JP2004533991A - コンホメーションエピトープを利用するｈｃｖ感染の予防及び治療 - Google Patents

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Abstract

Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)のエンベロープタンパク質Ｅ２のコンホメーションエピトープを同定して、ＨＣＶが感染した患者に由来するモノクローナル抗体のパネルを利用して特性決定した。これらのコンホメーションエピトープは、ＨＣＶに対するヒトの免疫応答において重要であり、特に、このウイルスの中和において重要であることが測定されている。これらのコンホメーションエピトープの同定に基づいて、これらの完全なコンホメーションエピトープを有するペプチド及びミモトープを含むワクチンを調製して患者に投与して、ＨＣＶ感染を予防し及び／又は治療することができる。Ｅ２の特定のエピトープに向けられたモノクローナル抗体の４つの別々のグループの同定を利用して、患者を、ＨＣＶに対する応答に基づいて階層分類し、適当な治療養生法を決定することができる。

Description

【技術分野】
【０００１】
この発明は、構造的に保存されたＨＣＶエピトープに対するヒトモノクローナル抗体(ＨＭＡｂ)の調製物に関係する。かかる抗体は、患者の高い割合において見出すことができ、例えば、ＨＣＶ感染の診断及び治療において有用である(ある治療ストラテジーの恩恵を受けると予想される患者の同定において有用であることを含む)。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)は、エンベロープを有するウイルスであり、その遺伝情報は、９．５ｋｂの陽性鎖ＲＮＡゲノム中にコードされている。３４１ｂｐの高度に保存された非コード領域が、このウイルスゲノムの５’末端に位置しており、その後ろに、約３，０１０アミノ酸のポリタンパク質をコードする長いオープンリーディングフレームがある。２つの推定のエンベロープ糖タンパク質Ｅ１(ｇｐ３５)及びＥ２(ｇｐ７２)は、それぞれ、５又は６及び１１Ｎ結合グリコシル化部位により同定されてきた。高レベルの遺伝的変異性は、これらのエンベロープ遺伝子と関係している。この変異性は、Ｅ２遺伝子の５’末端で高度に強められており、そこには、ＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる２つの超可変域が記載されている。ＨＶＲ１に対する抗体は、細胞培養及びチンパンジー防護研究においてウイルス中和を媒介するようである(Farci等、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15394-15399；Shimizu等、1994 J.Virol.68:1494-1500；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。不幸にも、ＨＶＲ１に対する抗体は、分離株特異的である傾向があり、時間がたつと、既存の免疫応答が認識しない新しいウイルス変異体の複製を駆り立てる傾向がある(Farci等、1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7792-7796；Weiner等、1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3468-3472；Kato等、1993 J.Virol.67:3923-3930；これらの各々を、参考として本明細書中に援用する)が、もっとも、ＨＶＲ１関連配列に対する一層広い応答の誘導において進歩がなされてはいる(Puntoriero等、1998 EMBO Journal 17:3521-3533；参考として、本明細書中に援用する)。ＨＣＶエンベロープ抗原は、グリコシル化形態で発現されると、高度に免疫原性であるようである(da Silva Cardoso等、1997 Ann.Hematol.74:135-7；参考として、本明細書中に援用する)。予備データは、Ｅ２タンパク質内の保存されたエピトープの存在を示唆している(Lesniewski等、1995 J.Med.Virol.45:415-22；参考として、本明細書中に援用する)。感染した患者に由来する血清中の中和抗体の存在が報告されている。
【０００３】
哺乳動物細胞で発現されたＨＣＶＥ１〜Ｅ２タンパク質を利用する研究は、注射された個体が、コンホメーション的性質のエピトープに部分的に組み立てられたＨＣＶ Ｅ２に対する抗体応答を有することを示した(Harada等、1994 J.Gen.Virol.76:1223-1231；本明細書中に参考として援用する)。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体又は組換え抗体の単離を含む研究は、これらの抗体のかなりの画分がコンホメーション的エピトープを認識することを示した(da Silva Cordoso等、1998 J.Med.Virol.55:28-34；Burioni等、1998 Hepatology 28:810-814；Habersetzer等、1998 Virology 249:32-41；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。これらのドメインの生物学的機能に関して、研究者は、このウイルスはイン・ビトロで増殖できないので、ウイルス中和への洞察を与えるためにサロゲートアッセイを採用した(Houghton, Hepatitis C viruses. In Fields, Knipe, Howley (編) Virology. Lippincott-Raven, Philadelphia, p.1035-1058；参考として本明細書中に援用する)。一つのサロゲートアッセイの結合中和(ＮＯＢ)アッセイは、所定の抗体又は血清の、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質のヒトＴ細胞株との結合を妨げる能力を評価する(Rosa等、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1759-1763；参考として本明細書中に援用する)。このワクチン接種により防護されたチンパンジーから得られた血清抗体がＮＯＢアッセイにおいて強く陽性であったという発見は、このアッセイのウイルス中和活性の尺度としての適切さに対する支持を与える(Rosa等、前出；Ishii等、1998 Hepatology 28:1117-1120；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。
【０００４】
ヒトのテトラスパニン(tetraspannin)細胞表面タンパク質ＣＤ８１(ＴＡＰＡ−１、総説としては、Levy等、1998 Ann.Rev.Immunol.16:89-109を参照されたい；参考として本明細書中に援用する)は、ＮＯＢアッセイでＨＣＶ Ｅ２が結合する標的である(Pileri等、1998 Science 282:938-941；参考として本明細書中に援用する)。更に、ヒトＣＤ８１は、遊離のビリオンに結合し、その後、ＨＣＶに対する可能なレセプターである(Pileri等、前出)。ＨＣＶ １ａＥ２タンパク質を利用して、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に対する幾つかのヒトモノクローナル抗体は、ＨＣＶ Ｅ２のヒト細胞との相互作用を阻止することが報告されている(Burioni等、1998 Hepatology 28:810-814；Habersetzer等、1998 Virology 249:32-41；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。しかしながら、異なる遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質中のＮＯＢ陽性抗体により認識されるエピトープの保存に関しては、殆ど知られていない。
【０００５】
ＨＣＶの検出及びその防護に対する他のアプローチには、ペプチド模倣物の開発が含まれる。例えば、Ａ型及びＣ型肝炎ウイルスのペプチド模倣物が、ランダムに生成された合成の及びファージディスプレーペプチドライブラリーの作成(検出アッセイ及びワクチン療法における利用のため)によって造られている(Mattioli等、1995 J.Virology 69:5294-5299；Prezzi等、1996 J.Immunol.156:4504-4513；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。しかしながら、これらのミモトープ(mimotope)の有効な抗体結合は、線形に規定されたウイルスエピトープと比較されただけである。診断アッセイで利用するための幾つかの線形に規定された免疫優性(immunodominant)ＨＣＶエピトープの順次的組換え融合が、記載されている(Chein等、1999 J.Clin.Microbiol.37:1393-1397；参考として本明細書中に援用する)。しかしながら、線形エピトープからデザインされた複数のエピトープの融合物は、コンホメーション的模倣物と同程度の能力で機能するようには造られなかった(それは、標的レセプターに結合することを邪魔するようにはデザインされなかった)。
【０００６】
それ故、診断及び受動免疫療法に利用しうる感染した患者からの血清中の中和抗体を同定することは、かなり興味深いことである(これらの抗体は、ヒト細胞に由来し、広いスペクトルの遺伝子型の中和を、特に、特定の地理的領域で与える)。複数のＨＣＶ遺伝子型に対する反応性の幅とＨＣＶビリオンの感受性細胞への結合を邪魔する能力は、共に、治療上有用な中和抗体にとって鍵となる属性であろう。やはり興味あるのは、ＨＣＶエンベロープタンパク質のペプチド及び非ペプチド性(有機)構造模倣物のデザインである。
【０００７】
関連文献
ＨＣＶに関する背景情報を与える参考文献には、Abrignani 1997 Springer Semin.Immunopathology 19:47-55；Simmonds,1995 Hepatology 21:570:583；及びMahaney等、1994 Hepatology 20:1405-1411(これらの各々を参考として本明細書中に援用する)が含まれる。
【０００８】
Da Silva Cardosa等、1998 J.Med.Virology 55:28-34は、ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２に対するヒトモノクローナル抗体を記載している。Habersetzer等、1998 Virology 249:32-41は、ＨＣＶ Ｅ２遺伝子型１ａ及び１ｂを認識することのできるヒトモノクローナル抗体を記載している。Burioni等、1998は、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に対するヒト組換えＦabを報告している。Deleersnyder等、1997 J.of Virology 71:697-704は、Ｅ２反応性モノクローナル抗体を記載している。ＨＣＶに対する抗体の利用に関係する他の参考文献には、Burioni等、1998 Hepatology 28:810-814；Akatsuka等、1993 Hepatology 18:503-510；DeLalla等、1993 J.Hepatol.18:163-167；Mondelli等、1994 J.Virol.68:4829-4836；Siemoneit等、1994 Hybridoma 13:9-13；及びMoradpour等、1996 J.Med.Virol.48:234-241が含まれ、ヒト抗体生成に関しては、Foung等、1990 J.Immunol.Methods 70:83-90；Zimmerman等、1990 J.Immunol.Methods 134:43-50が；コンビナトリアルライブラリーを利用する改変抗体の生成に関しては、Burton及びBarbas, Dixon, FJ(編) Advances in Immunology, Vol.57,Vi+391p.Academic Press,Inc., カリフォルニア、San Diego在、191-280, 1994；Plaisant等、1997 Res.Virol.148-169；及びBarbas及びBurton, Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries. Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, ニューヨーク、Cold Spring Harbor在、1994が含まれる。これらのこの段落で引用された文献の各々を、参考として、本明細書中に援用する。
【０００９】
ＨＣＶ Ｅ２に対する抗体結合のアッセイは、Rosa等、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1759-1763に記載されており、参考として、本明細書中に援用する。
【００１０】
ＨＣＶゲノムの一部を有するワクシニアウイルス又はバキュロウイルス構築物が、Ralston等、1993 J.Virology 67:6733-6761及びLanford等、1993 Virology197:225-235に記載されており、これらの各々を参考として本明細書中に援用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の一面は、主要地理的領域内の優性ＨＣＶ型に結合するモノクローナル抗体(ヒトモノクローナル抗体を含む)を提供する。特に、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質のコンホメーション的に保存されたエピトープに結合するモノクローナル抗体のファミリーを提供する。このファミリー内には、米国で診断されたＨＣＶ感染の殆どすべての患者並びに他の地理的地域における患者の少なくともかなりの割合に結合することのできる実質的に全モノクローナル抗体であるように、米国で見出された優性遺伝子型に結合する抗体がある。これらのモノクローナル抗体は、様々な診断アッセイにおける用途が見出されている。加えて、組換えＨＣＶ Ｅ２タンパク質１型及び２型並びにそれらの断片のコンホメーション的に保存された発現が、アッセイ、薬物スクリーニング、ワクチン、診断アッセイにおける利用並びに他の目的のために与えられる。この発明の抗体は、感染患者のウイルス負荷を減じて、標的細胞の感染を邪魔するための受動免疫療法ストラテジーにおける利用が見出されている。コンホメーション的に依存するエピトープを認識する抗体は又、ペプチド及びコンホメーション的に規定されたエピトープ模倣物の合理的なデザインのためのテンプレートを与えるために利用することもできる(例えば、有機化合物、有機金属化合物、無機化合物、小分子)。
【００１２】
特に好適な具体例において、この発明の抗体は、ＨＣＶのＥ２又はＥ１タンパク質のコンホメーションエピトープに向けられている。Ｅ２のコンホメーションエピトープは、モノクローナル抗体のパネル及び一連のＥ２の欠失構造を利用して同定された。抗体の一つのグループは、ＨＣＶ１ｂに由来するＥ２のアミノ酸４１１〜６４４のコンホメーションエピトープに結合することが見出されている。このグループの抗体は、Ｅ２のＣＤ８１との相互作用を阻止することが見出されている。抗体の他のグループは、ＨＣＶ１ｂのＥ２のアミノ酸４７０〜６４４のコンホメーションエピトープに結合することが見出されている。抗体の第三のグループは、ＨＣＶ１ｂのＥ２のアミノ酸４７０〜６４４のコンホメーションエピトープに結合するが、Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止できない。第四のグループは、ＨＣＶ１ｂのＥ２のアミノ酸６４４〜６６１のコンホメーションエピトープに結合する。特に好適な具体例において、これらの抗体が向けられているコンホメーションエピトープは、ＨＣＶ株間で保存されている。本発明の抗体は、製薬上許容しうる賦形剤と組合せて、医薬配合物を与えることができる。
【００１３】
この発明の他の面は、ＨＣＶタンパク質中のコンホメーションエピトープの定義を与え、更に、かかるエピトープを含む組成物及び化合物を提供した。例えば、本発明は、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質のコンホメーションエピトープを含むタンパク質、ペプチド及び小分子を提供する。これらのペプチドは、欠失構造例えば図２３のものであってよい。これらのペプチドは、本発明の抗体により認識される少なくとも一つのコンホメーションエピトープを含むことができる。ある好適具体例において、これらのタンパク質は、少なくとも一つのペプチドがＨＣＶのコンホメーションエピトープを含む連結されたペプチドのストリングである。このストリングのペプチドは、ＨＣＶの種々のコンホメーション及び線形エピトープを含むことができ、又はこれらのペプチドは、同じエピトープを含むことができる。このストリングのペプチドは、好ましくは、そのコンホメーションエピトープを実質的に天然で見られるように提示するために適当に折り畳まる。かかるタンパク質及びペプチドは、ワクチン配合において又は診断試験において利用することができる。
【００１４】
本発明は又、患者を、そのＨＣＶに対する免疫学的応答に基づいて等級別に分類する方法及びＨＣＶ免疫療法によく応答しそうな患者を同定する方法をも提供する。例えば、患者の血清を用いて、特定のＨＣＶエピトープに対する抗体の存在について試験することができる。もしその患者がかかるエピトープに対する抗体の十分なレベルを有しないならば、そのエピトープに対するヒトモノクローナル抗体をその患者に投与することができる。
【００１５】
定義
「動物」：用語動物は、ここで用いる場合、ヒト並びに非ヒト動物をいい、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類が含まれる。好ましくは、非ヒト動物は、哺乳動物(例えば、ゲッ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類又はブタ)である。動物は、トランスジェニック動物であってよい。
【００１６】
「抗体」：用語抗体は、免疫グロブリンをいい、天然のものであっても、全体的に若しくは部分的に合成により生成されたものであってもよい。特異的結合能を維持しているそれらのすべての誘導体及び断片も又、この用語に包含される。この用語は又、免疫グロブリンの結合ドメインと相同な又はほぼ相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質をもカバーする。これらのタンパク質は、天然起源から誘導することができ、又は全体的に若しくは部分的に合成により生成することができる。抗体は、モノクローナルであっても、ポリクローナルであってもよい。この抗体は、ヒトのクラス：任意のヒトのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであってよい。しかしながら、本発明においては、ＩｇＧの誘導体が、好適である。
【００１７】
「ペプチド」：本発明により、「ペプチド」は、ペプチド結合により一緒に結合された少なくとも３つのアミノ酸のストリングを含む。ペプチドは、個々のペプチド又はペプチドの集合を指すことができる。発明のペプチドは、非天然アミノ酸(即ち、天然には存在しないがポリペプチド鎖に組み込むことのできる化合物；例えば、機能的イオンチャンネルに上首尾に組み込まれた非天然アミノ酸の構造を表示しているhttp://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gifを参照されたい)及び／又はアミノ酸類似体を代用として用いることはできるが、好ましくは、天然アミノ酸のみを含む。又、発明のペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸を、例えば、化学的実体例えば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、結合用リンカーの付加、官能化又は他の改変などによって改変することができる。好適具体例において、このペプチドの改変は、一層安定なペプチド(例えば、イン・ビボでの一層長い半減期)へと導く。これらの改変には、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組込みなどが含まれうる。これらの改変の何れも、実質的に、ペプチドの所望の生物学的活性を邪魔しない。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」：ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのポリマーをいう。このポリマーは、天然のヌクレオチド(即ち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン)、ヌクレオシド類似体(例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロール−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−イオドウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ(６)−メチルグアニン、及び２−チオシチジン)、化学的に改変した塩基、生物学的に改変した塩基(例えば、メチル化塩基)、インターカレーションを受けた塩基、改変された糖(例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース)、又は改変されたリン酸基(例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合)を含むことができる。
【００１９】
「小分子」：ここで用いる場合、用語「小分子」は、比較的低分子量であって、タンパク質、ポリペプチド又は核酸でない有機化合物をいい、天然のものであっても、人工的に(例えば、化学合成によって)造ったものであってもよい。典型的には、小分子は、約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。又、小分子は、典型的には、複数の炭素−炭素結合を有する。公知の天然の小分子には、ペニシリン、エリスロマイシン、タキソール、シクロスポリン及びラパマイシンが含まれるが、これらに限られない。公知の合成の小分子には、アンピシリン、メチシリン、スルファメトキサゾール及びスルホンアミドが含まれるが、これらに限られない。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１は、この出願中に記載のワクシニアウイルス構築物の幾つかによるＨＣＶＥ２タンパク質の発現を示すウエスタンブロットである。細胞質抽出物を、野生型ワクシニアウイルスを感染させてから、ｐＶＯＴＥ(ｗｔ)又は遺伝子型１ａ(Ｑ１ａ)若しくは２ｂ(Ｑ２ｂ)のＨＣＶ Ｅ２を発現する組換えｐＶＯＴＥでトランスフェクトしたＣＶ１細胞から調製した。細胞を、インデューサーＩＰＴＧの存在下(＋)又は非存在下(−)で２４時間培養した。２×１０5細胞に相当する抽出物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分画して、ニトロセルロース上にブロットした。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質が、ＥＣＬ検出システム(Amersham)を利用するｍＭａｂ Ｅ２Ｇの１／５００に希釈した腹水とのインキュベーションによって示された。分子量標準の移動を、右側に示してある。
【００２１】
図２(SEQ ID NO:９〜１２)は、ＨＣＶ Ｅ２ワクシニアウイルスクローンの中心領域から増幅された配列を記載している。示されているのは、ＨＣＶ Ｅ２ワクシニア構築物Ｑ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ及びＱ２ｂの中心の断片の配列であり、適当なＨＣＶ遺伝子型の代表的配列と比較して示してある。各遺伝子型の代表的配列の受入れ番号は、次の通りである。ＨＣＶ１Ａ＝Ｍ６２３２１、ＨＣＶ１Ｂ＝Ｄ１０７５０、ＨＣＶ２Ａ＝Ｄ００９４４、ＨＣＶ２Ｂ＝Ｄ１０９８８。系統発生的分析を、ＰＨＹＬＩＰパッケージのＣＬＵＳＴＡＬＹ及びＤＮＡＰＡＲＳプログラムを用いて行なった。
【００２２】
図３(SEQ ID NO:１〜８)は、ＨＣＶの配列：１ａ、Ｑ１ａ−ＦＲ、−１ｂ、１Ｑ１ｂ−ＦＲ、２ａ、Ｑ２ａ−ＦＲ、−２ｂ、−Ｑ２ｂ−ＦＲの、見出された最倹約トリー(most parsimonious tree)を利用した比較である。
【００２３】
図４は、ＨＣＶ血清の、種々の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との反応性のグラフを示している。ワクシニアウイルスＱ１ａ■、Ｑ１ｂ▲、Ｑ２ａ▼、Ｑ２ｂ◆又は非組換えワクシニアウイルスＶＷＡ○を感染させた６×１０5のＨｅＬａ細胞により発現されたＨＣＶ Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンをコートしたウェル上に捕捉した。ウェルを、洗って、ブロックし、結合したタンパク質を、遺伝子型分類したＨＣＶ血清又はＨＣＶ陰性の血清(グラフ上に示した)の希釈度(ｘ軸)の増大する希釈物とインキュベートした。値は、二連のウェルの平均の吸光度である。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００２４】
図５は、ＨＣＶに感染した個人由来の血清の、複数の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との反応性を示す棒グラフである。ＨＣＶ遺伝子型２ｂに感染した個人に由来する１２の血清(ｘ軸)を、遺伝子型１ａ(紺青色棒)、１ｂ(紫紅色棒)、２ａ(黄色棒)及び２ｂ(淡青色棒)のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に対して滴定した。０．５の平均比吸光度(ＶＷＡ抽出物で得られる平均比吸光度から減じたＨＣＶ Ｅ２含有抽出物で得られる平均吸光度)を生じた血清の希釈をｙ軸上に示してある。この値を、図４に与えたものと類似の滴定曲線データから計算した。
【００２５】
図６は、図７、８及び９に記載した実験で用いたＨＣＶ Ｅ２エンベロープタンパク質のコンホメーションエピトープを認識する抗体を評価するための直接結合アッセイの概略図を描いている。ＧＮＡレクチンを固体表面上にコートした後に、加えられたＥ２含有タンパク質抽出物は該レクチンにより捕捉される。試験抗体を、捕捉されたＥ２に結合させ、過剰の未結合抗体を除去して、結合した抗体を標識した第二抗体により検出する。
【００２６】
図７は、レクチンにより捕捉されたＨＣＶ Ｅ２に対するＨＣＶ ＨＭＡｂの反応性の棒グラフである。野生型(ＶＷＡと表示した棒)又はＨＣＶ １ａ Ｅ２(ＨＣＶ １ａ)(ＨＣＶと表示した棒)を発現するワクシニアウイルスが感染した６×１０5の細胞の細胞質抽出物に由来するタンパク質を、５００ｎｇのGalanthus nivalis (ＧＮＡ)又はTiriticum vulgaris (ＷＧＡ)をコートしたミクロ滴定プレートに加えた。捕捉されたタンパク質を５μｇ／ｍｌの示したＨＭＡｂ(ｘ軸)とインキュベートした。Ｒ０４は、イソ型の一致した対照である。結合したＨＭＡｂを、抗ヒト抗体−アルカリホスファターゼ及び適当な基質を用いて検出した。棒は、二連のウェルの平均ＯＤ値を示している。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００２７】
図８は、ＨＣＶ抗体の、基準からはずれたＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質との反応性のグラフを示している。ワクシニアウイルスＱ１ａ■、Ｑ１ｂ▲、Ｑ２ａ▼、Ｑ２ｂ◆が感染した６×１０5のＨｅＬａ細胞により発現されたＨＣＶ Ｅ２タンパク質が、５００ｎｇのＧＮＡレクチンをコートしたウェル上に捕捉された。ウェルを洗って、ブロックし、結合したタンパク質を、示したＨＣＶ ＨＭＡｂ(図９Ａ〜９Ｊの各々で同定されたＨＭＡｂ)及び対照用ＨＭＡｂ(Ｒ０４)図９Ｋ〜ＣＭＶタンパク質(Ward等、1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6773-6777；参考として本明細書中に援用する)と共にインキュベートした。値は、二連のウェルの平均比結合(ＨＣＶ Ｅ２タンパク質を発現するワクシニアウイルスが感染した細胞の抽出物−ｗｔワクシニア抽出物)である。ＨＣＶ及び対照用ＨＭＡｂの、ｗｔワクシニアウイルス感染細胞由来のタンパク質との反応性は、吸光度０．０４を超えなかった。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００２８】
図９は、ＨＣＶ ＨＭＡｂの、ネイティブ(ＮＡＴ)及び変性(ＤＮＴ)ＨＣＶ １ｂ Ｅ２タンパク質との反応性を示す棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ｂ及びＶＷＡが又はＶＷＡだけが感染した６×１０5のＨｅＬａ細胞に由来する細胞質抽出物を未処理のままでおき(青色棒)又は０．５％ ＳＤＳ及び５ｍＭ ジチオスレイトールとの５６℃１５分間のインキュベーションにより変性した(黄色棒)。処理後に、タンパク質をＢＬＯＴＴＯにて１：５に希釈し、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコートしたウェル上で捕捉した。ウェルを洗って、ブロックし、結合したタンパク質を、示した濃度のＨＣＶ ＨＭＡｂ及び対照用ＨＭＡｂ(Ｒ０４)と共にインキュベートした。結合した抗体を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体及びＰＮＰＰを用いて検出した。発色を、４５分間、進行させた。ネイティブ及び変性ＨＣＶ １ｂの値は、二連のウェルから得られた平均シグナルである。ＶＷＡ感染したＨｅＬａ細胞に由来するネイティブ及び変性タンパク質の単一ウェルからのシグナルは、識別不能であり、やはり平均化された(赤色棒)。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００２９】
図１０は、図１１、１２及び１３に記載の実験で用いた競争的結合分析の該略図を描いている。ＧＮＡレクチンを固体表面上にコートした後、加えられたＥ２含有タンパク質抽出物は、該レクチンに捕捉される。競争抗体を、この捕捉されたＥ２に結合させた後に、未結合の過剰抗体を除去して、標識した試験抗体を加える。
【００３０】
図１１は、ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５を利用する競争分析の棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ(青色棒)又はＱ１ｂ(赤色棒)が感染したＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物に由来するＨＣＶ Ｅ２タンパク質は、５００ｎｇのＧＮＡにより捕捉された。結合したＨＣＶ Ｅ２を、２５μｇ／ｍｌの示したＨＭＡｂ(ｘ軸)の存在下で、５μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＢＨ−５により検出した。結果を、如何なる競争相手も存在しない場合のビオチン化ＣＢＨ−５の結合と比較する。棒は、二連のウェルから得られた平均値を示している。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００３１】
図１２は、ＨＣＶ ＨＭＡｂの、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２の複数の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質への結合を邪魔する能力を示す競争分析である。ワクシニアウイルスＱ１ａ(青色棒)、Ｑ１ｂ(赤色棒)、Ｑ２ａ(黄色棒)又はＱ２ｂ(淡青色棒)が感染したＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物に由来するＨＣＶ Ｅ２タンパク質は、５００ｎｇのＧＮＡレクチンにより捕捉された。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｄ、−４Ｂ及び−１７を、遺伝子型２ Ｅ２タンパク質に対する限られた反応性のために、単にＨＣＶ １ａ又は１ｂ Ｅ２タンパク質を用いて評価した。結合したＨＣＶ Ｅ２を、２μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＢＨ−２を用いて、２０μｇ／ｍｌの示したＨＭＡｂ(ｘ軸)の存在下で検出した。これらの棒は、示した抗体の存在下で認められた結合を、任意の競争抗体(ｙ軸)の非存在下でのビオチン化ＣＢＨ−２のＨＣＶ Ｅ２への結合に対して示している。Ｒ０４は、サイトメガロウイルスタンパク質を認識する対照用ＨＭＡｂである。棒は、二連のウェルから得られた平均値を示している。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００３２】
図１３は、ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７がユニークエピトープを認識することを示す競争分析である。ワクシニアウイルスＱ１ａ(青色棒)又はＱ１ｂ(赤色棒)が感染したＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物に由来するＨＣＶ Ｅ２タンパク質は、５００ｎｇのＧＮＡレクチンにより捕捉された。結合したＨＣＶ Ｅ２を、２μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＢＨ−７により、２０μｇ／ｍｌの示したＨＭＡｂ(ｘ軸)の存在下で検出した。これらの棒は、示した抗体の存在下で認められた結合を、任意の競争抗体(ｙ軸)の非存在下でのビオチン化ＣＢＨ−７のＨＣＶ Ｅ２への結合に対して示している。Ｒ０４は、サイトメガロウイルスタンパク質を認識する対照用ＨＭＡｂである。棒は、二連のウェルから得られた平均値を示している。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００３３】
図１４は、図１に記載の実験で用いたＣＤ８１のＥ２タンパク質への結合をブロックする抗体の能力の評価の概略図を描いている。組換えＣＤ８１を、固体表面上にコートする。次いで、Ｅ２含有タンパク質抽出物を直接加え、又は試験抗体との予備インキュベーション後に加える。結合した試験抗体Ｅ２複合体を、適当な標識した第二抗体を利用して検出する。
【００３４】
図１５は、ＨＣＶ ＨＭＡｂのサブセットが、ＣＤ８１−ＬＥＬと結合したときに、ＨＣＶ Ｅ２と反応することを示す棒グラフである。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスが感染したＢＳＣ−１細胞からの抽出物を、５μｇ／ｍｌの示したＨＭＡｂ(ｘ軸)と合せて総容積を１００μｌとして、１００ｎｇのＧＳＴ ＣＤ８１−ＬＥＬ融合タンパク質又は非組換えＧＳＴでコートしたミクロ滴定プレートのウェル中で一晩インキュベートした。ウェルを洗って、結合した抗体を、適当なアルカリホスファターゼ結合体化第二抗体及びＰＮＰＰ基質を用いて、実施例６に更に記載したように検出した。値は、ＣＤ８１により捕捉された抗体の平均ＯＤ値を、１ａ(紫色棒)、１ｂ(赤色棒)、２ａ(黄色棒)又は２ｂ(緑色棒)Ｅ２タンパク質の存在下でＧＳＴにより捕捉された抗体の平均ＯＤ値で除した値である。ＧＳＴでコートしたウェルから得られたＯＤ値は、０．０２１〜０．０８１に及んだ。
【００３５】
図１６は、図１７に記載の実験で用いたＣＤ８１のＨＣＶビリオンへの結合をブロックする抗体の能力の評価の概略図を描いている。組換えＣＤ８１を、固体表面上にコートする。ＨＣＶビリオンを、試験抗体と予備インキュベートしてから、固定化ＣＤ８１と結合させる。結合したＨＣＶビリオンの検出を定量的ＰＣＲにより測定する。
【００３６】
図１７は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５がＨＣＶビリオンのＣＤ８１への結合を阻止することを示す棒グラフを示している。ＨＣＶ １ａチンパンジー血清を１０μｇの示した抗体(ｙ軸)と合わせてから、実施例７に記載のように、ＣＤ８１−ＬＥＬでコートしたビーズに結合させた後で、多くのＨＣＶ ＲＮＡ分子がポリスチレンビーズに結合した(ｘ軸)。
【００３７】
図１８は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇを用いて、ＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止する抗体の存在を検出することができることを示す棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａが感染したＢＳＣ−１細胞の抽出物に由来するＨＣＶ １ａ Ｅ２タンパク質を、４μｇ／ｍｌのＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇのビオチン化調製物と４℃で２０分間インキュベートした。次いで、Ｅ２−ＣＢＨ−４Ｇ複合体の５０μｌのアリコートを、５００ｎｇのＧＮＡ(青色棒)又は１００ｎｇのＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ(赤色棒)でコートしたウェルに加え、そこに、４０μｇ／ｍｌの示した抗体(ｘ軸)５０μｌを加えた。Ｒ０４は、サイトメガロウイルスタンパク質を認識する対照用ＨＭＡｂである。一晩４℃でインキュベートした後に、これらのウェルを、洗って、結合したビオチン化ＣＢＨ−４Ｇを、実施例８に記載のように検出した。これらの棒は、示した抗体の存在下で二連のウェルから得られた平均シグナルを、任意の競争抗体の非存在下で得られたシグナルに対して示している。
【００３８】
図１９は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇを用いて、ＨＣＶ感染した個人に由来する血清においてＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止する抗体の存在を検出することができることを示す棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ又はＱ２ｂが感染したＢＳＣ−１細胞の抽出物に由来するＨＣＶ １ａ又は２ｂ Ｅ２タンパク質を、４μｇ／ｍｌのＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇのビオチン化調製物と、４℃で２０分間インキュベートした。左側の４つの血清は、ＨＣＶ １ａ Ｅ２タンパク質を用いて試験し、右側の４つの血清は、ＨＣＶ ２ｂ Ｅ２タンパク質を用いて試験した。これらのＥ２−ＣＢＨ−４Ｇ複合体を、次いで、５００ｎｇのＧＮＡ(青色棒)又は１００ｎｇのＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ(赤色棒)でコートしたウェルに、遺伝子型分類したＨＣＶに感染した(１ａ又は２ｂ)又は未感染(ＮＥＧ)の個人に由来する、示した血清(ｘ軸)の１／５００倍希釈物の存在下で加えた。４℃で一晩のインキュベーションの後に、これらのウェルを洗って、結合したビオチン化ＣＢＨ−４Ｇを実施例８に記載のように検出した。これらの棒は、二連のウェルから示した血清の存在下で得られた平均シグナル(最終的希釈１／１０００)を、任意の競争血清の非存在下で得られたシグナルに対して示している。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００３９】
図２０は、競争アッセイの略画である。プレートを先ず、完全長の細胞内Ｅ２を、ＣＨＯ部分のＧＮＡレクチンへの結合によってミクロ滴定プレート上に捕捉するために用いるＧＮＡレクチンでコートする。競争ＨＭＡｂをＧＮＡ捕捉されたＥ２と接触させる。ビオチン化した試験ＨＭＡｂをこれらのプレートに加え、ビオチン化試験ＨＭＡｂのＥ２への結合を、ストレプトアビジン−ＡＰ結合体を利用して検出する。試験ＨＭＡｂの結合の阻止は、同じ抗体結合ドメイン内のエピトープを示唆する。
【００４０】
図２１は、４つのＨＣＶヒトモノクローナル抗体の競争分析を示している。ＨＣＶ Ｑ１ｂ Ｅ２タンパク質は、ＧＮＡレクチンコートしたミクロ滴定プレート上に捕捉された。ビオチン化試験抗体(上記各パネルで示した)を、２μｇ／ｍｌで、示した濃度(ｘ軸)の競争ヒトモノクローナル抗体を含むウェルに加えた。結合したビオチン化試験抗体を、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ結合体を利用して検出した。競争抗体の存在下で得られたシグナルを、ビオチン化試験抗体により得られたシグナルの、競争抗体の非存在下で得られたシグナルに対するパーセントとして表した(ｙ軸)。これらの点は、２つの二連のウェルから得られた平均値を示している。これらの棒は、平均からの１標準偏差を示している。競争抗体は、左側に、記号表で同定される。
【００４１】
図２２は、ヒトモノクローナル競争分析の結果を示している。結果は、試験抗体の、如何なる競争抗体も含まないウェルに対する平均の結合パーセントである。結果は、２〜５の別個の実験から得られた平均値である。遺伝子型１ａ及び１ｂ Ｅ２タンパク質の両方を試験した。ＮＤ＝未試験
【００４２】
図２３は、ここに記載のＨＣＶ Ｅ２欠失構築物を描いている。これらのＥ２構築物の名称は、左に与えてある。ベクターｐＤｉｓｐｌａｙから導かれた配列を、中実の黒色棒として示してある。ｐＤｉｓｐｌａｙベクター内に存在するＨＡエピトープ及びｃ−ｍｙｃエピトープの位置も示してある。ＨＣＶ １ｂ Ｅ２に由来する配列を、白色四角として示してある。ＨＣＶ １ｂ Ｅ２に由来する配列を、淡灰色四角として示してある。Ｘ軸の番号付け(下記)は、ＨＣＶ−１単離株のポリタンパク質による。
【００４３】
図２４は、ＨＣＶ Ｅ２欠失構築物が効率的に発現されることを示す該構築物のウエスタンブロット分析を示している。示したＨＣＶ Ｅ２構築物(レーンの上部)をＨＥＫ−２９３細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間に、細胞質抽出物を調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。これらの分画したタンパク質を、ニトロセルロースフィルター上にトランスファーして、ＨＡエピトープに対するラットモノクローナル抗体(ＨＡ ｒＭＡｂ)又はＣＭＶに対する対照用ＨＭＡｂ(対照)とインキュベートした。結合した抗体を、適当なＡＰ結合体化抗血清を用いて検出した。ＨＥＫ＝疑似トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞。分子量マーカーの移動を、左に示してある。
【００４４】
図２５は、ある発明のヒトモノクローナル抗体の、様々なＨＣＶ Ｅ２欠失構築物との反応性を示している。ＨＥＫ−２９３細胞は、疑似トランスフェクトされ(白色棒)、又は示したＨＣＶ Ｅ２構築物をトランスフェクトされた(各グラフの記号表参照)。トランスフェクションの２４時間後に、細胞質抽出物を調製して、等量のアリコートが、上記のようにＧＮＡレクチンをコートしたミクロ滴定プレート上に捕捉された。これらの捕捉されたＥ２タンパク質を、次いで、示したＨＣＶ ＨＭＡｂ(ｘ軸)とインキュベートし、結合した抗体の量を測定した。棒は、二連のウェルから得られた平均吸光度値を表している。誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００４５】
図２６は、ＨＣＶ感染した個人に由来する血清が、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を阻止する抗体の変動するレベルを有することを示すグラフを示している。相同なＨＣＶ Ｅ２タンパク質が、ウェル上に捕捉され、それらをＨＣＶ １ａ、１ｂ、２ａ又は２ｂ血清の増大する希釈度の希釈物とインキュベートした。値は、個人の血清を用いて得られたビオチン化ＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７の結合の特異的阻止である。二連の測定から所定の希釈(ｘ軸)で得られた平均阻止パーセント(ｙ軸)をプロットしてある。８つの陰性血清について得られた平均の特異的阻止も又与えられる(用いたＥ２タンパク質の遺伝子型を示してある)。陰性血清における誤差棒は、平均からの１標準偏差を示している。
【００４６】
図２７は、ＨＣＶ感染した個人に由来する血清は、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を阻止する抗体の変動するレベルを有することを示す散布図を示している。散布図は、試験ＨＭＡｂの阻止パーセンテージを示している。示した遺伝子型(ｘ軸)のＨＣＶ血清又は対照用血清(ＮＥＧ)を、１：２００に希釈し、ビオチン化試験ＨＭＡｂ(グラフ上部に表示)と、遺伝子型分類一致したＥ２タンパク質でコートしたウェル中でインキュベートした。試験ＨＭＡｂの結合を、ストレプトアビジン結合体化ＡＰを利用して検出した。得られた結果を、競争相手の非存在下での試験ＨＭＡｂの結合と比較した。各シンボルは、個人の血清を用いて得られた結果を示している。線は、中央パーセント阻止を示している。点線は、試験ＨＭＡｂの存在につき陽性の血清と呼ぶためのカットオフを示している。
【００４７】
図２８は、慢性肝炎を有する７４個人のパネルから得られたＣＢＨ−２阻止力価のヒストグラムである。個人の血清を用いて得られたＣＢＨ−２阻止力価は、１００刻みの２０の区分け棚及び２０００を超えるすべての力価についての１つのバインドに分離された。これらの棒は、所定の区分け棚内のＣＢＨ−２阻止力価を有する血清の数を示している。ＨＣＶ １ａ／１ｂ血清の数を、黒色で示してある。ＨＣＶ ２ａ／２ｂ 血清の数を、灰色で示してある。低い(＜２００)、中位(２００〜１０００)の、及び高い(＞１０００)阻止力価を有する血清の数を、グラフの下に示してある。
【００４８】
図２９は、慢性肝炎を有する７４個人のパネルから得られたＣＢＨ−７阻止力価のヒストグラムである。個人の血清を用いて得られたＣＢＨ−７阻止力価は、１００刻みの２０の区分け棚及び２０００を超えるすべての力価についての１つのバインドに分離された。これらの棒は、所定の区分け棚内のＣＢＨ−７阻止力価を有する血清の数を示している。ＨＣＶ １ａ／１ｂ血清の数を、黒色で示してある。ＨＣＶ ２ａ／２ｂ 血清の数を、灰色で示してある。低い(＜２００)、中位(２００〜１０００)の、及び高い(＞１０００)阻止力価を有する血清の数を、グラフの下に示してある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
診断及び治療に対する用途が見出される少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルス遺伝子型に結合するモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体(「ＨＭＡｂ」)を提供する。無症候性のＨＣＶ感染を有し、結合力価の高い血清中和を有する個人の末梢Ｂ細胞に由来するヒトモノクロナル抗体(ＨＭＡｂ)のパネルを生成して特性決定した。ＨＣＶ Ｅ２に対する１１のＨＭＡｂが生成された。抗体の１つのグループは、１型及び２型ＨＣＶの遺伝子型に結合し、他の抗体は、この遺伝子型より一層少ないものに結合する。１型及び２型ＨＣＶは、一緒に、西半球及び他の地理的位置で遭遇する優性ウイルス型である。これらの抗体は、ウイルス型及び遺伝子型を超えて保存されたコンホメーションエピトープに結合する。これらの抗体は、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合し、これらの抗体のサブセットは、これらのＥ２タンパク質のヒトＣＤ８１との相互作用を阻止する。これらの抗体の様々な結合プロフィルによって、米国で遭遇するＨＣＶに対する全抗ＨＣＶ抗体を提供するために、複数の種類及び複数の遺伝子型を検出する診断アッセイが採用されうるし、他方、同時に、個人の遺伝子型をサブトラクティブ分析によって詳細に分析することができる。加えて、ヒトのものである抗体を、ＨＣＶに対する危険にある個人のための予防療法として又はＨＣＶに対する血清反応陽性の人々に対する治療として、受動免疫化に利用することができる。
【００５０】
この発明のＨＭＡｂは、ＨＣＶに対する既存のＨＭＡｂを超える幾つかの利点を提供する。非相同の一次アミノ酸配列が、依然として、免疫学的に同じ三次元タンパク質構造を規定しうるので、構造的に保存されたエピトープに結合するＨＭＡｂは、複数の、ネイティブなコンホメーションの配列的に異なるＨＣＶ遺伝子型を認識することができるが、線形の又は変性したエピトープのみを認識する抗体は、該ＨＣＶ遺伝子型を認識することができない。特に、コンホメーション的に依存性の抗ＨＣＶ Ｅ２ ＨＭＡｂは、ネイティブなＨＣＶウイルスとその細胞標的レセプターとの相互作用を効果的に邪魔する。ネイティブなＨＣＶウイルスの標的細胞レセプター(例えば、ＣＤ８１)に結合する能力を活発に邪魔するためのコンホメーション的に依存性のＨＭＡｂの利用は、感染した個人におけるウイルス負荷を減じ、未感染の個人の臓器の感染又は再感染を防ぐための(特に、最近の臓器移植のレシピエントにおいて)特異的な治療応用を有する。ＨＭＡｂのあるサブセットは、Ｅ２関連のウイルス感染を、ＣＤ８１との直接的相互作用を妨げる以外の機構によって邪魔する。この抗体のサブセットは、ウイルスの感染性を、Ｅ２の共レセプタータンパク質への結合の防止、標的細胞結合、Ｅ１及びＥ２媒介のウイルスの標的細胞への融合及びＨＣＶビリオンの脱外被に必要なＥ１及び／又はＥ２タンパク質のコンホメーション変化を含む多くの可能な機構によって邪魔する。それらは、別のコンホメーションエピトープに結合するので、Ｅ２のＣＤ８１への結合を直接邪魔するＨＭＡｂのサブセットは、治療及び診断応用の両方のために、他の機構によって感染性を邪魔するサブセットにおいてＨＭＡｂを補完する。
【００５１】
コンホメーション的限定されたウイルスエピトープを認識してウイルス／標的レセプター相互作用を邪魔するＨＭＡｂ、及びかかるＨＭＡｂに結合するウイルスコンホメーションエピトープは又、ウイルスエピトープのペプチドその他の構造模倣物を合理的にデザインするためのテンプレートとしても役立ちうる。これらのコンホメーション的に依存性の抗ＨＣＶ ＨＭＡｂにより規定される構造的分子模倣物は、ネイティブなウイルスの標的レセプターへの結合を、標的レセプター自身に結合することによりブロックするそれらの能力に用途を見出す。
【００５２】
ヒトモノクローナル抗体を生成することにより、ＨＣＶに対するヒトの免疫応答を直接分析することができる。重要なことには、ヒトモノクローナル抗体を利用することにより、非ヒト起源から生成したモノクローナル抗体に対しては活発な免疫応答が生じる(外来抗原として認識されるので)が、外来抗原としてのヒトモノクローナル抗体自身に対する免疫応答は最小となる。保存されたウイルス性コンホメーションエピトープを認識するＨＭＡｂに対する選択は、ＨＣＶ感染を改善し又は予防する試薬の、線形又は変性したエピトープにのみ結合できる抗体より一層広く且つ一層効果的な治療応用を与える。ＨＣＶ感染又は標的細胞への取り込みを予防する特性を有するとして前に記載されたすべての抗体は、超可変域として知られるＨＣＶ Ｅ２の非常に変化しやすい配列を認識する。対照的に、上記の抗体は、コンホメーションエピトープを認識し、該エピトープの大部分は、複数の異なる遺伝子型の高度に保存されたＨＣＶ Ｅ２タンパク質である。従って、ここに記載の抗体は、それらが、以前に記載された中和抗体よりも遥かに広範囲のＨＣＶ分離株に対して活性であるという利点を有する。更なる利点は、ここに記載の抗体により認識されるエピトープの高度の保存は、これらの抗体が、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質内の機能的及び／又は構造的に重要な配列を認識することを示すということである。従って、これらの抗体を用いて単離されたペプチド又は小分子は、ＨＣＶ Ｅ２内の機能的領域を標的とする可能性が高い。これは、今日まで記載された他のＨＶＣ抗体については正しくない。
【００５３】
記載した検出抗体のうちで、ＣＢＨ−４Ｇは、本質的に、複数のＨＣＶ遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２−ＣＤ８１複合体と等しい反応性を有しているが、ＣＢＨ−４Ｂは、ＨＣＶ遺伝子型１ａ及び１ｂを認識する。ＨＣＶ抗血清中に存在する邪魔する抗体のレベルが全く低いことも示されている。それ故、それらは、ミクロ滴定プレート形式で、マルチプルフローサイトメトリー分析に頼ることなく、試料中に存在する中和抗体のレベルをアッセイする直接の手段を与える。
【００５４】
主題のＨＭＡｂの開発のために採用した全体的ストラテジーは、次の通りである：(１)ＨＣＶへの露出の形跡を有する個人を同定し；(２)その末梢血に由来する抗原特異的Ｂ細胞を拡大させて、イン・ビトロで活性化し；(３)これらの細胞を、適当なマウス−ヒトヘテロミエローマとの電気融合により不滅化し；(４)関連ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを同定し；そして(５)それらの関連ハイブリドーマを、クローニングにより安定化させる。このストラテジーは、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的なＨＭＡｂの同定を生じ、その幾つかは、単一抗体を用いて、米国及び他国で遭遇した主要な遺伝子型を認識するために、１型遺伝子型１ａ及び１ｂ並びに２型遺伝子型２ａ及び２ｂのＥ２のコンホメーションエピトープに結合したが、他のものは、ＨＣＶ型又は遺伝子型の同定において有用であるように、一層少ない示した遺伝子型のものに結合した。
【００５５】
例えば、無症候性ＨＣＶ感染を有する個人に由来する末梢Ｂ細胞及び結合力価の高い血清中和を用いて、ヒトモノクローナル抗体のパネルを生成して特性決定した。初期スクリーニングは、ＨＣＶ−１分離株の同じ領域に対する９８％相同性を有するアミノ酸配列を有する遺伝子型１ａＥ２タンパク質を利用した(Lanford等、1993 Virology 197:225-235；参考として本明細書中に援用する)。このステップは、ドナーが１ｂ分離株に感染したので、遺伝子型１ａ及び１ｂの間で保存されたエピトープに対する抗体の選択に利用されるスクリーニングアプローチを偏向させた。すべてのＨＭＡｂは又、ＨＭＡｂの選択において用いられたＨＣＶ １ａ分離株と７９％相同である異質ＨＣＶ １ｂ分離株Ｑ１ｂに由来するＥ２とも反応した。組換えＥ２の変性は、１１のＨＣＶ ＨＭＡｂのうちの１０の反応性を完全に排除した。従って、ＨＭＡｂの大部分は、コンホメーションエピトープを認識した。
【００５６】
５つのＨＭＡｂ、ＣＢＨ−４Ｄ、−４Ｂ、−４Ｇ、−９及び−１７は、ＮＯＢアッセイで陰性であり、ＨＣＶ Ｅ２−ＣＤ８１複合体と反応した。これらの抗体のうちの、ＣＢＨ−４Ｇ及びＣＢＨ−９は、ＧＮＡ及びＣＤ８１捕捉アッセイの両方で、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＨＣＶ Ｅ２と反応した。他の３つの抗体ＣＢＨ−４Ｂ、−４Ｄ及び−１７は、遺伝子型１ａ及び１ｂのＥ２タンパク質に対する限られた反応性を示した。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４Ｄは、カッパー及びラムダ軽鎖をそれぞれ有し、おそらく異なるエピトープを認識する。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１７は、変性した非反応性エピトープを認識する唯一の抗体であった。従って、ＮＯＢ陰性の各抗体が、異なるエピトープを認識することは、ありそうなことである。
【００５７】
コンホメーションエピトープを認識する６つのＨＭＡｂ、ＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−１１は、ＨＣＶ １ａ Ｅ２タンパク質を用いる結合アッセイの中和で試験した際に陽性であった。これらの５つの抗体のＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ及び−８Ｅは、試験したすべての遺伝子型のＥ２タンパク質と反応した。同じ６つの抗体は、ＣＤ８１−ＬＥＬと複合体化した際に、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ又は２ｂのＥ２に結合できなかった。従って、ＨＣＶ Ｅ２内のＣＤ８１結合部位と部分的に又は完全に重複するエピトープは、天然においてコンホメーション的であり且つ高度に保存されている。ＣＤ８１結合部位における高度の配列保存は、ＨＣＶ Ｅ２とＣＤ８１の間の相互作用が生物学的に意味があるという命題と一致する。試験した４つのＮＯＢ陽性抗体の内の２つの、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５は、完全なＨＣＶビリオンのＣＤ８１への結合を妨げることができた。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７とＣＢＨ−１１は、ＮＯＢアッセイで同じ活性を有するにもかかわらず、ＨＣＶビリオンのＣＤ８１への結合を有意に阻止した。これは、ＨＣＶビリオンが、Ｅ１−Ｅ２複合体をその表面に有すると考えられるという事実、及びＥ２に存在するすべてのエピトープがかかる複合体において露出しうる訳ではないという事実を反映しうる。Ｅ１−Ｅ２複合体を用いるＨＭＡｂの試験は、この問題に光を注ぎうる。或は、ＮＯＢ及びビリオン阻止アッセイにおける異なった結果は、ＨＭＡｂのＥ２タンパク質又はＥ１−Ｅ２複合体に対する真の親和性の差異を反映しうる。何れにせよ、それにおける及びそれ自身の結合活性の強い中和は、抗体が完全なＨＣＶビリオンに結合することを保証しない。従って、イン・ビトロでＥ２タンパク質とＣＤ８１−ＬＥＬの相互作用を阻止する抗体のすべてがイン・ビボで感染性を中和する訳ではないということはありうる。
【００５８】
これらの６つのＮＯＢ陽性抗体の内の５つは、この研究に使用した５つのＨＣＶ分離株に共有されるエピトープに対するものである。他の抗体ＣＢＨ−１１は２つの１ａ分離株に対する差次的反応性を示し、該抗体は、おそらく、他の抗体とは異なるエピトープを認識するのであろう。実際、ＣＢＨ−１１の種々の１ａ分離株に対する変化しやすい反応性は、そのビリオン結合実験における陰性の結果に寄与してきたであろう。ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７のＨＣＶビリオンとの差次的反応性並びに競争実験の両者は、ＣＢＨ−２とＣＢＨ−７が異なるエピトープを認識することを示している。競争実験は又、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５とＣＢＨ−２によって認識されるエピトープが異なることをも示唆している。しかしながら、ＣＢＨ−２とＣＢＨ−８Ｅが、同じ又は非常に類似したエピトープを認識するということも可能である。ユニークなエピトープの総数の決定は、ハイブリドーマにより生成される抗体遺伝子の配列決定並びに競争的研究及び更なるＨＣＶ分離株を用いる試験を必要とする。
【００５９】
競争的分析(図２２)が、ＨＣＶ Ｅ２内に類似の結合部位を有する抗体を限定するために用いられてきた。７つのＨＭＡｂをビオチン化して、それらのビオチン化抗体のＨＣＶ Ｅ２への結合が、増大する量の競争するＨＣＶ ＨＭＡｂの存在下で測定された。有意に交叉競争した抗体は、一緒に、グループ分けされた。それらの結合部位を含むＨＣＶ Ｅ２の領域を、一連のＨＣＶ Ｅ２欠失構築物を用いて位置を限定した(図２３)。４つの競争グループが限定された。グループＩは、５つのＨＭＡｂ、ＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１よりなる。このグループの抗体は、ＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止し、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸４１１〜６４４に位置限定された保存されたエピトープを認識する。グループＩＩは、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７及びＸＴＬ−Ｕ６８よりなり、これらは、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸４７０〜６４４に位置限定される高度に保存されたエピトープを認識する。グループＩ及びＩＩの抗体は、最小の交叉競争を示した。グループＩＩＩは、３つの抗体、ＣＢＨ−４Ｇ、−４Ｂ及び−４Ｄよりなり、これらは、ＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止せず、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸４７０〜６４４のエピトープを認識する。グループＩＶは、１つの抗体ＣＢＨ−１７よりなり、これは、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸６４４〜６６１に位置限定されたエピトープを認識した。グループＩ及びＩＩの抗体は、小動物モデルにおいて、ＨＣＶの複製を阻止すること及びＥ２の超可変域の外側の２つの別個の保存された結合部位を認識することが見出されている。グループＩとＩＩの抗体の間の低レベルの競争は、相加的なウイルス中和活性へと導き、これらの抗体がインビボで相乗的に作用しうる可能性を高めるであろう。
【００６０】
これらの結果は、ＨＣＶ Ｅ２中の幾つかのコンホメーションエピトープが、基準からはずれたＨＣＶ遺伝子型の間で高度に保存されていることを示唆している。これらのエピトープを認識する抗体は、ＨＣＶ Ｅ２の構造をより一層限定するための試薬として有用である。その上、ＨＣＶビリオンのヒトＣＤ８１、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５への結合を阻止した抗体は、ウイルス中和を媒介する第一の候補である。しかしながら、ウイルス中和の真のイン・ビトロモデルの存在しないことは、選択したＨＭＡｂの、適当な動物モデルにおけるＨＣＶ感染を防止し又は改変する能力によって基本的証拠が得られることを要求するであろう。もしうまくいけば、広い反応性の中和抗体が、治療上の有用性を有することはありそうなことである。肝臓移植におけるＢ型肝炎免疫グロブリンを用いて達成された成功(Dickson, 1998 Liver Transpl.Surg.4(5 補遺1):S73-S78；Markowitz等、1998 Hepatology 28:585-589；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)と同様に、一つの可能な応用は、肝臓移植のレシピエントにおいて、広い反応性のヒト中和モノクローナル抗体を用いて、ＨＣＶ感染を抑制することである。
【００６１】
ヒトモノクローナル抗体を提供するが、他の起源からの他の抗体は、ここに記載のヒト抗体により認識されるのと同じエピトープを認識することができ、やはり、使用することができる。一般に、ネズミ科起源、マウス及びラット、ウサギ目及び家畜由来の抗体は、用途を見出す。これらの哺乳動物起源の保存された領域を有する抗体を、遺伝子工学を利用し且つここに提供するＨＭＡｂの定常領域を置換することにより作成することができ、又は以下に記載するタンパク質を、これらの動物を免疫化するための免疫原として利用し、その後、生成したＢ細胞を不滅化して、類似の広範な結合特異性を有するモノクローナル抗体を生成する不滅化細胞につき下記するようにスクリーニングすることができる。主題のＨＭＡｂを用いる競争アッセイにおけるスクリーニングにより、非ヒト抗体が同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。
【００６２】
診断のために、これらの抗体を、循環するＨＣＶビリオン、Ｅ２タンパク質又は抗Ｅ２を捕捉し及び／又は同定するために、様々な方法で利用することができる。これらの抗体は、免疫療法、予防又は治療のために利用することができる。これらの抗体は又、ＨＣＶに対するワクチンの開発にも利用することができる。
【００６３】
これらの抗体は、ＩｇＧクラスであり、特に、ＩｇＧ1である。下記は、これらの抗体の呼称及び該抗体が認識するＨＣＶ遺伝子型である。すべてのＨＭＡｂは、ＨＣＶ Ｅ２に対する良好な親和性を示し、これらの抗体は、１〜２０μｇ／ｍｌの濃度で最大のシグナルを示した。
【００６４】
【表１】
Figure 2004533991
【００６５】
これらの抗体は、それらのネイティブな形態で利用することもできるし、切り詰めて、Ｆab又はＦ(ab')2断片を与えることもできる。これらの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、多くの異なった方法で単離して改変することができる。都合のよいことに、ＲＴ−ＰＣＲを利用して、これらの遺伝子のｃＤＮＡを、更なる操作に便利な構築物にて得ることができる。重鎖及び軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を単離して、直接又は２つの可変領域の間のアミノ酸リンカーを与える３ｎヌクレオチドの鎖によって結合することができ、ここに、ｎは、１以上且つ約６０以下であって、通常、約４０以下である。この鎖長は、最適の親和性その他の特性(例えば、キレート化、表面又は他の分子への結合のためのメルカプト、カルボキシ又はアミノ基による結合など)を与えるように経験的に決定することができる。加えて、少なくともこれらの可変領域を含む遺伝子(完全なもの又は部分)を、他の配列と融合して、表面、細胞傷害性のためのトキシン、同定のための標識又はタグ、アフィニティー分離のための配列などへの結合の各々を与えることができる。
【００６６】
標識がポリペプチドである場合、その配列を、抗体鎖の一方の遺伝子と直接融合させることができる。何れにせよ、マレイミド基とのチオエーテルを形成するためのシステイン、金属をキレート化するためのポリヒスチジン／システイン又はポリヒスチジン／アスパラギン酸(様々な分子に結合されうる)、還元的活発反応においてアルデヒドとの反応のためのポリリジンのような標識を結合するための部位を提供する配列を与えることができる。標識は、酵素、キレート化用原子団、リガンド結合タンパク質への結合のためのリガンド(ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニンなど)、グリーン蛍光タンパク質などを包含することができる。大腸菌ビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質(ＢＣＣＰ)のビオチン化配列を、大腸菌中で発現され又は大腸菌の溶解物中に導入されたタンパク質のイン・ビボでのビオチン化に利用することができる。抗体を、固定化２価カチオンを含むカラムに結合させるのに適した６ヒスチジンの配列又はヒスチジンとアスパラギン酸の交互の配列を利用することができる。ＦＬＡＧエピトープＤＹＫＤＤＤＤＫ(SEQ ID NO:１３)、Ｔ１７タグ配列ＭＡＳＭＴＧＧＱＭＧ(SEQ ID NO:１４)、Ｓタグ配列ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ(SEQ ID NO:１５)、又は他の相補的結合メンバー若しくはタンパク質試薬に対する高親和性結合を与える任意の配列などの高親和性エピトープをコードする配列を用いることができる。融合タンパク質(上記のもの以外のもの)には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、肝細胞、Ｔ細胞又は他の望ましい細胞標的上で見出される細胞表面レセプターに対するリガンドなどが含まれる。かかる融合物は、通常、タンパク質の２官能性を促進する３〜５０アミノ酸のリンカーを介して結合される。これらの分子は、開裂可能なアーム(プロテアーゼ部位)又は他の手段を介して抗体に結合することができる。これらの抗体は、様々なトキシン例えばジフテリアトキシン、リシン、アブリン、リボソーム不活性化タンパク質、アポトーシスシグナリングタンパク質、孔形成タンパク質(例えば、パーフォリン)などに化学結合し又は融合させることができる。或は、これらの抗体は、キレート化毒性重金属又は放射性同位元素特にテクネチウム、放射性ヨウ素などに結合することができる。これらの抗体は、蛍光体又は化学発光分子に化学的に結合させることができる。化学的カップリングは、活性化カルボン酸基又はビオチン−Ｃ１１−ヒドロキシスクシンイミドエステル(システインと反応する)を利用するビオチン化；抗体に結合するための様々なビーズ(セファロース、アガロース、磁気、ポリスチレンビーズなど)又は表面のＣＮＢｒ活性化の利用によるカップリングなど；一般に、抗体を有用な化学部分に橋かけすることを含む、通常、リジンその他の塩基性残基を改変することにより又は遊離のスルフヒドリル基に特異的な試薬の利用によって達成されるかなり多くの他の方法 を包含することができる。
【００６７】
重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子を利用して、特に、その可変領域の超可変領域を、公知の方法により変異させて、抗体の結合親和性を増大させ又は反応性を広げることができる。ファージディスプレー法、配列のランダム又は位置指定突然変異誘発法、又は他の同様の方法を利用して、最適の結合抗体を同定するためにイン・ビトロ選択を利用することができる。或は、超可変領域のアラニン又はグリシンウォークを利用して、必須アミノ酸を同定し、次いで、それらの又は他の部位のアミノ酸を変更して、エピトープの改良された結合を同定することができる。当分野で公知の他の技術を用いて、変異させた抗体を与えることができる。
【００６８】
抗体の起源としてハイブリドーマを利用する代りに、遺伝子を単離して適当な哺乳動物宿主細胞例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＣＶ１などに導入することができる。適当な発現用プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ、ｐＩＮＤ(ＳＰ１)、ｐＲＥＰ８(これらは、すべて、カリフォルニア、Carlsbad在、Invitrogenより入手可能)などが例示される。これらの抗体遺伝子は、ウイルスベクター又はレトロウイルスベクター(ＭＬＶベースのベクター、ワクシニアウイルスベースのベクターなどを例示できる)により発現させることができる。同様に、これらの抗体遺伝子を、Ｍ１３ファージの表面上のｐＣＯＭＢシリーズのベクターを利用して、２本の独立した鎖として発現させて、それらを復元させて完全な抗体を形成することができる。或は、これらの抗体を、少なくとも可変領域を含む一本鎖として発現させることができる。これらの遺伝子は、それらを、抗体が構成的に又は誘導により発現されて分泌される適当な細胞例えばリンパ球、筋肉細胞、繊維芽細胞などに導入して、該宿主細胞の寿命に基づき、予定期間にわたる抗体の連続的又は間欠性起源を提供することによって、遺伝子治療に利用することができる。これらの遺伝子を、マーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐性)と共に、患者から採った細胞の細胞培養物に導入し、そのマーカーによって改変した細胞を選択して、該マークされた細胞を宿主に戻すことができる。ＤＮＡを、宿主細胞に、様々なプラスミドＤＮＡ、裸のＤＮＡ、ＤＮＡウイルス(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又はワクシニアウイルス)構築物又はＲＮＡウイルス(少し例を挙げれば、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキ森林熱ウイルス)を利用して導入することができる。ＤＮＡは、主題の細胞中に転写因子が存在するか又は該因子を誘導し若しくは導入することのできるプロモーターを有する構築物を有するであろうし、遺伝子は、かかるプロモーターの転写制御下にある。他の調節用配列例えば分泌用リーダー配列、エンハンサー配列、ＲＮＡ安定化配列なども又、存在しうる。
【００６９】
診断目的のために、これらの抗体を、Ｅ２タンパク質の検出、ＨＣＶ遺伝子型の識別、ビリオン及び抗体の検出のために、様々な形式で利用することができる(例えば、米国特許第５，６９５，３９０号(参考として、本明細書中に援用)を参照されたい)。これらの抗体は、個別に又は他の主題グループ即ち他の抗体と又はＥ２上に存在するグリコシル基に結合するレクチン、ビリオンエンベロープタンパク質若しくはＨＣＶ Ｅ２が複合体形成する他のタンパク質(例えば、ＨＣＶ Ｅ１)と組み合せて利用することができる。診断目的のために、様々な標識を用いることができる(その大部分については、前述してある)。これらには、蛍光体、化学発光体、放射性同位元素、酵素、粒子例えばコロイド状炭素及び金、ラテックス粒子など、高親和性レセプターが存在するリガンド、及び活性化されて検出可能なシグナルを与えることのできるプロラベルが含まれるが、これらに限られない。
【００７０】
一具体例において、表面を、遊離の若しくは循環するタンパク質としての又は完全な若しくは部分的に完全なビリオンの部分としてのＨＣＶ抗原と結合するタンパク質でコートする。１型及び２型ＨＣＶの両方、又はレクチン例えばGalanthus nivalisレクチンに結合する主題の発明の抗原を利用することができる。このアッセイは、この表面を、遊離の又はビリオンに含まれるタンパク質を含みうる媒質と接触させることを含み、ここに、この媒質は、１つ以上の遺伝子型の公知のＥ２の試料又は溶液であってよい。インキュベーション及び非特異的結合タンパク質除去のための洗浄の後に、このアッセイを、何をアッセイするかに依って、様々な仕方で行なうことができる。血清反応陽性の疑いのある血液試料をアッセイする場合には、その試料を、Ｅ２タンパク質の層に加え、インキュベートして、洗浄し、このタンパク質層に結合したヒト抗体の存在を測定する。標識した抗(ヒト抗体)(主題の抗体が初期に用いられてきた場合、主題の抗体のイソ型に対するもの以外)を利用することができる。血清反応陽性の患者中の抗体に関するアッセイにおいて、主題の抗体を、かかる患者の血清中の任意のヒト抗ＨＣＶを検出するために用いられる同じ試薬と共に、対照として利用することができる。試料中の抗体の特異性を、抗(ヒト抗体)から差次的に標識されて、試料中の抗体によりブロックされるかどうかを測定する主題の抗体を利用することにより確認することができる。
【００７１】
試料をＨＣＶ Ｅ２タンパク質についてアッセイする場合、検出は、標識した主題の抗体を用い、その選択は、Ｅ２タンパク質の遺伝子型分類に関心があるのか該タンパク質の同定に関心があるのかに依存する。非特異的結合抗体を洗浄した後に、標識抗体の存在を、公知技術による標識の存在の検出によって測定する。或は、主題の抗体を表面に結合させる場合には、Ｅ２に対する標識レクチンを用いて、Ｅ２タンパク質の存在を検出することができる。
【００７２】
主題の抗体を利用して、血清中の抗体、モノクローナル抗体、遺伝子工学により発現された抗体を含む他の抗体の反応性を測定することができる。コンホメーション的に保存されたエンベロープタンパク質も又用途を見出しうるが、望ましくは、ＨＣＶタンパク質よりも完全なビリオンを利用する。ビリオン捕捉のためには、例えば、Kimura等、1998 J.Med.Virology 56:25-32；Morita等、1996 Hapato-Gastroenterology 43:582-585；Sata等、1993 Virology 196:354-357；及びHijikata等、1993 J.Virology 67:1953-1958(各々を参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。一つのプロトコールは、固体支持体をレクチン(例えば、ＧＮＡ)でコートしてから、その表面を完全なＨＣＶビリオンを含む媒質と、例えば血清反応陽性の患者の血清と接触させることである。これらのビリオンを破壊しうる添加剤(例えば、洗剤)は、避けるべきである。この媒質をインキュベートし、非特異的結合成分を除去した後に、これらのビリオンを、主題の発明の抗体及び試料の抗体と接触させることができる。これは、同時に行なうこともできるし、連続して行なうこと(試料を最初に加える)もできる。他の抗体による置換に感受性の量の主題の抗体を利用する。かかる量は、経験的に決めることができ、一連の試験において、主題の抗体の種々の量を用いることを希望することができる。試料の非存在下及び存在下で得られたシグナルを知ることにより、試料中のこれらの抗体の反応性又は結合親和性を測定することができる。様々な技術を利用して、これらのビリオンに結合した主題の抗体の量を測定することができる。主題の抗体を、例えばビオチン又はジゴキシゲニンで標識した場合には、蛍光体又は基質が検出可能なシグナルを生成する酵素で標識されたストレプトアビジン又は抗(ジゴキシゲニン)は、主題の抗体の量の測定に役立ちうる。
【００７３】
レセプター(抗体又はレシチン)を、直接又は間接に(間接には、ビリオンに結合したレセプターの空の部分に結合することのできるリガンド−核酸配列結合体を意図する)ＤＮＡ配列で標識する場合には、標識配列に相同なプライマー及び標準的なＰＣＲ条件を用いて、その配列を拡大することができる。次いで、このＤＮＡを、別のハイブリダイゼーション反応において又はアガロースゲル電気泳動により検出することができる。或は、増幅される配列に相同な、光放出標識、蛍光体又は発光体を一端に有し且つ消光部分を他端に有する標識した内部オリゴヌクレオチドプローブを利用して、Ｔａｑｍａｎアプローチを利用することができる。この断片が増幅されるにつれて、Ｔａｑポリメラーゼの５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性は、低下し、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、蛍光体をクエンチャーから自由にし、それにより、その蛍光体は、今や、媒質の適当な波長の光の照射により検出されうる。
【００７４】
サイクリングプローブ技術を実施するのに適した標識オリゴヌクレオチドプローブも利用することができる。１つのオリゴヌクレオチドは、この標識に相同で４５℃以下のＴＭを有する約１５〜２０デオキシヌクレオチドから構築される、この標識に相同で４５℃以下のＴＭを有する約５リボヌクレオチド以下の配列。完全なオリゴヌクレオチドは、６０℃を超えるＴＭを有する。このオリゴヌクレオチドは、更に、上記のように光放出標識及びクエンチャー標識により改変される。結合した標識に対して過剰のオリゴヌクレオチド構築物を加え、それを結合した標識に約５５℃の温度でハイブリダイズさせた後に、ＲＮアーゼＨ(５５℃で活性)を加えてリボヌクレオチドを分解する。分解に際して、光放出標識は、放出され、クエンチャーはなく、照射又は活性化に際して、その光放出を測定する。
【００７５】
或は、転写媒介増幅(ＴＭＡ)を用いることができる。この場合に、結合したオリゴヌクレオチド標識は、Ｔ７ポリメラーゼ又は他の慣用のポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含む。Ｔ７又は他の適当なポリメラーゼ及びｒＮＴＰの適当な条件下での添加は、オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドの転写を生じ、それは、次いで、任意の慣用の手段(例えば、電気泳動)により検出することができる。
【００７６】
標識した主題の抗体は、生検材料のＨＣＶの存在についてのアッセイで利用することができる。標識した抗体を、一種以上の主題の標識した抗体の溶液を用いて、固定化された生検材料例えば肝臓スライスと共にインキュベートすることができる。非特異的に結合した抗体を洗浄除去した後に、生検組織の細胞に結合した抗体の存在を、標識の性質に依って、検出することができる。
【００７７】
コンホメーション的に保存されたＥ２遺伝子型タンパク質１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂ(後者２つは、新規な発現組成物である)を、ワクシニアウイルス構築物から発現されたタンパク質として提供する。それらの製法は、実験部に記載してある。これらのタンパク質は、Ｅ１及びＥ２の両方をコードする遺伝子から調製することができる(この場合、得られた融合タンパク質を処理して、もはや共有結合してないが、複合体として存在しうる２つのタンパク質を与える)が、Ｅ１タンパク質のアミノ酸なしで得られる。これらのタンパク質は、溶解物から、又は構築物が分泌を可能にする媒質から単離することができる。このタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又は非変性ゲル電気泳動を利用して、容易に精製することができる。これらのタンパク質は、９５ｗｔ％を超える純度(通常、少なくとも９９ｗｔ％)で得ることができる。これらのタンパク質は、ＨＣＶ感染患者由来の血清の遺伝子型分類のためのアッセイ、親和性及び特異性についてのモノクローナル抗体のスクリーニングで利用することができ、薬物の評価に利用することができ(この場合、これらのタンパク質は、薬物の標的である)、抗血清及びモノクローナル抗体の製造のための哺乳動物宿主の免疫化などに利用することができる。それらの診断アッセイにおける利用は、既に検討した。
【００７８】
これらの抗体を利用して、それらが結合するＥ２タンパク質における構造的エピトープを同定することができる。コンホメーションエピトープを同定するためのモノクローナル抗体を利用する２つの基本的アプローチを採用することができる。第一に、ＨＣＶ分離株の天然変異体又は該分離株の突然変異分析を利用して、領域を同定し、最終的に、これらのモノクローナル抗体により認識されるエピトープに含まれる個々のアミノ酸を同定することができる(Schwartz等、1999 J.Mol.Biol.287:983-999；参考として、本明細書中に援用する)。これらの抗体を種々のＨＣＶ Ｅ２分離株に対してスクリーニングし、個々の抗体と選択的に非反応性である分離株を同定する。例えば、ＨＭＢＡｂ ＣＢＨ−１１のＨＣＶ Ｅ２タンパク質Ｑ１ａとの反応性は、ＨＣＶ Ｅ２ Ｑ２ａとの反応性と比較して低い(図９)。次いで、「キメラの」Ｅ２エンベロープタンパク質を構築し、該キメラの部分は、一のＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質に由来し、他の部分は、他のＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質に由来する。これらのキメラのＥ２タンパク質は、重複断片のＰＣＲ増幅により及び／又は両Ｅ２タンパク質に共通する制限部位の利用により構築される。別法は、バイオテクノロジの会社のMaxy-Genにより開発されたＤＮＡシャフリングである。種々のキメラＥ２タンパク質の、種々のモノクローナル抗体との認められた結合反応性を概観することにより。コンホメーションエピトープの形成に決定的なＥ２タンパク質中のアミノ酸領域が同定される。一度決定的な領域が同定されれば、異なる遺伝子型の間で異なる個々のアミノ酸を変異させて、反応性のＥ２配列を組み立てる。完全な反応性を回復した変異体は、エピトープの形成に関与するアミノ酸を同定する。
【００７９】
コンホメーションエピトープを限定するための第二のアプローチは、ＨＣＶ Ｅ２の所望の配列をコードする一連の重複する１０〜１５残基長のエピトープを合成することである。次いで、これらのエピトープを、高濃度の抗体(しばしば、１００μｇ／ｍｌ以上)を利用して、これらの抗体に対してスクリーニングする。完全なコンホメーションエピトープを含む個々の領域は、しばしば、検出可能な抗体との残留結合活性を保持する。一度これらの領域が同定されれば、それらを、１０〜１５残基のペプチドを含む突然変異研究を利用して、このペプチドの関係において、又はコンホメーション的に完全なＨＣＶ Ｅ２タンパク質中に置換を導入することによって確認することができる。この方法論の変形は、Reineke等、1999 Nature Biotechnology,17:271-275(参考として、本明細書中に援用する)に記載されている。
【００８０】
主題の抗体は、ミモトープのスクリーニングにも利用することができる。ミモトープは、ファージディスプレーを利用して製造することができ、これらのペプチドは、主題の抗体を利用してスクリーニングすることができる(Livnah等、1996 Science 273:464-471；Prezzi等、1996 J.Immunol.156:4504-4513；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。コンホメーション的に保存されたＨＣＶエピトープを認識する抗体は、コンホメーションエピトープ又はミモトープのペプチド又は非ペプチド構造模倣物の合理的デザインのためのテンプレートとして利用することができる。
【００８１】
ミモトープの生成は、生物学的に重要である。コンホメーション的に規定されたウイルスエピトープの構造を模倣することにより、ミモトープは、そのウイルスの標的レセプターに結合する能力をそのレセプター自身に結合することにより邪魔することができる。例えば、モノクローナル抗体と主要壊死因子(ＴＮＦ)の間の界面を規定する解明された結晶構造の分析は、ＴＮＦレセプターに結合することによりＴＮＦの生物学的活性と拮抗することのできる非ペプチド性模倣物の合理的デザインを可能にした(Takasaki等、1997 Nat.Biotech.15:1266-1270；参考として本明細書中に援用する)。ペプチド構造模倣物のデザインにおいて利用するための一次アミノ酸配列からのタンパク質の折り畳まりを合理的に推論するために使うことのできるコンピューター使用技術は、Teichmann等、1999 Curr.Opin.Struct.Biol.9:390-399(参考として本明細書中に援用する)に総説されている。コンホメーション的に保存されたエピトープを構造的に設計する際に利用するためのコンピュータープログラムの実際的応用は、Schwarz等、1999 J.Mol.Biol.287:983-999(参考として本明細書中に援用する)に記載されている。抗体エピトープのペプチド構造模倣物を合理的に造るための別法には、不連続な抗体結合部位の直線的表現としてデザインされた合成ペプチドの組織的置換が含まれる(Reineke等、1999 Nat.Biotech.17:271-275；参考として本明細書中に援用する)。
【００８２】
モノクローナル抗体に対する特異的親和性を有し且つコンホメーション的に完全なＥ２タンパク質のエピトープとそれ自身で又はＥ１と複合体形成することにより競争するペプチド及び他の小分子を、診断アッセイにおいて、ワクチンとして利用し、遺伝子型を限定するための競争アッセイにおいて、特異的ＨＣＶエピトープに対する抗体の製造のための免疫化に利用することなどができる。例えば、Puntoriero等、1998 EMBO J.17:3521-3533；Meola等、1995,J.Immunol.154:3162-3172；Tafi等、1997 Biol.Chem.378:495-502を参照されたい。
【００８３】
コンホメーション的に保存されたＨＣＶエピトープの構造的模倣物を効果的に造るための他のアプローチは、コンホメーション的に依存性の抗ＨＣＶ ＨＭＡｂに対する抗イディオタイプ抗体を生成することである。抗イディオタイプは、ネイティブなウイルスの標的レセプターへの結合を効果的にブロックすることができる(Chanh等、1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3891-3895；Kopecky等、1999 Intervirol.42:9-16；Xue等、1993 J.Gen.Virol.74:73-79；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。抗ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、５、４Ｂ、４Ｄ、４Ｇ、７、８Ｃ、８Ｅ、９又は１１の何れか一つのコンホメーション的結合部位を認識する抗イディオタイプ抗体は、ウイルス感染を、Ｅ２の標的細胞タンパク質への結合を邪魔するか又は標的細胞へのビリオンの付着を邪魔することによってさえも防ぐことができた。
【００８４】
主題の抗体は、ウイルス負荷を減じ、ウイルスの標的タンパク質への結合を阻止し、ウイルス媒介の標的細胞との融合を阻止し、そして細胞感染に必要なウイルスエンベロープタンパク質におけるコンホメーション的変化を邪魔することによって、予防的治療又はＨＣＶ感染の治療に用途を見出す。用いられる組成物は、単一のコンホメーション的エピトープに対するモノクローナル抗体であってよいし、又は、１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質の別のコンホメーション的エピトープを認識する相補的モノクローナル抗体の混合物(従って、感染過程の複数の機構を同時に邪魔する)であってもよい。
【００８５】
身体の成分の、特に、ＨＣＶに感染した患者の身体成分のウイルス負荷を減じるために、患者の血液を、ＨＣＶを補足するための表面に結合させた抗体を含む装置を通過させる。例えば、米国特許第５，６９８，３９０号及び４，６９２，４１１号(これらの各々を、参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。文献中に見出される様々な他の装置を主題の抗体と共に利用して、同様の結果を達成することができる。身体成分は、生物学的液体、組織、器官例えば肝臓などであってよい。
【００８６】
これらの抗体は又、受動免疫療法又は他のイン・ビボの治療に利用することもできる(例えば、Piazzi等、1997 Arch Intern Med.157:1537-1544；Farci等、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15394-15399；al-Hemsi等、1996 Clin.Transplant.10:668-675；Krawczynski等、1996 J.Infect.Dis.173:822-828を参照されたい；これらの各々を、参考として本明細書中に援用する)。かかる治療用途のために、これらの抗体を、任意の慣用の方法により注射用に又は静脈投与用に配合することができる。様々な媒質例えばリン酸緩衝塩溶液、塩溶液などを利用することができる。これらの抗体の量は、感染レベル、抗体の親和性、投与方法、投与の頻度、患者の応答、他の治療剤の利用などに依って変化しうる。一般に、投与される抗体の量は、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲にある。例えば、Andrus等、1998 J.Infect.Dis.177:889-97及びKreil等、1988 J.Virology 72:3076-3081 (これらの各々を参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。
【００８７】
チンパンジーは、ＨＣＶワクチン及び治療剤のスクリーニングの受け入れられた動物モデルである。例えば、Farci等、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15394-15399；Farci等、1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7792-7796；Farci等、1992 Science 258:135-140；Krawczynski等、1996 J.Infect.Dis.173:822-828；Bassett等、J.Virology 72:2589-2599(これらの各々を、参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。これらの抗体の効力を、ＨＣＶ ＲＮＡの存在及び力価につき、定量的ＰＣＲ法を利用してモニターすることによって測定することができる。ウイルス負荷の上首尾の減少又は試験動物若しくは患者における感染の予防は、血清中のＨＣＶ ＲＮＡの減少又は排除として反映される。酵素的試験例えばアラニンアミノトランスフェラーゼの測定及び／又は順次的パンチ針肝臓生検の利用も又、効力を試験するために用いられ、何れかの評価における改善は、ウイルスに誘導される肝臓のダメージの減少を示す。
【００８８】
ワクチン
ＨＣＶに対するワクチンを配合するために、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質の少なくとも一つのコンホメーション的エピトープを模倣する任意の薬剤を利用することができる。例えば、この薬剤は、ペプチド、タンパク質、小分子、ミモトープ、有機化合物、有機金属化合物、又は向き化合物などであってよい。好適具体例において、このワクチンにおいて典型的なエピトープには、感染を阻止することの知られた抗体が向かうものが含まれる。他の好適具体例において、このワクチンにおける典型的なエピトープには、ウイルスの種々の遺伝子型間で又は種々のウイルス株の間で保存されているものが含まれる。本発明の特に好適な具体例において、ＨＣＶのＥ２のコンホメーション的に規定されたエピトープを含むペプチド又はタンパク質は、ＨＣＶの感染を防止し又はＨＣＶ感染を治療するためのワクチンの配合において有用である。これらのペプチド又はタンパク質は、好ましくは、１００アミノ酸長未満であり、一層好ましくは、５０アミノ酸長未満である。特に好適な具体例において、ワクチンの配合に用いられるべきペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質のペプチド断片である。好ましくは、このペプチドは、ネイティブなＥ２タンパク質における折り畳まりと類似の仕方で折り畳まり、それ故、コンホメーション的エピトープの３次元構造を保存している。
【００８９】
このワクチンは又、抗体が向かうコンホメーション的エピトープを有する結合されたペプチドに相当するタンパク質を含むこともできる。多量体を形成する幾つかの異なるペプチドを利用して、各ペプチドが、異なるエピトープを含むようにし、又は同じペプチドを多量体中で２つ以上利用することができる。
【００９０】
この発明のペプチドは、メリーフィールド固相化学を含む当分野で公知の任意の方法を利用して合成することができる。これらのペプチドは又、Ｅ２タンパク質の開裂及び精製によってえることもできる。これらのペプチドは、作ることができ、大腸菌、酵母(例えば、Ｓ．セレビシエ)、昆虫細胞(例えば、Ｓｆ９細胞)又は哺乳動物細胞(例えば、ＣＨＯ細胞)において、当分野の任意の利用可能な技術(Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版、1989；Miller & Calos編、Gene Transfer vectors for Mammalian Cells, 1987；Ausubel等編、Current Protocols in Molecular Biology, 1987；これらの各々を、参考として本明細書中に援用する)を利用して生成することができる。これらのペプチドを改変して、それらの免疫原性、水溶液中での溶解度を増大させ又はそれらの正しく折り畳まる性質を増強することができる。例えば、ペプチドは、グリコシル化し、ファルネシル化し、ヒドロキシル化し、還元し、酸化することなどができる。
【００９１】
特に好適な具体例において、このペプチドは、ＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸４１１〜６４４を含む。他の具体例において、このペプチドは、ＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸４７０〜６４４を含む。更に別の具体例において、このペプチドは、ＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸６４４〜６６１を含む。当業者は認めるであろうが、他の遺伝子型のＨＣＶからのＥ２タンパク質の類似のアミノ酸配列を利用してよい。類似の配列は、種々の株又は遺伝子型のＨＣＶに由来するＥ２タンパク質の複数の配列を整列させることにより決定することができる。所望のエピトープを保存している相同な配列も又、ワクチンの配合に利用することができる。好ましくは、これらの配列は、ＨＣＶ １ｂ Ｅ２タンパク質由来のネイティブな配列に対して少なくとも５０％相同であり、一層好ましくは少なくとも６０％相同であり、最も好ましくは少なくとも７０％相同である。
【００９２】
特に好適な具体例においては、このペプチド又はペプチドの集合を、アジュバント及び適宜他の製薬上許容しうる賦形剤と混合してから、個人に投与する。
【００９３】
アジュバント
本発明の実施において利用される組成物は、一種以上のアジュバント又はサイトカインを含むことができ、又はこれらを含むプロトコールの部分として投与されうる。任意のアジュバントを、本発明によって利用することができる。多数のアジュバント化合物が知られており；多くのかかる化合物の有用な大要は、米国立衛生研究所により用意されており、world wide web (http:/www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf)にて見出すことができ(参考として本明細書中に援用する)；Allison Dev.Biol.Stand.92:3-11,1998；Unkeless等、Annu.Rev.Immunol.6:251-281,1998；及びPhillips等、Vaccine 10:151-158,1992(これらの各々を、参考として本明細書中に援用する)も参照されたい。数百の異なるアジュバントが、当分野では知られており、本発明の実施において利用することができよう。
【００９４】
投与
当業者は、本発明による個人に投与すべき抗体又はワクチンは、様々な経路、プロトコール及び投与養生法の何れかによって投与することができるということを認めるであろう。公知の投与経路には、例えば、静脈(ＩＶ)、腹腔内(ＩＰ)、胃内(ＩＧ)、皮下(ＳＱ)、筋肉内(ＩＭ)、口内(ＰＯ)、直腸(ＰＲ)、くも膜下、膣内、鼻内、経皮、皮内投与などが含まれる。一般に、静脈、筋肉内、経皮、皮内及び口内送達が好ましい。
【００９５】
医薬組成物
本発明による利用のための医薬組成物は、製薬上許容しうる賦形剤又はキャリアーを含む。ここで用いる場合、用語「製薬上許容しうるキャリアー」は、無毒性の、不活性の固体の、半固体の又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は任意の種類の配合助剤を意味する。製薬上許容しうるキャリアーとして役立ちうる材料の幾つかの例は、糖類例えばラクトース、グルコース及びシュークロース；澱粉例えばトウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉；セルロース及びその誘導体例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロースアセテート；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤例えばココアバター及び坐薬ワックス；油例えば落花生油、綿実油；紅花油；胡麻油；オリーブ油；コーン油及び大豆油；グリコール例えばプロピレングリコール；エステル例えばエチルオレエート及びエチルラウレート；寒天；緩衝剤例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張塩溶液；リンゲル溶液；エチルアルコール及びリン酸緩衝溶液であり、並びに他の無毒性の相容性潤滑剤例えばラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム並びに着色剤、離型剤、被覆剤、甘味料、調味料及び香料、防腐剤及び抗酸化剤も又、配合者の判断により組成物中に存在してよい。この発明の医薬組成物は、ヒト及び／又は動物に、経口投与、直腸投与、非経口投与、槽内投与、膣内投与、鼻内投与、腹腔内投与、局所投与(粉末、クリーム、軟膏及び滴剤などによる)、頬内投与、又は口内若しくは鼻内スプレーすることができる。
【００９６】
口内投与用の液体投薬形態には、製薬上許容しうるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分に加えて、これらの液体投薬形態は、当分野で一般的に用いられる不活性な希釈剤例えば水及び他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及び胡麻油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル並びにこれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤に加えて、口内用組成物は、アジュバント例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、調味料及び香料をも含むことができる。
【００９７】
注射可能な製剤、例えば、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁液を、適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を利用する公知技術により配合することができる。この無菌の注射可能な製剤は又、無毒性の、非経口的に許容しうる希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液(例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液)、懸濁液又はエマルジョンであってもよい。許容しうるビヒクル及び溶媒のうちで、使用できるのは、水、リンゲル溶液、Ｕ.Ｓ.Ｐ.及び等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の、固定油が、溶媒又は懸濁媒として慣用される。この目的のためには、任意の温和な固定油(合成のモノ又はｈジグリセリドを含む)を用いることができる。加えて、脂肪酸例えばオレイン酸を注射用製剤に利用することができる。
【００９８】
これらの注射可能な配合物は、例えば、細菌保持性フィルターを通して濾過することにより滅菌し、又は殺菌剤を混合することにより滅菌することができ、該殺菌剤は、無菌の固体組成物であって、無菌水又は他の無菌の注射用媒質に使用前に溶解させ又は分散させることができる。
【００９９】
薬剤の効果を引き延ばすために、皮下注射又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅くすることは、しばしば望ましい。これは、水溶性の乏しい結晶性又は非晶質物質の液体懸濁液の利用により達成することができる。この薬剤の吸収速度は、次いで、その分解速度に依存し、該速度は、結晶寸法及び結晶型に依存しうる。或は、非経口投与された薬物形態の遅延した吸収は、その薬物を油ビヒクルに溶解させ又は懸濁させることにより達成される。注射可能なデポー剤型は、この薬物が生物分解性ポリマー例えばポリラクチド−ポリグリコリドにマイクロカプセル封入されたマトリクスを形成することにより作成される。薬剤のポリマーに対する比及び使用する特定のポリマーの性質に依存して、この薬剤の放出速度は、制御することができる。他の生物分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)及びポリ(無水物)が含まれる。注射可能なデポー剤配合物は又、薬物を、身体の組織と適合性のリポソーム又はミクロエマルジョン中に捕捉することにより調製することもできる。
【０１００】
直腸又は膣内投与用の組成物は、好ましくは、坐薬であり、それは、この発明の化合物を適当な非刺激性の賦形剤又はキャリアー例えばココアバター、ポリエチレングリコールと、又は周囲温度では固体であるが体温では液体となりそれ故直腸又は膣内腔で溶融して活性化合物を放出する坐薬ワックスと混合することにより調製することができる。
【０１０１】
経口投与用の固体投薬形態には、カプセル、錠剤、ピル、粉末及び顆粒が含まれる。かかる固体投薬形態において、活性化合物は、少なくとも一種の不活性な、製薬上許容しうる賦形剤又はキャリアー例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム及び／又はａ）充填剤若しくは増量剤例えば澱粉、ラクトース、シュークロース、グルコース、マンニトール及び珪酸、ｂ）バインダー例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、シュークロース及びアカシア、ｃ）湿潤剤例えばグリセロール、ｄ）崩壊剤例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ澱粉又はタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種の珪酸塩及び炭酸ナトリウム、ｅ）溶解遅延剤例えばパラフィン、ｆ）吸収促進剤例えば第四アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート、ｈ）吸収材例えばカオリン及びベントナイトクレー、及びｉ）潤滑剤例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、並びにこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤及びピルの場合には、投薬形態は、緩衝剤を含むこともできる。
【０１０２】
類似の型の固体組成物も又、ラクトース又は乳糖並びに高分子量のポリエチレングリコールなどの賦形剤を利用する軟及び硬質充填ゼラチンカプセルにおいて充填剤として用いることができる。
【０１０３】
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル及び顆粒の固体投薬形態は、医薬配合技術において周知のコーティング及びシェル例えば腸溶性コーティング及び他のコーティングを伴って調製することができる。それらは、適宜、不透明剤を含むことができ、活性成分を、腸管のある部分だけで又は該部分で優先的に、適宜遅延した仕方で放出する組成であってもよい。用いることのできる包埋組成物の例には、ポリマー物質及びワックスが含まれる。
【０１０４】
類似の型の固体組成物も又、ラクトース又は乳糖並びに高分子量のポリエチレングリコールなどの賦形剤を利用する軟及び硬質充填ゼラチンカプセルにおいて、充填剤として用いることができる。
【０１０５】
これらの化合物は又、上記の一種以上の賦形剤を用いて、マイクロカプセルに封入された形態であってもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル及び顆粒の固体投薬形態は、医薬配合技術において周知のコーティング及びシェル例えば腸溶性コーティング、放出制御コーティング及び他のコーティングを伴って調製することができる。かかる固体投薬形態において、活性化合物は、少なくとも一種の、不活性な、希釈剤例えばシュークロース、ラクトース又は澱粉と混合することができる。かかる投薬形態は又、普通のことであるが、不活性希釈剤以外の追加的物質例えば錠剤化潤滑剤及び他の錠剤化助剤例えばステアリン酸マグネシウム及び微晶質セルロースを含むこともできる。カプセル、錠剤及びピルの場合には、これらの投薬形態は、緩衝剤をも含むことができる。それらは、適宜、不透明剤を含むことができ、活性成分を、腸管のある部分だけで又は該部分で優先的に、適宜遅延した仕方で放出する組成であってもよい。用いることのできる包埋組成物の例には、ポリマー物質及びワックスが含まれる。
【０１０６】
発明の医薬組成物の局所投与又は経皮投与のための投薬形態には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入又は絆創膏が含まれる。活性成分は、無菌条件下で、製薬上許容しうるキャリアー及び任意の必要な防腐剤又は必要でありうる緩衝剤と混合される。
【０１０７】
これらの軟膏、ペースト及びゲルは、この発明の活性化合物に加えて、賦形剤例えば動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含むことができる。
【０１０８】
粉末及びスプレーは、この発明の化合物に加えて、賦形剤例えばラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含むことができる。スプレーは、更に、通例の推進剤例えばクロロフルオロハイドロカーボンを含むことができる。
【０１０９】
経皮パッチは、身体への化合物の制御された送達を与えるという追加的利点を有する。かかる投薬形態は、化合物を適当な媒質中に溶解させ又は分散させることにより作成することができる。吸収増進剤を利用して、皮膚を横切る化合物の流れを増大させることもできる。その速度は、速度制御膜を与え又は化合物をポリマーマトリクス若しくはゲル内に分散させることにより制御することができる。
【０１１０】
患者の治療
本発明は又、ＨＣＶ感染患者を階層分類し、適宜、治療するする方法をも提供する。特に好適な具体例において、その治療養生法は、特に、個人に適している。治療すべき患者を準備し、血清試料をその患者から得る。次いで、血清を、特定の抗体例えば中和抗体又はＨＣＶタンパク質の特定の領域若しくはエピトープに結合する抗体の存在につき分析する。この出願に記載したものを含む当分野で公知の任意の方法(例えば、ＥＬＩＳＡ、競争アッセイ)を利用して、検出すべき抗体の存在を測定することができる。患者の血清中の抗体のレベルに基づいて、その患者のための治療をデザインすることができる。例えば、天然のレセプターに対するビリオンの結合を邪魔することが知られている抗体を有しない患者は、この型のモノクローナル抗体を用いて治療することができる。一つの特に好適な具体例において、ＨＣＶ感染患者由来の血清は、もし患者の血清の１／２００倍以上の、一層好ましくは１／５００倍以上の、最も好ましくは１／１０００倍以上の希釈においてＥ２結合の５０％以上の阻止が得られたならば、競争抗体の存在につき陽性であるとみなす。
【０１１１】
この方法の利点の一つは、治療が、治療を受ける特定の個人に合せて調整されるということである。患者により必要とされるが、自然には患者によって生成されない抗体のみを投与する。これは、必要な治療剤の投与に由来する副作用の危険を回避し又は減少させる。この方法は又、かかる治療の恩恵を受けないであろう患者を治療する費用をもなくすであろう。例えば、もし患者が、Ｅ２の特定のエピトープに対する抗体を既に生成しているならば、外因的にそのエピトープに対するヒトモノクローナル抗体を投与する必要はないであろう。
【０１１２】
他の特に好適な具体例において、この治療は、患者に欠如していることが見出された抗体の産生を誘導するようにデザインされたワクチンの投与を含むことができる。特に好適な具体例において、このワクチンは、エピトープ又はそのミモトープであって、その個人において該エピトープ又はそのミモトープに対して抗体が自然には生成されない当該エピトープ又はそのミモトープを含む。かかるワクチンの投与は、患者の免疫系による、投与されたエピトープに対する一組の抗体の産生の開始を誘導するであろう。
【０１１３】
本発明のこれらの及び他の面は、下記の実施例の考察により更に真価を認められよう。該実施例は、この発明のある特定の具体例を説明するためのものであり、請求の範囲に規定した発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０１１４】
実施例１
複数の遺伝子型に由来するＨＣＶ Ｅ２タンパク質のワクシニアウイルスにおける製造
ＨＣＶ血清の反応性を分析してＨＣＶ−ＨＭＡｂ反応性の広さを試験するために、ＨＣＶの完全なコード配列を、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂ
の分離株からクローン化し、ＨＣＶ陽性の血清からＰＣＲ増幅して、ｐＶＯＴＥ(Ward等、1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6773-6777；参考として本明細書中に援用する)トランスファーベクター(ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂに対して、それぞれ構築物Ｑ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ及びＱ２ｂ)を利用して、ワクシニアウイルスにより発現させた。遺伝子型選択は、米国におけるＨＣＶ感染した個人間での逸脱及び頻度(Mahaney等、1994 Hepatology 20:1405-1411；参考として本明細書中に援用する)に基づいた。オリゴヌクレオチドプライマーをデザインして、Ｅ１の最後の３９アミノ酸、Ｅ２／ｐ７のすべて及びＮＳ２のＮ末端の９８アミノ酸を発現する断片を増幅した。表２(SEQ ID NO:１８〜２７)を参照されたい。
【０１１５】
従って、ＨＣＶ ＲＮＡについて陽性の個々のＰＣＲに由来する血漿のアリコートを得て、製造業者(Innogenetics, ベルギー国、Ghent在)の指示に従って行なうＩｎｎｏＬｉｐａ ＨＣＶ遺伝子型分類アッセイを利用して遺伝子型分類を行なった。ＲＮＡを、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂに感染した個人に由来する１２５μｌの血漿から、ＰｕｅｒｅｓｃｒｉｐｔＲＮＡキットを製造業者(GentraSystems, ミネソタ、Minneapolis在)の指示に従って利用して調製した。ＲＮＡペレットを、２５μｌのＲＮＡアーゼを含まないＨ2Ｏに懸濁して、１０μｌを逆転写ＰＣＲにかけた。逆転写反応を、ＭＭＬＶ逆転写酵素を利用して、リバースＨＣＶ特異的プライマーＨＣＶ Ｅ２−Ｒ１ 5'-CGC GCA CrA AGT AsG GyA CT-3'(SEQ ID NO:１６)を使用して行なった。逆転写は、４０℃で、６０分であった。逆転写されたｃＤＮＡを、９８℃で５分間のインキュベーションにより変性してから、４℃に冷却し、０．１５ｍＭ ｄＮＴＰ、３μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液、３ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼ及びフォワードプライマーＨＣＶ Ｅ２−Ｆ１ 5'-CGC ATG GCi TGG GAy ATG ATG-3'(SEQ ID NO:１７)を含むＰＣＲ混合液を添加した。増幅は、９４℃で１分間、５５℃で３分間、及び７２℃で３分間の３０サイクルによるものであった。次いで、増幅生成物の２〜８μｌを、各遺伝子型のクローニングに適したフォワードプライマー及び内部リバースプライマーＩＮＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ(表２、SEQ ID NO:１８〜２７)又は各遺伝子型に適したリバースプライマー及びＩＮＴ−フォワードを利用する第二ラウンドのＰＣＲ増幅にかける。ＰＣＲ増幅は、９４℃で１分間、６０℃で２．５分間、及び７２℃で２分間の３０サイクルによるものであった。バンドを適当な寸法にし(遺伝子型特異的なフォワードプライマー及びＩＮＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅには約８２０ヌクレオチド、ＩＮＴフォワード及び遺伝子型特異的なリバースプライマーには約１０８０ヌクレオチド)、エチジウムブロミド染色したアガロースゲルから切り出して、市販の樹脂(Quiagen, カリフォルニア、Valencia在)を利用して精製した。約５０ｎｇの各バンドを合わせて、各遺伝子型に適したフォワード及びリバースプライマー(表２)を用いて再増幅した。ＰＣＲ増幅は、９４℃で１分間、５５℃で２．５分間、及び７２℃で２分間の３０サイクルによるものであった。増幅生成物を、次いで、エチジウムブロミド染色したアガロースゲルから切り出して精製し、適当な制限酵素で消化した。この３ステップの増幅手順は、完全長インサートの、標準的な２ステップ手順よりずっと高い収率を生じた。これらの消化したＤＮＡを、次いで、同様に消化したｐＶＯＴＥ１又はｐＶＯＴＥ２ベクター(Ward等、1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6773-6777；参考として本明細書中に援用する)中に連結した。これらの連結したプラスミドを、標準的方法(Sambrook J., Fritsch E.及びManiatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, ニューヨーク、Cold Spring Harbor, 1989；参考として本明細書中に援用する)を利用して、コンピテントな大腸菌にトランスフェクトし、インサートを含むクローンを同定して繁殖させた。得られたクローンを，ＨＣＶの遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂの完全長Ｅ２及びｐ７を発現する構築物につき、それぞれ、Ｑ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ及びＱ２ｂと指名した。
【０１１６】
【表２】
Figure 2004533991
【０１１７】
ワクシニアウイルス構築物Ｑ１ａ及びＱ２ｂによる完全なＥ２タンパク質の発現を一時的発現アッセイにおいて確認した。ＣＶ−１細胞に、５プラーク形成単位(ｐｆｕ)の野生型ワクシニアウイルスＶＷＡ株(Ward等、前出)を感染させてから、ｐＶＯＴＥプラスミドを、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ(Promega,ウィスコンシン、Madison在)を製造業者の指示に従って利用してトランスフェクトした。細胞を、１ｍＭ イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を補った培地で培養して、ＨＣＶタンパク質の発現を誘導した(Ward等、前出)。トランスフェクションの４８時間後に、これらの細胞を、培養細胞をＰＢＳで洗い、それらの細胞を溶解緩衝液(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、０．５％ デオキシコール酸、１．０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に再懸濁させることによって採取し、これに、プロテアーゼインヒビターのＰｅｆｂｌｏｃ(Boehringer Mannheim, インディアナ、Indianapolis在)、アプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチンを、それぞれ、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌまで加えた。１００マイクロリットルの溶解緩衝液を、３×１０6細胞を採取するごとに加えた。核を、１８，０００×ｇの、４℃、１０分間の遠心分離によりペレット化し、上清を、直ちに利用するか又は利用するまで２日間以内の期間、４℃で保存した。
【０１１８】
ウエスタンブロット分析のために、１０μｌの溶解緩衝抽出液を１０μlの２×ＳＤＳ試料緩衝液(２０％ グリセロール、１０％ β−メルカプトエタノール、４．８％ ＳＤＳ、０．１２５ｍＭ トリス(ｐＨ６．８)と合わせ、９５℃に５分間加熱し、１２％ ポリアクリルアミドゲルを使用するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)(Laemmli等、1970 Nature 227:680-685；参考として本明細書中に援用する)により分画した。これらの分画したタンパク質を、次いで、ニトロセルロースにエレクトロトランスファーして、ウエスタンブロットＨＣＶ Ｅ２を認識するマウスモノクローナル抗体(ｍＭａｂ)２Ｃ８(スタンフォード大学、H.Greenberg博士より入手可能)と一晩インキュベートした。ｍＭＡｂ ２Ｃ８を、ＢＬＯＴＴＯ(２．５％ 脱脂粉乳、２．５％ 正常ヤギ血清、０．１％ ツイーン−２０(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)、０．０２％ アジ化ナトリウム(ＴＢＳ中)：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５)中で、１：５００に希釈した。精製したＨＣＶ又は対照用抗体又はＨＭＡｂ含有培養培地を、ＢＬＯＴＴＯにて、５μｌ／ｍｌのＩｇＧ濃度まで希釈した。これらのブロットを、ＴＢＳで３回洗い、結合抗体を、ＥＣＬウエスタンブロットキットを製造業者(Amersham, イリノイ、Arlington Heights在)の指示に従って用いて検出した。
【０１１９】
これらの構築物Ｑ１ａ及びＱ２ｂは、ｍＭＡｂ ２Ｃ８と免疫反応性の約７０ｋｄａｌのタンパク質を生成した(図１)。ｐＶＯＴＥシステム(Ward等、1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6773-6777；参考として本明細書中に援用する)を用いて予想されたように、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質の発現は、インデューサーＩＰＴＧの存在に大いに依存した。発現されたタンパク質は又、ＩＦＡにより、すべての４つの構築物から、１０の遺伝子型分類されたＨＣＶ血清パネルを用いて検出された(データは示してない)。何れの構築物もＨＣＶ陰性の血清とは反応性でなかったし、何れのＨＣＶ抗血清も野生型ワクシニアウイルスが感染した細胞と反応しなかった。
【０１２０】
クローン化Ｅ２タンパク質の遺伝子型を、４つのクローンの各々に由来するＨＣＶ Ｅ２の中心からの１６０ｂｐの内部断片(ＨＣＶ−１のｎｔｓ．２００９〜２１６８)のＤＮＡ配列決定により確認した。図２(SEQ ID NO:９〜１２)を参照されたい、又は完全なインサート(構築物Ｑ１ｂ){染料ターミネーター方法論及び自動化ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems,カリフォルニア、Foster City在)を使用}。これらのインサートは、フレームシフト又は終止変異を有しない様々なデータベースにおいて利用可能なＨＣＶ Ｅ２の適当な配列に対して高度に相同性であった。図３(SEQ ID NO:１〜８)を参照されたい。従って、これは、４つのすべての遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２が、ｐＶＯＴＥ構築物によって正確に発現されたことの十分な証拠である。次いで、完全なＨＣＶを生成したプラスミドを用いて、ワクシニアウイルスＶＷＡ株のヘマグルチニン遺伝子座への相同組換えにより、組換えワクシニアウイルスを生成した{Ward等、前出、Moss及びEarl (F.Ausubel及びR Brent及びR Kingston(編), Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, John Wiley & Sons, ニューヨーク、New York, 1994中)}。組換えワクシニアウイルスを、ＢＳＣ−１細胞への感染とその後の、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ含有ウイルスについての、標準的方法(Moss等、前出)を利用する、ミコフェノール酸、キサンチン及びヒポキサンチンを含む培地による選択により同定した。精製されたウイルスストックが、各組換えウイルスについて得られ、力価を、５〜１０×１０8ｐｆｕ／ｍｌに及ぶＢＳＣ−１細胞を利用して測定した。
【０１２１】
実施例２
潜在的ＨＣＶ陽性Ｂ細胞ドナーの抗体スクリーニング
ＨＣＶは、イン・ビトロで確実に増殖させられないので、真核細胞で発現される組換えエンベロープタンパク質を利用して、ＨＣＶタンパク質に対する強い力価を有する個人を同定する必要がある。かかるスクリーニングにおいて、エンベロープタンパク質のネイティブな構造を与え、そうして、コンホメーションエピトープに対する抗体の検出を可能にする方法を利用することが必要である。ＨＣＶ ＨＭＡｂの生成のための血清の同定において、間接免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)を使用した。このアッセイは、アセトン固定した細胞を利用し、ヒトＴリンパ球向性ウイルスのエンベロープタンパク質上のコンホメーションエピトープに対する中和ＨＭＡｂの製造で利用される方法と類似している(Hadlock等、1997 J.Virology 71:5828-5840；参考として本明細書中に援用する)。ＨＣＶのために、ＨＣＶ Ｅ２エンベロープタンパク質を発現するアセトン固定した細胞を利用した。様々な点で、これらのＥ２タンパク質を、Ｓｆ９細胞中の組換えバキュロウイルス、ＨｅＬａ細胞中の組換えワクシニアウイルス(上記)を利用して、又は市販のベクター(ｐＤｉｓｐｌａｙ、カリフォルニア、Carlsobad在、In Vitrogen社製)を利用してチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞中で発現させた。昆虫由来の細胞は、ウイルスのエンベロープタンパク質を真にネイティブなコンホメーションで発現しえない(Rosa等、前出；Arp等、1996 J.Virolog, 70:7349-7359；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)ので、ワクシニアウイルス又は哺乳動物細胞発現系の利用が、好ましい。所与の血清を用いて認められる蛍光を、蛍光顕微鏡により、視覚的に評価し、幾つかの場合には、血清の増大する希釈の希釈物を評価して、潜在的ドナー血清の終点希釈力価を得た。
【０１２２】
免疫蛍光を用いて得られた結果を確認するために、血清のＨＣＶ Ｅ２に対する反応性を評価するミクロ滴定プレートアッセイが開発された。ＨｅＬａ細胞の単層を８０％集密まで増殖させて、５ｐｆｕ／細胞のＶＷＡと５ｐｆｕ／細胞の組換えワクシニアウイルス又はＶＷＡのみ５ｐｆｕ感染させた。ＨＣＶ組換えウイルスを完全なヘマグルチニン遺伝子を有する野生型ワクシニアと混合して、ヘマグルチニンマイナスウイルスで観察されたワクシニアウイルス誘導される細胞変性効果を最小にした(Seki等、1990 Virology 175:372-384；参考として本明細書中に援用する)。感染の２４時間後に、細胞を採集した。抽出物を、これらの細胞をＰＢＳで洗ってから、３０×１０6細胞を１ｍｌの溶解緩衝液(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、０．５％ デオキシコール酸塩、１．０％ Ｎｏｎｉｄｅｔｅ−Ｐ４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ(Boehringer Mannheim, インディアナ、Indianapolis在)、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、及び１μｇ／ｍｌ ペプスタチン)に再懸濁させることにより調製した。核を、１８，０００×ｇで、４℃で１０分間の遠心分離によりペレット化した。抽出物を、４℃で貯蔵し、製造から２４時間以内にＥＬＩＳＡのために用いた。ミクロ滴定プレート(Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ニューヨーク、Rochester在、Nalge Nunc International社製)を、個々のウェルを１００μｌのＰＢＳ中の５００ｎｇの精製Galanthus nivalisレクチン(SIGMA,ミズーリ、St. Louis在より入手)で３７℃で１時間コートすることにより準備した。次いで、ウェルを、ＴＢＳ(１５０ｍＭ ＮＡＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５)で洗って、１５０μＬ ＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳプラス０．１％ ツイーン−２０、２．５％ 正常ヤギ血清、２．５％ 脱脂粉乳)による室温で１時間のインキュベーションによりブロックした。プレートを、ＴＢＳで２回洗い、その後、ワクシニアウイルス感染したＨｅＬａ細胞の抽出物(１：５のＢＬＯＴＴＯを伴う)２０μｌを加えた。室温での１．５時間のインキュベーションの後に、プレートをＴＢＳで３回洗い、その後、９５μｌのＢＬＯＴＴＯに５μＬのワクシニアウイルスＶＷＡが感染したＨｅＬａ細胞の可溶性抽出物を補ったもので様々に希釈したＨＣＶ血清を加えた。可溶性抽出物を含ませることは、ＧＮＡレクチンによっても捕捉できるワクシニアウイルスタンパク質に対する反応性の抑制に役立った。プレートを１．５時間インキュベートし、ウェルをＴＢＳで３回洗い、１００μｌのＢＬＯＴＴＯで１／５０００倍に希釈した抗ヒトアルカリホスファターゼ結合体(Promega,ウィスコンシン、Madison在)を加えた。１時間のＲＴでのインキュベーションの後に、これらのプレートを、ＴＢＳで４回洗い、その後、１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ)溶液とインキュベートした。基質の顕色を３０〜４５分間進行させた後に、これらのウェルの４０５ｎｍでの吸光度を、マルチウェルプレートリーダー(Du Pont Co.,デラウエア、Wilmington在)を利用して測定した。
【０１２３】
典型的な結果を、図４に与える。この実験において、５つの遺伝子型分類されたＨＣＶ血清及び１つのＨＣＶ陰性血液ドナー由来の血清を、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＨＣＶ Ｅ２タンパク質並びに、非組換えワクシニアウイルスＶＷＡが感染した抽出物から捕捉されたタンパク質に対して滴定した。ＨＣＶＥ２に対する最小反応性が、未感染の個人に由来する血清にて観察された(陰性血清という名称のグラフ)。加えて、ＨＣＶ感染した個人に由来する５つすべての血清は、野生型ワクシニアウイルスが感染した抽出物から捕捉されたタンパク質に対する反応性を殆ど又は全く示さなかった(全グラフの黒色の細線)。ＨＣＶＥ２タンパク質に対する血清反応性の広範な変化が、試験した５つの血清で得られたということが認められ、ＨＣＶ ２ａ個人が、最高の全体的反応性を示している。
【０１２４】
ＨＣＶ遺伝子型２ｂが感染した個人に由来する１２の血清を用いて得られた結果を図５に与える。このグラフにおいて、４つすべてのＨＣＶ Ｅ２タンパク質について比ＯＤ０．５を生じた血清の希釈を比較した(比ＯＤは、ＨＣＶ Ｅ２構築物の抽出物でコートしたウェルから得られるＯＤ−非組換えワクシニアウイルスの抽出物でコートしたウェルのＯＤである)。１２の血清すべてについて、ＨＣＶ ２ｂ又は２ａ Ｅ２タンパク質に対する反応性は、ＨＣＶ １ａ又は１ｂ Ｅ２タンパク質で得られたものより有意に高かった。これは、ＨＣＶ遺伝子型Ｅ２タンパク質の、ＨＣＶ遺伝子型２ａ又は２ｂに感染した個人におけるＨＣＶエンベロープを認識する抗体の検出についての優越性を示している。このグラフの右側に与えられた個人は、遺伝子型２ａ又は２ｂ Ｅ２タンパク質に存在するエピトープに特異的なＨＣＶ ＨＭＡｂの単離に関して一層有望なドナーである。
【０１２５】
ＨＣＶ ＨＭＡｂを精製するために使われたドナーは、自己供与過程において第一世代のＨＣＶスクリーニングアッセイを用いて血清反応陽性として同定された。供与されたユニットのアラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)試験は、７つの供与の内の６つが正常範囲内(＜４５ＩＵ)にあるという結果となった。一の供与は、４９のＡＬＴ値を有したが、これは、正常カットオフのすぐ上である。或は、このドナーは、肝炎の症状を示さなかった。この個人は、もっと後で、ＨＣＶ陽性であることが、RocheのアンプリカーＨＣＶアッセイ(Roche Diagnostics, ニュージャージー、Branchburg在)を利用するＰＣＲにより確認され、１ｂ遺伝子型のＨＣＶに感染したことが、ＩｎｎｏＬｉｐａプローブアッセイ(Innogentics, ベルギー国、Ghent在)により決定された。この個人は、ＩＦＡを利用してＨＣＶ Ｅ２を認識することのできる抗体の高い力価を有することが見出された。結合アッセイの中和による試験(下記参照)も又、このドナーが、潜在的に中和する抗体の高い力価を有することを示した。末梢血のＢ細胞を、この個人から分離して、ＨＣＶ抗体分泌性ヒトハイブリドーマを生成するために上首尾に利用した(下記)。
【０１２６】
実施例３
抗原特異的ヒトモノクローナル抗体の製造
末梢Ｂ細胞を、ドナーＴ細胞から、Ｔ細胞ソーティングにより、記載されたようにして精製した(Foung等、1984 J.Immunol.Methods 134:35-42；参考として本明細書中に援用する)。個々の１×１０4のＢ細胞の培養物を、ミクロ滴定プレート中でＥＢＶ活性化した。ＨＣＶ特異的抗体を、免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)により検出した。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス、ＨＣＶ Ｅ２を発現する組換えバキュロウイルスが感染した細胞、及び／又はＤＮＡからＨＣＶ Ｅ２を発現するように処理された哺乳動物細胞株を、ＨＴＣスーパーキュアド２４スポットスライド上に固定した。これらの細胞を、１００％アセトンで、１０分間、室温で固定した。固定した細胞を、ＥＢＶ活性化Ｂ細胞又はハイブリドーマからの未希釈培養培地と、３０分間、３７℃でインキュベートし、リン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)(ｐＨ７．４)で５分間洗った。スライドを、次いで、３０分間、３７℃で、０．００１％ エバンスブルー対比染色溶液及びフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Zymed, カリフォルニア、South San Francisco在)と共にインキュベートした。結合した抗体が、蛍光顕微鏡観察により示された。
【０１２７】
５４０の培養物中、ＨＣＶ Ｅ２に対して有意の免疫蛍光を示す９９ウェルを同定し(収率、約１８％)、種々の免疫蛍光パターンを有するＥＢＶ活性化された３０の培養物を、記載されたマウス−ヒトヘテロミエローマへのエレクトロフュージョン(Found等、1990 J.Immunol.Methods 134:35-42；Zimmerman等、1990 J.Immunol.Methods 134:43-50；Perkins等、1991 Hum.Antibod.Hybridomas 2:155-159；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)のために選択した。１２の融合物(幾つかの融合物は、１つより多くの陽性ＥＢＶ活性化培養物を含んだ)のうち、４５６の初期ハイブリドーマ培養物のうちの１８２が、ＨＣＶ Ｅ２との反応性をＩＦＡにより示した(収率、全体で４０％)。ウエスタンブロットによりＨＣＶ−Ｅ２に対する反応性を示した元のＥＢＶ活性化培養物の２つについて６つの更なる融合を行なった。ウエスタンブロットにより反応性(ＩＦＡ反応性に加えて)のＨＣＶ Ｅ２抗体を分泌するハイブリドーマを、これらの融合物の２つから分離した。全体的に、３０のヒトハイブリドーマを凍結した。限界希釈クローンを、１２の親ハイブリドーマから分離し、これらのハイブリドーマの１１からＨＣＶ−ＨＭＡｂを、その後の研究のために、バルクで生成した。ＨＣＶ ＨＭＡｂの８つは、カッパー軽鎖を有するＩｇＧ1であり、２つは、ラムダ軽鎖を有するＩｇＧ1であった。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−９は、ＩｇＧ1であったが、ラムダ軽鎖を利用するのかカッパー軽鎖を利用するのかは知られていない。これらのＨＭＡｂの１０個のＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析(唯一つの例外は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−９であった)は、これらのＨＭＡｂのすべてが異なる重鎖及び軽鎖を発現することを確認した。融合パートナー、ＩｇＧサブタイプ、及びこれらのハイブリドーマを用いるＩＦＡで得られた結果を、表３に記す。
【０１２８】
実施例４
ＨＣＶ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ
以前の研究は、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質が、高度にグリコシル化しており、Galanthus nivalis(ＧＮＡ)、Tiriticum vulgaris(ＷＧＡ)及びRicinus communisを含む幾つかのレクチンの何れか一つによって結合されうることを示した(Ralston等、1993, 前出；da Silva Cardosa, 1998, 前出；Sato等、1993 Virology 196:354-357；これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。それ故、２つのレクチンＧＮＡ及びＷＧＡの試薬としての有用性を、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質のミクロ滴定プレートへの捕捉につき評価した。このアッセイの概略図を図６に描いてある。
【０１２９】
ＨｅＬａ細胞の単層を８０％集密まで増殖させて、５ｐｆｕ／細胞のＶＷＡと５ｐｆｕ／細胞の組換えワクシニアウイルス又は５ｐｆｕのＶＷＡのみを感染させた。ＨＣＶ組換えウイルスを、完全なヘマグルチニン遺伝子を有する野生型ワクシニアと混合して、ヘマグルチニンマイナスウイルスで観察されたワクシニアウイルス誘導される細胞変性効果を最小にした(Seki等、1990 Virology 175:372-384；参考として本明細書中に援用する)。感染の２４時間後に、細胞を採集した。抽出物を、これらの細胞をＰＢＳで洗ってから、３０×１０6細胞を１ｍｌの溶解緩衝液(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、０．５％ デオキシコール酸塩、１．０ ％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｐｅｆａｂｌｏｃ(Boehringer Mannheim, インディアナ、Indianapolis在)、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、及び１μｇ／ｍｌ ペプスタチン)に再懸濁させることにより調製した。核を、１８，０００×ｇで、４℃で１０分間の遠心分離によりペレット化した。抽出物を、４℃で貯蔵し、製造から２４時間以内にＥＬＩＳＡのために用いた。
【０１３０】
【表３】
Figure 2004533991
【０１３１】
ミクロ滴定プレート(Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ニューヨーク、Rochester在、Nalge Nunc International社製)を、個々のウェルを１００μｌのＰＢＳ中の５００ｎｇの精製レクチンで３７℃で１時間コートすることにより準備した。次いで、ウェルを、ＴＢＳ(１５０ｍＭ ＮＡＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５)で洗って、１５０μＬ ＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳプラス０．１％ ツイーン−２０、２．５％ 正常ヤギ血清、２．５％ 脱脂粉乳)による室温で１時間のインキュベーションによりブロックした。プレートを、ＴＢＳで２回洗い、その後、ワクシニアウイルス感染したＨｅＬａ細胞の抽出物(１：５のＢＬＯＴＴＯを伴う)２０μｌを加えた。室温での１．５時間のインキュベーションの後に、プレートをＴＢＳで３回洗い、その後、１００μｌのＢＬＯＴＴＯ中の様々な濃度の未標識抗体を加えた。プレートを１．５時間インキュベートし、ウェルをＴＢＳで３回洗い、１００μｌのＢＬＯＴＴＯで１／５０００倍に希釈した抗ヒトアルカリホスファターゼ結合体(Promega,ウィスコンシン、Madison在)を加えた。１時間のＲＴでのインキュベーションの後に、これらのプレートを、ＴＢＳで４回洗い、その後、１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ)溶液とインキュベートした。基質の顕色を３０〜４５分間進行させた後に、これらのウェルの４０５ｎｍでの吸光度を、マルチウェルプレートリーダー(Du Pont Co.,デラウエア、Wilmington在)を利用して測定した。
【０１３２】
Ｑ１ａワクシニアウイルスにより生成されたＨＣＶ １ａ Ｅ２を、ＨＣＶ Ｅ２の起源として使用し、６つのＨＣＶ ＨＭＡｂを、検出試薬として使用した(図７)。何れのレクチンにより捕捉されたタンパク質も、対照用モノクローナル抗体との反応性は認められず、ＷＧＡにより捕捉されたタンパク質とのバックグラウンドレベルの反応性のみが、すべてのＨＣＶ ＨＭＡｂについてみとめられた。対照的に、ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７は、すべて、ＧＮＡにより捕捉されたタンパク質に対する強い反応性を示した。更に、ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１７及びＣＢＨ−４Ｄは、ＧＮＡに捕捉されたタンパク質との一層低レベルの反応性を有した。これは、ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１１がこの特定のＥ２を認識しないことを示唆している。しかしながら、ＧＮＡ捕捉ＥＬＩＳＡが、ＨＭＡｂのＨＣＶ Ｅ２との反応性の分析に極めて有用であることは明らかである。
【０１３３】
それ故、ＨＣＶ ＨＭＡｂの反応性を、次いで、基準からはずれた遺伝子型のＥ２タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを用いて評価した(図８)。１１のＨＣＶ ＨＭＡｂは、すべて、これらのＨＣＶ Ｅ２構築物の２つ以上と結合し、対照用ＨＭＡｂによっては、特異的シグナルは得られなかった(Ｒ０４と記したパネル)。４つすべての遺伝子型のＥ２タンパク質に対する最高の相対的親和性と反応性レベルを有するＨＭＡｂは、ＣＢＨ−７とＣＢＨ−８Ｃであり、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５、−２及び−８Ｅがそれに続いた。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４ＧとＣＢＨ−９は、遺伝子型２ａ及び２ｂのＨＣＶ Ｅ２タンパク質に対する有意に一層大きい反応性を示したが、他方、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１１は、Ｑ１ａ Ｅ２タンパク質とは著しく小さく反応性であった。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１７(及び、一層少しであるが、ＣＢＨ−４ＤとＣＢＨ−４Ｂ)は、遺伝子型２ａ及び２ｂのＥ２タンパク質に比べて遺伝子型１ａ及び１ｂのＥ２タンパク質への優先的結合を示した。これらの変化は、種々のＥ２タンパク質を用いて得られた最大シグナルがすべての実験で非常に同等であったので、種々のＥ２タンパク質の捕獲の効率の変化の結果ではなかった。これらの結果は、同じ構築物を用いたＩＦＡで得られた結果と一致した(上記の表３参照)。７つの抗体ＣＢＨ−２、−４Ｇ、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−９は、試験したすべてのＨＣＶ Ｅ２構築物との有意の反応性を示し、広く反応性であると考えることができる。
【０１３４】
試験したすべてのＨＭＡｂの少なくとも２つのＨＣＶ遺伝子型との反応性は、ＨＣＶ ＨＭＡｂにより認識されるエピトープが高度に保存されることを示唆している(図９参照)。これらのＨＭＡｂにより認識されるエピトープが、自然において、コンホメーション的であるか直線的であるかを決定することは、興味深いことであった。これは、ネイティブなＨＣＶ Ｅ２と変性したＨＣＶ Ｅ２の両者に対するＨＣＶ ＨＭＡｂの反応性を比較することにより、直接的に扱われた(図９参照)。予想されるように、１１すべてのＨＣＶ ＨＭＡｂは、ＨＣＶ １ｂ Ｅ２を認識する。０．５％ ＳＤＳ及び５ｍＭ ジチオスレイトールの存在下で５６℃まで加熱することによるＨＣＶ Ｅ２の処理は、１１のＨＣＶ ＨＭＡｂのうちの１０について反応性の完全な排除を生じた。唯一の例外は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１７であり、これは、変性Ｅ２タンパク質との反応性の約９０％を保持した。このＨＭＡｂ ＣＢＨ−１７のウエスタンブロット分析は、それが、ｖＱ１ａ又はｖＱ１ｂにより発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質と弱く反応性であることを確認した(データは示してない)。ウエスタンブロットしたｖＱ１ａとの反応性は、残りの１０のＨＭＡｂの何れを用いても認められなかった(データは示してない)。従って、１１のＨＣＶ ＨＭＡｂのうちの１０が、コンホメーション的エピトープを認識する。
【０１３５】
最後に、競争分析を使って、何れのＨＣＶ ＨＭＡｂが、同じ(又は、空間的に非常に近い)エピトープを認識するのかを限定した。このアッセイの概略図を、図１０に描いてある。これらのＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を、標準的方法を利用してビオチン化し、これらのビオチン化ＨＭＡｂの、過剰の選択したＨＭＡｂの存在下でのＨＣＶ１型又は２型Ｅ２への反応性を、如何なる追加の抗体もない試料中で見られたものと比較した。図１１に見られるように、対照のＨＭＡｂＲ０４及びＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｄ、−４Ｂ、−４Ｇ、−７、−９及び−１７は、すべて、本質的に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５の結合の阻止を示さなかった。対照的に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５は、それ自身の過剰により８５％阻止され、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−８Ｅにより約７５％阻止された。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−８Ｃにより一層変動的に阻止され、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２によって約５０％まで阻止された。特に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２を用いて見られた競争は、比較的不確かであり、ＣＢＨ−２が、ＣＢＨ−５と同じエピトープを減じた親和性で認識するか、又は別の空間的に近いエピトープを認識するのかどうか明確でない。
【０１３６】
ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２を用いた抗体競合の分析(図１２)は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２の結合が、それ自身及びＨＭＡｂ ＣＢＨ−５、−８Ｃ及び−８Ｅにより７５％より大きい程まで阻止されたことを示した。対照的に、ＣＢＨ−７は、Ｑ１ａタンパク質だけへの結合を６０％だけ阻止し、ＣＢＨ−１１は、Ｑ１ｂ及びＱ２ａタンパク質への結合だけを阻止した。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５と同様に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇ、−４Ｄ、−４Ｂ、−９又は−１７では競争は、認められなかった。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７を用いた競争結果の分析(図１３)は、ＣＢＨ−７の結合を有意に阻止した唯一のＨＭＡｂは、それ自身であったことを示している。これらのデータは、広く反応性のＨＭＡｂのうちで、ＣＢＨ−２、−５、−１１及び−７のすべてが、別のエピトープを認識することを示している。ＣＢＨ−２、−８Ｃ及び−８Ｅが、同じエピトープ又は２つの別個のエピトープを認識するという可能性が残っている。加えて、ＣＢＨ−９及びＣＢＨ−４Ｇは、同じエピトープ又は２つの別個のエピトープを認識することができるが、それらがＣＢＨ−２、−５などと競争しえないことは、それらが、他の広く反応性のＨＭＡｂと同じエピトープを認識しないことを確実にする。従って、最小に広く反応性のＨＭＡｂは、５つの異なるエピトープを認識する。
【０１３７】
実施例５
結合アッセイの中和におけるＨＭＡｂ活性の評価
結合の中和(ＮＯＢ)アッセイは、所与の抗体又は血清が、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質の、ヒトＴ細胞株で発現された推定のレセプターへの結合を妨げることができるかどうかを試験する。これらのＮＯＢアッセイは、前に記載された(Rosa等、前出；Ishii等、前出)方法及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質を利用して行なった。
簡単には、哺乳動物細胞(Rosa等、前出)中で生成された１μｇのＨＣＶ Ｅ２ １ａタンパク質を一連の抗体の希釈物(０．１〜３００μｇ／ｍｌ)と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｍｏｌｔ−４細胞(１０5)を、この混合物に加えて、氷上で１時間インキュベートした。洗浄後に、Ｍｏｌｔ−４細胞に結合したＨＣＶ−Ｅ２の量を前に記載された(Rosa等、前出)ようにして、フローサイトメトリーにより評価した。このＮＯＢ力価は、Ｅ２結合の５０％中和を示す血清希釈として定義される。
【０１３８】
ＨＣＶ １ａ Ｅ２のＣＤ８１発現細胞への結合を阻止するＨＭＡｂの能力を、結合の中和(ＮＯＢ)アッセイ(Rosa等、前出)により評価した。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｄ、４Ｂ、４Ｇ及び１７は、Ｅ２の標的細胞への結合を、２５μｌ／ｍｌ未満の濃度でブロックしなかった。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−１１は、複数の実験で、５０％阻止を、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で達成した(表４)。
【０１３９】
実施例６
ＣＤ８１へのＥ２の結合に対するＨＣＶ ＨＭＡｂの効果：ミクロ滴定プレートアッセイ
最近、ヒトのテトラスパニンタンパク質ＣＤ８１は、ＨＣＶの潜在的なレセプター及びＨＣＶ Ｅ２の細胞標的として、ＮＯＢアッセイにおいて同定された。ＣＤ８１内のＨＣＶ Ｅ２のための結合部位は、大きい細胞外ループ、ＣＤ８１−ＬＥＬに局在化されており(Pileri等、1998 Science ２８２：938-941；参考として本明細書中に援用する)、これは、以前には、細胞外ループ２又はＬＥＬと呼ばれたものである。Ｅ２とＬＥＬの間の混乱を防ぐために、我々は、この領域を大きい細胞外ループ(ＬＥＬ)と呼ぶこと選んだ。ヒトＣＤ８１(ＣＤ８１−ＬＥＬ)の大きい細胞外ループは、ｐＧＥＸベクター(ＧＳＴ−２Ｔ)を使用して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現された。このタンパク質の構築及び精製は、記載されている(Flint等、1999 J.Virology 73:6235-6244；参考として本明細書中に援用する)。このＣＤ８１−ＬＥＬ−ＧＳＴ融合タンパク質を利用して、何れのＨＭＡｂが、ＣＤ８１−ＨＣＶ Ｅ２複合体を認識することができるかを測定した。このアッセイの概略図を、図１４に与える。ミクロ滴定プレートのウェルを、１００ｎｇの精製ＣＤ８１−ＬＥＬ又は非組換えＧＳＴ(ＰＢＳで希釈)によりコートした。３７℃で２時間の後に、ウェルをＴＢＳで１回洗い、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯとのＲＴで１時間のインキュベーションによりブロックした。ＨＣＶ Ｅ２を発現するワクシニアウイルスが感染したＢＳＣ１細胞に由来する抽出物を試験抗体と、コートされたプレート中で、１００μｌのＢＬＯＴＴＯ中で合わせ、一晩４℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートした。次いで、ウェルを、ＴＢＳで３回洗った後に、適当なアルカリホスフェート結合体化第二抗体及びＰＮＰＰ基質を実施例４に記載のように加えた。
【０１４０】
複数の遺伝子型のＥ２タンパク質を利用するＮＯＢの結果を確認するために、我々は、ＨＣＶ ＨＭＡｂが、ＨＣＶ Ｅ２とＣＤ８１との相互作用を阻止することができるかどうかを評価した。ミクロ滴定プレートを先ず精製したＣＤ８１−ＬＥＬグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質でコートし、それに、過剰のＨＣＶ Ｅ２を、ＨＣＶ ＨＭＡｂの存在下で加えた。ＨＣＶ Ｅ２はヒトＣＤ８１に特異的に結合するが、他の殆どの霊長類のＣＤ８１タンパク質には結合せず(Rosa等、前出)、これらのＥ２タンパク質は、内因性ＣＤ８１の影響を最小化するためにミドリザル腎臓細胞株ＢＳＣ−１で生成された。抗ＨＣＶ及び対照抗体の両者は、精製した非組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼにより捕捉された。ＨＣＶも対照用抗体も、野生型ワクシニアウイルスが感染したＢＳＣ−１細胞の抽出物と合わせた際に、ＣＤ８１により捕捉されなかった(データは示してない)。
【０１４１】
ＮＯＢ陰性のＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇは、ＣＤ８１コートしたプレート上に、試験した４つすべての遺伝子型のＥ２タンパク質と同程度に捕捉された。これらのＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｂ、−４Ｄ及び−１７は、ＨＣＶ １ａ又は１Ｂ Ｅ２タンパク質によって、変化する程度に、ＣＤ８１コートしたプレート上に捕捉されたが、ＨＣＶ ２Ａ又は２Ｂ Ｅ２タンパク質によっては捕捉されず、これは、これらのＨＭＡｂのＧＮＡ捕捉されたＥ２タンパク質との反応性と一致する(図１５)。４つのＮＯＢ陰性ＨＭＡｂの滴定分析は、それら全部が、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で得られる最大結合の５０％でＨＣＶ １ｂ Ｅ２タンパク質に結合したことを確認した(表４)。ＮＯＢ陽性抗体ＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−１１の何れも、我々の試験した遺伝子型の何れのＣＤ８１及びＥ２タンパク質によっても捕捉されなかった(図１５)。ＨＣＶ抗体を、ＨＣＶ １ｂ Ｅ２タンパク質が既にＣＤ８１−ＬＥＬに結合されているウェルに加えた場合に、同様の結果が得られ、これは、得られた結果が、Ｅ２タンパク質の添加及びＨＣＶ ＨＭＡｂの添加から互いに独立していたことを示している。ＧＮＡ捕捉されたＥ２とは強く反応性であるがＣＤ８１結合したＥ２とは陰性であるＨＭＡｂ ＣＢＨ−２及び７の滴定分析は、これらの抗体が、ＣＤ８１−ＬＥＬ Ｅ２複合体と、２５μｇ／ｍｌ以下の濃度では反応しないことを確認した(データは示してない)。従って、６つのＨＭＡｂは、複数の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を阻止した。
【０１４２】
【表４】
Figure 2004533991
【０１４３】
実施例７
ＨＣＶ ＨＭＡｂのＨＣＶビリオンのＣＤ８１への結合に対する効果
ビリオン−ＣＤ８１結合アッセイを、以前に記載された(Pileri等、1998 Science 282:938-941；参考として本明細書中に援用する)ようにして行なった。簡単には、１／４”ポリスチレンビーズ(Pierce, イリノイ、Rockford在)を、一晩、５０μｇ／ｍｌの精製組換えＬＥＬ−ＴＲＸタンパク質(Pileri等、前出)により、基準緩衝液(ｐＨ４．０)中で、室温でコートしてから、５０ｍＭ トリス.Ｃｌ(ｐＨ８)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ(ＴＥＮ)緩衝液中の２％ ＢＳＡにより１時間ブロックした。５×１０5ＨＣＶ ＲＮＡゲノムを含む血清を、１０μｇの精製モノクローナル抗体を含む２００μｌ ＴＥＮ緩衝液中で希釈して、４℃で１時間インキュベートした。この希釈した血清を、次いで、コートしたビーズに加えて、３７℃で１〜２時間インキュベートした。上清の除去後に、各ビーズを、１５ｍｌ ＴＥＮ緩衝液で５回洗い、結合したウイルスを市販のキット(Qiagen, スイス国、Basel在)を利用して抽出した。ポリメラーゼキナ反応媒介のＲＮＡコピー数評価を、Perkin Elmer ABI ７７００配列検出システムを利用して記載された(Pileri等、前出)ように行なった。
【０１４４】
組換えＥ２のＣＤ８１への結合をブロックしたＨＣＶ ＨＭＡｂの幾つかを、ＨＣＶビリオン(脂質二分子層に発現されたＥ１及びＥ２タンパク質を含む)のＣＤ８１への結合を邪魔する能力について試験した。イン・ビトロのＨＣＶ培養アッセイの欠如のために、我々は、エンベロープと結合したＨＣＶ ＲＮＡのＣＤ８１への結合を示すために開発されたＰＣＲアッセイ(Pileri等、前出)を利用した。このアッセイの概略図を、図１６に描いてある。簡単には、ＣＤ８１の主要細胞外ループをポリスチレンビーズに結合させて、既知量のＨＣＶ １ａ ＲＮＡ分子を含む感染性血漿と共にインキュベートする。洗浄後に、ビーズに結合したウイルスの量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。これらの４つの最高の見かけの活性を有するＮＯＢ陽性ＨＭＡｂ、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７及びＣＢＨ−１１を評価した。ウイルス結合の阻止は、対照用抗体又はＮＯＢ陽性抗体ＣＢＨ−７若しくはＣＢＨ−１１を用いては、観察されなかった。対照的に、１０μｇ／ｍｌのＨＭＡｂ ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５を含む感染性血漿との予備インキュベーションは、ＨＣＶのＣＤ８１への結合を阻止した(図１７)。これらの結果は、これらの抗体がＨＣＶビリオンに結合することができて、イン・ビボでの中和効果を有しうるという観察を支持している。
【０１４５】
上記のアッセイにおいて得られた結果のすべてを合わせると、ここに記載の１１のＨＭＡｂの仮のエピトープ評価を構築することができる。これを、表５に与える。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−８Ｃにより認識されるエピトープは、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２及び／又はＣＢＨ−８Ｅにより認識されるものから、ＨＣＶ Ｅ２の４つすべての遺伝子型につきＣＢＨ−８Ｃにより得られる非常に類似した滴定によって分離される。ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−８Ｅは、遺伝子型２ａ及び１ａで得られる値と比較して、遺伝子型１ｂ及び２ｂとの幾分低い反応性を繰り返し示す性質を有する。他の異なるエピトープの評価は、得られた結果を仮定すれば、非常に直接的である。しかしながら、更なる実験が、ＣＢＨ−４Ｇ及びＣＢＨ−９により認識されるエピトープ並びに／又はＣＢＨ−８Ｅ及びＣＢＨ−２により認識されるエピトープの分離に役立つであろうことは、ありえる。
【０１４６】
実施例８
ＨＣＶ中和抗体のミクロ滴定プレートアッセイ
ＨＣＶ感染の個人の治療及び管理を助成するために、彼らが、強い抗ウイルス免疫応答を有するかどうかを知ることは、望ましいであろう。中和抗体力価を測定することのできる幾つかのアッセイ(上記の結合の中和アッセイ及びチンパンジーの接種前のエキス・ビボ中和を含む)が、記載されているが、これらのアッセイは、すべて、厄介で且つ多数の試料を試験するのに適していない。それ故、我々は、複数の遺伝子型のＥ２タンパク質について、ＨＣＶ Ｅ２−ＣＤ８１複合体に対して同等に反応性のＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇを、阻止アッセイにおいて使用して、ヒト血清における抗体様結合の中和のレベルを測定した。ミクロ滴定プレートの個々のウェルを５００ｎｇの精製ＧＮＡレクチン又は１００ｎｇのＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ融合タンパク質で１時間３７℃でコートした。これらのウェルを、次いで、ＴＢＳで１回洗い、試験血清又はモノクローナル抗体の様々な希釈の希釈物を適当なウェルに総容積５０μｌで加えた。同時に、１５μｌのＨＣＶ Ｅ２タンパク質含有抽出物を、４μｇ／ｍｌのＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇのビオチン化調製物と、各ウェルにつき、総容積５０μｌのＢＬＯＴＴＯ中で合わせた。２０分間の４℃でのインキュベーションの後に、Ｅ２ ＣＢＨ−４Ｇ混合物を、試験抗体を既に含んでいるミクロ滴定プレートのウェルに加えた。翌朝、これらのウェルの内容物を捨てて、これらのウェルをＴＢＳで３回洗った。その後、１００μｌのストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼ(Amersham-Pharmacia, ニュージャージー、Piscataway在)(ＰＢＳに０．１％ ツイーン−２０(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)を加えたもので１／１０００倍に希釈したもの)を加えた。次いで、これらのプレートを、１時間、室温でインキュベートし、その後、これらのウェルを、ＴＢＳで４回洗い、結合したビオチン化抗体を実施例２及び４に記載したように、ＰＮＰＰ基質と共にインキュベートすることにより検出した。
【０１４７】
１１のＨＣＶ ＨＭＡｂのパネルを試験抗体として用いた場合に得られた結果を図１８に与える。この実験において、２０μｇ／ｍｌの濃度のＨＣＶ ＨＭＡｂの、ＨＣＶ遺伝子型１ａ Ｅ２タンパク質のヒトＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を阻止する能力を評価した。ＣＤ８１−ＬＥＬコートしたウェルで認められた結合の阻止は、ＧＮＡレクチンコートしたウェルで同じ抗体を用いて得られる結果に匹敵する。ＧＮＡコートしたウェルでのＥ２結合の観察された阻止は、ＣＢＨ−４Ｇ検出抗体と競争抗体との間の相互作用の阻止を反映している。ＣＤ８１−ＬＥＬコートしたウェルでの観察された特異的阻止は、ＣＤ８１とＥ２との間の相互作用の阻止を反映している。１１のＨＣＶ ＨＭＡｂ又は対照用抗体Ｒ０４の何れも、ＣＢＨ−４Ｇの、ＧＮＡにより捕捉されたＥ２への結合の５０％を超える阻止を示さなかった。対照的に、結合の中和陽性であることが以前に示された６つのＨＣＶ ＨＭＡｂの内の５つは、ＣＢＨ−４Ｇ−Ｅ２複合体のＣＤ８１-ＬＥＬへの結合を強く阻止した。唯一の例外は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１１であり、これは、遺伝子型１ａ Ｅ２タンパク質のＱ１ａ分離株を効率的に認識しない。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４ｂ、−４Ｇ、−４Ｄ、−９及び−１７は、ＣＤ８１−ＬＥＬ−Ｅ２複合体を認識し、すべて、最少に、ＣＢＨ−４Ｇ結合したＥ２のＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を達成した。従って、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇは、効果的に、ＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１との相互作用を阻止しうるか阻止しえないかで区別することができる。
【０１４８】
【表５】
Figure 2004533991
【０１４９】
従って、この実験を、次いで、ＨＣＶ及び対照用血清をＨＣＶ ＨＭＡｂの代わりに利用して、反復した(図１９)。６つの遺伝子型のＨＣＶ血清(３つの遺伝子型１ａの血清及び３つの遺伝子型２ｂの血清)及び２つのＨＣＶ陰性血清を、相同なＥ２タンパク質に対して１／１０００倍希釈で試験した。ＨＣＶ ＨＭＡｂで見られたように、ＨＣＶ Ｅ２のＧＮＡへの結合の阻止は、殆ど又は全く認められなかった。何れの陰性血清も、ＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１−ＬＥＬへの結合に有意に影響を与えなかった。対照的に、ＣＤ８１−ＬＥＬへのＥ２の結合の広範な様々な阻止が、ＨＣＶ血清により認められた。従って、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇは、ミクロ滴定プレート形式で、推定のレセプターＣＤ８１に結合する。
【０１５０】
上記の結果から、これらのモノクローナル抗体が、ＨＣＶを有する患者の治療のための診断剤及び治療剤の開発における重要な追加であるということは明らかである。遺伝子型１及び２を認識することにより、ＨＣＶあっせいを、擬陰性の一層少ない一層高い予想で行なうことができ、このＨＣＶ感染を同定するアッセイの実施には、一層少ない抗体が必要とされる。これらの抗体は、広範な様々なプロトコールにおいて利用を見出すであろう。加えて、これらの抗体を利用して、遺伝子型を同定し、ビリオン粒子を分離し、そしてミモトープを同定することができる。それらがヒトであることにより、それらは、治療において利用すること(ウイルスにさらされうる患者を防護するための予防又は患者の有効なウイルス負荷減じるための治療の何れか)ができる。
【０１５１】
実施例９
ＨＣＶ感染の小動物モデルにおいてＨＣＶの複製を阻止するＨＣＶ Ｅ２に対するヒトモノクローナル抗体の競争分析及びエピトープの局在化
材料と方法
細胞株及びウイルス。ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)及び２ｍＭグルタミンを補った最小必須培地(ＭＥＭ、Life Technologies, メリーランド、Bethesda在)で増殖させた。ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ−２９３)細胞を、１０％ ウシ胎児血清(GIBCO)及びＬ−グルタミン(２ｍＭ)(GIBCO)を補ったダルベッコ改変最小必須培地(ＤＭＥＭ、Life Technologies, メリーランド、Gaithersburg)で、５％ ＣＯ2中で維持した。ＨＣＶエンベロープタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを構築して、記載されたように生育させた(ＨＣＶ ＪｏＶ)。ＨＣＶ １ａのＨ株の構造タンパク質を発現するワクシニアウイルス１４８８を、Charles Riceはかせから得た。
【０１５２】
モノクローナル抗体。ＨＣＶ ＨＭＡｂの生成、精製及びビオチン化を、記載されたように行なった(ＨＣＶ ＪｏＶ)。ＨＣＶ Ｅ２に対するラットのモノクローナル抗体３／１１を、以前に記載されたようにしてインキュベートし、これは、Jane McKeating博士から得た。インフルエンザ・ヘマグルチニン(ＨＡ)エピトープに対するラットモノクローナル抗体を、Roche Diagnostics(インディアナ、Indianapolis在)から得た。ｃ−ｍｙｃエピトープに対するマウスモノクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnology(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。
【０１５３】
競争アッセイ。ＨｅＬａ細胞の単層を、８０％集密まで生育させ、ＨＣＶ Ｅ２を発現する組換えワクシニアウイルスを感染させて、細胞質抽出物を前に記載された(ＨＣＶ ＪｏＶ)ようにして調製した。ミクロ滴定プレートを、ウェルを１００μｌのＰＢＳ中の５００ｎｇの精製Galanthus nivalis(ＧＮＡ)レクチン(SIGMA, ミズーリ、St. Louis在)で、１時間３７℃でコートすることにより準備した。ウェルを、ＴＢＳ(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５)で洗ってから、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳプラス０．１％ ツイーン−２０、２．５％ 正常ヤギ血清、２．５％ 脱脂粉乳)で１時間室温でブロックした。プレートを、ＴＢＳで２回洗い、その後、各ウェルに対して、１００μｌのＢＬＯＴＴＯ中に１５μｌの抽出物を加えた。ＲＴで１．５時間後に、プレートを、ＴＢＳで３回洗い、その後、競争抗体を様々な濃度で総容積５０μｌ／ウェルで加えた。プレートを、３０分間、インキュベートし、その時点で、５０μｌ／ウェルのビオチン化試験抗体の８μｇ／ｍｌ(ＣＢＨ−４Ｇ)又は４μｇ／ｍｌ溶液(すべての他の抗体)を加えた。１．５時間の室温でのインキュベーションの後に、これらのプレートを、ＴＢＳで３回洗い、１００μｌの１／１０００倍希釈したアルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジン(Amersham-Pharmacia Biotech, ニュージャージー、Piscataway在)を加えた。室温で１時間の後に、これらのプレートを、ＴＢＳで４回洗い、その後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ)の１ｍｇ／ｍｌ溶液と３０分間インキュベートした。吸光度を、４０５ｎｍで、マルチウェルプレートリーダー(BioTek Instruments, バーモント、Winooski在)を用いて測定した。ビオチン化試験抗体及びＥ２を用いて、競争抗体の存在下で得られたシグナルを、試験抗体とＥ２から競争抗体の非存在下で得られたシグナルと比較した。
【０１５４】
ＨＣＶ Ｅ２欠失構築物の単離とクローン化。ＨＣＶ １ｂ ＲＮＡを、ＨＣＶ遺伝子型１ｂが感染した個人に由来する血清から、ＰｕｒｅＳｃｒｉｐｔ(Gentra systems, ミネソタ、Minneapolis在)を製造業者の指示に従って利用して単離した。ワクシニアウイルス組換えＱ１ｂ及びＨＣＶ １ｂ欠失構築物のすべての両者は、同じ個人に由来した。ＨＣＶ ＲＮＡを、ランダムプライマー及び逆転写酵素(Perkin-Elmer Applied Biosystems, カリフォルニア、Foster City在)を製造業者のプロトコールに従って、４２℃で３０分間利用して、ｃＤＮＡに変換した。ＨＣＶ Ｅ１の断片を、ｐｆｕ ｔａｑポリメラーゼ(Stratagene, カリフォルニア、La Jolla在)を利用するポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、隣接するＢｇｌＩＩ又はＰｓｔＩ制限部位を含むｃＤＮＡから、適当なオリゴヌクレオチドプライマー(Integrated DNA Technologies, アイオワ、Corlville在)を用いて増幅した。ＨＣＶ Ｈ株を、ワクシニアウイルス構築物ｖｖ１４８８のウイルスストックからＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、その後、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ消化したｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド(Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)中に連結した。すべてのプラスミドを、標準的手順(２８)を利用して構築した。イン・フレームのＨＣＶインサートの存在を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングを利用するＤＮＡ配列決定により自動化シーケンサー(PE-Applied Biosystems, カリフォルニア、Foster City在)にて確認した。
【０１５５】
ＨＣＶ Ｅ２欠失構築物の発現。ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ)２９３細胞を播種して、後日、約６０〜７０％集密を得た。Ｔ−７５フラスコのトランスフェクションのために、 μｇの適当なプラスミドＤＮＡ及び μｇのＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｐｆｘ−２(Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)の混合物を、 ｍｌの無血清培地と、ＤＮＡ：脂質比１：６(ｗ／ｗ)で合せた。３７℃で４時間のインキュベーションの後に、トランスフェクション溶液を、２．５ｍｌの完全培地で置き換え、細胞を、更に２４時間生育させた。細胞抽出物を、細胞をＰＢＳで洗い、それらを１ｍｌの溶解緩衝液(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリスｐＨ７．５、０．５％ デオキシコール酸塩、１．０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｐｅｆａｂｌｏｃ(Boehringer Mannheim, インディアナ、Indianapolis在)、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン、及び１μｇ／ｍｌ ペプスタチン)に再懸濁することにより調製した。核を、１８，０００×ｇでの、４℃で、１０分間の遠心分離によりペレット化した。ウエスタンブロット分析のために、抽出物を、１対１で、２×ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動試料用緩衝液(ＳＤＳ−ＳＢ；２０％ グリセロール、１０％ β−メルカプトエタノール、４．８％ ＳＤＳ、０．１２５ｍＭ トリスｐＨ６．８)と合せた。タンパク質を、９５℃まで５分間加熱することにより変性してから、１２％ポリアクリルアミドゲル中で、それらの変性した抽出物の２０μｌのアリコートのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)を行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後のウエスタンブロッティングを、標準的方法を利用して行なった。
【０１５６】
ミクロ滴定プレートアッセイのために、ミクロ滴定プレートを、ウェルを１００μｌのＰＢＳ中の５００ｎｇの精製Galanthus nivalis(ＧＮＡ)レクチン(SIGMA, ミズーリ、St. Louis在)で、１時間、３７℃でコートすることにより準備した。ウェルを、ＴＢＳ(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５)で洗ってから、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳプラス０．１％ ツイーン−２０、２．５％ 正常ヤギ血清、２．５％ 脱脂粉乳)で１時間室温でブロックした。ウェルを、ＴＢＳで２回洗い、その後、Ｅ２欠失構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞に由来する２５μｌの抽出物を７５μｌのＢＬＯＴＴＯ中に希釈して加えた。室温で１．５時間後に、プレートを、ＴＢＳで３回洗い、その後、モノクローナル抗体を様々な濃度で加えた。プレートを、１．５時間インキュベートし、３回ＴＢＳで洗ってから、１００μｌの適当なアルカリホスファターゼ結合体化第二抗体(製造業者が推奨するようにＢＬＯＴＴＯで希釈したもの)を加えた(抗ヒト及び抗マウス用は、ウィスコンシン、Madison在、Promega, 抗ラット用は、カリフォルニア、South San Francisco在、Kirkegard and Perry)。室温で１時間の後に、これらのプレートを、ＴＢＳで４回洗い、その後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ)の１ｍｇ／ｍｌ溶液と３０分間インキュベートした。吸光度を、４０５ｎｍで、マルチウェルプレートリーダー(Du Pont Co, デラウェア、Wilmington在)を用いて測定した。
【０１５７】
フローサイトメトリー分析。総容積１００μｌの染色溶液(ＰＢＳプラス１％ ＦＣＳ及び０．１％ アジ化ナトリウム)中の試験抗体の様々な希釈度の希釈物を、１０6の生存力のあるＨＣＶ Ｅ１を発現する又は対照用のＨＥＫ−２９３細胞と合せ、１００μｌの染色溶液に再懸濁させて、４℃で４５分間インキュベートした。追加の３ｍｌの染色溶液の添加後に、これらの細胞を、室温で１０分間の５００×ｇでの遠心分離によりペレット化した。このペレットを、保存し、製造業者(Jackson Immunoresearch laboratories, ペンシルベニア、West Grove在)の推奨するように染色溶液に希釈した１００μｌのＦＩＴＣ結合体化第二抗体に再懸濁させた。４℃で４５分の後に、９００μｌの染色溶液を加え、これらの細胞を上記のようにペレット化した。これらの細胞を、次いで、１ｍｌの固定溶液(ＰＢＳ中の３．８％ ホルムアルデヒド)に再懸濁させ、細胞表面に結合したＨＭＡｂの量をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ(Becton-Dickinson, カリフォルニア、San Jose在)にて分析した。２色染色のために、第二抗体を、Ｒ−フィコエリトリンと結合体化して、蛍光を６０６ｎｍでモニターしたが、他方、ＥＧＦＰ蛍光は、５４５ｎｍでモニターした。
【０１５８】
結果
ＨＣＶ Ｅ２を認識するヒトモノクローナル抗体は、２つの起源から得られた。１０のＨＭＡｂ(ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｄ、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢＨ−８Ｅ、ＣＢＨ−１１及びＣＢＨ−１７)は、遺伝子型１ｂのＨＣＶに感染した無症候性の個人から得られた。ＨＭＡｂ ＸＴＬ−Ｕ６８を、ＨＣＶ １ｂの別の分離株でＨＣＶ感染をクリアした個人から得た。これらの抗体は、それらの種々の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２との反応性の幅及び ＨＣＶ Ｅ２とヒトＣＤ８１との相互作用を阻止する能力が変化した。これらのＨＣＶ ＨＭＡｂの呼称、反応性及び性質を、表６にまとめる。
【０１５９】
【表６】
Figure 2004533991
【０１６０】
１１のＨＭＡｂの内の１０のＩｇＧ１遺伝子の配列分析は、それらが、独立のＢ細胞に由来することを確認した。注意すべきことには、ＨＭＡｂ ＸＴＬ−Ｕ６８、ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−４Ｄ及びＣＢＨ−１７は、すべて、Ｅ２のＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を阻止することができなかった(表６)。
【０１６１】
競争アッセイを使用して、ＨＭＡｂと反応性のＥ２内の別々の部位の数を測定した。個々のＨＭＡｂを精製し、ビオチン化し、抗体の結合を、増大する濃度の競争抗体の存在下で測定した。代表的な結合曲線を、図２１に与える。ＨＭＡｂＣＢＨ−２、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−８Ｃ及びＣＢＨ−１１のＨＣＶ １ｂ Ｅ２への結合は、過剰のＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１によって、すべて有意に阻止された。一般に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５は、最高レベルの阻止を示し、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−８Ｅは、最も弱い阻止を示した。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、−５、−８Ｃ及び−１１について、中間レベルの阻止が、ＨＭＡｂ ＸＴＬ−Ｕ６８によって認められ、対照用ＨＭＡｂ、Ｒ０４又はＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４Ｇによっては有意の阻止が認められなかった。対照的に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７は、それ自身により又はＨＭＡｂ ＸＴＬ−Ｕ６８によって強く阻止され、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｂにより非常に弱く阻止され、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、−５、−８Ｃ、−８Ｅ、−１１、−４Ｇ又は対照用抗体の存在によって影響を受けなかった。同様に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｂは、ＨＭＡｂ ＸＴＬ−Ｕ６８により強く阻止され、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４Ｇにり中間レベルの阻止を示した。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、−５、−８Ｃ、−１１及び８Ｅは、互いに近接しているエピトープを認識し、ＨＣＶ Ｅ２内の抗体結合部位を潜在的に規定する。
【０１６２】
阻止実験の完全なシリーズからの結果を、図２２に与える。コンホメーションエピトープを認識し、Ｅ２のＣＤ８１−ＬＥＬとの結合を阻止する５つの抗体ＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１は、すべて、交叉して競争し、１つの競争グループ(グループＩ)を形成した。第二の競争グループ(グループＩＩ)は、ＨＭＡｂ ＸＴＬ−Ｕ６８及びＣＢＨ−７を含む。第三の競争グループは、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４Ｄにより形成され、第四の競争グループは、直線的エピトープを認識するパネル中の唯一の抗体であるＣＢＨ−１７により形成される。グループＩからの抗体の結合は、グループＩＩからの抗体により僅かに影響を受けるだけであり、グループＩＩＩ又はＩＶからの抗体によっては全く影響を受けなかった。グループＩＩからの抗体のＥ２への結合は、任意の他のグループの抗体の存在によって影響を受けなかった。グループＩＩＩからの抗体は、グループＩの抗体の存在によって影響を受けず、強く阻止されるか、又はＣＢＨ−７の存在下でのＣＢＨ−４Ｇ結合の場合には、グループＩＩＩの抗体の存在によって刺激された。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１７は、任意の他の抗体の結合に影響を及ぼさなかった。従って、これらの１１のＨＣＶ ＨＭＡｂは、ＨＣＶ Ｅ２内の４つの相対的に異なる抗体結合部位を規定する。
【０１６３】
現在、ＨＣＶの繁殖のための効率的な培養システムはない。ＨＣＶの構造タンパク質を哺乳動物由来の細胞で発現させる場合には、それらのタンパク質は、通常、細胞内に保持される。しかしながら、最近、幾つかのグループは、ＨＣＶ Ｅ２の哺乳動物細胞表面での上首尾な発現を報告した。細胞表面で発現されたＨＣＶ Ｅ２は、感染性ビリオンの表面のＨＣＶ Ｅ２の構造を一層厳密に反映するので、我々は、ＨＣＶ １ｂ Ｅ２の細胞外ドメイン(アミノ酸３８４〜６６１)をｐＤｉｓｐｌａｙベクターで発現させた。これらのＨＣＶ Ｅ２配列を、血小板由来成長因子レセプター(ＰＤＧＦＲ)の膜貫通ドメインとイン・フレームで発現させた。ＨＣＶ Ｅ１タンパク質のカルボキシ末端のシグナル配列を、マウスのＩｇＫリーダー配列と置き換えた。インフルエンザウイルスヘマグルチニン(ＨＡ)からの強い直線的エピトープ及びｃ−ｍｙｃは、直ちに、ＨＣＶ配列の前後に、それぞれ、位置される。ＨＣＶ １ｂ 構築物ｓｆ１ｂ(ＨＣＶ １ｂ Ｅ２のアミノ酸３８４〜６６１を発現する)の予想分子量は、グリコシル化前に、４２ｋＤであった。タンパク質発現をウエスタンブロットにより分析する場合には、２つの異なる免疫反応性タンパク質を、ｓｆ１ｂ−Ｅ２細胞株によって生成した。第一は、６８〜７０ｋｄａｌで比較的控え目な移動するバンドである。この種は、ＧＮＡレクチンアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製され、マンノース富化炭水化物鎖を有するＥ２の細胞内形態である。第二の免疫反応性タンパク質は、不均一なスミアであり、それは、７０〜９８ｋＤの大きさに及んだ。この種は、ＧＮＡレクチンクロマトグラフィーによって効率的に精製されなかったし、複雑な炭水化物鎖を有し且つこれらの細胞の表面に存在する主要な種であると仮定される。ＤＮＡ配列蹴っては、期待された挿入物のフレームシフト又はターミネーションを有しないクローン化を確認した。
【０１６４】
ＨＣＶ Ｅ２構築物ｓｆ１ｂ−Ｅ２をＣＨＯ細胞に導入して、このタンパク質を発現する細胞株を得た。これらのｓｆ１ｂ−Ｅ２発現細胞を、次いで、ＨＣＶ ＨＭＡｂ又は対照用抗体と合せて、細胞表面に発現されたＨＣＶ Ｅ２に結合するＨＭＡｂの能力を測定した。ＨＡエピトープに対するモノクローナル抗体で染色した場合に、強いシグナルが、これらの細胞の９５％より多くから得られた。特異的シグナルは、親ＣＨＯ細胞から得られず、ｓｆ１ｂ−Ｅ２発現細胞株及び対照用抗体によって如何なるシグナルも得られなかった。これらのＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−７及びＣＢＨ−４Ｂは、すべて、ｓｆ１ｂ−Ｅ２細胞株の染色を示したが、これは、ＨＡエピトープで認められたものと同等であった。対照的に、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−１１及びＣＢＨ−１７は、やはり細胞表面に発現されたＥ２タンパク質と反応性であるが、他のＨＭＡｂと比較して１０倍減じた染色を示した(表７)。従って、１１のＨＣＶ ＨＭＡｂの内の９つが、細胞表面に発現されたＥ２タンパク質と強く反応し、ＨＭＡｂの２つが、Ｅ２が細胞表面で発現された際に反応性の有意の減少を示した。
【０１６５】
【表７】
Figure 2004533991
【０１６６】
次に、我々は、これらの４つの異なるグループの抗体により認識される結合部位を含むＨＣＶ Ｅ２の領域の局在性に関心を持った。この目的のために、ｓｆ１ｂ−Ｅ２のアミノ末端からカルボキシ末端まで、欠失を生じさせた。これらの欠失の内で、ｐＤＮ４１１は、ＨＣＶ ｓｆ１ｂ−Ｅ２の超可変域を除去した。他の欠失は、ｓｆ１ｂ−Ｅ２のアミノ末端又はカルボキシ末端から、大きい部分を除去した。これらの欠失したＥ２を、次いで、インサートの細胞表面での発現を与えるベクターｐＤｉｓｐｌａｙ中に再クローン化した。ＨＣＶの遺伝子型１ｂ及びＨ分離株由来の配列を発現するＨＣＶ Ｅ２欠失構築物を構築した(SEQ ID NO:２８〜３５)(図２３)。これらのＥ２欠失構築物の発現を、ＨＥＫ−２９３細胞へのトランスフェクトとその後の、ＨＡエピトープに対するモノクローナル抗体を利用する細胞質抽出物のウエスタンブロット分析により確認した(図２４)。モノクローナル抗体のＣＭＶタンパク質に対する反応性は、認められなかった(データは、示してない)。ｓｆ１ｂ−Ｅ２で見られたように、一層早く移動する控え目なバンド及び一層遅く移動する不均一なスミアの両者が、すべての構築物で観察された。同様の結果が、ｓｆＨ１ａ−Ｅ２及びｐＤＮＨ−４１１で得られた(データは、示してない)。ＤＮＡ配列決定は、これらの構築物の各々が、予想された配列をフレームシフト又はターミネーションを生じることなく発現したことを確認した。
【０１６７】
それ故、これらのＨＣＶ Ｅ２欠失構築物を、ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトして、細胞質抽出物を調製し、Ｅ２の細胞内型をＧＮＡレクチンを利用してミクロ滴定プレート上に捕捉した。次いで、これらのＨＣＶ ＨＭＡｂのＧＮＡ捕捉されたＥ２との反応性を測定した。予想されるように、これらのすべてのＨＣＶ ＨＭＡｂは、ｓｆ１ｂ Ｅ２タンパク質と反応し、疑似トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の抽出物から捕捉されたタンパク質とは反応しなかった(図２５)。これらのＨＣＶ ＨＭＡｂのすべては、ｐＤＮ−４１１により生成されたＥ２とも強く反応性であり、これは、これらのＨＭＡｂに認識されるエピトープがＨＶＲ−１を含まないことを示している。次に、同じ抗体のパネルを、ＨＶＲ１を伴うＨ株(ｓｆＨ１ａ−Ｅ２)(SEQ ID NO:２９)又は伴わないＨ株(ｐＤＮＨ−４１１)(SEQ ID NO:３０)の両方に由来するＨＣＶ Ｅ２の細胞外ドメインに対して試験した。ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−８Ｃ及びＣＢＨ−１１は、ｓｆＨ１ａ又はｐＤＮＨ−４１１を認識せず、これは、これら２つのＨＭＡｂにより認識されるエピトープがＨ株由来のＥ２タンパク質では変異していたことを示唆している。ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−８Ｅ及びＣＢＨ−５のＨ株Ｅ２タンパク質との反応性の有意の減少も又、注意された。これらのＨＭＡｂは、ＨＶＲ１構築物ｐＤＮＨ−４１１との反応性を保持し、これは、これらのＨＭＡｂにより認識されるエピトープがＨＶＲ１の外側にあることを確認する。他のＨＣＶ ＨＭＡｂ及び対照用抗体は、Ｈ株由来のＥ２タンパク質及び遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質との同等の反応性を示した。従って、１１のＨＣＶ ＨＭＡｂの内の９つは、ｓｆ１ｂ−Ｅ２とｓｆＨ１ａ−Ｅ２の間で保存されたエピトープを認識した。
【０１６８】
ｓｆ１ｂ−Ｅ２の配列からのアミノ酸３８４〜４４６(ｐＤＮ−４４７)(SEQ ID NO:３１)又は３８４〜４６９(ｐＤＮ−４７０)(SEQ ID NO:３２)の更なる欠失は、グループIのＨＭＡｂ(ＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１)の反応性を排除した。ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸３８４〜４４５よりなる直線的エピトープを認識することが以前に測定されたラットのＭＡｂ３／１１も又、ｐＤＮ−４４７及びｐＤＮ−４７０とは非反応性であった。対照的に、グループＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのＨＣＶ ＨＭＡｂは、それらの両構築物との反応性を保持した。ＰＤＮ−４４７及びｐＤＮ−４７０(エピトープはこれらのグループのＨＭＡｂにより認識されることを示す)は、ＨＣＶ Ｅ２のカルボキシ末端領域に対して中心に位置された。最後に、カルボキシ末端領域に欠失を有するＥ２タンパク質を、これらのＨＣＶ ＨＭＡｂを用いて評価した。ＣＢＨ−１７を除くすべてのＨＣＶ ＨＭＡｂは、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸３８４〜６４４を発現するＥ２タンパク質(ｐＤＣ−６４４)(SEQ ID NO:３３)と反応性であった。対照的に、ＨＣＶ ＨＭＡｂの何れも、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸３８４〜５７９を発現する構築物(ｐＤＣ−５７９)(SEQ ID NO:３４)と反応性でなかった。このラットＭＡｂ３／１１は、ＨＡ又はｃ−ｍｙｃエピトープに対するＭａｂのように、カルボキシ末端の欠失した両Ｅ２タンパク質との反応性を保持した。従って、アミノ酸６４４〜５７９のＨＣＶ Ｅ２配列の欠失は、コンホメーションエピトープを認識する１０のＨＣＶ ＨＭＡｂすべての反応性を排除するのに十分である。
【０１６９】
ＧＮＡアッセイの利用は、ＨＣＶ ＨＭＡｂの細胞内型欠失体との反応性を確認した。ＨＣＶ ＨＭＡｂの細胞表面で発現されるＥ２の同じ欠失構築物との反応性を確認するために、ＨＭＡｂの、Ｅ２欠失構築物を発現する細胞との結合をフローサイトメトリーにより評価した。ＨＭＡｂグループＩのＣＢＨ−５、ＨＭＡｂグループＩＩＩのＣＢＨ−７及びＨＭＡｂグループＩＩＩのＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｂを用いて構築物を評価した。対照用抗体は、ラットＭＡｂ３／１１及びＨＡを含んだ。Ｅ２欠失構築物ｐＤＮ４１１及びｐＤＮ４４７を用いた代表的結果を図２５に与える。これらのＥ２欠失体のすべてを伴う結果は、表７に含まれている。これらのＥ２欠失体は、ＨＥＫ−２９３細胞に一時的トランスフェクションにより導入されたので、それらの細胞の約５０〜６０％のみがプラスミドを取り込んでＥ２タンパク質を発現した。従って、観察された蛍光の幾何学的意味は、クローン化ＣＨＯ細胞株により得られたものと比較して著しく減少される。それにもかかわらず、フローサイトメトリーにより、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７及びＣＢＨ−４Ｂで得られた結果は、ＧＮＡ捕捉アッセイの結果と完全に一致した(表７)。従って、グループＩＩ及びＩＩＩのＨＭＡｂは、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸４７０〜６４４に位置するエピトープを認識する。グループＩのＨＭＡｂは、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸４１１〜６４４のアミノ酸に位置するエピトープを認識する。
【０１７０】
実施例１０
ＨＣＶ感染を中和することのできる高レベルの抗体は、ＨＣＶ感染した個人においては稀である
患者及び方法
患者。評価した血清は、核酸試験を受けて、１９９１〜１９９９年にＣ型肝炎への感染の診断を確認し又は追跡された個人に由来した。すべての個人は、サンフランシスコ湾地域の診療所で彼らの肝炎を診てもらっていた。これらの患者は、ＨＣＶ ＲＮＡについて、ポリメラーゼ連鎖反応によっては陽性であったが、Ｂ型肝炎表面抗原の存在については陰性であり、遺伝子型分類され、試料が得られた時点で抗ウイルス治療を受けていなかった。人口統計情報は、医学的記録から得られ、年齢、性別、診断期日、以前のインターフェロン治療、アラニントランスアミナーゼ(ＡＬＴ)値及び潜在的曝露経路を含んだ。患者の大部分は、ＨＣＶ感染の少なくとも１つの因子に曝されていると報告された。すべての患者からすべての情報が入手可能な訳ではなかった。肝生検を行なった場合には、組織学的活性インデックス(ＨＡＩ)を利用して記録した。遺伝子型分析を、ＩｎｎｏＬＩＰＡアッセイを製造業者(Innogenetics, ベルギー国、Leuven在)の指示に従って利用して行なった。ＨＣＶウイルス負荷の測定を、ＣＯＢＡＳ Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶモニターキット(Roche molecular system, カリフォルニア、Alameda在)を用いて行なった。ＨＣＶ陰性の対照用血清を、Stanford Medical School 血液センターへの血液ドナーの血漿から得たが、それらは、輸血感染性ウイルスの存在について、標準的な抗体ベースのスクリーニングアッセイにより陰性であった。
【０１７１】
ＨＣＶ血清のＥ２抗体スクリーニング。ＨｅＬａ細胞の単層を、８０％集密まで生育させて、ＨＣＶ Ｅ２を発現するワクシニアウイルスを感染させた。２４時間後に、感染細胞を採集して、抽出物を記載された(Hadlock等、2000)ようにして調製した。ＨＣＶ Ｅ２反応性についてのＥＬＩＳＡアッセイを、以下に概説するように行なった。ミクロ滴定プレートを、５００ｎｇの精製Galanthus nivalisレクチン(１００ｍｌＰＢＳ中)で１時間３７℃でコートした。次いで、ウェルを、ＴＢＳで洗って、ＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳプラス０．１％ ツイーン−２０、２．５％ 正常ヤギ血清、２．５％ 脱脂粉乳)とのインキュベーションによりブロックした。プレートを洗って、各ウェルに１５ｍｌのＨＣＶ Ｅ２含有抽出物(ＢＬＯＴＴＯで希釈)を入れた。１．５時間、２５℃でのインキュベーション後に、ウェルをＴＢＳで洗ってから、ＨＣＶ感染者又は未感染者からの血清の増大する希釈度の希釈物(ＢＬＯＴＴＯにて希釈)を加えた。３０分間のインキュベーションの後に、ビオチン化試験ＨＭＡｂを終濃度２ｍｇ／ｍｌまで加えた。これらのプレートを、１．５時間、２５℃でインキュベートし、ウェルをＴＢＳで３回洗い、１００ｍｌのストレプトアビジン−ＡＰ結合体を、１時間、２５℃で加えた。ウェルを、ＴＢＳで４回洗い、その後、ＰＮＰＰと共にインキュベートした。基質の顕色を３０分間進行させてから、これらのウェルの吸光度を４０５ｎｍでマルチウェルプレートリーダーを利用して測定した。
【０１７２】
競争する血清の各希釈のために、得られた光学密度(ＯＤ)の読みを、競争用抗体を含まないウェルから得られたＯＤと比較した。得られた結合抗体のパーセンテージを、希釈度に対してプロットし、試験ＨＭＡｂ結合の５０％阻止を生じる血清の希釈度を計算するのに使用した。５０％阻止を達成しなかった血清には、力価４０を割り当てたが、それは、試験した最低の希釈を下回った。試料の血清反応性を評価する個人は、試料のウイルス負荷及び臨床的状態を知らされておらず、試験した。統計分析を、InStat and Prismソフトウェアパッケージ(Graph Pad Software Inc, カリフォルニア、San Diego在)を利用して行なった。
【０１７３】
結果
この研究において、ＨＣＶ感染した個人に由来する血清を、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７のＨＣＶ Ｅ２への結合を阻止できる抗体の存在について評価した。ヒトモノクローナル抗体ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を精製してビオチン化し、ＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７の遺伝子型の一致したＥ２タンパク質への結合の５０％阻止を生じる血清の希釈度を測定した。ＨＣＶ陰性の個人由来の血清を用いて、非特異的結合を測定し、カットオフ値を確立した。ＨＣＶ感染した個人に由来する血清を、１／２００以上の希釈でＥ２結合の５０％以上の阻止が得られたならば、競争用抗体の存在について陽性であるとみなした(図２６及び２７)。ＨＣＶ感染した個人に由来する７４の血清の内で、ウイルスＲＮＡ陽性の３５(４７％)は、ＣＢＨ−２結合を阻止する抗体について陽性であり、３２(４３％)は、ＣＢＨ−７結合を阻止する抗体について陽性であった(図２８及び２９)。１５の血清(２０％)は、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７の両方を阻止する抗体の存在につき陰性であった。１９(２７％)の個人は、ＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７の結合を阻止した抗体の一層高い力価(＞１／１０００)を有している(表８参照)。これらの個人は、有意に減じた平均ウイルス負荷(２．４×１０6対４．７×１０6、ｐ＝０．０３５)を有したが、それ以外では他のＨＣＶ感染した個人と異ならなかった。従って、殆どのＨＣＶ感染した個人は、推定の中和活性を有する低レベルの血清抗体により特徴付けられる。低レベルのＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７様ＨＭＡｂを有する個人は、単純な阻止アッセイを利用して同定することができる。ＨＣＶ中和用ヒトモノクローナル抗体例えばＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７の治療的利用は、これらの個人において、価値がある可能性を有している。
【０１７４】
【表８】
Figure 2004533991
【０１７５】
他の具体例
当業者は、前述したものは、単にこの発明のある好適な具体例を表すものであることを容易に認めるであろう。上記の手順及び組成物に対する様々な変化及び改変は、本発明の精神又は範囲から離れることなくなされうるが、それらは、後記の請求の範囲に示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、この出願中に記載のワクシニアウイルス構築物の幾つかによるＨＣＶＥ２タンパク質の発現を示すウエスタンブロットである。
【図２】図２(SEQ ID NO:９〜１２)は、ＨＣＶ Ｅ２ワクシニアウイルスクローンの中心領域から増幅された配列を記載している。
【図３Ａ】図３Ａ(SEQ ID NO:１〜８)は、ＨＣＶの配列：１ａ、Ｑ１ａ−ＦＲ、−１ｂ、１Ｑ１ｂ−ＦＲ、２ａ、Ｑ２ａ−ＦＲ、−２ｂ、−Ｑ２ｂ−ＦＲの、見出された最倹約トリー(most parsimonious tree)を利用した比較である。
【図３Ｂ】図３Ｂ(SEQ ID NO:１〜８)は、ＨＣＶの配列：１ａ、Ｑ１ａ−ＦＲ、−１ｂ、１Ｑ１ｂ−ＦＲ、２ａ、Ｑ２ａ−ＦＲ、−２ｂ、−Ｑ２ｂ−ＦＲの、見出された最倹約トリー(most parsimonious tree)を利用した比較である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＨＣＶ血清の、種々の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との反応性のグラフを示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＨＣＶ血清の、種々の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との反応性のグラフを示している。
【図５】図５は、ＨＣＶに感染した個人由来の血清の、複数の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との反応性を示す棒グラフである。
【図６】図６は、図７、８及び９に記載した実験で用いたＨＣＶ Ｅ２エンベロープタンパク質のコンホメーションエピトープを認識する抗体を評価するための直接結合アッセイの概略図を描いている。
【図７】図７は、レクチンにより捕捉されたＨＣＶ Ｅ２に対するＨＣＶ ＨＭＡｂの反応性の棒グラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、ＨＣＶ抗体の、基準からはずれたＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質との反応性のグラフを示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＨＣＶ抗体の、基準からはずれたＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質との反応性のグラフを示している。
【図９】図９は、ＨＣＶ ＨＭＡｂの、ネイティブ(ＮＡＴ)及び変性(ＤＮＴ)ＨＣＶ １ｂ Ｅ２タンパク質との反応性を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、図１１、１２及び１３に記載の実験で用いた競争的結合分析の該略図を描いている。
【図１１】図１１は、ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−５を利用する競争分析の棒グラフである。
【図１２】図１２は、ＨＣＶ ＨＭＡｂの、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２の複数の遺伝子型のＨＣＶ Ｅ２タンパク質への結合を邪魔する能力を示す競争分析である。
【図１３】図１３は、ＨＣＶ ＨＭＡｂ ＣＢＨ−７がユニークエピトープを認識することを示す競争分析である。
【図１４】図１４は、図１に記載の実験で用いたＣＤ８１のＥ２タンパク質への結合をブロックする抗体の能力の評価の概略図を描いている。
【図１５】図１５は、ＨＣＶ ＨＭＡｂのサブセットが、ＣＤ８１−ＬＥＬと結合したときに、ＨＣＶ Ｅ２と反応することを示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、図１７に記載の実験で用いたＣＤ８１のＨＣＶビリオンへの結合をブロックする抗体の能力の評価の概略図を描いている。
【図１７】図１７は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５がＨＣＶビリオンのＣＤ８１への結合を阻止することを示す棒グラフを示している。
【図１８】図１８は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇを用いて、ＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止する抗体の存在を検出することができることを示す棒グラフである。
【図１９】図１９は、ＨＭＡｂ ＣＢＨ−４Ｇを用いて、ＨＣＶ感染した個人に由来する血清においてＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止する抗体の存在を検出することができることを示す棒グラフである。
【図２０】図２０は、競争アッセイの略画である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、４つのＨＣＶヒトモノクローナル抗体の競争分析を示している。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、４つのＨＣＶヒトモノクローナル抗体の競争分析を示している。
【図２２Ａ】図２２Ａは、ヒトモノクローナル競争分析の結果を示している。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ヒトモノクローナル競争分析の結果を示している。
【図２３】図２３は、ここに記載のＨＣＶ Ｅ２欠失構築物を描いている。
【図２４】図２４は、ＨＣＶ Ｅ２欠失構築物が効率的に発現されることを示す該構築物のウエスタンブロット分析を示している。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ある発明のヒトモノクローナル抗体の、様々なＨＣＶ Ｅ２欠失構築物との反応性を示している。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ある発明のヒトモノクローナル抗体の、様々なＨＣＶ Ｅ２欠失構築物との反応性を示している。
【図２６】図２６は、ＨＣＶ感染した個人に由来する血清が、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を阻止する抗体の変動するレベルを有することを示すグラフを示している。
【図２７】図２７は、ＨＣＶ感染した個人に由来する血清は、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を阻止する抗体の変動するレベルを有することを示す散布図を示している。
【図２８】図２８は、慢性肝炎を有する７４個人のパネルから得られたＣＢＨ−２阻止力価のヒストグラムである。
【図２９】図２９は、慢性肝炎を有する７４個人のパネルから得られたＣＢＨ−７阻止力価のヒストグラムである。

Claims (74)

  1. Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質のコンホメーションエピトープに対する抗体。
  2. Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質のコンホメーションエピトープに対する抗体。
  3. Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２タンパク質のコンホメーションエピトープに対する抗体。
  4. エピトープに対する抗体の解離定数(ＫD)が、１０-7Ｍより小さい、請求項１に記載の抗体。
  5. エピトープに対する抗体の結合定数(ＫD)が、１０-8Ｍより小さい、請求項１に記載の抗体。
  6. エピトープに対する抗体の結合定数(ＫD)が、１０-9Ｍより小さい、請求項１に記載の抗体。
  7. エピトープに対する抗体の結合定数(ＫD)が、１０-10Ｍより小さい、請求項１に記載の抗体。
  8. Ｃ型肝炎ウイルス１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸４１１〜６４４内のコンホメーションエピトープに対する抗体。
  9. Ｃ型肝炎ウイルス１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸４７０〜６４４内のコンホメーションエピトープに対する抗体。
  10. Ｃ型肝炎ウイルス１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸４７０〜６４４内のコンホメーションエピトープに対する抗体であって、請求項８に記載の抗体と最少の交差競争を示す当該抗体。
  11. Ｃ型肝炎ウイルス１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸６４４〜６６１内のエピトープに対する抗体。
  12. ＣＢＨ−２、−４Ｄ、−４Ｂ、−４Ｇ、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ、−９、−１１又は−１７により認識されるエピトープに対する抗体。
  13. 抗体が、そのエピトープへの結合について、ＣＢＨ−２、−４Ｄ、−４Ｂ、−４Ｇ、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ、−９、−１１又は−１７と競争する抗体。
  14. 抗体が、ＨＣＶ Ｅ２のＣＤ８１への結合を阻止する、請求項３に記載の抗体。
  15. 請求項１に記載の抗体を発現する細胞株。
  16. 細胞株が、Ｂ細胞株である、請求項１５に記載の細胞株。
  17. 細胞株が、ヒト細胞株である、請求項１５に記載の細胞株。
  18. 細胞株が、哺乳動物細胞株である、請求項１５に記載の細胞株。
  19. 細胞株が、真核細胞株である、請求項１５に記載の細胞株。
  20. 細胞株が、ハイブリドーマである、請求項１５に記載の細胞株。
  21. 細胞株が、エプスタイン−バールウイルス(ＥＢＶ)によりトランスフォームされている、請求項１５に記載の細胞株。
  22. 細胞株が、ウイルスに感染している、請求項１５に記載の細胞株。
  23. 細胞株が、ファージに感染している、請求項１５に記載の細胞株。
  24. 請求項１に記載の抗体を提示するウイルス。
  25. 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の抗体。
  26. 抗体が、ヒト抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の抗体。
  27. 抗体が、ヒト化抗体である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３に記載の抗体。
  28. 抗体が、哺乳動物抗体である、請求項１に記載の抗体。
  29. 請求項１に記載の抗体及び製薬上許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
  30. ＨＣＶが感染した患者を治療する方法であって、該方法は、下記のステップ：
    ＨＣＶが感染した又はＨＣＶ感染の疑いのある患者を用意し；そして
    その患者に請求項１に記載の抗体を投与する
    ことを含む当該方法。
  31. ＨＣＶに曝された患者を治療する方法であって、該方法は、下記のステップ：
    ＨＣＶに曝された患者を用意し；そして
    その患者に請求項１に記載の抗体を投与する
    ことを含む当該方法。
  32. 抗体を投与するステップが、一種より多くの異なる抗体を投与することを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. ＨＣＶのＥ１タンパク質のコンホメーションエピトープを含むペプチド。
  34. ペプチドが、ＨＣＶのＥ１タンパク質の完全な配列を含まない、請求項３３に記載のペプチド。
  35. ＨＣＶのＥ２タンパク質のコンホメーションエピトープを含むペプチド。
  36. ペプチドが、ＨＣＶのＥ２タンパク質の完全な配列を含まない、請求項３５に記載のペプチド。
  37. ＨＣＶ １ｂのＥ２のアミノ酸４１１〜６４４を含むペプチド。
  38. アミノ酸が、ＨＣＶ １ｂのＥ２のアミノ酸４１１〜６４４と類似している、ＨＣＶのＥ２のアミノ酸配列を含むペプチド。
  39. ＨＣＶ １ｂ Ｅ２のアミノ酸４７０〜６４４を含むペプチド。
  40. アミノ酸が、ＨＣＶ １ｂのＥ２のアミノ酸４７０〜６４４と類似している、ＨＣＶのＥ２のアミノ酸配列を含むペプチド。
  41. ＨＣＶ １ｂ Ｅ２のアミノ酸６４４〜６６１を含むペプチド。
  42. アミノ酸が、ＨＣＶ １ｂのＥ２のアミノ酸６４４〜６６１と類似している、ＨＣＶのＥ２のアミノ酸配列を含むペプチド。
  43. コンホメーションエピトープを含むＨＣＶ Ｅ２のペプチド断片。
  44. ペプチドが、請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２又は４３に記載のペプチドと少なくとも６０％同一であるペプチド。
  45. ペプチドが、請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２又は４３に記載のペプチドと少なくとも７０％同一であるペプチド。
  46. ペプチドが、請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２又は４３に記載のペプチドと少なくとも８０％同一であるペプチド。
  47. ペプチドが、請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２又は４３に記載のペプチドと少なくとも９０％同一であるペプチド。
  48. ペプチドが、化学的に改変されている、請求項３３に記載のペプチド。
  49. ペプチドが、グリコシル化されている、請求項３３に記載のペプチド。
  50. 薬剤の非存在下に対して、薬剤の存在下で、エピトープの抗体への結合と競争するのに十分なだけＨＣＶ Ｅ２コンホメーションエピトープに対する三次元構造的類似性を有する薬剤。
  51. 薬剤の非存在下に対して、薬剤の存在下で、エピトープの抗体への結合と競争するのに十分なだけＨＣＶ Ｅ１コンホメーションエピトープに対する三次元構造的類似性を有する薬剤。
  52. 抗体を、ＣＢＨ−２、−４Ｄ、−４Ｂ、−４Ｇ、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ、−９、−１１又は−１７よりなる群から選択する、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  53. エピトープが、ＨＣＶ １ｂ Ｅ２のアミノ酸４１１〜６４４内のコンホメーションエピトープ、ＨＣＶ １ｂ Ｅ２のアミノ酸４７０〜６４４内のコンホメーションエピトープ又はＨＣＶ １ｂ Ｅ２のアミノ酸６４４〜６６１内のエピトープである、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  54. 薬剤が、ペプチドである、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  55. 薬剤が、小分子である、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  56. 薬剤が、化学化合物である、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  57. 薬剤が、有機化合物である、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  58. 薬剤が、無機化合物である、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  59. 薬剤が、モモトープである、請求項５０又は５１に記載の薬剤。
  60. コンホメーションエピトープを含むＨＣＶ Ｅ２のペプチド断片を含むワクチン。
  61. 請求項１に記載の抗体により認識されるエピトープを含むＨＣＶ Ｅ２のペプチド断片を含むワクチン。
  62. ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−４Ｄ、ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢＨ−８Ｅ、ＣＢＨ−９、ＣＢＨ−１１及びＣＢＨ−１７よりなる群から選択するヒトモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含むＨＣＶ Ｅ２のペプチド断片を含むワクチン。
  63. 請求項３３、３４又は３５に記載のペプチドを含むワクチン。
  64. 請求項５０又は５１に記載の薬剤を含むワクチン。
  65. アジュバントを更に含む、請求項６０に記載のワクチン。
  66. ＨＣＶが感染した患者を分類する方法であって、該方法は、下記のステップ：
    ＨＣＶが感染した患者から血清を用意し；
    抗ＨＣＶモノクローナル抗体のそのエピトープへの結合の、該患者の血清による阻止を測定し；そして
    該患者を、治療を施与する候補者として同定する
    ことを含む当該方法。
  67. 請求項６６に記載の方法であって、該方法は、下記の追加のステップを含む当該方法：
    前記の患者に抗体を投与する。
  68. 抗ＨＣＶモノクローナル抗体が、ＨＣＶ Ｅ２に向けられている、請求項６６に記載の方法。
  69. 抗ＨＣＶモノクローナル抗体を、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７よりなる群から選択する、請求項６６に記載の方法。
  70. 投与のステップが、抗ＨＣＶ抗体により結合されるエピトープに対する抗体を投与することを含み、この結合が患者の血清によって阻止されない、請求項６６に記載の方法。
  71. ＨＣＶ感染を検出する方法であって、該方法は、下記のステップ：
    個人を用意し;
    その個人に由来する体液を請求項３３又は３５に記載のペプチドと、抗体がその抗原に結合するのに適した条件下で接触させ；そして
    抗体のそのペプチドへの結合を検出する
    ことを含む当該方法。
  72. ＨＣＶ感染を検出する方法であって、該方法は、下記のステップ：
    個人を用意し；
    その個人に由来する体液を請求項５０又は５１に記載の薬剤と、抗体／抗原結合に適した条件下で接触させ；そして
    抗体のその抗原への結合を検出する
    ことを含む当該方法。
  73. ＨＣＶの遺伝子型を同定する方法であって、該方法は、下記のステップ：
    個人を用意し；
    その個人に由来する体液を請求項３３又は３５に記載の少なくとも２種のペプチドと、抗体／抗原結合に適した条件下で接触させ；
    抗体のそれらのペプチドへの結合を検出し；そして
    抗体結合のプロフィルを分析して、ＨＣＶの遺伝子型を決定する
    ことを含む当該方法。
  74. 体液が、血液である、請求項７１に記載の方法。
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