JP2004533241A - マイクロサテライトの不安定性の検出および腫瘍診断におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願の相互引用
本出願は、米国特許出願第09/841366号(2001年4月24日出願)(前記は米国特許出願第09/663020号(2000年9月15日出願)の部分継続出願である)に基づく優先権を主張する。
連邦政府支援研究開発に関する記述
本発明は、米国予防衛生研究所による政府の小企業における刷新的研究に対するグラント(US government Small Business Innovation Research Program Grant CA76834-02)を用いて達成された。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
技術分野
本発明は、単純な縦並びの繰返しを含むゲノムDNA領域(例えばマイクロサテライト遺伝子座)における不安定性の検出に関する。本発明は特に、腫瘍に由来する細胞、組織または体液から得られるゲノムDNAのマイクロサテライト遺伝子座セットにおける不安定性の有無についての多重分析に関する。本発明はまた、癌および癌の素因の検出並びに診断にマイクロサテライトの不安定性の分析を使用することに関する。
【0002】
背景技術
ゲノムDNAのマイクロサテライト遺伝子座は、多様な応用(父子鑑定、法医学的検査並びに癌の検出および診断を含むが、ただしこれらに限定されない)のために分析されてきた。癌は、1つまたは2つ以上の腫瘍細胞タイプで不安定な特定のマイクロサテライト遺伝子座で不安定性が存在することによって検出または診断することができる。
マイクロサテライト遺伝子座は、長さが1塩基対から5塩基対の繰返し単位の単純な縦並びの繰返しを有するゲノム領域である。前記のようなマイクロサテライト遺伝子座がヒトゲノム全体に多数分散している。マイクロサテライト遺伝子座は最少の繰返し単位の長さにより分類される。例えば、長さが1塩基対から5塩基対の繰返し単位を有する遺伝子座は、それぞれ“一ヌクレオチド”、“二ヌクレオチド”、“三ヌクレオチド”、“四ヌクレオチド”および“五ヌクレオチド”繰返し遺伝子座と称される。
【0003】
ほとんどの二倍体種(例えば哺乳類種)の正常なゲノムDNAの各マイクロサテライト遺伝子座は、各遺伝子座について2つの対立遺伝子から成る。2つの対立遺伝子は長さが互いに同じでもまたは異なっていてもよく、それぞれ個々に変動することができる。マイクロサテライトの対立遺伝子は通常、個々の対立遺伝子およびその子孫において一定の長さで維持されるが、いくつかの腫瘍タイプではマイクロサテライトの長さに不安定性が観察されている(Aaltonen et al., 1993, Science 260:812-815; Thibodeau et al., 1993, Science 260:816-819; Peltomaki et al., 1993, Cancer Research 53:5853-5855; Ionov et al., 1993, Nature 363:558-561)。腫瘍におけるこのゲノム不安定性の状態(マイクロサテライト不安定性(以下では“MSI”)と称される)は、遺伝性癌症候群、遺伝性非ポリポーシス大腸癌(以下では“HNPCC”)の分子的特徴である。HNPCCのMSIの原因は、機能不全のDNSミスマッチ修復系であると考えられている。前記はDNA修復時に発生するエラーを取り消すことができない(Fishel et al., 1993, Cell 75:1027-38; Leach et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner et al., 1994, Nature 368:258-61; Nicolaides et al., 1994, Nature 371:75-80; Miyaki et al., 1997, Nat. Genetics 17:271-2)。DNA修復時に1つまたは2つ以上の繰返し単位の挿入または欠失がミスマッチの修復をもたらすことなく繰返し発生し、正常および腫瘍DNAサンプルから増幅されたマイクロサテライト遺伝子座で認められる長さの多形性として、対立遺伝子のサイズの比較によって検出することができる(Thibodeau et al., 1993, 上掲書)。
【0004】
MSIは90%を越えるHNPCCで、さらに散発性大腸癌の10−20%で見出された(Liu et al., 1996, Nature Med. 2:169-174; Thibodeau et al., 1993, 上掲書; Ionov et al., 1993, Nature 363:558-561; Aaltonen et al., 1993, Science 260:812-816; Lothe et al., 1993, Cancer Res. 53:5849-5852)。しかしながら、MSIは大腸癌に限定されない。MSIはまた膵臓癌でも(Han et al., 1993, Cancer Res. 53:5087-5089)、胃癌でも(Peltomaki et al., 1993, Cancer Res. 53:5853-5855; Mironov et al., 1994, Cancer Res. 54:41-44; Rhyu et al., 1994, Oncogene 9:29-32; Chong et al., 1994, Cancer Res. 54:4595-4597)、前立腺癌でも(Gao et al., 1994, Oncogene 9:2999-3003)、子宮内膜癌でも(Risinger et al., 1993, Cancer Res. 53:5100-5103; Peltomaki et al., 1993, Cancer Res. 53:5853-5855)、さらに乳癌でも(Patel et al., 1994, Oncogene 9:3695-3700)検出された。
HNPCCの遺伝学的根拠は、いくつかのDNAミスマッチ修復遺伝子(以下では“MMR”)の1つにおける生殖細胞系列の突然変異であると考えられる(Leach et al., 1993 Cell 75:1215-1225; Fishel et al., 1993 Cell 75:1027-38; Leach et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner et al., 1994 Nature 368:258-61; Nicolaides et al., 1994 Nature 371:75-80; Miyaki et al., 1997 Nat. Genetics 17:271-2; Papadopoulos et al., 1994 Science 263:1625-1629)。HNPCC患者では、50−60%が2つの修復遺伝子、MSH2およびMLH1に遺伝性の突然変異を保有すると報告されている(Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074)。さらにまた、その腫瘍が高頻度MSI(以下では“MSI−H”)表現型を示すHNPCC症例の70−100%が、これら2つの遺伝子で生殖細胞系列の突然変異を有すると報告されている。HNPCC患者ではMSH6、MSH3、PMS1およびPMS2遺伝子における生殖細胞系列突然変異はほとんど報告されておらず、これらのミスマッチ修復遺伝子における遺伝性突然変異はHNPCCではマイナーな役割しか果たしていないことを示唆している(Peltomaki et al., 1997 Gastroenterology 113:1146-1158; Liu et al., 1996 Nat. Med. 2:169-174; Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074)。機能的な修復タンパク質がなければ、複製中に発生するエラーは修復されず、高率の突然変異を生じ、腫瘍発生の可能性が増す。
【0005】
繰返しDNAは特に複製時のエラーに敏感で、したがってミスマッチ修復系の機能不全はマイクロサテライト領域で広範囲の変化を生じる。機能的なミスマッチ修復系をもたない酵母細胞の研究によって、一ヌクレオチド、二ヌクレオチド、三ヌクレオチド、四ヌクレオチド、および五ヌクレオチド繰返しでそれぞれ2800倍、284倍、52倍および19倍の突然変異率の増加が示された(Sia et al., 1997 Molecular and Cellular Biology 17:2851-2858)。ミスマッチ修復遺伝子の突然変異は腫瘍発生で直接的な役割を果たすとは考えられていないが、むしろDNA複製のエラーを持続させることによって作用を及ぼす。ミスマッチ修復欠損細胞は高い突然変異誘発率を有し、これらの変異が腫瘍誘発に関与する遺伝子で発生する場合、その結果は腫瘍の発生につながるであろう。MSI陽性腫瘍は、増殖コントロール、アポトーシスおよびDNA修復に関与するいくつかの遺伝子(例えばTGFBRII、BAX、IGFIIR、TCF4、MSH3、MSH6)のコード領域の一ヌクレオチド繰返しにおいて体細胞性フレームシフト変異を保有することが見出された(Planck et al., 2000 Genes, Chromosomes & Cancer 29:33-39; Yamamoto et al., 1998 Cancer Research 58:997-1003; Grady et al., 1999 Cancer Research 59:320-324; Markowitz et al., 1995 Science 268:1336-1338; Parsons et al., 1995 Cancer Research 55:5548-5550)。変化がもっとも一般的である遺伝子座はTGFBRIIで、この遺伝子座に関しては、90%を越えるMSI−H大腸癌が、前記遺伝子座に存在する10塩基ポリアデニン繰返しに変異を含むことが見出されている(Markowitz et al., 1995 Svience 268:1336-1338)。
【0006】
MSIは、ミスマッチ修復遺伝子が関与するか否かに関わらずほぼ全てのHNPCCで生じる。MSIはまた、腫瘍発生の初期に生じることが示された。前記2つの要素は、MSI分析がHNPPC検出のための優れた診断検査になる一因を与えた。さらに、MSI分析は有用なプレスクリーニング検査として機能し、更なる遺伝的検査を要する潜在的HNPCC患者を特定することができる。散発性大腸癌のMSI分析もまた望ましい。なぜならばMSI出現は予後が良好であるか否かについて相関性を有するからである(Bertario et al., 1999 International J. Cancer 80:83-7)。
HNPCCの診断に関する長い間の問題の1つは、HNPCC罹患者の大腸腫瘍の生検は散発性大腸癌と外観が病理学的に同じで、症状の診断を困難にしているということである。HNPCCの患者の予後判定、治療および追跡処置は異なっているので、より決定的な診断方法を見つけることは重要である。しかしながら、変異について既知のホットスポットをもたない大型の遺伝子である少なくとも5つの既知のMMR遺伝子が存在するために、HNPCC患者における変異の検出は依然として困難である。直接的遺伝子配列決定は突然変異検出のためのもっとも正確な方法であるが、前記の方法は時間を要し高価でもある(Terdiman et al., 1999 The American Journal of Gastroenterology 94:23544-23560)。さらにまた、検出される多くの変異はミスマッチ修復タンパク質の機能に対して影響を及ぼさない無害な多形性であるので、高感度および特異性を配列決定単独で得ることは困難であろう。
マイクロサテライト遺伝子座のDNA分析は、特定の癌タイプの検出に使用される血液検査の開発を理論的に可能にする。腫瘍DNAは環境中に遊離され、特に多数の異なる癌タイプで血漿および血清中に高濃度で存在することが初期の研究によって示された(Leon et al., 1977 Cancer Res. 37:646-650; Stroun et al., 1989 Oncology 46:318-322)。それ以来、ポリメラーゼ連鎖反応(以下では“PCR”)を用いて、いくつかの異なる腫瘍タイプから得られた血液中に放出されたDNAがマイクロサテライトDNAの分析によって検出されてきた(Hibi et al., 1998 Cancer Research 58:1405-1407; Chen et al., 1999 Clinical Cancer Research 5:2297-2303; Kopreski et al., 1999 Clinical Cancer Research 5:1961-1965; Fujiwara et al., 1999 Cancer Research 59:1567-1571; Chen et al., 1996 Nature Medicine 2:1033-1034; Goessl et al., 1998 Cancer Research 58:4728-4732; Miozzo et al., 1996 Cancer Research 56:2285-2288)。
【0007】
担癌患者から得られた血液で検出された最初の腫瘍特異的配列は変異を有するK−ras遺伝子であった(Vasioukhin et al., 1994 Br. J. Haematol. 86:774-779; Sorenson et al., 1994 Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 3:67-71; Sorenson et al., 2000Clinical Cancer Research 6: 2129-2137; Anker et al., 1997 Gastroenterology 112:1114-1120)。さらに最近になって頭部および頸部の扁平上皮癌(Nawroz et al., 1996 Nature Med. 2:1035-1037)および小細胞肺癌(Chen et al., 1996 Nature Med. 2:1033-1035)から得られた血漿および血清の可溶性腫瘍DNAでマイクロサテライトの不安定性が検出された。上記の検出は、多くの他の癌タイプに由来する循環腫瘍DNAのマイクロサテライトの不安定性についての研究を促した。Hibiらはマイクロサテライトマーカーを用い、大腸癌患者の血清DNAにおける遺伝的変化の存在について調べた(K. Hibi et al., 1998 Cancer Research 58:1405-1407)。Hibiらはまた、大腸癌患者の原発腫瘍の80%がMSIおよび/またはヘテロ接合性の消失(以下では“LOH”)(以下で考察するまた別の突然変異型)を示すことを報告した。マイクロサテライト変異またはLOH変異は対を形成する血清DNAで検出されなかった。しかしながら、同一のK−ras変異が対応する腫瘍および血清DNAで見出され、腫瘍DNAは前記血液中に存在することを示唆した(同書)。
【0008】
循環腫瘍細胞および微小転移巣の検出もまた予後判定および治療に重要な関わりを有するであろう。播種された腫瘍細胞は非常に少数として存在するので、それら細胞は通常の免疫細胞学的検査では容易に検出することはできない(免疫細胞学的検査では、10000から100000個の正常細胞中の1個の腫瘍細胞を検出できるだけである(Ghoussein et al., 1999 Clinical Cancer Research 5:1950-1960)。DNAまたはRNAにおける腫瘍特異的異常のPCR増幅によるより感度の高い分子的技術は、眼にみえない(隠れた)腫瘍細胞の検出を極めて容易にした。100万個の正常細胞中で1個の腫瘍細胞を日常的に検出することができるPCRによる検査が、白血病、リンパ腫、メラノーマ、神経芽腫および種々のタイプの癌で循環腫瘍細胞および微小転移巣を特定するために考案された(同書)。
播種された腫瘍細胞を検出するほとんどの場合の標的はmRNAであった。しかしながら、DNA標的がいくつか用いられ成功した(前記には上記で述べたように大腸癌のK−ras変異が含まれる)。いくつかの腫瘍細胞タイプでマイクロサテライトの不安定性が存在することによって、前記不安定性により生じたこれら腫瘍特異的変異は隠れた腫瘍細胞のPCRによる検出のための標的として機能することができるのではないかという可能性が生じた。
【0009】
どのようにしてMSIを正確に限定し正確に測定するかについては顕著な矛盾が存在する(Boland, 1998 Cancer Research 58:5248-5257)。種々の腫瘍におけるMSIの頻度に関する報告は極めて変動する。例えば、膀胱癌におけるMSIの頻度について、別個の実験が3%から95%の範囲のMSIを報告している(Gonzalez-Zulueta et al., 1993 Cancer Research 53:28-30; Mao et al., 1996 PNAS 91:9871-9875)。MSIの範囲を限定することに関する1つの問題は、前記は腫瘍特異的でもあり、遺伝子座依存的でもあるということである(Boland et al., 上掲書)。したがって、単一の研究において特定の腫瘍タイプで観察されるMSIの頻度は、分析される腫瘍の数、調べられる遺伝子座の数、腫瘍がMSIを有するという判定の変更を与えるためにどれくらい多くの遺伝子座が必要であるのか、さらに個々の遺伝子座のどれを分析に含めるかによって左右されるであろう。これらの問題の解析に役立てるために、米国癌研究所がMSIに関するワークショップのスポンサーになり、この分野を統一した(同書)。ワークショップの結果、5つのマイクロサテライトのセットがこの分野における将来の研究のためのリファレンスパネルとして提唱された。このパネルは2つの一ヌクレオチド遺伝子座BAT−25、BAT−26、および3つの二ヌクレオチド遺伝子座D5S346、D2S123、D17S250を含む。
腫瘍サンプルのMSI分析における1つの固有の問題は、あるマーカーに対する正常な対立遺伝子の1つがLOHのために失われており、他の新規なフラグメントが前記マーカーのために存在しない場合に生じる(同書)。前記の事例が真のLOHを表しているのか、またはMSIを表しているのかは容易には識別できない(MSIの場合、シフトされた対立遺伝子は残りの野生型対立遺伝子と一緒に移動している)。前記MSIに関するNCIワークショップの推奨では、前記のような事例はMSIと呼ばない。このタイプの問題を最少にする1つの方法は、大腸腫瘍で低頻度のLOHを示す遺伝子座を用いることであろう。
【0010】
疾患の治療および予後の決定に用いられる臨床診断アッセイでは、検査は高度に正確で(偽陰性が少ない)、さらに特異的(疑陽性率が低い)であることが要求される。情報量の多い多数のマイクロサテライト遺伝子座が特定され、MSI検査用に推奨された(Boland et al. 1998上掲書)。しかしながら、もっとも情報量の多いマイクロサテライト遺伝子座でさえ感度は100%ではなく、特異性も100%ではない。個々のマーカーを用いる感度の欠如を代償するために、マルチマーカーを用いて検出力を高めることができる。マルチマーカー分析に必要な労力の増加は、多重化によって相殺することができる。多重化は1本の試験管内で1組の遺伝子座の同時増幅および同時分析を可能にし、さらに完全な分析に必要なDNA総量をしばしば減少させることができる。与えられた任意の癌タイプのMSIアッセイの特異性を高めるために、NCIワークショップで特定された5つの高度に情報量を有するマイクロサテライト遺伝子座パネル(上記を参照されたい)を改変し、同様に有用な他の遺伝子座と交換または付加することが推奨された(Boland et al. 1998, p.5250上掲書)。より大量の遺伝子座を増幅および分析することによって得られる情報量の増加は、検査結果の解釈における信頼性および正確さを高める。
【0011】
多重MSI分析によって正確さおよびMSI表現型の識別に関する問題は解決したが、複雑さが加わったことによって分析はより骨の折れるものとなろう。例えば、マイクロサテライト遺伝子座が多重形式で同時増幅および同時分析されるとき、データ解釈の容易さおよび正確さに影響を与える要因の重要性ははるかに大きくなる。正確なデータ解釈に影響を与える要因の1つは、PCR時にマイクロサテライト遺伝子座で発生する吃音様断続生成物(スタッター、stutter)の量である(Bacher & Schumn, 1998 Profiles in DNA 2:3-6; Perucho, 1999 Cancer Research 59:249-256)。スタッター生成物は、PCRの過程で生成される小さなフラグメントで、主要な対立遺伝子とコアの繰返し単位の倍数分だけサイズが異なっている。マイクロサテライト遺伝子座で観察されるスタッターの量は、コアの繰返し単位の長さと反比例する傾向がある。したがって、スタッターは一繰返しおよび二繰返し遺伝子座でもっとも強く出現し、三ヌクレオチド、四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返しで減少する(Bacher & Schumn, 1998上掲書)。多重化ではスタッターが少ない遺伝子座を使用することによって前記の問題を大きく減少させることができよう。しかしながら、パーセントスタッターは個々の繰り返し単位内でさえ大きく変動するので、遺伝子座の注意深い選択はスタッターの少ない遺伝子座の選択でもなお必要である(Micka et al., J. Forensic Sciences 44:1-15)。
【0012】
マイクロサテライト多重系は、主に遺伝子型決定、マッピング実験、およびDNAタイピングに用いるために開発された。これらの多重系は、多数のマイクロサテライト遺伝子座を一反応で同時に増幅させ、続いて得られた増幅対立遺伝子のサイズを検出するようにデザインされている。DNAタイピング分析の場合、多数のマイクロサテライト遺伝子座を使用することによって1つの遺伝子座での適合確率は劇的に高められる。適合確率はDNAタイピングで用いられる一般的統計量で、任意に選択した個体と同じDNAパターンを見つけるまでに検索しなければならない個体数の範囲を定める。例えば、4遺伝子座多重系(GenePrint(登録商標)CTTv Multiplex System, Promega)は、8遺伝子座多重系(GenePrint(登録商標)PowerPlex(登録商標)1.2 System, Promega)(これは2.74x108で適合確率1を有する)と比較して、アフリカ人−アメリカ人集団の252.4で適合確率1を有する(Proceedings:American Academy of Forensic Sciences (Feb. 9-14,1998), James W. Schumm et al., p.53, B88;(同書)Sandra D. Gibson et al., p.53, B89;(同書)Katherine Lazaruk et al., p.51, B83;R. Sparkes et al., 1996 Int. J. Legal. Med. 109:186-194)。市販ルートで入手可能な他のDNAタイピング用多重系にはAmpFlSTRプロファイラー(登録商標)およびAmpFlSTRコファイラー(Cofiler)(登録商標)(AmpFlSTR Prifiler(登録商標)PCR Amplification Kit User7s Manual (1997), i-viiiおよび1-1から 1-10;およびAmpFlSTR Cofiler(登録商標)PCR Amplification Kit User Bulletin (1998), i-iiiおよび1-1から1-10,両文献ともPerkin-Elmer Corpにより刊行)が含まれる。DNAタイピング用多重系の他に、いくつかの多重マイクロサテライト系が疾患(例えば癌)の検出のために開発された。そのような系の1つ(“HNPCCマイクロサテライト不安定性検査”)はロシュダイアグノスチクス(Roche Diagnostics)によって開発され、前記検査では、5つのMSI遺伝子座(BAT25、BAT26、D5S436、D17S250およびD2S123)が同時増幅され分析される。また別の系、特にMSIに対して高い感度および分析の容易さと正確さのためにスタッターが少ないさらに別の遺伝子座を含む系が必要とされている。
本発明の材料と方法は、種々の供給源(種々のタイプの組織、細胞および体液を含む)から得られるヒトゲノムDNAの特定のマイクロサテライト遺伝子座の多重分析で使用するようにデザインされている。本発明は従来の技術を凌ぐ顕著な改善を示し、MSI遺伝子座の識別力、正確さの増加、並びにMSI分析と前記遺伝子座の変異に関係する疾患(例えば癌)診断の処理量の増加をもたらす。
【0013】
発明の要約
本発明は、マイクロサテライト遺伝子座またはマイクロサテライト遺伝子座セットの増幅および分析のための方法およびキットを提供する。本発明はまた、腫瘍組織または癌細胞に由来するヒトゲノムDNAの多数のマイクロサテライト遺伝子座を同時増幅することによって、個体の癌を検出するための方法およびキットを提供する。
ある特徴では、本発明は以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法を提供する:(a)ゲノムDNAの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを1本の試験管で同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記遺伝子座セットは少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含み;(b)ゲノムDNAサンプルに由来する少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座の前記セットを多重増幅反応で前記プライマーを用いて同時増幅し、それによって増幅DNAフラグメントを生成し;さらに(c)前記増幅DNAフラグメントのサイズを決定する。
別の特徴では、本発明は、少なくとも2つの別個のゲノムDNAサンプルの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅する方法を提供する。ここで第一のサンプルは1つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来し、第二のサンプルは前記個体の第二の生物学的材料に由来する。前記少なくとも2つのヒトゲノムDNAサンプルは、少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットに存在する各遺伝子座のためのプライマーを用いて、別個の多重増幅反応で同時増幅される。前記2つの多重反応から得られた増幅DNAフラグメントのサイズを互いに比較し、第二のヒトゲノムDNAサンプルの前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のいずれかにおける不安定性を検出する。
【0014】
本発明の別の態様は、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択されるヒトゲノムDNAの少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を分析する方法である。前記のMONO−11およびMONO−15から成る群から選択される少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を分析する方法は以下の工程を含む:(a)少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の少なくとも1つのプライマーを提供し;(b)ヒト対象者個体の生物学的材料に由来するゲノムDNAサンプルの少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を前記少なくとも1つのプライマーを用いて増幅し、それによって増幅DNAフラグメントを生成し;さらに(c)前記増幅DNAフラグメントのサイズを決定する。好ましくは、前記増幅DNAフラグメントは、ヒト集団の該当遺伝子座でもっとも一般的に観察される対立遺伝子のサイズと前記増幅DNAフラグメントのサイズとを比較することによって、前記少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座のマイクロサテライトの不安定性を検出するために分析される。また別には、前記方法を用いて、1つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来するヒトゲノムDNAサンプルの少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を増幅し、さらにマイクロサテライトの不安定性は、得られた増幅DNAフラグメントを工程(b)で得られたものと比較することによって検出される。
【0015】
本発明のまた別の実施態様は、対象者個体から単離されたDNAのマイクロサテライトの不安定性を検出する、以下を含むキットである:1つの一ヌクレオチド遺伝子座および2つの四ヌクレオチド遺伝子座を含む少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。
上記に簡単に記載した本発明の方法およびキットの種々の実施態様は、腫瘍細胞または癌細胞のMSIの検出で使用するために特に適している。特に、本発明の方法およびキットを用いて、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、または、生物学的材料(例えば組織または体液、好ましくは腫瘍または癌性細胞に由来するDNAを含むか、または含むと思われる生物学的材料)に由来する少なくとも1つのゲノムDNAサンプルの、1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを増幅させることができる。単形態性または準単形態性遺伝子座(例えばMONO−11およびMONO−15)の場合、該当遺伝子座の標準的パターンを有する集団の任意の個体に由来する正常なDNAを増幅することによって作製されたパターンと前記の生成パターンとを比較することができる。しかしながら、陽性結果がMSIではなく生殖細胞系列の変異を反映しているのではないことを担保するために、前記腫瘍DNAを得た個体と同じ個体の正常組織に由来するDNAを使用するのが好ましい。
【0016】
前記方法およびキットはまた、個体の正常組織から得たDNAの多重増幅の結果を同じ個体の他の生物学的材料から得たDNAの多重増幅の結果と比較するために用いることができる。本発明の方法のこの固有の実施態様を使用し、正常細胞との比較によって腫瘍細胞のMSIを検出することについては図1で説明されている。特に図1は四ヌクレオチド繰返し(GATA)を示し、前記はポリメラーゼ連鎖反応(“PCR”)でプライマー対(“プライマーA”および“プライマーB”)によって増幅される。続いて毛細管電気泳動を用いて増幅された対立遺伝子をサイズによって分離し、分画された増幅対立遺伝子をジーンスキャン(GeneScan(登録商標))ソフトによって作図する。正常DNAから得られた増幅DNAの図表には2つの対立遺伝子および小さなスタッターのピークのみが出現するが、一方、増幅された腫瘍DNAの図表には2つの対立遺伝子の他に3つのMSIピークが出現していることに留意されたい。
本発明の特徴の利点およびより完全な評価は、以下の図面、好ましい実施態様の詳細な説明および添付の請求の範囲を吟味することによって得られるであろう。図面は説明と例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定しようとするものではないことは明瞭に理解されよう。
【0017】
発明の開示
A.定義
以下の定義は、本発明の記載および限定に用いられる以下の用語の範囲および細部の明瞭で一貫した理解の提供を容易にしようとするものである。
本明細書で用いられるように、“対立遺伝子”は、特定の染色体上の位置(遺伝子座)に存在する遺伝子またはDNA配列のいくつかの選択可能形態の1つを指す。各常染色体の遺伝子座で、個体は2つの対立遺伝子(1つは父親から1つは母親から遺伝する)を有する。
本明細書で用いられるように、“増幅する”とは、核酸(例えばゲノムDNA)のある特定の遺伝子座から多数のコピーが生成される過程を指す。増幅は、以下を含む多数の公知の手段のいずれかを用いて実施できる(ただしこれらに限定されない):ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(R.K. Saiki et al., 1985 Science 230:1350-1354)、転写利用増幅(D.Y. Kwoh & T.J. Kwoh, American Biotechnology Laboratory, October, 1990)および鎖置換増幅(SDA)(G.T. Walker et al., 1992 Proc Natl. Acad. Sci., USA 89:392-396)。
本明細書で用いられるように、“同時増幅”は、同じ容器内の単一の増幅反応で2つまたは3つ以上の遺伝子座から多数のコピーが生成される過程を指す。
【0018】
本明細書で用いられるように、“DNA多形性”は、ある遺伝子座について集団内に2つまたは3つ以上の対立遺伝子が存在することをいう。本明細書で用いられるように、“遺伝子座”は、個々の遺伝子またはDNA配列の位置を特定する固有の染色体上の位置をいう。本明細書で用いられるように、“遺伝子座特異的プライマー”は、指定の遺伝子座または前記遺伝子座の少なくとも1つの対立遺伝子に対して相補的な鎖の一部分と特異的にハイブリダイズし、さらに当該増幅方法で用いられる条件下では他のDNA配列と効率的にハイブリダイズしないプライマーをいう。
本明細書で用いられるように、“ヘテロ接合性の消失”(以下では“LOH”)とは、個体が生まれつきヘテロ接合体であるマーカーについてアッセイすることによって検出される、ある染色体上の対立遺伝子の消失を指す。特に、LOHは、一人の特定の対象者から得た2つの異なるゲノムDNAサンプル(1つのサンプルは正常な生物学的材料に由来し、他方は腫瘍または前癌状態の組織に由来する)の増幅で観察することができる。正常な生物学的材料に由来するDNAは2つの異なる長さの対立遺伝子を生成し、腫瘍サンプルは増幅される同じ遺伝子座の2つの長さの対立遺伝子のうち1つのみを生成する場合は、前記腫瘍はLOHを示している。
【0019】
本明細書で用いられるように、“マイクロサテライト遺伝子座”とは、1つから7つ、より好ましくは1つから5つ、非常に好ましくは1つから4つの塩基対の長さを有する短い繰返し配列エレメントを含むゲノムDNAの領域を指す。マイクロサテライト遺伝子座の中で少なくとも1回繰り返される各配列は、本明細書では“繰返し単位”と称される。各マイクロサテライト遺伝子座は好ましくは少なくとも7つの繰返し単位、より好ましくは少なくとも10個の繰返し単位、さらに非常に好ましくは少なくとも20個の繰返し単位を含む。
本明細書で用いられる“マイクロサテライト不安定性”(以下では“MSI”)は、ある対象者の一定の組織、細胞または体液から得られたゲノムDNAの対立遺伝子の長さがマイクロサテライト遺伝子座で変化する遺伝的不安定性の様式をいう。具体的には、MSIは個々の対象者から得られた2つの異なるゲノムDNAサンプル(例えば健康な組織と癌性組織)の増幅に際して観察することができる(この場合、正常サンプルは1つまたは2つの長さが異なる増幅された対立遺伝子を生じ、腫瘍サンプルでは、増幅された対立遺伝子の少なくとも1つは前記遺伝子座のDNAを含む正常サンプルの増幅対立遺伝子とは長さが異なる)。MSIは一般には、マイクロサテライト遺伝子座で少なくとも1つの繰返し単位が挿入または欠失した結果として生じる。
【0020】
本明細書で用いられるように、“MSI−H”は、高頻度のMSIをもつ腫瘍を分類するために用いられる用語である。5つのマイクロサテライト遺伝子座(例えば米国立癌研究所の1998年のHNPCCに関するワークショップでHNPCCの検出に使用するために選択された5つのマイクロサテライト遺伝子座)を分析したとき、前記遺伝子座の少なくとも2つが不安定性を示すとき腫瘍はMSI−Hと分類される(Boland, 1998 Cancer Research 58:5248-5257)。6つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を分析した場合、腫瘍に由来するゲノムDNAのマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも30%が不安定であることが判明したとき、前記腫瘍はMSI−Hと分類される。
本明細書で用いられるように、“MSI−L”は、低頻度のMSIをもつ腫瘍を分類するために用いられる用語である。5つのマイクロサテライト遺伝子座(例えば米国立癌研究所の1998年のHNPCCに関するワークショップでHNPCCの検出に使用するために選択された5つのマイクロサテライト遺伝子座)を分析したとき、前記遺伝子座の1つだけが不安定性を示すとき腫瘍はMSI−Lと分類される。6つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を分析した場合、腫瘍に由来するゲノムDNAのマイクロサテライト遺伝子座の30%未満が不安定であることが判明したとき、前記腫瘍はMSI−Lと分類される。MSI−Lの腫瘍は、MSI−Hの腫瘍とは潜在的に異なる分子的病因を有する別個のミューテーターの表現型であると考えられる(Thibodeau, 1998; Wu et al., 1999 Am. J. Hum. Genetics 65:1291-1298)。正確にMSI−HとMSI−L表現型を区別するためには、6つ以上のマイクロサテライトマーカーを分析するように推奨されている(Boland 1998 上掲書;Frazer et al., 1999 Oncology Research 6:497-505)。
【0021】
本明細書で用いられるように、“MSS”は、マイクロサテライトが安定である(いずれのマイクロサテライト遺伝子座も不安定性を示さない)腫瘍を指す。MSI−LとMSSとの区別もまた、5つよりはるかに多い数のマーカーを用いたときにのみ達成できる。米国立癌研究所は、前記の目的のため、および上記のMSI−HとMSI−Lとを明瞭に区別する目的のためにはさらに別の19個の一ヌクレオチドおよび二ヌクレオチド繰返し遺伝子座を使用することを推奨した(Boland, 1998上掲書)。
本明細書で用いられるように“MSI−L/S”は、MSI−LまたはMSSのいずれかであると分類された全てのものを指す。
本明細書で用いられるように“マイクロサテライトマーカー”は、マイクロサテライト繰返しおよび前記繰返し領域に接する核酸配列を含むゲノムDNAのフラグメントを指す。
本明細書で用いられるように“単形態性”とは、ただ1つの対立遺伝子パターンが集団の全メンバーの正常なゲノムDNAに存在することが判明したゲノムDNAの遺伝子座を指す。
本明細書で用いられるように“ヌクレオチド”はDNA分子の塩基単位を指し、これは、1つのホスファチジル骨格単位および4塩基(アデニン(“A”)、チミン(“T”)、グアニン(“G”)およびシトシン(“C”))のうちの1つを含む。
【0022】
本明細書で用いられるように“ポリメラーゼ連鎖反応”または“PCR”は、変性、プライマーによるアニーリングおよびDNAポリメラーゼによる伸長の繰返しにより標的DNA配列のコピー数を約106倍またはそれ以上増幅する技術を指す。核酸を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応の工程は、米国特許第4683195号および4683202号(前記両文献は参照により本明細書に含まれる)に含まれる。
本明細書で用いられるように“プライマー”とは、その3’末端がDNAポリメラーゼ酵素による重合反応部位として機能できるように、標的DNAの遺伝子座を含む一方の鎖とハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドまたはDNAフラグメントを指す。
本明細書で用いられるように“プライマー対”とは、標的DNAの対向する鎖と増幅されるべきヌクレオチド配列に接する標的DNAの領域でハイブリダイズする一対のプライマーを指す。
本明細書で用いられるように“プライマー部位”とは、プライマーがハイブリダイズする標的DNAの領域を指す。
本明細書で用いられるように“準単形態性”とは、ただ1つの対立遺伝子パターンがある集団のほぼ全てのメンバーの正常なゲノムDNAで存在することが判明しているゲノムDNAの遺伝子座を指す。
本明細書で用いられるように“スタッター”とは、マイクロサテライト遺伝子座の増幅後に認められる小さなフラグメントを指し、主たるフラグメントまたは対立遺伝子よりも小さい1つまたは2つ以上の繰返し単位の長さを有する。前記は、増幅過程でDNAポリメラーゼのすべり現象により生じると考えられている(Levinson & Gutman, 1987 Molecular Biology Evolution 4:203; Schlotterer & Tautz, 1992 Nucleic Acids Research 20:211)
【0023】
B.増幅または同時増幅させる遺伝子座の選択
本明細書で例示および考察される本発明の実施態様の各々で増幅または同時増幅される少なくとも1つのMSI遺伝子座は一ヌクレオチド繰返し遺伝子座である。前記のような遺伝子座は、機能不全のDNAミスマッチ修復系を有する腫瘍で非常に変化し易いことが示され(Parsons, 1995上掲書)、そのような遺伝子座の有用性が特に癌および機能不全DNAミスマッチ修復系が関与する他の疾患の検出で高められた。ある研究者グループは、ただ1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座(BAT−26)を増幅および分析することによって、160の腫瘍サンプルのうち159で(99.4%の精度)MSI−H状態を正しく確認することができたと報告した(Hoang et al., 1997 Cancer Research 57:300-303)。
いくつかの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座(BAT−26を含む)はまた、準単形態性を有することが確認された。単形態性または準単形態性は、正常/腫瘍対合サンプルの比較をより簡単にする。なぜならば、正常サンプルのPCR生成物は一般に全て同じサイズで、腫瘍サンプルのいずれの変化も容易に特定できるからである。
【0024】
ゲノムDNA分析で一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を使用することの主要な欠点は、前記のような遺伝子座のいずれの増幅も、種々の長さを有する大量の異質なDNA増幅フラグメント(“スタッター”生成物)を増幅反応中に生じるということである。そのような人工産物は、はるかに長い繰返し単位を有する遺伝子座の増幅生成物ではより低い度合いで存在する。繰返し単位の長さと異質な増幅フラグメントの存在との関係の説明には図2を参照されたい。図2は、五ヌクレオチドから一ヌクレオチド繰返し遺伝子座まで繰り返し単位の長さが減少するにつれて人工産物のスタッターが増加することを示している。
一ヌクレオチド遺伝子座が単形態性または準単形態性である場合は、しかしながら対立遺伝子のサイズシフトを容易に検出することができ、たとえ重度にスタッターが存在したとしてもMSIは顕示される。遺伝子座が準単形態性であるときは、サイズシフトの検出は、マイクロサテライト不安定性が示されると考えられる個体の生物学的材料(例えば腫瘍組織または体液)から得られるゲノムDNAの増幅対立遺伝子を、1つの集団の対応する遺伝子座でもっとも一般的に観察される対立遺伝子のサイズと比較することによって実施できる。この特質によって、単一の標準対立遺伝子または標準対立遺伝子パネルのパターンを用いて個々の結果を分析し、個体の一定のゲノムDNAにおけるマイクロサテライト不安定性の検出のために前記個体から採取しなければならないサンプル量を最小限にすることができる。
【0025】
本発明の方法でまたは本発明のキットを用いて増幅されるマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも1つは、好ましくは一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、より好ましくは準単形態性一ヌクレオチド繰返し遺伝子座である。本発明の方法およびキットで使用するために選択される前記一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、好ましくは癌性生物学的材料では不安定であるが、正常な生物学的材料では不安定ではない。BAT−25、BAT−26およびBAT−40は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌の特徴を有する大腸腫瘍でMSIの識別に有用な一ヌクレオチド繰返し遺伝子座として認定された(Zhou et al., 1998 Genes, Chromosomes & Cancer 21:101-107; Boland et al., 1998 Cancer Research 58:5248-5257; Dietmaier et al., 1997 Cancer Research 57:4749-4756; Hoang et al., 1997 Cancer Research 57:300-303)。2つのまた別の遺伝子座(本明細書ではMONO−11およびMONO−15と認定)は、コンピュータ化公開配列情報データベース(GenBank)の検索により特定され、前記のような遺伝子座として上記で確認されたとおりの好ましい特徴を有することが判明した。本発明での使用に適した一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の検索および特定は実施例2で説明される。同様な技術を用いて、本発明の方法およびキットで使用するために適した他の一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を特定することができる。
【0026】
本発明の方法にしたがって、または本発明のキットを用いて増幅または同時増幅される一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、好ましくは準単形態性であり、与えられた用途について対象組織タイプで不安定性を示す。MONO−11およびMONO−15、BAT−25並びに特にBAT−26はいずれも準単形態性であり、いくつかの癌性腫瘍組織で不安定性を示す。4つの準単形態性一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は全て、本発明の方法およびキットで特に有用であることが判明した。BAT−40はまた、いくつかの癌性腫瘍組織におけるその不安定性のために本発明の方法およびキットで有用であることが判明した。しかしながら、BAT−40は準単形態性遺伝子座ではない。本発明の方法では、少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2つの一ヌクレオチド繰返しマイクロサテライト遺伝子座が増幅または同時増幅される。
少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、本発明の方法およびキットに関する少なくともいくつかの実施態様にしたがって同時増幅され分析される。四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、より短い繰り返し単位を有するマイクロサテライト遺伝子座、特に一ヌクレオチドおよび二ヌクレオチド繰返し遺伝子座と比較して、増幅されたときに本質的に人工産物のスタッターをほとんど生じない(例えば図2を参照されたい)。前記のような人工産物は、シフトした対立遺伝子が第二の対立遺伝子のスタッターの位置に生じた場合にはMSIと区別することは困難であろう。したがって、解釈についての懸念、およびデータの解釈を可能にするために準単形態性の必要性は存在しない(前記は一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の場合である)。実際、1つの集団内で高度に多形性である四ヌクレオチド繰返し遺伝子座さえも、個々の対象者内では前記が安定であることを条件に使用することができる。そのような遺伝子座はDNAタイピングで一般的に用いられる。
【0027】
本発明のいずれかの方法またはいずれかのキットを用いて増幅されるいずれの遺伝子座についても、好ましくは四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、問題の生物学的材料タイプを除いて個体のDNAで安定であることを基準に選択される。本発明の方法およびキットで用いられる好ましい四ヌクレオチド繰返し遺伝子座には以下が含まれる:FGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51。
上記で述べた同じ好ましい基準をもつまた別の一ヌクレオチドまたは四ヌクレオチドが、上記で述べた少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットと一緒に好ましくは同時増幅される。しかしながら、一ヌクレオチド繰返しまたは四ヌクレオチド繰返し遺伝子座以外のマイクロサテライト遺伝子座を前記の少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットに包含し、本発明の方法にしたがいまたは本発明のキットを用いて同時増幅し、分析することもまた意図される。
本発明の方法にしたがって、または本発明のキットを用いて増幅される遺伝子座および遺伝子座のセットを選択する好ましい方法は下記でさらに考察される。しかしながら、本発明の方法および材料がいったん開示されたら、本発明の方法およびキットで使用される遺伝子座、プライマー対および増幅技術を選択するさらに別の方法も当業者には容易に理解されることとなろう。そのような方法は全て添付の請求の範囲内に包含される。
【0028】
C.更なる遺伝子座のスクリーニング
本発明の方法またはキットを疾患の治療および予後判定用の臨床診断アッセイに用いようとするときは、前記は高度に正確(偽陰性が少ない)および特異的(疑陽性率が低い)な結果を生じるようにデザインする必要がある。情報量の多い遺伝子座は好ましくはスクリーニングによって、より好ましくは徹底したスクリーニングによって特定される(実施例1および2参照)。しかしながら、もっとも情報量の多いマイクロサテライト遺伝子座でさえも感度は100%ではなく、特異性も100%ではない。
特定の疾患(例えば癌性腫瘍)に密接に関連する組織でMSIを検出する場合の個々のマーカーの能力は、多数のマーカーを多重化することによって顕著に高められる。より多くの遺伝子座を増幅し分析することによって得られる情報の増加は、検査結果の解釈における信頼性および正確さを高める結果をもたらす。疾患(例えば癌)の検出または診断で必要な感度を得るために、5つまたは6つ以上の非常に情報量の多いマイクロサテライト遺伝子座を分析することが推奨された(Boland, 1998 Cancer Research 58:5248-5257)。マイクロサテライト遺伝子座の多重化は、多数の遺伝子座全ての同時増幅および分析を可能にし、一方、しばしば制限される増幅に必要なDNA量を減少させることによってMSIの分析をさらに簡易化する。
【0029】
MSI測定におけるまた別の一般的な問題は、ごく少しの割合(<30%)のマイクロサテライトマーカーが腫瘍で変化する中間型MSI表現型の出現に関する(Boland, 1998上掲書)。これらの低MSI腫瘍は、MSI−H腫瘍とは潜在的に異なる分子的病因を有する別個のミューテーターの表現型を示していると考えられる(Thibodeau et al., 1993 Science 260:816-8; Wu et al., 1999 Am. J. Hum. Genetics 65:1291-1298; Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074; Wijnen et al., 1999 Nature Genetics 23:142-144)。しかしながら、MSI−LとMSI−Hとが本当に異なるのか否かは明らかではない。診断のためには、MSI−LおよびMSS腫瘍は一般的には1つの安定な表現型クラスであると考えられる。MSI−HとMSI−L表現型とを正確に区別するために、多数のマイクロサテライトマーカーを分析することが推奨されている(Boland, 1998; Frazer, 1999上掲書)。
多重増幅反応で遺伝子座を同時増幅し分析しようとするときは、データ解釈の容易さおよび正確さを含むさらに別の事柄も考慮することが必要である。正確なデータ解釈に影響を与える主要な要因の1つはPCR中にマイクロサテライト遺伝子座で発生するスタッターの量である。四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、それらは二ヌクレオチドのようなより短い繰返しタイプよりも顕著に少ないスタッターを生じる(図2)という理由から、本発明の方法および本発明のキットにより分析されるMSI多重化物に包含させるために選択された。しかしながら、%スタッターは個々の繰返しタイプ内でさえ顕著に変動する(図4)ので、遺伝子座を注意深く選択することはなお必要である。一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、疾患を含む問題の生物学的材料で高率の不安定性を示すので個体分析およびMSI多重化物に含めるために選択された。
【0030】
LOH発生率は、本発明の方法またはキットで増幅および分析されるMSI選択のまた別の因子である。LOHは、マイクロサテライトマーカーに対する新規な他のフラグメントが存在しないとき、MSIを示す前記マーカーで正常な対立遺伝子が失われたと誤った認識をもたらす。具体的には、これが真のLOHであるか、シフトされた対立遺伝子は残りの野生型と一緒に移動するMSIであるかは容易には識別できない。上記で述べた問題を最小限にするために、本発明の方法およびキットで使用するために選択されるマイクロサテライトマーカーは、好ましくは低頻度LOH、好ましくは約20%を超えないLOH、より好ましくは約14%を越えないLOH、さらに好ましくは約3%を越えないLOHを示す。
マイクロサテライトマーカーが上記で述べた必要な属性(すなわち高い感度、高い特異性、低いスタッター、低いLOH)を全て保有することは比較的稀なことである。診断検査で用いることができるMSI分析系のための敷居は若干高く、扱いにくいサンプルから得られる少量のDNAを用いて、1つのアッセイで多数の遺伝子座から強固で再現性があり、さらにMSI−L表現型とMSI−H表現型とを区別できる結果が要求される。本発明で使用するために好ましいものとして上記で特定された具体的な好ましい一ヌクレオチドおよび四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は全て、上記で説明したとおり、診断分析での使用に適したMSI遺伝子座の基準の各々に合致することが判明した。
本発明の好ましい多重分析方法およびキットを用いて増幅されるMSI遺伝子座の特に2つの主要なタイプに対するさらに別の遺伝子座選択基準は以下で述べる。
【0031】
D.プライマーのデザイン
1つまたは2つ以上のマイクロサテライト遺伝子座のためのプローブは本発明の方法およびキットに関する各実施態様で提供される。各遺伝子座について少なくとも1つのプライマー、より好ましくは各遺伝子座について少なくとも2つのプライマーが提供される(後者の少なくとも2つのプライマーは遺伝子座に接するプライマー対の形態を有する)。プライマーが多重増幅反応で用いられる場合は、多数の同時増幅遺伝子から増幅される遺伝子はサイズがオーバーラップしないか、またはサイズがオーバーラップする場合は前記オーバーラップする対立遺伝子を識別できるような態様で標識した増幅対立遺伝子が生成されるプライマーおよび増幅条件を選択するのが好ましい。
本発明の方法にしたがって好ましくは同時増幅される個々の遺伝子座の増幅に適したプライマーは下記の実施例4の表9に提示されている。9つの遺伝子座(すなわちBAT−25、D10S1426、D3S2432、BAT−26、D7S3046、D7S3070、MONO−15、D1S518およびD7S1808)を含む好ましいある多重化物で使用される適切なプライマーは実施例6の表11に記載されている。9つの遺伝子座(すなわちBAT−25、D10S1426、D3S2432、BAT−26、D7S3046、D7S3070、MONO−15、BAT−40およびD7S1808)を含むより好ましい多重化物での使用に適したプライマーは実施例8の表13に記載されている。前記および他の多重化物をデザインするための手引きは下記で提供される。同じ遺伝子座または本発明の範囲内に含まれる他の遺伝子座セットの増幅に適した他のプライマーも当業者には決定できよう。
【0032】
E.MSI多重化物のデザインおよび試験
本発明のマイクロサテライト遺伝子座の多重分析方法は、適切な遺伝子座セット、プライマーおよび増幅プロトコルを選択し、多数の同時増幅遺伝子座から増幅された対立遺伝子を生成することを含む。前記生成される増幅対立遺伝子は好ましくはサイズがオーバーラップせず、より好ましくは、それらは、別個の遺伝子座に由来するサイズがオーバーラップする対立遺伝子を識別することが可能な態様で標識される。遺伝子座の組み合わせは、上記2つの理由のいずれかのために、または、組み合わせた場合1つまたは2つ以上の遺伝子座が適切な生成物を生じないか、または真の対立遺伝子を示さないフラグメントがこの反応で生成されるという理由のために拒絶することができる。
以下の因子は、好ましくはどの遺伝子座を本発明の多重化物に含めるかを決定する際に考慮される。マイクロサテライト多重化物を効果的にデザインするために、各遺伝子座の対立遺伝子のサイズレンジが決定される。前記情報を用いて全ての別個の遺伝子座間で対立遺伝子の分離が促進される。なぜならば、オーバーラップはいずれも、別の遺伝子座の不安定性として不適切な認定を下すある遺伝子座に由来する対立遺伝子を生じる可能性があるためである。
【0033】
偽一ヌクレオチド(non-mononucleotide)繰返し遺伝子座によって出現するスタッターの量もまた好ましくは考慮される。なぜならば、遺伝子座によって示されるスタッターの量はデータ解釈の容易さおよび正確さの主要な因子であるからである。各偽一ヌクレオチド繰返し遺伝子座に対して存在するスタッターレベルは集団調査を実施して決定するのが好ましい。上記で特記したように、四ヌクレオチド繰返しマーカーでは、二ヌクレオチドのようなより短い繰返しタイプよりスタッターが顕著に少なく、したがってMSI分析で正確にスコアを付与することができる。(図2および3)(Bacher & Schumm, 1988 Profiles in DNA 2(2):3-6)。少ないスタッターを生じることが判明している種類のマイクロサテライト遺伝子座(例えば四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返し遺伝子座)でさえも、%スタッターは繰返しタイプ内で顕著に変動する可能性があることに留意されたい(図3、また図2も参照されたい)(Micka et al., 1999上掲書)。
少なくとも1つの一ヌクレオチドおよび少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、本発明の方法にしたがいまたは本発明のキットを用いて同時増幅されるMSI遺伝子座多重化物に含まれるが、さらに別の一ヌクレオチドおよび/または四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を前記多重化物中に含ませることができる。同じ基準または上記で述べた基準に類似する基準に合致する一ヌクレオチドまたは四ヌクレオチド繰返し遺伝子座以外のマイクロサテライト遺伝子座を多重化物に含めることもまた意図される。
【0034】
本発明にしたがって分析される多重化物は好ましくは少なくとも3つのMSI遺伝子座のセットを含む。より好ましくは、前記は、少なくとも5つのMSI遺伝子座のセット、さらに好ましくは少なくとも9つのMSI遺伝子座のセットを含む。前記多重化物が少なくとも9つの遺伝子座のセットであるとき、好ましくは前記多重化物は少なくとも以下の遺伝子座のセットであり(BAT−25、D10S1426、D3S2432、BAT−26、D7S3046、D7S3070、MONO−15、D1S518およびD7S1808)、さらに好ましくは以下の遺伝子座のセットである(BAT−25、D10S1426、D3S2432、BAT−26、D7S3046、D7S3070、BAT−40、MONO−15およびD7S1808)。最初の多重化物で使用するために適したプライマーのリストは下記の実施例6の表11に提示されている。第二のより好ましい多重化物で使用するために適したプライマーのリストは下記の実施例8の表13に提示されている。
他の因子、例えば材料と方法の都合のよい組み合わせを考慮することもまた意図されている。そのような追加される因子の決定は、本明細書に開示した選択方法および手引きにしたがうか、または当業者に公知の技術を用いて決定できる。具体的には、同じ技術または実質的に同様な技術を用い、下記に記載した好ましいMSI遺伝子座およびMSI遺伝子座のセットを特定してプライマー対配列を選択し、さらにプライマーの濃度を調節して含まれる遺伝子座の全てが増幅される平衡を特定することができる。換言すれば、いったん本発明の方法および材料が開示されれば、本発明の方法およびキットで使用される遺伝子座、プライマー対増幅技術を選択する種々の方法を当業者は容易に想起することができよう。そのような方法は全て本発明の範囲内に含まれる。
【0035】
F.ゲノムDNAの供給源
本発明の方法にしたがって同時増幅されるゲノムDNAは、対象個体、好ましくは哺乳類、より好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、サルまたはヒト、さらに好ましくはヒトまたはマウス、極めて好ましくはヒトから得られる生物学的材料に由来する。前記生物学的材料は、任意の組織、細胞、またはゲノムDNAを含む前記対象者から得られる生物学的液体であろう。前記生物学的材料は、好ましくは腫瘍組織、播種細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿および他の体液から成る群から選択される。
前記生物学的材料は、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された組織サンプルの形態(本明細書では“PET”)であってもよい。生検から得られる組織サンプルは一般的に長期保存のためにPETとして保存される。ホルマリンは組織サンプル内で架橋を形成し、前記は破壊が困難で時にはDNA収量の低下をもたらす。ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルに付随するまた別の問題は、より長いフラグメントの増幅はしばしば問題が多いということである。そのようなサンプルから得られるDNAが多重増幅反応で用いられるときは、ピークの高さの顕著な低下がフラグメントサイズの増加にしたがって認められる。本発明のマイクロサテライト分析方法およびキットは、好ましくはPET組織サンプルから得られるDNAの増幅および分析のためにデザインされる。(本発明の方法を用いた前記のようなサンプルの増幅の説明については実施例7を参照されたい。)
本発明の方法またはキットを腫瘍の分析または検出に用いるときは、分析するゲノムDNAの少なくとも1つのサンプルは腫瘍に由来する。単形態性または準単形態性遺伝子座(例えばMONO−11またはMONO−15)を増幅させるときは、生成された増幅対立遺伝子のサイズは普遍的集団の対応する遺伝子座でもっとも一般的に観察される対立遺伝子サイズと比較される。好ましくは本発明の方法およびキットは、同じ個体から得られた少なくとも2つの異なるDNAサンプルを増幅させることによって腫瘍を診断または検出するために用いられる(前記では2つのサンプルのうち1つは正常な非癌性の生物学的材料に由来する)。
本発明をさらに以下の実施例によって説明する。本実施例は本発明の範囲を制限するものと解されるべきではない。
【0036】
実施例1
MSIの頻度についてのマイクロサテライトマーカーのスクリーニング
本実施例では、MSIを検出するために、腫瘍から単離したDNAのマイクロサテライトマーカーを正常組織または細胞から単離したDNAのマイクロサテライトマーカーと比較した。具体的には、マイクロサテライト遺伝子座を正常/腫瘍DNAサンプル対から増幅し遺伝子型を決定した。正常サンプルでは認められない1つまたは2つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍DNAサンプルに存在する場合は、スコアをMSI陽性とした。二ヌクレオチド、四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返しマイクロサテライトマーカーを変化の頻度について分析し、MSIに対する個々のマーカーの相対的感度を決定した。本実施例で用いた具体的な方法についての詳細な情報は以下で提供される。
組織およびDNAの単離:適合する39人の患者の正常組織(血液)および新形成組織サンプルをヒト組織共同ネットワーク(Cooperative Human Tissue Network, 以下では“CHTN”)(Ohio State University, Columbus, OH)から入手した。外科的切除の後で、組織サンプルを液体窒素で凍結して−70℃で保存した。血液サンプルは真空試験管を用いて静脈穿刺によって採集した。血液および固形腫瘍のDNA抽出は標準的フェノール/クロロホルム法(Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, Cold Springs Harbor, New York)にしたがうか、またはQIAアンプ血液組織キット(QIAamp Blood and Tissue Kit, QIAGEN, Santa Clarita, CA)を用い製造元のプロトコルにしたがって実施した。
【0037】
PCRおよびマイクロサテライト分析:275のマイクロサテライト遺伝子座から得た蛍光標識プライマーを用いて正常/腫瘍サンプル対から鋳型DNAを増幅した。リサーチジネティクスCHLC/ウェーバーヒトスクリーニングセット(Weber Human Screening Set)バージョン9.0の245の四ヌクレオチド繰返しマーカーを評価した(Research Genetics, Huntsville, AL)。四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返しマーカーのためのまた別のプライマーセットをプロメガ社(Promega Corporation, Madison, WI)から入手した(パワープレックス(PowerPlex(登録商標))16システムはD3S1358、TH01、D21S11、D18S51、ペンタE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、ペンタD、vWA、D8S1179、TPOXおよびFGA遺伝子座を含む)。五ヌクレオチド繰返しマーカーTP53、ペンタA、ペンタB、ペンタC、ペンタD、ペンタE、ペンタFおよびペンタGは、公開データベースから得た配列データを用いた注文合成であった(Promega Corporation, Madison, WI)。比較のために包含させた二ヌクレオチドマーカー(D8S254、NM23、D18S35、D5S346、TP53−di、D2S123、D1S2883、D3S1611、D7S501)はPEバイオシステム社(現在はアプライドバイオシステムグループ(Applied Biosystems Group(Foster City, CA)として事業を続行)から入手した。
【0038】
リサーチジネティクスのヒトスクリーニングセットバージョン9.0のマーカーを10μLのPCR反応物中で2.5ngのDNAを用いて以下に記載したように多重反応させ、スクリーニングを実施した。他の遺伝子座は25μLのPCR反応物中で1ngのDNAを用いて以下に記載したように単一反応体として評価した。全てのマーカーは、下記で別に指示しないかぎり、パーキンエルマー(Perkin-Elmer(登録商標))ジーンアンプ(GeneAmp)PCRシステム9600サーマルサイクラーを用い同じ条件下でPCR増幅させた。パワープレックス(PowerPlex(登録商標))16システム(Technical Manual #TMD012, Promega Corporation, Madison, WI)から得たマイクロサテライトマーカーおよびマイクロサテライトRERアッセイシステム(PE Biosystems発行の製品文献を参照されたい、non Applied Biosystems, Foster City, CA)の二ヌクレオチド繰返しマーカーは製造元のプロトコルにしたがって分析した。
【0039】
【表1】
【0040】
【表2】
【0041】
【表3】
【0042】
PCR生成物(リサーチジネティクスのマーカーは最初に1XのゴールドスターPCR緩衝液で1:4に希釈)の1μLをインターナルレーンスタンダード(Promega Corporation, Madison, WI)1μLおよび脱イオン化ホルムアミド24μLと混合した。サンプルを95℃で3分間変性させ、ただちに氷上で3分冷却した。増幅フラグメントの分離および検出は、ABIPRISM(登録商標)310ジネティックアナライザーを用い、ユーザーマニュアルで推奨されている標準的プロトコルにしたがって以下の設定で実施した:注入時間5秒、注入電圧15kV、泳動15kV、泳動温度60℃および泳動時間28分。
【0043】
アッセイの説明:正常な対立遺伝子および腫瘍の対立遺伝子のサイズの特定は、ABIPRISM310ジネティックアナライザー(Applied Biosystems)の適切な電気泳動図を精査し、各遺伝子座について主要なピークを決定することによって実施した。正常なサンプルでは、個体が個々のマーカーについてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかに応じて、1つまたは2つのピークまたは対立遺伝子が各遺伝子座について存在する。正常および腫瘍対に対する対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を比較し、同じ個体の正常サンプルで見出されない1つまたは2つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍DNAサンプルに存在する場合は、スコアをMSI陽性とした。
評価されるサンプル間でさらにマーカー間で広い範囲の変化の頻度が観察された。MSIに関するNCIワークショップで推奨されたガイドライン(Boland et al., 1998)にそって変化の頻度を基準にサンプルを2つの群に分けた。30−40%を越えるマーカーが腫瘍サンプルで変化を示すサンプルをMSI−Hと分類し、さらに30−40%未満の場合をMSI−Lと分類した。変化を示さないサンプルをマイクロサテライト安定(MSS)と分類した。このMSI表現型の定義を基準にして、9つのサンプルがMSI−Hに分類され、残りの30サンプルがMSI−LまたはMSSのいずれかに分類された。
四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、上記のスクリーニングを実施した遺伝子座でもっとも少量のスタッターを示した。四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返し遺伝子座で認められた%スタッターの結果について図4を参照されたい。四ヌクレオチド繰返しマーカーはまた、MSI−H群で0〜100%の範囲で変化の頻度が変動した(図5)。一般に五ヌクレオチドマーカーは低レベルのMSIを示した(図6)。CHTNサンプルでMSIに対して高い感度(MSI−HサンプルでMSIは88%を越える)および高い特異性(MSI−LおよびMSSサンプルについてはMSIは8%未満)を示すマイクロサテライトマーカーを選択し、メーヨークリニック(Mayo Clinic, Rochester, MN)から得られたまた別の20個の正常/腫瘍大腸癌サンプルとともにさらに評価した(実施例5参照)。
【0044】
実施例2
一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の特定と性状決定
MSI表現型の決定で一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は非常に情報量が多いという特性のために、我々はまた、ヒトゲノムのポリ(A)領域をMSIアッセイの新規な供給源として吟味した。これを実施するために、(A)30(N)30配列についてGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)からBLASTN(Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:402-410)検索を用いて一ヌクレオチド繰返しを特定した。(N)30配列を付け加えたのは、頻繁なmRNAヒットを排除し、さらにフランキング配列をPCRのためのプライマーのデザインに利用することができるようにするためであった。次にフランキングプライマーを33のGenBankのDNA配列のためにオリゴプライマー分析ソフト(バージョン6.0)(National Bioscience, Inc., Plymouth, MN)を用いてデザインし、ポリ(A)繰返しを含む領域を増幅した。遺伝子座の評価は、9つのMSI−Hおよび30のMSS大腸癌サンプルおよび対応する正常DNAサンプルを用いて実施した。
【0045】
新規な遺伝子座で2つの特徴についてスクリーニングした。第一にMSI−H群で検出でき、MSS群で検出できない遺伝子座についてスクリーニングした。第二に、単形態性またはほぼ単形態性(準単形態性)であることを基準にして遺伝子座を選別した。新規な遺伝子座の単形態性は、5つの人種群(アフリカ系アメリカ人、アジア系アメリカ人、白人系アメリカ人、ラテンアメリカ系アメリカ人、インド系アメリカ人)から得られた96サンプルの遺伝子型を決定することによって決定した。33の一ヌクレオチド繰返し遺伝子座のスクリーニングによって4つの新規な一ヌクレオチド繰返し遺伝子座が明らかにされた(MONO−3、MONO−11、MONO−15およびMONO−19)。これらはMSIに対して高い感度を示し(表4および図7)、さらに比較的ホモ接合性で単形態性であった(表5)。前記の各遺伝子座で検出されたホモ接合性および単形態性の度合いは表5に示されている。
【0046】
【表4】
【0047】
【表5】
【0048】
実施例3
集団調査
集団調査を実施した。前記調査では、上記の実施例1および2で説明した実験で多重化の候補として選択した好ましいマイクロサテライト遺伝子座を用い、アフリカ系アメリカ人の個体から得られた93のサンプルの遺伝子型を決定した(使用した増幅条件については下記の表6および上記の表3を参照されたい)。本実験で増幅および分析した遺伝子座のリストについては下記の表7を参照されたい。さらに、プールしたヒト多様化DNAサンプルおよびコントロールCEPHDNA1331−1および1331−2(Coriell Cell Repository, Camden, NJ)をスクリーニング集団に加えた。アフリカ系アメリカ人のサンプルは、全ての人種群で見出された最大の遺伝的多様性を含むので用いた。
22の異なるマイクロサテライトマーカーを含む96のサンプルのスクリーニングを促進するために、選択されるマーカーは3つを含む小さな群で多重化した。多重化プライマーセットを用いて、下記に述べる条件下で個体のサンプルDNAを増幅させた。
【0049】
【表6】
【0050】
集団調査の結果は表7にまとめられている。各対立遺伝子座に対する最少および最大の対立遺伝子のサイズは対立遺伝子サイズのレンジを決定することによって特定した。パーセントスタッターを計算するために、スタッターバンドのピークの高さを真の対立遺伝子によって生成されたピークの高さで割り、続いて100倍した。最少および最大スタッター値を各遺伝子座について計算するとともに、20の任意のサンプルの値をまとめた平均パーセントスタッターを算出した。
【0051】
【表7】
【0052】
実施例4
MSI多重化デザイン
MSIに対して高い感度を示し、さらに最少のスタッターおよび最少のLOH発生率を有する多重化MSIアッセイを開発するために、下記表8に挙げた基準を用いて上記の実施例で特定した遺伝子座をMSI分析で使用可能な候補として特定した。
【0053】
【表8】
【0054】
下記表9に挙げた遺伝子座が、上記表8に挙げた明細に合致する遺伝子座として特定された。
【0055】
【表9】
【0056】
実施例5
ミスマッチ修復遺伝子の分析
多重MSIアッセイの開発で用いられるMSI−H腫瘍サンプルのMSIの主要な原因を決定するために、MLH1およびMSH2遺伝子のタンパク質発現レベルを調べた。8つのMSI−Hサンプルに由来するパラフィン包埋組織の免疫組織化学的分析を文献(Thibodeau et al., Cancer Research 58:1713-1718)に記載されたように実施した。MLH1およびMSH2におけるタンパク質発現の欠如は高レベルのMSIを示す腫瘍サンプルで予想され、前記は機能不全のミスマッチ修復系を示唆する。
MSI−H腫瘍サンプルに対する免疫組織化学的アッセイの結果は表10に示されている。表10のタンパク質発現の欄における“ND”は何も検出されなかったことを示していることに留意されたい。
【0057】
【表10】
【0058】
実施例6
MSI多重アッセイの開発および実証
本発明の方法にしたがって分析される多重化物のデザインで使用する最良の遺伝子座が決定されたら、多重PCRに付随する問題および遺伝子座間の不適合を克服する必要がある。これは、注意深いプライマーのデザインおよび徹底的な試行錯誤によって単一PCR条件セットを用いて同時増幅できる遺伝子座を見つけることを必要とした。遭遇する問題には以下が含まれる:(1)多数のオリゴがただ1つのPCR反応で混合されたときに生じるプライマー−プライマー相互反応;(2)個々の遺伝子座における配列の束縛によるプライマーデザインの制限(例えばDNA配列によって許容されるアンプリコンの最少サイズ、プライマーの最適以下の%GC、均一なPCR条件下で全てのプライマーに対してTmのバランスをとることの困難さ、プライマーの非特異的増幅、ヘアピン形成および自己ダイマー形成を最小限にするために望ましい温度プロフィルをもつプライマーを見出すことの困難さ、ヒトゲノムの他の繰返し配列に対する相同性)、および(3)250bpの限定サイズ範囲内で9つの遺伝子座の全ての分離を可能にする多重デザイン。
実施例1から5に記載した300に近いマイクロサテライトマーカーの徹底的な評価をもとにして、好ましいMSI多重アッセイのために9つの遺伝子座を選択した(表11)。3つの遺伝子座は一ヌクレオチド繰返し(BAT−25、BAT−26およびMONO−15)で、6つは四ヌクレオチド繰返し(D1S518、D3S2431、D10S1426、D7S3070、D7S1808)であった。前記の遺伝子座は腫瘍サンプルでMSIを特定するために優れたマーカーセットであることが判明した。前記9遺伝子座多重化物を用いた、29のMSI−Hおよび30のMSI−LまたはMSS大腸癌サンプルについてのMSI分析の結果は図8に要約されている。
【0059】
上記の9つの遺伝子座を含むMSI多重化物を用いて得られた結果の典型的な例は図9に示されている。画像は、選択した9つ全てのマイクロサテライト遺伝子座を同時に増幅し、続いてPCR生成物をABI310CEで分離して得られた。9つ全てのマイクロサテライト遺伝子座の一本の毛細管(またはゲルレーン)での分離は、遺伝子座のサイズがオーバーラップしないように前記多重化物をデザインするか、または異なる蛍光染料の使用によって達成された。異なる多重遺伝子座に対するサイズレンジは、下記に記載するプロトコルにしたがい、記載のMSI多重化物を用いてアフリカ系アメリカ人の個体から得られた93のサンプルの遺伝子型を決定することによって求めた。さらに、プールしたヒト多種DNAサンプルおよびコントロールCEPHDNA1331−1および1331−2(CORIELL細胞集積所)もスクリーニング集団に含めた。アフリカ系アメリカ人のサンプルは、全ての人種群の中でそれらが最も大きな遺伝的多様性を含むことが判明したので用いられた。
【0060】
【表11】
【0061】
MSI多重アッセイのためのプロトコル:同じ個体から得た正常組織および腫瘍組織に由来する鋳型DNAを、QIAアンプ血液組織キット(QIAamp Blood and Tissue Kit, QIAFEN, Santa Clarita, CA)を用い製造元のプロトコルにしたがって精製した。25μLの反応容積中の2ナノグラムの鋳型DNAを下記表12に記載したプロトコルを用い、上記の表3に示した反復プロフィルに従って増幅した。
【0062】
【表12】
【0063】
1μLのPCR生成物を1μLのインターナルレーンスタンダード(Promega Corporation, Madison, WI)および24μLの脱イオン化ホルムアミドと混合した。サンプルを95℃で3分加熱して変性させ、直ちに氷上で3分冷却した。増幅フラグメントの分離および検出は、ABIPRISM310ジネティックアナライザーで、ユーザーマニュアルで推奨されている標準的プロトコルにしたがい下記の設定により実施した:
泳動モジュール: GSSTRPOP4(フィルターセットA)
注入時間: 4秒
注入電圧: 15kV
泳動電圧: 15kV
泳動温度: 60℃
泳動時間: 24分
正常な対立遺伝子および腫瘍の対立遺伝子のアンプリコンサイズの特定は、ABIPRISM310ジネティックアナライザーから得られた電気泳動図を調べ、各遺伝子座について優勢なピークを決定することによって達成された。正常サンプルでは、個々のマーカーについて個体がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかにしたがい、各遺伝子に対して1つもしくは2つのピークまたは対立遺伝子が存在した。正常および腫瘍対に対する対立遺伝子のパターンまたは遺伝子型を比較し、同じ個体の正常サンプルでは見出されない1つまたは2つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍DNAサンプルに存在する場合はMSIを陽性とした。MSI分析のためにデザインした多重化物を用いて得られた結果の典型的な例は、大腸癌については図10および11に、胃癌については図12に示されている。
【0064】
実施例7
MSI多重化物を用いたPETサンプルDNAの増幅
上記実施例6で特定した多重化物のマイクロサテライト遺伝子座を、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル由来のDNAを増幅させるその能力について調べた。DNAはPETブロックから切り出した3つの10ミクロン切片から、QIAアンプ組織キット(QIAamp Tissue Kit; Qiagen, Sanra Clarita, CA)を用い、以下の改変を加えながら製造元の指示にしたがって抽出した。70℃に予備加熱した100μLのQIAGENAE緩衝液をカラムに加え、5分インキュベートして遠心分離し、続いて第二の溶出のためにカラムに再適用した。精製DNA溶液100μLのうちの2μLをPCR反応の鋳型として用いた。実施例6で述べた9つの遺伝子座を多重化したプライマーセットを用いてPETサンプルのDNAを増幅させた。得られた結果は、MSI多重化物は、通常的に用いられるが扱いにくいPETサンプルに由来するDNAを増幅させることができることを示した(図13)。
【0065】
実施例8
第二のMSI多重系の構成
第二のMSI多重アッセイ系での分析のために、9つの遺伝子座を含む第二のセットを特定した。前記遺伝子座は、大腸腫瘍サンプルでMSIを決定するために上記の実施例4で特定した周知の遺伝子座のセットのうちの8つおよびさらに別の一ヌクレオチド繰返し遺伝子座(BAT−40)に由来する。多重遺伝子座のデザインは、1本の毛細管またはゲルレーンの中で遺伝子座のサイズがオーバーラップしないものであるか、または分離させたときオーバーラップが生じる場合は異なる染料を用いて標識することができるものであった。経験的に決定した最適な実験条件を用いて、数百人の健常な個体で多重マイクロサテライト分析を実施した。
MSI多重アッセイのために選択した9遺伝子座のセットおよび各遺伝子座について関連する識別データは下記の表13に示されている。
【0066】
【表13】
【0067】
第二のMSI多重化物の遺伝子座の4つ(BAT−25、BAT−26、BAT−40およびMONO−15)は一ヌクレオチド繰返しで、5つ(D3S2432、D7S1808、D7S3046、D7S3070、D10S1426)は四ヌクレオチド繰返しである。表13は、第二のMSI多重化物中の各遺伝子座の増幅に用いられるプライマー対、各プライマー対による各遺伝子座の増幅で生成されるフラグメントのおよそのサイズレンジを示している。表13に示したプライマー配列は、第二のMSI多重化物中の各遺伝子座の増幅に特に適切なものとして選択された。
表13に示した9つの遺伝子座を含む多重化物およびプライマー対を用いて36のMSI−H大腸癌および30のMSS大腸癌に対するMSIの分析の結果は、下記表14および図14に表されている。図14は、調べた2つのタイプのサンプル(すなわちMSI−HおよびMSS)の各々で、多重化物の各遺伝子座で測定されたパーセントMSIを示す棒グラフである。実施例6で認定した多重化物のさらに別の遺伝子座(すなわちD1S518)もまた本発明のアッセイに含めた。
【0068】
【表14】
【0069】
表14および図14にまとめたアッセイの結果は、BAT−40の増幅は、D1S518よりもMSI−HとMSSサンプルとをより明瞭に識別することを示した。第二のMSI増幅系を用いて増幅された9つ全ての遺伝子座は非常に高い効率で検出された。
【0070】
実施例9
MSI多重系による分析
アフリカ系アメリカ人の各個体に由来する93のサンプル、プールしたヒト多種DNA並びに細胞株1331−1および1331−2(Coriel Cell Repository, Camdem, NJ)由来のコントロールDNAを実施例8に記載した多重9遺伝子座系を用いて調べた。選択した9つ全てのマイクロサテライト遺伝子座の同時増幅、それに続くABI310CEでの生成物の分離によって、予想された全ての生成物が下記に示すように得られた。
【0071】
【表15】
【0072】
【表16】
【0073】
1μLのPCR生成物を1μLのインターナルレーンスタンダード(DG2611、Promega Corporation, Madison, WI)および24μLの脱イオン化ホルムアミドと混合した。サンプルを95℃で3分加熱して変性させ、直ちに氷上で3分冷却した。増幅フラグメントの分離および検出は、ABIPRISM310ジネティックアナライザーで、ユーザーマニュアルで推奨されている標準的プロトコルにしたがい下記の設定により実施した:
泳動モジュール: GSSTRPOP4(フィルターセットA)
注入時間: 4秒
注入電圧: 15kV
泳動電圧: 15kV
泳動温度: 60℃
泳動時間: 24分
正常な対立遺伝子のアンプリコンサイズの特定は、ABIPRISM310ジネティックアナライザーから得られた電気泳動図を調べ、各遺伝子座について優勢なピークを決定することによって達成された。これらの結果は図15に示されている。個々のマーカーについて個体がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかにしたがい、正常サンプルの各遺伝子に対して1つもしくは2つのピークまたは対立遺伝子が存在した。
【0074】
実施例10
MSI多重系による患者サンプルの分析
同じ個体に由来する正常および腫瘍組織対の対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を、上記の実施例8に記載した多重遺伝子座を用いて調べた。選択した9つ全てのマイクロサテライト遺伝子座の同時増幅とそれに続くABI310CEでの生成物の分離によって全ての予想された生成物が得られた。
患者サンプルの多重MSIアッセイおよび反復プロフィルのためのプロトコルは、正確に上記の実施例のとおりに実施した。正常な対立遺伝子および腫瘍の対立遺伝子のアンプリコンサイズの特定は、ABIPRISM310ジネティックアナライザーから得られた電気泳動図を調べ、各遺伝子座について優勢なピークを決定することによって達成された。
組織対の試験の典型的な結果は図16に示されている。個々のマーカーについて個体がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかにしたがい、正常サンプルの各遺伝子に対して1つまたは2つの対立遺伝子が存在した。正常および腫瘍のサンプル対に対する対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を比較し、同じ個体の正常サンプルには見出されない1つまたは2つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍DNAサンプルに存在する場合は、MSI陽性とした。
本発明をこれまで具体的に説明してきたが、当業者には、これまでに記載されたもので実施することができる変更、付加および省略を含む種々の改変が明らかであろう。したがって、これら改変もまた本発明に包含され、本発明の範囲は、添付の請求の範囲に合法的に一致するもっとも広い解釈によってのみ範囲を制限される。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図1】マイクロサテライト不安定性分析を示す。図では、同じゲノムDNAの2つの対立遺伝子上の四ヌクレオチド遺伝子座にアニールさせたプライマー対が示され、正常組織と腫瘍組織に由来するDNAの四ヌクレオチド遺伝子座の増幅生成物の毛細管電気泳動の結果がプロットされている。腫瘍組織の増幅DNAの図表にはMSIのピークが示されている。
【図2】観察されるスタッターの量に対するマイクロサテライト繰返し単位の長さの影響を示す。図には、ゲノムDNAの2つの異なる対立遺伝子上の四ヌクレオチド遺伝子座にアニールさせたプライマー対の略図、並びに種々の個体から得られたヒトゲノムDNAの増幅された一、二、三、四および五ヌクレオチド繰返し遺伝子座の蛍光スキャンおよび図表のセットが含まれている(前記増幅された遺伝子座はゲルまたは毛細管電気泳動によって分画された)。
【図3】低スタッター四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は高スタッター二ヌクレオチド繰返し遺伝子座よりも解釈が容易であることを示す。図は、正常および腫瘍組織に由来する2つの異なるDNAサンプルセットの2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座および2つの二ヌクレオチド繰返し遺伝子座の増幅生成物を毛細管電気泳動した結果をプロットしたものである。
【図4】選択した四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチドでのスタッター量の変動を示す。図では13の異なる四ヌクレオチド繰返し遺伝子座および5つの異なる五ヌクレオチド繰返し遺伝子座で観察されるパーセントスタッターの変動がプロットされている。四角は平均パーセントスタッターを示し棒線は各遺伝子座で観察されるスタッターの範囲を表している。
【図5】マイクロサテライト不安定性の頻度に対する四ヌクレオチド繰返しマーカーのスクリーニングの結果を示す。図では、総数273のマーカーで与えられたパーセントMSIを示すマイクロサテライト遺伝子座の数がプロットされている。例えば、ほぼ15の遺伝子座が調べたMSI−H腫瘍サンプルの100%で変化を示した。
【図6】マイクロサテライト不安定性の頻度に対する五ヌクレオチド繰返しマーカーのスクリーニングの結果を示す。図では、9つのMSI−H腫瘍のセットおよび30のMSS腫瘍のセットで、8つの異なる四ヌクレオチド繰返し遺伝子座の各々について観察されたパーセントMSIがプロットされている。
【図7】MONO−15マーカーを用いたマイクロサテライト不安定性分析を示す。図は、4人の異なる個体に由来する4つの異なる正常/腫瘍サンプル対から得られたDNAのMONO−15遺伝子座の増幅生成物を毛細管電気泳動して得られた図表である。
【図8】9遺伝子座のMSI多重化物を用いて得られた59の大腸癌サンプルのパーセントMSIを示す。図では、下記実施例6で述べた9つの遺伝子座を含むMSI多重化物(すなわち、D1S518、D3S2432、D7S1808、D7S3046、D7S9070、D10S1426、BAT−25、BAT−26およびMONO−15)を用いて59の大腸癌サンプル(29のMSI−Hおよび30のMSI−LまたはMSSサンプル)で観察されたパーセントMSIがプロットされている。
【図9】9遺伝子座MSI多重化物を用いた蛍光多重マイクロサテライトアッセイを示す。図は、図8で使用した9遺伝子座MSI多重化物を用いて得られた正常な非癌性ヒトゲノムの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図10】9遺伝子座MSI多重化物を用いた大腸癌サンプルでのマイクロサテライト不安定性の検出を示す。図は、図8で使用した9遺伝子座MSI多重化物を用いて得られた正常サンプルおよび大腸腫瘍サンプル由来DNAの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図11】9遺伝子座MSI多重化物を用いた大腸癌サンプルでのマイクロサテライト不安定性の検出を示し、図10と同じタイプの図表であるが、異なる個体に由来する正常/大腸癌DNA対の異なるサンプルを用いて作成された。
【図12】9遺伝子座MSI多重化物を用いた胃癌サンプルでのマイクロサテライト不安定性の検出を示す。図は、図8で述べた9遺伝子座MSI多重化物を用いて得られた正常/胃癌サンプル対由来DNAの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図13】9遺伝子座MSI多重化物を用いたパラフィン包埋組織のマイクロサテライト分析を示す。図は、図8で述べた9遺伝子座MSI多重化物を用いて得られたパラフィン包埋組織由来DNAの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図14】10の異なるマイクロサテライト遺伝子座における大腸癌サンプルでのパーセントMSIを示す。図は、実施例8で述べたMSI多重化物に含まれる9つの遺伝子座(すなわち、BAT−26、D7S3070、D7S3046、BAT−40、MONO−15、D7S1808、BAT−25、D10S1426およびD3S2432)およびD1S518を用いて66の大腸癌サンプル(36のMSI−Hおよび30のMSI安定またはMSI−Lサンプル)で観察されたパーセントMSIの棒グラフである。
【図15】9遺伝子座MSI多重化物を用いた蛍光多重マイクロサテライト分析を示す。図は、以下のような蛍光染料標識プライマーで標識した実施例8で述べたMSI多重化物を用いた正常非癌性ヒトゲノムDNAの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。BAT−26、D7S3070およびD7S3046に対するプライマーはフルオレセインで標識し、BAT−40、MONO−15およびD7S1808に対するプライマーはJOEで標識し、BAT−25、D10S1426およびD3S2432に対するプライマーはTMRで標識した。
【図16】9遺伝子座MSI多重化物を用いたマイクロサテライト不安定性の検出を示す。図は、図15で使用した同じ9遺伝子座MSI多重化物および標識プライマーを用いて正常/大腸腫瘍サンプル対由来DNAの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
Claims (71)
- 以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法:
(a)ゲノムDNAの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記セットは、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにFGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含み;
(b)前記少なくとも1つのゲノムDNAサンプルに由来する少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを多重増幅反応で前記プライマーを用いて同時増幅し、それによって増幅DNAフラグメントを生成し;さらに
(c)前記増幅DNAフラグメントのサイズを決定する。 - 前記ゲノムDNAがヒトゲノムDNAである請求項1の方法。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも5つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される2つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにFGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される3つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項1の方法。
- 工程(a)で提供される前記プライマーの少なくとも1つが、配列番号1−68によって特定されるプライマー配列の群から選択される核酸配列を有する請求項1の方法。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、MONO−15、BAT−40、D3S2432、D7S3046、D7S3070、D7S1808およびD10S1426を含む請求項1の方法。
- 前記少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも1つのプライマーを用いて同時増幅される請求項5の方法:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号65および配列番号66、
前記遺伝子座がBAT−40であるとき、配列番号67および配列番号68、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号63および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号64、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、蛍光によって標識された、各遺伝子座のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて工程(c)で同時増幅される請求項1の方法。
- 前記少なくとも1つのゲノムDNAサンプルが、1つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来する第一のゲノムDNAサンプルおよび前記個体の腫瘍に由来する第二のゲノムDNAサンプルを含む請求項1の方法であって、前記方法がさらに、第一のゲノムDNAサンプルを同時増幅することにより生成された増幅DNAフラグメントのサイズを、第二のゲノムDNAサンプルを同時増幅することにより生成された増幅DNAフラグメントのサイズと比較することによってマイクロサテライト不安定性を検出することを含む請求項1の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が腫瘍の予後診断に用いられる請求項8の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が家族性腫瘍素因の診断に用いられる請求項8の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が、胃腸系および子宮内膜の癌性腫瘍の検出に用いられる請求項8の方法。
- 前記癌性腫瘍が大腸癌に由来する腫瘍である請求項11の方法。
- 以下の工程を含むゲノムDNAにおけるマイクロサテライトの不安定性を検出する方法:
(a)ゲノムDNAの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記セットは、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにFGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含み;
(b)1つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来する第一のゲノムDNAサンプルおよび前記個体の第二の生物学的材料に由来する第二のゲノムDNAサンプルの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを、前記マイクロサテライト遺伝子座の各々のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて別個に多重増幅反応で同時増幅させ、それによって第一のサンプルから第一の増幅DNAフラグメントおよび第二のサンプルから第二の増幅DNAフラグメントを生成し;さらに
(c)第一の増幅DNAフラグメントのサイズを第二の増幅DNAフラグメントのサイズと比較し、第二のゲノムDNAの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のいずれかの不安定性を検出する。 - 前記ゲノムDNAがヒトゲノムDNAである請求項13の方法。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも5つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される2つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにFGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される3つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項13の方法。
- 工程(a)で提供される前記プライマーの少なくとも1つが、配列番号1−68によって特定されるプライマー配列群から選択される核酸配列を有する請求項13の方法。
- 工程(a)で提供される各遺伝子座のための少なくとも1つのプライマーが蛍光によって標識される請求項13の方法。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、MONO−15、BAT−40、D3S2432、D7S3046、D7S3070、D7S1808およびD10S1426を含む請求項13の方法。
- 前記少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも1つのプライマーを用いて同時増幅される請求項18の方法:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号65および配列番号66、
前記遺伝子座がBAT−40であるとき、配列番号67および配列番号68、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号63および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号64、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 前記第二の生物学的材料サンプルが、腫瘍組織、播種細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿および他の体液から成る群から選択される請求項13の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が腫瘍の予後診断に用いられる請求項13の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が家族性腫瘍素因の診断に用いられる請求項13の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が、胃腸系および子宮内膜の癌性腫瘍の検出に用いられる請求項13の方法。
- 前記癌性腫瘍が大腸癌に由来する腫瘍である請求項23の方法。
- 以下を含む、ゲノムDNAのマイクロサテライト遺伝子座を分析することを目的とするキット:
BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにFGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む、ゲノムDNAの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。 - 前記ゲノムDNAがヒトゲノムDNAである請求項25のキット。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも5つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される2つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにFGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される3つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項25のキット。
- 前記少なくとも2つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、MONO−15、BAT−40、D3S2432、D7S3046、D7S3070、D7S1808およびD10S1426を含む請求項25のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが以下から成る群から選択される請求項28のキット:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号65および配列番号66、
前記遺伝子座がBAT−40であるとき、配列番号67および配列番号68、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号63および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号64、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 前記セットの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座の各々のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが蛍光によって標識される請求項25のキット。
- 前記キットがさらに耐熱性ポリメラーゼを含む請求項25のキット。
- 前記キットがさらに、正常非癌性生物学的材料から単離された第一のコントロールDNAおよびミスマッチ修復遺伝子を欠く生物学的材料由来の第二のコントロールDNAを含む請求項25のキット。
- 前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を腫瘍の予後診断に用いることができる請求項25のキット。
- 前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を家族性腫瘍素因の診断に用いることができる請求項25のキット。
- 前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性が胃腸系および子宮内膜の腫瘍の徴候である請求項25のキット。
- 前記マイクロサテライトの不安定性が大腸癌の徴候である請求項25のキット。
- 以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法:
(a)ヒトゲノムDNAの少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記セットは、BAT−25、BAT−26、MONO−15、BAT−40、D3S2432、D7S3046、D7S3070、D7S1808およびD10S1426を含み;
(b)少なくとも1つのゲノムDNAサンプルに由来する少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを前記プライマーを用いて多重増幅反応で同時増幅させ、それによって増幅DNAフラグメントを生成し;さらに
(c)前記増幅DNAフラグメントのサイズを決定する。 - 前記少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも1つのプライマーを用いて同時増幅される請求項37の方法:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号65および配列番号66、
前記遺伝子座がBAT−40であるとき、配列番号67および配列番号68、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号63および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号64、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 以下を含む、ゲノムDNAのマイクロサテライト遺伝子座を分析することを目的とするキット:
BAT−25、BAT−26、MONO−15、BAT−40、D3S2432、D7S3046、D7S3070、D7S1808およびD10S1426を含む、ヒトゲノムDNAの少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。 - 前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが以下から成る群から選択される請求項39のキット:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号65および配列番号66、
前記遺伝子座がBAT−40であるとき、配列番号67および配列番号68、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号63および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号64、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法:
(a)少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む、ゲノムDNAの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し;
(b)少なくとも1つのゲノムDNAサンプルに由来する少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを前記プライマーを用いて多重増幅反応で同時増幅させ、それによって増幅DNAフラグメントを生成し;さらに
(c)前記増幅DNAフラグメントのサイズを決定する。 - 前記ゲノムDNAがヒトゲノムDNAである請求項41の方法。
- 前記少なくとも2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、FGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される請求項42の方法。
- 前記少なくとも1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される請求項42の方法。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが以下を含む少なくとも5つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである請求項42の方法:
BAT−25、BAT−26、MONO−11、BAT−40およびMONO−15から成る群から選択される少なくとも2つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座;および
FGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される少なくとも3つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座。 - 工程(a)で提供される前記プライマーの少なくとも1つが、配列番号1−68によって特定されるプライマー配列の群から選択される核酸配列を有する請求項42の方法。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、MONO−15、D1S518、D3S2432、D7S1808、D7S3070、D7S3046、D10S1426を含む請求項42の方法。
- 前記少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも1つのプライマーを用いて同時増幅される請求項47の方法:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号7および配列番号8、
前記遺伝子座がD1S518であるとき、配列番号49および配列番号50、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号17および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号56、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、MONO−15、BAT−40、D3S2432、D7S3046、D7S3070、D7S1808およびD10S1426を含む請求項42の方法。
- 前記少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも1つのプライマーを用いて同時増幅される請求項49の方法:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号65および配列番号66、
前記遺伝子座がBAT−40であるとき、配列番号67および配列番号68、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号63および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号64、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、蛍光によって標識された、各遺伝子座のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて工程(c)で同時増幅される請求項41の方法。
- 前記少なくとも1つのゲノムDNAサンプルが、1つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来する第一のゲノムDNAサンプルおよび前記個体の腫瘍に由来する第二のゲノムDNAサンプルを含む請求項41の方法であって、前記方法がさらに、第一のゲノムDNAサンプルを同時増幅することにより生成された増幅DNAフラグメントのサイズを、第二のゲノムDNAサンプルを同時増幅することにより生成された増幅DNAフラグメントのサイズと比較することによってマイクロサテライト不安定性を検出することを含む請求項41の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が腫瘍の予後診断に用いられる請求項52の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が家族性腫瘍素因の診断に用いられる請求項52の方法。
- 前記マイクロサテライト不安定性の結果が、胃腸系および子宮内膜の癌性腫瘍の検出に用いられる請求項52の方法。
- 前記癌性腫瘍が大腸癌に由来する腫瘍である請求項55の方法。
- 以下を含むヒトゲノムDNAのマイクロサテライト遺伝子座を分析することを目的とするキット:
1つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む、ヒトゲノムDNAの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。 - 前記2つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、FGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される請求項57のキット。
- 前記一ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される請求項57のキット。
- 前記少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも5つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、BAT−40、MONO−11およびMONO−15から成る群から選択される2つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにFGA、D1S518、D1S547、D1S1677、D2S1790、D3S2432、D5S818、D5S2849、D6S1053、D7S3046、D7S1808、D7S3070、D8S1179、D9S2169、D10S1426、D10S2470、D12S391、D17S1294、D17S1299およびD18S51から成る群から選択される3つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項57のキット。
- 前記少なくとも2つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、MONO−15、D1S518、D3S2432、D7S1808、D7S3070、D7S3046、D10S1426を含む請求項57のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが以下から成る群から選択される請求項61のキット:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号7および配列番号8、
前記遺伝子座がD1S518であるとき、配列番号49および配列番号50、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号17および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号56、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 前記少なくとも2つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも9つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、BAT−25、BAT−26、MONO−15、BAT−40、D3S2432、D7S3046、D7S3070、D7S1808およびD10S1426を含む請求項57のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが以下から成る群から選択される請求項63のキット:
前記遺伝子座がBAT−25であるとき、配列番号1および配列番号60、
前記遺伝子座がBAT−26であるとき、配列番号61および配列番号62、
前記遺伝子座がMONO−15であるとき、配列番号65および配列番号66、
前記遺伝子座がBAT−40であるとき、配列番号67および配列番号68、
前記遺伝子座がD3S2432であるとき、配列番号63および配列番号59、
前記遺伝子座がD7S1808であるとき、配列番号51および配列番号52、
前記遺伝子座がD7S3070であるとき、配列番号53および配列番号54、
前記遺伝子座がD7S3046であるとき、配列番号55および配列番号64、および
前記遺伝子座がD10S1426であるとき、配列番号57および配列番号58。 - 前記セットの少なくとも3つのマイクロサテライト遺伝子座の各々のための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが蛍光によって標識される請求項57のキット。
- 前記キットがさらに耐熱性ポリメラーゼを含む請求項57のキット。
- 前記キットがさらに、正常非癌性生物学的材料から単離された第一のコントロールDNAおよびミスマッチ修復遺伝子を欠く生物学的材料由来の第二のコントロールDNAを含む請求項57のキット。
- 前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を腫瘍の予後診断に用いることができる請求項57のキット。
- 前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を家族性腫瘍素因の診断に用いることができる請求項57のキット。
- 前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性が胃腸系および子宮内膜の腫瘍の徴候である請求項57のキット。
- 前記マイクロサテライトの不安定性が大腸癌の徴候である請求項70のキット。
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