JP2004534054A - Ｍｉｆアンタゴニスト活性を有するイソオキサゾリン化合物 - Google Patents

Abstract

ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）の阻止因子として働く、場合により置換されたイソオキサゾリン環系を含む低分子量化合物の族についての使用方法および医薬組成物を開示する。特に、前記化合物は、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、対宿主性移植片病、狼瘡症候群）、喘息、関節炎、ＡＲＤＳ、乾癬、インターロイキン−２毒性、増殖性血管病、および様々な形態の敗血症および敗血症性ショックなどの炎症作用またはプロ炎症性サイトカイン応答を含む多様な疾患、および、例えば腫瘍増殖および新生血管形成（血管新生）を含む、基礎となるＭＩＦ応答を特徴とする他の状態を治療するために有用である。

Description

【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年６月８日に出願された米国特許仮出願通し番号第６０／２９６，４７８号による優先権を主張するものである。この仮出願の全体が、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、場合により置換されたイソオキサゾリン化合物の属および関連する使用方法および医薬組成物を提供する。該化合物は、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）アンタゴニスト活性を有する。特に、該ＭＩＦアンタゴニストは、自己免疫疾患、喘息、関節炎、多発性硬化症、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）ならびに様々な形態の敗血症および敗血症性ショックなどの炎症作用またはプロ炎症性サイトカイン応答を含む多様な疾患、および、例えば腫瘍増殖および新生血管形成を含む、基礎となるＭＩＦ応答を特徴とする他の状態を治療するための方法において有用である。
【０００３】
発明の背景
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、最も早期に記述されたサイトカインの一つであり、極めて多様な細胞および生物活性を有する免疫調節タンパク質である（総説については：Swope ら、Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 139, 1〜32(1999)；Metz ら、Adv. Immunol. 66, 197〜223(1997)；およびBucala, FASEB J. 14, 1607〜1613(1996)参照）。最初に、ＭＩＦは、活性化リンパ系細胞によって分泌され、マクロファージのランダムな移動を阻止し、遅延型過敏症反応に結びつくことが、見出された（George ら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 111, 514〜521(1962)；Weiser ら、J. Immunol. 126, 1958〜1962(1981)；Bloom ら、Science, 153:80〜82(1966)；David, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 56, 72〜77(1966)）。ＭＩＦは、また、マクロファージの接着、食作用および殺腫瘍作用を増強することが示された（Nathan ら、J. Exp. Med., 137, 275〜288(1973)；Nathan ら、J. Exp. Med., 133, 1356〜1376(1971)；Churchill ら、J. Immunol., 115, 781〜785(1975)）。残念ながら、初期のＭＩＦ試験の多くは混合培養上清を使用しており、それらは、後に、同じくマクロファージ移動阻止活性を有するＩＦＮ−γおよびＩＬ−４などの他のサイトカインを含有することが示された（McInnes ら、J. Exp. Med., 167, 598〜611(1988)；Thurman ら、J. Immunol., 134,305〜309(1985)）。組換えＭＩＦが使用できるようになったことは、これらの生物活性の確認と付加的な活性の特定を可能にした。
【０００４】
組換えヒトＭＩＦは、最初、ヒトＴ細胞ライブラリーからクローニングされ（Weiser ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7522〜7526(1989)）、インビトロで細胞内寄生生物および腫瘍細胞を死滅させる血液由来のマクロファージを活性化すること、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαの発現を刺激すること、および一酸化窒素の合成を誘導することが示された（Weiser ら、J. Immunol., 147, 2006〜2011(1991)；Pozzi ら、Cellular Immunol., 145, 372〜379(1992)；Weiser ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8049〜8052(1992)；Cunha ら、J. Immunol., 150, 1908〜1912(1993)）。これら初期の報告のいくつかから導かれる結論は、使用された組換えＭＩＦ製剤中の生物活性マイトジェン夾雑物の存在によって混乱しているが、この厄介な因子に関わっていない他の試験では、ＭＩＦの強力なプロ炎症作用が確認された（Bucala, The FASEB, Journal 10, 1607〜1613(1996)において総説されている）。
【０００５】
より最近のＭＩＦ試験は、精製形態の組換えＭＩＦの生産ならびにＭＩＦ特異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の開発に基づき、様々な正常ホメオスタシスおよび病態生理学的状況におけるＭＩＦの生物学的役割を確立した（Rice ら、Annual Reports in Medicinal Chemistry, 33, 243〜252(1998)において総説されている）。これら後期報告の最も重要な洞察の中に、ＭＩＦが免疫系のサイトカイン産物であるのみならず、内分泌系、特に下垂体のホルモン様生成物でもあるという認識があった。この研究は、糖質コルチコイド（内因的に放出されるものと治療的に投与されるものの両方）の抗炎症作用の対立調節因子としてのＭＩＦの強力な活性を過小評価しており、実際に、炎症応答の重症度を制限し、抑制するという糖質コルチコイドの正常な活動が、ＭＩＦによって阻止される。内因性ＭＩＦ応答は、それ故、様々な炎症性疾患および状態の原因または増悪因子とみなされている（Donnelly ら、Molecular Medicine Today, 3, 502〜507(1997)において総説されている）。
【０００６】
ＭＩＦは、現在、その周知の遅延型過敏症反応との結びつく以外にいくつかの生物学的機能を持つことが知られている。例えば、上述したように、マクロファージおよびＴ細胞によって放出されるＭＩＦは、生理的濃度の糖質コルチコイドに応答する下垂体メディエイターとして働く（Bucala, FASEB J., 14, 1607〜1613(1996)）。これは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−６およびＩＬ−８レベルの変化を通して糖質コルチコイドの免疫抑制作用を無効にする作用を導く。ＭＩＦの付加的な生物活性は、刺激されたＴ細胞の調節（Bacher ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7849〜7854(1996)）、ＩｇＥ合成の制御（Mikayama ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10056〜10060(1993)）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の機能的不活性（Hudson ら、J. Exp. Med., 190, 1375〜1382(1999)）、グルコースおよび炭水化物代謝の調節（Sakaue ら、Mol. Med., 5, 361〜371(1999)）、ならびに腫瘍細胞増殖および腫瘍血管新生の減衰（Chesney ら、Mol. Med., 5, 181〜191(1999)；Shimizu ら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, 751〜758(1999)）を含む。
【０００７】
ＭＩＦは、Ｄ−ドパクロム互変異性化酵素と有意の配列相同性（３６％同一性）を共有する。このことが、ＭＩＦは酵素活性を有しており、非生理的基質、Ｄ−ドパクロム（Rosengren ら、Mol. Med., 2, 143〜149(1996)）およびＬ−ドパクロムメチルエステル（Bendratら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）の互変異性を触媒するという発見を導いた。さらに、フェニルピルビン酸およびｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（Rosengren ら、FEBS Letter, 417, 85〜88(1997)）、ならびに３，４−ジヒドロキシフェニルアミンクロムおよびノルエピネフリンクロム（Matsunaga ら、J. Biol. Chem., 274, 3268〜3271(1999)）は、ＭＩＦ基質であるが、これらの物質のいずれかの互変異性が、ＭＩＦについての自然の機能を含むかどうかは不明である。
【０００８】
ヒトＭＩＦの三次元結晶構造は、該タンパク質がホモトリマーとして存在し（Lolis ら、Proc. Ass. Am. Phys., 108, 415〜419(1996)）、構造的に４−オキサロクロトネート互変異性化酵素、５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコネート、コリスメートムターゼ、およびＤ−ドパクロム互変異性化酵素に関連することを明らかにする（Swope ら、EMBO J., 17, 3534〜3541(1998)；Sugimoto ら、Biochemistry, 38, 3268〜3279(1999)）。最近、ヒトＭＩＦおよびｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸の間で形成される複合体に関して、その結晶構造が報告された（Lubetsky ら、Biochemistry, 38, 7346〜7354(1999)）。この基質は、アミノ末端の疎水腔に結合し、サブユニットの１つにおいてＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２およびＩｌｅ−６４と、また隣接サブユニットにおいてＴｙｒ−９５およびＡｓｎ−９７と相互作用することが認められた（Taylor ら、Biochemistry, 38, 7444〜7452(1999)）。ＮＭＲを用いた溶液試験は、アミノ末端疎水腔におけるｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸およびＰｒｏ−１の間の相互作用のさらなる証拠を提供する（Swope ら、EMBO J., 17, 3534〜3541(1998)）。
【０００９】
突然変異試験は、Ｐｒｏ−１がＭＩＦの触媒機能に関与することを確信させる証拠を提供する。Ｐｒｏ−１の欠失もしくはＳｅｒ（Bendratら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）、Ｇｌｙ（Swope ら、EMBO J., 17, 3534〜3541(1998)）またはＰｈｅ（Hermanowski-Vosatka ら、Biochemistry, 38, 12841〜12849(1999)）によるＰｒｏ−１の置換、およびＰｒｏ−１へのＮ末端ペプチドタグの付加（Bendratら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）は、Ｌ−ドパクロムメチルエステルおよびｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を使用したアッセイにおいてＭＩＦの触媒作用を無効にした。Ｐｒｏ−１およびＭｅｔ−２の間にＡｌａを挿入することによって同様の活性損失が認められた（Lubetsky ら、Biochemistry, 38, 7346〜7354(1999)）。酵素活性および生物活性の間の関係は、しかしながら、はっきしないままである。ＰｒｏからＳｅｒへのＭＩＦ突然変異体は、糖質コルチコイド対立調節作用を示し（Bendratら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）、ＰｒｏからＰｈｅへの突然変異体と同様に、単球走化性を完全に阻止することができた（Hermanowski-Vosatka ら、Biochemistry, 38, 12841〜12849(1999)）。これに対し，ＰｒｏからＧｌｙへのＭＩＦ突然変異体は、活性化好中球においてスーパーオキシド産生を刺激するその能力が大きく損なわれた（Swope ら、EMBO J., 17, 3534〜3541(1998)）。これらの結果は、酵素的に不活性なＭＩＦ突然変異体の生物活性が、突然変異の性質だけでなく、生物学的機能を評価するために使用するアッセイにも依存すると考えられることを示唆する。
【００１０】
ＭＩＦ阻止因子（例えばアンタゴニスト）として機能し、更に、より大きな高分子タンパク質（例えば抗体）および核酸ベースの（例えばアンチセンス）治療薬に比べて有機低分子治療薬の有益性を備えた有機低分子を発見し、開発することが、当技術分野において求められている。内毒素および外毒素誘発の中毒性ショック（Bernhagen ら、Nature, 365, 756〜759(1993)；Kobayashi ら、Hepatology, 29, 1752〜1759(1999)；Calandra ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 11383〜11388(1998)；およびMakita ら、Am. J. Respir. Crit. Care Med.158, 573〜579(1998)）、Ｔ細胞活性化（Bacher ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7849〜7854(1996)）、慢性関節リウマチを含む自己免疫疾患（例えば対宿主性移植片病、インスリン依存性糖尿病および様々な形態の狼瘡）（Ｋ itaichi ら、Curr. Eye Res., 20, 109〜114(2000)；Leech ら、Arthritis Rheum., 42, 1601〜1608(1999)）、創傷治癒（Abe ら、Biochim. Biophys. Acta, 1500, 1〜9(2000)）、および血管新生（Shimizum ら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, 751〜758(1999)）のモデルにおける抗ＭＩＦ抗体の作用を考慮すると、低分子量ＭＩＦ阻止因子の治療上の潜在的可能性は、多大である。そのような活性を示す低分子量抗ＭＩＦ薬は、それらが、経口活性であるかまたは一般により容易に投与され、より良好なバイオアベイラビリティーを有し、改善された生体分布を備えると考えられ、はるかにより安価に生産されるはずであるので、中和抗体および核酸ベースの薬剤に比べて臨床的有益性を提供するであろう。本発明に先立って、強力な低分子量ＭＩＦ阻止因子についての唯一の公表報告は、マウスＭＩＦのドパクロム互変異性化酵素活性を可逆的に阻止する、いくつかの一般的に認められる長鎖脂肪酸に関するものであった（Bendratら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）。これらの脂肪酸は、ＭＩＦ活性の生物学的アッセイにおけるそれらの作用に関しては試験されなかった。
【００１１】
Markofskyへの米国特許第４，９３３，４６４号は、３−フェニルイソオキサゾリンおよび３−フェニルイソオキサゾールおよび関連生成物を形成するための工程を開示している。
【００１２】
Cohan らへの米国特許第６，１１４，３６７号は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の阻止剤であるイソオキサゾリン化合物を開示している。それらのイソオキサゾリン化合物は、その必要のある哺乳類においてＴＮＦを阻止するため、および炎症性状態または疾患の治療または緩和において有用であると述べられている。そのような化合物を含む医薬組成物も開示されている。
【００１３】
Curuzu ら、Collect. Czech. Chem. Commun., 56:2494〜2499(1991)は、３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸および３−（４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸を含む、３−置換フェニル−４，５−ジヒドロイソオキサゾレン酢酸を開示しており、これら２つの化合物のうち最初のものは、抗炎症作用を持たず、２番目の化合物は、ラットの足におけるカラゲニン誘発水腫アッセイにおいて、フェニル環のパラ位置で置換されていない親化合物に比べてそのような活性が劇的に低下していることを示している。
【００１４】
Wityak ら、J. Med. Chem., 40:50〜60(1997)は、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体のイソオキサゾリンアンタゴニストを開示している。
【００１５】
Eichenger ら、Synth. Commun. 27(16):2733〜2742(1997)は、［３−（４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸を開示している。
【００１６】
Eichinger ら、Synth. Commun. 28(13):2457〜2466(1998)は、［３−（４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸およびそのメチルエステルを開示している。
【００１７】
Kleinman ら、「ホスホジエステラーゼ４型（ＰＤＥ４）へのヒドロキサム酸置換の著明な影響および２つのシリーズのロリプラム類似体のＴＮＦα阻止活性：ＰＤＥ４の新しい活性部位モデルの意味」J. Med. Chem. 41(3):266〜270(1998)は、中でも特に、次の化合物を開示している：［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸およびそのメチルエステル、ならびに［３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−Ｎ−ヒドロキシアセトアミド。
【００１８】
その全体が、参照として本明細書に組み入れられる、２０００年７月２６日出願の米国特許出願通し番号第０９／６２５，８２９号は、ＭＩＦ阻止因子活性を有するキノン関連化合物を開示している。その全体が、参照として本明細書に組み入れられる、２０００年１０月２７日出願の米国特許出願通し番号第０９／６９９，２５８号は、ＭＩＦ阻止因子活性を有するアミノ酸／ベンズアルデヒドシッフ塩基化合物を開示している。
【００１９】
発明の要旨
ＭＩＦの酵素活性（互変異性化酵素）およびそれを受容する基質は、ＭＩＦに結合してその生物活性を分断する低分子量薬剤を設計するための酵素活性アッセイを提供する。本発明は、イソオキサゾリン構造を有するそのような化合物属についての使用方法を提供する。
【００２０】
本発明は、式Ｉの化合物の有効量を投与することを含み、式Ｉが、
【００２１】
【化４】

【００２２】
［式中、
Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_{1 〜 6}アルキルであり；
Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
Ａは、置換または非置換芳香環であり；
Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
ｎは、０または１である］
である、関節炎、増殖性血管病、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカインが介在する毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦが介在する状態、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、対宿主性移植片病、および狼瘡症候群を含むが、これらに限定されない）、腫瘍増殖または血管新生、もしくは局所または全身性ＭＩＦ放出または合成を特徴とする何らかの状態を含むが、これらに限定されない、炎症性疾患を治療するための方法を提供する。
好ましくは、該化合物は、上記式中、Ｒ、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの各々が、Ｈまたは−ＣＨ₂−Ａであり、そしてＺが、ＯＲである、ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にｐ−ヒドロキシフェノルイソオキサゾリンメチルエステルとしても知られるそのメチルエステル酸（ここでは「ＩＳＯ−１」と特定する）である。更に一層好ましくは、該化合物は、（２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（「ＩＳＯ−２」と特定する）である。
【００２３】
本発明は、更に、イソオキサゾリン部分を有する化合物、または薬学的に許容され得るその塩、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供し、前記組成物が、式Ｉの化合物の有効量を含み、式Ｉが、：
【００２４】
【化５】

【００２５】
［式中：
Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであり；
Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
Ａは、置換または非置換芳香環であり；
Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
ｎは０または１であり、
ただし、下記のいずれかまたは全部を条件とする：
（ｉ）Ｚ＝ＯＣＨ₃であるとき、Ｒ、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの少なくとも１つが、Ｈではない；
（ｉｉ）Ｒ₁＝Ｒ₂＝ｔｅｒｔ−ブチルであり、各々が、ＯＲに対してオルトであるとき、Ｒ、Ｒ₃、Ｒ₄、ＸおよびＹの少なくとも１つが、ＨではないかまたはＺが、ＯＣＨ₃ではない；
（ｉｉｉ）Ｚ＝ＯＨおよびＲ＝Ｈまたはメチルであるとき、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの少なくとも１つが、Ｈではない（すなわち、該化合物は［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸または［３−（４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸ではない）；および
（ｉｖ）Ｚ＝ＯＣＨ₃およびＲ＝メチルであるとき、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの少なくとも１つが、Ｈではない（すなわち、該化合物は［３−（４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸メチルエステルではない）］
である、医薬組成物を提供する。
【００２６】
本発明はまた、イソオキサゾリン部分を有する化合物および薬学的に許容され得る担体を含み、前記化合物が、ＭＩＦタンパク質の少なくとも１個のアミノ酸残基と安定な相互作用を形成する、医薬組成物を提供する。好ましくは、前記相互作用は、ＭＩＦタンパク質の互変異性化酵素作用の活性部位でまたは活性部位の近くで起こる。好ましくは、該化合物は、ヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−１）である。更に一層好ましくは、該化合物は、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−２）である。
【００２７】
本発明は、ＭＩＦタンパク質と安定な相互作用を形成する、イソオキサゾリン部分を有する化合物の有効量を投与することを含む、炎症性疾患（関節炎、増殖性血管病を含むが、これらに限定されない）、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカインが介在する毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦが介在する状態、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、対宿主性移植片病、および狼瘡症候群を含むが、これらに限定されない）、腫瘍増殖もしくは血管新生、または局所もしくは全身性ＭＩＦ放出もしくは合成を特徴とする何らかの状態を治療するための方法を提供する。好ましくは、該化合物は、イソオキサゾリン含有化合物またはヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−１）である。更に一層好ましくは、該化合物は、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−２）である。
【００２８】
ステロイド（抗炎症性糖質コルチコイドなど）の抗炎症作用を妨げるＭＩＦの作用に従って、式Ｉの化合物は、内因的に生じるものおよび外因的に投与されるものの両方のステロイド系抗炎症性物質の活性および治療的恩恵を高めるというさらなる有用性を見出す。そのような恩恵は、一部の場合には、ステロイド療法の必要性が低減すること（例えば、より低い用量または頻度；効力の低い薬剤；全身投与の必要性の低減）によって、またはステロイド投与に結びつく副作用の低減によって最も明らかになるであろう。ＭＩＦ阻止因子（特に式Ｉの化合物）を投与することの恩恵は、本発明のＭＩＦ阻止因子だけを使用する単独療法として、または、特に、限定を伴わずに、抗炎症性ステロイドを含む付加的な抗炎症薬との併用療法として、実現されうる。そのような併用療法は、単一製剤またはＭＩＦ阻止因子（特に式Ｉの阻止因子）を少なくとも１つの他の抗炎症薬（ステロイド系または非ステロイド系抗炎症薬でありうる）と組み合わせた医薬組成物の投与を通して、または別々の製剤または医薬組成物を互いに同時に投与することを通して、またはその両方を通して、達成されうる。
【００２９】
発明の詳細な説明
先に記述されている（米国特許出願通し番号第０９／６９９，２５８号、前記参照）アミノ酸シッフ塩基型化合物との構造的類似性に基づき、本発明者らは、潜在的ＭＩＦアンタゴニストについての活性基として付加的なフェニルイミン骨格を探索した。いくつかの代表的なフェニルイミン化合物を合成し、ＭＩＦのドパクロム互変異性化酵素活性の阻止因子として試験して、イソオキサゾリンが、さらなる注目に値する魅力的な骨格であると結論付けた。したがって、本発明者らによるフェニルピルビン酸：ＭＩＦの共結晶化およびアミノ酸／ベンズアルデヒドシッフ塩基型化合物に関するＳＡＲ結果の以前の分析（米国特許出願通し番号第０９／６９９，２５８号）（例えば会合遠位エステル官能基とのイミン結合を担うｐ−ヒドロキシル化フェニル骨格）に基づき、（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾール−酢酸メチルエステルは、ＭＩＦ互変異性化酵素活性部位への結合のために重要であると思われるある種の構造要素である。
【００３０】
したがって、本発明は、先に開示されているキノン関連阻止因子（米国特許出願通し番号第０９／６９９，２５８号）と異なり、内因性および外因性ＭＩＦの両方を中和するに適すると考えられる、イソオキサゾリンに関連した潜在的ＭＩＦ阻止因子の新しいクラスを提供する。特に、イソオキサゾリンは、ＭＩＦ互変異性化酵素および免疫調節作用の両方を５．０マイクロモルのＩＣ₅₀で阻止するラセミ混合物であることが見出された。ＭＩＦおよびイソオキサゾリン４の共結晶の分析は、Ｓ−鏡像異性体だけの結合を明らかにした。
【００３１】
本発明は、それ故、ＭＩＦ阻止因子化合物の族を提供する。この族の化合物は、インビトロでＭＩＦ酵素活性を阻止するので、ＭＩＦ阻止因子として特定される。ＭＩＦは、ドパクロム関連ＭＩＦ基質の無色生成物への互変異性化を触媒する。特に異なる指示が為されていない限り、本明細書における阻止濃度への言及（例えばＩＣ₅₀または他の活性指数）は、ＭＩＦ互変異性化酵素アッセイ（下記で更に詳述するような、およびBendrat ら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）における被験化合物の阻止活性を指す。
【００３２】
ＭＩＦ互変異性化酵素アッセイ
ＭＩＦは、互変異性化（すなわちケト−エノール異性化）反応を触媒する（Rosengren ら、Molecular Medicine,2,143〜149(1996)）。同定された最も活性な基質は、ドパクロムの非生理的Ｄ−異性体である。この反応は治療的ＭＩＦ阻止因子を予測する（その全体が、参照として本明細書に組み入れられる、１９９６年２月１６日に出願された審理中の米国特許出願通し番号第０８／６０２，９２９号および２０００年１０月２７日に出願された米国特許出願通し番号第０９／６９９，２５８号参照）。ＭＩＦ互変異性化酵素活性の阻止は、ＭＩＦ生物活性の阻止の予測となる。
【００３３】
ＭＩＦドパクロム互変異性化酵素活性についてのアッセイを実施する方法は、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルなどのＤＯＰＡ関連基質前駆体の調製および酸化から始まる。過ヨウ素酸ナトリウムによるこの酸化は、橙色で、互変異性化酵素としてのＭＩＦの酵素活性に関する光度測定法において使用するのに好都合な基質を含む、対応するドパクロム誘導体（例えばＬ−３，５−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−５−オキソ−２Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチルエステル（「ドパクロムメチルエステル」）を生成する。ＭＩＦ（典型的には最終濃度５０〜１０００ng／mlの組換えＭＩＦの精製製剤）の添加は、着色ドパクロム基質を無色の５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸メチルエステル生成物へと速やかに互変異性化させる。ＭＩＦの酵素活性は、典型的には最終アッセイ成分の添加および混合から２０秒後の時点で、適切な緩衝液中のドパクロム関連基質の着色溶液の脱色速度として測定される。約４７５nm（または０．５nMを超える基質濃度については５５０nm）で吸光度を測定する。ＭＩＦ互変異性化酵素活性への被験化合物の作用（すなわち阻止因子としての）を、被験阻止因子化合物の不在下で実施する対照アッセイと比較して基質互変異性化の動態の変化に注目することによって測定しうるように、被験化合物をアッセイ溶液に含めてもよい。特に、ＭＩＦ互変異性化酵素アッセイは、本質的に次のように実施しうる：
【００３４】
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステル（例えばSigma D-1507）は、ドパクロム基質前駆物質であり、これをｄｄＨ₂Ｏ中４mM溶液として調製する。過ヨウ素酸ナトリウムをｄｄＨ₂Ｏ中８mM溶液として調製する。アッセイ緩衝液（リン酸カリウム５０mM／ＥＤＴＡ １mM、pH６．０）を調製する。精製組換えＭＩＦをＮａＣｌ １５０mM／トリス緩衝液２０mM（pH７．４）中で、約７００ng／mlの最終濃度のＭＩＦを供給するために好都合な保存溶液として調製する。アッセイを開始する直前に、ドパクロム基質前駆物質溶液３．６ml、過ヨウ素酸溶液２．４mlおよびアッセイ緩衝液４．０mlを混合して均質な混合物にする（このドパクロム基質の製剤は、１分後から、その後約３０分間、アッセイでの使用に適する）。次に被験化合物（典型的にはＤＭＳＯ中の濃縮原液として調製する）およびＭＩＦをアッセイ緩衝液０．７ml＋ドパクロム基質溶液０．３mlと混合して、均質な混合物中の所望最終濃度の被験化合物を提供し、このアッセイ混合物の光学密度（吸光度）を４７５nmで監視する。典型的には、ＯＤ₄₇₅を５秒ごとに０〜６０秒間記録し、所与の時点でのＯＤ₄₇₅を、ＭＩＦを加えていないかまたは被験化合物を除いた並行アッセイと比較する。被験化合物によるＭＩＦ互変異性化酵素活性の阻止を、多くの場合２０秒目の時点で、アッセイ混合物の脱色の阻止によって判定する。ＭＩＦ互変異性化酵素活性を５０％阻止する阻止因子の濃度に相当する、ＭＩＦ互変異性化酵素阻止作用を有する化合物についてのＩＣ₅₀値を、いくつかの異なる阻止因子濃度でのＭＩＦ互変異性化酵素アッセイからの結果の補間によって決定する。これらのＩＣ₅₀値は、被験化合物のＭＩＦ酵素阻止活性およびＭＩＦの生物活性の阻止との間の妥当な相関を提供する（下記参照）。
【００３５】
治療の方法および医薬組成物
実施例１で使用したＭＩＦ互変異性化酵素アッセイは、ある種のイソオキサゾリン含有化合物がＭＩＦ酵素活性を阻止することを示す。実施例２は、ある種のイソオキサゾリンベースの化合物が、ＭＩＦ酵素活性（すなわち互変異性化酵素）を特異的に阻止するだけでなく、ＭＩＦ生物活性のアッセイにおいて測定したときＭＩＦの免疫調節作用も阻止することを示している。最後に、実施例３は、ＭＩＦ：イソオキサゾリン複合体の共結晶構造を示し、ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリンのＳ−異性体の３つの分子だけが、ＭＩＦ三量体内の３つの活性部位に化学量論的に結合することを明らかにしている。これらのＸ線データは、次の世代のＭＩＦ活性阻止因子を予測する上で貴重な情報を表す。
【００３６】
これらのデータは、ＭＩＦの互変異性化酵素活性および生物学的アッセイにおけるＭＩＦ拮抗作用の間の妥当な相関を提供する。集合的に、これらのデータは、ＭＩＦ互変異性化酵素アッセイにおける化合物による阻止は、ＭＩＦ生物活性を阻止する上でのその潜在的治療用途の予測となることを示している。
【００３７】
したがって、本発明は、ヒトＭＩＦを、ヒトＭＩＦの少なくとも１個のアミノ酸残基と安定な相互作用を形成するイソオキサゾリン部分を有する化合物または化合物の組合せと接触させることを含む、ヒトＭＩＦの酵素および生物活性を不活性化するための方法を提供する。好ましくは、前記相互作用は、ＭＩＦタンパク質の互変異性化酵素作用の活性部位においてまたは活性部位の近くで起こる。好ましくは、安定な相互作用は、イソオキサゾリン含有化合物のイソオキサゾリン部分および、ヒトＭＩＦのＮ末端プロリン残基の間で形成される。好ましくは、該化合物は式Ｉのイソオキサゾリン含有化合物であり、式Ｉは：
【００３８】
【化６】

【００３９】
［式中、
Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_{1 〜 6}アルキルであり；
Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
Ａは、置換または非置換芳香環であり（例えばＲ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨから選択される１つまたはそれ以上の基で置換された）；
Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
ｎは０または１である］
である。好ましくは、該化合物は、上記式中、Ｒ、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの各々が、Ｈまたは−ＣＨ₂−Ａであり、そしてＺが、ＯＲである、ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−１）である。更に一層好ましくは、該化合物は、（２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−２）である。
【００４０】
本発明は、また、式Ｉの化合物の有効量を投与することを含み、式Ｉが、
【００４１】
【化７】

【００４２】
［式中、
Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_{1 〜 6}アルキルであり；
Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
Ａは、置換または非置換芳香環であり；
Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
ｎは０または１である］
である、関節炎、増殖性血管病、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカインが介在する毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦが介在する状態、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、対宿主性移植片病、および狼瘡症候群を含むが、これらに限定されない）、腫瘍増殖もしくは血管新生、または局所もしくは全身性ＭＩＦ放出もしくは合成を特徴とする何らかの状態を含むが、これらに限定されない、炎症性疾患を治療するための方法を提供する。
【００４３】
好ましくは、該化合物は、上記式中、Ｒ、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの各々が、Ｈまたは−ＣＨ₂−Ａであり、そしてＺが、ＯＲである、ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−１）である。更に一層好ましくは、該化合物は、（２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−２）である。
【００４４】
本発明は更に、イソオキサゾリン部分を有する化合物、または薬学的に許容され得るその塩、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供し、前記組成物が、式Ｉの化合物の有効量を含み、式Ｉが、：
【００４５】
【化８】

【００４６】
［式中：
Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_{1 〜 6}アルキルであり；
Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
Ａは、置換または非置換芳香環であり；
Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
ｎは０または１であり、
ただし、下記のいずれかまたは全部を条件とする：
（ｉ）Ｚ＝ＯＣＨ₃であるとき、Ｒ、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの少なくとも１つが、Ｈではない；
（ｉｉ）Ｒ₁＝Ｒ₂＝ｔｅｒｔ−ブチルであり、各々が、ＯＲに対してオルトであるとき、Ｒ、Ｒ₃、Ｒ₄、ＸおよびＹの少なくとも１つが、ＨではないかもしくはＺが、ＯＣＨ₃ではない；
（ｉｉｉ）Ｚ＝ＯＨおよびＲ＝Ｈまたはメチルであるとき、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの少なくとも１つが、Ｈではない（すなわち、該化合物は［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸または［３−（４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸ではない）；および
（ｉｖ）Ｚ＝ＯＣＨ₃およびＲ＝メチルであるとき、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの少なくとも１つが、Ｈではない（すなわち、該化合物は［３−（４−メトキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］酢酸メチルエステルではない）］
である、医薬組成物を提供する。
【００４７】
本発明は、更に、イソオキサゾリン部分がＭＩＦタンパク質の少なくとも１個のアミノ酸残基と安定な共有結合相互作用を形成する、前記イソオキサゾリン部分を有する化合物の有効量を投与することを含む、関節炎、増殖性血管病、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカインが介在する毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦが介在する状態、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、対宿主性移植片病、および狼瘡症候群を含むが、これらに限定されない）、腫瘍増殖もしくは血管新生、または局所もしくは全身性ＭＩＦ放出もしくは合成を特徴とする何らかの状態を含むが、これらに限定されない、炎症性疾患を治療するための方法を提供する。好ましくは、前記相互作用は、ＭＩＦタンパク質の互変異性化酵素作用の活性部位においてまたは活性部位の近くで起こる。好ましくは、該化合物は、イソオキサゾリン含有化合物またはヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−１）である。更に一層好ましくは、該化合物は、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−２）である。
【００４８】
本発明は、また、イソオキサゾリン部分が、ＭＩＦタンパク質の少なくとも１個のアミノ酸残基と安定な共有結合相互作用を形成する、前記イソオキサゾリン部分を有する化合物および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、前記相互作用は、ＭＩＦタンパク質の互変異性化酵素作用の活性部位においてまたは活性部位の近くで起こる。好ましくは、該化合物は、イソオキサゾリン含有化合物またはヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−１）である。更に一層好ましくは、該化合物は、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−２）である。
【００４９】
本発明の治療方法の一例として、本発明のイソオキサゾリン含有化合物を使用してＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）を有する患者を治療することができる。ＡＲＤＳは、しばしば、免疫応答における動的平衡が、過度の炎症および組織破壊の方向へとシフトする原型臨床応答であるとみなされる。ＭＩＦは、ＩＩ型肺胞細胞および浸潤性免疫細胞の両方において発現される。ＡＲＤＳ患者の気管支肺胞洗浄中のＭＩＦレベルは、対照被験者と比較したとき有意に高いことが、認められた（Donnelly ら、Nat. Med., 3,320〜323(1997)）。ヒトＭＩＦは、対照細胞と比較したとき、ＡＲＤＳ肺胞マクロファージ（エクスビボ）からのＴＮＦαおよびＩＬ−８分泌の両方を増強する。これらの細胞を抗ＭＩＦ抗体で前処理すると、ＡＲＤＳ肺胞細胞からのＴＮＦαおよびＩＬ−８産生は有意に低下する。更に、「発明の背景」で上述したように、ｒＭＩＦ（組換えＭＩＦ）は、濃度依存的に、ＡＲＤＳマクロファージにおけるサイトカイン分泌の糖質コルチコイドを介した阻止を無効にすることが、認められた。これらは、ＭＩＦ／糖質コルチコイドの対が、、ヒト疾患の経過中、インビボでプロ炎症性活性化を受けた細胞において活性であることを示唆する最初のデータであった（Donnelly ら、Nat.Med.,3,320〜323(1997)）。それらのＡＲＤＳへと進行する危険度の高い患者では、そうでない患者と比べて有意に高いレベルの肺胞ＭＩＦが、認められた。ＭＩＦは、恐らくＡＲＤＳにおいて肺の炎症応答を促進し、持続させるための重要なメディエイタとして働くと考えられる。ＡＲＤＳにおけるその顕著な発現は、この疾患の劇発性の経過、そして恐らく、確立された症例においてなぜ糖質コルチコイド治療が失望させる結果となってきたかを説明するであろう。したがって、本発明のイソオキサゾリン含有化合物を含む医薬組成物を使用してＡＲＤＳ患者を治療することができる。
【００５０】
本発明の治療方法のさらなる例として、本発明のイソオキサゾリン含有化合物を使用して慢性関節リウマチの患者を治療することができる。慢性関節リウマチの患者の罹患関節から得た滑液は、変形性関節症を有する患者または健常対照被験者から得たものよりも有意に高いレベルのＭＩＦを含有する（Metz ら、Adv. Immunol., 66, 197〜223(1997)；Leech ら、Arthritis Rheum., 41, 910〜917(1998)；Onodera ら、Cytokine, 11, 163〜167(1999)）。免疫組織化学的染色法によって明らかにされるように、関節炎を起こしているヒト関節内の浸潤性単核細胞は、ＭＩＦの主要ソースである。関節炎の２つの動物モデルにおいて、抗ＭＩＦ ｍＡｂを中和することは疾患の進行および疾患の重症度を有意に抑制し（Leech ら、Arthritis Rheum., 41, 910〜917(1998)；Mikulowska ら、J. Immunol., 158. 5514〜5517(1997)）、炎症性疾患における潜在的治療用途のためのさらなるＭＩＦ阻止因子を開発することへの要求を促進した。したがって、本発明のイソオキサゾリン含有化合物を含む医薬組成物を使用して関節炎患者を治療することができる。
【００５１】
本発明の治療方法のさらなる例として、本発明のイソオキサゾリン含有化合物を使用してアトピー性皮膚炎の患者を治療することができる。アトピー性皮膚炎は、慢性のそう痒性炎症性皮膚疾患である。その病因は、一部には、末梢単核細胞によるサイトカイン産生の調節不全によるものと思われる。アトピー性皮膚炎の患者からの病巣では、ＭＩＦタンパク質が、ケラチノサイトによる高い発現を伴って表皮層全体に広汎に分布している（Shimizu ら、FEBS Lett., 381, 199〜202(1996)）。健常ヒト皮膚では、ＭＩＦは、主として表皮ケラチノサイトに局在した。アトピー性皮膚炎患者の血清ＭＩＦレベルは、対照被験者におけるよりも６倍高かった。更に、アトピー性皮膚炎患者におけるＭＩＦレベルは、臨床像が改善すると共に低下し、ＭＩＦが皮膚炎における皮膚の炎症応答において中枢的役割を果たすことを示唆する。そこで、本発明のイソオキサゾリン含有化合物を含む医薬組成物を使用してアトピー性皮膚炎の患者を治療することができる。
【００５２】
同様に、本発明は、また、増殖性血管病、サイトカインが介在する毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦが介在する状態、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、対宿主性移植片病、狼瘡症候群、および局所または全身性ＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態を含むが、これらに限定されない、他の炎症性または自己免疫疾患を治療するまたは予防するための方法を提供する。
【００５３】
本発明の治療方法のさらなる例として、本発明のイソオキサゾリン含有化合物を使用して腫瘍増殖を有する患者を治療することができる。抗ＭＩＦ抗体を中和することは、インビボでマウス３８Ｃ１３ Ｂ細胞リンパ腫の増殖と血管新生（新脈管形成）を有意に低減することが認められた（Chesney ら、Mol. Med., 5, 181〜191(1999)）。ＭＩＦは、主に腫瘍関連新生血管系において発現された。培養した微小血管内皮細胞は、ＭＩＦを産生することおよびインビトロでの増殖のためにその活性が必要であることが認められたが、３８Ｃ１３ Ｂ細胞ではそれらは認められなかった（Takahashiら、Mol. Med., 4, 707〜714(1998)）。更に、マウスへの抗ＭＩＦ抗体の投与は、インビボでの新血管形成のモデルである、Matrigelの移植によって惹起される血管新生応答を有意に阻止することが認められた（Bozzaら、J. Exp. Med., 189, 341〜346(1999)）。これらのデータは、ＭＩＦが、腫瘍の新生血管形成を阻止する抗腫瘍薬の開発のための新たな標的である腫瘍血管新生において中枢的な役割を果たすことを示唆する。
【００５４】
そこで、本発明は、また、イソオキサゾリン部分を有し、ＭＩＦタンパク質の少なくとも１個のアミノ酸残基と安定な相互作用を形成する化合物または化合物の組合せの有効量を投与することを含む、腫瘍増殖または血管新生を治療するまたは予防するための方法を提供する。好ましくは、前記相互作用は、ＭＩＦタンパク質の互変異性化酵素活性の活性部位においてまたは活性部位の近くで起こる。好ましくは、該化合物はイソオキサゾリン含有化合物またはヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物である。より好ましくは、該化合物は、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−１）である。更に一層好ましくは、該化合物は、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステル、特にそのメチルエステル（ＩＳＯ−２）である。
【００５５】
本発明はまた、関節炎、増殖性血管病、ＡＲＤＳ、サイトカインが介在する毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦが介在する状態、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、対宿主性移植片病、狼瘡症候群を含むが、これらに限定されない）、腫瘍増殖もしくは血管新生、または局所もしくは全身性ＭＩＦ放出もしくは合成を特徴とする何らかの状態を含む、炎症性疾患の治療または予防のための薬剤において使用するためまたは薬剤を製造するための、上記のいずれかを含む医薬組成物としての、式Ｉの化合物または薬学的に許容され得るその塩を提供する。
【００５６】
薬学製剤
本発明の化合物は、それによってＭＩＦが細胞ソースから放出され、ＭＩＦ産生が増強されるＭＩＦ応答を特徴とする、多くの疾患および障害の治療および予防のための薬理学的組成物において有用性を持つ。本発明の化合物は、単独でまたは適切な担体または賦形剤と混合された医薬組成物中で、ＭＩＦ放出を特徴とする様々な状態を治療するまたは改善する用量でヒト患者に投与することができる。治療上の有効用量は、更に、ＭＩＦ互変異性化酵素活性およびＭＩＦ生物活性を阻止するのに十分な化合物の量を指し、そのような阻止は、当業者が標的ＭＩＦ活性を阻止するために必要な化合物の用量を決定することができるような種々の濃度で起こりうることは明白である。治療上の有効用量は、単独でまたはステロイド系または非ステロイド系抗炎症薬もしくは抗腫瘍薬などの他の治療と組み合わせた補助療法として投与しうる。本出願の化合物の製剤および投与のための手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版に認められる。
【００５７】
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、または腸投与；場合によりデポー剤または持続放出製剤中での、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含みうる。
【００５８】
更に、標的薬剤送達システム中で、例えばリポソーム中で本発明の化合物を投与することができる。
【００５９】
本発明の医薬組成物および化合物は、それ自体既知であるように、例えば従来の混合、溶解、糖衣丸製造、浮揚化（levitating）、乳化、被包、内包、または凍結乾燥工程によって製造しうる。本発明に従って使用するための医薬組成物は、それ故、薬学上使用できる、活性化合物の製剤への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、１つまたはそれ以上の生理的に許容され得る担体を使用して従来のように製剤しうる。適切な製剤は、選択する投与経路に依存する。
【００６０】
注射のためには、本発明の化合物を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理的塩類緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液に製剤しうる。経粘膜投与のためには、透過すべき関門に適切な浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤は、当技術分野において既知である。
【００６１】
経口投与のためには、活性化合物を当業者に周知の薬学的に許容され得る担体と組み合わせることにより、該化合物を容易に製剤することができる。そのような担体は、治療する患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤することを可能にする。経口投与用の薬学製剤は、該化合物を固体賦形剤と組み合わせて、場合により、生じた混合物を粉砕し、所望に応じて適切な補助剤を加えた後、錠剤または糖衣丸コアを生成するように顆粒の混合物を処理することによって入手できる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖類；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤のような充填剤である。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【００６２】
糖衣丸コアには適切な被覆が設けられる。このために、場合によりアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／またはニ酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有し、濃縮糖溶液が使用できる。特定のためまたは活性化合物用量の種々の組合せを特徴付けるために錠剤または糖衣丸剤皮に染料または顔料を加えてもよい。
【００６３】
経口で使用できる薬学製剤は、ゼラチンでできたプッシュフィット（push-fit）カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤でできた密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／または滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および、場合により、安定剤と混合した有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、活性化合物を、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁しうる。更に、安定剤を加えてもよい。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した用量でなければならない。
【００６４】
口腔内投与については、組成物は、従来のように製剤された錠剤またはロゼンジの形態をとりうる。
【００６５】
吸入による投与に関しては、本発明に従って使用するための化合物は、適切な推進薬、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧パックまたは噴霧器からエーロゾルスプレー提供の形態で好都合に送達される。加圧エーロゾルの場合は、一定量を送達するための栓を備えることによって投与量単位を決定しうる。吸入器または注入器において使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤しうる。
【００６６】
該化合物は、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤しうる。注射用の製剤は、単位投与形態、例えばアンプルまたは防腐剤を添加した多回用量容器として提供されうる。該組成物は、油性または水性媒質中の懸濁液、溶液または乳剤などの形態をとることができ、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤などの製剤物質を含有しうる。
【００６７】
非経口投与用の薬学製剤は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調製しうる。適切な親油性溶媒または媒質は、ゴマ油などの脂肪油、もしくはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、もしくはリポロームを含む。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を高める物質を含有しうる。場合により、懸濁液はまた、安定剤または化合物の溶解度を高めて高度濃縮溶液の調製を可能にする物質を含有しうる。
【００６８】
または、該有効成分は、使用前に適切な媒質、例えば無菌発熱物質不含水で還元するための粉末形態でありうる。
【００６９】
該化合物は、また、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含有する坐薬または停留浣腸のような直腸組成物に製剤しうる。
【００７０】
上述した製剤に加えて、該化合物は、また、デポー製剤としても製剤しうる。そのような長時間作用性製剤は、移植（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与しうる。そこで、例えば、該化合物は、適切な高分子もしくは疎水性材料（例えば許容され得る油中の乳剤として）もしくはイオン交換樹脂と共に、または辛うじて可溶性の誘導体として、例えば辛うじて可溶性の塩として製剤しうる。
【００７１】
リポソームおよび乳剤は、疎水性薬剤のための送達媒質または担体の周知の例である。ジメチルスルホキシドなどのある種の有機溶媒も使用しうるが、通常はより大きな毒性という対価を伴う。更に、該化合物は、治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出システムを使用して送達しうる。様々な形態の持続放出材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出カプセルは、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日以上にわたって化合物を放出しうる。治療試薬の化学的性質と生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のための付加的な戦略が使用できる。
【００７２】
医薬組成物は、また、適切な固相またはゲル相担体または賦形剤を含みうる。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
ＭＩＦ活性の阻止因子として特定される本発明の化合物の多くは、薬学上適合性の対イオンとの塩として提供されうる。薬学上適合性の塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、等々を含むがこれらに限定されない多くの酸；または塩基で形成されうる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水または他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。薬学的に許容され得る塩、担体または賦形剤の例は、当業者に周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版、A. R. Gennaro編集、Mack Publishing Co., Easton, PA(1990)に認められる。そのような塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩およびリンゴ酸塩、等を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明における使用に適した医薬組成物は、有効成分がそれらの意図されている目的を達成するための有効量で含有されている組成物を含む。より特定すると、治療上有効な量は、治療する被験対象においてＭＩＦの放出および産生を特徴とする疾患の発症または進行を予防するまたは抑制するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書で提供する詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７５】
本発明の方法において使用するいずれの化合物についても、治療上有効な量は、最初に互変異性化酵素阻止アッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【００７６】
治療上有効な量は、ＭＩＦの放出および産生を特徴とする疾患の発症または重症度の低減をもたらす化合物の量を指す。そのような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ₅₀（個体群の５０％に致死的な用量）およびＥＤ₅₀（個体群の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学、薬理学および毒物学的手順によって決定することができる。毒性作用および治療効果の用量比が、治療指数であり、これはＬＤ₅₀およびＥＤ₅₀の比で表わすことができる。高い治療指数（ＥＤ₅₀＞ＬＤ₅₀またはＥＤ₅₀＞＞ＬＤ₅₀）を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイまたは動物試験から得たデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を設定する際に使用できる。そのような化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わないＥＤ₅₀を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いる投与形態および利用する投与経路に依存してこの範囲内で変化しうる。正確な製剤形態、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されうる。（Finglら(1975)、The Pharmacological Basis of Therapeuticsより、第１章、１ページ参照）。
【００７７】
投与量および投与間隔は、所望の調節作用または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な活性部分の血漿中レベルを与えるように個々に調節しうる。ＭＥＣは、各々の化合物について異なるが、インビトロデータ、例えばＭＥＦ活性の５０〜９０％阻止を達成するのに必要な濃度から推定することができる。ＭＩＣを達成するために必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイ、生物検定法または免疫測定法を用いて血漿中濃度を測定することができる。
【００７８】
投与間隔もＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は、期間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％にわたってＭＥＣを上回る血漿中レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。
【００７９】
局所投与、例えば標的器官もしくは組織内への直接導入、または選択的取込みの場合は、薬剤の有効局所濃度は血漿中濃度に関係しないと考えられる。
【００８０】
投与する組成物の量は、言うまでもなく、治療する被験対象、被験対象の体重、被験対象の年齢、疾病の重症度、投与方法、および処方する医師の判断に依存するであろう。
【００８１】
該組成物は、所望に応じて、有効成分を含有する１つまたはそれ以上の単位投与形態を含有しうるパックまたは投薬装置として提供されうる。パックは、例えば、ブリスターパックのような金属またはプラスチックホイルを含みうる。パックまたは投薬装置には、投与についての指示が添付されることもある。適合性薬学担体中に製剤された本発明の化合物を含む組成物も、調製して、適切な容器に入れ、指示される状態の治療についてのラベルを貼付することができる。
【００８２】
試験材料および方法
合成。下記の合成の例において、使用したすべての試薬および溶媒は、市販の最高品質のものを購入した。使用したすべての溶媒は、FisherからのＨＰＬＣグレードであった。¹Ｈ（２７０MHz）および¹³ＣＮＭＲ（６７．５MHz）のＮＭＲスペクトルは、JEOL Eclipse 270分光計で記録した。結合定数は、Hertz（Ｈｚ）で報告し、化学シフトは、ＣＤＣｌ₃、ＤＭＳＯまたはＣＤ₃ＯＤを溶媒として、テトラメチルシラン（ＴＭＳ、０．０ppm）に対して１００万分の１（ppm）で報告した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびフラッシュカラムクロマトグラフィーは、それぞれSelecto ScientificおよびFisher Scientific Basic alumina Brockman acitivity IからのAlumina B,F-254 TLCプレートを使用して実施した。反応をＴＬＣおよび^１ＨＮＭＲによって監視し、¹ＨＮＭＲに従って粗生成物の収率が９０〜９５％になったときに停止した。
【００８３】
試薬。特に指示がない限り、すべての化学物質は、AldrichまたはSigma Chemical Companiesより購入し、市販の最高グレードのものであった。ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリンメチルエステルは、先に述べられているように（Xue ら、J. Med. Chem., 40, 2064〜2084(1997)；Wityak ら、J. Med. Chem., 40, 50〜60(1997)；Baraldi ら、Synthesis-Stuttgart-1994, 11, 1158〜1162(1994)；Curuzu ら、Collect. Czech. Chem. Commun., 56,2494〜2499(1991)３段階で合成した。その手順は次のように要約できる（図１）：４−ヒドロキシベンズアルデヒド（４．０g、３２．８mmol）および塩酸ヒドロキシルアミン（２．２８g、３２．８mmol）をメタノール（１００mL）に溶解し、次いで炭酸ナトリウム（６．９５g、６５．６mmol）を加えた。一晩反応させて、９５％の収率（４．３g）で生成物２を得た。ＤＭＦ（１００mL）中Ｎ−クロロスクシニミド（４．２２g，３１．６mmol）を使用してオキシム２を塩素化し、定量的にクロロオキシム３を生成した。次に化合物３をＴＨＦ／水（８０／２０）に溶解し、３−ブテノエートメチルエステル（３g、２４．５mmol）および炭酸ナトリウム（７．８g、７３．６mmol）で処理した。完了（１２時間）後、生成物を酢酸エチルで抽出し、有機抽出物をブラインで洗って、硫酸マグネシウムで乾燥した。フラッシュクロマトグラフィーによって生成物４を７５％の収率（０．４２g）で得た。構造を¹Ｈおよび¹³ＣＮＭＲおよび質量分析によって確認した。
【００８４】
ドパクロムメチルエステルを、先に公表されている手順（Bendrat ら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)；Swope ら、EMBO J., 17, 3534〜3541(1998)）と同様にして調製した。簡単に述べると、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルの４mM水溶液に、ＮａＩＯ₄を６mMの最終濃度まで加えた。その溶液を直ちに氷上に置いた。制限試薬、ＮａＩＯ₄が使い尽くされたことを意味する、４７５nmでの吸光度が最高値に達した時点でアッセイを開始した。組換えヒトおよびマウスＭＩＦを大腸菌において発現し、先に報告されているように（Bernhagan ら、Biochemistry, 33, 14144〜14155(1994)）精製した。
【００８５】
阻止因子によるＭＩＦの処理。ＭＩＦ試料（手順Ａ：ウシ血清アルブミン２０μg／mlを含有するリン酸ナトリウム５０mM（pH６．６）中０．７２μg／ml；手順Ｂ：胎仔ウシ血清を含有するリン酸ナトリウム５０mM（pH６．６）中０．７２μg／ml；手順Ｃ：リン酸ナトリウム５０mM（pH６．６）中０．１〜０．６mg／ml）を様々な濃度の阻止因子により室温で５〜２０分間（正確な時間は下記の実施例の中で記載する）処理した。次に処理したＭＩＦ試料を、ドパクロム互変異性化酵素アッセイを用いて酵素活性に関して分析した。マイクロＢＣＡアッセイ（Pierce Chemical Co.）を用いてタンパク質濃度を測定した。
【００８６】
ドパクロム互変異性化酵素アッセイ。組換えマウスまたはヒトＭＩＦ試料（上記手順Ａ、ＢおよびＣからの規定された緩衝液中０．７２μg／ml）の室温溶液（０．７ml）にドパクロムメチルエステル（４mMで０．３ml、その場で調製）を加えた。試料を直ちに、未処置ＭＩＦ溶液およびＭＩＦを加えていないドパクロムメチルエステルと比較して、４７５nmでの吸光度の喪失について監視した。
【００８７】
ＭＡＬＤＩ ＭＳ実験。ワシントン大学生化学部質量分析研究室（the University of Washington Department of Biochemistry Mass Spectrometry Laboratory）においてPerceptive Voyager DE MALDI MS（ＤＨＢマトリックス）を用いて試料を検査した。
【実施例１】
【００８８】
酵素阻止試験。この実施例は、イソオキサゾリンによるヒトＭＩＦの酵素活性の阻止を示す。組換えヒトＭＩＦの酵素的互変異性化作用は、Ｌ−ドパクロムメチルエステルを色素形成基質として用いて実施した（Bendrat ら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）。上記で詳述したように、ＭＩＦによって触媒される互変異性化反応は、無色であるジヒドロキシインドール生成物の形成を導く。
【００８９】
いくつかのイソオキサゾリン誘導体を調製し、ＭＩＦドパクロム互変異性化酵素アッセイにおいて活性を試験した。化合物４（図１）は、約１０μMのＩＣ₅₀で用量依存的にＭＩＦ互変異性化酵素活性を阻止したが、対応する非ヒドロキシル化フェニル類似体は、約１２倍効力が低かった。４−メトキシ類似体（７；図３）は、活性を示さず、パラヒドロキシル官能基は、恐らくＭＩＦ：フェニルピルビン酸共結晶化データが示唆するようにＡｓｐ９７との水素結合の好都合な形成に帰せられる、我々が提起するＭＩＦ互変異性化酵素阻止因子についての活性基の重要な特徴であるという先の結論を裏付けた。
【００９０】
イソオキサゾリンシリーズにおける構造：活性関係（ＳＡＲ）試験を継続するため、図２に示すように、イソオキサゾリン試験化合物４を、キラル中心を排したイソオキサゾール５へと酸化し（Xue ら、J. Med. Chem., 40, 2064〜2084(1997)、イソオキサゾリンシリーズにおけるエナンチオ選択性の問題に対する解決法を提供した。意外にも、イソオキサゾール５は、ドパクロム互変異性化アッセイにおいて完全に不活性であった。ＭＩＦおよび化合物４のラセミ混合物の結晶性共存構造のＸ線試験において示されるように、Ｓ−立体異性体だけがＭＩＦに結合する。その立体異性体を精製するために、ＨＰＬＣを用いたキラル分離工程によって鏡像異性体が好都合に単離される（Wityak ら、J. Med. Chem., 40, 50〜60(1997)）。
【００９１】
官能基化イソオキサゾリン。この章は、ＭＩＦの活性部位へのｐ−ヒドロキシフェニル環の結合を改善することを目指した新しい戦略を述べる。この新しい合成法は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＮＨＡｃ、−Ｎ₃およびハロゲン化物などの基によるｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド環の一置換または多置換のいずれかから開始する。最初に、イソオキサゾリン誘導体を合成するための市販の材料だけを使用して２、３、５および６位に構造活性関係を創造する。この目的にかなうべく必要な出発物質の合成は、上述したように、ＭＩＦ互変異性化酵素活性を測定することによって最初のセットのイソオキサゾリン類似体を詳細に検討した後、好都合に実施される。
【００９２】
先に述べられているアミノ酸シッフ塩基型化合物に関する以前の実験（米国特許出願通し番号第０９／６９９，２５８号参照、前記）では、アミノ酸残基の側鎖が、特定されていない機序により、疎水性コアの近くでの結合親和性を改善する上で重要な役割を果たした。例えば、ドパクロム互変異性アッセイにおいて、グリシンおよびトリプトファンシッフ塩基誘導体のＩＣ₅₀は、それぞれ１００μMおよび１．６μMである。最初に、化合物４（ＩＳＯ−１）の効力を改善するための論理的アプローチは、多様な新規化合物を生産するためのα位置における官能基化である。最初の化合物、すなわち２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸メチルエステル（ＩＳＯ−２）は、４つのジアステレオマーの混合物として合成された。分別後、２つの異性体の混合物である１つの分画が、５５０nMのＩＣ₅₀でＭＩＦドパクロム互変異性化酵素活性を阻止することを認めた（図４）。しかし、この合成経路は、出発物質として官能基化アルケン（市販されていない）の調製を必要とし、４つのジアステレオマーの混合物を生成する。この直接的なアプローチは、それ故、キラルＨＰＬＣ分離を必要とし、したがって、イソオキサゾリン誘導体を合成するために市販の材料だけを使用して２、３、５および６位の構造活性関係を検討する上記アプローチよりも好ましくない。
【００９３】
化合物４の官能性誘導体へのもう１つのアプローチは、純粋な鏡像異性体から始まり、これは図５に示すように要約できる。このアプローチは、アミノ官能基付近の多様性を提供し、やはり２つのジアステレオマーの分離可能な混合物を生成する。この戦略は、いずれも市販されているＲ−またはＳ−ビニルグリシンから出発することによって達成される。各々の異性体の官能基化は、広い範囲の脂肪族もしくは芳香族アルデヒドを使用した還元的アミド化によって、または脂肪族もしくは芳香族酸とのカップリングを通してのアミド化によって達成される。更に、アリールアミンを生成するためのＰｄを介したアリールハロゲン化物カップリングもこのアプローチにおいて使用される。このアプローチは、アミノ官能基付近の多様性をもたらし、当技術分野で周知の同様の合成経路に基づく。
【００９４】
そこで、本発明に従って、構造的に化合物４に関連するイソオキサゾリンベースの化合物は、新しくかつ一般的なクラスの、低分子量で特異的なＭＩＦ酵素活性の阻止因子を含む。
【実施例２】
【００９５】
ＭＩＦ活性の生物学的アッセイ。この実施例は、イソオキサゾリンベースの化合物がＭＩＦ酵素活性を特異的に阻止するだけでなく、ＭＩＦの免疫調節作用、特にＭＩＦの糖質コルチコイド調節作用も阻止することを示す。ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリンメチルエステルが、ヒト単球によるＴＮＦα産生へのデキサメタゾンの抗炎症作用に影響を及ぼすＭＩＦの作用を中和する能力を試験した。図３に示すように、ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリンメチルエステルは、この試験系においてＭＩＦ依存性の糖質コルチコイドへの干渉を有意に阻止した。イソオキサゾリンのこの特性は、用量依存的であり、ＩＣ₅₀は、５μMであった。ＭＩＦへのこの阻止作用の特異性を調べるために、ＭＩＦ互変異性化酵素活性のそれほど強力な阻止因子ではない他のイソオキサゾリン類似体（例えば非ヒドロキシル化形態および化合物５、６および７）を試験し、これらの化合物が、イソオキサゾリン化合物４と異なって、抗炎症作用を与えないことを認めた（すべてについてＩＣ₅₀＞１００μM）。これらの結果は、互変異性化酵素活性部位での低分子の結合によってＭＩＦのプロ炎症作用を中和できるという仮説と一致するが、この作用は、互変異性化酵素活性自体の中和には依存しないと考えられる。
【００９６】
該化合物は、更に、例えば標的細胞へのＭＩＦ結合の阻止、ＭＩＦ放出または合成の阻止、ＭＩＦ特異的抗体とのＭＩＦ免疫反応性の阻止、円偏光二色性分光法、液体ＮＭＲ分光法、Ｘ線結晶学、熱安定性測定によって評価されるようなＭＩＦのコンフォメーションまたは構造的完全性の変化、静止ＮＩＨ／３Ｔ３細胞へのＭＩＦのプロ増殖作用の阻止およびそこでの付随する長期的ＥＲＫ活性化の阻止、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞からのＭＩＦ誘導性アラキドン酸放出の阻止、Ｌ６単球におけるＭＩＦ誘導性のフルクトース２，６ビスホスフェート形成の阻止、ＭＩＦ、ＴＮＦまたはＬＰＳで攻撃誘発した試験動物におけるＭＩＦ毒性の阻止、インビトロまたはインビボでのＭＩＦの糖質コルチコイド対立調節作用の阻止、ｐ５３癌抑制タンパク質のＭＩＦ誘導性の機能的不活性化の阻止（Hudson ら、J.Exp. Med., 190, 1375〜1382(1999)）、プロスタグランジンＥ２のＭＩＦ誘導性放出の阻止、およびＭＩＦの放出、産生および／または出現を特徴とするヒト疾患の多くの動物モデルのいずれかにおける罹病率または死亡率の抑制を含む、ＭＩＦ生物活性についての多くのアッセイのいずれかにおいて、ＭＩＦ生物活性の阻止に関して評価される。
【実施例３】
【００９７】
ＭＩＦ：イソオキサゾリン４（ＩＳＯ−１）の共結晶構造分析。最近、ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリン４と複合したＭＩＦの結晶構造が解明された。ＭＩＦとのｐ−ヒドロキシフェニルピルベート（Lubetsky ら、Biochemistry, 38, 7346〜7354(1999)）および（Ｅ）−２−フルオロ−ｐ−ヒドロキシシンナメート（Taylor ら、Biochemistry, 38, 7444〜7452(1999)）の共結晶化と同様に、イソオキサゾリンの３つの分子は、各々のＭＩＦ三量体分子に結合しており、２つのサブユニットの間の各々の界面に存在する。この阻止因子は、１つのサブユニットからのＰｒｏ−１およびＬｙｓ−３２、ならびに隣接するユニットからのＡｓｎ−９７と相互作用する。特に、阻止因子４は、イソオキサゾリン環のＣ３炭素を通してＭＩＦのＰｒｏ−１と相互作用する。
【００９８】
結合分子の構造分析は、Ｓ−異性体だけがＭＩＦクレフトに結合できることを明らかにし、候補阻止因子化合物の一部のラセミ混合物には実質的な鏡像異性作用が存在する可能性が高いという初期の指摘を裏付けた。更に、アルコール付加物６を生じるｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリンのカルボキシレート部分の還元は、Ｌｙｓ−３２との水素結合を形成するためのこの基の重要性という主張と一致して、互変異性化酵素活性への阻止作用を無効にする。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、ｐ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリンメチルエステルの合成を示す。
【図２】図２は、酸化、還元およびメチル化を含む、イソオキサゾリン４（ＩＳＯ−１）の修飾を示す。
【図３】図３は、化合物４（ＩＳＯ−１）（図１）がＭＩＦの糖質コルチコイド調節作用を阻止することを示す。ＭＩＦタンパク質が、種々の濃度の化合物４の存在下で単球において糖質コルチコイドによるＴＮＦ産生の抑制を調節する能力を、先に述べられているように（Bendrat ら、Biochemistry, 36, 15356〜15362(1997)）検定した。単球は、接着によって末梢血から精製し、１×１０⁶細胞／穴をデキサメタゾン（１０^-8Ｍ）、ＭＩＦ（天然ＭＩＦ １００ng／ml）および／または図に示す種々の濃度の化合物４と共にプレインキュベートした後、ＬＰＳ ０．５μg／ml ＬＰＳ（大腸菌０１１１：B4, Sigma Chemical Co.）を加えた。左から３番目の棒に対応する培養物については、２０μMの化合物４（左から５番目および６番目の棒）の可溶化に使用したのと等しい量の溶媒（ＤＭＳＯ）を加えた。１６時間後に細胞培養上清を収集し、標準的な市販のＥＬＩＳＡによって分泌されたＴＮＦαを定量した。当技術分野において既知の標準的な方法により、ＭＴＴ低下によって評価したとき、化合物４は、細胞生存率に影響を及ぼさなかった。示されているデータは、２回反復し、同様の結果であった代表的実験における３つの穴の平均値±標準偏差である。
【図４】図４は、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸メチルエステル（ＩＳＯ−２）への逆合成アプローチを示す。
【図５】図５は、官能基化イソオキサゾリン誘導体の合成を示す。

Claims (16)

1. 少なくともヒトＭＩＦのＮ末端プロリン残基と安定な相互作用を形成するイソオキサゾリン部分を有する化合物または化合物の組合せにヒトＭＩＦを接触させることを含む、ヒトＭＩＦの酵素および生物活性を阻止するための方法。
2. 上記化合物が、式Ｉのイソオキサゾリン含有化合物であり、式Ｉが、：
   

   

   ［式中：
   Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
   ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_{1 〜 6}アルキルであり；
   Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
   Ａは、置換または非置換芳香環であり；
   Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
   Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
   Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
   ｎは、０または１である］
   である、請求項１記載の方法。
3. 上記化合物が、パラ−ヒドロキシフェニルイソオキサゾリン含有化合物であり、上記式中、Ｒ、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの各々が、Ｈまたは−ＣＨ₂−Ａであり、そしてＺが、ＯＲである、請求項２記載の方法。
4. 該化合物が、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）のエステルである、請求項３記載の方法。
5. 該化合物が、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）である、請求項４記載の化合物。
6. 上記化合物が、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸メチルエステル（ＩＳＯ−２）のエステルである、請求項３記載の方法。
7. 上記化合物が、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸メチルエステル（ＩＳＯ−２）である、請求項６記載方法。
8. その必要のある対象に式Ｉの化合物の有効量を投与することを含み、式Ｉが、：
   

   

   ［式中：
   Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
   ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_{1 〜 6}アルキルであり；
   Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
   Ａは、置換または非置換芳香環であり；
   Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
   Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
   Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
   ｎは、０または１である］
   である、炎症性疾患、または局所または全身性ＭＩＦ放出または合成を特徴とするあらゆる状態を処置するための方法。
9. 上記式中、Ｒ、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの各々が、Ｈまたは−ＣＨ₂−Ａであり、そしてＺが、ＯＲである、請求項８記載の方法。
10. 上記疾患または状態が、アトピー性皮膚炎、関節炎、増殖性血管病、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカインが介在する毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦが介在する状態、自己免疫疾患、腫瘍増殖または血管新生から成る群より選択される、請求項９記載の方法。
11. 上記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病および狼瘡症候群から成る群より選択される、請求項１０記載の方法。
12. 式Ｉの化合物または薬学的に許容され得るその塩、および薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含み、式Ｉが、：
    

    

    ［式中：
    Ｒ_{1 〜 4}は、独立して、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＨ、ＮＲＲ′またはＳＨであり；
    ＲおよびＲ′は、独立して、ＨまたはＣ_{1 〜 6}アルキルであり；
    Ｘは、Ｒ、ハロ、Ｎ₃、ＣＮ、ＯＲ、ＮＲＲ′、ＳＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ₂またはＡであり；
    Ａは、置換または非置換芳香環であり；
    Ｙは、Ｒ、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″または（ＣＨ₂）_ｎ−Ａであり；
    Ｚは、Ｒ、ＯＲ、ＯＲ″、ＮＲＲ′、ＮＲＲ″またはＡであり；
    Ｒ″は、飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖Ｃ₂〜Ｃ₁₈であり；そして
    ｎは、０または１であるが、
    ただし、
    （ａ）Ｒ₁＝Ｒ₂＝ｔｅｒｔ−ブチルであり、各々が、ＯＲに対してオルトであるとき、Ｒ、Ｒ₃、Ｒ₄、ＸおよびＹの少なくとも１つが、ＨではないかまたはＺが、ＯＣＨ₃ではなく；そして
    （ｂ）Ｚ＝ＯＨおよびＲ＝Ｈまたはメチルであるとき、Ｒ_{1 〜 4}、ＸおよびＹの少なくとも１つが、Ｈではない］
    である、医薬組成物。
13. 上記化合物が、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸のエステルである、請求項１２記載の医薬組成物。
14. 上記化合物が、（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾリン酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）である、請求項１３記載の医薬組成物。
15. 上記化合物が、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸のエステルである、請求項１２記載の医薬組成物。
16. 上記化合物が、２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロイソオキサゾール−５−イル］−３−フェニルプロピオン酸メチルエステル（ＩＳＯ−２）である、請求項１５記載の医薬組成物。

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