JP2004534508A - コルチコトロピン放出因子レセプタ２欠失マウスとその利用 - Google Patents

Abstract

本発明はコルチコトロピン放出因子レセプタ２（ＣＲＦＲ２）を欠失した遺伝子導入マウスを提供する。ＣＲＦＲ１を欠失したマウスは不安状の挙動の低下とストレス応答の低下を示す。対照的に、ＣＲＦＲ２欠失突然変異体マウスはストレスに対する過剰反応と不安状の挙動の増大を示す。これらは不安、鬱、及びＨＰＡ軸の生理の研究に有用である。ＣＲＦＲ２欠失突然変異体マウスは検査されたすべての組織内で血管形成の増大を示した。従って、ＣＲＦＲ２拮抗物質は種々の状態の治療のために血管形成を促進するために用いることができる。対照的に、ＣＲＦＲ２作用物質は血管形成を抑止するために用いることができる。ウロコルチンとｂＦＧＦの組み合わせは急速な毛髪成長を誘発することが観察された。

Description

【０００１】
（連邦政府の資金援助について）
本発明は一部連邦政府からの資金援助第ＮＩＨ ＤＫ−２６７４１及びＮＲＳＡフェローシップ第ＤＫ０９８４１及び第ＤＫ０９５５１を用いて行われたものである。従って、本発明に対して連邦政府は一定の権利を有している。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般的には神経生物学、内分泌学、及び精神医学の分野に関するものである。より具体的には、本発明は不安症の研究及びコルチコトロピン放出因子レセプタ２を欠失したマウスに関するものである。
【０００３】
（関連技術の説明）
コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）は視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸の重要な調整因子である。ストレスに応答して、視床下部傍室核（ＰＶＮ）から放出されたコルチコトロピン放出因子は下垂体前葉の副腎皮質刺激因子上のコルチコトロピン放出因子レセプタを活性化し、その結果血流中に副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）が放出される。一方で、ＡＣＴＨは副腎皮質中のＡＣＴＨレセプタを活性化し、グルココルチコイド（１）の合成と放出を増加させる。
【０００４】
ＣＲＦのレセプタである、ＣＲＦＲ１及びＣＲＦＲ２はＣＮＳ及び末梢の全体にわたって局在する。ＣＲＦはＣＲＦＲ２に対するよりもＣＲＦＲ１に対する親和性が高く、ＣＲＦ関連ペプチドであるウロコルチン（ＵＣＮ）はＣＲＦよりも４０倍近い高い親和性で結合するため、ＣＲＦＲ２に対する内因性リガンドであると考えられている（２）。ＣＲＦＲ１とＣＲＦＲ２のアミノ酸類似性は約７１％で、脳及び周辺組織内の局在が異なっている（３−６）。ＣＲＦＲ１は主に下垂体、大脳皮質、小脳、後脳、及び嗅球で発現するが、ＣＲＦＲ２は側中隔（ｌａｔｅｒａ ｓｅｐｔｕｍ）、視床下部腹内側部（ＶＭＨ）、脈絡叢、及び多くの末梢部位に見られる（３、７）。
【０００５】
ＣＲＦＲ１を欠失したマウスはＨＰＡ軸のホルモン・レベルが低下し、ストレス応答の機能が損なわれ、不安症に似た行動が減少する（８、９）。これらの結果はＣＲＦＲ１特異的拮抗物質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで用いて得られた結果と一致する（１０−１２）。その一方で、ＣＲＦＲ２特異的拮抗物質は現在のところ利用可能でなく、１９９５年にクローニングされて以来、ＣＲＦＲ２の生理学的機能については殆ど解明されていない。ＵＣＮはＣＲＦＲ２に対する内因性リガンドの可能性があり、中枢に投与されるとき摂食行動を調節することが示されている（１３）。ＣＲＦＲ２は摂食行動の調整と満腹に関する中枢部位である視床下部腹内側部に局在することから、これらのレセプタでのウロコルチンの作用が摂食行動に影響している可能性がある。さらに、ウロコルチンの末梢投与は血管内皮細胞内のＣＲＦＲ２での作用の結果と考えられる（３、７）高血圧に至る（２、１４）。従って、ＣＲＦＲ２の発生的及び生理的な役割を識別するため、ＣＲＦＲ２の無発現変異マウスを産生し、分析した。
【０００６】
先行技術はコルチコトロピン放出因子レセプタ２を欠失させたマウスを欠いている点で不十分である。本発明は本技術分野における長年のニーズと願望を達成するものである。
【０００７】
（発明の要約）
ＣＲＦＲ２欠失マウスは不安症に似た行動が増加し、ストレス応答においてＨＰＡ軸の過敏性を示す。ＣＲＦＲ１及びＣＲＦＲ２の無発現変異マウスは不安症と抑鬱の貴重なモデルを提供し、これらの疾病に内在する分子メカニズムの解明をさらに促進することができる。コルチコトロピン放出因子のシグナル経路と不安症及び抑鬱の処置におけるその役割に関する研究はこれらの疾病の効果的な治療に求められる必要な手がかりを提供するであろう。
【０００８】
従って、本発明はコルチコトロピン放出因子レセプタ２（ＣＲＦＲ２）の少なくとも１つの対立遺伝子を破壊した非自然型遺伝子導入マウスに関するものであり、前記マウスは前記対立遺伝子からのコルチコトロピン放出因子レセプタ２（ＣＲＦＲ２）を発現しない。好ましくは、前記コルチコトロピン放出因子レセプタ２対立遺伝子のエクソン１０、１１、及び１２のＤＮＡ塩基配列は除去されている。その遺伝子導入マウスはネオマイシン耐性遺伝子カセットで置換されたこれらのＤＮＡ塩基配列を有してもよい。その遺伝子導入マウスはこの置換に対して異型接合的または同型接合的のいずれでもよい。また、本発明の１つの実施の形態には本発明によるマウスと別系統のマウスの交配の結果も含まれている。
【０００９】
本発明の別の実施の形態は、不安症または抑鬱の研究及び不安症または抑鬱に対する種々の化合物の効果をテストするためのＣＲＦＲ２欠失マウスの利用法である。例えば、不安緩和活性を有する化合物をスクリーニングする１つの方法が提供され、その方法は：ａ）前記化合物を本発明による遺伝子導入マウスに投与するステップ；ｂ）上記マウスを不安症に関係する行動についてテストするステップ、及びｃ）上記マウスの不安症に似た行動を上記化合物が投与されない本発明による第２の遺伝子導入マウスの不安症に似た行動と比較するステップで構成される。さらに、鬱緩和活性を有する化合物をスクリーニングする１つの方法が提供され、その方法は：ａ）前記化合物を本発明による遺伝子導入マウスに投与するステップ；ｂ）上記マウスを抑鬱に関係する行動についてテストするステップ、そしてｃ）上記マウスの抑鬱に似た行動を上記化合物が投与されない本発明による第２の遺伝子導入マウスの抑鬱に似た行動と比較するステップで構成される。
【００１０】
本発明のさらに別の実施の形態は血圧または血管形成に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするため同様の手順におけるＣＲＦＲ２欠損マウスの利用を含んでいる。
【００１１】
本発明のまた別の実施の形態は、例えば、視床下部−下垂体−副腎軸のストレスへの応答に効果を持つ化合物をスクリーニングする１つの方法などＨＰＡ軸の生理機能の研究に対するＣＲＦＲ２欠損マウスの利用法であり、その利用法は：ａ）前記化合物を本発明による遺伝子導入マウスに投与するステップ；ｂ）上記マウスをストレス誘発状態に置くステップ；ｃ）上記マウスのコルチコステロン及び副腎皮質刺激ホルモンの血漿レベルをモニターするステップ；及びｄ）前記レベルをストレス誘発状態に置かない本発明による遺伝子導入マウスのレベルと比較するステップで構成される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施の形態で、前記マウスはコルチコステロン及びＡＣＴＨの血漿レベルをモニターすることによってストレスに対するＨＰＡ軸の応答に関する化合物の影響を調べるために用いることができる。
【００１３】
本発明のさらに別の実施の形態はコルチコトロピン放出因子レセプタ２のコルチコトロピン放出因子やウロコルチンなど他の蛋白質に対する影響の研究において前記マウスを利用することに関する。
【００１４】
本発明のさらに別の実施の形態は、ＣＲＦＲ２の存在によって妨げられずにＣＲＦＲ１の応答を調べるためのＣＲＦＲ２欠損マウスの利用である。
【００１５】
ＣＲＦＲ２無発現変異マウス（ＣＲＦＲ２ ｎｕｌｌ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ）の研究によってＣＲＦＲ２遺伝子の欠失は実験を行った全ての組織で血管新生の増加をもたらしていることを明らかにした。従って、本発明による別の実施の形態は血管形成調節の分子メカニズムの研究へのＣＲＦＲ２無発現変異マウスの利用法である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施の形態で、ＣＲＦＲ２拮抗物質をその組織に投与することによって標的組織内で血管形成が促進される。そのような拮抗物質の１つの例がＣＲＦＲ２遺伝子に対して向けられたアンチセンス・ヌクレオチドである。心臓、脳、下垂体、生殖腺、腎臓、脂肪、及び胃腸管はそうした応答が達成される組織内にある。この血管形成の促進は梗塞、卒中、及びけがの治療に有益であるとされている。
【００１７】
本発明のさらに別の実施の形態で、血管形成はウロコルチンまたはＣＲＦなどのＣＲＦＲ２作用物質の投与によって標的組織内で阻害される。血管形成のＣＲＦＲ２作用誘発阻害性はガン及び糖尿病性網膜症治療に用いることができる。
【００１８】
本発明による別の実施の形態は、髪の成長が望まれる皮膚領域の下部にウロコルチン及びｂＦＧＦを移植することによって髪の成長を刺激する方法、または局所用組成物内のウロコルチンを皮膚に接触させる方法に関するものである。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明に従って、本技術分野の範囲内の通常の分子生物学、微生物学、そして組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。こうした技術については文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８２）； ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ［Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）］； ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” ［Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８４）］； ”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” ［Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６） ］； ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ Ｐｅｒｂａｌ， ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （１９８４）を参照されたい。
【００２０】
従って、本明細書では、以下の用語は下に述べられる定義を有するものとする。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、『ｃＤＮＡ』とは遺伝子のｍＲＮＡ転写のＤＮＡの複製を意味する。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、『ライブラリをスクリーニングする』という用語は、適切な条件下で、特定のＤＮＡライブラリ内に存在するプローブに対して相補的な配列が存在しているかどうかを調べるためにラベルされたプローブを用いるプロセスを指している。さらに、『ライブラリをスクリーニングする』ことはＰＣＲによって行なうことができる。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、『ＰＣＲ』という用語はＭｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２の主題であるポリメラーゼ鎖反応及び本技術分野で周知のその他の改良を指している。
【００２４】
本明細書で述べられるアミノ酸は好ましくは『Ｌ』異性体である。しかしながら、『Ｄ』異性体の残基も、ポリペプチドによって免疫グロブリン結合の望ましい機能的特性が保持される限り、いずれのＬアミノ酸残基ででも置換することができる。ＮＨ_２とはポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指している。ＣＯＯＨとはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基である。標準的なポリペプチドの専門用語集、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３：３５５２−５９ （１９６９） に準拠し、アミノ酸残基の略語は本技術分野で周知である。
【００２５】
尚、本明細書においてすべてのアミノ酸残基配列は左から右への向きがアミノ末端からカルボキシ末端へという従来の方式で表されている。さらに、アミノ酸残基配列の開始点あるいは終点のダッシュは１つ以上のアミノ酸残基の別の配列へのペプチド結合を示す。
【００２６】
『レプリコン』とは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自立的単位として機能する、即ちそれ自体の制御下で複製を行なうことができるすべての遺伝子要素（例えば、プラスミド、クロモソーム、ウィルス）である。
【００２７】
『ベクター』とは、別のＤＮＡセグメントを取り付けて、その取り付けられたセグメントの複製を引き起こすプラスミド、ファージ、あるいはコスミドなどのレプリコンである。
【００２８】
『ＤＮＡ分子』とは、１本鎖あるいは２本鎖らせんのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシン）の重合体の形状をとったものを意味する。この用語はその分子の一次及び二次構造のみについて言い、特定のどんな三次的形状にも限定するものではない。従って、この用語は、特に線状ＤＮＡ分子（例えば、制限酵素断片）、ウィルス、プラスミド、及びクロモソーマに見られる２本鎖ＤＮＡなどを含む。本明細書において上記構造に関する議論では、ＤＮＡの非転写鎖（例えば、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与える標準的な慣例に従う。
【００２９】
『複製開始点』とは、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を意味する。
【００３０】
ＤＮＡの『コード配列』とは２本鎖ＤＮＡ配列であり、適切な調節塩基配列の制御下に置かれたとき、ｉｎ ｖｉｖｏでポリベプチドに転写され、翻訳される。コード配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、そして合成ＤＮＡ配列さえも含まれるが、それだけに限定されるものではない。ポリアデニル酸化シグナル及び転写終結配列はコード配列に対して３’に位置するのが普通である。
【００３１】
転写及び翻訳調節塩基配列は、ホスト細胞内でコード配列の発現を提供するプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル酸化シグナル、ターミネータ等のＤＮＡ調節配列である。
【００３２】
『プロモータ配列』とは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を明示する目的のため、上記プロモータ配列はその３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグランドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基あるいは成分の最低限の数を含めるため上流（５’方向）に伸長される。プロモータ配列内には転写開始部位、そしてＲＮＡポリメラーゼ結合を担う蛋白質結合領域（コンセンサス配列）も見いだされるであろう。真核生物のプロモ−タは常にではないが、しばしば『ＴＡＴＡ』ボックス及び『ＣＡＴ』ボックスを含んでいる。原核生物のプロモ−タは−１０及び−３５のコンセンサス配列に加えて、ＳＤ配列を含んでいる。
【００３３】
『発現制御配列』とは、別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御、調整するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写するとき、コード配列は細胞内で転写及び翻訳調節配列の『調節下』にあり、その後上記コード配列によってコードされる蛋白質に翻訳される。
【００３４】
『シグナル配列』はコード配列の近傍などにある。この配列はシグナル・ペプチドをポリペプチドのＮ末端にコードし、シグナル・ペプチドはポリペプチドを細胞表面に導くか、またはポリペプチドを媒体に分泌するようホスト細胞に伝達し、このシグナル・ペプチドは蛋白質が細胞を離脱する前にホスト細胞によって切離される。シグナル配列は原核生物及び真核生物が生来持つ種々の蛋白質に関連して見いだされる。
【００３５】
『オリゴヌクレオチド』とは、本発明によるプローブについて本明細書で用いられているように、２個以上、より好ましくは３個以上のリボヌクレオチドからなる分子として定義される。その厳密な大きさは最終的な機能及びオリゴヌクレオチドの利用に左右される多くの要因に依存する。
【００３６】
『プライマー』とは、本明細書で用いられるように、精製された制限消化物のように自然発生するものであれ、人工的に生成されたものであれ、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導体の存在下で、適切な温度及びｐＨにあるときに合成開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは１本鎖あるいは２本鎖のいずれでもよいが、誘導体の存在下で好ましい伸長生成物の合成をプライムするために十分な長さでなければならない。プライマーの厳密な長さは温度、プライマーの供給源及び使用法など多くの要因に左右される。例えば、分析に利用するときは、ターゲット配列の複雑性にもよるが、オリゴヌクレオチド・プライマーは通例１５から２５個あるいはそれ以上のヌクレオチドを含み、それより少ないヌクレオチドを含んでいる場合もある。
本明細書におけるプライマーは特定のターゲットＤＮＡ配列の異なる鎖に対して
【００３７】
『実質的に』相補的であるように選択される。このことはプライマーがその各々の鎖とハイブリダイズするため十分相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列はテンプレート配列を正確に反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片はプライマーの５’末端に付着され、プライマー配列の残り部分はその鎖に相補的であってもよい。また、もしプライマー配列がその配列に十分相補的であるか、またはその配列とハイブリダイズされ、それによって伸長生成物合成のためのテンプレートを形成するならば、非相補的な塩基あるいはより長い配列がプライマーに散在される。
【００３８】
本明細書で用いられるように、『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』とは、２本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列で、あるいはその近傍で切断するすべての酵素を意味する。
【００３９】
外来性または異種由来のＤＮＡが細胞内に導入されたとき、そのようなＤＮＡによって細胞は『形質転換』される。形質転換ＤＮＡはその細胞のゲノム内に組み込まれる（共有結合）ことも、組み込まれないこともある。例えば、原核生物、イースト菌、及び哺乳類の細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム因子上に保持されるかもしれない。真核生物の細胞に関して、安定的に形質転換された細胞は、クロモソーム複製を介して娘細胞によって受け継がれるように形質転換ＤＮＡがクロモソーム内に組み込まれる。この安定性は形質転換ＤＮＡを含んでいる娘細胞群から成る細胞株またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって明示される。『クローン』とは、単一の細胞または有糸分裂による原種に由来する細胞群である。『細胞株』とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで何代にもわたって安定して成長できる第１次細胞のクローンである。
【００４０】
一般に、挿入されたＤＮＡ断片の効果的な転写を促進するプロモータ配列を含んでいる発現ベクターは上記ホストに関連して用いられる。その発現ベクターは通常複製開始点、プロモータ、ターミネータ、さらに形質転換細胞において表現型選択を提供することができる特異的な遺伝子も含んでいる。その形質転換ホストを細胞の最適な成長を達成するために本技術分野で周知の方法に従って発酵及び培養することができる。
【００４１】
当業者に周知の方法を適切な転写及び翻訳制御信号を含んでいる発現ベクターをつくるために用いることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． に記述された技術を参照。１つの遺伝子とその転写コントロール配列は、もしその転写コントロール配列がその遺伝子の転写を効果的に制御するならば、『操作可能に結合されている』と定義される。本発明によるベクターにはプラスミド・ベクター及びウイルス・ベクターなどがある。
【００４２】
本発明はＣＲＦＲ２を欠失したマウスに関するものであり、前記マウスは不安症及びＨＰＡ軸回路構成におけるＣＲＦＲ２の発生的及び生理的な役割を識別するためつくられた。これはコルチコトロピン放出因子レセプタ２対立遺伝子のエクソン１０、１１、及び１２を欠失することによって行われた。本発明において、これらの塩基配列はネオマイシン耐性遺伝子カセットで置換された。前記マウスはそのＣＲＦＲ２欠失に対して異型接合的または同型接合的のいずれであってもよく、別系統のマウスと交配させてもよい。
【００４３】
本発明は不安症または抑鬱を緩和させる働きをする化合物をテストするための方法など不安症または抑鬱の研究におけるＣＲＦＲ２欠失マウスの利用法にも関するものである。血圧または血管形成に影響を及ぼす化合物もＣＲＦＲ２欠損マウスを使ってスクリーニングすることができる。
【００４４】
本発明は視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸の分子生理学の研究におけるＣＲＦＲ２欠損マウスの利用にも関するものである。そのマウスを化合物がストレスに対するＨＰＡ軸の応答に及ぼす効果についてテストするため用いることもできる。
【００４５】
本発明はコルチコトロピン放出因子レセプタ２のコルチコトロピン放出因子、コルチコトロピン放出因子レセプタ１、ウロコルチン及びその他のＣＲＦ及びウロコルチン・レセプタに対する分子機能を研究するための前記形質転換マウスの利用にも関する。
【００４６】
さらに、本発明はＣＲＦＲ２の負の環境（ＣＲＦＲ２ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）におけるＣＲＦＲ１の応答及び働きを研究するためにも用いられる。この意味で、ＣＲＦＲ１応答をＣＲＦＲ２の調整によって妨げられずに研究することができる。
【００４７】
本発明は血管形成の分子制御に対するＣＲＦＲ２無発現変異マウスの利用にも関するものである。
【００４８】
本発明はＣＲＦＲ２拮抗物質を標的組織に投与することによって血管形成を促進する方法にも関する。これが達成される１つの方法はＣＲＦＲ２遺伝子に対して向けられたアンチセンス・ヌクレオチドの利用によるものである。そうした応答が達成される組織には心臓、脳、下垂体、生殖腺、腎臓、脂肪、及び消化管などである。本発明は梗塞、卒中、及びけがの後の血管形成促進に有益であることが証明される。
【００４９】
本発明は心臓、脳、下垂体、生殖腺、腎臓、脂肪、及び消化管などの標的組織にＣＲＦＲ２作用物質を投与することによって血管形成を阻害する方法にも関するものである。ＣＲＦＲ２作用物質にはウロコルチンまたはＣＲＦなどがある。ガン及び糖尿病性網膜症は血管形成のＣＲＦＲ２作用物質誘発阻害性に応答的な疾病の例である。
【００５０】
本発明は髪の成長が望まれる皮膚領域にウロコルチンを皮膚に接触させるステップで構成される髪の成長を促進する方法に関するものである。１つの実施の態様で、そのウロコルチンは皮膚下に移植される。ウロコルチン単独でも有用であろうが、ｂＦＧＦをウロコルチン投与の前、後、または同時に投与してもよい。ウロコルチンは、ｂＦＧＦとともに組成物に含まれていてもよい。
【００５１】
【実施例】
以下の実施例は本発明による種々の実施の形態を説明する目的でしめされるものであり、いかなる形でも本発明の限定を意味しない。
【００５２】
実施例１
ＣＲＦＲ２欠失マウスの産生
ＣＲＦＲ２非発現変異マウスをつくるため、ＣＲＦＲ２座を含んでいる１つのゲノム・クローンＤＮＡをマウス系統１２９ゲノムＤＮＡライブラリから単離した。このクローンから、膜貫通領域５の始めから膜貫通領域７の末端までをコードするＣＲＦＲ２遺伝子のエクソン１０、１１、及び１２がネオマイシン耐性遺伝子カセットで置換された標的ベクターをつくった（図１Ａ）。その結果得られたプラスミドＤＮＡをＮｏｔ Ｉで線形化し、先に述べたようにＪ１胚性幹（ＥＳ）細胞に電気穿孔した（８）。０．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（活性型）内で７から９日間選択した後、ネオマイシン耐性クローンを個別に選択し、サザン・プロット分析によって破壊されたＣＲＦＲ２対立遺伝子の存在をスクリーニングした。
【００５３】
ポジティブＥＳクローンをＣ５７ ＢＬ／６胚盤胞に注入し、キメラ・マウスをつくった。キメラ・マウスのオスをＣ５７ ＢＬ／６のメスと交配し、破壊された対立遺伝子の生殖細胞系伝達を毛色がアグーチを示すＦ１の子から得た尾部ＤＮＡのサザン・ブロット分析によって判定した（図１Ｂ）。
【００５４】
実施例２
ＣＲＦＲ２欠失マウスにおけるＣＲＦＲ１及びＣＲＦＲ２発現の分析
標的とされた欠失がＣＲＦＲ２遺伝子の非発現変異体を生じさせたかどうかを判定するため、レセプタ・オートラジオグラフィーを野生種対照群及び変異型マウスからの脳切片について行った。
【００５５】
２０μｍの切片化脳組織をセットしたスライドを室温で解凍し、１０分間５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で室温で２回洗浄した。その後切片を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、^１２５Ｉ−ソーバジン、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％のＢＳＡ、及び０．０５％バシトラシンを含んでいる緩衝液で６０分間室温で培養した。^１２５Ｉ−ソーバジンと１μｍの非加熱（ｃｏｌｄ）ソーバジンの両方に暴露させた隣接切片に非特異的結合が明示された。培養期間終了後、スライドを５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液に０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えたもので４Ｃで５分間の洗浄を２回行った。スライドを速やかに純水に浸漬し、乾燥させ、３日間並置して薄膜を生じさせた。
【００５６】
変異マウスでは、ＣＲＦＲ２（外側中隔）に特異的な脳領域内の結合は検出されなかったが、皮質内でＣＲＦＲ１への結合は維持された（図１Ｃ）。これらの結果はＣＲＦＲ２遺伝子の破壊がこれらマウスの非発現変異に至ったことを示す。変異マウスは繁殖可能で、メンデルの法則に従って変異対立遺伝子を伝えた。
【００５７】
実施例３
ＣＲＦＲ２欠失マウスの組織学的分析
ＨＰＡ軸の発達がＣＲＦＲ２非発現変異マウスで損なわれるかどうかを判定するため、生後１０から１２週のオスのマウスの下垂体及び副腎を切片化し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。すなわち、マウスを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流させた。組織を除去し、１晩４Ｃで後固定し、ＰＢＳ内の３０％スクロースで凍結保護した。組織を１２μｍ厚さに切片化し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。その結果は構造あるいは細胞型に明確な差異がないことを示した（図１Ｄ、図１Ｅ）。
【００５８】
さらに、下垂体の切片を抗ＡＣＴＨ抗体で染色した。下垂体を切片化し、５分間４％ＰＦＡで後固定し、ＰＢＳでリンスし、先に述べたようにＡＣＴＨ抗体で染色した（６）。野生種と変異型の副腎皮質刺激因子の間に定性的な差異は認められなかった（図１Ｅ）。
【００５９】
実施例４
ＣＲＦＲ２欠失マウスにおけるコルチコステロン及びＡＣＴＨレベルの判定
コルチコステロン及びＡＣＴＨの分析のため、個別飼育した生後１０から１２週のオスのマウスから血漿を得た。ケージの混乱を３０秒以内にして無麻酔のマウスから眼窩後部の血液からサンプルを採取した。基礎ＡＭサンプルは７：００ＡＭに回収した。基礎ＰＭサンプルは５：００ＰＭに回収した。放射免疫アッセイ・キットによって全く同一になるよう計量され、コルチコステロン・アッセイ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｄｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）で５μｌの血漿を使用し、ＡＣＴＨアッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ， ＣＡ）で５０μｌの血漿を使用した。ＡＣＴＨ及びコルチコステロンの標準的な基礎レベルが変異型及び対照群マウス（図２Ａ、２Ｂ）で見いだされ、ＡＣＴＨのレベルは脳内で影響を受けないという知見と一致した。
【００６０】
実施例５
ＣＲＦＲ２欠失マウスにおいてストレスがＨＰＡ軸応答に及ぼす効果
ストレスに対するＨＰＡ軸の応答を調べるため、マウスを段階的に時間を長くした物理的拘束ストレス下に置いた。５０ｍｌの円錐管（底部を取り除いたプラスチック製円錐管）内での２、５、または１０分間のいずれかの拘束ストレスの直後に血液サンプルを採取した。血漿のサンプルを直ちに遠心分離にかけ、評価が行われるまで−２０℃で保存した。
【００６１】
変異型マウスのＡＣＴＨレベルは有意に上昇し、拘束ストレス後わずか２分後に最高に達した（図２Ｃ）。一方、対照群マウスのＡＣＴＨレベルは拘束１０分後に最大に達した。同様に、変異型マウスのコルチコステロンのレベルは拘束２分後有意に上昇したが、対照群マウスのレベルはストレスの５分後増加した（図２Ｄ）。これらの結果は変異型マウスにおいてストレスに対するＨＰＡ軸の過敏応答を明らかにした。
【００６２】
実施例６
ＣＲＦＲ２欠失マウスは食餌剥奪に過敏
ＣＲＦＲ２はＶＭＨに多く含まれ、今までの研究でｉｃｖウロコルチン（１３）の食欲抑制効果が示されていることから、変異型と野生種の同腹仔で基礎摂食及び体重の増加を測定した。
【００６３】
基礎摂食を個別飼育した生後１２から１６週のオス同腹仔で測定した。マウス及びそれらの食餌用ペレットの重さを毎日９：００に測定した。食餌剥奪実験のため、対照群及び変異型同腹仔を個別飼育し、それらの基礎食餌摂取と体重を明らかにした。マウスの食餌剥奪を１２：００に開始して２４時間行ったが、水は自由に飲ませた。食餌剥奪期間の後、マウスの体重を測定し、前もって重量を量っておいた食餌ペレットを与えた。その後、食餌ペレットの重量を消灯（１８：００）まで２時間ごとに測定した。食餌ペレットとマウスの重さを翌朝もう一度測定した。食餌剥奪中の体重減少と、食餌剥奪後２４時間の食餌総消費量及び体重の増加を記録した。
【００６４】
ＣＲＦＲ２非発現変異（ｍｕｔ）マウスのオスの基礎摂食及び体重増加は野生種（ｗｔ）同胎仔と類似していた（２４時間食餌消費量 ｗｔ＝４．３±０．２４ｇ、 ｍｕｔ＝４．６±０．２３ｇ； 体重 ｗｔ＝２１．７±０．６６ｇ、 ｍｕｔ＝２１．２±０．５０ｇ； ｎ＝１０、平均値±ｓｅｍ）。
ストレスの多い刺激が変異型マウスの食餌摂取を変えるかどうか判定するため、対照群及び変異型マウスから２４時間食餌を剥奪し、その後再給餌して、前記マウスの食餌摂取と体重の変化を測定した。食餌剥奪の結果によれば、２４時間の食餌剥奪後、変異型マウスの食餌摂取の有意な減少を示した（図３Ａ）。変異型マウスは食餌剥奪後２４時間の期間に野生種の食餌レベルの７５％を消費した。しかし、変異型及び野生種の体重は食餌剥奪あるいは再給餌後で有意な違いはなかった（３Ｂ）。
【００６５】
実施例７
高架式十字迷路におけるＣＲＦＲ２欠失マウスの不安症に似た行動の評価
ＣＲＦＲ１変異型マウスが抗不安に似た行動を見せたので（８）、ＣＲＦＲ２非発現変異マウスを類似の実験で分析した。対照群及び変異型マウスを高架式十字迷路（ＥＰＭ）を使って評価した。生後２２から２４週のオスのマウスをこの実験で用いた。同腹仔野生種マウスを対照群として用いた。マウスを集団飼育して、規則的な明暗条件（６：００ＡＭ点灯、６：００ＰＭ消灯）を維持し、実験の１週間前に１日おきに取り扱った（ｈａｎｄｌｅ）。
【００６６】
十字迷路装置は黒色プレキシグラス製で２本のオープン・アーム（３０ｘ５ｃｍ）と同サイズのクローズド・アームを有し、３０ｃｍの高さの壁があった。その装置を床面から３０ｃｍの高さの高架にした。前記アームをセントラル・スクエア（５ｘ５ｃｍ）に連結し、それによって迷路装置を十字型に形成した。２５ワットの電灯を前記装置の上方に設置し、オープン・アームの光度を６ルクスにした。すべての実験を明暗サイクルのうち明期に行った。行動実験前に１時間マウスを実験室条件に慣れさせ、被験マウスは１回５分の実験を個別に受けた。
【００６７】
各マウスをオープン・アームに面したセンター・プラットフォームに置いて、実験を開始した。記録した行動はオープン・アーム及びクローズド・アームへの進入回数及び迷路の種々の部分での滞在時間であった。アームへの進入とは４本の脚すべてがアームへ進入することと定義した。クローズド・アームへの進入は十字型迷路における自発運動の指標と見なした。装置の上方に設置したカメラによって隣室のビデオ・モニターでマウスの行動の観察が可能であった。実験の最後に、オープン・アームへの進入回数及び滞在時間がそれぞれ全アームへの進入回数及び実験の所要時間に占めるパーセンテージで表された。結果を平均値±平均値の標準誤差で表す。ＥＰＡテストから得られた行動パラメータをスチューデントのｔ−テストを使って分析した。
【００６８】
その結果、ＣＲＦＲ２非発現変異マウスは野生種対照群マウスよりも十字型迷路装置のオープン・アームでの滞在時間が少なく、進入回数も少ないことが示された。オープン・アームへの進入率［ｔ（１２）＝２．６８４；ｐ＜０．０２］とオープン・アームでの滞在時間率［ｔ（１２）＝３．５２４；ｐ＜０．００５］の両方について有意な効果が見られた（図４Ａ）。不安症に似た行動の増加は、クローズド・アームでの行動全体［ｔ（１２）＝０．４６９；ｐ＝０．６４］及びすべてのアームへの進入［ｔ（１２）＝０．９０４；ｐ＝０．３８］が２つの群の間に相違がなかったので（図４Ｂ）、自発運動の変化によるものではない。これらの結果はＣＲＦＲ２非発現変異マウスが不安症に似た行動を著しく増加させたことを示す。
【００６９】
実施例８
明暗箱におけるＣＲＦＲ２欠失マウスの不安症に似た行動の評価
ＣＲＦＲ２非発現変異マウス及び対照群マウスの行動を明暗箱における不安症に似た行動に対しても分析した。長方形のプレキシグラス製の箱を２つの区画に分割して、１つは白く塗り（２８．５ｃｍ ｘ ２７．０ｃｍ）、もう１つは黒く塗った（１４．５ｃｍ ｘ ２７．０ｃｍ）。赤いプレキシグラスのふたで覆った黒い区画の光度は８ルクスで、白い区画の光度は４００ルクスであった。それらの区画を仕切りの中央の床面に位置する開口部（７．５ｃｍ ｘ ７．５ｃｍ）でつないだ。すべての実験を前記明暗サイクルの暗期の１９：００から２１：００の間に行った。各マウスを前記白色領域の中央に置いて１０分間実験し、２つの区画を行き来する回数及び白色領域での滞在時間を記録した。装置の上方に設置したカメラによって隣室のビデオ・モニターでマウスの行動の観察が可能であった。
【００７０】
明暗箱から得られた結果によって、ＣＲＦＲ２非発現変異マウスは対照群と同じ程度に明暗箱の明領域に滞在し、明暗箱の明領域と暗領域間を行き来したことが明らかになった（図４Ｃ及び４Ｄ）。この実験で２つの群の間に有意な違いは認められなかった。
【００７１】
実施例９
ＣＲＦＲ２欠失が他の遺伝子の発現に及ぼす効果
ＨＰＡ軸の構成要素に全体として解剖学的異常は認められなかったので（図１Ｄ及び図１Ｅ）、変異体マウスのストレス及び行動応答の変化はＣＲＦシグナル経路のその他の構成要素の遺伝子発現が変化したことによるものであろう。この可能性について調べるため、ＵＮＣ、ＣＲＦ、及びＣＲＦＲ１ ｍＲＮＡの発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで調べた。
【００７２】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを前述の方法に従って行った（１５）。すなわち、組織切片（２０μｍ）を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳでリンスし、無水酢酸に浸漬し、一連の段階エタノールを介して脱水し、クロロホルムで脱脂し、そして、もう１度脱水した。その後、スライドを^３５Ｓでラベルしたリボプローブを使って５０％脱イオン化ホルムアミド・ハイブリダイゼーション混合物内で１晩５５℃の温度下で加湿培養槽内でハイブリダイズした。培養後、スライドを振盪しながら１Ｘ ＳＳＣ内で室温で３０分間洗浄し、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で３７Ｃで３０分間処理し、１Ｘ ＳＳＣ緩衝液内で室温で３０分間リンスし、振盪しながら２０分間６５Ｃで０．１Ｘ ＳＳＣ内で３回洗浄し、０．１Ｘ ＳＳＣ内で室温で３０分間リンスし、一連の段階エタノールで脱水し、空気乾燥させ、Ｋｏｄａｋ ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）に３日間並置した。
【００７３】
フィルムを現像した後、スライドをＮＴＢ２液体原子核乳剤（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ； 水と１：１に希釈）に浸漬し、１０日間露出させ、写真用に処理し、ヘマトキシリンで対比染色し、カバースリップした。スライドを画像分析システムＩｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ， Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ ＭＤ）を使って分析した。ＰＶＮ及びｃＡｍｙｇの分析のため、サークル・ツール（領域＝３０２２ピクセル）を使って各マウスに対する解剖学的図譜に一致した部分をＰＶＮ及びｃＡｍｙｇの同一領域と比較するために各部分の平均光学密度を判定した。ウロコルチンを発現するＥＷ細胞体は標準的な光学密度法を使って分析するには拡散度が高過ぎた。従って、コンピュータが非ポジティブ細胞及びバックグラウンドの銀粒を除外することを予め規定するよう、色及び細胞の大きさによって最低限の光学密度を発現する、指定されたＥＷ内の細胞数を判定するようなパラメータを用いた。その後、コンピュータによってウロコルチンｍＲＮＡに対してポジティブと判定された各細胞を光学密度を計るためにカウントした。その後、各部分について平均光学密度及び細胞数を比較した。
【００７４】
図５Ａで説明されているように、ウロコルチンｍＲＮＡはエディンガー・ウェストファール（ＥＷ）核の吻部領域で変異型マウスにおける発現細胞数（図５Ｂ）及び１細胞あたりウロコルチンｍＲＮＡ濃度（図５Ｃ）の両方について有意に増加した。扁桃（ｃＡｍｙｇ）の中心核は非発現変異マウスのＣＲＦ ｍＲＮＡ内で有意な増加を示した（図５Ａ及び５Ｄ）。ＰＶＮ内のＣＲＦ ｍＲＮＡの有意な変化はストレスを受けていない基礎マウスには見られなかった（図５Ａ及び５Ｅ）。脳または下垂体前葉でのＣＲＦＲ１ ｍＲＮＡの発現パターン及びレベルは変異型及び野生種マウスの間で違いがなかった（図示せず）。これらの結果はＣＲＦＲ２非発現変異マウスは吻部エディンガー・ウェストファール核のｃＡｍｙｇ及びウロコルチンｍＲＮＡ内のＣＲＦ ｍＲＮＡの発現レベルを増加させたことを示している。
【００７５】
実施例１０
ＣＲＦＲ２非発現変異マウスのＵＣＮに対する応答における緊張低下の評価
今までの研究報告ではウロコルチンの末梢注射に応答する緊張低下が示されている（２）。さらに、ＣＲＦＲ２は血管内皮細胞に局在し（３、７）、ウロコルチンの血管拡張作用を担っているという仮説が立てられている。この仮説を検証するため、ＣＲＦＲ２非発現変異型及び対照群マウスにウロコルチンを注射し、前記マウスの血圧変化を測定した。
【００７６】
ウロコルチン及び血管拡張薬であるニトロプルシド・ナトリウムの静脈内注射に対する心血管系応答をイソフルオリンで麻酔をかけたマウス（野生種：ｎ＝５；変異型：ｎ＝３）で調べた。血圧を記録するための動脈カテーテルは軟化させ、外径〜０．４ｍｍに引き伸ばした消毒済ＰＥ−１０チュービングから加工した。大腿動脈を露出させ、ヘパリン生理食塩水（５００Ｕ／ｍｌ）を注入した動脈カテーテルを埋め込み、外科用縫糸と組織接着剤（Ｖｅｔｂｏｎｄ）で固定した。そのカテーテルを血圧トランスデューサ（Ｓｔａｔｈａｍ）に繋ぎ、動脈圧パルスをグールド・ペンレコーダに表示させた。その後、薬剤の静脈内注射のために第２のカテーテルを外頸静脈に埋め込んだ。薬剤注入はカニューレ処置完了後に３０分間行った。静脈カテーテルを薬剤を充填した注射器に繋いだ。注入は０．５から１．０分以内に完了した。野生種及び変異型の両方に同量のウロコルチン（２００μｌの０．９％生理食塩水中に０．１μｇ）及び生理食塩水（対照群として）が投与された。
【００７７】
用いられた投与量はスプラーグ・ドーリー・ラットにおける対応する研究から得られたデータを引用した予備実験から決定した（２）。変異型マウスのウロコルチン注射に対する脳血管系応答がなかったことは血管拡張に対する前記マウスの能力喪失に起因するのではないことを検証するため、変異型マウスもウロコルチン注射からの動脈圧の回復後、第２のニトロプルシド・ナトリウム注射（１００μｌの０．９％生理食塩水中に０．８μｇ）を受けた。平均動脈圧（ＭＡＰ）は血圧の追跡から判定した。
【００７８】
ウロコルチン（０．１μｇ）の静脈内注射は対照群マウスに顕著な抑制応答（−２８．３±２．０ｍｍＨｇ）をもたらした（図６）。記録した期間（９０から１２０分）全体にわたって動脈圧の低下が持続した。全く対照的に、変異型マウスはウロコルチンに対して測定可能な応答を示さなかった（１匹の変異型マウスだけが非常に小さくて一時的な脈圧の低下（−３．５ｍｍＨｇ）を示したが、注射の圧力自体に起因すると考えられる。）（図６）。変異型マウスの末梢脈管構造は別の刺激に応答して血管拡張を可能にすることを検証するため、一酸化窒素の供与体として血管拡張を引き起こすニトロプルシド・ナトリウム（ＮＰ）を変異型マウスに投与した。ニトロプルシド・ナトリウム注射（−３０．０±５．０ｍｍＨｇ）に応答した急速かつ強力な抑制応答が一貫して観察された。
【００７９】
実施例１１
ＣＲＦＲ２欠失が不安症及びストレスに及ぼす効果の要約
ここに提示する結果はＣＲＦＲ２非発現変異マウスがストレスに敏感で不安症に似た表現型を見せることを示唆する。基礎摂食及び体重増加は正常であるものの、変異型マウスは食餌剥奪に対して食餌剥奪のストレス後の摂食量減少によって応答した。このことは新陳代謝の影響かもしれないが、食餌剥奪のストレスがマウスの不安症状態を変化させ、前記マウスの食欲を減退させる可能性がある。変異型マウスは束縛ストレスに対しても急速なＨＰＡ応答を見せ、これらのマウスがストレスに対してより敏感であることを再び示唆する。変異型マウスは対照群マウスより早く、より高いステロイド・レベルを示したので、変異型マウスの拘束１０分後のＡＣＴＨレベル減少は視床下部に対するより迅速なネガティブ・グルココルチコイド・フィードバックの結果としてもさしつかえない。まとめると、変異型マウスのＨＰＡ軸がストレスに応答する摂食応答あるいは増加率の変化のいずれかに対してその他の生理学的説明の可能性を排除することはできないものの、摂食及びＨＰＡ軸の結果はＣＲＦＲ２非発現変異マウスのストレスに対する過敏性を示唆している。
【００８０】
変異型マウスはＥＰＭ内で不安症に似た行動の増加も見せる。しかし、これらのマウスは明暗箱では同様なレベルの不安症に似た行動を示している。薬理学的過敏性及び特異性は通常多くの不安症に関する動物実験で示されているが、課題が異なっていることが時折観察される（１６、１７）。どちらの実験も無条件探索実験として分類されるが、明暗箱は探索と併せて新奇恐怖症を測定する。ＥＰＭ内での行動は嫌悪環境の探索によって判定される（１８）。実験中の光条件も動物実験で抗不安または不安生成効果を検出する能力に大きく影響する。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスに対する結果のこの側面は新奇恐怖症ではなく、嫌悪環境の探索に関係する情動性の亢進を示すものである。今までの研究報告は神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）欠失マウスは明暗箱では正常だが、ＥＰＭでは不安になるという類似の行動表現型を示している（１９）。これらＮＰＹ変異型マウスは不安症的であると分類され、ＮＰＹ注射が不安症を減らすという従来の知見を支持した。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスで得られた結果は、ＥＰＭがこれらのマウスにおいて不安症を検出するためのより感度の高い課題であり得ることを示している。
【００８１】
実施例１２
ｃＡｍｙｇ内のＣＲＦ増加が不安症に及ぼすと考えられる効果
この扁桃核はＣＲＦＲ１を発現し（７）、ストレス・シグナルの形質導入で主要な役割を果たすので（２１）、ｃＡｍｙｇ内のＣＲＦの増加によって変異型マウスの不安症に似た行動とＨＰＡ軸過敏性の増加が説明できる。さらに、ＣＲＦＲ２を多く含む扁桃の外側中隔は扁桃の働きを調節することが示され（２２−２４）、この扁桃核の障害は拘束ストレス後のＡＣＴＨ分泌の減少が生じる（２５−２８）。従って、ストレスの間外側中隔内のＣＲＦＲ２が扁桃の働きを調節し、ＣＲＦＲ２がないときは、扁桃の働きが妨げられずに速やかなＨＰＡ応答及び不安症に似た行動の増加をもたらすのであろう。
【００８２】
扁桃の障害はＣＲＦに誘発された不安症（２１）、そして中隔の障害から生じる過剰な情動性（２２）を阻害することが示されている。この神経経路はＣＲＦＲ１欠失マウスに見られる不安症に似た行動の減少、そしてＣＲＦＲ２欠失マウスでの不安症に似た行動の増加を説明することができる（８）。従って、ＣＲＦＲ２非発現変異マウスは不安症に似た行動におけるレセプタ調節の新奇なメカニズムに対する可能性のある証拠を提供している。
【００８３】
実施例１３
吻部ＥＷ内のＵＣＮ ｍＲＮＡ増加が引き起こす不安症の考えられるメカニズム
ウロコルチンを静脈内注射すると不安症に似た行動を誘発することが示されていることから、吻部ＥＷ内のウロコルチンｍＲＮＡの増加は変異型マウスの不安症に似た行動の増加につながる第２のメカニズムと考えられる（２９）。コエルレウス座（ｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ）（ＬＣ）などＣＮＳ内の多くの領域への吻部ＥＷ注入（３０）及びウロコルチン関連分子であるＣＲＦのｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓへの注射は不安症に似た応答を生じさせる（３１）。従って、吻部ＥＷでのウロコルチンｍＲＮＡ増加はｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓを活性化し、不安症に似た応答及び／又はストレスに対する過敏性を高める。
【００８４】
実施例１４
ＣＲＦＲ２非発現変異マウス及び自律神経系の敏感性
自律神経系の敏感性の亢進（３２−３４）など不安症に似た行動の増加に対する付加的な説明をまだ除外することはできない。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを使った今までの研究は不安症と行動におけるＣＲＦＲ２の役割に関して相反する結果を見いだしている（３５、３６）。
【００８５】
これらの研究報告はＣＲＦＲ１アンチセンス・オリゴヌクレオチドの注射による抗不安に似た効果を示しているが、どの研究もＣＲＦＲ２アンチセンス・オリゴヌクレオチドの注射に関する一貫した知見は報告していない。アンチセンス・オリゴヌクレオチド注射の技術は潜在的に有望であるが、ノックアウト・マウスで達成されているように、蛋白質のレベル低下をその標的の完全な除去によって置換できないことから現在精査中である。
【００８６】
実施例１５
血管拡張に対するＵＣＮの効果の確認
非発現変異マウスにＣＲＦＲ２がないことは血管拡張に対するウロコルチンの効果の確認を可能にした。変異型マウスは静脈内のウロコルチンに全く応答しなかったが、野生種マウスは平均動脈圧の劇的な減少を示した。ニトロプルシド注射は変異型マウスの血管拡張を生じさせ、従って、ウロコルチンへの応答の欠如は変異型マウスの脈管構造が物理的に拡張不能であることによるものではなく、明らかにＣＲＦＲ２の欠如によるものであることが確認された。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスはウロコルチンに全く応答を示さなかったので、これらの結果は、低血圧症に対するウロコルチンの効果（２、１４）は血管内皮細胞内のＣＲＦＲ２における作用を通じて起きる（３、７）という仮設を支持する。ＵＮＣに誘発された血管拡張が最も起こりやすい生理的刺激は今のところ知られていないが、脈管構造内のＣＲＦＲ２に対するウロコルチンの効果は高血圧治療薬の開発において興味深い標的になるであろう。
【００８７】
要約
要約すると、これらの結果はＣＲＦＲ２欠失マウスが高架式十字迷路で不安症に似た行動の増加及びストレスに応答するＨＰＡ軸の過敏性を示すことを明らかにしている。ＣＲＦＲ１及びＣＲＦＲ２非発現変異マウスは不安症及び抑鬱の貴重なモデルを提供し、これらの疾病の根底にある分子メカニズムをさらに明らかにする一助になり得る。ＣＲＦシグナル経路と、不安症及び抑鬱の制御におけるその役割の研究はこれらの疾病の効果的な治療に求められる必要な手掛かりを提供してくれる。
【００８８】
実施例１６
ＣＲＦＲ２非発現変異マウスにおける血管生成の促進
ＣＲＦＲ２非発現変異マウスは種々の組織において血管の大きさと数の増加を示すと考えられた。ＣＲＦＲ２レセプタとその働きが血管の内皮細胞層内にあると突き止められたので（３、７）、ＣＲＦＲ２が血管形成の調節に役割を果たしていると仮定された。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスがより大きな血管をより多く有したことを確認するため、対照群及びＣＲＦＲ２非発現変異マウスの組織を血管特異性マーカーである血小板−内皮細胞−接着分子（ＰＥＣＡＭ）に対する抗体で免疫染色した。
【００８９】
生後３から４カ月の対照群及びＣＲＦＲ２非発現変異マウスの両方から下垂体前葉、白色脂肪組織、及び背側脳表面の組織を得た。その組織を４％のパラホルムアルデヒド内で２日間固定した後、その組織をＤｅｎｔ’ｓ ｆｉｘ（メタノール：ＤＭＳＯ ４：１）に５％の過酸化水素を加えたのもので１晩さらした。その組織を３回にわたってそれぞれ１Ｘ ＴＢＳ内で１％Ｔｗｅｅｎ−２０を使って３０分間洗浄し、１晩５％ヤギ血清で希釈緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＰＢＳ、３．０％ ＢＳＡ、及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に１％ＤＭＳＯを加えたもので室温で遮断した。翌日、その遮断した混合物に抗ＰＥＣＡＭ抗体（Ｐｅｌ Ｆｒｅｅｚｅ）の１：１０００希釈溶液を加え、その後さらに２日間室温で培養した。その抗体を取り除いて、その組織を３回にわたってそれぞれ１時間１Ｘ ＴＢＳにＴｗｅｅｎ−２０と１％ＤＭＳＯを加えたもので洗浄した。ヤギ抗−ＲＡＴ ＨＲＰ二次抗体を１：５０００の希釈度で加え、１晩室温で培養した。その組織を上の通りに洗浄し、最後の洗浄を１Ｘ ＴＢＳのみで１時間室温で行った。ペルオキシダーゼ反応は、赤茶色を生じるまでグルコース・オキシダーゼを含んでいる（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）反応混合物の存在下で行った。その組織を一連の段階メタノールで脱水し、グリセロールで透明にした。
【００９０】
抗ＰＥＣＡＭ免疫染色の結果を図７Ａから７Ｆに示す。これらの実験によって非発現変異マウスのＣＲＦＲ２レセプタの欠如は下垂体前葉（図７Ｂ）、白色脂肪組織（図７Ｄ）、及び背側脳表面（図７Ｆ）での血管の数と大きさの増加をもたらすことが確認された。対照群マウスの同じ組織を図７Ａ−下垂体前葉、図７Ｃ−白色脂肪組織、及び図７Ｅ−背側脳表面に示す。従って、正常マウスにおけるＣＲＦＲ２レセプタの役割のひとつは血管生成のＣＲＦに誘発される阻害を仲介することである。
【００９１】
実施例１７
ＣＲＦＲ２は胎児マウスに血管生成の効果を及ぼさない
ＣＲＦＲ２レセプタが胚発育中の血管形成に関与しているかどうかを判定するため受精後１１日の胎児マウスからの組織切片で抗ＰＥＣＡＭ免疫染色実験を行った。胎児マウスから組織切片をつくり、成体マウスからの切片と同じ方法で処理した。
【００９２】
図８ＡはＣＲＦＲ２非発現変異マウス（右）及び対照群マウス（左）の頭部からの抗ＰＥＣＡＭ免疫染色切片を示し、図８ＢはＣＲＦＲ２非発現変異マウス（右）及び対照群マウス（左）の前脚からの免疫染色切片を示す。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスと対照群マウスの頭部または前脚組織切片のいずれの間にも血管の数あるいは大きさの違いは観察されなかった。従って、ＣＲＦＲ２は完全に成長したマウスについてのみ血管形成に関与していると考えられる。
【００９３】
実施例１８
成体マウスにおける血管新生のマイクロフィル・ポリマー特徴づけ
ＣＲＦＲ２非発現変異マウスの過剰な血管新生をさらに特徴づけるため、対照群及び変異型マウスの脈管組織をマイクロフィル・ポリマーで灌流し、血管体積に増加が生じたことを確認した。灌流の準備として、３０標準規格注射針を麻酔をかけた成体または生後３週のＣＲＦＲ２非発現変異マウス及び対照群マウスの左心室にセットした。灌流はシリンジ・ポンプを使って、前記目的のために潅水が右心房に開けた排出口から自由に排出されるまで行った。マウスを４℃の温度下に１晩置いて、前記ポリマーから回復させた。回復させたマウスから組織切片を取り出し、２５％エタノールから始まる一連の段階エタノールを介して第１日目に脱水した。第２日目に６％過酸化水素水でさらした後、第３日目に５０％エタノールと引き続き７５％エタノールで、第４日目に９５％エタノールで、そして第５日目に１００％エタノールで一連のエタノール処理を続けた。その組織を分析前にグリセロールで透明化した。軟組織の除去後、種々の組織の血管床の体積を観察することができた。
【００９４】
図９及び図１０は成体ＣＲＦＲ２非発現変異マウス及び対照群マウスから得たマイクロフィル灌流組織を示す。図９に、正常マウスからの組織を各パネルの左側に示し、ＣＲＦＲ２非発現変異マウスからの同様の切片を右側に示す。背側脳表面（図９Ａ）、大腸（図９Ｂ）、及び心臓（図９Ｃ）などＣＲＦＲ２非発現変異マウスのすべての組織で血管の数と大きさの増加が観察された。図１０で、腎臓（図１０Ａ及び１０Ｂ）、副腎（図１０Ｃ及び１０Ｄ）、及び睾丸（図１０Ｅ及び１０Ｆ）の主要な動脈を矢印で示す。ＣＲＦＲ２非発現変異マウス（図１０Ｂ、図１０Ｄ、及び図１０Ｆ）の主要な血管は対照群マウス（図１０Ａ、図１０Ｃ、及び図１０Ｅ）と比較して大きさが著しく増大している。これらの結果によって、抗ＰＥＣＡＭ免疫染色の結果と合わせて、ＣＲＦＲ２欠失マウスが脳、心臓、下垂体、及び消化管など観察したすべての組織で過剰血管新生の増加を示すことが確認される。血管の大きさと数の両方が増加した。
【００９５】
生後３週のマウスから得たマイクロフィル灌流組織を図１１Ａから図１１Ｄに示す。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスは小腸（図１１Ｂ対１１Ａ）及び胃（図１１Ｄ対１１Ｃ）で血管数の増加を示す。これらの結果は過剰血管新生は先ず血管の数を増加させ、マウスの加齢につれて血管の大きさが増大することを示唆している。
【００９６】
実施例１９
ＣＲＦＲ２非発現変異マウスにおけるＶＥＧＦ発現の分析
ＣＲＦＲ２が血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の発現に影響を及ぼすかどうかを判定するため、ＣＲＦＲ２非発現変異マウス及び対照群マウスからの組織をウェスタン・ブロット分析によってＶＥＧＦ含有量について調べた。白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＤＲＲ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇアプロチニン）で均質化した。４０μｇアリコートの蛋白質抽出物を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）上に分離し、ニトロセルロース膜へ移した。ブロットを５％無脂肪粉乳で１時間遮断し、１Ｘ ＴＢＳ に０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を加えたもので洗浄した。その後、ブロットを抗ＶＥＧＦ抗体の１：１０００希釈液で１時間培養し、それぞれＴＢＳＴで２０分間の洗浄を２回行い、抗ウサギＨＲＰの１：１００００希釈液で１時間培養した。各回につきＴＢＳＴで２０分間の洗浄を２回行った後、ブロットをＥＣＬ試薬で視覚化した。代表的なブロットを図１２に示す。ＶＥＧＦ発現の増加がＣＲＦＲ２非発現変異マウスで調べたすべての組織で観察され、ＣＲＦＲ２とＶＥＢＦ生成の間に相互作用がある可能性を示した。
【００９７】
実施例２０
ウロコルチン処理マウスにおける毛髪成長の促進
マウスの小さな領域の皮膚の毛を剃って、ｂＦＧＦ及びウロコルチン、種々の成長因子、及びＣＲＦ拮抗物質アストレシンを含浸したゲル・フォーム・スポンジを毛を剃った皮膚の下部に外科的に埋め込んだ。ｂＦＧＦとウロコルチンの両方を移植したマウスでは、埋め込んだスポンジのすぐ上方でわずか５日後にかなりの毛髪成長が観察された。成長ホルモンあるいはアストレシンだけを含んでいるスポンジを埋め込まれたマウスの毛を剃った領域で毛髪成長は殆ど観察されなかった。図１３にウロコルチンとｂＦＧＦの両方を埋め込まれたマウスのｂＦＧＦだけを移植したマウスと比較した毛髪成長を示す。従って、ウロコルチンとｂＦＧＦは速やかな髪の成長を刺激する。
【００９８】
本明細書において以下の参考文献を引用した：
１． Ｖａｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１３， １３９４−１３９７ （１９８１）．
２． Ｖａｕｇｈａｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ２８７−２９２ （１９９５）．
３． Ｐｅｒｒｉｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２， ２９６９−２９７３ （１９９５）．
４． Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ， Ｔ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｅｒｒａｔｕｍ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９５ Ｊｕｎ ６；９２（１２）；５７５９］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２， ８３６−８４０ （１９９５）．
５． Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｅｒｒａｔｕｍ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９５ Ａｐｒ ２５；９２（９）；４０７４］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２， １１０８−１１１２ （１９９５）．
６． Ｓｔｅｎｚｅｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ９， ６３７−６４５ （１９９５）．
７． Ｃｈａｌｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １５， ６３４０−６３５０ （１９９５）．
８． Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ ２０， １０９３−１１０２ （１９９８）．
９． Ｔｉｍｐｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９， １６２−１６６ （１９９８）．
１０． Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｅ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７， ５７４７−５７５０ （１９９６）．
１１． Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ， Ｓ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９， １５４６−１５５５ （１９９８）．
１２． Ｄｅａｋ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０， ７９−８６ （１９９９）．
１３． Ｓｐｉｎａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３， １５６１−１５６４ （１９９６）．
１４． Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １２５， １１６４−１１７１ （１９９８）．
１５． Ｂａｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６， ２７−３２．
１６． Ｈｏｇｇ， Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈａｖ ５４， ２１−３０ （１９９６）．
１７． Ｒｏｄｇｅｒｓ， Ｒ． Ｊ． Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａｎｘｉｅｔｙ’： ｗｈｅｒｅ ｎｅｘｔ？ Ｂｅｈａｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ８， ４７７−４９６； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ４９７−５０４ （１９９７）．
１８． Ｂｅｌｚｕｎｇ， Ｃ． ＆ Ｌｅ Ｐａｐｅ， Ｇ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｅｈａｖ ５６， ６２３−６２８ （１９９４）．
１９． Ｐａｌｍｉｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ Ｈｏｒｍ Ｒｅｓ ５３， １６３−１９９ （１９９８）．
２０． Ｈｅｉｌｉｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ ４１， ６１−６９ （１９９２）．
２１． Ｌｉａｎｇ， Ｋ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １２， ２３１３−２３２０ （１９９２）．
２２． Ｋｉｎｇ， Ｆ． Ａ． ＆ Ｍｅｙｅｒ， Ｐ． Ｍ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｍｙｇｄａｌｏｉｄ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｕｐｏｎ Ｓｅｐｔａｌ Ｈｙｐｅｒｅｍｏｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １２８， ６５５−６５６ （１９５８）．
２３． Ｍｅｌｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｅｈａｖ ４９， ６０３−６１１ （１９９１）．
２４． Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ６４２４−６４３３ （１９９７）．
２５． Ａｌｌｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９， １１５−１２５ （１９７５）．
２６． Ｂｅａｕｌｉｅｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ４４， ２４７−２５４ （１９８６）．
２７． Ｂｅａｕｌｉｅｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ４５， ３７−４６ （１９８７）．
２８． Ｍａｒｃｉｌｈａｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８１， １０３５−１０３８ （１９９６）．
２９． Ｍｏｒｅａｕ， ｅｔ ａｌ， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８， １６９７−１７０１ （１９９７）．
３０． Ｋ． Ｓａｋａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １１９， ２１−４１ （１９７７）．
３１． Ｐ． Ｄ． Ｂｕｔｌｅｒ， Ｊ． Ｍ． Ｗｅｉｓｓ， Ｊ． Ｃ． Ｓｔｏｕｔ， Ｃ． Ｂ． Ｎｅｍｏｒｏｆｆ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １０， １７６−８３ （１９９０）； Ｊ． Ｍ． Ｗｅｉｓｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ３５， ５６１−７２ （１９９４）．
３２． Ｕｄｅｌｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１９， １４７−１５０ （１９８６）．
３３． Ａｎｄｒｅｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８， １１９８−１２００ （１９９１）．
３４． Ａｎｄｒｅｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１， ６９−７２ （１９９２）．
３５． Ｈｅｉｎｒｉｃｈｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ ７１， １５−２１ （１９９７）．
３６． Ｌｉｅｂｓｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｒｅｓ ３３， １５３−１６３ （１９９９）．
【００９９】
本明細書で述べられたすべての特許あるいは刊行物は本発明が属する技術分野の当業者のレベルを表すものである。これらの特許及び刊行物はあたかも個々の刊行物が引用によって具体的、個別的に組み込まれるよう指示されたと同じ程度に引用によって本明細書に組み込まれる。
【０１００】
当業者であれば、本発明が前記目的を実行し、述べられたとともに本発明に内在している狙いと利点を得るためによく適合していることを直ちに認識するであろう。本実施例はここで述べられた方法、手順、処置、分子、及び特定の化合物に加えて現在のところ好ましい実施の形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして意図されていない。請求の範囲によって定義された本発明の精神の範囲内に含まれる本発明の変更及び他の利用法は当業者に自明であろう。
【図面の簡単な説明】
上に挙げられた本発明の特徴、利点、及び目的、そして今後明らかになるその他の事項が達成され、詳細に理解されるように、本発明を添付図面に説明されたいくつかの実施の形態を参照して、さらに具体的に記述される。これらの図面は本明細書の一部を成している。しかしながら、添付図面は本発明による好ましい実施の形態を説明するためのものであり、従って、それら実施の形態の範囲を限定するものと考えられてはならない。
【図１Ａ−１Ｅ】
ＣＲＦＲ２欠損マウスをつくるために使われた手順を示す図。
【図１Ａ】
膜貫通領域５の半分から膜貫通領域７の末端までをコードするエクソン１０、１１、及び１２の欠失を示すＣＲＦＲ２遺伝子のゲノム組織。相同的組み換えに使われた標的コンストラクトも示す図。
【図１Ｂ】
破壊された対立遺伝子を野生型（＋／＋）、異型接合型（＋／−）、及び非発現変異型（−／−）マウスから単離したテールＤＮＡのサザン・ブロット分析によって検出したことを示す図。
【図１Ｃ】
ＣＲＦＲ２対照群（上）及び変異型（下）マウスにおける^１２５Ｉ−ソーバジンのオートラジオグラフ結合を示す図。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスの側中隔（ｌａｔｅｒａｌ ｓｅｐｔｕｍ）にＣＲＦＲ２結合はないが、ＣＲＦＲ１の皮質性結合は対照群マウスのものと類似していることに注意。
【図１Ｄ】
副腎のヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ）を示す図。倍率１０倍での副腎の大きさ（上部）や倍率２０倍での副腎の構造（下部）に違いがないことに注意。Ｃは皮質、Ｍは髄質、ＺＧは球状帯、ＺＦは束状帯、ＺＲは網状層、ｎ＝８。
【図１Ｅ】
倍率４倍、ｎ＝８で組織断面のための肝臓上で標本にした副腎のＨ＆Ｅ染色（上パネル）を示す図。下垂体の副腎皮質刺激因子を倍率１０倍、ｎ＝５で抗ＡＣＴＨ抗体を使って識別した（２０）（下パネル）。Ｐは後葉、Ｉは中葉、Ａは前葉。副腎あるいはＡＣＴＨの副腎皮質刺激因子の局在性あるいは発現レベルに解剖学的差異は観察されなかった。
【図２Ａ−Ｄ】
変異動物のストレスに対するＨＰＡ軸の過敏性を示す図。＊＝同じ時点の野生型対照群と有意に異なり、シェフェ・ポストホック・テストによりｐ＜０．０１。非麻酔後眼窩出血（ｕｎａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｅｙｅｂｌｅｅｄ）によって得た血漿。
【図２Ａ】
７：００ＡＭのストレス前ＡＣＴＨ血漿レベルを示す図。ｎ＝１６。
【図２Ｂ】
７：００ＡＭ及び５：００ＰＭのコルチコステロン血漿の基礎レベルを示す図。ｎ＝５。
【図２Ｃ】
ＡＣＴＨに対する抑制ストレス効果の時間的経過を示す図。
【図２Ｄ】
コルチコステロン血漿レベル（７：００ＡＭ）は同じ時点での野生型対照群と有意に異っていることを示す図。ｎ＝７。
【図３Ａ−Ｂ】
野生型と変異型同腹仔マウスにおける２４時間の食餌剥奪が摂食に及ぼす効果を示す図。
【図３Ａ】
野生型同腹仔マウス（ｎ＝１０）と比較した変異マウス（ｎ＝７）の基礎的食餌消費と２４時間の食餌剥奪期間直後の食餌消費を示す図。シェフェ・ポストホック・テストによりｐ＜０．００１。
【図３Ｂ】
野生型と変異型マウスの基礎体重（白抜き棒線）及び２４時間の食餌剥奪後に再給餌して２４時間経過したときの体重（黒棒線）を示す図。実験群間で基礎体重及び再給餌後の体重に違いがないことに注意されたい。
【図４Ａ−４Ｄ】
高架式十字迷路で変異型動物の不安症に似た行動が増加することを示す図。
（対照群 ｎ＝７、変異型 ｎ＝７；平均値 ±ＳＥＭ）
【図４Ａ】
オープン・アーム内での滞在時間のパーセンテージ（＊＊、ｐ＜０．００５）及びオープン・アームを訪れた回数（＊、ｐ＜０．０２）を示す図。野生型対照群よりも変異型マウスの方がいずれも有意に少なかった。
【図４Ｂ】
クローズド・アームへの進入の合計（ｐ＝０．６４）及びアームへの進入の合計（ｐ＝０．３８）で計測された自発運動を示す図。対照群と変異型動物の間に違いがなかった。
【図４Ｃ】
明暗箱実験で箱の明るい部分での滞在時間に対して計測した不安症に似た行動に違いは見られなかった。
【図４Ｄ】
明暗箱実験で箱の明るい部分と暗い部分の間を往来する回数に対して計測した不安症に似た行動に違いは見られなかった。
【図５Ａ−５Ｅ】
変異型の脳内でウロコルチン及びＣＲＦ ｍＲＮＡのレベルが上昇したことを示す図。４Ｂから４Ｅまで、ｎ＝３、±ＳＥＭ、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００５。
【図５Ａ】
倍率２０倍での吻部ＥＷ（上）のウロコルチンｍＲＮＡ及び倍率１０倍でのｃＡｍｙｇ（中）と傍室核（下）内のＣＲＦ ｍＲＮＡに対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（２３）から生じた銀粒子を示す図。
【図５Ｂ】
銀粒子の半定量分析を用いて吻部ＥＷ内でウロコルチンｍＲＮＡを発現する細胞数を判定した結果を示す図。
【図５Ｃ】
細胞１個当たりのウロコルチンｍＲＮＡの平均光密度を示す図。
【図５Ｄ】
ｃＡｍｙｇ内のＣＲＦ ｍＲＮＡの光密度を示す図。
【図５Ｅ】
傍室核内のＣＲＦ ｍＲＮＡの光密度を示す図。
【図６】
野生型（ｎ＝５）と変異型マウス（ｎ＝３）における１．０μｇのウロコルチンの静脈内注射に対する心血管系の応答性を示す図。ウロコルチン注入に対して変異型マウスの顕著な抑制応答がないことに注目されたい。＊＊＊、ｐ＜０．００５。
【図７Ａ−７Ｆ】
抗ＰＥＣＡＭ抗体で免疫染色した成体ＣＲＦＲ２対照群（図７Ａ、７Ｃ、及び７Ｅ）及びＣＲＦＲ２非発現変異体（図７Ｂ、７Ｄ、及び７Ｆ）マウスからの組織を示す図。これらの研究によって、ＣＲＦＲ２非発現変異マウスの下垂体前葉（図７Ｂ）、白色脂肪組織（図７Ｄ）、及び背側脳表面（図７Ｆ）では対照群マウスの下垂体前葉（図７Ａ）、白色脂肪組織（図７Ｃ）、及び背側脳表面（図７Ｅ）と比較して脈管の数及び大きさが増加していることが示された。
【図８Ａ−８Ｂ】
受精後１１日目の胚体ＣＲＦＲ２非発現変異マウス及び対照群マウスから得た免疫染色された組織を示す図。図８ＡはＣＲＦＲ２非発現変異マウス（右）及び対照群マウス（左）の頭部から得た組織を示す。図８ＢはＣＲＦＲ２非発現変異マウス（右）及び対照群マウス（左）の前足部から得た組織示す。頭部あるいは前足部のいずれでも脈管の数及び大きさの違いは観察されなかった
【図９Ａ−９Ｃ】
成体ＣＲＦＲ２非発現変異マウス（右、図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃ）及び対照群マウス（左、図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃ）から得たマイクロフィル灌流組織を示す図。ＣＲＦＲ２非発現変異マウスでは背側脳表面（図９Ａ）、大腸（図９Ｂ）、及び心臓（図９Ｃ）に脈管の増加が見られる。
【図１０Ａ−１０Ｆ】
成体ＣＲＦＲ２非発現変異マウス（図１０Ｂ、１０Ｄ、及び１０Ｆ）及び対照群マウス（図１０Ａ、１０Ｃ、及び１０Ｅ）からのマイクロフィル灌流組織を示す図。矢印は腎臓（図１０Ａ及び１０Ｂ）、副腎（図１０Ｃ及び１０Ｄ）、及び睾丸（図１０Ｅ及び１０Ｆ）の主要な動脈を示す。
【図１１Ａ−１１Ｄ】
生後３週間のＣＲＦＲ２非発現変異マウス（図１１Ｂ及び１１Ｄ）及び対照群マウス（図１１Ａ及び１１Ｃ）から得たマイクロフィル灌流組織を示す図。変異マウスでは小腸（図１１Ｂ対１１Ａ）及び胃（図１１Ｄ対１１Ｃ）の血管数の増加が見られる。
【図１２】
ＣＲＦＲ２非発現変異マウスからの白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）におけるＶＥＧＦ発現の増加を明示するウェスタン・ブロットを示す図。
【図１３】
ウロコルチン及びｂＦＧＦで含浸したゲル・フォーム・スポンジの外科的移植によって直接そのスポンジ移植に覆われた部分で髪の成長が促進されたことを示す図。右のマウスはｂＦＧＦだけを含むスポンジで処置した。左のマウスにはウロコルチンとｂＦＧＦの両方で含浸したスポンジを移植した。

Claims (27)

1. 対立遺伝子からコルチコトロピン放出因子レセプタ２（ＣＲＦＲ２）蛋白質を発現しないようにコルチコトロピン放出因子レセプタ２（ＣＲＦＲ２）の少なくとも１つの対立遺伝子を破壊した非自然型遺伝子導入マウス。
2. 前記コルチコトロピン放出因子レセプタ２対立遺伝子のエクソン１０、１１、及び１２のＤＮＡ塩基配列が除去されていることを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入マウス。
3. 前記ＤＮＡ塩基配列がネオマイシン耐性遺伝子カセットで置換されていることを特徴とする請求項２記載の遺伝子導入マウス。
4. 前記マウスが前記置換に対して異型接合的であることを特徴とする請求項３記載の遺伝子導入マウス。
5. 前記マウスが前記置換に対して同型接合的であることを特徴とする請求項３記載の遺伝子導入マウス。
6. 請求項３記載のマウスと、別の系統のマウスの間の交配による子孫。
7. 不安緩和活性を有する化合物をスクリーニングする方法において、
   ａ）前記化合物を請求項５記載の遺伝子導入マウスに投与するステップ、
   ｂ）上記マウスを不安症に関係する行動についてテストするステップ、及び
   ｃ）上記マウスの不安症に似た行動を上記化合物が投与されない請求項５記載の第２の遺伝子導入マウスの不安症に似た行動と比較するステップ
   で構成される方法。
8. 前記マウスが高架式十字迷路で不安症がテストされることを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 鬱緩和活性を有する化合物をスクリーニングする方法において、
   ａ）前記化合物を請求項５記載の遺伝子導入マウスに投与するステップ、
   ｂ）上記マウスを抑鬱に似た行動についてテストするステップ、及び
   ｃ）上記マウスの抑鬱に似た行動を上記化合物が投与されない請求項５記載の第２の遺伝子導入マウスの抑鬱に似た行動と比較するステップ
   で構成される方法。
10. 血圧を制御する化合物をスクリーニングする方法において、
    ａ）請求項５記載の遺伝子導入マウスに化合物を投与するステップ、
    ｂ）前記遺伝子導入マウスの血圧変化をテストするステップ、及び
    ｃ）前記遺伝子導入マウスの血圧変化を第２のマウスの血圧変化と比較するステップで構成され、前記第２のマウスが前記化合物が投与されなかった請求項５記載の遺伝子導入マウスと前記化合物も投与された野生種マウスとで構成される群から選択されることを特徴とする方法。
11. 血管形成に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法において、
    ａ）請求項５記載の遺伝子導入マウスに化合物を投与するステップ、
    ｂ）前記遺伝子導入マウスの血管形成における変化を評価するステップ、及び
    ｃ）前記遺伝子導入マウスの血管形成における変化を、前記化合物を投与しなかった請求項５記載の遺伝子導入マウスと、前記化合物を投与した野生種マウスで構成される群から選択されるマウスにおける血管形成変化と比較するステップで構成される方法。
12. 視床下部−下垂体−副腎軸のストレスへの応答に効果を持つ化合物をスクリーニングする方法において、
    ａ）請求項５記載の遺伝子導入マウスに化合物を投与するステップ、
    ｂ）前記マウスをストレス誘発状況に置くステップ、
    ｃ）前記マウスにおけるコルチコステロンと副腎皮質刺激ホルモンの血漿レベルをモニタリングするステップ、及び
    ｄ）前記レベルを前記ストレス誘発状況に配置されない請求項５の遺伝子導入マウスにおけるそれと比較するステップ
    で構成される方法。
13. 前記ストレス誘発状況が物理的拘束ストレスであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. 第２の蛋白質に対するＣＲＦＲ２の影響を判定する方法において、
    ａ）上記第２の蛋白質に影響を及ぼす作用物質（ａｇｏｎｉｓｔ）を請求項５記載の遺伝子導入マウスに投与するステップ、
    ｂ）上記第２の蛋白質の評価を行い、上記評価が蛋白質発現の評価と蛋白質活性の評価で構成される群から選択されることを特徴とするステップ、及び
    ｃ）前記遺伝子導入マウスに対する評価結果を上記作用物質を投与した野生種マウスから得られた結果と比較するステップ
    で構成されるステップ。
15. 前記第２の蛋白質がコルチコトロピン放出因子、コルチコトロピン放出因子レセプタ１、ウロコルチン、コルチコトロピン・レセプタ及びウロコルチン・レセプタで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. 標的組織内での血管形成を増進する方法において、前記標的組織にＣＲＦＲ２拮抗物質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）を投与するステップを含む方法。
17. 前記ＣＲＦＲ２拮抗物質がＣＲＦＲ２に対して向けられたアンチセンス・ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
18. 前記標的組織が心臓、脳、下垂体、生殖腺、腎臓、脂肪、及び胃腸系組織で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
19. 前記血管形成が梗塞、発作、及び傷害で構成される群から選択される病理状態を有する個人において増進されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
20. 標的組織内での血管形成を抑制する方法において、前記標的組織にＣＲＦＲ２作用物質を投与するステップを含んでいることを特徴とする方法。
21. 前記ＣＲＦＲ２作用物質がウロコルチンとＣＲＦで構成される群から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
22. 前記組織が心臓、脳、下垂体、生殖腺、腎臓、脂肪、及び胃腸系組織で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
23. 前記血管形成が癌及び糖尿病性網膜症で構成される群から選択される病理状態を有する個人において抑制されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
24. 毛髪成長が望ましい皮膚領域にウロコルチンを接触させるステップを含む毛髪成長を促進する方法。
25. 前記ウロコルチンが上記皮膚下に埋め込まれることを特徴とする請求項２４記載の方法。
26. ｂＦＧＦがウロコルチンの前、ウロコルチンの後、あるいはウロコルチンと同時に前記皮膚に投与されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
27. ウロコルチンがｂＦＧＦと共に組成物内に含まれることを特徴とする請求項２４記載の方法。

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