CN109370963A - 一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒dna的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：（1）液体培养基的配制；（2）固体培养基的配制；（3）培养基灭菌；（4）纯化培养；（5）扩大培养。本发明提供了一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，培养基中原料搭配合理，培养方法科学，通过本发明的培养方法提高了单位体积大肠杆菌工程菌菌液中质粒总含量，单位菌体质粒含量，单位菌体质粒中超螺旋质粒的含量，对于质粒DNA提取及应用有很好的推动作用，极具市场推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法。
背景技术
质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞（大肠杆菌）中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。
研究发现，提取的质粒一般有超螺旋、线形和开环三种构象。进行琼脂糖凝胶电泳实验时三种构象的质粒电泳速度为超螺旋质粒＞线形质粒＞开环质粒，以超螺旋质粒电泳速度最快，线形质粒在中间，而开环质粒在最后。更重要的是，在用质粒转染时，超螺旋比例高时其转染效率及表达量较高，普遍认为超螺旋质粒 DNA 在基因治疗和DNA 疫苗中是起主要作用的质粒载体形式。细菌的培养作为生产超螺旋质粒 DNA 的第一步，在整个生产过程中起着关键的作用。它兴驻直接影响到超螺旋质粒 DNA 的产量，而且也影响下续步骤的进行。因此，选择和优化菌体的生长条件，是产生大量稳定的超螺旋质粒 DNA必要条件，特别是培养基的组成成分和浓度对细菌的生长和超螺旋质粒DNA 的含量有较大的影响。
《用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基及培养方法》（申请号为201610877655.6）中公开了一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基及培养方法，能够显著提高单位体积质粒总含量和单位菌体质粒含量，但是单位菌体质粒含量依然有待提高，并且对于单位质量质粒中超螺旋质粒的含量没有显著的改善。
发明内容
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：
（1）液体培养基的配制：
a. 原料称取：
称取相应重量份的甘油21~23份、胰蛋白胨13~15份、酵母提取物13.5~14.5份、氯化钠12.5~13.5份、微量元素0.62~0.68份、改性复合粉8.5~9.5份、无菌水460~540份备用；
b. 培养基的配制：
将操作a称取的无菌水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至99~101℃，然后将操作a中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、改性复合粉依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌52~58min，搅拌的同时进行超声波处理；
（2）固体培养基的配制：
将琼脂粉和步骤（1）所得的液体培养基按照质量体积比为7~8g:900~1000mL共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至98~100℃，边搅拌边加热，直至琼脂粉完全溶解；
（3）培养基灭菌：
将步骤（1）所得的液体培养基和步骤（2）所得的固体培养基分别置于高温高压锅内进行灭菌处理，灭菌的温度为120~122℃，灭菌19~23min后，取出培养基，待培养基的温度降至45~55℃时，分别向灭菌处理后的固体培养基和液体培养基中加入培养基体积比1~2%的氨苄青霉素，摇匀即可；
（4）纯化培养：
将大肠杆菌工程菌以平板划线的方式接种于步骤（3）所得的固体培养基中，将接种后的固体培养基倒平板，然后置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制为34~36℃，培养直至单菌落的直径为0.7~1.1mm；
（5）扩大培养：
用无菌的接种针挑取步骤（4）中固体培养基中的单菌落接种于步骤（3）所得的液体培养基中，将接种后的液体培养基置于摇床中进行培养，在摇床中培养的同时，每隔30~40min进行一次光波交替处理，直至OD600达到0.9~1.0即可。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改性复合粉的制备，包括如下步骤：
1）将黄土石和碳酸镧按照重量比为2.2~2.8:1共同投入8.5~9.5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时碱液内的温度控制为62~68℃，浸泡处理22~28min后滤出；
2）将步骤1）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入13.2~13.8%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时酸液内的温度控制为51~55℃，浸泡处理16.5~17.5min后滤出；
3）将步骤2）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理，煅烧炉内的温度控制为930~970℃，煅烧处理5~7min后，将煅烧炉中的温度降至102~104℃，然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡，浸泡过程在微波炉中进行，浸泡处理13~17min后，过滤得滤渣；
4）将步骤3）中所得的滤渣置于烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为66~74℃，干燥至含水率为6.5~7.5%即得改性复合粉；
进一步的，所述步骤3）中改性液各成分及其对应重量份为：十二烷基苯磺酸钠12.2~12.8份、硬脂酸钙8.5~9.5份、水解酪蛋白6.5~7.5份、异戊醇7.5~8.5份、无菌水305~315份。
进一步的，所述步骤3）中微波炉中的频率控制为88~90GHz。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中微量元素各成分及对应重量份为：硫酸铜0.0022~0.0028份、硫酸锰0.00013~0.00015份、碘化钾0.00235~0.00245份、硫酸锰0.000012~0.000018份、氯化钴0.000135~0.000145份、硫酸锌0.0022~0.0028份。
进一步的，所述步骤（1）操作b中超声波的频率为43~45kHz。
进一步的，所述步骤（3）中氨苄青霉素的浓度为15~20ug/mL。
进一步的，所述步骤（5）中摇床培养时，摇床的转速为280~300rpm，摇床内的温度控制为30~32℃。
进一步的，所述步骤（5）中光波交替处理的具体程序为：首先波长为460~470nm的蓝光照射4~5min，然后580~590nm的黄光照射60~70s，再用460~470nm的蓝光照射2~3min。
本发明在现有的大肠杆菌工程菌培养方法的基础上做了很大的改进，首先是培养基的配制，其中添加了一种特殊的改性复合粉，其是以黄土石和碳酸镧合理搭配作为主体物质改性配制，在改性复合粉的制备过程中，首先将黄土石和碳酸镧按照一定的比例共同投入碱液中进行浸泡，浸泡一段时间后滤出，再投入酸液中进行浸泡，碱酸处理后，黄土石和碳酸镧粉末表面遭受一定程度的侵蚀，为后续的改性处理奠定一定的基础，酸碱浸泡过程中，有助于黄土石和碳酸镧的相互结合，再将酸碱浸泡处理后的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧，黄土石和碳酸镧的表面进一步被软化，在高温条件下煅烧，表面形成多孔结构，有助于提高培养基的透气性，促进菌体的生长，防止菌体死亡，提高菌液的质量；煅烧后将煅烧炉中的温度降至102~104℃，然后取出黄土石和碳酸镧混合物立刻置于改性液中进行浸泡，快速降温，黄土石和碳酸镧混合物快速吸附改性液中的活性成分，经过改性液改性处理，黄土石和碳酸镧混合物的表面活性增加，促进菌体对培养基中营养成分的吸收，并且有助于超螺旋质粒DNA处于拓扑缠绕状态，在菌液提取中，更容易沉淀，进而提高单位质量中超螺旋质粒DNA的比重，改性处理的过程在微波环境中实施，微波辅助，增强改性的效果。在菌体的培养中，首先进行纯化培养，目的是活化菌种，纯化菌种，为后续的质粒提取和质粒DNA的质量提供有效的保障，然后进行扩大培养，培养过程在摇床中进行，本发明打破常规的培养温度，将摇床内的温度控制为30~32℃，申请人在大量的实验中发现，在较低的环境中采用光波交替处理，不同波长的光波刺激，有助于超螺旋质粒DNA的表达，提高了超螺旋质粒DNA的含量，并且单位菌体质粒含量也有显著提高。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，培养基中原料搭配合理，培养方法科学，通过本发明的培养方法提高了单位体积大肠杆菌工程菌菌液中质粒总含量，单位菌体质粒含量，单位菌体质粒中超螺旋质粒的含量，对于质粒DNA提取及应用有很好的推动作用，极具市场推广价值。
具体实施方式
实施例1
一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：
（1）液体培养基的配制：
a. 原料称取：
称取相应重量份的甘油21份、胰蛋白胨13份、酵母提取物13.5份、氯化钠12.5份、微量元素0.62份、改性复合粉8.5份、无菌水460份备用；
b. 培养基的配制：
将操作a称取的无菌水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至99~℃，然后将操作a中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、改性复合粉依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌52min，搅拌的同时进行超声波处理；
（2）固体培养基的配制：
将琼脂粉和步骤（1）所得的液体培养基按照质量体积比为7g:900mL共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至98℃，边搅拌边加热，直至琼脂粉完全溶解；
（3）培养基灭菌：
将步骤（1）所得的液体培养基和步骤（2）所得的固体培养基分别置于高温高压锅内进行灭菌处理，灭菌的温度为120℃，灭菌19min后，取出培养基，待培养基的温度降至45℃时，分别向灭菌处理后的固体培养基和液体培养基中加入培养基体积比1%的氨苄青霉素，摇匀即可；
（4）纯化培养：
将大肠杆菌工程菌以平板划线的方式接种于步骤（3）所得的固体培养基中，将接种后的固体培养基倒平板，然后置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制为34℃，培养直至单菌落的直径为0.7mm；
（5）扩大培养：
用无菌的接种针挑取步骤（4）中固体培养基中的单菌落接种于步骤（3）所得的液体培养基中，将接种后的液体培养基置于摇床中进行培养，在摇床中培养的同时，每隔30min进行一次光波交替处理，直至OD600达到0.9即可。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改性复合粉的制备，包括如下步骤：
1）将黄土石和碳酸镧按照重量比为2.2:1共同投入8.5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时碱液内的温度控制为62℃，浸泡处理22min后滤出；
2）将步骤1）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入13.2%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时酸液内的温度控制为51℃，浸泡处理16.5min后滤出；
3）将步骤2）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理，煅烧炉内的温度控制为930℃，煅烧处理5min后，将煅烧炉中的温度降至102℃，然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡，浸泡过程在微波炉中进行，浸泡处理13min后，过滤得滤渣；
4）将步骤3）中所得的滤渣置于烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为66℃，干燥至含水率为6.5%即得改性复合粉；
进一步的，所述步骤3）中改性液各成分及其对应重量份为：十二烷基苯磺酸钠12.2份、硬脂酸钙8.5份、水解酪蛋白6.5份、异戊醇7.5份、无菌水305份。
进一步的，所述步骤3）中微波炉中的频率控制为88GHz。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中微量元素各成分及对应重量份为：硫酸铜0.0022份、硫酸锰0.00013份、碘化钾0.00235份、硫酸锰0.000012份、氯化钴0.000135份、硫酸锌0.0022份。
进一步的，所述步骤（1）操作b中超声波的频率为43kHz。
进一步的，所述步骤（3）中氨苄青霉素的浓度为15ug/mL。
进一步的，所述步骤（5）中摇床培养时，摇床的转速为280rpm，摇床内的温度控制为30℃。
进一步的，所述步骤（5）中光波交替处理的具体程序为：首先波长为460nm的蓝光照射4min，然后580nm的黄光照射60s，再用460nm的蓝光照射2min。
实施例2
一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：
（1）液体培养基的配制：
a. 原料称取：
称取相应重量份的甘油22份、胰蛋白胨14份、酵母提取物14份、氯化钠13份、微量元素0.65份、改性复合粉9份、无菌水500份备用；
b. 培养基的配制：
将操作a称取的无菌水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至100℃，然后将操作a中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、改性复合粉依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌55min，搅拌的同时进行超声波处理；
（2）固体培养基的配制：
将琼脂粉和步骤（1）所得的液体培养基按照质量体积比为7.5g:950mL共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至99℃，边搅拌边加热，直至琼脂粉完全溶解；
（3）培养基灭菌：
将步骤（1）所得的液体培养基和步骤（2）所得的固体培养基分别置于高温高压锅内进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌21min后，取出培养基，待培养基的温度降至50℃时，分别向灭菌处理后的固体培养基和液体培养基中加入培养基体积比1.5%的氨苄青霉素，摇匀即可；
（4）纯化培养：
将大肠杆菌工程菌以平板划线的方式接种于步骤（3）所得的固体培养基中，将接种后的固体培养基倒平板，然后置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制为35℃，培养直至单菌落的直径为0.9mm；
（5）扩大培养：
用无菌的接种针挑取步骤（4）中固体培养基中的单菌落接种于步骤（3）所得的液体培养基中，将接种后的液体培养基置于摇床中进行培养，在摇床中培养的同时，每隔35min进行一次光波交替处理，直至OD600达到0.95即可。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改性复合粉的制备，包括如下步骤：
1）将黄土石和碳酸镧按照重量比为2.5:1共同投入9%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时碱液内的温度控制为65℃，浸泡处理25min后滤出；
2）将步骤1）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入13.5%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时酸液内的温度控制为53℃，浸泡处理17min后滤出；
3）将步骤2）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理，煅烧炉内的温度控制为950℃，煅烧处理6min后，将煅烧炉中的温度降至103℃，然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡，浸泡过程在微波炉中进行，浸泡处理15min后，过滤得滤渣；
4）将步骤3）中所得的滤渣置于烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为70℃，干燥至含水率为7%即得改性复合粉；
进一步的，所述步骤3）中改性液各成分及其对应重量份为：十二烷基苯磺酸钠12.5份、硬脂酸钙9份、水解酪蛋白7份、异戊醇8份、无菌水310份。
进一步的，所述步骤3）中微波炉中的频率控制为89GHz。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中微量元素各成分及对应重量份为：硫酸铜0.0025份、硫酸锰0.00014份、碘化钾0.0024份、硫酸锰0.000015份、氯化钴0.00014份、硫酸锌0.0025份。
进一步的，所述步骤（1）操作b中超声波的频率为44kHz。
进一步的，所述步骤（3）中氨苄青霉素的浓度为17.5ug/mL。
进一步的，所述步骤（5）中摇床培养时，摇床的转速为290rpm，摇床内的温度控制为31℃。
进一步的，所述步骤（5）中光波交替处理的具体程序为：首先波长为465nm的蓝光照射4.5min，然后585nm的黄光照射65s，再用465nm的蓝光照射2.5min。
实施例3
一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：
（1）液体培养基的配制：
a. 原料称取：
称取相应重量份的甘油23份、胰蛋白胨15份、酵母提取物14.5份、氯化钠13.5份、微量元素0.68份、改性复合粉9.5份、无菌水540份备用；
b. 培养基的配制：
将操作a称取的无菌水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至101℃，然后将操作a中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、改性复合粉依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌58min，搅拌的同时进行超声波处理；
（2）固体培养基的配制：
将琼脂粉和步骤（1）所得的液体培养基按照质量体积比为8g:1000mL共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至100℃，边搅拌边加热，直至琼脂粉完全溶解；
（3）培养基灭菌：
将步骤（1）所得的液体培养基和步骤（2）所得的固体培养基分别置于高温高压锅内进行灭菌处理，灭菌的温度为122℃，灭菌23min后，取出培养基，待培养基的温度降至55℃时，分别向灭菌处理后的固体培养基和液体培养基中加入培养基体积比2%的氨苄青霉素，摇匀即可；
（4）纯化培养：
将大肠杆菌工程菌以平板划线的方式接种于步骤（3）所得的固体培养基中，将接种后的固体培养基倒平板，然后置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制为36℃，培养直至单菌落的直径为1.1mm；
（5）扩大培养：
用无菌的接种针挑取步骤（4）中固体培养基中的单菌落接种于步骤（3）所得的液体培养基中，将接种后的液体培养基置于摇床中进行培养，在摇床中培养的同时，每隔40min进行一次光波交替处理，直至OD600达到1.0即可。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改性复合粉的制备，包括如下步骤：
1）将黄土石和碳酸镧按照重量比为2.8:1共同投入9.5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时碱液内的温度控制为68℃，浸泡处理28min后滤出；
2）将步骤1）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入13.8%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时酸液内的温度控制为55℃，浸泡处理17.5min后滤出；
3）将步骤2）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理，煅烧炉内的温度控制为970℃，煅烧处理7min后，将煅烧炉中的温度降至104℃，然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡，浸泡过程在微波炉中进行，浸泡处理17min后，过滤得滤渣；
4）将步骤3）中所得的滤渣置于烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为74℃，干燥至含水率为7.5%即得改性复合粉；
进一步的，所述步骤3）中改性液各成分及其对应重量份为：十二烷基苯磺酸钠12.8份、硬脂酸钙9.5份、水解酪蛋白7.5份、异戊醇8.5份、无菌水315份。
进一步的，所述步骤3）中微波炉中的频率控制为90GHz。
进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中微量元素各成分及对应重量份为：硫酸铜0.0028份、硫酸锰0.00015份、碘化钾0.00245份、硫酸锰0.000018份、氯化钴0.000145份、硫酸锌0.0028份。
进一步的，所述步骤（1）操作b中超声波的频率为45kHz。
进一步的，所述步骤（3）中氨苄青霉素的浓度为20ug/mL。
进一步的，所述步骤（5）中摇床培养时，摇床的转速为300rpm，摇床内的温度控制为32℃。
进一步的，所述步骤（5）中光波交替处理的具体程序为：首先波长为470nm的蓝光照射5min，然后590nm的黄光照射70s，再用470nm的蓝光照射3min。
对比实施例1
本对比实施例1与实施例2相比，省去步骤（1）操作a和操作b中的改性复合粉，以及省去改性复合粉的制备，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例2
本对比实施例2与实施例2相比，省去步骤（1）操作b中的超声波处理，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例3
本对比实施例3与实施例2相比，省去步骤（5）中的光波交替处理，除此外的方法步骤均相同。
对照组
申请号为：201610877655.6公开的用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基及培养方法。
为了对比本发明效果，分别用实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对照组的方法培养大肠杆菌工程菌，然后进行质粒DNA提取实验，具体为：
（1）实验材料：
真核表达质粒pcDNAS2S由解放军458医院肝病研究所构建；宿主菌DH5α由广州白云山拜迪生物医药有限公司（以下简称拜迪）保存；质粒pcDNAS2S转化DH5α，获得工程菌DH5α/pS2S，拜迪公司保存；质粒小量抽提试剂盒，购自QIAGEN公司；紫外可见分光光度计，日本日立公司UV-300型。
（2）菌液培养：
将步骤（1）中的工程菌DH5α/pS2S分别用实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对照组的方法进行培养，待菌液达到相应OD值时，停止摇菌，取菌液以10000g离心速度、4℃、20min离心条件收获菌体，进行相关检测。
（3）质粒抽提，参数测定：
采用QIAGEN质粒小量抽提试剂盒按操作说明进行。质粒含量采用紫外分光光度计测定260nm 波长的A值确定。质粒纯度的测定采用紫外分光光度计测定260nm、280nm波长的吸收比值确定（符合质量标准的比值应在1.75-1.85之间）并进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统扫描，并分析超螺旋质粒的比例（符合质量标准的超螺旋比值应>90％）。
具体实验对比数据如下表1所示：
表1
| 单位体积收菌量（g/L） | 单位体积质粒含量和（mg/L） | 单位菌量质粒含量（mg/g） | A260/A280 | 超螺旋比例（%） | |
| 实施例2 | 196.43 | 495 | 2.52 | 1.82 | 95 |
| 对比实施例1 | 187.32 | 424 | 2.26 | 1.84 | 90 |
| 对比实施例2 | 192.12 | 438 | 2.28 | 1.86 | 87 |
| 对比实施例3 | 184.27 | 389 | 2.11 | 1.82 | 83 |
| 对照组 | 185.64 | 402 | 2.17 | 1.84 | 85 |
由上表1可以看出，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，培养基中原料搭配合理，培养方法科学，通过本发明的培养方法提高了单位体积大肠杆菌工程菌菌液中质粒总含量，单位菌体质粒含量，单位菌体质粒中超螺旋质粒的含量，对于质粒DNA提取及应用有很好的推动作用，极具市场推广价值。
Claims (9)
1.一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）液体培养基的配制：
a. 原料称取：
称取相应重量份的甘油21~23份、胰蛋白胨13~15份、酵母提取物13.5~14.5份、氯化钠12.5~13.5份、微量元素0.62~0.68份、改性复合粉8.5~9.5份、无菌水460~540份备用；
b. 培养基的配制：
将操作a称取的无菌水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至99~101℃，然后将操作a中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、改性复合粉依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌52~58min，搅拌的同时进行超声波处理；
（2）固体培养基的配制：
将琼脂粉和步骤（1）所得的液体培养基按照质量体积比为7~8g:900~1000mL共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至98~100℃，边搅拌边加热，直至琼脂粉完全溶解；
（3）培养基灭菌：
将步骤（1）所得的液体培养基和步骤（2）所得的固体培养基分别置于高温高压锅内进行灭菌处理，灭菌的温度为120~122℃，灭菌19~23min后，取出培养基，待培养基的温度降至45~55℃时，分别向灭菌处理后的固体培养基和液体培养基中加入培养基体积比1~2%的氨苄青霉素，摇匀即可；
（4）纯化培养：
将大肠杆菌工程菌以平板划线的方式接种于步骤（3）所得的固体培养基中，将接种后的固体培养基倒平板，然后置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制为34~36℃，培养直至单菌落的直径为0.7~1.1mm；
（5）扩大培养：
用无菌的接种针挑取步骤（4）中固体培养基中的单菌落接种于步骤（3）所得的液体培养基中，将接种后的液体培养基置于摇床中进行培养，在摇床中培养的同时，每隔30~40min进行一次光波交替处理，直至OD600达到0.9~1.0即可。
2.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）操作a或操作b中改性复合粉的制备，包括如下步骤：
1）将黄土石和碳酸镧按照重量比为2.2~2.8:1共同投入8.5~9.5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时碱液内的温度控制为62~68℃，浸泡处理22~28min后滤出；
2）将步骤1）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入13.2~13.8%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时酸液内的温度控制为51~55℃，浸泡处理16.5~17.5min后滤出；
3）将步骤2）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理，煅烧炉内的温度控制为930~970℃，煅烧处理5~7min后，将煅烧炉中的温度降至102~104℃，然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡，浸泡过程在微波炉中进行，浸泡处理13~17min后，过滤得滤渣；
4）将步骤3）中所得的滤渣置于烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为66~74℃，干燥至含水率为6.5~7.5%即得改性复合粉。
3.根据权利要求2所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤3）中改性液各成分及其对应重量份为：十二烷基苯磺酸钠12.2~12.8份、硬脂酸钙8.5~9.5份、水解酪蛋白6.5~7.5份、异戊醇7.5~8.5份、无菌水305~315份。
4.根据权利要求2所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤3）中微波炉中的频率控制为88~90GHz。
5.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）操作a或操作b中微量元素各成分及对应重量份为：硫酸铜0.0022~0.0028份、硫酸锰0.00013~0.00015份、碘化钾0.00235~0.00245份、硫酸锰0.000012~0.000018份、氯化钴0.000135~0.000145份、硫酸锌0.0022~0.0028份。
6.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）操作b中超声波的频率为43~45kHz。
7.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中氨苄青霉素的浓度为15~20ug/mL。
8.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（5）中摇床培养时，摇床的转速为280~300rpm，摇床内的温度控制为30~32℃。
9.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（5）中光波交替处理的具体程序为：首先波长为460~470nm的蓝光照射4~5min，然后580~590nm的黄光照射60~70s，再用460~470nm的蓝光照射2~3min。
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| CN112175852A (zh) * | 2019-07-04 | 2021-01-05 | 华大青兰生物科技(无锡)有限公司 | 一种生产质粒的方法 |
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| EP1379645B1 (en) * | 2001-04-18 | 2010-06-23 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Isolation of dna molecules using mercapto-aryl ligands |
| US20150132740A1 (en) * | 2012-06-05 | 2015-05-14 | 3M Innovative Properties Company | Lanthanum-based concentration agents for microorganisms |
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