WO2015037055A1 - 蛍光画像取得装置 - Google Patents

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WO2015037055A1
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sample
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辰弥 池原
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株式会社島津製作所
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and method for acquiring a fluorescent substance in a sample as an image, for example, an apparatus and method for acquiring an in-vivo fluorescent image for a biological sample such as a small animal.
  • Fluorescence image acquisition devices are roughly divided into two systems.
  • One is (A) a scanning fluorescent image acquisition device.
  • a fluorescent image is obtained by irradiating a sufficiently condensed excitation light from one point of the sample to be observed to excite the fluorescent substance present in the sample and receiving the fluorescence generated from the fluorescent substance. To get.
  • a fluorescent image of the entire sample is obtained by scanning so that the irradiation point extends over the entire sample (see Patent Documents 1 and 2).
  • a characteristic of the scanning fluorescent image acquisition device is that an observation region can be specified. For example, when it is desired to observe the brain of a biological sample, if only the brain region is set as a scanning point, background fluorescence from other than the brain can be removed, and a sufficient dynamic range can be obtained. However, such background fluorescence may have important information in in vivo observation. For example, when drug metabolism is evaluated, if drugs accumulate outside the target area, there is a risk that it may affect the side effects of the drugs. For this reason, first, it is necessary to scan the entire living body, but in the scanning apparatus, it takes an enormous amount of time to scan the entire observation object.
  • the other is (B) all-irradiation type fluorescence acquisition device.
  • this apparatus a wide area fluorescence image is obtained at a time by simultaneously irradiating a wide area of a sample with excitation light (see Patent Document 3).
  • Patent Document 3 Japanese Patent Document 3
  • a feature of the all-irradiation type fluorescence acquisition apparatus is that a fluorescence image of the entire observation target, which was a scanning type defect, can be acquired in a short time.
  • a fluorescent image can be obtained in a short time in a method of use aimed at drug screening using a mouse or monitoring during surgery.
  • a sufficient dynamic range may not be obtained due to the influence of background fluorescence.
  • weak fluorescence in the target region may not be detected due to accumulation other than the target object (particularly liver accumulation).
  • ICG Indo Cyanine Green
  • the scanning type can ensure a wide dynamic range, but the observation time is extremely long.
  • the all-irradiation type can observe for a short time and continuous time, but the dynamic range is narrow and relative There is a problem that weak fluorescence cannot be detected.
  • the present invention is not limited to acquiring a fluorescent image of a living body, but includes acquiring a fluorescent image for a sample other than a living body, and efficiently acquiring an image of a fluorescent substance in the entire observation target with a wide dynamic range. Objective.
  • the fluorescence image acquisition device of the present invention is configured to irradiate the sample with excitation light
  • the sample table and the sample placed on the sample table are separated from the sample by a beam of excitation light that spreads from the position.
  • An excitation light source that irradiates and excites a fluorescent substance in the sample to generate fluorescence
  • an imaging unit including a two-dimensional detector that detects fluorescence from the sample, and an image based on the fluorescence image acquired by the imaging unit is displayed.
  • a display device a display device.
  • the fluorescence image acquisition device of the present invention is further arranged between a sample and the two-dimensional detector, and a blocking mechanism for blocking a part of the fluorescence from the sample from entering the two-dimensional detector,
  • a blocking control unit that controls the blocking mechanism so as to substantially block the strongest fluorescence from the sample from being incident on the two-dimensional detector at the time of imaging by the imaging unit;
  • an image integration unit that performs calculation processing so that at least two fluorescent images including at least one fluorescent image obtained by the imaging unit in a partially blocked state are integrated into one image.
  • the display device is configured to display an integrated image obtained by the image integration unit.
  • substantially blocking when the blocking control unit substantially blocks the strongest fluorescence incident on the two-dimensional detector means that the next strongest fluorescence can be detected after the strongest fluorescence. This means that the strongest fluorescence is blocked.
  • substantially blocking the example described later with reference to FIG. 7 is the strongest in order to increase the dynamic range of a region other than the blocking portion by a factor of 5 to enable detection of weak fluorescence.
  • the intensity of the fluorescence is attenuated to about 1/5. Attenuation to about 1/5 of that corresponds to substantially blocking.
  • the attenuation factor is not particularly limited, and may be larger or smaller than 1/5. Of course, the case of 100% blocking is also included.
  • the fluorescent image acquisition method of the present invention includes the following steps (A) to (D).
  • step (B) In a state where the fluorescence from the portion emitting the strongest fluorescence at the time of detecting the fluorescence by the two-dimensional detector is substantially blocked from entering the two-dimensional detector, the step (A) And at least one step of irradiating the sample with excitation light and obtaining a fluorescence image by the two-dimensional detector,
  • step (C) integrating at least two fluorescent images composed of the fluorescent image obtained in step (A) and at least one fluorescent image obtained in step (B) into one image;
  • step (D) A step of displaying the image integrated in step (C).
  • step (A) a fluorescence image of the entire observation target of the sample is acquired.
  • the entire observation object may be the entire sample or a part of the sample.
  • the fluorescence from the fluorescent substance in the sample is detected depending on the dynamic range of the two-dimensional detector.
  • the strongest fluorescence from the sample is substantially blocked by operating a blocking mechanism that physically blocks the fluorescence based on the positional information of the fluorescent substance inside the sample.
  • the position information of the fluorescent substance inside the sample can be obtained, for example, by a calculation processing unit that obtains biological internal information from a fluorescent image, or based on the inputted sample internal information.
  • the excitation light may be blocked so that the fluorescent material that generates the strongest fluorescence is not irradiated with the excitation light, or the fluorescent material that generates the strongest fluorescence is irradiated with the excitation light. Even if fluorescence is generated, the fluorescence may be blocked so that the fluorescence does not enter the two-dimensional detector.
  • a fluorescence image is acquired in the state which blocked
  • the fluorescence from the fluorescent substance with the next strongest fluorescence intensity is detected.
  • This detection is performed with increased sensitivity by a method such as increasing the exposure time of the two-dimensional detector as compared with the imaging condition in step (A).
  • step (B) as necessary.
  • the fluorescence detected in step (A) is already substantially blocked, so that the fluorescence detected in the first step (B) is in the second step (B).
  • the detection in the second step (B) is performed with increased sensitivity by a method such as increasing the exposure time of the two-dimensional detector as compared with the imaging conditions in the first step (B). The same applies when performing step (B) for the third time or more.
  • step (A) and step (B) are repeated at most about 2 to 5 times, it takes a shorter time than imaging the entire area by the scanning type, and is a remarkably efficient process.
  • the present invention integrates at least two fluorescence images including a fluorescence image obtained by the imaging unit in a state where the strongest fluorescence from the sample at the time of imaging is substantially blocked from entering the two-dimensional detector into one image.
  • the fluorescence of the entire observation target can be detected in a wide dynamic range compared to the all irradiation type, and the fluorescence of the entire observation target can be detected in a short time compared to the scanning type, so that the efficiency is improved.
  • FIG. 1 It is a figure explaining the method of determining the range blocked by the blocking mechanism
  • (A) is a sectional view showing the fluorescent substance and fluorescence installed in the living body
  • (B) is the fluorescence intensity detected on the surface of the biological sample It is a figure which shows a profile. It is a figure which shows the profile of the fluorescence intensity which normalized the profile of FIG. 6 (B) so that the fluorescence intensity at a distance of 20 mm becomes 1.
  • FIG. It is a flowchart which shows an example of operation
  • FIG. 10 It is a figure which shows the fluorescence detection of the observation whole area
  • (A) is a figure which shows the phantom and the fluorescent substance containing tube embedded in it
  • (B) is an image which shows the fluorescence image of the whole observation object. It is the longitudinal cross-sectional view (left) and the cross-sectional view (right) which show the fluorescence image reconfigure
  • (A) is a perspective view which shows the blocking mechanism which covers the phantom and its part
  • (B) shows the detected fluorescence image. It is an image.
  • the excitation light source 14 includes an excitation light source that emits fluorescence by irradiating the sample 12 placed on the sample stage 10 from a position away from the sample 12 with excitation light 16 of a luminous flux that spreads to excite the fluorescent substance in the sample 12. ing.
  • an LD laser diode
  • LED light emitting diode
  • the excitation light source 14 it is preferable to use an excitation-side interference filter that removes light having a fluorescence wavelength to be detected in combination with the excitation light source.
  • the excitation light source 14 further includes a three-dimensional distribution calculation processing unit as a preferred embodiment, three-dimensional surface shape data used in the forward problem analysis process and the inverse problem analysis process is obtained from the captured appearance image.
  • a three-dimensional distribution calculation processing unit as a preferred embodiment, three-dimensional surface shape data used in the forward problem analysis process and the inverse problem analysis process is obtained from the captured appearance image.
  • an illumination light source such as a white LED for illuminating the sample and capturing an appearance image of the sample is also provided.
  • the imaging unit 18 includes a two-dimensional detector 20 that detects fluorescence from the sample 12.
  • the two-dimensional detector 20 is, for example, a CCD (charge coupled device).
  • the imaging unit 18 removes the excitation light component to prevent the excitation light component from entering the two-dimensional detector 20 and an optical system such as a condenser lens for guiding the fluorescence from the sample 12 to the two-dimensional detector 20.
  • a fluorescence side interference filter that transmits the fluorescence to be detected is also included.
  • a blocking mechanism 22 is provided to block the fluorescence from a predetermined portion of the sample 12 from entering the two-dimensional detector 20.
  • the shut-off mechanism 22 it is preferable to include a mechanism that automatically operates by electrical control from the shut-off control unit 24.
  • the blocking control unit 24 controls the blocking mechanism 22 so that the blocking mechanism 22 substantially blocks the strongest fluorescence from the sample 12 from entering the two-dimensional detector 20 at the time of imaging.
  • the image integration unit 26 performs calculation processing so that at least two fluorescence images including the fluorescence image obtained by the imaging unit 18 in a state where a part of the sample 12 is blocked by the blocking mechanism 22 are integrated into one image.
  • the display device 28 displays the integrated image obtained by the image integration unit 26.
  • the display device 28 is not particularly limited, but is a liquid crystal display device, for example.
  • the display device 28 is preferably configured to display the integrated image in different colors for each intensity range.
  • the blocking control unit 24 controls the blocking mechanism 22 so as to substantially block the strongest fluorescence from the sample 12 at the time of imaging from entering the two-dimensional detector 20 based on the sample internal information.
  • a three-dimensional distribution calculation processing unit 30 for obtaining the sample internal information from the fluorescence image data obtained by the imaging unit 18 is provided.
  • the blocking control unit 24 controls the blocking mechanism 22 based on the sample internal information obtained by the three-dimensional distribution calculation processing unit 30.
  • a sample internal information input unit 32 for inputting the internal information of the sample to be detected is further provided.
  • the blocking control unit 24 controls the blocking mechanism 22 based on the sample internal information input from the input unit 32.
  • the image integration unit 26 may be configured to integrate the fluorescent images reconstructed by the 3D distribution calculation processing unit 30.
  • the blocking control unit 24, the image integration unit 26, and the three-dimensional distribution calculation processing unit 30 are realized by a computer 34.
  • a computer 34 is a dedicated computer or a personal computer of the fluorescent image acquisition apparatus.
  • the input unit 32 is an input device including a keyboard and a mouse for inputting data to the computer 34.
  • the entire observation object of the sample 12 is irradiated with the excitation light 16 from the excitation light source 14, and a fluorescence image in the entire observation object is acquired by the two-dimensional detector 20 of the imaging unit 18 (FIG. 3A).
  • the entire observation target is not necessarily the entire sample, but may be a part of the sample to be observed.
  • the sample is not particularly limited, but is a biological sample, for example.
  • the place with the strongest fluorescence intensity is detected with high sensitivity.
  • the location indicated by the symbol a is the location with the strongest fluorescence intensity, and the fluorescence from that location is detected with high sensitivity.
  • the living body internal information is obtained by the three-dimensional distribution calculation processing unit 30.
  • processing procedures for obtaining internal biological information include a method of calculating a tomographic image from forward problem analysis and inverse problem analysis, a method of deriving deep information from different wavelengths (see Patent Document 5), and the like.
  • the accumulation location such as a subcutaneous blood vessel or lymph node is known in advance, instead of obtaining the in-vivo information by the three-dimensional distribution calculation processing unit 30, the in-vivo information is input from the sample internal information input unit 32. You may make it input.
  • the forward problem analysis is a process in which the excitation light propagates through the living body when the excitation light is irradiated from any direction, and the fluorescence propagates inside the living body when a fluorescent substance is present at any position inside the living body. It consists of the process of doing. Each process can be calculated by the following light diffusion equations (1) and (2).
  • D diffusion constant
  • ⁇ a absorption coefficient
  • ⁇ ex (j) excitation light fluence rate at position r when excitation light is applied from the j-th direction
  • ⁇ em (k) fluorescence fluence rate at position r when a fluorescent substance is present at the k-th position
  • ⁇ molar extinction coefficient
  • ⁇ quantum yield
  • M molar concentration
  • S (j) excitation light intensity at the j-th position
  • the theoretical values of excitation and fluorescence propagation can be obtained from the equations (1) and (2), and the system matrix A is created based on the calculation results.
  • the system matrix A is a matrix for obtaining a theoretical value of the fluorescence distribution detected on the surface of the living body when the spatial distribution f of the fluorescent material is given.
  • the column vector v of the system matrix is a theoretical value of the fluorescence distribution detected on the surface of the living body at an arbitrary position, and the system matrix is obtained for each column vector up to the kth position.
  • the calculation in the inverse problem analysis consists of a process of obtaining the spatial distribution of the fluorescent substance from the fluorescence detection data obtained by the apparatus and the theoretical value calculated in the forward problem analysis.
  • the system matrix A in Equation (3) can be obtained by forward problem analysis.
  • the fluorescence biological image acquisition device can obtain the fluorescence distribution vector g on the living body surface in the equation (4).
  • the spatial distribution vector f of the unknown fluorescent substance is obtained from the system matrix A obtained by the forward problem analysis and the fluorescence distribution vector g on the living body surface.
  • a general method for obtaining the vector f is the least square method, which can be obtained by minimizing the evaluation function of the following equation (5).
  • a part of the excitation light is blocked by the blocking mechanism 22 so that the excitation light does not enter the fluorescent material at the location a, or temporarily
  • the blocking mechanism 22 blocks the fluorescence so that the fluorescence generated from the fluorescent material at the location a does not enter the two-dimensional detector 20 even if the excitation light enters the fluorescent material at the location a.
  • steps 2 to 4 are repeated when the fluorescence image is also detected. The same applies when weak fluorescence is detected.
  • Image data is integrated with respect to the obtained plurality of fluorescent image data.
  • the image data is integrated after obtaining the acquisition conditions of the two-dimensional detector 20.
  • the image data to be integrated may be fluorescence image data acquired by the two-dimensional detector 20 or fluorescence image data reconstructed in the procedure 2.
  • FIG. 4 is an example of a blocking mechanism 22A installed around a sample made of a small living body such as a mouse.
  • Cylindrical blocking plates 42 ⁇ / b> A and 42 ⁇ / b> B having a diameter of about 70 mm are installed at two locations on both sides of the biological sample 12 in the longitudinal direction.
  • the longitudinal direction of the biological sample 12 is the direction of a straight line connecting the head to the tail of the living body.
  • the blocking plates 42A and 42B are supported by the respective electric sliders 44A and 44B so that they can move along the longitudinal direction of the biological sample 12.
  • the material of the blocking plates 42A and 42B is preferably a lightweight material such as aluminum or plastic, and the surface is preferably painted black to suppress light reflection as much as possible.
  • the blocking plates 42A and 42B are driven by the electric sliders 44A and 44B according to an instruction from the blocking control unit 24, and move to an arbitrary region to block light.
  • FIG. 5 is an example of a blocking mechanism 22B disposed between the excitation light source 14 and the two-dimensional fluorescence detector 20 and the sample 12.
  • two excitation light sources 14 are arranged in front of the two-dimensional fluorescence detector 20.
  • the number of excitation light sources 14 may be one, or three or more.
  • the excitation light source 14 irradiates excitation light 16 over a wide angle with respect to a sample (not shown).
  • the blocking mechanism 22B is disposed between the position where the excitation light source 14 and the two-dimensional fluorescence detector 20 are installed and the sample.
  • the blocking mechanism 22B blocks the sample from being irradiated with a part of the excitation light 16 from the excitation light source 14, and blocks a part of the fluorescence from the sample from entering the two-dimensional fluorescence detector 20.
  • the blocking mechanism 22B includes four blocking plates 46A to 46D arranged in the same plane, and these blocking plates 46A to 46D are supported by the respective electric sliders 48A to 48D so as to move independently from each other. .
  • the material of the blocking plates 46A to 46D is preferably a lightweight material such as aluminum or plastic, and the surface is preferably painted black to suppress light reflection as much as possible.
  • the blocking plates 46A to 46D are driven by the electric sliders 48A to 48D according to instructions from the blocking control unit 24, and move to an arbitrary region to block light.
  • a blocking mechanism that physically blocks excitation and fluorescence in accordance with position information of the fluorescent substance inside the living body.
  • position information of the fluorescent substance inside the living body For example, when there is a fluorescent substance that emits the strongest fluorescence in a shallow position inside the living body as viewed from the two-dimensional detector 20, the influence of scattering when the fluorescence passes through the inside of the living body is small, and thus the fluorescence is removed. It is possible to narrow the blocking range for doing.
  • the fluorescent substance is present at a deep position inside the living body as viewed from the two-dimensional detector 20, since the influence of scattering when the fluorescence passes through the inside of the living body is large, the blocking range for removing the fluorescence is expanded. There is a need. In this way, it is possible to give optimum imaging conditions while taking into consideration the scattering problem that is a problem in biological measurement.
  • the range to be blocked by the blocking mechanism 22 is determined as follows, for example.
  • FIG. 6A a simulation of how far the fluorescence emitted from the fluorescent substance inside the living body is detected on the surface of the biological sample is performed.
  • FIG. 6B shows a profile of the fluorescence intensity detected on the surface of the biological sample when the installation depth is varied. This profile can be calculated by the light diffusion equations (1) and (2).
  • FIG. 7 shows a fluorescence intensity profile normalized so that the fluorescence intensity at a distance of 20 mm is 1 from FIG. 6 (B). From FIG. 7, it is possible to obtain an index as to how much the fluorescence inside the biological sample is scattered and spread and detected on the surface. Based on the information obtained from FIG. 7, the range in which the fluorescence should be blocked is determined. For example, when the fluorescent material is present at a depth of 2 mm of the biological sample when viewed from the two-dimensional detector 20, if the range of about 3 mm from the peak point of the fluorescence intensity is blocked, the fluorescence derived from this fluorescent material is reduced to about 1 / It can be attenuated to 5. By this blocking, the dynamic range of the region other than the blocking portion can be increased about five times, and even weak light can be detected. An attenuation of 1/5 represents an example of substantial interruption.
  • the blocking control unit 24 can efficiently specify the blocking range. Further, in the case where the fluorescent substance accumulation location is known in advance, such as each organ such as the liver, subcutaneous blood vessels, and lymph nodes, the positional information of the fluorescent substance in the biological sample is known in advance. Once such a simulation is performed, a range to be blocked in advance can be input from the input unit 32 to the computer 34 and held.
  • the computer 34 keeps a correspondence table of the cutoff range with respect to the depth.
  • An example of the correspondence table is shown in Table 1.
  • This correspondence table is obtained in advance by calculation so that the optical attenuation of the fluorescence incident on the two-dimensional detector 20 becomes 1/5 due to the interruption.
  • the degree of light attenuation of the fluorescence incident on the two-dimensional detector 20 is a degree for substantially blocking so that the fluorescence having the next strongest intensity can be detected, and can be changed as necessary. .
  • the blocking control unit 24 inputs the depth information of the fluorescent material by the configuration process (FIG. 2 (2)) from the three-dimensional distribution calculation processing unit 30, as shown in FIG. .
  • the data in Table 1 is read out and the blocking range is determined (input) based on the depth information.
  • the blocking control unit 24 controls the operation of the electric sliders 23A and 23B based on the blocking range, and moves the blocking plates 42A and 42B to a predetermined position.
  • the fluorescence image capturing for the third time and thereafter is performed in a state in which all of the fluorescence images having the strongest intensity in each of the fluorescence image capturing so far are substantially blocked.
  • a blocking mechanism 22B shown in FIG. 5 is suitable.
  • the computer 34 keeps a correspondence table of the cutoff range with respect to the depth.
  • the correspondence table is shown in Table 2, for example, and the position of each lymph node, blood vessel, and heart is known in advance as to how many millimeters the depth from the sample surface is as seen from the two-dimensional detector. It is requested in advance how much the cut-off range is set with respect to the depth.
  • This correspondence table is also obtained in advance by calculation so that the optical attenuation of the fluorescence incident on the two-dimensional detector 20 is 1/5 due to the interruption.
  • the organ with the strongest fluorescence intensity is known in the first imaging, and it is determined as a blocking target.
  • the blocking control unit 24 inputs what is to be blocked from the input unit 32.
  • the blocking control unit 24 reads the data in Table 2 and determines (inputs) the blocking range for the blocking target.
  • the blocking control unit 24 controls the operation of the electric sliders 48A to 48D based on the blocking range, and moves the blocking plates 46A to 46D to a predetermined position.
  • the fluorescence from the organ having the strongest fluorescence signal in the entire image range is substantially blocked, and the weakness from the organ other than the organ to be blocked at the time of the second fluorescence image capturing (FIG. 2 (4)). It becomes possible to detect the fluorescence.
  • the third fluorescence image capturing is performed in a state where all of the fluorescence images having the strongest intensity in each of the previous fluorescence image capturings are substantially blocked.
  • ICG Indocyanine Green
  • a sample in which two tubes 52A and 52B were installed was prepared as a sample. Both tubes 52A and 52B are not located at the center of the column of the phantom 50, but at a depth of 6 mm from a certain peripheral surface, and the distance between the tubes 52A and 52B is about 10 mm.
  • the ICG concentration is 5 ppm for tube 52A and 0.5 ppm for tube 52B.
  • the fluorescence image of the tube 52A is located at a depth of 6 to 7 mm from the peripheral surface on the two-dimensional detector side as shown in FIG. Has been reconfigured.
  • the density difference is only about one digit, and the fluorescent image of the tube 52B is also reconstructed at a density of about 1/10.
  • the fluorescence blocking range was calculated from a table in which the position information and the blocking range created in advance were associated with each other. Table 1 was used as this correspondence table. Since the fluorescence image from the tube 52A was reconstructed at a depth of 6 to 7 mm from the phantom peripheral surface on the two-dimensional detector side, a depth of 5.8 mm was obtained from the data in Table 1 as a blocking range corresponding to 7 mm. It was adopted.
  • the blocking mechanism 22C is operated as shown in FIG. 12A to substantially block the fluorescence from the tube 52A from entering the two-dimensional detector.
  • FIG. 12B shows a fluorescence image acquired again in this state.
  • the detection sensitivity of the two-dimensional detector can be increased by substantially blocking the fluorescence from the tube 52A, and the weak fluorescence from the tube 52B is detected with good contrast as shown in FIG. (Arrows in FIG. 12B).
  • FIG. 14 shows the fluorescent images obtained as shown in FIGS. 10 and 12 on the same screen using two different colors.
  • the image was displayed after contrast enhancement (intensity below a certain threshold was cut).
  • FIG. 15 shows the reconstructed fluorescence results obtained as shown in FIGS. 11 and 13 on the same screen using two different colors. By using the reconstructed fluorescence result, noise due to excitation light or the like can be removed.

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Abstract

　蛍光画像取得方法は以下のステップ（Ａ）から（Ｄ）を含む。（Ａ）試料から離れた位置から、広がる光束の励起光で試料を照射して試料中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させ、発生した蛍光を二次元検出器で検出して蛍光画像を得るステップ、（Ｂ）前記二次元検出器により蛍光を検出しようとする時点において最も強い蛍光を発する部分からの蛍光が前記二次元検出器に入射するのを実質的に遮断した状態で、前記ステップ（Ａ）と同様に試料に励起光を照射して前記二次元検出器により蛍光画像を得る少なくとも１つのステップ、（Ｃ）ステップ（Ａ）で得た蛍光画像とステップ（Ｂ）で得た少なくとも１つの蛍光画像からなる少なくとも２つの蛍光画像を１つの画像に統合するステップ、及び（Ｄ）ステップ（Ｃ）で統合された画像を表示するステップ。

Description

蛍光画像取得装置
　本発明は試料中の蛍光物質を画像として取得する装置と方法に関し、例えば、小動物などの生体試料を対象とする生体内の蛍光画像を取得する装置と方法に関する。
　蛍光画像取得装置には大きく分けて２つのシステムが存在する。
　１つは、（Ａ）走査型蛍光画像取得装置である。この装置では、十分に集光された励起光を観察対象である試料の１点から照射して試料内に存在する蛍光物質を励起し、その蛍光物質から発生する蛍光を受光することにより蛍光画像を取得する。その照射点が試料全域に及ぶように走査することで試料全体の蛍光画像を得る（特許文献１，２参照。）。また、得られた各蛍光画像データから蛍光物質の位置を推定する断層画像化の機能をもつ装置も存在する。
　走査型蛍光画像取得装置の特徴として、観察領域を指定できることが挙げられる。例えば、生体試料の脳を観察したい場合、脳領域のみを走査点として設定すれば、脳以外からのバックグランド蛍光を除去することができ、十分なダイナミックレンジを得ることができる。しかしながら、in vivo観察においてこのようなバックグランド蛍光も重要な情報をもつ場合がある。例えば薬物代謝評価を行う場合、対象領域以外で薬剤が集積してしまうとそれが薬の副作用として影響するおそれがある。このため、まずは生体全体を走査することが必要となるが、走査型装置では観察対象全域の走査に膨大な時間がかかる。
　もう１つは、（Ｂ）全照射型蛍光取得装置である。この装置では、励起光で試料の広域を同時に照射して広域の蛍光画像を一度に得る（特許文献３参照。）。また、データ数は少ないものの、得られた各蛍光画像データから蛍光物質の位置を推定する断層画像化の機能をもつ装置も存在する。
　全照射型蛍光取得装置の特徴として、走査型の欠点であった観察対象全域の蛍光画像を短時間で取得できる点が挙げられる。例えば、マウスを利用した薬物スクリーニングや手術中のモニタリング等を目的とした使用方法においては短時間に蛍光画像を得ることが期待できる。しかしながら、全域観察においてはバックグランド蛍光の影響によって十分なダイナミックレンジを得ることができない場合がある。例えば抗体医薬品の評価を行う場合、目的とする対象以外への集積（特に肝臓集積）によって対象領域の微弱な蛍光が検出できない場合がある。また、例えばＩＣＧ（Indo Cyanine Green）を利用したリンパ節観察の場合、ＩＣＧを注入した箇所で蛍光強度が極めて強くなるため、リンパ節末端の微弱な蛍光が検出できない場合がある。
　このため、（Ｃ）全照射型に励起光の強度分布を与えてダイナミックレンジを広くする方法が考えられている（特許文献４参照。）。この方法は蛍光物質の深さ方向を考慮しない場合（ＤＮＡ検出など）においては有効であるが、マウスやヒト等の生体計測においては、媒体の深さ方向によって励起条件を変えていく必要があるので、（Ｃ）の方法を単純に転用できない。また、励起される箇所によって励起光を弱めたとしてもその箇所の蛍光物質の量が多ければ蛍光強度が大きくなってしまうため、蛍光検出側にも何らかの処理機構が必要となる。
　なお、蛍光二次元検出器にハレーションを起こさない機構を取り付けることも考えられるが、この場合、蛍光強度の線形性が担保できないために定量性解析等に問題が生じる。
米国特許第６６１５０６３号 米国特許出願公開第２０１２／００１７８４２号 米国特許第８３４５９４１号 米国特許第７３０７２６１号 米国特許出願公開第２０１１／０１９９５００号
　前述のように、走査型は広いダイナミックレンジを確保することができるが観察時間が極めて長くなり、一方、全照射型は短時間・連続時間観察が可能であるがダイナミックレンジが狭く、また相対的に微弱な蛍光が検出できない、といった問題点が挙げられる。
　本発明は生体の蛍光画像を取得する場合に限らず、生体以外の試料を対象として蛍光画像を取得する場合も含み、観察対象全域の蛍光物質の画像を広いダイナミックレンジで効率よく取得することを目的とする。
　本発明の蛍光画像取得装置は、試料への励起光による照射を全照射型とするため、試料台と、試料台に置かれた試料を、試料から離れた位置から、広がる光束の励起光で照射し試料中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させる励起光源と、試料からの蛍光を検出する二次元検出器を備えた撮像部と、撮像部が取得した蛍光画像に基づく画像を表示する表示装置とを備えている。
　本発明の蛍光画像取得装置は、さらに、試料と前記二次元検出器との間に配置され、試料からの蛍光の一部が前記二次元検出器に入射するのを遮断する遮断機構と、前記撮像部により撮像しようとする時点において試料からの最も強い蛍光が前記二次元検出器に入射するのを実質的に遮断するように前記遮断機構を制御する遮断制御部と、前記遮断機構によって試料の一部が遮断された状態で前記撮像部が得た少なくとも１つの蛍光画像を含む少なくとも２つの蛍光画像を１つの画像に統合するように計算処理する画像統合部とを備えている。そして、前記表示装置は、前記画像統合部が得た統合画像を表示するように構成されている。
　ここで、遮断制御部が二次元検出器に入射する最も強い蛍光を実質的に遮断するときの「実質的に遮断する」とは、最も強い蛍光の次に強い蛍光が検出できるようになる程度にまで、最も強い蛍光を遮断することを意味する。実質的に遮断することの一例として、後で図７を用いて説明する例では、遮断部分以外の領域のダイナミックレンジを５倍に高めて微弱な蛍光の検出を可能にするために、最も強い蛍光の強度を約１／５に減衰させている。その場合の約１／５に減衰させることは、実質的に遮断することに相当する。減衰率は特に限定されるものではなく、１／５よりも大きくても小さくてよい。もちろん、１００％遮断する場合も含む。
　本発明の蛍光画像取得方法は以下のステップ（Ａ）から（Ｄ）を含む。
　（Ａ）試料から離れた位置から、広がる光束の励起光で試料を照射して試料中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させ、発生した蛍光を二次元検出器で検出して蛍光画像を得るステップ、
　（Ｂ）前記二次元検出器により蛍光を検出しようとする時点において最も強い蛍光を発する部分からの蛍光が前記二次元検出器に入射するのを実質的に遮断した状態で、前記ステップ（Ａ）と同様に試料に励起光を照射して前記二次元検出器により蛍光画像を得る少なくとも１つのステップ、
　（Ｃ）ステップ（Ａ）で得た蛍光画像とステップ（Ｂ）で得た少なくとも１つの蛍光画像からなる少なくとも２つの蛍光画像を１つの画像に統合するステップ、及び
　（Ｄ）ステップ（Ｃ）で統合された画像を表示するステップ。
　ステップ（Ａ）では試料の観察対象全域での蛍光画像を取得する。観察対象全域は試料全体のこともあるし、試料の一部のこともある。この場合、試料中の蛍光物質からの蛍光は二次元検出器のダイナミックレンジに依存して検出される。
　ステップ（Ｂ）では、試料内部での蛍光物質の位置情報に基づいて、蛍光を物理的に遮断する遮断機構を作動させて試料からの最も強い蛍光を実質的に遮断する。試料内部での蛍光物質の位置情報は、例えば蛍光画像から生体内部情報を求める計算処理部によって、又は入力された試料内部情報に基づいて得ることができる。最も強い蛍光を遮断するには、最も強い蛍光を発生する蛍光物質に励起光が照射されないように励起光を遮断してもよく、又は最も強い蛍光を発生する蛍光物質に励起光が照射されて蛍光が発生してもその蛍光が二次元検出器に入射しないようにその蛍光を遮断してもよい。そして、このように撮像時点の試料からの最も強い蛍光を実質的に遮断した状態で蛍光画像を取得する。このとき、最も強い蛍光物質からの蛍光は実質的に遮断されているため、その次に蛍光強度の強い蛍光物質からの蛍光が検出されることになる。この検出は、ステップ（Ａ）での撮像条件に比べて、二次元検出器の露光時間を長くするなどの方法により、感度を上げて行う。
　さらにステップ（Ｂ）の処理を必要に応じて繰り返す。２回目のステップ（Ｂ）では、ステップ（Ａ）で検出される蛍光はすでに実質的に遮断されているので、１回目のステップ（Ｂ）で検出される蛍光が２回目のステップ（Ｂ）での最も強い蛍光となる。２回目のステップ（Ｂ）での検出は、１回目のステップ（Ｂ）での撮像条件に比べて、二次元検出器の露光時間を長くするなどの方法により、感度を上げて行う。３回目以上のステップ（Ｂ）を行う場合も同様である。
　このように、二次元検出器の撮像条件（露光時間等）を各ステップ毎に変えていくことで最終的にダイナミックレンジを拡げることができ、強い蛍光から微弱な蛍光まで線形性を担保したまま蛍光検出できるようになる。ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）を含む処理はせいぜい２～５回程度の繰り返しであるため、走査型で全領域を撮像するよりも短時間ですみ、格段に効率的なプロセスである。
　本発明は、撮像時点の試料からの最も強い蛍光が二次元検出器に入射するのを実質的に遮断した状態で撮像部が得た蛍光画像を含む少なくとも２つの蛍光画像を１つの画像に統合する。これにより、全照射型に比べて観察対象全域の蛍光を広いダイナミックレンジで検出することができ、かつ走査型に比べて観察対象全域の蛍光を短時間で検出することができるので、効率がよくなる。例えば、生体内の複数個所に蛍光物質が集積する場合や、強い蛍光に隠れて見逃すことの多い微弱な蛍光を検出する際に特に有用である。
蛍光画像取得装置の一実施形態を示すブロック図である。 一実施形態の動作の一例を示すフローチャートである。 一実施形態の動作の一例を示す概要図であり、（Ａ）は観察対象全域での蛍光画像を取得する状態を示し、（Ｂ）は特定の場所からの蛍光が二次元検出器に実質的に入射しないように遮断した状態で蛍光画像を取得する状態を示している。 遮断機構の第１の具体例を示す図である。 遮断機構の第２の具体例を示す図である。 遮断機構によって遮断する範囲を決定する方法を説明する図であり、（Ａ）は生体内に設置された蛍光物質と蛍光を示す断面図、（Ｂ）は生体試料表面で検出される蛍光強度のプロファイルを示す図である。 図６（Ｂ）のプロファイルを距離２０ｍｍでの蛍光強度が１となるように規格化した蛍光強度のプロファイルを示す図である。 図４に示される遮断機構の動作の一例を示すフローチャートである。 図５に示される遮断機構の動作の一例を示すフローチャートである。 円筒型ファントムの観察対象全域の蛍光検出を示す図であり、（Ａ）はファントムとそれに埋め込まれた蛍光物質入りチューブを示す図、（Ｂ）は観察対象全域の蛍光画像を示す画像である。 図１０（Ｂ）の蛍光画像データに基づいて再構成された蛍光画像を示す縦断面図（左）と横断面図（右）である。 同円筒型ファントムの一部を遮断した状態での蛍光検出を示す図であり、（Ａ）はファントムとその一部を覆う遮断機構を示す斜視図、（Ｂ）は検出された蛍光画像を示す画像である。 図１２（Ｂ）の蛍光画像データに基づいて再構成された蛍光画像を示す縦断面図（左）と横断面図（右）である。 図１０、１２の蛍光画像を異なる２色を用いて同じ画面上に表示する方法を示す図である。 図１１、１３の蛍光画像を異なる２色を用いて同じ画面上に表示する方法を示す図である。
　蛍光画像取得装置の一実施形態を図１に示す。
　試料台１０上に測定対象の試料１２が載せられる。試料１２は特に限定されるものではないが、例えばマウス等の小動物のような生体試料である。励起光源１４は試料台１０に置かれた試料１２を、試料１２から離れた位置から、広がる光束の励起光１６で照射し試料１２中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させる励起光源を備えている。励起光源としては、必要な励起波長の励起光を発光するＬＤ（レーザダイオード）やＬＥＤ（発光ダイオード）のほか、ハロゲンランプなどのランプ類を用いることができる。励起光源１４には、検出しようとする蛍光波長の光を除去する励起側干渉フィルタを励起光源に組み合わせて使用するのが好ましい。
　励起光源１４は、さらに、好ましい実施形態として三次元分布計算処理部を備えている場合には、撮像された外観画像から順問題解析処理と逆問題解析処理で使用する三次元表面形状データを得るために、試料を照明して試料の外観画像を撮像するための白色ＬＥＤなどの照明用光源も備えている。
　撮像部１８は試料１２からの蛍光を検出する二次元検出器２０を備えている。二次元検出器２０は例えばＣＣＤ（電荷結合素子）である。撮像部１８は試料１２からの蛍光を二次元検出器２０に導くための集光レンズ等の光学系と、励起光成分が二次元検出器２０に入射するのを防ぐために励起光成分を除去し検出しようとする蛍光を透過させる蛍光側干渉フィルタも含んでいる。
　試料１２の所定の箇所からの蛍光が二次元検出器２０に入射するのを遮断するために、遮断機構２２が設けられている。遮断機構２２の具体的な例は後述するが、遮断制御部２４からの電気制御によって自動動作する機構を備えているのが好ましい。遮断制御部２４は遮断機構２２が撮像時点において試料１２からの最も強い蛍光が二次元検出器２０に入射するのを実質的に遮断するように遮断機構２２を制御する。
　画像統合部２６は遮断機構２２によって試料１２の一部が遮断された状態で撮像部１８が得た蛍光画像を含む少なくとも２つの蛍光画像を１つの画像に統合するように計算処理する。表示装置２８は画像統合部２６が得た統合画像を表示する。表示装置２８は、特に限定するものではないが、例えば液晶表示装置である。表示装置２８は、統合画像を強度範囲毎に異なる色彩で表示するように構成されているのが好ましい。
　遮断制御部２４は、試料内部情報に基づいて、撮像時点の試料１２からの最も強い蛍光が二次元検出器２０に入射するのを実質的に遮断するように遮断機構２２を制御する。そのための試料内部情報を得るために、一実施形態では、撮像部１８が得た蛍光画像データから試料内部情報を得る三次元分布計算処理部３０を備えている。その場合は、遮断制御部２４は、三次元分布計算処理部３０が得た試料内部情報に基づいて遮断機構２２を制御する。
　遮断制御部２４が遮断機構２２を制御するための試料内部情報を得るために、他の実施形態では、検出対象である試料の内部情報を入力する試料内部情報入力部３２をさらに備えいる。その場合は、遮断制御部２４は、入力部３２から入力された試料内部情報に基づいて遮断機構２２を制御する。
　三次元分布計算処理部３０を備えている場合、画像統合部２６は三次元分布計算処理部３０により再構成された蛍光画像を統合するように構成されていてもよい。
　遮断制御部２４、画像統合部２６及び三次元分布計算処理部３０はコンピュータ３４により実現される。コンピュータ３４はこの蛍光画像取得装置の専用コンピュータ又はパーソナルコンピュータである。入力部３２はコンピュータ３４にデータを入力するキーボードやマウスを含む入力装置である。
　図２と図３を参照して、一実施形態の動作の一例を説明する。
（手順１）（図２（１））
　まず始めに、励起光源１４からの励起光１６で試料１２の観察対象全域を照射し、撮像部１８の二次元検出器２０により観察対象全域での蛍光画像を取得する（図３（Ａ））。観察対象全域は必ずし試料全体でなくてもよく、試料の観察しようとする一部であってもよい。試料は特に限定されるものではないが、例えば生体試料とする。この処理では、最も蛍光強度の強い場所が感度よく検出される。図３（Ａ）の例では、記号ａで示される場所が蛍光強度の最も強い場所であり、その場所からの蛍光が感度よく検出される。一方、その場所ａからの蛍光を検出する条件で別の箇所ｂの微弱な蛍光まで感度よく撮像しようとすると、二次元検出器の検出感度を上げなければならないため、二次元検出器のダイナミックレンジが足りずに場所ａからの強い蛍光によってハレーションを起こす状況が発生する。
（手順２）（図２（２））
　次に、前述の処理で得た蛍光画像データを元に、三次元分布計算処理部３０により生体内部情報を求める。生体内部情報を求める処理手順の具体例として、順問題解析と逆問題解析から断層画像を計算する方法や、異なる波長から深部情報を導き出す方法（特許文献５参照。）等がある。また、皮下の血管やリンパ節など集積箇所が予め判明している場合については、三次元分布計算処理部３０により生体内部情報を求めるのに代えて、試料内部情報入力部３２から生体内部情報を入力するようにしてもよい。
　ここで、生体内部情報を求める処理手順の一例として、順問題解析と逆問題解析から断層画像を計算する方法について、その処理手順を説明する。順問題解析は、任意の方向から励起光を生体試料へ照射した場合に励起光が生体内部を伝搬する過程、及び生体内部の任意の位置に蛍光物質が存在した場合に蛍光が生体内部を伝搬する過程から成り立つ。それぞれの過程は次に示す光拡散方程式（１）、（２）によって計算することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
ここで、
　　Ｄ：拡散定数、
　　μａ：吸収係数、
　　φex(j)：ｊ番目の方向から励起光を与えた場合の位置ｒにおける励起光フルエンスレート、
　　φem(k)：ｋ番目の位置に蛍光物質が存在した場合の位置ｒにおける蛍光フルエンスレート、
　　ε：モル吸光係数、
　　γ：量子収率、
　　Ｍ：モル濃度、
　　Ｓ（ｊ）：j番目の位置における励起光強度、
を表す。
　（１）式と（２）式から励起・蛍光伝搬の理論値を求めることができ、この計算結果を元にシステム行列Ａを作成する。システム行列Ａとは、蛍光物質の空間分布ｆを与えた場合に生体表面で検出される蛍光分布の理論値を得るための行列である。具体的には、システム行列の列ベクトルｖは、任意の位置における生体表面で検出される蛍光分布の理論値であり、この列ベクトルをｋ番目の位置までそれぞれ求めたのがシステム行列である。
ｇ＝Ａｆ　　　　　（３）
Ａ＝［ｖ（１），ｖ（２），…，ｖ（ｋ）］　　　　（４）
ここで、
　　Ａ：システム行列、
　　ｆ：蛍光物質の空間分布ベクトル、
　　ｇ：生体表面での蛍光分布ベクトル、
を表す。例えば、蛍光物質の空間分布ｆ＝［０　０　０.５　１　０.５　０　…　０］Tが与えられた場合、このベクトルにシステム行列を掛けると（Ａｆ）、生体表面での蛍光分布ベクトルが得られる。［Ａ　Ｂ　Ｃ］Tは転置行列である。
　逆問題解析での演算は、装置で得られた蛍光検出データと順問題解析で計算した理論値から蛍光物質の空間分布を求める過程から成り立つ。まず、順問題解析によって（３）式におけるシステム行列Ａを求めることができる。一方、蛍光生体画像取得装置によって（４）式における生体表面での蛍光分布ベクトルgを得ることができる。逆問題解析では、順問題解析で求められたシステム行列Ａと生体表面での蛍光分布ベクトルgから、未知の蛍光物質の空間分布ベクトルfを求める。ベクトルfの求め方の一般的な方法は最小二乗法であり、以下の（５）式の評価関数を最小化することで求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　一方、今回対象とする問題では、光の吸収・散乱によって測定ノイズの影響が強くなるため、（５）式の最小化問題では解が発散する可能性が高い。そこで、ノイズによる発散を防ぐ目的で以下の(６)式の最小化問題を考える。この最小化問題（チホノフ正則化）は逆問題の研究分野で一般的に利用されており、ベクトルfのノルムを評価関数に組み入れることで解の発散を防ぐことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
ここで、
　　λ：正則化パラメータ、
を表す。このようにして、生体内部情報を求めることができ、生体内部での蛍光物質の画像を再構成することができる。
（手順３）（図２（３））
　手順２によって蛍光物質のある場所ａの生体内部での位置情報が得られるので、遮断制御部２４はこの情報に基づいて場所ａに対して蛍光を物理的に遮断する遮断機構２２を作動させて場所ａからの蛍光を除去する（図３Ｂ）。場所ａからの蛍光が二次元検出器２０に入射しないように遮断するには、励起光が場所ａの蛍光物質に入射しないように遮断機構２２で励起光の一部を遮断するか、又は仮に励起光が場所ａの蛍光物質に入射しても場所ａの蛍光物質から発生する蛍光が二次元検出器２０に入射しないように遮断機構２２で蛍光を遮断する。
（手順４）（図２（４））
　手順３によって、場所ａからの蛍光が二次元検出器２０に実質的に入射しないように限定された観測範囲に対して、再度蛍光画像を取得する（図３Ｂ）。このとき、場所ｂからの蛍光が十分検出できるよう、二次元検出器２０の取得条件を変えて撮像を行う。
　さらに、図３Ｂに記号ｃで示されるようなさらに微弱な蛍光が検出される場合に、その蛍光画像も検出するときも手順２～４を繰り返す。さらに微弱な蛍光を検出するときも同様である。
（手順５）（図２（５））
　得られた複数の蛍光画像データに対して画像データを統合する。画像データの統合の際、二次元検出器２０の取得条件を揃えた上で画像データを統合する。統合する画像データは、二次元検出器２０が取得した蛍光画像データであってもよく、手順２で再構成された蛍光画像データであってもよい。
（手順６）（図２（６））
　手順５で得たデータを、表示部２８に表示する。観察時にダイナミックレンジを拡げて測定することができたとしても、表示の際に表示部２８のダイナミックレンジが不足する可能性もある。そのため、表示については統合画像に対して、（ａ）表示範囲を任意に設定した上で表示する、（ｂ）対数表示する、（ｃ）蛍光強度をいくつかの範囲に分割して異なる色彩で表示する、といった方法で実施する。
　次に、蛍光の遮断機構２２の具体例を説明する。
　図４は、マウスのような小さい生体からなる試料の周囲に設置する遮断機構２２Ａの例である。直径が７０ｍｍ程度の円筒型遮断板４２Ａ，４２Ｂが生体試料１２の長手方向の前後の両側２ヶ所に設置されている。生体試料１２の長手方向とは、生体の頭部から尾部を結ぶ直線の方向である。遮断板４２Ａ，４２Ｂは生体試料１２の長手方向に沿って移動できるように、それぞれの電動スライダ４４Ａ，４４Ｂに支持されている。遮断板４２Ａ，４２Ｂの材質はアルミニウムやプラスチック等の軽量なものが好ましく、表面が黒色に塗装されていて光反射をなるべく抑えたものであることが好ましい。遮断板４２Ａ，４２Ｂは、遮断制御部２４からの指示により電動スライダ４４Ａ，４４Ｂによって駆動され、任意の領域まで移動して光遮断を行う。
　図５は、励起光源１４及び二次元蛍光検出器２０と、試料１２の間に配置される遮断機構２２Ｂの例である。この例では、二次元蛍光検出器２０の手前に２つの励起光源１４が配置されている。励起光源１４の数は１つでもよく、３つ以上でもよい。励起光源１４は試料（図示されていない）に対して広い角度にわたって励起光１６を照射する。遮断機構２２Ｂは励起光源１４及び二次元蛍光検出器２０の設置位置と試料との間に配置されている。遮断機構２２Ｂは励起光源１４からの励起光１６の一部が試料に照射されるのを遮断するとともに、試料からの蛍光の一部が二次元蛍光検出器２０に入射するのを遮断する。
　遮断機構２２Ｂは同一平面内に配置された４枚の遮断板４６Ａ～４６Ｄを備え、それらの遮断板４６Ａ～４６Ｄはそれぞれの電動スライダ４８Ａ～４８Ｄによって互いに独立して移動するように支持されている。遮断板４６Ａ～４６Ｄの材質はアルミニウムやプラスチック等の軽量なものが好ましく、表面が黒色に塗装されていて光反射をなるべく抑えたものであることが好ましい。遮断板４６Ａ～４６Ｄは、遮断制御部２４からの指示により電動スライダ４８Ａ～４８Ｄによって駆動され、任意の領域まで移動して光遮断を行う。
　蛍光物質の生体内部での位置情報に対応して、励起・蛍光を物理的に遮断する遮断機構を動作させることが好ましい。その際、例えば、二次元検出器２０からみて生体内部の浅い位置に最も強い蛍光を発する蛍光物質がある場合は、蛍光が生体内部を透過する際の散乱による影響が小さいため、その蛍光を除去するための遮断範囲を狭めることができる。一方、二次元検出器２０からみて生体内部の深い位置にその蛍光物質がある場合は、蛍光が生体内部を透過する際の散乱による影響が大きいため、その蛍光を除去するための遮断範囲を拡げる必要がある。このようにして、生体計測において問題となる散乱問題を考慮しつつ、最適な撮像条件を与えることができる。
　遮断機構２２によって遮断する範囲は、例えば以下のように決定する。
　まず、生体内部の蛍光物質から発せられる蛍光が生体試料表面でどの程度広がって検出されるかのシミュレーションを実施する。例を図６に示す。図６（Ａ）に示すように、直径１ｍｍの光源を生体内部（吸収係数０．０２［／ｍｍ］、散乱係数１０［／ｍｍ］）に設置するものとする。図６（Ｂ）は、その設置する深さを異ならせた場合に、生体試料表面で検出される蛍光強度のプロファイルを示している。このプロファイルは光拡散方程式（１）、（２）によって計算することができる。
　図６（Ｂ）から、距離２０ｍｍでの蛍光強度が１となるように規格化した蛍光強度のプロファイルを図７に示す。図７より、生体試料内部の蛍光がどの程度散乱されて表面で拡がって検出されるかについての指標を得ることができる。図７から得た情報に基づき、蛍光を遮断すべき範囲を決定する。例えば、蛍光物質が二次元検出器２０からみて生体試料の深さ２ｍｍの場所に存在した場合、蛍光強度のピーク地点から３ｍｍ程度の範囲を遮断すれば、この蛍光物質由来の蛍光を約１／５に減衰できる。この遮断によって、遮断部分以外の領域のダイナミックレンジを約５倍に高めることができるようになり、微弱光であっても検出できるようになる。１／５の減衰は実質的な遮断の一例を示す。
　図７から得た知見に基づき、位置情報と遮断範囲を対応付けした表を予め作成してコンピュータ３４に保持しておけば、遮断制御部２４は遮断範囲を効率よく指定できる。また、肝臓などの各臓器や皮下の血管やリンパ節など、蛍光物質の集積箇所が予め判明している場合については、生体試料内での蛍光物質の位置情報が予めわかっているので、図７のようなシミュレーションを一度実施しておけば、予め遮断する範囲を入力部３２からコンピュータ３４に入力して保持することができる。
　以上の遮断機構の動作の一例を示す。遮断機構２２が図４に示される遮断機構２２Ａである場合について図８により説明する。この遮断機構２２Ａは試料がマウスのような小さい生体が測定対象の場合に適する。コンピュータ３４は深さに対する遮断範囲の対応表を保持しておく。その対応表の一例は表１に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この対応表は、遮断により二次元検出器２０に入射する蛍光の光減衰が１／５になるように予め計算によって求められている。二次元検出器２０に入射する蛍光の光減衰の度合いは、その蛍光の次に強い強度をもつ蛍光が検出できるように実質的に遮断するための度合いであり、必要に応じて変えることができる。
　遮断機構２２Ａを使用しないで、観察対象の全領域からの蛍光画像を検出する１回目の撮像はすでに行われているものとする。
　２回目の蛍光画像撮像にあたり、遮断制御部２４は、図８に示されるように、三次元分布計算処理部３０からの構成処理（図２（２））による蛍光物質の深さ情報を入力する。表１のデータを読み出し、深さ情報を基にしてから遮断範囲を決定（入力）する。遮断制御部２４はその遮断範囲に基づいて電動スライダ２３Ａ，２３Ｂの動作を制御して遮断板４２Ａ，４２Ｂを所定の位置まで移動させる。その結果、全画像範囲で最も蛍光信号が強かった箇所箇所からの蛍光の約８０％が遮断されて、２回目の蛍光画像撮像時（図２（４））では微弱な蛍光を検出することができるようになる。３回目以降の蛍光画像撮像は、それまでの蛍光画像撮像のそれぞれで最も強度の強かった蛍光画像の全てを実質的に遮断した状態で行う。
　遮断機構２２が図５に示される遮断機構２２Ｂの動作も同様に制御することができる。
　リンパ節、血管又は心臓というような生体臓器が検出対象の場合は図５に示される遮断機構２２Ｂが適する。コンピュータ３４は深さに対する遮断範囲の対応表を保持しておく。対応表は例えば表２で示されるものであり、リンパ節、血管及び心臓のそれぞれの位置も、二次元検出器からみて試料表面から何ｍｍの深さにあるかが予めわかっているので、それぞれの深さに対して遮断範囲をいくらにするかが予め求められている。この対応表も、遮断により二次元検出器２０に入射する蛍光の光減衰が１／５になるように予め計算によって求められたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　遮断機構２２Ｂを使用しないで、観察対象の全領域からの蛍光画像を検出する１回目の撮像はすでに行われているものとする。
　２回目の蛍光画像撮像にあたり、１回目の撮像で最も蛍光強度の強かった臓器が何であるかがわかるので、それを遮断対象とする。遮断制御部２４は、図９に示されるように、入力部３２から遮断対象が何であるかを入力する。遮断制御部２４は表２のデータを読み出し、遮断対象に対する遮断範囲を決定（入力）する。遮断制御部２４はその遮断範囲に基づいて電動スライダ４８Ａ～４８Ｄの動作を制御して遮断板４６Ａ～４６Ｄを所定の位置まで移動させる。その結果、全画像範囲で最も蛍光信号が強かった臓器からの蛍光が実質的に遮断されて、２回目の蛍光画像撮像時（図２（４））では遮断対象の臓器以外の臓器からの微弱な蛍光を検出することができるようになる。３回目の蛍光画像撮像は、それまでの蛍光画像撮像のそれぞれで最も強度の強かった蛍光画像の全てを実質的に遮断した状態で行う。
（検証結果）
　本発明を円筒型ファントムで検証した結果を以下に示す。
　図１０（Ａ）に示されるように、直径２５ｍｍの円筒型ファントム５０（吸収係数０．０２［／ｍｍ］、散乱係数１０［／ｍｍ］）に、濃度が１桁異なるＩＣＧ（インドシアニン・グリーン）入りの２つのチューブ５２Ａと５２Ｂを設置したものを試料として用意した。両チューブ５２Ａ，５２Ｂはファントム５０の円柱の中心部ではなく、ある周面から６ｍｍの深さの場所とし、両チューブ５２Ａ，５２Ｂ間の距離を１０ｍｍ程度とした。ＩＣＧ濃度はチューブ５２Ａが５ｐｐｍ、チューブ５２Ｂが０．５ｐｐｍである。
　この条件で観察対象全域の蛍光画像を取得すると、図１０（Ｂ）に示されるように、チューブ５２Ａ由来の蛍光が観察された。チューブ５２Ｂ由来の蛍光も微弱ではあるが観察された。図１０（Ｂ）の数値は蛍光検出強度を表わし、例えば「５ｅ＋２」は「５×１０2」を意味する。図１２、図１４においても同様である。
　次に、図１０（Ｂ）の蛍光画像データを利用して、内部情報を計算すると、図１１のように二次元検出器側の周面から深さ６～７ｍｍの場所にチューブ５２Ａの蛍光画像が再構成された。なお、今回の計算では、１桁程度しか濃度差がないということもあって、チューブ５２Ｂの蛍光画像ついても１／１０程度の濃度で再構成された。
　次に、図１１の生体内部情報を元に、予め作成しておいた位置情報と遮断範囲を対応付けした表から蛍光の遮断範囲を算出した。この対応表として表１を使用した。チューブ５２Ａからの蛍光画像は二次元検出器側のファントム周面から深さ６～７ｍｍの場所に再構成されたので、深さを７ｍｍに該当する遮断範囲として、表１のデータから５．８ｍｍを採用した。
　次に、表１から得た情報を基に、図１２（Ａ）のように遮断機構２２Ｃを動作させてチューブ５２Ａからの蛍光が二次元検出器に入射するのを実質的に遮断し、その状態で再度蛍光画像を取得したのが図１２（Ｂ）である。図１０（Ｂ）の結果結果ではチューブ５２Ａからの強い蛍光に阻害されてチューブ５２Ｂからの蛍光画像を鮮明に検出することが難しかった。しかし、チューブ５２Ａからの蛍光を実質的に遮断したことによって二次元検出器の検出感度を上げることができ、図１２（Ｂ）に示されるように、チューブ５２Ｂからの微弱蛍光がコントラストよく検出された（図１２（Ｂ）中の矢印）。
　次に、図１２（Ｂ）の蛍光画像データを利用して、内部情報を計算すると、図１３のように二次元検出器側のファントム周面から深さ６～７ｍｍの場所にチューブ５２Ｂからの蛍光画像が再構成された。
　最後に、図１０～１３のように得た蛍光観察結果および生体内部情報の計算結果を、一つの画像上に統合して表示した。
　図１４は、図１０、１２のように得られた蛍光画像を異なる２色を用いて同じ画面上に表示したものである。表示にあたり、ファントム表面での蛍光画像は散乱の影響で拡がっているため、コントラスト強調（ある閾値以下の強度はカット）を実施した上で画像を表示した。
　図１５は、図１１、１３のように得られた再構成された蛍光結果を異なる２色を用いて同じ画面上に表示したものである。再構成された蛍光結果を用いることにより、励起光などによるノイズを除去することができる。
　　１０　　　試料台
　　１２　　　試料
　　１４　　　励起光源
　　１６　　　励起光
　　１８　　　撮像部
　　２０　　　二次元検出器
　　２２，２２Ａ，２２Ｂ，２２Ｃ　　　遮断機構
　　２４　　　遮断制御部
　　２６　　　画像統合部
　　２８　　　表示装置
　　３０　　　三次元分布計算処理部
　　３４　　　コンピュータ

Claims (13)

  1. 　試料台と、
    　前記試料台に置かれた試料を、試料から離れた位置から、広がる光束の励起光で照射し試料中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させる励起光源と、
    　試料からの蛍光を検出する二次元検出器を備えた撮像部と、
    　試料と前記二次元検出器との間に配置され、試料からの蛍光の一部が前記二次元検出器に入射するのを遮断する遮断機構と、
    　前記撮像部により撮像しようとする時点において試料からの最も強い蛍光が前記二次元検出器に入射するのを実質的に遮断するように前記遮断機構を制御する遮断制御部と、
    　前記遮断機構によって試料の一部が遮断された状態で前記撮像部が得た少なくとも１つの蛍光画像を含む少なくとも２つの蛍光画像を１つの画像に統合するように計算処理する画像統合部と、
    　前記画像統合部が得た統合画像を表示する表示装置と、
    を備えた蛍光画像取得装置。
  2. 　前記撮像部が得た蛍光画像データから試料内部を計算して蛍光画像を再構成する三次元分布計算処理部をさらに備え、
    　前記画像統合部は前記三次元分布計算処理部により再構成された蛍光画像を統合するように構成されている請求項１に記載の蛍光画像取得装置。
  3. 　前記遮断制御部は、前記三次元分布計算処理部により再構成された蛍光画像に基づいて、最も強い蛍光が前記二次元検出器に入射するのを実質的に遮断するように前記遮断機構を制御するように構成されている請求項２に記載の蛍光画像取得装置。
  4. 　試料の内部情報を入力する入力部をさらに備え、
    　前記遮断制御部は、前記入力部から入力された試料内部情報に基づいて、最も強い蛍光が前記二次元検出器に入射するのを遮断するように前記遮断機構を制御するように構成されている請求項１又は２に記載の蛍光画像取得装置。
  5. 　前記遮断制御部は、蛍光を受光する方向から見たときの蛍光物質の試料内部での深さに応じて遮断範囲を変化させるように前記遮断機構を制御するように構成されている請求項１から４のいずれか一項に記載の蛍光画像取得装置。
  6. 　前記遮断機構は、前記遮断制御部からの電気制御によって自動動作する機構を備えている請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光画像取得装置。
  7. 　前記表示装置は、統合画像を強度範囲毎に異なる色彩で表示するように構成されている請求項１から６のいずれか一項に記載の蛍光画像取得装置。
  8. 　以下のステップ（Ａ）から（Ｄ）を含む蛍光画像取得方法。
    　（Ａ）試料から離れた位置から、広がる光束の励起光で試料を照射して試料中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させ、発生した蛍光を二次元検出器で検出して蛍光画像を得るステップ、
    　（Ｂ）前記二次元検出器により蛍光を検出しようとする時点において最も強い蛍光を発する部分からの蛍光が前記二次元検出器に入射するのを実質的に遮断した状態で、前記ステップ（Ａ）と同様に試料に励起光を照射して前記二次元検出器により蛍光画像を得る少なくとも１つのステップ、
    　（Ｃ）ステップ（Ａ）で得た蛍光画像とステップ（Ｂ）で得た少なくとも１つの蛍光画像からなる少なくとも２つの蛍光画像を１つの画像に統合するステップ、及び
    　（Ｄ）ステップ（Ｃ）で統合された画像を表示するステップ。
  9. 　ステップ（Ａ）と（Ｂ）で得た蛍光画像から試料内部を計算してそれぞれの蛍光画像を再構成する再構成ステップをさらに備え、
    　前記画像統合ステップ（Ｃ）は前記再構成ステップにより再構成された蛍光画像を統合する請求項８に記載の蛍光画像取得方法。
  10. 　前記ステップ（Ｂ）は、前記再構成ステップで得た試料内部情報に基づいて、前記二次元検出器により蛍光を検出しようとする時点における最も強い蛍光を発する部分を決定する請求項９に記載の蛍光画像取得方法。
  11. 　前記ステップ（Ｂ）は、外部から入力された試料内部情報に基づいて、前記二次元検出器により蛍光を検出しようとする時点における最も強い蛍光を発する部分を決定する請求項８又は９に記載の蛍光画像取得方法。
  12. 　前記ステップ（Ｂ）は、蛍光を受光する方向から見たときの蛍光物質の試料内部での深さに応じて遮断範囲を変化させる請求項８から１１のいずれか一項に記載の蛍光画像取得方法。
  13. 　前記ステップ（Ｄ）は、統合された画像を強度範囲毎に異なる色彩で表示する請求項８から１２のいずれか一項に記載の蛍光画像取得方法。
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