JP2004533237A - Dna分子の単離 - Google Patents
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Abstract
Description
技術分野
本発明は、溶液中のプラスミドDNAのような核酸分子を分離するための方法に関する。より特に、本方法は、oc(開環)DNAおよびスーパーコイル化ccc(共有結合的閉環状)DNAおよびリボ核酸および他のデオキシリボ核酸の、お互いからの分離および溶液中に存在する他の成分からの分離に基づく。
【0002】
背景技術
遺伝子治療およびDNAワクチンの開発により、プラスミドDNAのような高純度遺伝子ベクターの必要性が高まってきた。スーパーコイル化プラスミドDNAの精製に伴う問題には、宿主タンパク質、エンドトキシン、染色体DNA、RNA、プラスミドDNAの開環状およびニック型のような他の細胞成分の完全除去がある。異なるクロマトグラフ法は、粒径排除(size exclusion)クロマトグラフィー、またはゲル濾過、ヒドロキシアパタイト、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーのようなプラスミドDNA精製に使用されている。殆どの方法は、スーパーコイル化プラスミドDNAを他のプラスミド型から分離する可能性を欠く。多くの利用可能な方法もまた、サンプルをクロマトグラフカラムに適用する前に、透明なライゼート中のRNAを加水分解するRNaseを使用する。RNaseの使用は、ヒトでの使用を目的とするプラスミドDNAの分離には推奨されない。
【0003】
イオン交換クロマトグラフィーは、最も普通に使用されるクロマトグラフィー法である。プラスミドDNA、染色体DNAおよびRNAは、類似の荷電特性を有するため、すべて陰イオン交換体に結合する。疎水性相互作用クロマトグラフィーもまた用いるが、プラスミドDNAは結合せず、フロースルー中に溶出した。
【0004】
本発明の要約
本発明の目的は、1つまたはそれよりも多い上記の欠点を避ける、スーパーコイル化プラスミドDNAの単離のための方法を提供することである。そのため、本発明の1つの目的は、効率的な、マトリクスにおける核酸分子の単離のための方法を提供することである。本発明の目的は、本願添付の請求の範囲で定義のような方法により、および添付の請求の範囲のマトリクスにより、より特に得られる。
【0005】
定義
用語「核酸分子」は、本願明細書では、開環プラスミドDNA、スーパーコイル化プラスミドDNAおよび他のDNA(例えば、ゲノムDNA)およびmRNA、tRNAおよびsRNAのようなRNAのような巨大分子および分子集合体(aggregate)を含む。
【0006】
用語「溶出液」は、本願明細書では、クロマトグラフィーでの通常の意味、すなわち、固相(吸着剤マトリクス)と産物(核酸分子)との間の相互作用に摂動を起こさせる(perturb)ことができ、当該固相からの当該産物の選択的分離を促進できる溶液に使用する。
【0007】
本明細書に使用する任意の用語は、本願明細書中で特に定義しないが、当業者が理解する一般的な意味により構成されると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図1は、Sepharose 6 Fast Flowと反応するアリール−S化合物であって、分離特性を有する当該化合物の例を示す。
【図2】図2は、130および150mlの透明なライゼートをSephacryl S-500HRにそれぞれロードし、2M硫酸アンモニウム中で作動(run)させた後に得られた2つのクロマトグラムを示す。挿入図(insert)は、選択画分および開始物質のアリコートのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図3A】図3Aは、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Sリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。挿入図(insert)は、選択画分のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図3B】図3Bは、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Sリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。挿入図(insert)は、選択画分のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図3C】図3Cは、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Sリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。挿入図(insert)は、選択画分のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図4】図4は、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Sリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。
【図5】図5は、高伝導率条件(>240mS/cm)下、Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowにサンプル(ゲル濾過により精製)をロードした後に得られたクロマトグラムを示す。
【図6】図6は、XK16/15カラム中のPyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowに透明なライゼートのクロマトグラフィーを行なった後に得られた結果を示す。
【図7】図7は、本発明によるS−アリールリガンドにプラスミドDNAを吸着させる間のNa2SO4の使用の解説に用いるクロマトグラムである。
【0009】
本発明の詳細な説明
第一の態様では、本発明は、溶液から核酸分子を単離する方法であって、
(a)核酸分子の混合物を、S−アリールリガンドが提供される担体表面のマトリクスに適用する(subject)こと、
(b)当該核酸分子を溶出ステップに適用すること、
(c)異なる核酸分子を含む異なる画分を単離すること、および
所望により、適当な溶液で当該担体を洗浄すること、
のステップを含む当該方法に関する。
【0010】
そのため、ステップ(a)の間に、核酸分子は、S−アリールリガンドに吸着し得る。当該洗浄は、残存する望ましくない物質を除去するため、当業者に既知のように、吸着の後であるが溶出前に行なう。天然には、本方法もまた、核酸が溶液の望ましくない成分である場合、すなわち、核酸から精製した溶液を提供するために使用し得る。その場合、核酸分子の溶出は、カラムの再生のために行なう。従って、本発明の溶液の精製のための方法は、溶出のステップを含む必要はない。
【0011】
ある実施態様では、本発明の方法は、細胞中で発現する核酸分子の単離であり、それ故、細胞を破壊し核酸分子を含む溶液を提供する第一のステップをまた含む。その破壊は、例えば、標準的なプロトコール(例えば、Maniatis, T, Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY)による、アルカリ溶解のような溶解により行なう。
【0012】
他の実施態様では、本方法は、適当な溶出液をマトリクスに接触させることによりスーパーコイル化プラスミドDNA分子を溶出する更なるステップを含む。そのため、当該溶出ステップは、動的(dynamic)またはバッチ(batch)の手順として行ない得る。溶出は、以下の実験部分においても解説するように、通常、伝導率が低下する勾配によるような既知の原理で行なう。
【0013】
そのため、本発明の方法は、例えば、遺伝子治療、DNAワクチンおよび遺伝子治療に関連する実験室での研究での使用のための核酸の精製のために、利用される。有利な実施態様では、本方法は、許容される遺伝子治療品質のスーパーコイル化プラスミドDNAを単離する。より特に、近い将来、遺伝的物質のキャリアまたはベクターとして遺伝子治療に使用のために大量のプラスミドDNAの必要性が増大する。上記のように、そのキャリアの単離のための従来記載されている方法は、この目的には不十分であり、そのため、本発明の方法は、最初に、医学的および診断的使用のために核酸分子をラージスケールで処理、特にocプラスミドDNAおよびcccプラスミドDNAを分離し得る。本方法の更なる利点は、都合がよいことには、自動化に適用されることである。例えば、AKTA(商標)explorer(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)での自動化では、高量の同種性プラスミドDNA、より特に98%を超えるスーパーコイル化プラスミドDNAを生ずることが判る。
【0014】
本発明により単離したプラスミドは任意の起源からなり得る。殆ど通常、E. coliのような細菌などの微生物は、プラスミドの作成(culturing)に使用するが、宿主細胞の使用は制限されず、原核細胞または真核細胞であり得る。当該プラスミドを保持する宿主細胞は、多くの当分野に既知の方法、例えば、インキュベーター、バイオリアクター、発酵槽(fermentor)など中で培養され得る。本発明により単離した当該プラスミドは、実際には任意の大きさ、約1kbから約20kbまでの範囲となり得る。上限として、コスミドおよび人工染色体の単離もまた含まれ、その大きさは、それぞれ約50kbおよび500kbまでであり得る。
【0015】
プラスミドは高コピー数または低コピー数であり得、任意の遺伝子、任意の源由来の目的のタンパク質またはペプチドをコードするゲノムまたは合成の何れかの遺伝子を保有し得る。宿主細胞の作成(culturing)および遺伝子治療のためのプラスミドの開発は当分野に既知である。
【0016】
当該プラスミドを含む宿主細胞を培養した後、当該細胞を例えば遠心分離または濾過により回収する。当該細胞は、例えば、フリーザー中で保存され得、または直前に処理し得る。
【0017】
上記のように、本発明のプラスミドDNAを細胞中で作成するとき、その溶解は有利にはアルカリ溶解により行なう。次いで、当該ライゼートは、二価アルカリ土類金属イオンのような金属イオンで処理し、不純物および特にRNAおよび染色体DNAを沈殿させ得る。その沈殿物質を取り除くとき、当該溶液はカラムに適用し得る(本文書中で金属イオン沈殿法の詳細な開示のためには、例えば、Amersham Pharmacia Biotechの名義のWO9916869参照)。
【0018】
利点ある実施態様では、使用するマトリクス物質は、カラムクロマトグラフィー物質として存在し、リガンドが結合する担体物質は、任意の適当な無機性または有機性物質である。無機性物質は、ガラス、シリカ、または他の不活性粒子無機物である。その物質は、市場で利用可能な任意のマトリクスであり得る。異なる樹脂またはポリマーに基づく利用可能な多くの商業製品、例えば、アガロースまたは架橋化アガロース(Sepharose(商標)など、Amersham Pharmacia Biotech)、デキストラン(Sephadex(商標)、Amersam Pharmacia Biotech)、ポリスチレン/ジビニルベンゼン(MonoBeads(商標)、SOURCE(商標)、Amersham Pharmacia Biotech)、コート化ポリスチレン、アクリル性ポリマー、デキストランアクリル性ポリマー(Sephacryl(商標)、Amersham Pharmacia Biotech)、ビニル性グラフト化ポリマー、またはビニル性ポリマー、シリカ−デキストラン、シリカ−アクリル性ポリマーまたはシリカ−ポリエチレンイミンのような異なるシリカに基づく樹脂がある。
【0019】
本方法は、膨張ベッド(expanded bed)または充填ベッド(packed bed)としての、またはバッチモードのマトリクスで行ない得る。充填ベッド吸着では、当該吸着剤は、クロマトグラフカラム中に充填され、精製工程の間に使用する全ての溶液は同じ方向でカラムを流れる。しかし、膨張ベッド吸着では、当該吸着剤は膨張し、カラムを通して液体を流すことにより平衡化する。適当な流体化膨張ベッドは、サンプル適用および洗浄ステップにおいて粒子沈降または上昇速度と流速との間にバランスがとれているときに、形成される。溶出ステップでは、吸着剤が沈降し、充填ベッド吸着剤のように挙動する。
【0020】
担体物質に結合し本発明のマトリクスを形成するリガンドは、メルカプト−ピリジン、メルカプトアルキルピリジンであり、ここで、当該メルカプト−およびメルカプトアルキル基が、ピリジル−窒素原子との関係でそれぞれオルトおよびメタの位置に結合する。ここで、それは、チオエーテル結合を介し担体物質に結合するメルカプト基である。更に、リガンドの一部を形成するアリール基は、フェニル、ベンジル、トルイル、フェネチル、ナフチル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、キノリニル、プリニルである。更なる置換基がまた芳香族環に加えられ得る。望ましい結合および溶出特性を得るため、更なる置換基を有する本S−アリールリガンドを提供することにより、広範囲の異なる分離媒体を設計し得る。例えば、吸着ステップのための低濃度の溶出液を使用し得るため、溶出プロファイルをシフトすることが望ましいかもしれない。当該置換基は、例えば、1つまたはそれより多いアミン基、ニトロ基、エーテル基、チオール基、および/またはフッ素のようなハロゲンであり得る。これらの更なる置換基はまた、望ましいため、更なる炭素原子を含み得る。また、当業者が理解するように、炭素原子は、上記環構造中のヘテロ原子と置換され得る。本願明細書では、用語「S−アリールリガンド」は、望ましい程度に置換され得る広範囲の化合物を含み、それらの幾つかは、以下の図1で例示する。リガンド密度は、10−500μmole/mLキャリア、好ましくは10−100μmole/mLキャリアの範囲である。
【0021】
本発明で使用する溶出液は、pH中性(好ましくはpH6.5から8.5)の溶出液であり、好ましくは、ccc型とは対照的にocDNAが結合しない0.5から4M、好ましくは1.5から2.0Mの濃度を有する硫酸アンモニウムである。サンプルを完全にカラムにロードした後、その後、結合cccプラスミドDNAは、減少させた硫酸アンモニウム濃度を用いることによりカラムから溶出させ得る。RNA分子は、一様に低濃度の硫酸アンモニウムを用いることによりカラムから溶出し得る。
【0022】
第二の態様では、本発明は、マトリクスがocDNA、cccDNA、およびRNA分子のような核酸プラスミド分子を選択的に選択する、メルカプト−アリール部分を含むマトリクスに関する。ここで、メルカプト−基は、アリール基に直接置換され得るか、または1から7炭素原子を有するアルキレン鎖を介して置換され得る。行なわれた実験室での研究では、4−(2−メルカプトエチル)ピリジン、または2−(2−オキソエチル)ピリジンの何れも、ocDNAおよびcccDNAを分離する能力を有していなかったことが判った。
【0023】
1つの実施態様では、マトリクス粒子は、約10−300μmの範囲内の平均サイズ、例えば10−20、20−50、50−100、100−200または200−300μmの範囲内である。しかし、当該粒子は、都合よくは、250、212、180、150、125、106、90、75、63、45、37、30、25、20、15μmのような商業的に利用可能なシーブ装置が存在する任意のサイズで作成され得る。
【0024】
プラスミドまたはウイルスのようなナノ粒子の分離に特に有利な1つの実施態様では、本方法は、スーパーポーラス(superporous)粒子に結合するリガンドとして1つまたはそれより多い上記S−アリール化合物を含むマトリクスを使用する。本実施態様で使用するスーパーポーラスマトリクス粒子の平均スーパーポア直径は、約5−10または約10−20μmのような少なくとも約4μmであり、約20−30または一様の約30−40μmのような約25μmまでの値であり得る。しかし、本文書では、用語「スーパーポーラス」は、ポアが粒子の構造の本質的部分となり得るように十分大きく、すなわち、実質的に固相である中央部分以外に多孔性表面層を有する通常の粒子よりも相当程度に深くまで粒子に浸透し得る。1つの特に有利な実施態様では、吸着ステップは、動的条件下で行なわれる。従って、本実施態様で使用するスーパーポーラス粒子は、ポアを通過する実質的部分であるが、その一方、それらはまた、動的な流動手順の間、元来の外観を維持、すなわち、破壊されず十分に強固なとなるように設計される。
【0025】
図面の詳細な説明
図1は、Sepharose 6 Fast Flowと反応する多様なアリール−S化合物の例を示す。この図面からの様相のように、アリール−S化合物は、異なる置換基が提供され、それらそれぞれは、異なる目的に利点となることが証明され得る結合および溶出特性を生じ得る。
【0026】
図2は、20cm高さのベッドを有するXK50/30カラム中のSephacryl S-500 HRにおける、透明なライゼートのプラスミドDNA対RNAの群分離(group separation)後に得られる結果を示す。当該カラムは、216mS/cmの伝導率を有する25mM Tris、pH7.9中の2M (NH4)2SO4で平衡化し、それぞれ130および150mlの透明なライゼートを流速30cm/hrでロードする。サンプルを当該カラムに一旦適用すると、その流速は60cm/hrに増加させ、空隙容量(void volume)を回収する。全サンプルの全溶出およびカラムの再平衡の後、次のサンプルをロードする。1%アガロースゲル電気泳動の選択画分の分析により、透明なライゼート調製物中のRNAと共に開環およびスーパーコイル化プラスミドDNAの存在が示される。ゲル濾過の排出体積では、RNAの存在は検出され得ない。しかし、開環およびスーパーコイル化プラスミドDNAの両方の殆どは、これらの画分中に見られ得る。当該排出体積を回収し、その後のクロマトグラフィーステップに使用する。
【0027】
図3Aは、Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flow カラムにプラスミドDNAサンプルをロードし、H2O勾配で溶出させたのち得られたクロマトグラフを示す。ピリジル−Sリガンドは、上側右隅に示している。Pyridyl-S Sepharose 6 FFは、ゲル濾過クロマトグラフィー後に得られたサンプル20mlを流速45cm/hrでPyridyl-S Sepharose 6FFにロードした後に4.6/15PEEKカラム中の25mM Tris、pH7.9(216mS/cm)中の2M (NH4)2SO4で平衡化する。全ての非結合物質を平衡化緩衝液で洗浄後、スーパーコイル化プラスミドDNAは、2カラム体積のH2Oの勾配を適用することにより伝導率を低下させることにより溶出させる。伝導率が212mS/cmに到達すると、1つのピークが溶出する。すべての勾配が終了(establish)すると、当該カラムは、25mM Tris、pH7.9(216mS/cm)中の2M (NH4)2SO4で再平衡化する。空隙容量および溶出ピークから選択した画分を、1%アガロースゲル電気泳動で、異なるプラスミドDNA型の存在を分析する。当該挿入図は、これらの条件下、殆どの開環プラスミドDNAは、Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowとは結合せず、その一方、スーパーコイル化DNAは当該媒体に結合し、212mS/cm未満に伝導率を下げることにより溶出し得る。アガロースゲルにおける最後のレーンは、スーパーコイル化プラスミドDNAを含む溶出ピークの5倍希釈物を示す。
【0028】
図3Bは、Sephacryl S-500 HR カラムでのゲル濾過後に得られるプラスミドDNAサンプルを2−メルカプトエチルピリジンSepharose 6 Fast Flow カラムにロードした後に得られる結果を示す。この実験で使用するリガンドはクロマトグラムの上側右隅に示している。カラムの平衡化後、図1で示した実験で得られたサンプル20mlを当該カラムに45cm/hrでロードする。2カラム体積の洗浄緩衝液後、スーパーコイル化プラスミドDNAは、H2Oの勾配で伝導率を低下させることによりカラムから溶出させる。伝導率が209mS/cmに到達すると、結合物質はカラムから溶出する。1%アガロースゲル電気泳動に示すように、この溶出ピークは、主にスーパーコイル化プラスミドDNAを含み、その一方、開環プラスミドDNAは、空隙容量中に見ることができ、そのため、これらの設定条件下では当該媒体には結合しない。
【0029】
図3Cは、図の上側右隅に示したリガンドで得られたクロマトグラムを示す。フェニル-S Sepharose 6 Fast Flowカラムは、ゲル濾過の空隙容量20mlを当該媒体に流速45cm/hrでロードする前に、25mM Tris、pH7.9(216mS/cm)中の2M (NH4)2SO4で平衡化する。非結合の物質を、25mM Tris、pH7.9(216mS/cm)中の2M (NH4)2SO4で洗浄し、非結合物質は、H2Oの勾配で伝導率を低下させることにより溶出させる。伝導率214mS/cmで、当該物質は、当該媒体から溶出を開始する。1%アガロースゲル電気泳動での分析により、フロースルー中には開環プラスミドDNAのみの存在が見られる。スーパーコイル化DNAはカラムに結合し、溶出ピーク中で検出される。
【0030】
図4は、図1で示される幾つかの異なるリガンドで得られた多くのクロマトグラムを示す。各クロマトグラムで、リガンドは、図の上側右隅に示されている。アリール-S Sepharose 6 Fast Flowカラムは、ゲル濾過の空隙容量20mlを当該媒体に流速45cm/hrでロードする前に、25mM Tris、pH7.9(220mS/cm)中の2M (NH4)2SO4で平衡化する。結合物質は、純粋H2Oの勾配で伝導率を低下させることにより溶出させる。異なるクロマトグラムの比較から、リガンド特性を変化させることにより、プラスミドDNAの結合および溶出条件は、修飾され得る。
【0031】
図5は、高伝導率条件下でPyridyl-S Sepharose 6 Fast FlowにプラスミドDNAサンプルをロードした後に得られる結果を示す。Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flow は、25mM Tris、pH7.9(240mS/cm)中の2.4M (NH4)2SO4で平衡化する。Sephacryl S 500 HR でのゲル濾過後に得られるサンプルは、Pyridyl-S Sepharose 6 FFに45cm/hrで20mlロードする前に240mS/cmに調節する。非結合物質を同じ緩衝液を用い洗浄し、溶出は、H2O−勾配で伝導率を低下させることにより開始させる。2つの溶出ピークは、これらの条件下で検出し、選択サンプルは、1%アガロースゲル電気泳動で分析する。これらの状況下、開環およびスーパーコイル化プラスミドDNAの両方が、Pyridyl-S Sepharose 6 FFに結合するが、それら両方とも、異なる伝導率値で溶出する傾向があり、そのため、開環またはスーパーコイル化DNAの何れかが豊富な画分が得られ得ることが判る。
【0032】
図6は、XK16/15カラム中のPyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowに透明なライゼートにクロマトグラフィーを行なった後に得られる結果を示す。Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowカラムは、25mM Tris、pH7.5(224mS/cm)中の2M (NH4)2SO4で平衡化し、その後、透明なライゼート150mlを流速90cm/hrでロードする。非結合物質を洗浄し、結合物質を、カラム全体に水の勾配を適用することにより伝導率を低下させることにより溶出させる。開環プラスミドDNAはマトリクスには結合せず、その一方、スーパーコイル化プラスミドDNAおよびRNAの両方ともPyridyl-S Sepharose 6 FFに結合する。しかし、両方とも、異なる伝導率で溶出し得、ここで、スーパーコイル化プラスミドDNAは、211mS/cmでカラムから溶出を開始し、その一方、RNAは、伝導率が一旦170mS/cm未満になると広範のピーク中で僅かに溶出する。
【0033】
図7は、3.0M Na2SO4、10mM EDTA、100mM Tris−HCl、pH7.0で事前に処理した本発明のカラムに、どのようにプラスミドDNAをロードし、1M NaClまでの勾配でどのように溶出するかを示している。
【実施例】
【0034】
実験部分
以下、本発明を、説明としてのみ提供され、如何なる態様においても添付の請求の範囲により定義されるような本発明の範囲を制限するように解釈されてはならない実施例により記載する。以下または本願明細書中の他の場所で含まれる引用文献はすべて、引用により本願明細書に含める。
【0035】
アガロースビーズを含むリガンドの調製
Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacial Biotech)は、Hermanson et al[Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press (1992), p. 118]によるエポキシ基で活性化された。当該リガンド密度は、おおよそ50μmolエポキシ/mLキャリアであった。アリール−S試薬(図1参照)、50μmol/mLキャリアは、pH10.5のエポキシ活性化セファロースと反応させた。当該反応は、一夜かけて窒素気流下、45℃で行なった。反応後、当該ゲルを冷却し、アセトンおよび最終的には水で洗浄した。得られた当該リガンド濃度は、30−50μmol/mLキャリアの範囲であった。
【0036】
細胞培養
JV4−挿入物を有するpUC19プラスミドを含むE. coli TG1細胞の接種物は、2YT培地中でOD4まで増殖し、その後、40mlをBiostat EDリアクター中の10リッター培地に移す。OD13.6で、当該細胞を回収し、Sorvall RC12BPローター中で4200rpmで40分間遠心分離し、細胞ペレットを−70℃で保存する。
【0037】
アルカリ溶解
細菌25gを、氷冷S緩衝液(61mM グルコース、10mM Tris、50mM EDTA pH8.0)50ml中に再懸濁する。緩衝液S130mlを更に加える。一定の緩やかな攪拌の後、緩衝液P2(0.2M NaOH、1%SDS)390mlを加える。室温でゆっくりと攪拌し確実に完全に混合して10分後、氷冷緩衝液P3(3M 酢酸カリウム、pH5.5)293mlを加える。20分間ゆっくりと攪拌し、当該溶液は、一夜4℃に保存する前に氷上でインキュベーションする。次の日、当該混合物を、GSAローター中で4℃で10,000rpmで30分間遠心分離し、当該上清を濾過ペーパーで濾過し、透明なライゼートを得る。
【0038】
サンプル調製
透明なライゼートを以下の通り処理する:
a)等量(体積)の4M硫酸アンモニウムを加えることにより2M硫酸アンモニウムに調節するか、または好ましくは、
b)Sephacryl(商標) S-500 HR (Amersham Pharmacial Biotech)の粒径排除(基分離および緩衝液交換)、事前平衡化および2M硫酸アンモニウム中での作動によるサンプル精製。Sephacryl S-500 HR (XK50/30カラム、ベッドの高さ20cm)は、25mM Tris、pH7.9中の2M (NH4)2SO4で平衡化する。0.4CVまでの透明なライゼートを、30cm/hrでカラムにロードする。一旦、全てのサンプルをカラムにロードすると、当該溶出速度は、60cm/hrに調節し、プラスミドDNAを含むフロースルーは更なる実験のために回収する(図2参照)。
【0039】
クロマトグラフィー
幾つかのアリール-S Sepharose 6 Fast Flow 媒体は、140cm/hrで4.6/15PEEK−またはXK16/15ガラスカラム(ベッド高さ15cm)中に充填し、すべてのカラムを、215mS/cm(温度25℃に換算)を超える伝導率を生ずる25mM Tris、pH7.9中の2M (NH4)2SO4で45cm/hrで平衡化する。次いで、透明なライゼート調製物(a)またはb)により、上記参照)20−150mlを、同じ流速でカラムにロードする。2カラム体積の洗浄後、結合物質は、10カラム体積にわたるH2O勾配で媒体から溶出する。作動の間、260nmの吸収を記録する。異なる画分を回収し、それら多くを1%アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロミドで染色し、UVで視覚化する(図3A−C、図4、図5および図6参照)。
Claims (31)
- 溶液から核酸分子を単離する方法であって、
(a)核酸分子の混合物を、S−アリールリガンドが提供される担体表面のマトリクスに適用すること、
(b)当該核酸分子を溶出ステップに適用すること、
(c)異なる核酸分子を含む異なる画分を単離すること、
(d)所望により、適当な溶液で当該担体を洗浄すること、
のステップを含む当該方法。 - 当該核酸分子を発現する細胞を分解し、核酸分子を含む溶液を提供する最初のステップを含み、その分解は溶解である、請求項1の方法。
- 適当な溶出液を接触させることにより、核酸分子を溶出する更なるステップを含む、請求項1または2の方法。
- 当該担体が無機性マトリクスである、請求項1−3の何れかの方法。
- 当該担体がガラスである、請求項4の方法。
- 当該担体がゼオライトである、請求項4の方法。
- 当該担体がシリカである、請求項4の方法。
- 当該担体が有機性マトリクスである、請求項1−3の何れかの方法。
- 当該担体が樹脂またはポリマーである、請求項8の方法。
- 当該担体がアガロースまたは架橋化アガロース、デキストラン、ポリスチレン/ジビニルベンゼン、コート化ポリスチレン、アクリル性ポリマー、デキストランアクリル性ポリマー、ビニル性グラフト化ポリマー、またはビニル性ポリマーである、請求項9の方法。
- 当該担体が、シリカ−デキストラン、シリカ−アクリル性ポリマーまたはシリカ−ポリエチレンイミン型の、異なるシリカに基づく樹脂である、請求項9の方法。
- 当該担体が、当該核酸分子混合物が付される活性表面として存在する、請求項1から11の何れか1以上の方法。
- 当該担体が、核酸分子混合物と接触する膜として存在する、請求項1から12の何れか1以上の方法。
- 当該担体が、核酸分子混合物と接触するフィルターとして存在する、請求項1から13の何れか1以上の方法。
- 当該担体が、核酸分子混合物が通過するカラム中のクロマトグラフィーマトリクスとして存在する、請求項1から14の何れか1以上の方法。
- 当該担体が、核酸分子混合物を適用するスポンジ物質として存在する、請求項1から15の何れか1以上の方法。
- S−アリールリガンドが、2(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合するS−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項1−16の何れか1以上の方法。
- S−アリールリガンドが、3(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合するS−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項1−16の何れか1以上の方法。
- S−アリールリガンドが、2(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合し、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、S−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項17の方法。
- S−アリールリガンドが、3(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合し、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、S−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項18の方法。
- S−アリールリガンドがフェニル−Sリガンドである、請求項1−16の何れか1以上の方法。
- S−アリールリガンドが、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介しS−基に分離されるフェニル部分を有するフェニル−Sリガンドである、請求項21の方法。
- 核酸分子がocプラスミドDNA、cccプラスミドDNA、ゲノムDNAおよびRNAを含む、請求項1から22の方法。
- 核酸分子を分離するためマトリクスであって、マトリクスを形成するため担体に結合するアリール−Sリガンドを含むが、ただし、当該リガンドは2−(メルカプトメチル)ピリジン、4−(メルカプトメチル)ピリジン、2−(2−メルカプトエチル)ピリジン、4−(2−メルカプトエチル)ピリジン、4−ニトロ−1−メルカプトメチル−ベンゼン、3,4−ジニトロ−1−メルカプトメチルベンゼン、2−メルカプトメチルキノリン、メルカプトエチルイミダゾリン、および6−メルカプトメチルウラシリンではないことを特徴とする、当該マトリクス。
- S−アリールリガンドが、2(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、S−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項24のマトリクス。
- S−アリールリガンドが、3(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、S−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項24のマトリクス。
- S−アリールリガンドが、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するフェニル部分に分離されるS−基を所望により有するフェニル−Sリガンドである、請求項24のマトリクス。
- 核酸プラスミド分子の分離および精製のためのカラムであって、アリール−Sリガンドが結合するマトリクスを含むが、ただし、当該リガンドは2−(メルカプトメチル)ピリジン、4−(メルカプトメチル)ピリジン、2−(2−メルカプトエチル)ピリジン、4−(2−メルカプトエチル)ピリジン、4−ニトロ−1−メルカプトメチル−ベンゼン、3,4−ジニトロ−1−メルカプトメチルベンゼン、2−メルカプトメチルキノリン、メルカプトエチルイミダゾリン、および6−メルカプトメチルウラシリンではないことを特徴とする、当該カラム。
- S−アリールリガンドが、2(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、S−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項28のカラム。
- S−アリールリガンドが、3(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、S−部分を有するピリジル−Sリガンドである、請求項28のカラム。
- S−アリールリガンドが、1から7炭素原子、好ましくは1から4炭素原子を有するアルキレン鎖を介するフェニル部分に分離されるS−基を所望により有するフェニル−Sリガンドである、請求項28のカラム。
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