JP2004528916A - 身体領域内の標的の深さ、輝度およびサイズを決定するための方法および装置 - Google Patents
身体領域内の標的の深さ、輝度およびサイズを決定するための方法および装置 Download PDFInfo
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Abstract
被験体における発光源の位置およびサイズを調査する方法が開示される。この方法を実施する際に、（ｉ）発光源から発生し、（ｉｉ）被験体の混濁生物学的組織を通して進み、そして（ｉｉｉ）被験体の目的の第１の表面領域から発光する、光子を測定することによって、光強度プロフィールを、光検出器デバイスを用いる第１の投射から、最初に得る。光強度プロフィールは、深さおよびサイズのような関数パラメータを予測するために、パラメータに基づく生物光学的関数に対して整合される。このように決定されたパラメータは、第１の測定された光強度プロフィール以外のデータを使用して精密化され、被験体における発光源のおよその深さおよびサイズを得る。この方法を実施するための装置もまた開示される。
Description
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、非侵襲性医学的画像化、医学的研究、病理学、ならびに薬物の発見および開発の分野のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
種々の医学的診断および治療設定において、ならびに生体医学的研究において、被験体の身体領域内の表面下標的または領域を画像化することは望ましい。例えば、固形腫瘍の一部もしくは全て、心筋虚血の領域、被験体に投与された治療化合物の分布、または疾患の進行を非侵襲的に位置決定し、画像化することは、有用な研究または診断情報を提供し得る。理想的には、画像化方法は、身体領域内の目的の標的を位置決定し得、その身体領域の表面の下にあるその標的の形状、サイズ、細胞数、および深さについての情報を提供し得る。しかし、これまでは、表面下の身体標的画像化のために使用され、そして／または提唱されてきた方法は、一般に、Ｘ線のような電離放射線、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のような高価かつ大きくて扱いにくい機器、または超音波を使用する方法に制限されてきた。
【０００３】
Ｘ線は、優れた組織透過性を有し、コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）またはコンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）とともに使用される場合には、優れた画質を提供し得る。しかし、Ｘ線への曝露は、そのような曝露が長期化される場合には、潜在的に有害であるので、Ｘ線は、疾患の進行をモニタリングする際の使用を制限してきた。Ｘ線は、身体領域内の標的に位置した組成物を位置決定および画像化するために使用され得るが、常に、Ｘ線照射と関連した潜在的な有害性に曝されてはいる。しかし、Ｘ線は、インビボでの遺伝子産物の発現を画像化し、このような遺伝子産物を発現する標的の深さおよび／または形状を決定するためには、容易に使用することができない。
【０００４】
ＭＲＩはまた、被験体の身体領域における標的、領域および構造を画像化するための優れた方法である。ＭＲＩは、電離照射と関連するもののような有害な属性を有するとは考えられていないが、ＭＲＩの使用のために必要な、その高価かつ大きく扱いにくい機器の大きさにより、多くの応用または状況が実際的なものではなくなっている。ＭＲＩは、被験体の身体領域以内の標的についての二次元情報および三次元情報を提供し得るが、標的と関連した生理学的活性を画像化する際にはあまり有効でない。
【０００５】
超音波または超音波検査法は、ヒト身体内の構造の画像を生成するための高周波数音波（超音波）の使用である。超音波は、ヒトが聞き取れる音の範囲を超えた音波である。超音波は、圧電性結晶の電気刺激により発生され、このような波は、特定の身体領域にねらいをつけられ得る。波が身体領域内の身体組織を通って進むにつれて、波は、例えば、身体の２つの異なる器官の間の境界のように、組織密度が変化する任意の地点で反射される。超音波は、照射も放射活性物質も使用しないという利点を提供し、ＭＲＩほど、高価でもなく、大きく扱いにくい機器も使用しないが、下にある組織および構造の密度の違いを認識することにのみ制限される。従って、超音波は、感染により標的組織の密度に認識可能な変化が生じなければ、このような感染の進行を効率的に追跡しかつモニターすることはできない。超音波は、組織または器官の生理学的機能を画像化することも検出することもできない。
【０００６】
これまで、陽子射出断層撮影法すなわちＰ．Ｅ．Ｔ．は、器官または組織の機能の画像を生成するので、画像化技術の中では、独特であった。他の画像化技術（例えば、Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩおよび超音波撮影）は、器官または組織の解剖学的構造を示すが、器官または組織内の生理学的活性を認識することはできない。器官の特定の生化学的活性を画像化するために、放射活性物質（放射性トレーサーまたは放射性医薬品といわれる）が身体内に注入または吸入されている。このトレーサーは、通常、水または糖のような身体内に天然に存在する物質の放射性等価物である。放射活性同位体は、その原子が、異なる中性子の数を有することを除いて、身体自身の非放射活性同位体に同一である。結論として、被験体の身体は、放射活性物質が負荷され、このような物質と関連する潜在的な有害性が負荷される。Ｐ．Ｅ．Ｔ．は、トランスジェニック組織、器官、またはトランスジェニック動物に由来する非同位体発現産物を検出できない。身体の放射線源の二次元写真が、放射性同位体の使用により得られる診断技術である、シンチグラフィーはまた、構造およびそれらの機能を画像化するために使用され得る。しかし、シンチグラフィーは、被験体の身体領域における標的の深さを決定するためには適切ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
被験体の身体領域における標的の位置決めおよび画像化のための上述の技術の観点から、このような標的の深さおよび／または形状および／または細胞の数を、放射活性、放射線、または高価なかつ嵩高い機器を使用する必要なく決定するための、方法およびデバイスに対する必要性が存在する。本明細書中に開示される本発明は、これらの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、被験体における発光源の位置、サイズおよび細胞数を調査するための方法を包含する。この方法を実施する際に、（ｉ）発光源から発生し、（ｉｉ）被験体の混濁生物学的組織を通して進み、そして（ｉｉｉ）被験体の目的の第１の表面領域から発光する、光子を測定することによって構築される、第１の測定された光強度プロフィールを、光検出器デバイスを用いる第１の投射から、最初に得る。光強度プロフィールは、深さおよびサイズのような関数パラメータを予測するために、パラメータに基づく生物光学的関数に整合される。このように決定されたパラメータは、第１の測定された光強度プロフィール以外のデータを使用して精密化され、被験体における発光源のおよその深さおよび大きさを得る。さらなるデータは、被験体から測定されたデータ、モデリング分析からのデータ、または被験体の表面から放出された光子の波長に関連するデータであり得る。例えば、以下である：
この方法は、代表的に、被験体における発光源のおよその深さおよび形状を使用して、発光源の２−Ｄまたは３−Ｄの可視的表示を作成する工程、ならびにこの可視的表示を、被験体の２−Ｄまたは３−Ｄの画像に重ね合わせる工程を包含する。
【０００９】
さらなるデータは、混濁媒体における発光源からの光の拡散のコンピュータシミュレーションから得られ得る。１つの好ましいシミュレーションアプローチは、（ｉ）複数の深さの１つで位置し、かつ複数のサイズおよび形状の１つを有するグロー源から、生物学的祖組織と類似の吸収特性および散乱特性を有する混濁媒体を通る、光子拡散のモデルに基づいて、複数の理論的光強度プロフィールを作成する工程、（ｉｉ）これらの複数の理論的光強度プロフィールの各々と、第１の測定された光強度プロフィールとの間の一致の質を比較する工程、（ｉｉｉ）この第１の測定された光強度プロフィールを提供する理論的光強度プロフィールを選択する工程、ならびに（ｉｖ）(ｉｉｉ)で選択された理論的光強度プロフィールからのパラメータを使用して、被験体における源の適切な深さ、形状および輝度を得る工程、を包含する。この方法は、光子散乱モデルにおいて、光子が通過する組織に対応する１つ以上の予め決定された組織特異的光散乱係数を使用することを包含し得る。
【００１０】
別の一般的な実施形態において、さらなるデータは、約４００ｎｍと約１０００ｎｍとの間の２つ以上の異なる波長において、被験体からの光放射を測定し、これらの異なる波長において測定した相対光強度を決定し、そしてこの決定された相対光強度と、異なる波長における既知の相対シグナル強度とを、組織深さの関数として比較することによって、得られる。あるいは、光強度のスペクトルは、約４００〜１０００ｎｍの間の選択された波長範囲にわたって測定され、そしてこの測定されたスペクトルは、組織内の種々の深さに配置された発光源から測定された複数のスペクトルと比較され、この測定されたスペクトルと既知のスペクトルとを対応させることにより、発光源の深さを決定する。
【００１１】
発光源についての種々の実施形態において、この発光源は、発光部分または蛍光部分であり；この発光源は、被験体に投与され、そして選択された標的に結合するか、またはそうでなければ、測定の前に、被験体内に位置し；そしてこの発光源は、被験体の生物学的細胞または被験体に投与される生物学的細胞により発現される光発生タンパク質のような、光発生タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質など）である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、被験体中の発光源の位置およびサイズを調査する際に使用するための装置を包含する。この装置は、被験体からの光放射事象が検出され得る遮光（ｌｉｇｈｔ−ｔｉｇｈｔ）エンクロージャ、およびこのエンクロージャに付随する光学システムを備え、この光学システムは、このエンクロージャ内の第１の透視から、光子（これは、（ｉ）発光源から発生し、（ｉｉ）被験体の混濁した生物学的組織を通過し、そして（ｉｉｉ）被験体の目的の第１の表面領域から放射される）を測定することにより作成される第１の光強度を生成する際に使用するためのものである。光子検出器に作動可能に連結された計算ユニットは、（ｉ）この第１の測定された光強度プロフィールを、パラメータベースの生体光子関数と対応させ；そして（ｉｉ）この第１の測定された光強度プロフィール以外のデータを使用して、生体光子関数のパラメータを精密化して、被験体中の発光源の適切な深さおよび形状を生成するように機能する。
【００１３】
光学システムは、好ましくは、増感電荷結合素子（ＣＣＤ）または冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）、およびこのＣＣＤに光を集めるためのレンズを備える。この光学システムは、被験体の目的の複数の異なる選択された表面領域から放射される光子を検出するような様式で、構成され得る。このシステムは、選択された異なる波長範囲（例えば、６００ｎｍの上および下）内の光子を伝達するための１つ以上のフィルタを備え得る。
【００１４】
この計算ユニットは、曲線を第１の空間的プロフィールと対応させるために、種々の深さにおける種々のサイズの発光源を表すモデルの生体光子関数のデータファイルを備え得る。
【００１５】
この光学システムは、波長弁別のためのフィルタを備え、この計算ユニットは、以下（ｉ）および（ｉｉ）のパラメータ精密化操作の少なくとも１つを実施するように作動可能である：
（ｉ）異なる波長で測定した相対光強度を決定し、そしてこの決定された相対光強度と、異なる波長における既知または算出された相対シグナル強度とを、組織深さの関数として比較すること；および
（ｉｉ）測定されたスペクトルを、組織内の種々の深さに配置された発光源から測定された複数のスペクトルと比較し、そしてこの測定されたスペクトルを既知のスペクトルと対応させることによって、発光源の深さを決定すること。
【００１６】
別の実施形態において、この計算ユニットは、強度パターン画像を平均化して単一の強度値にし、さらに、特定のサイズおよび形状の発光源の関数として生成される、積分された光強度値によって、光放射源のサイズを決定するように、作動可能である。
【００１７】
この計算ユニットは、複数の深さの１つで位置し、かつ複数のサイズおよび形状の１つを有する発光源から、生物学的祖組織と類似の吸収特性および散乱特性を有する混濁媒体を通る、光子拡散のモデルに基づく、複数の理論的光強度プロフィールを含むデータベースを有し得る。ここで、この計算ユニットは、（ｉ）これらの複数の理論的光強度プロフィールの各々と、第１の測定された光強度プロフィールとの間の一致の質を比較し、（ｉｉ）この第１の測定された光強度プロフィールに対する最高の整合を提供する理論的光強度プロフィールを選択し、そして（ｉｉｉ）(ｉｉ)で選択された理論的光強度プロフィールからのパラメータを使用して、被験体における源の適切な深さ、形状および形状を得るように、作動可能である。
【００１８】
さらに、この計算ユニットは、被験体中の発光源の適切な深さおよび形状を使用して、この発光源の可視的な二次元表示または三次元表示を作成するように作動可能であり、この可視的表示を被験体の二次元画像または三次元画像に重ね合わせる。
【００１９】
別の局面において、本発明は、被験体中の発光源の深さを決定する方法を提供する。この方法の実施において、約４００ｎｍと約１０００ｎｍとの間の２つ以上の異なる波長にで、被験体からの光放射強度が、測定される。この発光源の深さは、測定された光強度および被験体の組織の光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）を使用して決定される。
【００２０】
光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）は、被験体の減衰係数および拡散係数と同じかまたは類似である材料におけるこれらの係数の直接測定によって、得られ得る。
【００２１】
あるいは、光学特性の情報は、２つ以上の異なる波長で、被験体の組織または材料に対応する組織または材料における複数の深さの各々に位置する発光源からの光強度を決定することによって、間接的に得られ得る。次いで、所望の深さの決定は、測定された光強度を、複数の深さの各々で決定された光強度と対応させることによって、行われる。
【００２２】
後者のアプローチにおいて、発光源からの光強度のスペクトルプロフィールは、複数の深さの各々における発光源からの光強度の複数のスペクトルプロフィールの各々と比較され得る。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明を、添付の図面と共に読んだ場合に、より十分に明らかとなる。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
他に明記されない限り、以下の用語は、以下のように規定される。
【００２５】
「生体光子関数」は、光子源変数（例えば、源の深さ、サイズおよび形状、光放射細胞の数、特定の組織型についての波長依存的散乱係数および吸収係数、ならびに光放射体のスペクトル特性）の形で、測定可能な光子出力（例えば、光放射プロフィール、スペクトル強度分布、または積分された光強度）を示す数学関数である。光子関数は、例えば、以下に記載されるような光子拡散モデル、Ｍｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏシミュレーション、または有限要素分析に基づき得る。
【００２６】
「混濁組織」は、光散乱特性および光吸収特性の両方を有する、被験体中の不透明な組織である。
【００２７】
「標的領域」とは、被験体中の内部表面下領域（例えば、表面下の組織または器官、固形腫瘍、または感染領域）をいい、これは，（ｉ）被験体内に位置し、（ｉｉ）混濁組織によって、被験体の表面領域から離れており、そして（ｉｉｉ）好ましくは、少なくとも１つの区別可能な特徴（例えば、組織特異的抗原または器官特異的抗原、ｍＲＮＡまたは発現タンパク質のいずれかとしての遺伝子または遺伝子産物、細胞、器官または組織の活性化、不活性化または調節から生じる産物）を有する。
【００２８】
発光源とは、標的領域における光放射の源をいう。この発光源自体は、標的組織が、特定の遺伝子がいくつかの活性化手段により発現される場合に、組換え光放射タンパク質を生成するように遺伝的に改変されている場合、可視光を放射し得る。好ましい実施形態において、異なるタイプの光発生タンパク質（例えば、生体発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）および蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｄｓＲｅｄおよびＹＦＰ））が、用いられる。例示的な発光源としては、光発生タンパク質で形質転換され、動物被験体に投与された原核生物細胞および真核生物細胞、ならびに光発生レポーター遺伝子に対してトランスジェニックにされた動物の内因部分である光発生細胞が挙げられる。
【００２９】
あるいは、この源は、蛍光分子または可視光を放射する電磁放射線によって励起され得る他の分子を含み得る。例えば、標的の光放射を引き起こすのに有効な組成物が、被験体に投与され得、そして標的位置における局在化を可能にされ、ここでこの組成物は、次いで、光を放出するか、または標的内または標的に隣接するいくつかの他の部分の光放出を引き起こす。例えば、投与される組成物は、標的内の細胞または標的に隣接する細胞を活性化し、次いで、このような細胞の光放射を引き起こす化合物であり得、従って、局在化した細胞は、被験体の身体領域内の標的である。さらに他の実施形態において、感染細胞が、被験体に投与され、そして疾患の進行および局所性が決定される。この実施形態において、標的は、被験体の身体領域内の位置を有する所定の点における細胞のクラスターである。本発明の他の実施形態において、身体領域は、複数の標的を有し得、そして被験体は、複数の身体領域を有し得、各々の領域は、標的を有する可能性がある。
【００３０】
「蛍光色素」または「蛍光団」は、励起極大でまたは励起極大付近で効率的に励起され、長波長の光を放射または蛍光を発する分子である。蛍光色素の励起極大とこの蛍光色素の発光極大との間の差異は、ストークスシフトとして知られている。所定の蛍光色素のストークスシフトが大きくなるほど、励起スペクトル、またはこの蛍光色素を励起する波長の範囲と、発光スペクトル、または蛍光性である場合の蛍光色素により放射される光の波長の範囲との間の差異が大きくなる。本発明の特定の実施形態は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣＹ７、および他の遠赤外（ｄｅｅｐ ｆａｒ ｒｅｄ）、または近赤外（ＮＩＲＦ）の蛍光色素が有するような高いストークスシフトを有する蛍光色素を用いる。特に好ましい蛍光色素は、約６００ｎｍより長い波長の光を放射する。他の好ましい蛍光色素は、６００ｎｍより短い範囲の光を放射する。特に、「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）の改変体（各々は、種々の発光スペクトルを有する）が、特に有用である。なぜなら、ルシフェラーゼと同様に、このようなタンパク質は、標的またはこの標的に隣接しているかもしくは結合している細胞によって合成され得るか、またはこのようなタンパク質は、例えば感染における場合と同様に、標的に位置しているからである。ＧＦＰは、結合体として、標的に局在する別のタンパク質または生物学的材料にさらに投与され得る。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、既知の発光条件下で、各々の発光源は、既知の発光スペクトルを有する。各々の発光スペクトルは、好ましくは、検出工程の全体にわたって一定である。特に、各々の光の波長で発光の相対強度は、全てのスペクトル強度が変化するので、発光源の発光スペクトルの範囲内の他の全ての光の波長での発光強度と比例したままである。本発明のいくつかの実施形態は、最低少なくとも２つの識別可能な範囲の発光波長を必要とする。より好ましくは、本発明の特定の実施形態は、これらの光が被験体の選択された体内の領域を伝わる場合、他の領域からこのような光が体内の領域を伝わるための距離または深さの関数として、各々の光の波長の範囲が別々に挙動することを必要とする。例えば、光の波長の第１範囲の強度は、光が伝わる体内の領域の１センチメートル毎に半分にカットされるのに対して、光の波長の第２範囲の強度は、光が伝わる体内の領域の１センチメートル毎に４分の３をカットされる。両方の波長範囲を有する光の強度は、各々の範囲が同じ強度を有する場合、１センチメートルの組織を通過後に、第１範囲で２分の１を、そして第２範囲で４分の３を減少する。組織の深さ０にて初期の１：１の強度比から得られた２：１の強度比を比較することによって、光が組織を通って１センチメートル伝わったという決定が、なされ得る。
【００３２】
本発明は、異なるルシフェラーゼ酵素のような異なる発光源を用いて実行され得る。例えば、寒天上に発現した「青色（ｂｌｕｅ）」細菌ルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来の発光は、約４８５ｎｍに中心のあるスペクトルを明らかにする分光計によって分析された。ＰＢＳ溶液中のＰＣ−３Ｍ細胞にて発現した「緑色」ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）は、約５７０ｎｍに中心のあるスペクトルを示して発光した。ＰＢＳ溶液中に懸濁したＰＣ−３Ｍ細胞にて発現した「赤色」ルシフェラーゼは、約６２０ｎｍに中心のあるスペクトルを示した。
【００３３】
（ＩＩ 装置および方法）
図１Ａは、本発明に従って、被験体における発光源の位置およびサイズを調査するのに使用され得る装置２０の断面図である。この装置は、一般的に、被験体からの発光現象が検出され得る遮光エンクロージャまたはチャンバ２２を備える。遮光ボックス２２は、共有に係るＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１６３２４７（これは、その全体において本明細書中に参考として援用される）に記載されるように構築され得る。簡単には、このチャンバは、後壁（例えば、後壁２１）および側壁によって規定され、そして前開口部（図示されてないが、これは、開けられてチャンバの内側へのアクセスを提供し得、そして閉じられて遮光シールを提供し得る）を有する。遮光ボックス２２は、小動物に対して設計されたが、この技術は、ヒトを含むより大きな哺乳動物に適用され得る。
【００３４】
ステージ２４は、チャンバ内に含まれ、このステージ２４上に被験体が配置され、そして好ましくは、発光検出の間、固定化される。本明細書中に記載される多数の実施例は、小さな哺乳動物の被験体（代表的には、マウスまたはラット）でなされなければならないが、同じ原理および方法が、チャンバサイズの適切な拡大、ならびに必要に応じて、標的領域における発光体のサイズおよび数の適切な増加を利用して、他の動物ならびにヒト被験体に適用することが理解される。示される装置におけるステージは、一般に２６で示される従来のウォームスクリュー機構によって、そして利用者の制御下で、チャンバ内の選択された垂直位置に上昇および下降されるように設計される。チャンバ内のステージ位置は、可視光シグナルを必要としない多くの公知の追跡デバイスのいずれかによって、モニターされ得る。
【００３５】
投射（ｖｉｅｗｉｎｇ）オプティクスは、２つの一般的な構成要素に備えられる。１つ目は、光検出器３２の検出スクリーン上に被験体の表面からの放出現象に焦点を合わせるために役立つレンズアセンブリ２８であり、光検出器３２は、代表的には、電荷結合デバイス（これは、内因性のノイズレベルを最小するために冷却条件で作動され得る）の光検出器ピクセルアレイである。レンズアセンブリの構築および光検出器へのレンズアセンブリの光学結合は、従来のものである。１つの好ましいＣＣＤは、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから市販のｍｏｄｅｌ ６２０ ＣＣＤである。
【００３６】
光学システムの２つ目の任意の構成要素は、多数の光学バンドパスフィルター（選択された範囲の可視光波長以外、全ての光透過を遮断するように設計される）を備える波長フィルターホイール３０である。１つの標準的な設定としては、以下の３つのフィルタが挙げられる；５１０ｎｍ未満の波長用のショートパスフィルター３０ａ（青色光フィルタ）、５００〜５７０ｎｍの範囲内のバンドパス用のミッドパスフィルター３０ｂ（緑色光フィルタ）、および５９０ｎｍより長い波長用のロングパスフィルター（赤色光フィルタ）。いくつかの適用において、フィルタは、より緻密なバンドパス（例えば、２０ｎｍ毎）を提供し得る。直前に記載の投射オプティクスおよび検出器はまた、本明細書中において集団的に、光学システムと称される。
【００３７】
この装置はまた、コントロールユニット３４を備える。種々の利用者に制御される設定（例えば、ステージ高、配向、および並進位置、バンドパスフィルター、ならびに検出様式）は、装置内のコントロール入力パネル３６を通じてなされる。
【００３８】
図１Ｂは、装置２０のより概略的な表現を示し、ここでは、小さな哺乳動物被験体（例えば、マウス３８）の画像化に使用するためのスケールで示される。レンズアセンブリは、ここでは、単体レンズ２８、フィルターホイール３０、およびＣＣＤ検出器３２として示されている。検出出力は、コントロールユニットコンピュータユニット３４（これは、データファイルに対するプロセッサ４０および記憶ユニット４２を備える）内のコンピュータユニット４０に提供される。検出器３２由来の設計からの光検出シグナルに応答する、データファイルの内容、およびコンピュータユニットの作動は、以下に記載される。コントロールユニットは、利用者に情報および画像を表示するために、表示／出力デバイス４４（例えば、コンピュータモニタ）に作動可能に接続される。
【００３９】
コンピュータユニットの操作は、この装置によって実行される本発明の方法から理解され得、この操作は、図２に要約され、そして以下にさらに詳細に記載される。この方法における第１工程は、最初に測定される光−強度特性を得ることである。これは、被験体内に発光源をまず局在化することによってなされる。これは、上記されるように、種々の方法でなされ得、これらの方法としては、標的領域において発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）を産生するのに有効な遺伝子を被験体に導入すること、または標的源に蛍光性化合物を局在化させること（両方とも、例えば、共有に係るＰＣＴ出願ＷＯ９９ＵＳ／３００７８、ＷＯ００ＵＳ／７２９６、ＷＯ９９ＵＳ３００８０；およびＷＯ９７ＵＳ６５７８（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように公知である方法に従う）が挙げられる。
【００４０】
このようにして準備された被験体は、遮光チャンバ内に配置され、そして標的領域での発光現象に由来する被験体表面からの発光が、図２において５２で示されるように測定され、デジタル化され、そしてコンピュータユニットに収容される。コンピュータユニットは、このデータを用いて、５４で示されるように発光の空間プロフィールを生成する。このプロフィールは、検出器内の検出器エレメントの選択された行および選択された列に沿って、取得され得、図１Ａにおけるステージに平行な平面内のｘ（横）軸およびｙ（縦）軸に沿ってプロフィールを示す。すなわち、このプロフィールは、検出器エレメントの選択された行および列に沿って測定された強度値のプロットであり、そして被験体表面から検出器アレイ上へと焦点を合わせられる光強度の値の分布を表す。被験体から測定される例示的な光強度値は、図３Ｂに実線で示される。図３Ａは、発光等高線を示し、そして図３Ｂは、これらの位置に対応する検出器ピクセルで決定されるような垂直プロフィールを示す。
【００４１】
ここで、図２に戻ってみると、このように取得された空間プロフィールは、パラメータベースの光子関数（ｐｈｏｔｏｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のデータベース５８に記憶されたプロフィールと整合またはあてはめられる。この光子関数は、既知のサイズおよび深さの発光源から測定されたか、または以下に記載されるような、深さパラメータおよびサイズパラメータ、ならびに必要に応じて、他のパラメータを用いる光子拡散モデルから計算されるかのいずれかの経験的関数である。
【００４２】
最適な曲線の整合から、このプログラムは、発光源の深さおよび／またはサイズおよび／または輝度の好ましくは、３つ全ての初期に推定される決定を行い得る。本発明の特徴に従って、この方法は、深さ決定およびサイズ決定が、さらなる光強度データ、および／またはさらなるモデリングデータの形態であり得るさらなるデータによって精密化される様式で、現在実行されている。例えば、図２に示されるように、このデータは、以下の形態であり得る：
（ａ）第２投射角から被験体を投射することによって得られる、光強度データ、代表的には、空間プロフィールデータを意味する６２で示されるような、第２投射データ。代表的には、装置内の被験体は、発光が、被験体表面の第２領域から得られるように光学システムに対して傾けられる；
（ｂ）１つ以上のバンドパス範囲（例えば、青色光、緑色光、または赤色光のスペクトル範囲）で得られる光強度データを意味する６４で示されるような、スペクトルデータ；
（ｃ）代表的には、目的の被験体に近い被験体内の選択された位置で波長の関数として得られる予め決定された光強度値を意味する６６で示されるような、透過率データ；
（ｄ）組織パラメータ（例えば、光が拡散する被験体組織に対応する、減少した散乱係数μ’ｓ、吸収係数μａ、または有効係数μｅｆｆ）の予め決定された値を意味する６８で示されるような、組織特性データ。このデータは、例えば、拡散モデルにより作成される空間プロフィール曲線を精密化するために、使用される；
（ｅ）被験体の標的領域および隣接表面を示すモデルにおけるか、またはこの被験体に近い実際の被験体において、選択された位置で既知の強度およびサイズの光源を配置することによって取得される、予め決定された光強度値、代表的には、空間プロフィールデータを意味する７０で示されるような、シミュレーションデータ；ならびに
（ｆ）空間プロフィール全体または検出器アレイ全体にわたって、合計または積分された全光強度を意味する７２で示されるような、全強度データ。コンピュータデバイスにより実行されるプログラムは、６０でさらなる情報を受信し、そして以下に考察されるように、７４での発光源の深さおよびサイズを精密化するための情報を使用する。最終的に、発光源における、源の深さ、サイズ、ならびに必要に応じて、形状および細胞数の精密化された決定は、発光源の位置および強度を示すデータの形態および／または１つ以上の被験体画像のいずれかで利用者に表示される。
【００４３】
（ｇ）７３で示されるような絶対較正された光強度。絶対強度に対する較正は、ＣＣＤにおける計数／秒／ピクセルを、ラジアンス光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ（ｓｒは、ステラジアンである）への変換を可能にする。図８Ａは、較正方法において使用される光学アセンブリ１００を例証する。このアセンブリは、ＣＣＤ検出器１０２に加えて、レンズ１０４（上記のようにレンズアセンブリを示す）、バンドパスフィルター１０６および低光レベル積分球（例えば、Ｏｐｔｒｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＯＬ Ｓｅｒｉｅｓ４２５球）を備え、この積分球は、既知の光強度の供給源として作動する。光子／秒／ｃｍ２／ｓｒで測定されるこの球からの既知のラジアンスは、２つの数に関する較正因子の計算を可能にする。
【００４４】
図８Ｂは、発光源において、細胞の総数を算出するために、絶対的な測定強度をどのように使用するかを説明する。各細胞が、光子フラックスφｃ（光子／秒／細胞）を生じると仮定する。被験体１１２内の発光源１１０からのラジアンスは、検出器１０２で測定される場合、光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒの数の測定値である。次いで、測定されたラジアンスが、目的の領域にわたって積分されて、光源フラックスφｓ（光子／秒）に変換される。既知のフラックス値から、発光源における細胞の数が、φｓ／φｃとして容易に算出される。
【００４５】
（ＩＩＩ．発光データおよびパラメータ）
この節は、本発明を実施する際に収集され得る発光データの種々の型を考慮し、そしてこれらのデータが、モデル拡散曲線との曲線の整合に基づいて、光子拡散モデル化において、および／または発光源の深さもしくはサイズを決定するために、どのように使用され得るかを議論する。
【００４６】
（光強度の空間プロフィール） 決定された基礎の発光データは、図３Ｂに関して上で議論された、光強度の空間プロフィールである。測定された光強度の空間プロフィールは、被験体の表面領域から発光された光強度の空間的分布を示す。光強度の空間プロフィールは、単一の線、または２つ以上の線に沿って（例えば、被験体を支持しているステージに対してｘ方向およびｙ方向に沿って）得られ得る。光の２Ｄ表面分布全体もまた、使用され得る。モデル化された空間プロフィールは、混濁した組織を通しての光子拡散のモデルから算出された、推定の光強度の空間的分布を表す。測定されたプロフィールをモデル化されたプロフィールと整合させることによって、発光源のおよその深さおよび／またはサイズが決定され得る。
【００４７】
（全光強度） 全光強度とは、検出器における全ての検出器要素にわたって合計または積分された、全光強度である。全光強度は、源、位置、および輝度を決定するために使用される、あてはめモデルに対するさらなる制約条件として使用され得る。
【００４８】
（絶対的な較正光強度） 図８Ｂに関して上で議論されたように、絶対的な光強度フラックスを使用して、発光源からの全フラックスを測定し得る。この源が、各々が平均細胞フラックスφｃを発光する細胞から構成されると仮定すると、この源を構成している発光細胞の総数が決定され得る。次に、この決定を使用して、組織源についての既知または推定の細胞質量比に基づいて、源の総質量または総体積を精密化し得る。
【００４９】
（スペクトルデータ） スペクトルデータとは、特定の波長範囲（例えば、上に記載された、青色光、緑色光、および赤色光の波長範囲）において収集された、光強度データである。光は、被験体の組織、および特に、被験体組織におけるヘモグロビンによって、短波長において優先的に吸収されるので、異なる波長の光の相対強度は、源の深さに関する情報を提供し得、そして精密化された波長依存性空間プロフィールを、波長依存性の組織散乱係数および吸収係数に基づいて生じるために、使用され得る。
【００５０】
図４Ａおよび４Ｂは、異なる波長または波長範囲において身体領域の組織を通って移動する光に対して距離または深さが有する差の効果を示す。このグラフは、ｙ軸上に増加する光強度を示し、そしてｘ軸上に増加する波長を示す。図４Ａにおける実線は、発光源についてのインビトロでの発光スペクトルを表し、これは、約４９５ｎｍを中心とする幅広の単一のピークを含む、深さゼロの発光スペクトルに相関する。広い破線は、約１ｍｍの組織（インビボ）を通過した後の、発光源の発光スペクトルを表す。約６００ｎｍにおいて、この１ｍｍの深さの発光スペクトルは、小さなピークを生じる。なぜなら、一旦、約４９５ｎｍの大きなピークの相対強度が減少し始めるからである。中位の破線は、約２ｍｍの組織（インビボ）を通過した後の、発光源の発光スペクトルを表す。４９５ｎｍのピークは、強度がより小さくなるが、一方で６００ｎｍのピークは増加し、そしてより明らかになる。最後に、点線は、約４ｍｍの組織（インビボ）を通過した後の、発光源の発光スペクトルを表し、ここで、４９５ｎｍのピークは、さらに減少している。
【００５１】
図４Ｂは、組織深さゼロの発光スペクトルに縮尺を合わせた、組織の４ｍｍの深さにおける発光スペクトルを表す。６００ｎｍのピークは、一旦突出した４９５ｎｍのピークより突出する。この例において、発光源の深さに関する情報を提供するものは、４９５ｎｍのピークに対する６００ｎｍのピークの比である。
【００５２】
本発明の好ましい方法は、自己縮尺計算を使用し、その結果、発光源の深さが、その全体の強度とは無関係に決定され得る。この目的を達成するために、２つ以上の波長範囲の比を利用する関数が数式化され、ここで、各範囲の波長は、身体領域の表面からの標的の深さの関数として異なる割合で、その身体領域において組織を通過する。
【００５３】
（身体を通しての透過率） 身体を通しての透過率は、被験体に対して選択された位置または被験体の内部に、既知の強度の光源を配置すること、およびこの被験体を通って透過した光強度を、複数の表面において測定することによって測定される。この透過率は、異なる組織の散乱係数および吸収係数の、強いスペクトル依存性に起因して、強いスペクトル成分を有する（以下を参照のこと）。代表的に、透過率の値は、モデル被験体を使用して、種々の選択された位置で、そして多数のスペクトル範囲の各々で、全透過率を測定することによって、予め決定される。
【００５４】
図５は、複数の身体領域（番号１〜１６によって示される）を有する被験体の上面図である。この例において、この被験体は、固定されたマウスであり、そして各身体領域は、目的の予め決定された領域に対応する。本発明の方法の実施による深さの決定の前に、この被験体は必要に応じて、各身体領域についての光学特性のデータファイルを作成するために、分析される。この例において、各身体領域は、スペクトル光源とスペクトル検出器との間に配置される。光透過スペクトルが、各身体領域について得られる。その結果は、各身体領域を分光計キュベットに入れ、そして各領域を異なる波長および波長範囲で測定して、光がどのように身体の異なる領域およびこのような領域における組織を透過するかのデータファイルを作成することと類似である。図１のデバイスを使用して、特定の波長範囲について類似のデータを作成し得、但し、このデバイスは、検出器に対して、被検体を試験される各身体領域を透過して照射するように適合される。従って、図１のデバイスは、本質的に、動物全体の分光計となる。
【００５５】
図６Ａおよび６Ｂは、すぐ上に記載されたスペクトル分析から収集された、実験的スペクトルデータを示す。以下にさらに詳細に記載されるように、このデータは、スペクトル全体または各スペクトルにおける特定の範囲のいずれかとして、検出された強度情報との比較のため、または標的深さを計算するための関数を展開するための、データファイルを作成するために使用され得る。
【００５６】
より詳細なアプローチにおいて、この装置は、被験体全体またはその一部を走査するための、全身スキャナを提供し、これは、被検体の身体を走査するための、走査用２色レーザーをさらに備える。このスキャナは、少なくとも２色のアークレーザー光を、同時にかまたは連続的に通って移動する。このレーザー光が上向きに光を発する場合、この光は、回転チューブ内に入れられた被験体の身体を貫通する。このレーザー光源に対向して配置された検出器は、この検出器がそのアーク経路を通って移動するにつれて、レーザー光を受容し、そして測定するように適合される。
【００５７】
（組織の光学的特性） 光子拡散モデル化において使用される被験体組織の、２つの重要な光学特性が存在する。第１のものは、組織の吸収係数μａであり、これは、単位光路長あたりに吸収される入射光の一部に関係する。図７Ａおよび７Ｂ（これらは、可視スペクトルにわたって、種々の組織型についての吸収係数をプロットする）に見られるように、吸収係数は、その組織の性質および光の波長に非常に依存し、各組織が、５００〜６００ｎｍの範囲のピーク吸収を示す。約６００ｎｍより上での比較的低い吸収係数は、図１３Ａに見られるスペクトルデータ、ならびに図６Ａおよび６Ｂに示される全透過率データと整合する。
【００５８】
第２の重要な光学特性は、組織の減少した散乱係数μ’ｓであり、これは、大きな角度の光散乱に起因する、単位長さあたりの光の貫通の強度の部分的な低下である。図７Ｃおよび７Ｄ（これらは、可視スペクトルにわたる同じ組織に対する減少した散乱係数をプロットする）に見られるように、散乱効果は、異なる組織において相対的に異なり得る。一般に、減少した散乱係数は、より長波長において、いくらか減少する。
【００５９】
二重積分球（ＤＩＳ）システムは、組織または任意の混濁媒体の光学特性を測定するために広範に使用される道具である。なぜなら、このシステムは、好都合に、拡散反射率Ｒｄおよび拡散透過率Ｔｄを同時に測定するからである。図６Ｃは、光学特性（例えば、吸収係数μａ、および減少した散乱係数μ’ｓ）を得る目的でこれらの値を測定するために使用される、二重成分球装置７４を示す（Ｐｒａｈｌ，Ｓ．Ａ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３２：５５９−５６８（１９９３）；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３２：３９９−４１０（１９９３））。サンプル７６は、２つの積分球７８と８０との間に配置され、ここで内部バッフル８２が、反射光または透過光を直接測定することを防止するために、配置される。これらの球は、高度に反射性の材料でコーティングされて、光の吸収を最小にする。光は、検出器８４で検出され、そして好ましくは、コンピュータ８６を使用して分析される。４００〜１０００ｎｍの間でのサンプル照射が、光ファイバーケーブル９０およびレンズ９２を介してモノクロメータ８８に接続されたアーク灯を使用して、達成される。
【００６０】
拡散反射率Ｒｄ値および拡散透過率Ｔｄ値から、吸収係数および減少した散乱係数が、逆加算−倍化（ｉｎｖｅｒｓｅ ａｄｄｉｎｇ−ｄｏｕｂｌｉｎｇ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｏｍｌｃ．ｏｇｉ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉａｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して得られる。このプログラムは、ワンスピード放射伝播式（ｏｎｅ ｓｐｅｅｄ ｒａｄｉａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｑｕａｔｉｏｎ）の１つの数値の解であり、この式は、散乱媒体中での定常状態での光伝播を説明する（Ｐｒａｈｌ，Ｓ．Ａ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３２：５５９−５６８（１９９３））。このプログラムは、反復プロセスであり、これは、算出された反射率および透過率が測定値に整合するまで、光学パラメータのセットから反射率および透過率を測定する。
【００６１】
ＤＩＳシステムの特徴は、組織が測定の前に抽出される必要があるという事実である。従って、組織の生存性を測定条件下で維持することが望ましい。特に、ヘモグロビンおよび水の吸収が高い波長においては、ヘモグロビンの血管排出および組織の水和が、考慮される必要がある。上述のことを部分的に考慮して、組織光学特性を測定する好ましい方法は、以下のような、非侵襲性のインビボ測定である。
【００６２】
Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ（Ｂｅｖｉａｌｃｑｕａ，Ｆ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３８：４９３９−４９５０（１９９９））によって記載されるものと類似の円形のファイバープローブを使用して、光学特性を、非侵襲的に、または最小の侵襲で、インビボで測定し得る。図６Ｄは、円形ファイバープローブ９４の実験設定を示す。ファイバープローブ９４は、照射源９５、少なくとも１つの照射ファイバー９６、およびいくつかの（例えば、６つの）検出ファイバー９７を、一般に１〜２ｍｍの距離以内に備える。次いで、このプローブは、目的の組織９９に、好ましくは、最小の接触圧で、垂直に配置される。検出ファイバー９７の出力は、対応する検出器９８のセットに供給される。光学特性は、源からの半径方向距離に対する強度から、空間的に解析される。源から検出器への小さな分離においては、単純な分析モデル（例えば、拡散近似）は、このシステムを説明するために十分に適切ではなく、従って、Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ法が、代表的に、データを分析するために使用される。
【００６３】
（ＩＶ．光子伝播モデル）
この節は、身体の表面における、この表面の下の光源からの光子の放射、および混濁媒体を通る移動をシミュレートするための、光子伝播モデルを考慮する。特に、以下に基づいて、シミュレートされた光強度空間プロフィールを作成することが望ましい：（ｉ）発光源の深さ、（ｉｉ）発光源のサイズ、ならびに（ｉｉｉ）光吸収係数および光散乱係数。光吸収係数および光散乱係数は、波長と、その光子が通って拡散する組織の性質との両方に依存するので、このモデルは、その組織の性質および選択された波長における空間プロフィールを、特に考慮するように精密化され得る。
【００６４】
本明細書中において使用される光子拡散モデルは、初期光強度空間プロフィール（これから、節Ｖにおいて考慮されるように、最初の源の深さおよび源のサイズの情報が作成され得る）の作成の目的で、単純化するための多数の仮定を行う。次いで、このモデルは、さらなる組織依存性および／または波長依存性の情報を考慮することによって拡張され、測定された空間プロフィールとの曲線のあてはめを改善する目的で、空間プロフィールを精密化し得る。あるいは、最初の深さおよびサイズの情報は、他の型の曲線またはデータの整合によって、精密化され得る。最初の深さ／サイズの近似を精密化するための両方のアプローチは、以下の節Ｖにおいて考慮される。
【００６５】
図９Ａは、細胞（例えば、細胞小器官１１３を含む細胞１１１）から形成される混濁組織を通って拡散する場合の、光子の経路を示す。見られるように、細胞のサイズ（代表的に、２０〜３０ミクロンのサイズの範囲）は、光の波長λ（これは、約０．４ミクロンと０．６ミクロンとの間である）に対して大きい。散乱は、膜における段階的な不連続性（＜＜λ）に起因し、そして長さの逆数である散乱係数μｓ（約１０〜２０ｍｍ−１）によって特徴付けられる。散乱の異方性ｇは、約０．９であり、これは、減少した散乱係数μ’ｓ＝μｓ（１−ｇ）、すなわち約２ｍｍ−１を与える。吸収係数μａ（λ）は、０．０１ｍｍ−１と１ｍｍ−１との間であり、そして上で示されたように、強い波長依存性を有する。吸収係数および散乱係数は、波長依存性であるが、λ＞約６００ｎｍにおいては、組織において、μａ＜＜μ’ａであることが、一般に真実である。
【００６６】
身体内の標的部位から、身体表面に隣接して位置する光検出器への光の伝播の、定量的な説明は、適切な境界条件を有する光の放射伝播拡散方程式の解によって達成され得る（例えば、Ｒ．Ｃ．Ｈａｓｋｅｌら；「Ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｄｉａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｊ．Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｏｃ Ａｍ．，１１Ａ：２７２７（１９９４））。例えば、１つのアプローチは、図９Ｂに概略的に示される外插された境界条件を使用し、ここで、光学流束量は、距離ｚｂにおける物理的境界から消失する平坦な表面において消失し、これは、この物理的境界における光のフレネル反射を考慮する。
【００６７】
第一近似として、発光源が位置する身体は、半無限の均一な混濁媒体として表現され、これは、散乱と吸収との両方を行う。この近似は、図９Ｂに示され、この図は、平板１１６中の点発光源１１４を、平板表面の下の距離ｄに示す。この拡散方程式は、以下：
Ｄ∇２φ（ｒ）＝μａφ（ｒ）−Ｓ（ｒ） （１）
であり、そして フィックの法則は、以下：
ｊ（ｒ）＝−Ｄ∇φ（ｒ） （２）
であり、ここで、φは、等方性の流束量（ワット／ｍ２）であり、ｊは、小さい指向性流束（ワット／ｍ２）であり、Ｓは、出力密度（ワット／ｍ３）であり、ｒは、半径であり、そして
【００６８】
【数１】
である。点源Ｐ（ワット）についてのグリーン関数の解は、以下：
【００６９】
【数２】
外插された境界条件を使用する平板構造における拡散方程式の解は、源１１４からの寄与に画像表面１１８（図９Ｂに示されるような）を合計して、深さｄにおける点源Ｐ（ワット）についてその表面におけるラジアンス（その表面に対して垂直に見る）について以下の式を得ることによって、得られる：
【００７０】
【数３】
であり、そしてＲｅｆｆは、有効反射係数であり、これは、組織に対して約０．４３である。
【００７１】
表面ラジアンスをρの関数としてプロットすることによって、図１０Ｂに実線で示されるプロットが得られ、これは、図３Ｂに点線で示される、光強度プロフィールプロットと同じ導関数を有する。
【００７２】
混濁媒体における発光点についての空間プロフィール曲線もまた、さらにずっと計算に強いＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションを使用して算出し、これは、図１０Ａに示されるように、酔歩を通して各光子を辿る。このＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーション（図１０Ｂにおいて「＋」の記号で示される）は、拡散方程式から算出された空間プロフィールに綿密に適合する。
【００７３】
拡散方程式をどのように使用して、種々の組織および種々の深さを通しての光子拡散をモデル化するかを示すために、空間プロフィールを、種々のμｅｆｆの値について（それぞれ２．０ｃｍ−１および２０ｃｍ−１のμａ値およびμ’ｓ値に対応する、μｅｆｆ＝１１ｃｍ−１について、それぞれ０．４ｃｍ−１および１０ｃｍ−１に対応する、μｅｆｆ＝３．５ｃｍ−１について、ならびにそれぞれ０．０５ｃｍ−１および５ｃｍ−１に対応する、μｅｆｆ＝０．８７ｃｍ−１について）、算出した。μａについてのこれらの３つの値は、青色波長、緑色波長、および赤色波長に対する組織吸収におよそ対応する。
【００７４】
図１１Ａおよび１１Ｂにおけるプロットは、深さが増加すると共に強度が減少し、そしてスポット幅が増加すること、および大きい値のμｅｆｆは、より狭いスポット幅のピーク強度の大きな減衰を生じることを示す。
【００７５】
（Ｖ．深さおよびサイズの情報の決定）
本発明の方法を実施する際に、被験体は、最初、上に詳述されたように、標的の源において、発光分子を局在化するために処理される。次いで、この被験体は、装置２０（被験体のサイズに対して適切に縮尺を決められている）の遮光チャンバ内の選択された位置に配置され、そして光学システムが、発光源と検出オプティクスとの間の、被験体の表面領域における源からの発光事象を測定するように調節される。被験体を選択された光学的関係で固定した状態で、表面発光の光強度の空間プロフィールが得られ、これもまた上記のとおりである。図３Ａは、表面下の光源から測定された光強度の表面マップであり、これを引き続いて使用して、図３Ｂに示される空間プロフィールを作成した。
【００７６】
次いで、空間プロフィールを、パラメータに基づく生体光子関数（これは、発光強度を発光源の深さ（およびいくつかの場合に、源のサイズ）に関係付ける）にあてはめ、源の深さ（およびいくつかの場合に、源のサイズ）を最初に決定する。１つの好ましい生体光子関数は、上記ＩＶ節において議論された、単純化拡散モデルから導出される関数であり、ここで、点源または規定された球状もしくは楕円体状の体積を有する源からの光強度は、源の深さ、一定の散乱係数および吸収係数、ならびに源からの表面距離ｒの関数として、算出される。従来の非線形最小二乗曲線あてはめ技術（例えば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（「Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ ｉｎ Ｃ」Ｐｒｅｓｓら編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９））は、曲線のあてはめに適切である。曲線のあてはめは、図３に示されるような単一の一次元（「１−Ｄ」）プロフィール、複数のこのようなプロフィール、または２−Ｄ全空間分布（例えば、図１２Ａに示されるような）を使用してなされ得る。図３Ｂに示されるデータに対する曲線のあてはめの算出（破線）は、２．７ｍｍの深さを示し、これは、２．２ｍｍの推定された実際の深さに十分に匹敵する。
【００７７】
図１２Ａ〜１２Ｃは、深さおよびサイズの情報がどのように空間プロフィールから決定され得るかの別の例を与える。ここで、発光源は、それぞれ２．７ｍｍおよび３．２ｍｍの、水平方向および垂直方向の実際の寸法、および１．５ｍｍの腫瘍の厚さを有する、皮下の楕円状腫瘍である。水平プロフィールおよび垂直プロフィール（それぞれ図１２Ｂおよび１２Ｃ）を、それぞれ１．３ｍｍおよび２．４ｍｍの水平寸法および垂直寸法、１．５ｍｍの厚さ、ならびに０．４ｍｍの深さを有する楕円発光源に対して作成された曲線にあてはめた。
【００７８】
源の深さ（および必要に応じて、源のサイズ）の、最初の曲線の当てはめからの決定は、さらなるデータ（その効果は、生体光子関数のパラメータを精密化することである）を使用することによって、精密化され得、そして源のサイズが近似され得る。さらなるデータの性質、および生体光子関数のパラメータ（例えば、深さおよびサイズ）を精密化して、精密化された深さおよび源のサイズの情報を与える様式を、ここで、上記節ＩＩにおいて、図２に関して概説した情報の型の各々について、考慮する。
【００７９】
（Ａ．第２の投射の情報） 第２の投射のデータを得るために、被験体は、発光源を別の視点から見るために、投射および検出オプティクスに対して回転される。この第２の視点から、第２の光強度プロフィールが得られ、第２の被験体表面領域に対する第２の深さが決定される。２つの異なる表面位置において、源の深さの共通部分を決定することによって、より正確な深さおよび／または源のサイズが決定され得る。多くの視点が得られるほど、より正確な深さおよび源のサイズが決定され得る。
【００８０】
（Ｂ．スペクトルデータ） 身体領域における標的の深さが、以下によって決定され得るか、または標的の深さが精密化され得る：（ｉ）標的を、２つ以上の波長領域において発光させること、および（ｉｉ）各波長範囲の光が、深さの関数として、他の波長範囲の光とは異なって、身体領域を透過することを仮定して、身体領域の表面において、身体領域を透過する各範囲の光の差異を比較すること。
【００８１】
源の深さの関数としての、代表的なスペクトル曲線（示される波長における全光強度に関する）が、上で議論された図４Ａに示される。図４Ｂ（ここで、ピークは、インビトロでのスペクトル曲線に縮尺を合わせられている）に特に見られるように、約６００ｎｍ（例えば、６２０ｎｍ）におけるピークの高さの、インビトロ（ゼロ深さ）でのピーク高さ（例えば、約５００ｎｍ）に対する比は、深さの関数として劇的に増加する。従って、スペクトル曲線を作成し、そしてピーク高さの比を（代表的に、６００ｎｍより長波長および短波長、例えば、６２０ｎｍ：５００ｎｍ））決定することによって、混濁組織における強度の、波長依存性の損失に基づく、正確な深さ情報が決定され得る。
【００８２】
スペクトル測定からの近似深さを決定するために有用な式は、式４から、以下のように導出され得る：
【００８３】
【数４】
ここで、ｄは、深さを表し、φは、測定された光強度を表し、μｅｆｆは、実験的に決定された有効減衰係数を表し、そしてＤは、実験的に決定された拡散係数である。上記式における下付き文字１および２は、測定がなされた２つの別の波長を表す。
【００８４】
上記式を使用して、深さが、異なる波長または波長範囲における２つ以上の光強度の測定から決定され得る。１つの実施形態において、深さは、以下の一連の工程を実行することによって、得られ得る：（１）インビトロおよびインビボ（動物中）で、２つの波長で、生物発光細胞を画像化する；（２）例えば、ピーク強度または平均（積分）強度を各画像について測定することによって、画像を定量する；（３）各波長において、インビトロの画像データに対するインビボの画像データの比を算出する；ならびに（４）式７、および例えば組織特性測定から得られた有効散乱係数μｅｆｆを使用して深さを算出する。このアプローチの適用は、実施例１に説明される。
【００８５】
１つの実施形態において、各μｅｆｆについて有意に異なる値を有することが好ましい。動物組織は、ヘモグロビン（これは、大きい吸収ピークを６００ｎｍのすぐ下に、そして比較的低い吸収を６００ｎｍの上に有する）の存在に大きく起因して、μｅｆｆにこのような差異を提供する。
【００８６】
あるいは、さらなるスペクトルデータは、１つ以上の選択された波長または波長範囲において得られる、１つ以上の空間プロフィールを含み得る。次いで、このプロフィールは、図３Ｂに関して上に記載されるように、例えば、上記光子拡散モデルから、波長特異的な値（吸収係数、散乱係数、および／または有効な係数について）を使用して作成される、モデル強度関数と比較される。
【００８７】
なお別の適用において、強度値は、２０ｎｍごとに間隔を空けた不連続な波長で測定され得る。図１３Ａにおけるスペクトルプロットは、ＰＢＳ溶液中の細胞における緑色ルシフェラーゼ、ならびに図１３Ｂに示される部位で皮下に、および図１３Ｃに示される肺に局在した、緑色ルシフェラーゼについてのスペクトル曲線を示す。全ての曲線は、７００ｎｍにおける１の値に対して標準化されている。５６０ｎｍ対６２０ｎｍの強度比は、深さの指標である。
【００８８】
上記のように、本発明の関連する局面は、被験体における発光源の深さを決定する方法を提供する。この方法を実施する際に、被験体からの発光強度は、約４００ｎｍと約１０００ｎｍの間の２つ以上の異なる波長においてである。発光源の深さは、測定された発光強度、および被験体の光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）を使用して、決定される。
【００８９】
光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）は、その被験体の物質と同じかまたは類似の物質の係数を直接測定することによって、得られ得る。この情報は、インビトロ（ゼロ深さ）およびインビボ（決定されるべき深さ）で、２つの波長で測定された強度と組み合わせて、式７に適用され、上記および実施例１に記載されるように、光源の深さを決定し得る。
【００９０】
あるいは、光学特性情報は、被験体の組織または材料に対応する組織または材料における、２つ以上の複数の深さの各々に位置する発光源からの光強度を、２つの以上の異なる波長で決定することによって、間接的に得られ得る。次いで、所望の深さの決定が、測定された光強度（例えば、異なる波長における強度比）を、複数の深さの各々において決定された光強度と適合させることによって、なされる。より特定のアプローチにおいて、発光源からの光強度の空間プロフィールは、複数の深さの各々における発光源からの光強度の複数の空間プロフィールの各々と比較（適合）され得る。
【００９１】
（Ｃ．身体を通しての透過率のデータ） 身体を通しての透過率のデータは、上記のように得られ、そして小動物被験体について、図５、６Ａおよび６Ｂに示される。上記のように、この情報は、既知の厚さの選択された組織を通る、波長依存性の光透過値を提供する。被験体における多数の選択された位置からの、予め決定された透過率データを使用して、異なる被験体位置での全身の平均散乱係数および吸収係数を、推定し得る。この目的は、可視スペクトル全体にわたってか、または選択された波長においてかのいずれかで、測定された空間プロフィールに対する曲線のあてはめのために使用される、モデル化された空間プロフィールを精密化することである。
【００９２】
（Ｄ．組織特性データ）組織特性データ（例えば、図７Ａ〜７Ｄに示されるもの）は、代表的に、大部分の身体組織の各々についての、波長依存性の吸収係数および散乱係数を含む。このデータは、例えば、上記光子拡散のモデルにおいて、所定の組織を透過する、所定の波長（代表的に、赤色波長）の光によって生じる空間プロフィールを精密化するために使用される。従って、例えば、被験体における発光源が筋肉であり、そして空間プロフィールが赤色波長で測定される場合、組織特異的かつ波長特異的な吸収係数を用いて作成される、精密化された空間プロフィールは、測定された曲線との曲線のあてはめのために、精密化された空間プロフィール曲線を提供する。
【００９３】
（Ｅ．シミュレーションデータ） 別の実施形態において、試験点または他の既知の形状の発光源は、混濁組織を模倣するブロックまたは平板に導入され得る。このブロックは、種々の散乱係数および拡散係数で、ならびに種々の形状で調製されて、被験体における発光源の条件をシミュレートし得る。試験点の配置の際に、空間プロフィールが、この試験点が配置された身体領域の外側表面からとられ得る。次いで、このデータは、試験点の実際の深さおよび位置に相関付けられる。この試験点をブロック内の点から点へと移動させることによって、一連の空間測定がなされ得る。この一連の空間測定から、被験体における異なる領域の空間応答をモデル化するためのデータファイルが組み立てられ得る。
【００９４】
（Ｆ．積分された光強度）
合計または積分された光強度とは、上記のように、検出器アレイの規定された領域全体またはいくらかにわたって合計された光強度をいう。積分光強度は、式５の積分と比較されて、源の深さおよび輝度のなお別の評価を提供し得る。この情報は、プロフィール情報と組み合わせて提供され得る。積分光強度もまた、複数の波長について算出され得る。
【００９５】
（Ｇ．較正された強度データ） 較正された強度データの非存在下では、強度測定は、カメラごとに変動し得、そして測定値は、投射、輝度、時刻およびＦストップのような変数に依存する。
【００９６】
絶対的な較正光強度（上記節ＩＩＩ）は、上記節ＩＩＩにおいて議論されるように、真のピーク値に対する曲線のあてはめに基づいた源の深さの決定を精密化すること、および組織における生物発光細胞の数を推定することを可能にする。
【００９７】
なお他の実施形態において、本発明は、強度および空間的分布データを用いて、他の画像化データの積分を提供し、被験体およびその中の標的位置のより詳細な三次元マップを作成する。例えば、集められた差次的光透過データ（例えば、上で開示されたもの）は、他の三次元画像化システム（例えば、三次元の計数化された「画像」または座標系を形成する、ＭＲＩ画像の積み重ねられたスライス）から誘導された座標系と組み合わせられ得る。次いで、このような座標系を使用して、標的が同定される被験体の解剖学的構造をより良好に示し得る。被験体が実験室動物（例えば、ラット）である場合、このような動物は、所定の系統について、１匹の動物から次の動物へと、構造が高度に均一である。その結果、座標データ、スペクトルデータ、および空間強度パターンファイルは、市場の販売者によって作成され得、そして図１に示されるような単純化された検出ユニットと共に使用するために、販売され得る。モデル三次元情報がデータファイルとして供給される場合、ユーザのユニットは、三次元の走査およびマッピングのために装備される必要がない。上に開示された方法および装置において考慮された、二次元の画像を、販売者によって提供される三次元データファイルと組み合わせて、被験体における標的のサイズ、形状、深さ、位相、および位置についての完全な三次元情報を得ることができる。
【００９８】
以下の実施例は、例示的であり、本発明を限定するようにはいかなる様式でも意図されない。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
（２波長空間画像を使用する、発光物体の深さの算出）
図１３Ａに示される空間情報を使用して、細胞の皮下注射を受けた動物（図１３Ｂ）および肺に標識細胞を有する動物（図１３Ｃ）におけるルシフェラーゼ標識細胞の深さを算出した。この分析を、以下の工程を使用して、６００ｎｍおよび６４０ｎｍに等しい波長でのデータを使用して実施した：（ｉ）生物発光細胞を、インビトロおよびインビボで、６００ｎｍおよび６４０ｎｍで画像化した；（ｉｉ）これらの画像を、各画像についての平均強度の測定によって定量した；（ｉｉｉ）インビトロの画像データに対するインビボの画像データの比を、各波長において決定した；そして（ｉｖ）式７を使用して深さを算出し、そして図７における平均有効散乱係数μｅｆｆを、吸収係数および散乱係数から推定した。
【０１００】
皮下の細胞については、インビボ対インビトロの強度比（相対強度、すなわちφ）は、６００ｎｍおよび６４０ｎｍにおいて、それぞれ０．３５および０．７５である。肺のシグナルについては、これらの同じ比は、０．０５および０．４７である。６００ｎｍにおいてμａ＝０．２５ｍｍ−１およびμｓ’＝１．０ｍｍ−１、ならびに６４０ｎｍにおいてμａ＝０．０５ｍｍ−１およびμｓ’＝１．０ｍｍ−１を使用すると、６００ｎｍにおいてμｅｆｆ＝０．９７ｍｍ−１、および６４０ｎｍにおいて０．４ｍｍ−１が得られる。拡散係数Ｄの値は、６００ｎｍおよび６４０ｎｍにおいて、それぞれ０．２７ｍｍおよび０．３２ｍｍである。これらの数値を式７（以下に再現する）：
【０１０１】
【数５】
（この場合、下付き文字１は、６００ｎｍを表し、そして下付き文字２は、６４０ｎｍを表す）に代入すると、皮下および肺の深さについてそれぞれ、ｄ＝１．６ｍｍおよびｄ＝４．０ｍｍが得られる。
【０１０２】
本発明を、特定の実施形態および適用に関して記載したが、種々の変化および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】図１Ａは、被験体中の発光源の位置およびサイズを調査する際に使用するための、本発明に従って構築される装置の断面図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａにおける装置の特徴を、概略形態で例示する。
【図２】図２は、本発明の方法の実施における、この装置によって実施され得る一般的な工程のフローチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、動物被験体中の発光源からの表面光強度画像である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの動物被験体からの光放射プロフィールであり、測定された放射プロフィール（実線）と、拡散モデルから算出された光放射プロフィールとの間の曲線の一致を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、示されるように、マウス大腿中の種々の深さにおけるインビトロ（実線）およびインビボ（破線）の、細菌ルシフェラーゼの発光スペクトルのプロットであり、ここで図４におけるプロットは、６００〜７００ｎｍの間の領域におけるインビボのピーク強度を示すために拡大されている。
【図５】図５は、透過スペクトルが得られた動物中の種々の位置を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、図５に示される種々の動物位置における生きた実験用動物を通る透過スペクトルを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図５に示される種々の動物位置における生きた実験用動物を通る透過スペクトルを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、サンプル（例えば、組織）の光学特性を測定するために有用な二重積分球型装置を例示する。
【図６Ｄ】図６Ｄは、インビボにおける組織の光学特性を測定するために有用な、放射状ファイバープローブの実験的設置を例示する。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、吸収係数のプロットである。図７Ｃおよび７Ｄは、波長の関数としての、種々の組織の等方的または減少した散乱係数のプロットである。
【図８Ａ】図８Ａは、絶対的較正の決定のために使用される装置の要素を例示する。
【図８Ｂ】図８Ｂは絶対的較正が、動物被験体から細胞数を決定することをどのようにして可能にするかを例示する。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、光子が組織を通ってどのように拡散するか（９Ａ）、およびこの組織の表面に拡散する光子が、本発明においてどのように捕獲されるか（９Ｂ）を例示する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、混濁組織を通る「酔歩」にわたる光子を追跡するＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、４ｍｍの深さにおける光源についての、拡散モデルから算出した予測光強度空間プロフィール（実線）、およびＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションを用いて算出した光強度空間プロフィール（「＋」記号）を例示する。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、拡散モデルから算出したプロットであり、発光源の深さの関数として、ピーク強度（１１Ａ）およびスポット幅（ＦＷＨＭ）（１０Ｂ）を示す。
【図１２】図１２Ａは、被験体中の発光源からの表面光強度画像であり、光強度プロフィールが測定された水平プロフィール線および垂直プロフィール線を示す。図１２Ｂおよび１２Ｃは、図１２Ａに示される水平プロフィール線および垂直プロフィール線に沿って測定される光強度プロフィールである。
【図１３】図１３Ａは、インビトロで取得されるルシフェラーゼ発光源のスペクトル画像プロット（実線）、図１３に示される皮下部位から取得されるルシフェラーゼ発光源のスペクトル画像プロット（四角）、および図１３Ｃに示される肺部位から取得されるルシフェラーゼ発光源のスペクトル画像プロット（菱形）を示す。図１３Ｂおよび１３Ｃは、皮下発光源を有する動物からの表面光強度画像（図１３Ｂ）、および肺中に発光源を有する動物からの表面光強度画像（図１３Ｃ）である。
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、非侵襲性医学的画像化、医学的研究、病理学、ならびに薬物の発見および開発の分野のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
種々の医学的診断および治療設定において、ならびに生体医学的研究において、被験体の身体領域内の表面下標的または領域を画像化することは望ましい。例えば、固形腫瘍の一部もしくは全て、心筋虚血の領域、被験体に投与された治療化合物の分布、または疾患の進行を非侵襲的に位置決定し、画像化することは、有用な研究または診断情報を提供し得る。理想的には、画像化方法は、身体領域内の目的の標的を位置決定し得、その身体領域の表面の下にあるその標的の形状、サイズ、細胞数、および深さについての情報を提供し得る。しかし、これまでは、表面下の身体標的画像化のために使用され、そして／または提唱されてきた方法は、一般に、Ｘ線のような電離放射線、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のような高価かつ大きくて扱いにくい機器、または超音波を使用する方法に制限されてきた。
【０００３】
Ｘ線は、優れた組織透過性を有し、コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）またはコンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）とともに使用される場合には、優れた画質を提供し得る。しかし、Ｘ線への曝露は、そのような曝露が長期化される場合には、潜在的に有害であるので、Ｘ線は、疾患の進行をモニタリングする際の使用を制限してきた。Ｘ線は、身体領域内の標的に位置した組成物を位置決定および画像化するために使用され得るが、常に、Ｘ線照射と関連した潜在的な有害性に曝されてはいる。しかし、Ｘ線は、インビボでの遺伝子産物の発現を画像化し、このような遺伝子産物を発現する標的の深さおよび／または形状を決定するためには、容易に使用することができない。
【０００４】
ＭＲＩはまた、被験体の身体領域における標的、領域および構造を画像化するための優れた方法である。ＭＲＩは、電離照射と関連するもののような有害な属性を有するとは考えられていないが、ＭＲＩの使用のために必要な、その高価かつ大きく扱いにくい機器の大きさにより、多くの応用または状況が実際的なものではなくなっている。ＭＲＩは、被験体の身体領域以内の標的についての二次元情報および三次元情報を提供し得るが、標的と関連した生理学的活性を画像化する際にはあまり有効でない。
【０００５】
超音波または超音波検査法は、ヒト身体内の構造の画像を生成するための高周波数音波（超音波）の使用である。超音波は、ヒトが聞き取れる音の範囲を超えた音波である。超音波は、圧電性結晶の電気刺激により発生され、このような波は、特定の身体領域にねらいをつけられ得る。波が身体領域内の身体組織を通って進むにつれて、波は、例えば、身体の２つの異なる器官の間の境界のように、組織密度が変化する任意の地点で反射される。超音波は、照射も放射活性物質も使用しないという利点を提供し、ＭＲＩほど、高価でもなく、大きく扱いにくい機器も使用しないが、下にある組織および構造の密度の違いを認識することにのみ制限される。従って、超音波は、感染により標的組織の密度に認識可能な変化が生じなければ、このような感染の進行を効率的に追跡しかつモニターすることはできない。超音波は、組織または器官の生理学的機能を画像化することも検出することもできない。
【０００６】
これまで、陽子射出断層撮影法すなわちＰ．Ｅ．Ｔ．は、器官または組織の機能の画像を生成するので、画像化技術の中では、独特であった。他の画像化技術（例えば、Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩおよび超音波撮影）は、器官または組織の解剖学的構造を示すが、器官または組織内の生理学的活性を認識することはできない。器官の特定の生化学的活性を画像化するために、放射活性物質（放射性トレーサーまたは放射性医薬品といわれる）が身体内に注入または吸入されている。このトレーサーは、通常、水または糖のような身体内に天然に存在する物質の放射性等価物である。放射活性同位体は、その原子が、異なる中性子の数を有することを除いて、身体自身の非放射活性同位体に同一である。結論として、被験体の身体は、放射活性物質が負荷され、このような物質と関連する潜在的な有害性が負荷される。Ｐ．Ｅ．Ｔ．は、トランスジェニック組織、器官、またはトランスジェニック動物に由来する非同位体発現産物を検出できない。身体の放射線源の二次元写真が、放射性同位体の使用により得られる診断技術である、シンチグラフィーはまた、構造およびそれらの機能を画像化するために使用され得る。しかし、シンチグラフィーは、被験体の身体領域における標的の深さを決定するためには適切ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
被験体の身体領域における標的の位置決めおよび画像化のための上述の技術の観点から、このような標的の深さおよび／または形状および／または細胞の数を、放射活性、放射線、または高価なかつ嵩高い機器を使用する必要なく決定するための、方法およびデバイスに対する必要性が存在する。本明細書中に開示される本発明は、これらの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、被験体における発光源の位置、サイズおよび細胞数を調査するための方法を包含する。この方法を実施する際に、（ｉ）発光源から発生し、（ｉｉ）被験体の混濁生物学的組織を通して進み、そして（ｉｉｉ）被験体の目的の第１の表面領域から発光する、光子を測定することによって構築される、第１の測定された光強度プロフィールを、光検出器デバイスを用いる第１の投射から、最初に得る。光強度プロフィールは、深さおよびサイズのような関数パラメータを予測するために、パラメータに基づく生物光学的関数に整合される。このように決定されたパラメータは、第１の測定された光強度プロフィール以外のデータを使用して精密化され、被験体における発光源のおよその深さおよび大きさを得る。さらなるデータは、被験体から測定されたデータ、モデリング分析からのデータ、または被験体の表面から放出された光子の波長に関連するデータであり得る。例えば、以下である：
この方法は、代表的に、被験体における発光源のおよその深さおよび形状を使用して、発光源の２−Ｄまたは３−Ｄの可視的表示を作成する工程、ならびにこの可視的表示を、被験体の２−Ｄまたは３−Ｄの画像に重ね合わせる工程を包含する。
【０００９】
さらなるデータは、混濁媒体における発光源からの光の拡散のコンピュータシミュレーションから得られ得る。１つの好ましいシミュレーションアプローチは、（ｉ）複数の深さの１つで位置し、かつ複数のサイズおよび形状の１つを有するグロー源から、生物学的祖組織と類似の吸収特性および散乱特性を有する混濁媒体を通る、光子拡散のモデルに基づいて、複数の理論的光強度プロフィールを作成する工程、（ｉｉ）これらの複数の理論的光強度プロフィールの各々と、第１の測定された光強度プロフィールとの間の一致の質を比較する工程、（ｉｉｉ）この第１の測定された光強度プロフィールを提供する理論的光強度プロフィールを選択する工程、ならびに（ｉｖ）(ｉｉｉ)で選択された理論的光強度プロフィールからのパラメータを使用して、被験体における源の適切な深さ、形状および輝度を得る工程、を包含する。この方法は、光子散乱モデルにおいて、光子が通過する組織に対応する１つ以上の予め決定された組織特異的光散乱係数を使用することを包含し得る。
【００１０】
別の一般的な実施形態において、さらなるデータは、約４００ｎｍと約１０００ｎｍとの間の２つ以上の異なる波長において、被験体からの光放射を測定し、これらの異なる波長において測定した相対光強度を決定し、そしてこの決定された相対光強度と、異なる波長における既知の相対シグナル強度とを、組織深さの関数として比較することによって、得られる。あるいは、光強度のスペクトルは、約４００〜１０００ｎｍの間の選択された波長範囲にわたって測定され、そしてこの測定されたスペクトルは、組織内の種々の深さに配置された発光源から測定された複数のスペクトルと比較され、この測定されたスペクトルと既知のスペクトルとを対応させることにより、発光源の深さを決定する。
【００１１】
発光源についての種々の実施形態において、この発光源は、発光部分または蛍光部分であり；この発光源は、被験体に投与され、そして選択された標的に結合するか、またはそうでなければ、測定の前に、被験体内に位置し；そしてこの発光源は、被験体の生物学的細胞または被験体に投与される生物学的細胞により発現される光発生タンパク質のような、光発生タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質など）である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、被験体中の発光源の位置およびサイズを調査する際に使用するための装置を包含する。この装置は、被験体からの光放射事象が検出され得る遮光（ｌｉｇｈｔ−ｔｉｇｈｔ）エンクロージャ、およびこのエンクロージャに付随する光学システムを備え、この光学システムは、このエンクロージャ内の第１の透視から、光子（これは、（ｉ）発光源から発生し、（ｉｉ）被験体の混濁した生物学的組織を通過し、そして（ｉｉｉ）被験体の目的の第１の表面領域から放射される）を測定することにより作成される第１の光強度を生成する際に使用するためのものである。光子検出器に作動可能に連結された計算ユニットは、（ｉ）この第１の測定された光強度プロフィールを、パラメータベースの生体光子関数と対応させ；そして（ｉｉ）この第１の測定された光強度プロフィール以外のデータを使用して、生体光子関数のパラメータを精密化して、被験体中の発光源の適切な深さおよび形状を生成するように機能する。
【００１３】
光学システムは、好ましくは、増感電荷結合素子（ＣＣＤ）または冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）、およびこのＣＣＤに光を集めるためのレンズを備える。この光学システムは、被験体の目的の複数の異なる選択された表面領域から放射される光子を検出するような様式で、構成され得る。このシステムは、選択された異なる波長範囲（例えば、６００ｎｍの上および下）内の光子を伝達するための１つ以上のフィルタを備え得る。
【００１４】
この計算ユニットは、曲線を第１の空間的プロフィールと対応させるために、種々の深さにおける種々のサイズの発光源を表すモデルの生体光子関数のデータファイルを備え得る。
【００１５】
この光学システムは、波長弁別のためのフィルタを備え、この計算ユニットは、以下（ｉ）および（ｉｉ）のパラメータ精密化操作の少なくとも１つを実施するように作動可能である：
（ｉ）異なる波長で測定した相対光強度を決定し、そしてこの決定された相対光強度と、異なる波長における既知または算出された相対シグナル強度とを、組織深さの関数として比較すること；および
（ｉｉ）測定されたスペクトルを、組織内の種々の深さに配置された発光源から測定された複数のスペクトルと比較し、そしてこの測定されたスペクトルを既知のスペクトルと対応させることによって、発光源の深さを決定すること。
【００１６】
別の実施形態において、この計算ユニットは、強度パターン画像を平均化して単一の強度値にし、さらに、特定のサイズおよび形状の発光源の関数として生成される、積分された光強度値によって、光放射源のサイズを決定するように、作動可能である。
【００１７】
この計算ユニットは、複数の深さの１つで位置し、かつ複数のサイズおよび形状の１つを有する発光源から、生物学的祖組織と類似の吸収特性および散乱特性を有する混濁媒体を通る、光子拡散のモデルに基づく、複数の理論的光強度プロフィールを含むデータベースを有し得る。ここで、この計算ユニットは、（ｉ）これらの複数の理論的光強度プロフィールの各々と、第１の測定された光強度プロフィールとの間の一致の質を比較し、（ｉｉ）この第１の測定された光強度プロフィールに対する最高の整合を提供する理論的光強度プロフィールを選択し、そして（ｉｉｉ）(ｉｉ)で選択された理論的光強度プロフィールからのパラメータを使用して、被験体における源の適切な深さ、形状および形状を得るように、作動可能である。
【００１８】
さらに、この計算ユニットは、被験体中の発光源の適切な深さおよび形状を使用して、この発光源の可視的な二次元表示または三次元表示を作成するように作動可能であり、この可視的表示を被験体の二次元画像または三次元画像に重ね合わせる。
【００１９】
別の局面において、本発明は、被験体中の発光源の深さを決定する方法を提供する。この方法の実施において、約４００ｎｍと約１０００ｎｍとの間の２つ以上の異なる波長にで、被験体からの光放射強度が、測定される。この発光源の深さは、測定された光強度および被験体の組織の光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）を使用して決定される。
【００２０】
光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）は、被験体の減衰係数および拡散係数と同じかまたは類似である材料におけるこれらの係数の直接測定によって、得られ得る。
【００２１】
あるいは、光学特性の情報は、２つ以上の異なる波長で、被験体の組織または材料に対応する組織または材料における複数の深さの各々に位置する発光源からの光強度を決定することによって、間接的に得られ得る。次いで、所望の深さの決定は、測定された光強度を、複数の深さの各々で決定された光強度と対応させることによって、行われる。
【００２２】
後者のアプローチにおいて、発光源からの光強度のスペクトルプロフィールは、複数の深さの各々における発光源からの光強度の複数のスペクトルプロフィールの各々と比較され得る。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明を、添付の図面と共に読んだ場合に、より十分に明らかとなる。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
他に明記されない限り、以下の用語は、以下のように規定される。
【００２５】
「生体光子関数」は、光子源変数（例えば、源の深さ、サイズおよび形状、光放射細胞の数、特定の組織型についての波長依存的散乱係数および吸収係数、ならびに光放射体のスペクトル特性）の形で、測定可能な光子出力（例えば、光放射プロフィール、スペクトル強度分布、または積分された光強度）を示す数学関数である。光子関数は、例えば、以下に記載されるような光子拡散モデル、Ｍｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏシミュレーション、または有限要素分析に基づき得る。
【００２６】
「混濁組織」は、光散乱特性および光吸収特性の両方を有する、被験体中の不透明な組織である。
【００２７】
「標的領域」とは、被験体中の内部表面下領域（例えば、表面下の組織または器官、固形腫瘍、または感染領域）をいい、これは，（ｉ）被験体内に位置し、（ｉｉ）混濁組織によって、被験体の表面領域から離れており、そして（ｉｉｉ）好ましくは、少なくとも１つの区別可能な特徴（例えば、組織特異的抗原または器官特異的抗原、ｍＲＮＡまたは発現タンパク質のいずれかとしての遺伝子または遺伝子産物、細胞、器官または組織の活性化、不活性化または調節から生じる産物）を有する。
【００２８】
発光源とは、標的領域における光放射の源をいう。この発光源自体は、標的組織が、特定の遺伝子がいくつかの活性化手段により発現される場合に、組換え光放射タンパク質を生成するように遺伝的に改変されている場合、可視光を放射し得る。好ましい実施形態において、異なるタイプの光発生タンパク質（例えば、生体発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）および蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｄｓＲｅｄおよびＹＦＰ））が、用いられる。例示的な発光源としては、光発生タンパク質で形質転換され、動物被験体に投与された原核生物細胞および真核生物細胞、ならびに光発生レポーター遺伝子に対してトランスジェニックにされた動物の内因部分である光発生細胞が挙げられる。
【００２９】
あるいは、この源は、蛍光分子または可視光を放射する電磁放射線によって励起され得る他の分子を含み得る。例えば、標的の光放射を引き起こすのに有効な組成物が、被験体に投与され得、そして標的位置における局在化を可能にされ、ここでこの組成物は、次いで、光を放出するか、または標的内または標的に隣接するいくつかの他の部分の光放出を引き起こす。例えば、投与される組成物は、標的内の細胞または標的に隣接する細胞を活性化し、次いで、このような細胞の光放射を引き起こす化合物であり得、従って、局在化した細胞は、被験体の身体領域内の標的である。さらに他の実施形態において、感染細胞が、被験体に投与され、そして疾患の進行および局所性が決定される。この実施形態において、標的は、被験体の身体領域内の位置を有する所定の点における細胞のクラスターである。本発明の他の実施形態において、身体領域は、複数の標的を有し得、そして被験体は、複数の身体領域を有し得、各々の領域は、標的を有する可能性がある。
【００３０】
「蛍光色素」または「蛍光団」は、励起極大でまたは励起極大付近で効率的に励起され、長波長の光を放射または蛍光を発する分子である。蛍光色素の励起極大とこの蛍光色素の発光極大との間の差異は、ストークスシフトとして知られている。所定の蛍光色素のストークスシフトが大きくなるほど、励起スペクトル、またはこの蛍光色素を励起する波長の範囲と、発光スペクトル、または蛍光性である場合の蛍光色素により放射される光の波長の範囲との間の差異が大きくなる。本発明の特定の実施形態は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣＹ７、および他の遠赤外（ｄｅｅｐ ｆａｒ ｒｅｄ）、または近赤外（ＮＩＲＦ）の蛍光色素が有するような高いストークスシフトを有する蛍光色素を用いる。特に好ましい蛍光色素は、約６００ｎｍより長い波長の光を放射する。他の好ましい蛍光色素は、６００ｎｍより短い範囲の光を放射する。特に、「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）の改変体（各々は、種々の発光スペクトルを有する）が、特に有用である。なぜなら、ルシフェラーゼと同様に、このようなタンパク質は、標的またはこの標的に隣接しているかもしくは結合している細胞によって合成され得るか、またはこのようなタンパク質は、例えば感染における場合と同様に、標的に位置しているからである。ＧＦＰは、結合体として、標的に局在する別のタンパク質または生物学的材料にさらに投与され得る。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、既知の発光条件下で、各々の発光源は、既知の発光スペクトルを有する。各々の発光スペクトルは、好ましくは、検出工程の全体にわたって一定である。特に、各々の光の波長で発光の相対強度は、全てのスペクトル強度が変化するので、発光源の発光スペクトルの範囲内の他の全ての光の波長での発光強度と比例したままである。本発明のいくつかの実施形態は、最低少なくとも２つの識別可能な範囲の発光波長を必要とする。より好ましくは、本発明の特定の実施形態は、これらの光が被験体の選択された体内の領域を伝わる場合、他の領域からこのような光が体内の領域を伝わるための距離または深さの関数として、各々の光の波長の範囲が別々に挙動することを必要とする。例えば、光の波長の第１範囲の強度は、光が伝わる体内の領域の１センチメートル毎に半分にカットされるのに対して、光の波長の第２範囲の強度は、光が伝わる体内の領域の１センチメートル毎に４分の３をカットされる。両方の波長範囲を有する光の強度は、各々の範囲が同じ強度を有する場合、１センチメートルの組織を通過後に、第１範囲で２分の１を、そして第２範囲で４分の３を減少する。組織の深さ０にて初期の１：１の強度比から得られた２：１の強度比を比較することによって、光が組織を通って１センチメートル伝わったという決定が、なされ得る。
【００３２】
本発明は、異なるルシフェラーゼ酵素のような異なる発光源を用いて実行され得る。例えば、寒天上に発現した「青色（ｂｌｕｅ）」細菌ルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来の発光は、約４８５ｎｍに中心のあるスペクトルを明らかにする分光計によって分析された。ＰＢＳ溶液中のＰＣ−３Ｍ細胞にて発現した「緑色」ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）は、約５７０ｎｍに中心のあるスペクトルを示して発光した。ＰＢＳ溶液中に懸濁したＰＣ−３Ｍ細胞にて発現した「赤色」ルシフェラーゼは、約６２０ｎｍに中心のあるスペクトルを示した。
【００３３】
（ＩＩ 装置および方法）
図１Ａは、本発明に従って、被験体における発光源の位置およびサイズを調査するのに使用され得る装置２０の断面図である。この装置は、一般的に、被験体からの発光現象が検出され得る遮光エンクロージャまたはチャンバ２２を備える。遮光ボックス２２は、共有に係るＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１６３２４７（これは、その全体において本明細書中に参考として援用される）に記載されるように構築され得る。簡単には、このチャンバは、後壁（例えば、後壁２１）および側壁によって規定され、そして前開口部（図示されてないが、これは、開けられてチャンバの内側へのアクセスを提供し得、そして閉じられて遮光シールを提供し得る）を有する。遮光ボックス２２は、小動物に対して設計されたが、この技術は、ヒトを含むより大きな哺乳動物に適用され得る。
【００３４】
ステージ２４は、チャンバ内に含まれ、このステージ２４上に被験体が配置され、そして好ましくは、発光検出の間、固定化される。本明細書中に記載される多数の実施例は、小さな哺乳動物の被験体（代表的には、マウスまたはラット）でなされなければならないが、同じ原理および方法が、チャンバサイズの適切な拡大、ならびに必要に応じて、標的領域における発光体のサイズおよび数の適切な増加を利用して、他の動物ならびにヒト被験体に適用することが理解される。示される装置におけるステージは、一般に２６で示される従来のウォームスクリュー機構によって、そして利用者の制御下で、チャンバ内の選択された垂直位置に上昇および下降されるように設計される。チャンバ内のステージ位置は、可視光シグナルを必要としない多くの公知の追跡デバイスのいずれかによって、モニターされ得る。
【００３５】
投射（ｖｉｅｗｉｎｇ）オプティクスは、２つの一般的な構成要素に備えられる。１つ目は、光検出器３２の検出スクリーン上に被験体の表面からの放出現象に焦点を合わせるために役立つレンズアセンブリ２８であり、光検出器３２は、代表的には、電荷結合デバイス（これは、内因性のノイズレベルを最小するために冷却条件で作動され得る）の光検出器ピクセルアレイである。レンズアセンブリの構築および光検出器へのレンズアセンブリの光学結合は、従来のものである。１つの好ましいＣＣＤは、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから市販のｍｏｄｅｌ ６２０ ＣＣＤである。
【００３６】
光学システムの２つ目の任意の構成要素は、多数の光学バンドパスフィルター（選択された範囲の可視光波長以外、全ての光透過を遮断するように設計される）を備える波長フィルターホイール３０である。１つの標準的な設定としては、以下の３つのフィルタが挙げられる；５１０ｎｍ未満の波長用のショートパスフィルター３０ａ（青色光フィルタ）、５００〜５７０ｎｍの範囲内のバンドパス用のミッドパスフィルター３０ｂ（緑色光フィルタ）、および５９０ｎｍより長い波長用のロングパスフィルター（赤色光フィルタ）。いくつかの適用において、フィルタは、より緻密なバンドパス（例えば、２０ｎｍ毎）を提供し得る。直前に記載の投射オプティクスおよび検出器はまた、本明細書中において集団的に、光学システムと称される。
【００３７】
この装置はまた、コントロールユニット３４を備える。種々の利用者に制御される設定（例えば、ステージ高、配向、および並進位置、バンドパスフィルター、ならびに検出様式）は、装置内のコントロール入力パネル３６を通じてなされる。
【００３８】
図１Ｂは、装置２０のより概略的な表現を示し、ここでは、小さな哺乳動物被験体（例えば、マウス３８）の画像化に使用するためのスケールで示される。レンズアセンブリは、ここでは、単体レンズ２８、フィルターホイール３０、およびＣＣＤ検出器３２として示されている。検出出力は、コントロールユニットコンピュータユニット３４（これは、データファイルに対するプロセッサ４０および記憶ユニット４２を備える）内のコンピュータユニット４０に提供される。検出器３２由来の設計からの光検出シグナルに応答する、データファイルの内容、およびコンピュータユニットの作動は、以下に記載される。コントロールユニットは、利用者に情報および画像を表示するために、表示／出力デバイス４４（例えば、コンピュータモニタ）に作動可能に接続される。
【００３９】
コンピュータユニットの操作は、この装置によって実行される本発明の方法から理解され得、この操作は、図２に要約され、そして以下にさらに詳細に記載される。この方法における第１工程は、最初に測定される光−強度特性を得ることである。これは、被験体内に発光源をまず局在化することによってなされる。これは、上記されるように、種々の方法でなされ得、これらの方法としては、標的領域において発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）を産生するのに有効な遺伝子を被験体に導入すること、または標的源に蛍光性化合物を局在化させること（両方とも、例えば、共有に係るＰＣＴ出願ＷＯ９９ＵＳ／３００７８、ＷＯ００ＵＳ／７２９６、ＷＯ９９ＵＳ３００８０；およびＷＯ９７ＵＳ６５７８（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように公知である方法に従う）が挙げられる。
【００４０】
このようにして準備された被験体は、遮光チャンバ内に配置され、そして標的領域での発光現象に由来する被験体表面からの発光が、図２において５２で示されるように測定され、デジタル化され、そしてコンピュータユニットに収容される。コンピュータユニットは、このデータを用いて、５４で示されるように発光の空間プロフィールを生成する。このプロフィールは、検出器内の検出器エレメントの選択された行および選択された列に沿って、取得され得、図１Ａにおけるステージに平行な平面内のｘ（横）軸およびｙ（縦）軸に沿ってプロフィールを示す。すなわち、このプロフィールは、検出器エレメントの選択された行および列に沿って測定された強度値のプロットであり、そして被験体表面から検出器アレイ上へと焦点を合わせられる光強度の値の分布を表す。被験体から測定される例示的な光強度値は、図３Ｂに実線で示される。図３Ａは、発光等高線を示し、そして図３Ｂは、これらの位置に対応する検出器ピクセルで決定されるような垂直プロフィールを示す。
【００４１】
ここで、図２に戻ってみると、このように取得された空間プロフィールは、パラメータベースの光子関数（ｐｈｏｔｏｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のデータベース５８に記憶されたプロフィールと整合またはあてはめられる。この光子関数は、既知のサイズおよび深さの発光源から測定されたか、または以下に記載されるような、深さパラメータおよびサイズパラメータ、ならびに必要に応じて、他のパラメータを用いる光子拡散モデルから計算されるかのいずれかの経験的関数である。
【００４２】
最適な曲線の整合から、このプログラムは、発光源の深さおよび／またはサイズおよび／または輝度の好ましくは、３つ全ての初期に推定される決定を行い得る。本発明の特徴に従って、この方法は、深さ決定およびサイズ決定が、さらなる光強度データ、および／またはさらなるモデリングデータの形態であり得るさらなるデータによって精密化される様式で、現在実行されている。例えば、図２に示されるように、このデータは、以下の形態であり得る：
（ａ）第２投射角から被験体を投射することによって得られる、光強度データ、代表的には、空間プロフィールデータを意味する６２で示されるような、第２投射データ。代表的には、装置内の被験体は、発光が、被験体表面の第２領域から得られるように光学システムに対して傾けられる；
（ｂ）１つ以上のバンドパス範囲（例えば、青色光、緑色光、または赤色光のスペクトル範囲）で得られる光強度データを意味する６４で示されるような、スペクトルデータ；
（ｃ）代表的には、目的の被験体に近い被験体内の選択された位置で波長の関数として得られる予め決定された光強度値を意味する６６で示されるような、透過率データ；
（ｄ）組織パラメータ（例えば、光が拡散する被験体組織に対応する、減少した散乱係数μ’ｓ、吸収係数μａ、または有効係数μｅｆｆ）の予め決定された値を意味する６８で示されるような、組織特性データ。このデータは、例えば、拡散モデルにより作成される空間プロフィール曲線を精密化するために、使用される；
（ｅ）被験体の標的領域および隣接表面を示すモデルにおけるか、またはこの被験体に近い実際の被験体において、選択された位置で既知の強度およびサイズの光源を配置することによって取得される、予め決定された光強度値、代表的には、空間プロフィールデータを意味する７０で示されるような、シミュレーションデータ；ならびに
（ｆ）空間プロフィール全体または検出器アレイ全体にわたって、合計または積分された全光強度を意味する７２で示されるような、全強度データ。コンピュータデバイスにより実行されるプログラムは、６０でさらなる情報を受信し、そして以下に考察されるように、７４での発光源の深さおよびサイズを精密化するための情報を使用する。最終的に、発光源における、源の深さ、サイズ、ならびに必要に応じて、形状および細胞数の精密化された決定は、発光源の位置および強度を示すデータの形態および／または１つ以上の被験体画像のいずれかで利用者に表示される。
【００４３】
（ｇ）７３で示されるような絶対較正された光強度。絶対強度に対する較正は、ＣＣＤにおける計数／秒／ピクセルを、ラジアンス光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ（ｓｒは、ステラジアンである）への変換を可能にする。図８Ａは、較正方法において使用される光学アセンブリ１００を例証する。このアセンブリは、ＣＣＤ検出器１０２に加えて、レンズ１０４（上記のようにレンズアセンブリを示す）、バンドパスフィルター１０６および低光レベル積分球（例えば、Ｏｐｔｒｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＯＬ Ｓｅｒｉｅｓ４２５球）を備え、この積分球は、既知の光強度の供給源として作動する。光子／秒／ｃｍ２／ｓｒで測定されるこの球からの既知のラジアンスは、２つの数に関する較正因子の計算を可能にする。
【００４４】
図８Ｂは、発光源において、細胞の総数を算出するために、絶対的な測定強度をどのように使用するかを説明する。各細胞が、光子フラックスφｃ（光子／秒／細胞）を生じると仮定する。被験体１１２内の発光源１１０からのラジアンスは、検出器１０２で測定される場合、光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒの数の測定値である。次いで、測定されたラジアンスが、目的の領域にわたって積分されて、光源フラックスφｓ（光子／秒）に変換される。既知のフラックス値から、発光源における細胞の数が、φｓ／φｃとして容易に算出される。
【００４５】
（ＩＩＩ．発光データおよびパラメータ）
この節は、本発明を実施する際に収集され得る発光データの種々の型を考慮し、そしてこれらのデータが、モデル拡散曲線との曲線の整合に基づいて、光子拡散モデル化において、および／または発光源の深さもしくはサイズを決定するために、どのように使用され得るかを議論する。
【００４６】
（光強度の空間プロフィール） 決定された基礎の発光データは、図３Ｂに関して上で議論された、光強度の空間プロフィールである。測定された光強度の空間プロフィールは、被験体の表面領域から発光された光強度の空間的分布を示す。光強度の空間プロフィールは、単一の線、または２つ以上の線に沿って（例えば、被験体を支持しているステージに対してｘ方向およびｙ方向に沿って）得られ得る。光の２Ｄ表面分布全体もまた、使用され得る。モデル化された空間プロフィールは、混濁した組織を通しての光子拡散のモデルから算出された、推定の光強度の空間的分布を表す。測定されたプロフィールをモデル化されたプロフィールと整合させることによって、発光源のおよその深さおよび／またはサイズが決定され得る。
【００４７】
（全光強度） 全光強度とは、検出器における全ての検出器要素にわたって合計または積分された、全光強度である。全光強度は、源、位置、および輝度を決定するために使用される、あてはめモデルに対するさらなる制約条件として使用され得る。
【００４８】
（絶対的な較正光強度） 図８Ｂに関して上で議論されたように、絶対的な光強度フラックスを使用して、発光源からの全フラックスを測定し得る。この源が、各々が平均細胞フラックスφｃを発光する細胞から構成されると仮定すると、この源を構成している発光細胞の総数が決定され得る。次に、この決定を使用して、組織源についての既知または推定の細胞質量比に基づいて、源の総質量または総体積を精密化し得る。
【００４９】
（スペクトルデータ） スペクトルデータとは、特定の波長範囲（例えば、上に記載された、青色光、緑色光、および赤色光の波長範囲）において収集された、光強度データである。光は、被験体の組織、および特に、被験体組織におけるヘモグロビンによって、短波長において優先的に吸収されるので、異なる波長の光の相対強度は、源の深さに関する情報を提供し得、そして精密化された波長依存性空間プロフィールを、波長依存性の組織散乱係数および吸収係数に基づいて生じるために、使用され得る。
【００５０】
図４Ａおよび４Ｂは、異なる波長または波長範囲において身体領域の組織を通って移動する光に対して距離または深さが有する差の効果を示す。このグラフは、ｙ軸上に増加する光強度を示し、そしてｘ軸上に増加する波長を示す。図４Ａにおける実線は、発光源についてのインビトロでの発光スペクトルを表し、これは、約４９５ｎｍを中心とする幅広の単一のピークを含む、深さゼロの発光スペクトルに相関する。広い破線は、約１ｍｍの組織（インビボ）を通過した後の、発光源の発光スペクトルを表す。約６００ｎｍにおいて、この１ｍｍの深さの発光スペクトルは、小さなピークを生じる。なぜなら、一旦、約４９５ｎｍの大きなピークの相対強度が減少し始めるからである。中位の破線は、約２ｍｍの組織（インビボ）を通過した後の、発光源の発光スペクトルを表す。４９５ｎｍのピークは、強度がより小さくなるが、一方で６００ｎｍのピークは増加し、そしてより明らかになる。最後に、点線は、約４ｍｍの組織（インビボ）を通過した後の、発光源の発光スペクトルを表し、ここで、４９５ｎｍのピークは、さらに減少している。
【００５１】
図４Ｂは、組織深さゼロの発光スペクトルに縮尺を合わせた、組織の４ｍｍの深さにおける発光スペクトルを表す。６００ｎｍのピークは、一旦突出した４９５ｎｍのピークより突出する。この例において、発光源の深さに関する情報を提供するものは、４９５ｎｍのピークに対する６００ｎｍのピークの比である。
【００５２】
本発明の好ましい方法は、自己縮尺計算を使用し、その結果、発光源の深さが、その全体の強度とは無関係に決定され得る。この目的を達成するために、２つ以上の波長範囲の比を利用する関数が数式化され、ここで、各範囲の波長は、身体領域の表面からの標的の深さの関数として異なる割合で、その身体領域において組織を通過する。
【００５３】
（身体を通しての透過率） 身体を通しての透過率は、被験体に対して選択された位置または被験体の内部に、既知の強度の光源を配置すること、およびこの被験体を通って透過した光強度を、複数の表面において測定することによって測定される。この透過率は、異なる組織の散乱係数および吸収係数の、強いスペクトル依存性に起因して、強いスペクトル成分を有する（以下を参照のこと）。代表的に、透過率の値は、モデル被験体を使用して、種々の選択された位置で、そして多数のスペクトル範囲の各々で、全透過率を測定することによって、予め決定される。
【００５４】
図５は、複数の身体領域（番号１〜１６によって示される）を有する被験体の上面図である。この例において、この被験体は、固定されたマウスであり、そして各身体領域は、目的の予め決定された領域に対応する。本発明の方法の実施による深さの決定の前に、この被験体は必要に応じて、各身体領域についての光学特性のデータファイルを作成するために、分析される。この例において、各身体領域は、スペクトル光源とスペクトル検出器との間に配置される。光透過スペクトルが、各身体領域について得られる。その結果は、各身体領域を分光計キュベットに入れ、そして各領域を異なる波長および波長範囲で測定して、光がどのように身体の異なる領域およびこのような領域における組織を透過するかのデータファイルを作成することと類似である。図１のデバイスを使用して、特定の波長範囲について類似のデータを作成し得、但し、このデバイスは、検出器に対して、被検体を試験される各身体領域を透過して照射するように適合される。従って、図１のデバイスは、本質的に、動物全体の分光計となる。
【００５５】
図６Ａおよび６Ｂは、すぐ上に記載されたスペクトル分析から収集された、実験的スペクトルデータを示す。以下にさらに詳細に記載されるように、このデータは、スペクトル全体または各スペクトルにおける特定の範囲のいずれかとして、検出された強度情報との比較のため、または標的深さを計算するための関数を展開するための、データファイルを作成するために使用され得る。
【００５６】
より詳細なアプローチにおいて、この装置は、被験体全体またはその一部を走査するための、全身スキャナを提供し、これは、被検体の身体を走査するための、走査用２色レーザーをさらに備える。このスキャナは、少なくとも２色のアークレーザー光を、同時にかまたは連続的に通って移動する。このレーザー光が上向きに光を発する場合、この光は、回転チューブ内に入れられた被験体の身体を貫通する。このレーザー光源に対向して配置された検出器は、この検出器がそのアーク経路を通って移動するにつれて、レーザー光を受容し、そして測定するように適合される。
【００５７】
（組織の光学的特性） 光子拡散モデル化において使用される被験体組織の、２つの重要な光学特性が存在する。第１のものは、組織の吸収係数μａであり、これは、単位光路長あたりに吸収される入射光の一部に関係する。図７Ａおよび７Ｂ（これらは、可視スペクトルにわたって、種々の組織型についての吸収係数をプロットする）に見られるように、吸収係数は、その組織の性質および光の波長に非常に依存し、各組織が、５００〜６００ｎｍの範囲のピーク吸収を示す。約６００ｎｍより上での比較的低い吸収係数は、図１３Ａに見られるスペクトルデータ、ならびに図６Ａおよび６Ｂに示される全透過率データと整合する。
【００５８】
第２の重要な光学特性は、組織の減少した散乱係数μ’ｓであり、これは、大きな角度の光散乱に起因する、単位長さあたりの光の貫通の強度の部分的な低下である。図７Ｃおよび７Ｄ（これらは、可視スペクトルにわたる同じ組織に対する減少した散乱係数をプロットする）に見られるように、散乱効果は、異なる組織において相対的に異なり得る。一般に、減少した散乱係数は、より長波長において、いくらか減少する。
【００５９】
二重積分球（ＤＩＳ）システムは、組織または任意の混濁媒体の光学特性を測定するために広範に使用される道具である。なぜなら、このシステムは、好都合に、拡散反射率Ｒｄおよび拡散透過率Ｔｄを同時に測定するからである。図６Ｃは、光学特性（例えば、吸収係数μａ、および減少した散乱係数μ’ｓ）を得る目的でこれらの値を測定するために使用される、二重成分球装置７４を示す（Ｐｒａｈｌ，Ｓ．Ａ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３２：５５９−５６８（１９９３）；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３２：３９９−４１０（１９９３））。サンプル７６は、２つの積分球７８と８０との間に配置され、ここで内部バッフル８２が、反射光または透過光を直接測定することを防止するために、配置される。これらの球は、高度に反射性の材料でコーティングされて、光の吸収を最小にする。光は、検出器８４で検出され、そして好ましくは、コンピュータ８６を使用して分析される。４００〜１０００ｎｍの間でのサンプル照射が、光ファイバーケーブル９０およびレンズ９２を介してモノクロメータ８８に接続されたアーク灯を使用して、達成される。
【００６０】
拡散反射率Ｒｄ値および拡散透過率Ｔｄ値から、吸収係数および減少した散乱係数が、逆加算−倍化（ｉｎｖｅｒｓｅ ａｄｄｉｎｇ−ｄｏｕｂｌｉｎｇ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｏｍｌｃ．ｏｇｉ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉａｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して得られる。このプログラムは、ワンスピード放射伝播式（ｏｎｅ ｓｐｅｅｄ ｒａｄｉａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｑｕａｔｉｏｎ）の１つの数値の解であり、この式は、散乱媒体中での定常状態での光伝播を説明する（Ｐｒａｈｌ，Ｓ．Ａ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３２：５５９−５６８（１９９３））。このプログラムは、反復プロセスであり、これは、算出された反射率および透過率が測定値に整合するまで、光学パラメータのセットから反射率および透過率を測定する。
【００６１】
ＤＩＳシステムの特徴は、組織が測定の前に抽出される必要があるという事実である。従って、組織の生存性を測定条件下で維持することが望ましい。特に、ヘモグロビンおよび水の吸収が高い波長においては、ヘモグロビンの血管排出および組織の水和が、考慮される必要がある。上述のことを部分的に考慮して、組織光学特性を測定する好ましい方法は、以下のような、非侵襲性のインビボ測定である。
【００６２】
Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ（Ｂｅｖｉａｌｃｑｕａ，Ｆ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ ３８：４９３９−４９５０（１９９９））によって記載されるものと類似の円形のファイバープローブを使用して、光学特性を、非侵襲的に、または最小の侵襲で、インビボで測定し得る。図６Ｄは、円形ファイバープローブ９４の実験設定を示す。ファイバープローブ９４は、照射源９５、少なくとも１つの照射ファイバー９６、およびいくつかの（例えば、６つの）検出ファイバー９７を、一般に１〜２ｍｍの距離以内に備える。次いで、このプローブは、目的の組織９９に、好ましくは、最小の接触圧で、垂直に配置される。検出ファイバー９７の出力は、対応する検出器９８のセットに供給される。光学特性は、源からの半径方向距離に対する強度から、空間的に解析される。源から検出器への小さな分離においては、単純な分析モデル（例えば、拡散近似）は、このシステムを説明するために十分に適切ではなく、従って、Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ法が、代表的に、データを分析するために使用される。
【００６３】
（ＩＶ．光子伝播モデル）
この節は、身体の表面における、この表面の下の光源からの光子の放射、および混濁媒体を通る移動をシミュレートするための、光子伝播モデルを考慮する。特に、以下に基づいて、シミュレートされた光強度空間プロフィールを作成することが望ましい：（ｉ）発光源の深さ、（ｉｉ）発光源のサイズ、ならびに（ｉｉｉ）光吸収係数および光散乱係数。光吸収係数および光散乱係数は、波長と、その光子が通って拡散する組織の性質との両方に依存するので、このモデルは、その組織の性質および選択された波長における空間プロフィールを、特に考慮するように精密化され得る。
【００６４】
本明細書中において使用される光子拡散モデルは、初期光強度空間プロフィール（これから、節Ｖにおいて考慮されるように、最初の源の深さおよび源のサイズの情報が作成され得る）の作成の目的で、単純化するための多数の仮定を行う。次いで、このモデルは、さらなる組織依存性および／または波長依存性の情報を考慮することによって拡張され、測定された空間プロフィールとの曲線のあてはめを改善する目的で、空間プロフィールを精密化し得る。あるいは、最初の深さおよびサイズの情報は、他の型の曲線またはデータの整合によって、精密化され得る。最初の深さ／サイズの近似を精密化するための両方のアプローチは、以下の節Ｖにおいて考慮される。
【００６５】
図９Ａは、細胞（例えば、細胞小器官１１３を含む細胞１１１）から形成される混濁組織を通って拡散する場合の、光子の経路を示す。見られるように、細胞のサイズ（代表的に、２０〜３０ミクロンのサイズの範囲）は、光の波長λ（これは、約０．４ミクロンと０．６ミクロンとの間である）に対して大きい。散乱は、膜における段階的な不連続性（＜＜λ）に起因し、そして長さの逆数である散乱係数μｓ（約１０〜２０ｍｍ−１）によって特徴付けられる。散乱の異方性ｇは、約０．９であり、これは、減少した散乱係数μ’ｓ＝μｓ（１−ｇ）、すなわち約２ｍｍ−１を与える。吸収係数μａ（λ）は、０．０１ｍｍ−１と１ｍｍ−１との間であり、そして上で示されたように、強い波長依存性を有する。吸収係数および散乱係数は、波長依存性であるが、λ＞約６００ｎｍにおいては、組織において、μａ＜＜μ’ａであることが、一般に真実である。
【００６６】
身体内の標的部位から、身体表面に隣接して位置する光検出器への光の伝播の、定量的な説明は、適切な境界条件を有する光の放射伝播拡散方程式の解によって達成され得る（例えば、Ｒ．Ｃ．Ｈａｓｋｅｌら；「Ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｄｉａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｊ．Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｏｃ Ａｍ．，１１Ａ：２７２７（１９９４））。例えば、１つのアプローチは、図９Ｂに概略的に示される外插された境界条件を使用し、ここで、光学流束量は、距離ｚｂにおける物理的境界から消失する平坦な表面において消失し、これは、この物理的境界における光のフレネル反射を考慮する。
【００６７】
第一近似として、発光源が位置する身体は、半無限の均一な混濁媒体として表現され、これは、散乱と吸収との両方を行う。この近似は、図９Ｂに示され、この図は、平板１１６中の点発光源１１４を、平板表面の下の距離ｄに示す。この拡散方程式は、以下：
Ｄ∇２φ（ｒ）＝μａφ（ｒ）−Ｓ（ｒ） （１）
であり、そして フィックの法則は、以下：
ｊ（ｒ）＝−Ｄ∇φ（ｒ） （２）
であり、ここで、φは、等方性の流束量（ワット／ｍ２）であり、ｊは、小さい指向性流束（ワット／ｍ２）であり、Ｓは、出力密度（ワット／ｍ３）であり、ｒは、半径であり、そして
【００６８】
【数１】
【００６９】
【数２】
【００７０】
【数３】
【００７１】
表面ラジアンスをρの関数としてプロットすることによって、図１０Ｂに実線で示されるプロットが得られ、これは、図３Ｂに点線で示される、光強度プロフィールプロットと同じ導関数を有する。
【００７２】
混濁媒体における発光点についての空間プロフィール曲線もまた、さらにずっと計算に強いＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションを使用して算出し、これは、図１０Ａに示されるように、酔歩を通して各光子を辿る。このＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーション（図１０Ｂにおいて「＋」の記号で示される）は、拡散方程式から算出された空間プロフィールに綿密に適合する。
【００７３】
拡散方程式をどのように使用して、種々の組織および種々の深さを通しての光子拡散をモデル化するかを示すために、空間プロフィールを、種々のμｅｆｆの値について（それぞれ２．０ｃｍ−１および２０ｃｍ−１のμａ値およびμ’ｓ値に対応する、μｅｆｆ＝１１ｃｍ−１について、それぞれ０．４ｃｍ−１および１０ｃｍ−１に対応する、μｅｆｆ＝３．５ｃｍ−１について、ならびにそれぞれ０．０５ｃｍ−１および５ｃｍ−１に対応する、μｅｆｆ＝０．８７ｃｍ−１について）、算出した。μａについてのこれらの３つの値は、青色波長、緑色波長、および赤色波長に対する組織吸収におよそ対応する。
【００７４】
図１１Ａおよび１１Ｂにおけるプロットは、深さが増加すると共に強度が減少し、そしてスポット幅が増加すること、および大きい値のμｅｆｆは、より狭いスポット幅のピーク強度の大きな減衰を生じることを示す。
【００７５】
（Ｖ．深さおよびサイズの情報の決定）
本発明の方法を実施する際に、被験体は、最初、上に詳述されたように、標的の源において、発光分子を局在化するために処理される。次いで、この被験体は、装置２０（被験体のサイズに対して適切に縮尺を決められている）の遮光チャンバ内の選択された位置に配置され、そして光学システムが、発光源と検出オプティクスとの間の、被験体の表面領域における源からの発光事象を測定するように調節される。被験体を選択された光学的関係で固定した状態で、表面発光の光強度の空間プロフィールが得られ、これもまた上記のとおりである。図３Ａは、表面下の光源から測定された光強度の表面マップであり、これを引き続いて使用して、図３Ｂに示される空間プロフィールを作成した。
【００７６】
次いで、空間プロフィールを、パラメータに基づく生体光子関数（これは、発光強度を発光源の深さ（およびいくつかの場合に、源のサイズ）に関係付ける）にあてはめ、源の深さ（およびいくつかの場合に、源のサイズ）を最初に決定する。１つの好ましい生体光子関数は、上記ＩＶ節において議論された、単純化拡散モデルから導出される関数であり、ここで、点源または規定された球状もしくは楕円体状の体積を有する源からの光強度は、源の深さ、一定の散乱係数および吸収係数、ならびに源からの表面距離ｒの関数として、算出される。従来の非線形最小二乗曲線あてはめ技術（例えば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（「Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ ｉｎ Ｃ」Ｐｒｅｓｓら編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９））は、曲線のあてはめに適切である。曲線のあてはめは、図３に示されるような単一の一次元（「１−Ｄ」）プロフィール、複数のこのようなプロフィール、または２−Ｄ全空間分布（例えば、図１２Ａに示されるような）を使用してなされ得る。図３Ｂに示されるデータに対する曲線のあてはめの算出（破線）は、２．７ｍｍの深さを示し、これは、２．２ｍｍの推定された実際の深さに十分に匹敵する。
【００７７】
図１２Ａ〜１２Ｃは、深さおよびサイズの情報がどのように空間プロフィールから決定され得るかの別の例を与える。ここで、発光源は、それぞれ２．７ｍｍおよび３．２ｍｍの、水平方向および垂直方向の実際の寸法、および１．５ｍｍの腫瘍の厚さを有する、皮下の楕円状腫瘍である。水平プロフィールおよび垂直プロフィール（それぞれ図１２Ｂおよび１２Ｃ）を、それぞれ１．３ｍｍおよび２．４ｍｍの水平寸法および垂直寸法、１．５ｍｍの厚さ、ならびに０．４ｍｍの深さを有する楕円発光源に対して作成された曲線にあてはめた。
【００７８】
源の深さ（および必要に応じて、源のサイズ）の、最初の曲線の当てはめからの決定は、さらなるデータ（その効果は、生体光子関数のパラメータを精密化することである）を使用することによって、精密化され得、そして源のサイズが近似され得る。さらなるデータの性質、および生体光子関数のパラメータ（例えば、深さおよびサイズ）を精密化して、精密化された深さおよび源のサイズの情報を与える様式を、ここで、上記節ＩＩにおいて、図２に関して概説した情報の型の各々について、考慮する。
【００７９】
（Ａ．第２の投射の情報） 第２の投射のデータを得るために、被験体は、発光源を別の視点から見るために、投射および検出オプティクスに対して回転される。この第２の視点から、第２の光強度プロフィールが得られ、第２の被験体表面領域に対する第２の深さが決定される。２つの異なる表面位置において、源の深さの共通部分を決定することによって、より正確な深さおよび／または源のサイズが決定され得る。多くの視点が得られるほど、より正確な深さおよび源のサイズが決定され得る。
【００８０】
（Ｂ．スペクトルデータ） 身体領域における標的の深さが、以下によって決定され得るか、または標的の深さが精密化され得る：（ｉ）標的を、２つ以上の波長領域において発光させること、および（ｉｉ）各波長範囲の光が、深さの関数として、他の波長範囲の光とは異なって、身体領域を透過することを仮定して、身体領域の表面において、身体領域を透過する各範囲の光の差異を比較すること。
【００８１】
源の深さの関数としての、代表的なスペクトル曲線（示される波長における全光強度に関する）が、上で議論された図４Ａに示される。図４Ｂ（ここで、ピークは、インビトロでのスペクトル曲線に縮尺を合わせられている）に特に見られるように、約６００ｎｍ（例えば、６２０ｎｍ）におけるピークの高さの、インビトロ（ゼロ深さ）でのピーク高さ（例えば、約５００ｎｍ）に対する比は、深さの関数として劇的に増加する。従って、スペクトル曲線を作成し、そしてピーク高さの比を（代表的に、６００ｎｍより長波長および短波長、例えば、６２０ｎｍ：５００ｎｍ））決定することによって、混濁組織における強度の、波長依存性の損失に基づく、正確な深さ情報が決定され得る。
【００８２】
スペクトル測定からの近似深さを決定するために有用な式は、式４から、以下のように導出され得る：
【００８３】
【数４】
【００８４】
上記式を使用して、深さが、異なる波長または波長範囲における２つ以上の光強度の測定から決定され得る。１つの実施形態において、深さは、以下の一連の工程を実行することによって、得られ得る：（１）インビトロおよびインビボ（動物中）で、２つの波長で、生物発光細胞を画像化する；（２）例えば、ピーク強度または平均（積分）強度を各画像について測定することによって、画像を定量する；（３）各波長において、インビトロの画像データに対するインビボの画像データの比を算出する；ならびに（４）式７、および例えば組織特性測定から得られた有効散乱係数μｅｆｆを使用して深さを算出する。このアプローチの適用は、実施例１に説明される。
【００８５】
１つの実施形態において、各μｅｆｆについて有意に異なる値を有することが好ましい。動物組織は、ヘモグロビン（これは、大きい吸収ピークを６００ｎｍのすぐ下に、そして比較的低い吸収を６００ｎｍの上に有する）の存在に大きく起因して、μｅｆｆにこのような差異を提供する。
【００８６】
あるいは、さらなるスペクトルデータは、１つ以上の選択された波長または波長範囲において得られる、１つ以上の空間プロフィールを含み得る。次いで、このプロフィールは、図３Ｂに関して上に記載されるように、例えば、上記光子拡散モデルから、波長特異的な値（吸収係数、散乱係数、および／または有効な係数について）を使用して作成される、モデル強度関数と比較される。
【００８７】
なお別の適用において、強度値は、２０ｎｍごとに間隔を空けた不連続な波長で測定され得る。図１３Ａにおけるスペクトルプロットは、ＰＢＳ溶液中の細胞における緑色ルシフェラーゼ、ならびに図１３Ｂに示される部位で皮下に、および図１３Ｃに示される肺に局在した、緑色ルシフェラーゼについてのスペクトル曲線を示す。全ての曲線は、７００ｎｍにおける１の値に対して標準化されている。５６０ｎｍ対６２０ｎｍの強度比は、深さの指標である。
【００８８】
上記のように、本発明の関連する局面は、被験体における発光源の深さを決定する方法を提供する。この方法を実施する際に、被験体からの発光強度は、約４００ｎｍと約１０００ｎｍの間の２つ以上の異なる波長においてである。発光源の深さは、測定された発光強度、および被験体の光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）を使用して、決定される。
【００８９】
光学特性に関する情報（例えば、被験体における減衰係数および拡散係数）は、その被験体の物質と同じかまたは類似の物質の係数を直接測定することによって、得られ得る。この情報は、インビトロ（ゼロ深さ）およびインビボ（決定されるべき深さ）で、２つの波長で測定された強度と組み合わせて、式７に適用され、上記および実施例１に記載されるように、光源の深さを決定し得る。
【００９０】
あるいは、光学特性情報は、被験体の組織または材料に対応する組織または材料における、２つ以上の複数の深さの各々に位置する発光源からの光強度を、２つの以上の異なる波長で決定することによって、間接的に得られ得る。次いで、所望の深さの決定が、測定された光強度（例えば、異なる波長における強度比）を、複数の深さの各々において決定された光強度と適合させることによって、なされる。より特定のアプローチにおいて、発光源からの光強度の空間プロフィールは、複数の深さの各々における発光源からの光強度の複数の空間プロフィールの各々と比較（適合）され得る。
【００９１】
（Ｃ．身体を通しての透過率のデータ） 身体を通しての透過率のデータは、上記のように得られ、そして小動物被験体について、図５、６Ａおよび６Ｂに示される。上記のように、この情報は、既知の厚さの選択された組織を通る、波長依存性の光透過値を提供する。被験体における多数の選択された位置からの、予め決定された透過率データを使用して、異なる被験体位置での全身の平均散乱係数および吸収係数を、推定し得る。この目的は、可視スペクトル全体にわたってか、または選択された波長においてかのいずれかで、測定された空間プロフィールに対する曲線のあてはめのために使用される、モデル化された空間プロフィールを精密化することである。
【００９２】
（Ｄ．組織特性データ）組織特性データ（例えば、図７Ａ〜７Ｄに示されるもの）は、代表的に、大部分の身体組織の各々についての、波長依存性の吸収係数および散乱係数を含む。このデータは、例えば、上記光子拡散のモデルにおいて、所定の組織を透過する、所定の波長（代表的に、赤色波長）の光によって生じる空間プロフィールを精密化するために使用される。従って、例えば、被験体における発光源が筋肉であり、そして空間プロフィールが赤色波長で測定される場合、組織特異的かつ波長特異的な吸収係数を用いて作成される、精密化された空間プロフィールは、測定された曲線との曲線のあてはめのために、精密化された空間プロフィール曲線を提供する。
【００９３】
（Ｅ．シミュレーションデータ） 別の実施形態において、試験点または他の既知の形状の発光源は、混濁組織を模倣するブロックまたは平板に導入され得る。このブロックは、種々の散乱係数および拡散係数で、ならびに種々の形状で調製されて、被験体における発光源の条件をシミュレートし得る。試験点の配置の際に、空間プロフィールが、この試験点が配置された身体領域の外側表面からとられ得る。次いで、このデータは、試験点の実際の深さおよび位置に相関付けられる。この試験点をブロック内の点から点へと移動させることによって、一連の空間測定がなされ得る。この一連の空間測定から、被験体における異なる領域の空間応答をモデル化するためのデータファイルが組み立てられ得る。
【００９４】
（Ｆ．積分された光強度）
合計または積分された光強度とは、上記のように、検出器アレイの規定された領域全体またはいくらかにわたって合計された光強度をいう。積分光強度は、式５の積分と比較されて、源の深さおよび輝度のなお別の評価を提供し得る。この情報は、プロフィール情報と組み合わせて提供され得る。積分光強度もまた、複数の波長について算出され得る。
【００９５】
（Ｇ．較正された強度データ） 較正された強度データの非存在下では、強度測定は、カメラごとに変動し得、そして測定値は、投射、輝度、時刻およびＦストップのような変数に依存する。
【００９６】
絶対的な較正光強度（上記節ＩＩＩ）は、上記節ＩＩＩにおいて議論されるように、真のピーク値に対する曲線のあてはめに基づいた源の深さの決定を精密化すること、および組織における生物発光細胞の数を推定することを可能にする。
【００９７】
なお他の実施形態において、本発明は、強度および空間的分布データを用いて、他の画像化データの積分を提供し、被験体およびその中の標的位置のより詳細な三次元マップを作成する。例えば、集められた差次的光透過データ（例えば、上で開示されたもの）は、他の三次元画像化システム（例えば、三次元の計数化された「画像」または座標系を形成する、ＭＲＩ画像の積み重ねられたスライス）から誘導された座標系と組み合わせられ得る。次いで、このような座標系を使用して、標的が同定される被験体の解剖学的構造をより良好に示し得る。被験体が実験室動物（例えば、ラット）である場合、このような動物は、所定の系統について、１匹の動物から次の動物へと、構造が高度に均一である。その結果、座標データ、スペクトルデータ、および空間強度パターンファイルは、市場の販売者によって作成され得、そして図１に示されるような単純化された検出ユニットと共に使用するために、販売され得る。モデル三次元情報がデータファイルとして供給される場合、ユーザのユニットは、三次元の走査およびマッピングのために装備される必要がない。上に開示された方法および装置において考慮された、二次元の画像を、販売者によって提供される三次元データファイルと組み合わせて、被験体における標的のサイズ、形状、深さ、位相、および位置についての完全な三次元情報を得ることができる。
【００９８】
以下の実施例は、例示的であり、本発明を限定するようにはいかなる様式でも意図されない。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
（２波長空間画像を使用する、発光物体の深さの算出）
図１３Ａに示される空間情報を使用して、細胞の皮下注射を受けた動物（図１３Ｂ）および肺に標識細胞を有する動物（図１３Ｃ）におけるルシフェラーゼ標識細胞の深さを算出した。この分析を、以下の工程を使用して、６００ｎｍおよび６４０ｎｍに等しい波長でのデータを使用して実施した：（ｉ）生物発光細胞を、インビトロおよびインビボで、６００ｎｍおよび６４０ｎｍで画像化した；（ｉｉ）これらの画像を、各画像についての平均強度の測定によって定量した；（ｉｉｉ）インビトロの画像データに対するインビボの画像データの比を、各波長において決定した；そして（ｉｖ）式７を使用して深さを算出し、そして図７における平均有効散乱係数μｅｆｆを、吸収係数および散乱係数から推定した。
【０１００】
皮下の細胞については、インビボ対インビトロの強度比（相対強度、すなわちφ）は、６００ｎｍおよび６４０ｎｍにおいて、それぞれ０．３５および０．７５である。肺のシグナルについては、これらの同じ比は、０．０５および０．４７である。６００ｎｍにおいてμａ＝０．２５ｍｍ−１およびμｓ’＝１．０ｍｍ−１、ならびに６４０ｎｍにおいてμａ＝０．０５ｍｍ−１およびμｓ’＝１．０ｍｍ−１を使用すると、６００ｎｍにおいてμｅｆｆ＝０．９７ｍｍ−１、および６４０ｎｍにおいて０．４ｍｍ−１が得られる。拡散係数Ｄの値は、６００ｎｍおよび６４０ｎｍにおいて、それぞれ０．２７ｍｍおよび０．３２ｍｍである。これらの数値を式７（以下に再現する）：
【０１０１】
【数５】
【０１０２】
本発明を、特定の実施形態および適用に関して記載したが、種々の変化および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】図１Ａは、被験体中の発光源の位置およびサイズを調査する際に使用するための、本発明に従って構築される装置の断面図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａにおける装置の特徴を、概略形態で例示する。
【図２】図２は、本発明の方法の実施における、この装置によって実施され得る一般的な工程のフローチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、動物被験体中の発光源からの表面光強度画像である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの動物被験体からの光放射プロフィールであり、測定された放射プロフィール（実線）と、拡散モデルから算出された光放射プロフィールとの間の曲線の一致を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、示されるように、マウス大腿中の種々の深さにおけるインビトロ（実線）およびインビボ（破線）の、細菌ルシフェラーゼの発光スペクトルのプロットであり、ここで図４におけるプロットは、６００〜７００ｎｍの間の領域におけるインビボのピーク強度を示すために拡大されている。
【図５】図５は、透過スペクトルが得られた動物中の種々の位置を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、図５に示される種々の動物位置における生きた実験用動物を通る透過スペクトルを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図５に示される種々の動物位置における生きた実験用動物を通る透過スペクトルを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、サンプル（例えば、組織）の光学特性を測定するために有用な二重積分球型装置を例示する。
【図６Ｄ】図６Ｄは、インビボにおける組織の光学特性を測定するために有用な、放射状ファイバープローブの実験的設置を例示する。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、吸収係数のプロットである。図７Ｃおよび７Ｄは、波長の関数としての、種々の組織の等方的または減少した散乱係数のプロットである。
【図８Ａ】図８Ａは、絶対的較正の決定のために使用される装置の要素を例示する。
【図８Ｂ】図８Ｂは絶対的較正が、動物被験体から細胞数を決定することをどのようにして可能にするかを例示する。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、光子が組織を通ってどのように拡散するか（９Ａ）、およびこの組織の表面に拡散する光子が、本発明においてどのように捕獲されるか（９Ｂ）を例示する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、混濁組織を通る「酔歩」にわたる光子を追跡するＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、４ｍｍの深さにおける光源についての、拡散モデルから算出した予測光強度空間プロフィール（実線）、およびＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションを用いて算出した光強度空間プロフィール（「＋」記号）を例示する。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、拡散モデルから算出したプロットであり、発光源の深さの関数として、ピーク強度（１１Ａ）およびスポット幅（ＦＷＨＭ）（１０Ｂ）を示す。
【図１２】図１２Ａは、被験体中の発光源からの表面光強度画像であり、光強度プロフィールが測定された水平プロフィール線および垂直プロフィール線を示す。図１２Ｂおよび１２Ｃは、図１２Ａに示される水平プロフィール線および垂直プロフィール線に沿って測定される光強度プロフィールである。
【図１３】図１３Ａは、インビトロで取得されるルシフェラーゼ発光源のスペクトル画像プロット（実線）、図１３に示される皮下部位から取得されるルシフェラーゼ発光源のスペクトル画像プロット（四角）、および図１３Ｃに示される肺部位から取得されるルシフェラーゼ発光源のスペクトル画像プロット（菱形）を示す。図１３Ｂおよび１３Ｃは、皮下発光源を有する動物からの表面光強度画像（図１３Ｂ）、および肺中に発光源を有する動物からの表面光強度画像（図１３Ｃ）である。
Claims (35)
- 被験体における発光源の位置およびサイズを調査する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）光検出デバイスを用いた第１の投射から、（ｉ）該発光源から生じ、（ｉｉ）該被験体の混濁生物学的組織を通して進み、そして（ｉｉｉ）該被験体の目的の第１表面領域から発せられた光子を測定することにより、第１の測定された光強度プロフィールを得る工程；
（ｂ）該第１の測定された光強度プロフィールをパラメータベースの生体光子関数にあてはめる工程；および
（ｃ）該第１の測定された光強度プロフィール以外のデータを用いて、該生体光子関数のパラメータを精密化して、該被験体における該発光源のおよその深さおよびサイズを得る工程、
を包含する、方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記精密化する工程が、前記被験体の発光源から発せられた光子の波長に関連するデータを使用する工程を包含する、方法。
- 前記被験体における発光源の深さを調査する工程において使用するための、請求項２に記載の方法であって、前記精密化する工程が、（ａ）約４００〜約１０００ｎｍの間の２以上の異なる波長にて該被験体からの発光強度を測定する工程、（ｂ）該被験体の組織における光学的特性に関連する情報を得る工程、および（ｃ）前記測定された光強度および該得られた情報を使用して、該発光源の深さを精密化する工程、を包含する、方法。
- 請求項３に記載の方法であって、前記工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、以下からなる群より選択されるプロトコル：
Ａ．工程（ｂ）は、前記被験体の組織または材料における減衰係数および拡散係数に対応する、組織または材料における減衰係数および拡散係数を測定する工程を包含し、工程（ｃ）は、前記発光源の深さを予測する式において、該係数を使用する工程を包含する；
Ｂ．工程（ｂ）は、２以上の異なる波長にて、該被験体の組織または材料に対応する、組織または材料における複数の深さの各々に位置した発光源からの光強度を決定することにより、実行され、工程（ｃ）は、前記測定された光強度と該複数の深さの各々にて決定された光強度とを整合させることにより実行される；
Ｃ．工程（ａ）は、前記発光源からの光強度のスペクトルプロフィールを測定する工程を包含し、工程（ｂ）は、複数の深さの各々での発光源からの光強度のスペクトルプロフィールを決定することにより実施され、工程（ｃ）は、該測定されたプロフィールと、該決定されたプロフィールとを整合させて、最良の曲線のあてはめを同定する工程により実施される；および
Ｄ．工程（ａ）は、異なる波長における前記光強度プロフィールを測定する工程を包含する、
により実行される、方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記精密化する工程が、前記被験体から測定されたデータを使用する工程を包含する、方法。
- 請求項５に記載の方法であって、前記精密化する工程は、第２の測定された光強度プロフィールから得られたデータを使用する工程を包含し、該第２のプロフィールは、光検出器を用いた第２の投射から、（ｉ）発光源から生じ、（ｉｉ）該被験体の混濁生物学的組織を通して進み、そして（ｉｉｉ）該被験体の目的の第２表面領域から発せられた光子を測定することにより構築される、方法。
- 請求項５に記載の方法であって、前記データを得る工程は、（ｉ）前記目的の第１表面領域からの総光強度を測定する工程、（ｉｉ）組織領域の深さ、サイズおよび輝度を、前記測定された光強度値と、点光源発光体の深さの関数として生成された総ラジアンス値とを比較することにより、予測する工程であって、該総ラジアンス値は、体表面の下の規定のサイズ、形状、および／または深さの光源からの光子拡散のモデルから生成される、工程、を包含する、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記精密化する工程は、混濁媒体中の発光源からの光拡散のコンピュータシミュレーションから得られたデータを使用する工程を包含する、方法。
- 請求項８に記載の方法であって、前記コンピュータシミュレーションが、光子拡散モデルである、方法。
- 請求項９に記載の方法であって、前記精密化する工程が、（ｉ）生物学的組織の吸収特性および散乱特性に類似する、吸収特性および散乱特性を有する混濁媒体を通した、複数の深さのうちの１つに位置し、複数のサイズおよび形状のうちの１つを有する発光源からの光子拡散モデルに基づいて、複数の理論的光強度プロフィールを生成する工程、（ｉｉ）該複数の理論的光強度プロフィールの各々と前記第１の測定された光強度プロフィールとの間のあてはめの質を比較する工程、（ｉｉｉ）該第１の測定された光強度プロフィールに供給する、該理論的光強度プロフィールを選択する工程、および（ｉｖ）前記被験体における該発光源のおよその深さ、形状および輝度を、（ｉｉｉ）において選択された該理論的光強度プロフィールからのパラメータを使用して得る工程、を包含する、方法。
- 請求項１０に記載の方法であって、前記あてはめの質を比較する工程は、最小二乗アルゴリズムを使用して行われる、方法。
- 請求項１０に記載の方法であって、前記あてはめの質を比較する工程は、遺伝アルゴリズムを使用して行われる、方法。
- 請求項１０に記載の方法であって、前記生成する工程は、光子散乱モデルにおいて、前記光子が進む組織に対応する、１以上の所定の組織特異的光散乱係数を使用する工程を包含する、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記発光源は発光部分である、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記発光源は蛍光部分である、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記発光源は、前記被験体に投与され、前記測定する工程の前に該被験体において選択された標的に結合する、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記発光源は光発生タンパク質である、方法。
- 請求項１７に記載の方法であって、前記光発生タンパク質は、前記被験体の生物学的細胞により発現される、方法。
- 請求項１７に記載の方法であって、前記光発生タンパク質は、前記被験体に投与された生物学的細胞により発現される、方法。
- 請求項１に記載の方法であって、前記被験体における前記発光源の前記およその深さおよび形状を使用して、該発光源の可視的な表示を生成する工程、および該可視的な表示を該被験体の画像に重ね合わせる工程、をさらに包含する、方法。
- 請求項２０に記載の方法であって、前記画像は二次元画像である、方法。
- 請求項２０に記載の方法であって、前記画像は三次元画像である、方法。
- 被験体における発光源の位置およびサイズを調査する際に使用するための装置であって、該装置は、以下：
該被験体からの発光事象を内部で検出し得る遮光エンクロージャ、
（ｉ）該発光源から生じ、（ｉｉ）該被験体の混濁生物学的組織を通じて進み、そして（ｉｉｉ）該被験体の目的の第１表面領域から発せられる、光子を該エンクロージャ内の第１投射から測定することにより、構築される第１光強度プロフィールを得る際に使用するための、該エンクロージャ内に設けられる光学システム；ならびに
（ｉ）該第１の測定された光強度プロフィールと、パラメータベースの生体光子関数とをあてはめ；そして（ｉｉ）該第１の測定された光強度プロフィール以外のデータを使用して、該生体光子関数の該パラメータを精密化して、該被験体における該発光源のおよその深さ、形状、および輝度を生成するための、該光検出器に操作可能に接続された計算ユニット、
を備える、装置。 - 請求項２３に記載の装置であって、前記光学システムは、冷却条件で操作され得る電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、および該ＣＣＤ上に光を集めるためのレンズを備える、装置。
- 請求項２４に記載の装置であって、前記光学システムは、前記被験体の目的の複数の異なる表面領域から発せられた光子を検出するように設計されている、装置。
- 請求項２３に記載の装置であって、前記光学システムは、約４００〜８００ｎｍの間の選択された２以上の異なる波長範囲内で光子発光強度を測定する際に使用するための、選択された異なる波長領域内の光子を通すための１以上の波長フィルタを備え、前記計算ユニットは、前記パラメータ精密化メント操作：
（ｉ）該異なる波長にて測定された相対光強度を決定し、組織深さの関数として、該決定された相対光強度と、該異なる波長での既知の相対シグナル強度とを比較する工程；および
（ｉｉ）該測定されたスペクトルと、組織内の種々の深さに配置された発光源から測定される複数のスペクトルとを比較し、該測定されたスペクトルと、該既知のスペクトルとを整合させることから、該発光標的領域の深さを決定する工程、
の少なくとも１つを実施するために操作可能である、装置。 - 請求項２３に記載の装置であって、前記計算ユニットは、モデル被験体のモデル身体領域内の、モデル標的の発光のサイズ、形状、および／または深さの関数として、前記選択された波長範囲内で発光された光の空間分布に関する所定の空間分布情報を含むデータファイルを含み、そして前記ユニットが、（ｉ）前記第１光強度プロフィールのスペクトル特性と、データベース中に含まれるスペクトル特性とを比較する、ためのタスクを実行する際に機能する、装置。
- 請求項２３に記載の装置であって、前記計算ユニットは、強度パターン画像を、単一の強度値に積分し、特定のサイズおよび形状の発光源の関数として生成された、積分された光強度値により発光源サイズを予測することが操作可能である、装置。
- 請求項２３に記載の装置であって、前記計算ユニットは、生物学的組織の吸収特性および散乱特性に類似の、吸収特性および散乱特性を有する混濁媒体を通した、複数の深さの１つに位置し、複数のサイズおよび形状のうちの１つを有するグロー源からの光子拡散のモデルに基づく複数の理論的光強度プロフィールを含むデータベースを含み、該ユニットは、（ｉ）該複数の理論的光強度プロフィールの各々と、第１の測定された光強度プロフィールとの間のあてはめの質を比較すること、（ｉｉ）最良のあてはめを該第１の測定された光強度プロフィールに提供する該理論的光強度プロフィールを選択すること、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）で選択された理論的光強度プロフィールからのパラメータを使用して、該被験体における該発光源のおよその深さおよび形状を得ることが操作可能である、装置。
- 請求項２３に記載の装置であって、前記計算ユニットは、前記被験体における発光源のおよその深さおよび形状を使用して、前記発光源の可視的な二次元表示または三次元表示を生成し、そして該可視的な表示を、該被験体の二次元画像または三次元画像に重ね合わせることが可能である、装置。
- 請求項１に記載の方法であって、前記得る工程は、絶対強度値を得る工程を包含する、方法。
- 被験体の組織における発光源の深さを決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍの間の２以上の異なる波長にて該被験体からの発光強度を測定する工程；
（ｂ）該被験体の組織の光学的特性に関連した情報を得る工程、および
（ｃ）該測定された光強度および該得られた情報を使用して、該発光源の深さを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項３２に記載の方法であって、工程（ａ）は、２つの異なる波長の各々にて光強度を測定することにより実施され、工程（ｂ）は、前記被験体の組織または材料に対応する、組織または材料の減衰係数および拡散係数を測定する工程を包含し、工程（ｃ）は、式において該係数を使用して、該発光源の深さを予測する工程を包含する、方法。
- 請求項３３に記載の方法であって、工程（ｂ）は、２以上の異なる波長にて、前記被験体における組織または材料に対応する、組織または材料における複数の深さの各々に位置した発光源からの光強度を決定する工程により実施され、工程（ｃ）は、該測定された光強度と、該複数の深さの各々にて決定された参照光強度とを整合させることにより実施される、方法。
- 請求項３４に記載の方法であって、工程（ａ）は、前記発光源からの光強度のスペクトルプロフィールを測定する工程を包含し、工程（ｂ）は、複数の深さの各々での発光源からの光強度のスペクトルプロフィールを決定することにより実施され、工程（ｃ）は、該測定されたプロフィールと、該決定されたプロフィールとを整合させて、最良の曲線のあてはめを同定することにより実施される、方法。
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