoxantrona (y tambien la doxorubicina) inducen la diferenciacion de precursores de DC CD34+ supervivientes. Ademas, cuando se anadieron al inicio de la diferenciacion en combinacion con DC o citocinas que se distorsionan hacia LC, este farmaco potencio espectacularmente la diferenciacion.
Los datos de los presentes inventores mostraron la induccion y aceleracion de la diferenciacion de celulas de Langerhans tras el tratamiento de celulas precursoras CD34+, pero no CD14+, con antraciclinas como mitoxantrona a pesar de causar la muerte celular. Las celulas precursoras CD34+ fueron sensibles a los farmacos, pero esta sensibilidad se redujo cuando las citocinas inductoras de la diferenciacion estuvieron presentes. Importante para todas las DC cultivadas in vitro que van a usarse para fines de vacunacion es la capacidad funcional de las DC. La antraciclina (por ejemplo, mitoxantrona) genero DC, aunque solo se diferenciaron durante 3 dfas y maduraron con una mezcla de maduracion de citocinas estandar durante 24 horas, fueron completamente capaces de migrar hacia las quimiocinas CCL19 y CCL21 y pudieron inhibir eficientemente la proliferacion de linfocitos T. Este metodo de diferenciacion de DC es asf un metodo mas rentable que requiere menos tiempo de generacion de DC cultivadas in vitro a niveles de (c)GMP para fines de vacunacion.
Ademas, los datos muestran que la administracion local de antraciclinas como mitoxantrona, en combinacion con citocinas, podna inducir la eficiente y potenciada migracion de DC de explantes de piel humano. Estos hallazgos muestran que antraciclinas como mitoxantrona son capaces de inducir la activacion de DC en sitios perifericos, como la piel (sitio de vacunacion preferido) o tumor, donde puede suprimirse la activacion o diferenciacion de DC de precursores locales. Por ejemplo, en cutis de melanoma, el sitio del tumor esta facilmente accesible y la localizacion anatomica garantiza la presencia de celulas precursoras LC dirigibles/accesibles a farmaco. La abundante presencia de antfgenos tumorales, especialmente despues de la administracion local de agentes citostaticos, que inducira que mueran algunas celulas de melanoma, y la rapida induccion de diferenciacion de LC por antraciclinas como mitoxantrona, pueden dar lugar a excelentes respuestas inmunitarias antitumorales.

Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Metodo in vitro para la produccion acelerada de celulas dendnticas en un medio de cultivo que comprende las etapas de:
    a) poner en contacto celulas CD34 positivas con una antraciclina y/o una antracenodiona durante un periodo de entre 1 y 7 dfas,
    b) permitir que las celulas CD34 positivas se diferencien en celulas dendnticas,
    c) obtener dichas celulas dendnticas del medio de cultivo.
  2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que celulas CD34 positivas aisladas se ponen en contacto con una antraciclina y/o una antracenodiona.
  3. 3. Un metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, en el que la antraciclina y/o una antracenodiona estan seleccionadas del grupo que consiste en daunorubicina, doxorubicina, pirarubicina, aclarubicina, epirubicina, oxaunomicina, andidarubicina y mitoxantrona.
  4. 4. Un metodo segun las reivindicaciones 1 - 3, en el que las celulas CD34 positivas se ponen en contacto con la antraciclina y/o una antracenodiona durante un periodo entre 1,5 y 5 dfas.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4, en el que las celulas CD34 positivas se ponen en contacto con la antraciclina y/o una antracenodiona durante un periodo entre 2 y 4 dfas.
  6. 6. Un metodo segun las reivindicaciones 1 - 5, en el que al menos un compuesto adicional capaz de inducir la diferenciacion de las celulas dendnticas esta presente en el medio de cultivo, en el que el compuesto adicional capaz de inducir la diferenciacion esta seleccionado del grupo que consiste en GM-CSF, TNF-alfa, IL-4 y TGF-beta 1.
  7. 7. Un metodo segun las reivindicaciones 1 - 6, en el que al menos un compuesto adicional capaz de inducir la maduracion de las celulas dendnticas esta presente en el medio de cultivo, en el que el compuesto adicional capaz de inducir la maduracion esta seleccionado del grupo que consiste en TNF-alfa, IL-6, PGE2 e IL-1 Beta.
  8. 8. Un metodo segun las reivindicaciones 1 - 7, en el que las celulas dendnticas estan seleccionados del grupo que consiste en celulas dendnticas intersticiales, celulas dendnticas inmaduras, celulas dendnticas de Langerhans, celulas dendnticas plasmatoides y celulas dendnticas maduras.
  9. 9. Un metodo segun las reivindicaciones 1 - 8, en el que las celulas CD34 positivas son celulas MUTZ3, celulas humanas o celulas tumorales humanas.
  10. 10. Un metodo segun la reivindicacion 9, en el que las celulas MUTZ3 se ponen en contacto con mitoxantrona 0,05 nM a 20 nM y/o doxorubicina 10 a 120 nM, en presencia de 50 a 150 ng/ml de GM-CSF, de 5 a 20 ng/ml de IL-4 y de 0,5 a 4 ng/ml de TNF-alfa.
  11. 11. Un metodo segun la reivindicacion 9, en el que las celulas MUTZ3 se ponen en contacto con mitoxantrona 0,05 nM a 20 nM y/o doxorubicina 10 a 120 nM, en presencia de 5 a 20 ng/ml de TGF-beta 1, de 50 a 150 ng/ml de GM-CSF y de 0,5 a 4 ng/ml de TNF-alfa.
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