JP2004523747A - ２−ｄｇｅ用試料調製のための免疫サブトラクション法 - Google Patents

Abstract

２次元ゲル電気泳動などにおいて、試料から豊富なタンパク質を除去することによって、試料中のより豊富でないタンパク質の検出及び分析が向上される。この除去は、いくつかの極めて豊富な、干渉又は汚染を生ずるタンパク質を同時に免疫除去することによって達成される。
【選択図】図２

Description

【０００１】
【背景技術】
【０００２】
複合試料からタンパク質を迅速及び特異的に精製するについて関心の高いクロマトグラフィ手法は、免疫アフィニティクロマトグラフィである。例えば、Anuradha Subramanian「Methods in Molecular Biology」における章、Affinity Chromatography第１４７巻ｐ．９５以下、Pfeiffer他J.Immunol. Methods９７ｐ．１−９、及びCuatrecasas,J.Boil.、Chem.２４５、ｐ．３０５９以下を参照されたい。この技法は、免疫アフィニティクロマトグラフィカラムによって試料から成分を分離するための、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の適用に関して改良されている。Gersten & Marchalonis, J.Immuno. Methods１２７、ｐ．２１５以下、及びSchneider他、J.Biol.Chem.２５７、ｐ．１０７６６以下には、より大きな容量でもって抗原を第１のステップで結合し第２のステップで溶離させるのを容易にする、クロマトグラフィマトリックスへの抗体の部位特異的な固定化に関する大幅な改良が報告されている。
【０００３】
ほとんどの場合、免疫アフィニティクロマトグラフィは、特定のタンパク質の精製に用いられてきた。より少ない事例では、免疫アフィニティクロマトグラフィマトリックスを利用する目的は、例えば、組織又は体液試料からウイルス（タンパク）成分を特異的に取り除くとか（Schreiber他、Curr.Stud. Hematol. Blood Transfus.１９８９年、第５６号、ｐ．１４６以下）、あるいは、患者の血液から臨床的に望ましくないタンパク質を除去するといった（Vallar他、J. Chromatogr. Biomed. Appl.１９９５年、第６６４号、ｐ．９７以下）、望ましくないタンパク質のサブトラクション即ち除去であった。この場合において、免疫アフィニティクロマトグラフィマトリックスに対して親和性のないタンパク質混合物を回収することが、主たる問題になる。Flurer及びNovotny（Anal.Chem.１９９３年、第１５巻、ｐ．８１７以下）は、免疫アフィニティクロマトグラフィカラムを用いて、ヒトの血漿からタンパク質が除去され、２次元ＲＰ−ＨＰＬＣによって血漿タンパク質分布が生成される、分析スケールの手法について解説している。
【０００４】
２次元ゲル電気泳動（２−ＤＧＥ）は、複数のタンパク質を含有する試料中の個々のタンパク質を識別できるようにする方法である。こうした試料には、細胞ライセート、組織ライセート、血清試料等が含まれる。タンパク質を同定する上での困難が生じるのは、タンパク質が同様の電荷及び分子量を有し、そのため２つ又はより多くのタンパク質が同様に移動し、ディスプレイでほぼ同様に近接して位置する場合である。
【０００５】
同定が困難になる別の要因は、１つ又はいくつかの極めて豊富なタンパク質の存在量が本来的に異なることである。こうしたタンパク質は一般に、他のより豊富ではないタンパク質と共に、２次元（２−Ｄ）電気泳動ゲル上で共に移動する。より豊富ではないタンパク質を検出しようとしてゲルに十分なタンパク質を加えると、２−Ｄゲルの像は極めて豊富なタンパク質によって極めて強く着色又は標識され、その結果、近くの関係のないタンパク質の弱い信号は隠蔽される。この効果は、ＷＯ ０１／１６８８４において実証されたように、染色が顕色するにつれて一連の光学測定を行うことによって、部分的に改善することが可能である。
【０００６】
さらに、等電点電気泳動手法においては、限られた量の試料タンパク質を用いて、許容可能な分離を実現することが可能である。２−Ｄゲルは、保持可能な全タンパク質の量に制限があり、従ってゲル中でより豊富でないタンパク質試料の量を最大化するのが望ましい。そこでＷＯ ００／３３０７５では、１回又はより多くの２−ＤＧＥを実施する前に、試料を分画することが提案されている。
【０００７】
これらの困難な条件は、ゲルの同じ辺りにある異なるタンパク質を明らかにすることが可能な、差別的検出法を利用して克服することが可能である。例えば、特定のタンパク質、及び恐らくはその副次的な変種に特異的に結合する試薬（例えば抗体、受容体、又はレポータ分子としてのリガンド）を利用するといった、特異的検出手段を用いることが可能である。かくして、より豊富なタンパク質を含有する試料中におけるより豊富ではないタンパク質の検出を可能にする技法が必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、クロマトグラフィ、電気泳動、質量分析、結合反応等のような、タンパク質分析に用いられることになる試料から、所望の、所望でない、及び／又は豊富なタンパク質を選択的に除去する方法及び手段を提供することにある。除去されるタンパク質は一般に、試料中に豊富にあり、従ってこれらが、より豊富でないタンパク質のために選択される。所望の目標にとって中心となる本発明の実施態様の１つは、分析を受ける試料中の他のタンパク質の濃縮を可能にするだけではなく、タンパク質の再現可能な定量化、サブトラクションマトリックスの再生利用可能性、高い処理量をも可能にするいくつかのタンパク質の除去である。目標の１つは、免疫サブトラクション（除去）技法に適切な高分解能の技法によって、試料中の多くのタンパク質を同時に定量することである。
【０００９】
これまでは、２次元ゲル電気泳動（２−ＤＧＥ）が、タンパク質について高分解能及び高処理量を可能にする、利用可能な最良の技法であった。２−ＤＧＥの障害は、ゲルに数百の精製されたタンパク質のスポットが生じることになる高分解能な、類似性の高いタンパク質の電気泳動分離に対して、制限された量のタンパク質しか適用できないという点である。本発明を利用すると、タンパク質試料から幾つかのタンパク質が除去されており、また同時に、他のより豊富でないタンパク質がかなり濃縮されている場合、数百の追加スポットを２−ＤＧＥによって分解し、プロテオミクスデータ分析によって定量することが可能になる。こうした方法がうまくいくためには、試料中に残存するより豊富でないタンパク質を不当に希釈してはならない。従って例えば、より豊富なタンパク質の約８０％又はより多くを試料から完全に除去する場合、より豊富でないタンパク質の有効濃度は５倍に増し、これに応じてタンパク質の定量感度も高くなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
２−ＤＧＥのような、タンパク質分離及び／又は同定技法による分離及び／又は同定に適した試料は、どれも、本発明の選択的分画がやりやすい。本発明の特定の用途は、試料から豊富なタンパク質を除去して、一般により豊富でない共に移動するタンパク質及びより豊富でないタンパク質の２−Ｄゲル上での分解を可能にすることである。この除去は、分離を促進し、試料の希釈を抑える低抵抗マトリックスの利用によって容易になる。
【００１１】
適切な試料には、細胞ライセート、組織ライセート、器官ライセート、生物体ライセート、体液試料、亜細胞画分、環境試料等が含まれる。それぞれの可溶性画分を用いるのが望ましい。適切な液体試料には、動物の場合、細胞質、血漿、血清、全血、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、組織液、胆汁や精液等の器官液、体液、粘液、滲出液、唾液及び涙のような分泌物、尿及び汗のような老廃物、及び他の生物学的液体が含まれる。植物、微生物、及び、他のこうした有機体の場合、他のさまざまな液体、組織、及び細胞抽出液が含まれる。従って、葉の組織のような植物の組織は、適正な緩衝液内で分解することによって、適正な試料が得られる。また、樹液のような天然の植物液を利用することも可能である。さまざまな他の環境的及び生物学的試料には、１つ又はより多くの共通するタンパク質、汚染物、干渉物質、又は、天然に産生する極めて豊富な物質、微生物、又は、細胞が、かなりの割合で含有されている。１又は２−ＤＧＥ、液体クロマトグラフィ、質量分析（ＩＣＡＴ−ＭＳを含む）、ＨＰＬＣ、結合分析、染色等によるような、こうした試料の任意のプロテオメトリック分析、及び試料からの単一のタンパク質の検出の場合でさえ、本発明のサブトラクション技法の恩恵に浴することが可能である。
【００１２】
環境的試料及び工業用試料の場合、極めて豊富な物質又は干渉物質が存在することが多い。例えば、下水中の病原体にスクリーニングを施す場合、極めて多数の比較的無害なバクテリア又はウイルスが存在している。本発明のものを含む任意の濃縮法によって、所望の物質の検出及び／又は定量化及び／又は分離が単純化される。
【００１３】
汚染物質及び干渉物質の除去は、多くの状況にとって重要である。プロテアーゼ及びヌクレアーゼは、多くの試料に遍在しており、測定される分析物を劣化させるので、通常は望ましくない。タンパク質及びペプチドの質量分析の分野では、試料及び中間体はケラチンによって汚染される場合が多いが、これはヒトが絶えず周囲にこのタンパク質を放出してためである。こうした汚染試料は容易に分析することができない。こうした状況において、質量分析の準備プロセスにおける初期試料採集時点から、より好ましくはもっと後の時点までの、プロセスの任意の時点において、ケラチン又はそのペプチドに対する受容体を有する免疫サブトラクションカラムを利用することが可能である。特に望ましいのは、ＬＣ／ＭＳのための液体クロマトグラフィカラムに試料が注入される直前に、カラムを利用することである。
【００１４】
血液及び血清タンパク質はまた、どの組織にとっても共通の汚染物質であり、従って分析を終了する前に、試料からこれらを除去するのが望ましい。また、免疫化のため抗原を調製する場合、特定の免疫優性抗原又は免疫抑制化合物を除去するのが望ましい場合が多い。さらに、ＤＮＡ結合タンパク質又はそれらがＤＮＡ上で結合する「フットプリント」を分離したい場合には、選択的除去システムも望ましい。生物学的液体の従来のイムノアッセイ、臨床化学分析、及び、他の分析では、天然タンパク質による干渉が多い。アルブミンのような多量のタンパク質を含有する試料は、周知のように、濁度、分析物の吸着等のため、取り扱いが困難である。この問題を解決するための従来の方法は、生理食塩水で試料を希釈することである。これはうまく作用するが、豊富でない分析物の濃度はさらに、おそらくは検出不可能な値域まで低下する。本発明は、過剰の希釈なしに生物学的試料中の干渉物質を除去するのに有効であり、実際のところ、そうした豊富でない分析物の検出及び定量に役立つ濃度とすることさえ可能である。
【００１５】
植物は、選択される組織に応じて、いくつかの共通するタンパク質を備えている。豆の種子の場合、全タンパク質の約４０％がファゼオリンである。トウモロコシの種子の場合、共通するタンパク質には、ゼイン、グロブリン、プロタミン、及びグルチンなどがある。脂肪種子の多くでは、１つ又は少数の貯蔵タンパク質が、全タンパク質のかなりの部分を占めている。
【００１６】
種子の貯蔵タンパク質以外では、大部分の植物の葉の組織は、その大きい単位及び小さい単位を考慮すると、約２０〜３０％のルビスコを含有しており、これは露光後には高レベルになり、光がないと低レベルになる。他の共通するタンパク質には、葉緑体とサイトゾルの両方のリボソームタンパク質、チラコイト、光合成系Ｉタンパク質、光合成系ＩＩタンパク質、葉緑体膜結合タンパク質、及び他の構造タンパク質が含まれる。
【００１７】
植物、又は培地内の植物細胞がウイルス感染を受けた場合、天然のものか人工によるものかに関係なく、全タンパク質のかなりの部分が、ウイルス性となる可能性がある。例えば、感染した組織からは、全タンパク質試料中で２０〜３０％のタバコモザイクウイルス外殻タンパク質が発見される可能性がある。
【００１８】
同様に、バクテリオファージに感染したバクテリア及びウイルスに感染した動物細胞は、全タンパク質試料中に、かなりの割合のウイルスタンパク質を含有している可能性がある。
【００１９】
従って、そうした状況においては、やはり、干渉タンパク質又は豊富なタンパク質の除去が望ましい。
【００２０】
試料からのタンパク質の除去は、除去すべきタンパク質と特異的に結合する受容体に試料をさらすことによって行われる。結合剤の再利用、並びに、分離されたタンパク質種の回収を可能にするため、結合は可逆性であるのが望ましい。適切な結合分子には、抗体、コンカナバリンＡ、コムギ胚芽凝集素、アブリン等のレクチン、受容体、金属、補因子、除去されるリガンド（アプタマー）に対して特異的結合受容体の働きをするように設計された組み合わせ化合物、重合体、核酸、人工タンパク質配列、及びヘパリン、ポリミキシンのような特定クラスのタンパク質、チバクロンブルーＦ３ＧＡのような色素、及び、疎水性タンパク質を結合するメチル及びフェニル基のような炭化水素を結合する他の化合物が含まれる。試薬は、タンパク質が誘引される官能基を含む場合が多い。こうした官能基の例には、ヒドラジド、アミン、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、カルボキシル、ホウ酸塩、及び、有機水銀が含まれる。
【００２１】
本特許出願は、一般に、試料からのタンパク質の除去に関するものであるが、本技法は、干渉し、妨害する、又は単に極めて豊富に存在する物質、複合体、粒子など、さらには微生物全体や細胞さえも含む、任意のリガンドを除去するために利用することが可能である。同様に、特異的に結合する相手方の具体例としては抗体が挙げられるが、現在説明中の技法に関して、試料中のリガンドと特異的に結合する任意の受容体を用いることが可能である。リガンド及び対応する受容体は、相互に比較的特異に結合する。リガンドも受容体も、単一の化合物である必要はなく、複合体、錯体、粒子、及び、さらに大きい構造を含むことも可能である。本特許出願は、アフィニティ及び免疫アフィニティという用語を特定の例に用いているが、これらは受容体とリガンドの間の特異的結合関係を表すものと、広義に解釈すべきである。
【００２２】
望ましい結合分子は抗体である。抗体は、任意の動物種のものとすることが可能である。抗体は、天然でも、あるいは組み換えによって生成されたものでもかまわない。抗体は、任意のクラス、サブクラス、単一鎖、及び、単機能性、二機能性、又は多機能性のものとすることが可能である。抗体は、もとのままか、又は、ほぼもとのままにしておくことが可能である。すなわち、抗原との結合又はＦｃ受容体との結合のような所望の機能が保持される限りにおいて、抗体のさまざまな部分を除去することが可能である。従って、グリコシル化部位を削除し、かつＦｃ受容体結合能力を保持することが可能である。
【００２３】
クローンによって、高親和性、高結合活性、又はその両方を備えた抗体が、本質的に量的に無制限に、質的に再現可能に得られるので、モノクローナル抗体は強力な試薬である。個々の抗体は、抗体とマトリックスの結合によって、抗原結合に障害を生じないことを確認するため、本明細書の教示に従って検査することが可能である。さらに、モノクローナル抗体を利用すると、本明細書で教示するように、対象となる同族抗原が結合したマトリックスを用いて抗体を精製する必要がなくなる。
【００２４】
試料から極めて豊富なタンパク質を除去するため、マトリックスに結合させられる特異的結合剤は、組み換えにより生成された、単鎖の二重特異性抗体又は抗体ディスプレイファージとすることも可能である。抗体ディスプレイファージが利用され、従来のパニングがその調製に用いられる場合、極めて親和性の高い及び／又は結合活性の高いディスプレイファージが調製される。しかし、プロテインＡ、又はＧと結合するＦｃ部分のない抗体は、異なる付着メカニズムを必要とする。しかし、ディスプレイファージは本質的に多価であるため、多くの技法によって固相に固定化することが可能であり、しかも依然として抗原結合のない抗体状の機能成分を備える。
【００２５】
Ｆａｂ又はＦａｂ２のような抗体断片を利用することが可能であるが、Ｆａｂの非エピトープ領域のための特異的結合剤を備えた固相を利用することになる。二官能性抗体（二重特異性抗体及び再組み合わせＦａｂ２又は再組み合わせ抗体）は、それぞれ、第１の抗原結合部分と、第２の抗原結合部分を備えることができる。二官能性抗体を固定化するための方法として、第１の抗原に結合した固相を有するのが有利である可能性があり、これはまた本明細書で説明するように、さらに架橋させることができる。これによって、結合を受けない試料から除去される抗原のための結合部位が残される。
【００２６】
合成受容体に関する最近の進展は、有望であるように思われる。これらは、単独か、又はより長い重合体配列内で用いられるかはともかくとして、組合せペプチド、オリゴマ、重合体等である。本発明の目的からすると、これらも受容体とみなされる。
【００２７】
分離及び除去プロセスを容易にするため、結合分子は、結合剤及び試料に対して不活性な固相に固定化するのが望ましい。結合剤は、既知の手法を用いて、結合剤又は分子のタンパク質結合能力を実質的に低下させないやり方で、固相に固定される。さらに、マトリックスの再現性を促進するため、結合分子は固相にしっかりと結合するのが望ましい。従って例えば、結合分子は、固相に吸着し、共有結合し、又は捕捉することが可能であり、或いは固相のコーティングに付着させるか、又は取り込むことが可能である。
【００２８】
結合剤又は分子の固定化に望ましい固相は、強化表面領域を備えるマトリックスである。適切なマトリックスは、例えば、ビーズ又は微小ビーズ形状及び形態である。こうしたビーズ又は微小ビーズは一般に、特定の樹脂又は重合体の球体であり、抗体を結合し、抗体に対して実質的に不活性であり、試料に対して実質的に不活性であり、分離プロセスに用いられる条件下で安定であるといった、アフィニティクロマトグラフィに適した特性を備える。
【００２９】
適切なマトリックスは、デキストラン、スチレン、アガロース、リン酸カルシウム、アクリル酸エステル、ポリアミン、アクリルアミド、シリカのような材料から造られたビーズである。シリカのような材料は通常、化学的に「樹脂」とはみなされないけれども、本明細書においてはこれらを総称して「樹脂」と呼ぶ。多くのこうした材料は、例えばファルマシア社、バイオラド社、シグマ社、及び他の販売業者から市販されている。望ましいマトリックスは、低い背圧で高流速を可能にするものである。とりわけ望ましいのは、ＰＯＲＯＳ（商標）（カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ社の商標）クロマトグラフィ媒体ゲルビーズのような灌流クロマトグラフィを可能にする多孔質ビーズのような、タンパク質多孔性マトリックス、及び、ＵＮＯ（商標）（カリフォルニア州リッチモンドのバイオラド・ラボラトリ社の商標）クロマトグラフィカラムのような連続ベッドマトリックスを利用した、高処理量の技法である。他の適切なマトリックスが、ファルマシア社他によって生産されている。
【００３０】
高速分離の場合、固体マトリックスを用いて、液体がマトリックスを迅速に貫通するか、又はその表面を通過することができるようにするのが望ましい。前に結合した材料が溶離した後、同じマトリックスに多数の試料を順次通すことにより、それらの試料を同様にして処理したい場合、試料がマトリックスを通過する速度は、時間制限因子になる。「灌流」マトリックスは、この技法にとってとりわけ望ましいが、他のマトリックスを利用することも可能である。以下の例のいくつかでは、１００を超える試料を同じカラムに通して、試料の充填、非結合タンパク質の溶離、溶離緩衝液の添加、結合タンパク質の溶離、及び最終洗浄からなる１サイクルを完了するのにかかった時間が、約１５分以下であった。
【００３１】
分離されることになっている試料は、一般に量が少ないので、迅速で、試料をあまり希釈しない分離プロセスを行うのが望ましい。とりわけ、空隙容量、又は固相マトリックスと結合しない入力タンパク質の部分には、もとの試料において豊富でないタンパク質が含まれているためである。
【００３２】
ＰＯＲＯＳ粒子はスチレン及びジビニルベンゼンの微小球体に相当し、これらは相互付着して、粒子内に豊富な孔とチャネルを備えたほぼ円形の粒子を生成する。その結果、有効な結合が粒子表面だけではなく粒子内部でも生じる、極めて多孔性の粒子が得られる。従って、高流速の利用が可能になる。
【００３３】
ＵＮＯカラムには、ビーズのような離散的構造ではなく、均質なマトリックスを含む連続ベッドマトリックスが含まれている。従って、単量体及びアイオノマーは、現場で重合される。重合体鎖は、微小粒子から構成される小結節の稠密網状構造に凝集される。結果として、分解能及び捕集容量を犠牲にすることなく、高流速に耐えることが可能なカラムが得られる。
【００３４】
利用可能な流速が、ＰＯＲＯＳ及びＵＮＯマトリックスに用いられる流速と同等か、又はそれより速い限りにおいて、他の望ましい固相マトリックスを利用することも可能である。
【００３５】
かくしてマトリックス自体が、特定のタンパク質又は特定のクラスのタンパク質に結合するか又はそれを取り込み、誘導体化又は修飾されて、その機能を実施するか、又はその機能を実施可能な分子を取り込むことになる。例えば特定の結合剤が、マトリックス表面に固定される。例えば特定の試料タンパク質に対する特異的な抗体のような結合分子が、マトリックスに固定される。抗体又は他の受容体は、モノクローナル又はポリクローナルとすることが可能である。すなわちそれらは、除去すべきリガンド上の１つ又は複数のエピトープを認識する。ポリクローナル抗体は有効である。ポリクローナル調製物は、さまざまなエピトープに結合し、特定の決定基に制限されるのではなく、除去すべきタンパク質の決定基に結合する。マトリックスに特定の抗体が結合すると、どの抗体種についても抗原結合能力及び容量に有害な影響を及ぼすことになる。従って、ポリクローナル抗体によれば、いくつかの利点が得られる。
【００３６】
抗体をマトリックスに固定する方法の１つは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合することが知られている、プロテインＡ及び／又はプロテインＧ及び／又はプロテインＬ等の利用である。プロテインＡ及びプロテインＧは、さまざまなクラス及びサブクラスの抗体、並びに、さまざまな動物の種から得られた抗体に関して特別な親和性を備えている。プロテインＡ又はプロテインＧに対する任意のある抗体調製物の親和性は、既知のところであるか、又は、本明細書に教示の方法を実施して確かめることが可能である。
【００３７】
表面に共有結合したプロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリックスは、例えば、アプライド・バイオシステムズ社及びバイオラド社から市販されている。あるいはまた、共有ヒドラゾン結合によって、免疫グロブリンのＦｃ部分と結合するヒドラジン基を有するマトリックスが、同様に有効である。抗体を固相に固定化する他の方法を利用することが可能であるが、結合反応の制御が困難であるため、又は結果として抗体がいっそう不活性になり、その結果結合能力が低下することになるため、一般にはあまり望ましくない。
【００３８】
かくして抗体調製物は、マトリックスに対する抗体の結合を促進するのに適した条件下において、マトリックスと混合される。いったん結合したならば、抗体とマトリックスを共有結合して、抗体をあまり損失することなく、処理に対して安定したマトリックスが得られるようにするのが望ましい。抗体をプロテインＡ、プロテインＧ、又はマトリックスに共有結合させる方法は既知である。例えば、イミダミド架橋を生じる、グルタルアルデヒド、ジメチルアジピニデート、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、テトラニトロメタン、及びジメチル３，３’ジチオビスプロプリオニミデートのような二官能性架橋分子は、この目的に関して周知であり、こうした共有結合は、当該技術において既知である。どれを用いてもかまわないが、複数の架橋剤を用いて、受容体をマトリックスにしっかりと結合させるのが望ましい。あるいは、反応成分間の間隔がわずかに異なる場合には、各架橋剤としてプロテインＡ又はＧのような中間結合剤を有するマトリックスが望ましい。
【００３９】
抗体が除去すべきタンパク質にとって特異的であることを確認するため、特にポリクローナル抗体が用いられる場合には、抗体調製物を精製して、交差反応抗体を除去することが可能である。抗体の特異性を改善するため、抗体調製物は、特定の同族抗原タンパク質に抗体をさらすことによって分画することが可能である。特定の同族抗原タンパク質は、上述のように不活性マトリックスに結合して、そのタンパク質に特異的に結合する抗体を分離するためのアフィニティクロマトグラフィマトリックスを生じさせることが可能である。マトリックスに固定されるタンパク質は、抗体調製物の特異性を強化するため、高純度であることが望ましい。用いられるマトリックスは、タンパク質の結合が容易なものが望ましいが、一般にプロテインＡ及びプロテインＧが固定されたものではない。マトリックス又はその誘導体形態は、抗原結合部位にとって特異的であって、精製される抗体調製物の抗原結合部位によって結合されねばならないからである。
【００４０】
従って、抗体調製物は、対象とするタンパク質、即ちバッチ、カラム、又は他の適切な形態でもって、後の分析に備えて試料から除去され、培養されることにより抗体がマトリックスに保持され、本明細書に規定のように使用すべく溶離され採集されるタンパク質を含有する、対応するマトリックスにさらすことが可能である。
【００４１】
結合マトリックスの一貫した製造のため、容易に自動化し得る再現可能なプロセスが望ましい。これには、２つの重要な機能、すなわち、（１）リガンドを利用して受容体を精製するための手段を設ける機能と、（２）受容体を利用して試料からリガンドを除去する機能が必要になる。例えば、アフィニティマトリックスを利用して、受容体を精製することが可能である。まず精製リガンドと前もって活性化したマトリックス材料を混合して、リガンドを結合させる。あるいはまた別個のステップとして、リガンドと樹脂を化学的に結合させることも可能である。あるいはまた、リガンドは誘導体化して、マトリックスと直接結合するか（例えば、ビオチン化リガンド及びアビジン結合マトリックス）、又はマトリックスと容易に反応するようにすることも可能である。リガンドマトリックスは次いで、既知の緩衝液を用いてカラム又は同様の形態に充填され、第１のカラムが形成される。前もって活性化されたマトリックスの反応基は、リガンドの相補性基に結合、できれば共有結合する。一般に、飽和量のリガンドがマトリックスに添加される。マトリックスを洗浄すると、結果として、リガンドがマトリックスに共有結合的に固定される。任意選択的に、阻害剤を加えて、マトリックスに対する受容体の非特異的吸着を減少させることが可能である。リガンドマトリックスは、バッチ形式で利用し、及び／又はカラム、或いはラテラル流装置、スピンカラム、マイクロ流体モジュール、若しくは取り外し可能コンポーネントのような別の装置の一部に充填することが可能である。次に、マトリックスに受容体調製物が添加され、特異的結合を可能にするのに適した条件下で培養される。結合した受容体は、例えば低いｐＨにさらすことによって、マトリックスから溶離される。溶離は、例えば、ＵＶ２８０吸着によってリガンドについてモニタされ、タンパク質リガンド及びタンパク質受容体が採集される。
【００４２】
カラムに類似した形態には、マトリックスが疎性ビーズか、浸透性パケットをなすか、磁気（又は磁気応答）マトリックスビーズであるかを問わず、液体試料中でのマトリックスの混合があり、また異なる受容体がマトリックス、リポソーム又はミセルエマルジョン、ディップスティック、チューブコーティング（毛細管、マイクロ流体装置のような）、ゲルビーズ、又はスラリ等の異なる位置に固定化されるマイクロ配列形式等が含まれる。固相は、容器、管、又は毛細管内部に緩く付着させることが可能である。こうした固定化技法は、受容体−リガンド結合の後でさえ実施可能である。例えば、抗Ｉｇ抗体（クームズ試薬）を利用して抗体、及びそれに結合した何らかのタンパク質を沈殿させる。あるいはまた、受容体はアルギン酸塩のような、選択的に分画可能な物質に結合させることが可能である。カルシウムイオンが付加されると（受容体−リガンド結合の前又は後に）、受容体及びそれに結合する他の何であろうと、固定化される。同様に、受容体は、ビオチンのような特異的結合相手の一部とすることもできるし、あるいは、それに結合させることも可能である。アビジンを加えると、受容体及びそれに結合する他の何であろうと、不溶化される。このプロセスにおいては、例えばＥＤＴＡを添加してカルシウムイオンをキレートして除去し、その結果アルギン酸塩が液化されるようにするといったように、対応する可逆反応によって受容体を選択的に再可溶化することによって、受容体を再利用することが可能になる。鍵となる特徴は、マトリックスが試料の液体から分離可能であるということである。「固相」及び「固相マトリックス」という用語は、本来固体であるか、又は固体にすることが可能な（上記アルギン酸塩ゲルのような）材料、或いはリポソーム、ミセル、固相上の液体コーティング、極めて粘性の高い不溶性液体といった、不溶性液体とみなすことが可能であるが固体のような働きをする材料を表している。「固相」材料は、本発明の方法の一部においてのみ、固体とすることが可能である。
【００４３】
ここで第１のカラムは第２のカラムと直列に接続することが可能であるが、この第２のカラムは例えばセファデックスを、任意選択的には緩衝液の中和物と共に含有するサイズ排除カラムであり、溶離剤を除去する。第１のカラムからの精製受容体は、マトリックスを通って排除され、その結果、そうした排除がなされない塩が除去される。この場合にも、タンパク質リガンド及び／又は受容体が用いられる場合には、例えばＵＶ２８０ｎｍ吸着によって、タンパク質について溶離をモニタすることが可能である。
【００４４】
次いで第２のカラムは第３のカラムと直列に接続されるが、これには抗体の結合に反応する成分を含有した望ましいマトリックスが充填されることになる。
【００４５】
プロセスを開始するため、第１のカラムに受容体調製物が添加され、カラムを通過させられる。リガンドマトリックスに付着したリガンドに特異な受容体がカラムに保持され、非結合物質は廃棄される。こうした結合に続いて、受容体は、例えば酸性又はアルカリ性緩衝液、カオトロピック剤又は変性剤（好ましくは可逆性の）にさらすことによって、リガンドマトリックスから溶離させられる。次いで酸性緩衝液中の溶離受容体は、任意選択的に中和され、第２のサイズ排除カラムに送られ、塩交換が実施される。そして溶離受容体は、まだ中和されていなければ任意選択的に中和され、受容体と結合するマトリックスを有する第３のカラムに送られる。第３のカラムには、カラムの受容体に対する所望の結合能力が得られるまで、受容体が充填される。その結果、特定のタンパク質に特異な抗体を含むマトリックスを有するカラムが得られる。
【００４６】
受容体に結合したマトリックスは、次に任意選択的に、既知の方法を利用した処理を受けて、例えば共有結合的付着によって受容体と永久的に結合し、それによって受容体がマトリックスに「固定」される。その結果、試料から同族リガンドを除去する際の反復利用に適したマトリックスが得られる。同族リガンドに関するマトリックスの単位容積又は重量当りの結合能力は、既知の方法を用いて決定される。
【００４７】
採集された受容体は、別個の結合分析のような既知の技法を用いて、問題となるリガンドに対する特異性についてテストすることが可能である。
【００４８】
次に、本明細書の教示に従って、マトリックスに受容体を結合させると、例えば２−ＤＧＥによって、試料中の分析物の分析又は精製、及び／又は検出が後で行われることになっている同族リガンドを試料から除去するための試薬が得られる。
【００４９】
最初にリガンドを固相に固定化する代わりに、遊離リガンドを利用し、受容体と混合することも可能である。受容体が少なくとも二価の場合、用いられる液体の残りから分離して回収することが容易な、不溶性錯体が生成しうる。分離は、濾過、傾瀉、遠心分離等によって可能である。
【００５０】
あるいはまた、リガンドがビオチンのような結合相手によって標識される場合、受容体との接触前又は後に、アビジンのような相補性結合相手を固相に結合させることが可能である。これに関しては、固相との結合によって、受容体−リガンド錯体を溶液から除去することが可能である。次に、遊離の受容体が溶離される。リガンドを利用して受容体を精製する他の形態を利用することも可能である。
【００５１】
従って例えば、試料から除去すべき特定のタンパク質に関して特異的な適切な抗体を望ましいマトリックスに付着させて、対象とする試薬を得ることが可能である。特異的抗体調製物を得て、その特異的抗体を精製し、望ましいマトリックスにその抗体を結合させるプロセスは、一連のカラムにおいて実施可能である。他のタンパク質にこのプロセスを繰り返すことによって、試料から除去すべき特定のタンパク質に対して特異的ないくつかのマトリックス試薬を生成することが可能である。
【００５２】
多くのタンパク質は量が異なる炭水化物を有し、そのため電荷は同様であるが分子量が異なる複数の分子を生ずるため、糖タンパク質の除去が有効である可能性がある。こうした分子は、２−Ｄゲルに「系列」をなすスポットの水平配列を生じる。こうした系列は、２−Ｄディスプレイに対して複雑性を加え、分解及び同定を混乱させる可能性があるので、糖タンパク質の除去は有効と考えられる。さらに、糖タンパクを除去する方法は、グリコシル化される試料とされない試料の比較を可能にする。既知のように、腫瘍発生には、細胞の正常なグリコシル化の妨害を伴う場合が多い。
【００５３】
グリコシル化に基づく分離が重要な場合、上述の教示に従ってマトリックスにレクチンを添加することにより、レクチンが結合する特定の単数又は複数の糖を有する分子と結合するマトリックスを提供することが可能である。
【００５４】
系列を除去する代替的な方法は、試料をサッカライダーゼ又はグリコシダーゼにさらして、試料中のタンパク質に結合した炭水化物を除去することである。多くの炭水化物はタンパク質に結合することが分っており、特定の糖を開裂させるさまざまな酵素のうち任意のものを利用することが可能である。
【００５５】
例えば、多くの糖タンパク質は、１回又は複数回にわたってシアリン酸化される。従ってノイラミニダーゼで試料を処理することによって、タンパク質から１つ又はより多くのシアリン酸残基を除去することが可能である。多くの糖タンパクはフコシル化される。従って、１つ又はより多くのフコシダーゼを利用して、フコース残基を除去することが可能である。炭水化物は、１→３又は１→４のようなさまざまなリンクでもってタンパク質及び他の糖と結合し、また幾つかの酵素は特異的であって、特定のリンクだけを切断するものもあるので、糖残基を除去するために頑強な酵素又はいくつかの酵素を用いることが可能である。試料は適正な条件下において、適切なサッカライダーゼ又はグリコシダーゼで処理され、所望の脱グリコシル化が実現される。脱グリコシルの結果として、より単純なパターンのタンパク質が生じ、タンパク質の総数が減少する。ある種の分析では、グルコシル化されたアイソフォームは、重要ではなく、従って１回の測定で消滅させても構わない。しかし、他の分析については、１つ又はより多くのアイソフォーム量の比が病気等の診察に用いられるので、全てのグリコシル化アイソフォームを保存するのが望ましい。同じことが、リン酸エステル化、金属イオン結合、及び他の任意の翻訳後修飾にも当てはまる。
【００５６】
一般に特定の分子だけに結合する抗体のような、結合剤を利用する上記手法とは異なり、脱グリコシル化では恐らく、特定のタンパク質ではなく、多数のタンパク質、又はあるクラスのタンパク質を除去することになる。異なるグリコシル化の分析が望ましい場合には、レクチンカラムの利用が好ましい。
【００５７】
本発明の別個の目的は、試料から多数の選択されたタンパク質を除去するため、組み合わせることが可能な試薬を提供することにある。一般に、複数のタンパク質が試料から除去される。したがって、あるクラスのタンパク質を結合する多機能マトリックス、又は異なる特異性を備えた抗体のような異なる試剤を担持する複数の個別マトリックスが組み合わせられる。複数の特異的マトリックスを用いる場合、異なる特異的マトリックスをバッチ式に混合することが可能である。混合物は、バッチ形態で維持し、利用することができるし、カラムに充填することも可能である。その場合、異なる種のマトリックスを相互に混合することが可能である。
【００５８】
あるいはまた、カラム形態を利用する場合には、順次添加又は充填する前に、異なる結合剤を担持する異なるマトリックスを混合することが可能であり、その場合に個々のマトリックスは、層中の多孔性膜のような不活性キャリヤによって分離することができ、あるいは別個のカラム内に収容することも可能である。こうした状況において、少なくとも１つの受容体は受容体の区画であり、受容体の少なくとも１つの他の区画から分離した所定の位置にある。
【００５９】
異なるタンパク質に結合する特異的な個別マトリックスを混合すべき場合には、その組合せによって、同族タンパク質に関するどのマトリックスの結合能力も実質的に低下しないことを確認しなければならない。その実施は、任意の１つのマトリックスだけの結合能力を確立し、混合物中におけるその同族タンパク質の結合能力を比較する標準的な技法を用いて行うことが可能である。
【００６０】
従って、いくつかの試料について特殊化された、混合物中の特定のマトリックスのいくつかの組合せを生成することが可能である。従って、血清中においてより豊富なタンパク質が何かは分っているので、血清試料に対して、特異的マトリックスの特定の組合せを再現可能に利用することが可能である。同様に、血漿、尿、ＣＳＦ、及び、他の生物学的試料からより豊富なタンパク質を除去することになる、特定の混合物を構成することが可能である。こうして、各マトリックスの結合能力で測定される、プールされた組合せ混合物中の、比例した量の各特定マトリックスを利用することが可能である。
【００６１】
あるいはまた、試料中の豊富でない分析物と同時に、豊富な分析物も定量測定したい場合には、豊富な分析物にとって最適な量より少ない特定のマトリックスを利用することが可能である。その結果、問題となる豊富な分析物の全てではないが、大部分が除去されることになる。特定の結合樹脂の量を慎重に測定することによって、試料中の豊富な分析物を豊富ではない分析物に変換することが可能である。そのデータ分析及び解釈を行う間に、測定量に制御された除去量を加えて、試料中の実際の量を推論することが可能である。
【００６２】
従って、別の形態では、異なる結合剤を担持する個別のマトリックスが、別個の容器、層、又は、コンパートメントに収容され、及び／又は、容器は例えば、導管又は管材料によって順次直列に接続される。例えば、毛細管、又は、各ウェルの底（浸透性とすることが可能な）にマトリックスが収容される９６ウェルプレート形態がある。
【００６３】
受容体マトリックスが異なれば、安定している時間期間も異なる。後述する実施例の方法によって調製される受容体マトリックスの幾つかは、特異性又は有効性を損なうことなく、数百サイクルの利用、ストリッピング、及び、再平衡化にわたって安定していた。他のマトリックスには、劣化の兆候を示すまでに１２又は２４サイクルしか安定しないものもあった。安定性を決定する要素には、受容体の選択、マトリックスの選択、及び固定化技法が含まれる。
【００６４】
受容体又はリガンドの幾つかが他より先に劣化する場合、易動性受容体又はリガンドに結合したマトリックスを別個のカラム内に入れて、除去及び新しい結合受容体との交換を容易にして、カラム全体の取替えを回避するのが望ましい。あるいはまた、易動性の結合相手は、浸透性膜によって離隔された別個の層内、又は、浸透性バッグ又はパケット内に入れてカラム内に収容し、交換のため容易に分離できるようにすることも可能である。易動性結合相手のマトリックスを入れる、上部及び底部に細かいメッシュを備えた厚い金属リングのような、永久サブカラムセクション又はチャンバを利用することが可能である。この構造は、米国特許第４６３６３６１号明細書におけるように、これまでは異なる目的のために利用されている。粒子状マトリックスの場合、易動性結合相手に結合したマトリックスには、磁性、常磁性、又は反磁性材料が取り入れられている。これらのマトリックス粒子は、カラムから全てのマトリックス粒子を除去し、磁界又は他の磁気反応部材を適用することによって、容易に分離可能である。一方のマトリックスが、他方のマトリックスが溶解しない条件において溶解するといった、１組の固相マトリックスを別の１組の固相マトリックスから分離する他の方法を利用することも可能である。これらの設計の全てにとって鍵となる特徴は、簡単に交換できるように、易動性マトリックス受容体を安定したマトリックス受容体から選択的に除去できるようにすることである。
【００６５】
どのマトリックスを組み合わせて混合物とすべきかの選択は、恣意的であってはならず、除去される特定のたんぱく質が共通の特性を共有しうることを観測することによって容易になるであろう。適切な特性の１つは、除去手順の後の、マトリックスからの溶離である。かくして、単一の緩衝液を用いて抗体を含むマトリックスから溶離させることが可能なタンパク質によって、どのマトリックスの組合せが可能であるかが分る。異なる充填又は溶離条件が望ましい場合、異なる条件を選好する抗体にとっては、異なるカラムが望ましく、少なくとも溶離条件と同じ数のカラムが設けられる。
【００６６】
保持されたタンパク質を使用することができる。例えば、免疫グロブリンが試料から除去されると、回収された免疫グロブリンは、治療に用いるか、又は例えば、除去された抗体が特定の抗原に結合するか否かを判定するための診断分析に用いることが可能である。除去される特定のタンパク質の量はまた、特定の条件を示す。例えば異常に低レベルのアルブミンは、特定の肝臓疾患、組織損傷、及び飢餓に際して見いだされる。同様に、鉄の量、肝臓及び腎臓疾患によって、トランスフェリンの発生量が影響を受ける。またα−アンチトリプシンは妊娠中に増大し、また炎症の指標としてさえ用いられてきた。
【００６７】
血清中における免疫グロブリン組成物の評価は、自己免疫疾患、又は自己免疫反応を伴う疾患（例えば、慢性関節リウマチ、狼瘡．．．）、又は免疫系が危うくなる疾患（例えばエイズ、放射線被爆又は毒素への暴露...）、又は血液悪性疾患（例えば、骨髄腫、リンパ腫...）において重要になる可能性がある。免疫グロブリンの包括的分析は、こうした疾患における抗体発現の定量的変化、並びに感染（例えば、肝炎、梅毒...）に対する免疫反応をモニタするのに役立つ可能性がある。図９は、本発明の免疫サブトラクションカラムに結合される免疫グロブリンの分離から得られた結果を示している。
【００６８】
異なる受容体は、相互の結合と競合するか、又は干渉することになるので、個々の受容体には個別のマトリックスを利用するのが望ましい。制御反応が弱ければ、各リガンドに関するマトリックスの結合能力は、予測しにくくなる。さらに、工業プロセスとして、単一マトリックスに対する多くの異なる受容体の結合は、制御が困難である。
【００６９】
複数のマトリックスが組み合わせられて１つの混合物になる場合、任意の１つのマトリックスの結合能力を判定して、他のマトリックス種の結合能力と比較してその相対量を調整し、長期にわたる均一な利用を保証するのが望ましい。この相対結合能力によって、試料中のタンパク質の相対的存在度を監視することが可能である。従って、ある特定のタンパク質の場合、アルブミンに対して特異的な抗体を含有する１ミリグラムのマトリックスが、例えば２ｍｇのアルブミンと結合することを判定できる。これは、既知の量のマトリックスを既知濃度の種々の量のタンパク質溶液に曝露することによって測定可能である。次いで例えば、マトリックスが実用的に最大量のアルブミンと結合した時点を、マトリックスにさらした後の液体のＵＶ２８０ｎｍ吸着をモニタすることによって測定可能である。マトリックスの結合能力、並びに結合したタンパク質の除去効率は、ＥＬＩＳＡ、ＵＶ２８０ｎｍ吸着、又はタンパク質染料のような標準的方法を用いて、試料及び溶離物中におけるタンパク質レベルをモニタすることによって査定可能である。
【００７０】
既知のように、一般に、血清には約４４ｍｇ／ｍｌのアルブミンが含まれている。従って、５０μｌのアルブミン試料のほぼ全てを除去するためには、少なくとも１．６ｍｇのマトリックスに血清試料をさらすことが必要になる。
【００７１】
また、タンパク質Ａ及びＢが、それぞれ、試料中の全タンパク質の３０％を占めているものと仮定する。タンパク質Ｃは、試料中の全タンパク質の２０％を占めている。それぞれ、Ａ、Ｂ、又はＣと特異的に結合する３つのマトリックスが調整される。各マトリックスが、同じモル量のＡ、Ｂ、又はＣと結合し、それぞれの特異的マトリックスからＡ、Ｂ、及びＣを同じ緩衝液を利用して溶離可能であるとする。試料からＡ、Ｂ、及びＣを除去するため、バッチ式に又は順次カラム内で、マトリックスＡ、Ｂ、及びＣを３７．５：３７．５：２５の比率で混合することによって、こうした試料からＡ、Ｂ、及びＣを取り除くことが可能な試薬を生成することが可能である。試薬に試料を加え、試薬と共に培養可能としておくと、Ａ、Ｂ、及びＣがそれぞれのマトリックスに結合する。Ａ、Ｂ、及びＣのない溶離物が採集される。
【００７２】
溶離試料に各種の利用可能なアッセイの任意の何れかを適用して、対象となるタンパク質の除去を確認することが可能である。例えば、溶離試料にＥＬＩＳＡを実施して、試料中の除去しようとするタンパク質の存在によって、任意のマトリックスの結合能力のキャパシティが超過されているか否かを判定することが可能である。溶離物中に存在する場合には、再生マトリックス又は新しいマトリックスによって試料をリサイクルするのが望ましい。
【００７３】
最終溶離物は採集され、次いで処理されて、試料に残存しているタンパク質が濃縮され、２−ＤＧＥ又はタンパク質測定の他の用途に適した緩衝液中にタンパク質があることが確保される。さらに試料には、透析、凍結乾燥等を施すことも可能である。
【００７４】
特に分離に際して糖タンパク質を除去するための試薬が含まれていない場合には、分離された試料に対して、任意選択的に脱グリコシル工程を実施することが可能である。例えば試料は、広範な基質特異性を備えた組み換え酵素である、プロザイムによって市販されるシアリダーゼＡのようなノイラミニダーゼによって、適切な条件下で培養することが可能である。
【００７５】
酵素処理の後、試料は好ましくは脱塩され、任意選択的に酵素から分離されて、等電点電気泳動の準備が施される。これに続く工程は、２−ＤＧＥ技法自体において周知である。
【００７６】
別の実施態様の場合、本発明は、タンパク質間の相互作用の判定とタンパク質錯体の結合の程度及び親和性の判定、及び、錯体結合タンパク質及び一緒に又は順次機能する可能性のある関連したタンパク質を見出すために利用可能である。これは、タンパク質が相互作用するためである。腎臓によって血液から除去されるほど小さい低分子量タンパク質の場合、より大きいタンパク質への結合は、そのタンパク質を血液中に維持するために重要である。本実施態様によれば、分子量、及びアルブミンのような高分子量分子に対する結合能力だけに基づく、化合物の血中半減期の指標が得られる。多くの医薬品及び生物学的に活性のペプチド及びタンパク質は、ある程度アルブミンと結合するので、これはアルブミン結合化合物の測定について特に有用である。
【００７７】
いくつかのタンパク質は、例えば信号伝達カスケード又はタンパク質分解経路といった複雑な生物学的プロセスにおいて、重要な役割を果たすことが知られている。これらの経路が生ずるためには、タンパク質間結合事象、又は他の代謝物質−タンパク質結合を生じさせることが必要になることが多い。こうした事象に関与する全てのタンパク質を調べて、同定することが望ましい。分子クローニングによって、ある役割を果たす複数のタンパク質を識別することができるが、全部というわけにはいかない。これまで人々は、イースト−２−ハイブリッドのスクリーニングを用いて、ある特定の相互作用に集中的に取り組んできた（例えば、米国特許第５２８３１７３号明細書、第５６３７４６３号明細書他）。しかし、異質環境及び不自然な相互作用タンパク質のために、得られたデータは現実を必ずしも反映しない。
【００７８】
本発明の場合、ある経路に含まれることが知られており、又は含まれると思われる幾つかのタンパク質に関して、１つの抗体又は１プールをなす抗体が生成される。抗体又はタンパク質（又は両方）が、クロマトグラフィマトリックス又は他の固相に固定化されて、固定化されたタンパク質に接触させられる可溶性の水性相の生物学的試料が適用される。所定の生物学的経路が生じるか、又は生じると予想される生物学的試料を選択することが重要である。試料中の結合しない全てのタンパク質は、通り抜けて廃棄される。抗体、又は特異性を備えた固定化タンパク質に結合する全ての試料タンパク質、及び選択された緩衝条件下で固定化されたタンパク質、又はその後のタンパク質に対して実質的な親和性を示すタンパク質が結合される。濃縮されたタンパク質は、直接分析されるか、又は例えば酸性溶液によって溶離させられる。溶離した画分内のタンパク質は、質量分析、液体クロマトグラフィ、電気泳動等のようないくつかの技法によって分析される。好ましい方法は２−Ｄ電気泳動である。タンパク質が調製され、適用され、２−ＤＥによって分離され、染色される。タンパク質は、イメージング技術によって高い分解能で検出できるので、質量分析、イムノアッセイ等のような、それ自体周知の技法によって個別に同定することが可能である。
【００７９】
血清中の極めて豊富な４つのタンパク質に対する抗体を含む本発明のカラムを利用して、血清試料が適用され、非結合画分が廃棄された。結合したタンパク質は酸性緩衝液によって溶離され、本明細書に教示の標準的な２次元電気泳動法によって分離された。その結果が図８であり、予測される４つのタンパク質に関するタンパク質スポットと、血清試料中でこれら４つのタンパク質に結合したタンパク質及びペプチドに相当する他のいくつかのタンパク質スポットが示されている。
【００８０】
豊富でないタンパク質に関する分離及び検出法の感度を高めるため、本発明の別の実施態様は、望ましくない極めて豊富なタンパク質を用いずに、免疫親和性カラムからの関連するタンパク質をストリッピングする。これは、タンパク質を解離するが、抗体−タンパク質結合を破壊するほど過酷ではない溶離条件を利用して実施される。例えばそれほど極端でないｐＨ、カオトロピック剤、熱等は、この目的に有効である。変性条件も、やはり同じ目的に有効である可能性がある。抗体−タンパク質結合をさらに強化して極めて豊富なタンパク質の溶離を阻止すべく、抗体に結合するいかなるタンパク質にも化学反応するように、近くの抗体又は化学部分（例えば架橋剤）をあらかじめ活性化させておくことが可能である。
【００８１】
極めて豊富な、干渉又は汚染する、若しくは望ましくない物質に対する受容体を用いて、タンパク質間相互作用等を判定するという本発明の主たる目標とは異ならせて、受容体を、豊富ではないリガンドを含む、任意の存在度のリガンドに対するものとすることが可能である。目的は、分析のために結合タンパク質を回収することにあるから、特異的に結合する受容体を用いる場合、試料中におけるリガンドの相対濃度は余り重要でない。
【００８２】
この実施態様をどのように利用可能であるかの適切な例の１つは、アルツハイマー病の研究分野である。現在のところ診断は、検死解剖において組織学的に班を観測することによって実施されている。アミロイド班が、この病気の進行に多少関連するものと考えられているが、そうしたことは生きている患者について容易に診断できるものではなく、病理学的事象及び要素を確認することが、薬剤の開発において役立つことになる。最初に、アミロイドタンパク質に対する抗体がカラムに固定化される。アルツハイマーの患者からの脳ホモジェネートがカラムに結合され、全ての非結合材料が自由に洗浄される。結合した関連タンパク質は、共に固定化される。アミロイドタンパク質及び結合した関連タンパク質は次いで、ｐＨ２．５の緩衝液によってカラムからストリッピングされ、その結果生じる溶離物は、さらに２−ＤＥ、ＬＣ／ＭＳ、イムノアッセイその他の方法によって分析され、結合した関連タンパク質の身元が確認される。これらは、潜在的可能性のある診断分析物、薬剤目標等に相当する。
【００８３】
あるいはまた、アミロイドタンパク質を固定化し、ＣＳＦを加え、タンパク質を結合させることが可能である。他の全ての非結合材料は、洗浄して廃棄される。次に、結合した関連タンパク質は、直接分析されるか、又はそれ自体周知の技法の任意の１つによって溶離されて分析され、その身元が確認される。一般に、こうした関連タンパク質のための抗体及びイムノアッセイを用意することが可能である。アルツハイマー患者のＣＳＦと正常なＣＳＦ中におけるこれら関連タンパク質の量を比較することによって、適切な診断が行われる。測定可能な量の同じタンパク質を備え、診断に用いることが可能な、他の体液、血清、尿、血漿等についても同様である。
【００８４】
任意の試料源の１つにおいて、目標は、最も豊富なタンパク質を除去して、あまり豊富ではないタンパク質の有効濃度が高くなるようにすることである。本発明のサブトラクション技法の前に、又はより好ましくは後に、さまざまなタンパク質分離及び検出を利用することが可能である。
【００８５】
動物の血清試料及び特にヒトの血清試料の場合、より豊富なタンパク質の中には、免疫グロブリン、アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、α−１−アンチトリプシン、ヘモペキシン、α_１−酸性糖タンパク質、ミオシン、トランスサイレチン、α_１−アンチキモトリプシン、アポリポプロテインＡＩ、α_２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、及びプレアルブミンがある。同様の分布が、脳脊髄液にも存在する。尿試料の場合、アルブミン及びα−酸性糖タンパク質が最も豊富なタンパク質である。組織試料の場合、血液及び血清タンパク質による汚染が一般的であり、従って上述のアルブミン、ヘモグロビン、及び他の任意の血清タンパク質が、除去すべき汚染物質である。したがって、いくつかのタンパク質の除去が可能である。それは全タンパク質の少なくとも約８５％のサブトラクション（除去）に相当する。しかし、異なるマトリックスを個々のタンパク質に結合させ、試料からそれらのタンパク質を取り除くのに利用することができるので、除去可能なタンパク質の数に制限はない。かくして、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はこれらの間の任意の数、又はこれらを超える数のタンパク質であっても、除去し、通常は分解不能なタンパク質を識別し得る量で含有するように濃縮可能な試料を生じさせることができる。
【００８６】
他の試料の場合、数種の極めて豊富か、又は相当に干渉するタンパク質を除去できるのが望ましい。換言すると、本発明の実施において、試料中のタンパク質の少なくとも４０％を除去するのが望ましい。好ましくは、タンパク質の少なくとも５０％を除去する。用いられる特定のマトリックスの数を増すことによって、後続の分析に先立って、試料中に存在するタンパク質の５０％を超える除去、６０％を超える除去、７０％を超える除去、７５％以上の除去、８０％を超える除去、及び９０％を超える除去さえ可能になる。下記の例の１つでは、もとの血清タンパク質濃度は８８ｍｇ／ｍｌであった。カラムを通過した後、７４ｍｇ／ｍｌが除去され、流通した溶出液は、濃縮後に１．４ｍｇ／１００ｍｌのアリコートしか含んでいなかった。理論的には、除去量は、試料中の各種リガンドの存在度、及びこれらの除去に用いられる対応する受容体の数によってのみ制限される。典型的な割合は表１から明らかであるが、これは元の試料が異なれば異なることになる。同様にして、他の試料に関して最も共通するタンパク質又は最も干渉するタンパク質のリストを求める（既に公知文献に記載されていなければ）ことが可能であり、これらから、利用に適した抗体を選択することが可能になる。
【００８７】
任意の試料から除去すべき特定のタンパク質は、試料中に存在する豊富なタンパク質に基づいて任意に決定することが可能である。異なる試料が有する除去すべき豊富なタンパク質は、殆ど同じ場合もあり、また異なる場合もある。植物試料の場合、一般にリブロース２リン酸オキシゲナーゼ／カルボキシラーゼ（ルビスコ）が、多くの植物の葉において最も豊富なタンパク質の１つである。
【００８８】
どのタンパク質が豊富なタンパク質であるかが未知の試料については、まず予備分離及び分析を行って、最も豊富なタンパク質を確認することが可能である。次に、これらのタンパク質に対する抗体を生成し利用して、豊富なタンパク質を除去する。このプロセスを繰り返すことによって、所望の除去を実現することができる。
【００８９】
こうした再利用可能なマトリックスを利用して、豊富なタンパク質を除去すると、再現可能で処理能力の高い仕方で、試料中においてより豊富でないタンパク質を同定し分解することが可能になる。再現性のおかげで、試料間における比較が可能になる。バッチ式に各試料を流すか、又は同じカラムで実験して、免疫サブトラクションにおける変動を制御するのが望ましい。
【００９０】
本発明の方法及び試薬の多くは、自動化が容易であり、処理能力及び再現性がさらに向上する。アプライド・バイオシステムズ社によって市販されているＩＮＴＥＧＲＡＬ及びＢＩＯＶＩＳＩＯＮワークステーションといった、市販のクロマトグラフィカラム及びステーションのような、現在利用可能な分離技法は自動化が可能である。こうしたワークステーションは、直列をなす複数のカラムの設置を可能にし、この場合異なる緩衝液で種々のカラムを溶離することが可能になる。また２−ＤＧＥの場合、それらの手法の多くはやはり自動化が容易であり、又は自動化がなされている。例えば出願人の先の特許であるAnderson他の米国特許第５９９３６２７号明細書を参照されたい。その結果、非常に時宜に適った仕方で成果が得られる、極めて再現性の高いシステムとなる。
【００９１】
「豊富」とは、例えば、試料中の各種タンパク質の実際の相対量に基づき、試料中でより多量に存在するタンパク質を意味する。豊富さはまた、２−Ｄゲル上で迅速かつ強く染色されるタンパク質スポットとしても明らかになる。豊富さの測定法は、例えばタンパク質の全量と比較して、相対測定値を確認することである。染色ゲルの濃度走査によって、こうした測定を得ることが可能である。分離された染色タンパク質を含む２−Ｄゲルは、デンシトメータで得られ、走査される。デンシトメータは次いで、ゲル上の染色タンパク質の全量、及び任意のタンパク質の全量に対する相対比率を計算する。こうした計算を用いると、豊富なタンパク質とは、試料中における全タンパク質の少なくとも１％に相当するタンパク質である。
【００９２】
本明細書において用いられる「タンパク質」は、機能とは関係なく、アミノ酸を含む任意の重合体である。タンパク質は、リン酸塩、糖、及び他の有機基といった、他の化学部分を含有することによって変性可能である。従って、２つのアミノ酸を含有するジペプチドであって、既知の機能がないものは、本出願の目的からはタンパク質である。タンパク質の別名は、ポリペプチドである。タンパク質は、動物由来、微生物由来、及び環境由来又は植物由来として得ることが可能である。
【００９３】
本発明は、複数化合物の同時精製、又は特に規定された量の複数物質が所望される場合の組成物の調製といった、多くの多岐に渡る用途に用いることが可能である。この実施態様の場合、固相には、存在する受容体のモル比によって規定されるモル比でもって、溶液から対応するリガンドを吸着する、複数の受容体が含まれる。例えばバクテリアの発酵によって、洗濯用洗剤に用いられる混合されたプロテアーゼ及びリパーゼが得られる。各プロテアーゼ及び各リパーゼ毎に所望の比率で受容体を有する吸着剤が、バクテリア酵素又はライセートに添加される。吸着剤は、沈殿、濾過、磁力（磁気ビーズの場合）等によって回収され、所望のプロテアーゼ及びリパーゼが溶離されて、回収される。他の用途には、粉ミルクを製造するためのプロテアーゼ、及び他のタンパク質加水分解物、デンプン加水分解酵素、人工香味料、及び芳香剤、又はそれらを製造するための酵素が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】
以上で本発明を完全に記述したが、下記の非制限的な例において、本発明のさまざまな態様が示される。
本発明技術の能力の立証
本発明では、処理能力の高い、新規な免疫アフィニティクロマトグラフィをベースにしたテクノロジと、多成分免疫アフィニティクロマトグラフィタンパク質サブトラクションを施された試料の２次元電気泳動による逐次のタンパク質試料定量分析を組み合わせた手法を記述している。記述した免疫アフィニティクロマトグラフィ技法の個々の側面、及び２次元電気泳動と組み合わせたその応用が報告されているが、（ｉ）単純な２ステップのクロマトグラフィ手法による個々の免疫アフィニティマトリックス生成方法について記述し、（ｉｉ）任意の所望の割合で利用することが可能な各免疫親和性成分毎に別々のクロマトグラフィマトリックス材料を生成し、（ｉｉｉ）再現可能な多成分の「プール」されたクロマトグラフィマトリックスの生成に成功し、（ｉｖ）多成分クロマトグラフィマトリックスの相当の再利用性（＞３００回）を立証し、（ｖ）高処理能力の自動化手法であり（１日当り＞５０試料の処理能力）、及び（ｖｉ）クロマトグラフィ試料が２次元電気泳動による分離を施された後、純タンパク質の正確な定量を可能にするといった応用例については知られておらず、発表もされていない。さらに、高処理能力の獲得に成功するため、クロマトグラフィマトリックスは、高流速、効率の良い結合、及び、マトリックスの高速再生を可能にするように選択された。極めて多孔性のビーズの表面対体積比によって可能になる高試料処理能力にとっては、灌流クロマトグラフィが理想的である。こうした灌流クロマトグラフィマトリックス（「ＰＯＲＯＳ」ビーズ）の製造業者には、アプライド・バイオシステムズ社（米国マサチューセッツ州フラミンガム）がある。
【００９５】
本明細書において解説のテクノロジは、制限するわけではないが、生体からの液体試料、又は生体の一部又は全部から得られた液体といった、生物学的試料に適用される。このテクノロジは、試料の処理能力を実質的に損なうことなく、液体から少なくとも５０％を超えるタンパク質の定量を可能にするので、特にこれらの試料中におけるタンパク質の分析に適用可能である。さらに、免疫親和性を利用したクロマトグラフィ分離手法を、各試料毎に２つ以上の画分を生成する特定の種類の試料に適した別の親和性手法又は他のクロマトグラフィ手法に転用するというフレキシビリティがある。免疫アフィニティクロマトグラフィと麦芽凝集素（レクチン）アフィニティクロマトグラフィを組み合わせる、血清タンパク質分画法が実証されている。
調製例Ａ：個別のクロマトグラフィ用免疫アフィニティマトリックスの生成
これまでに発表されている免疫クロマトグラフィ法とは異なり、以下に述べる技法では、極めて純度の高い抗体、及びそれを含有する極めて特異性の高い免疫アフィニティクロマトグラフィマトリックスが生成される。
【００９６】
アフィニティクロマトグラフィマトリックスは、灌流クロマトグラフィに用いられるＰＯＲＯＳマトリックスを利用して生成された。このマトリックスの誘導体は、アプライド・バイオシステムズ社から入手した。サイズ排除クロマトグラフィカラム（ＳＥＣ）は、バイオラド社から入手した。抗血清は、多くの異なる会社から入手し、力価は最高濃度の活性純抗体を備えた抗血清を選択するように決定された。
【００９７】
ＰＯＲＯＳ−ＡＬは、タンパク質を共有結合的に固定化するために用いられた、あらかじめ活性化された（アルデヒド機能）マトリックスである。ある所与の体液試料から全てのタンパク質を除去するため、複合的な抗血清からの純粋な特異的抗体に関する「選択」試薬として、タンパク質親和性マトリックスが生成された。この試薬は、（ａ）市販の、又は追加的に精製された純タンパク質、及び（ｂ）ＰＯＲＯＳ−ＡＬマトリックスであった。タンパク質親和性マトリックスは、バッチ手法で生成された。かくして、ある所与の試料から取り除かれるタンパク質と同じ数だけの、別々のタンパク質誘導体化親和性マトリックスが合成された。
【００９８】
ＰＯＲＯＳ−Ｇ２０及びＰＯＲＯＳ−Ａ２０は、既に特定のタンパク質が固定されたマトリックスである。これらのタンパク質はそれぞれ、プロテインＧ及びプロテインＡである。これら２つのタンパク質は、抗体のＦｃ断片に対する親和性が極めて高く、従って部位指向的な仕方で抗体を固定化するのに理想的に適している。マトリックスに容易に結合するプロテインＡ及びプロテインＧの注目すべき利点は、（ａ）固定化状態における抗体の安定性、（ｂ）対応する抗原との相互作用に利用可能な全てのＦａｂフラグメントを備えた抗体の正確な配向、及び（ｃ）抗体分子の構造と干渉しない極めて効率の良い共有結合ステップである。
【００９９】
図１には、抗血清から抗体を精製し、親和性カラムに固定化するために用いられるクロマトグラフィシステム及びプロセスが示されている。このシステムでは、複数カラムのためにカラム切換弁Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３が用いられた。カラム１は抗原タンパク質カラム（上述の活性化ＰＯＲＯＳ−ＡＬマトリックスが充填された）である。カラム２は、酢酸で溶離された抗体を中和し、塩を部分的に除去し、ＰＯＲＯＳ Ａ又はＧカラムでアフィニティトラッピングを施す前に、孔によって分子を篩にかけるＳＥＣカラムである。抗血清充填及び抗体トラッピングからなるワンステップクロマトグラフィが一続きで、ＰＯＲＯＳ Ａ又はＧカラムが抗体によって飽和するまで実施された。この飽和プロセスは、クロマトグラフィステーションの検出器Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３を用いて、直接ＵＶ２８０ｎｍの吸着を測定することによってモニタ可能である。
【０１００】
抗体カラムが得られると、１００％ＤＭＰ架橋に関する従来の手順の後で、二官能性架橋剤として５０％ジメチルピミジミレート（ＤＭＰ）及び５０％ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）を用いて、固定化された抗体がプロテインＡ又はＧに架橋され、かくしてマトリックスに共有結合的に付着される。ＤＭＰ／ＤＭＳは、アミン基との反応、及びイミノアミド結合によるプロテインＡ又はＧと抗体の結合が素早いので、「カラムでの架橋」手法において有効に作用する。酸性及び中性のｐＨ条件下において、その化学結合は極めて安定しており、タンパク質抗原結合及び溶離に対する抗体カラムの再生可能な利用が可能になる。
調製例Ｂ：多成分クロマトグラフィシステム用のマトリックスのプール
上述の手法は、多数のタンパク質抗原について実施可能であり、従って多数の免疫特異的抗体誘導体化マトリックスの生成が可能である。ここに記載する発明は、こうした抗体誘導体化免疫アフィニティクロマトグラフィマトリックスを利用する柔軟性を有する。個々のマトリックスを生成し、規定の量又は重さの分だけ、カラムに充填することが可能である。
【０１０１】
カラムの抗原結合能力は、飽和ピークが観測されるまで、カラムに抗原を個別に段階的に充填することによって評価することができる。従って、それぞれの抗体誘導体化マトリックスについて、カラムで捕捉可能な抗原の最大量を個別に計算することが可能である。規定の複数タンパク質結合能力を備えた多成分免疫アフィニティシステムへとマトリックスをプールすることによって、特定の目的のための特定のクロマトグラフィカラムを生成することが可能になる。下記の表は、こうした実体がいかに有用であるかの例である。血清には、いくつかの極めて豊富なタンパク質が含有されている。２−ＤＧＥのような「下流の」手順において、より豊富でないタンパク質を検出できるようにするためには、豊富なタンパク質を除去することが関心事となる。上述の多成分クロマトグラフィカラムの場合、こうしたタンパク質を数分で特異的に除去することが可能である。
【０１０２】
下記の表１には、多成分抗体アフィニティマトリックス（ＭＣＡＡＭ）が生成され、血清試料の生成に利用されたタンパク質がリストされている。この血清試料は結果として、これらのタンパク質とは全く異なるタンパク質分布を含み、また他の場合には検出できない、図３の銀染色ゲルのタンパク質スポットパターンで見えるようになる、より豊富でないタンパク質を含む。しかし、取り除かれるタンパク質の性質によっては、全てのマトリックスを１つのカラム本体にプールするのが必ずしも望ましいとは限らない。多くの例示的な用途では、少なくとも２つの独立したカラム本体が望ましい。タンパク質は、以下で詳述するさまざまな特定の溶離条件下で、その同族固定化抗体から溶離する可能性があるからである。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
免疫グロブリンＧについては、非誘導体化プロテインＧ及びＡによる十分な残留物との結合によって取り除かれるので、免疫アフィニティマトリックスを付加する必要はなかった。残留物との結合が不十分であれば、抗ＩｇＧアフィニティ・マトリックスを利用することが可能である。
【０１０５】
血清タンパク質の良好なサブトラクションに関する３つの特定の例が示された、図３を参照されたい。矢印１〜３は、両ゲル中におけるタンパク質の位置を示している。従って、ゲルＢ中において、矢印１はアルブミンを表し、矢印２はトランスフェリンを表し、矢印３は、ハプトグロビン鎖を表している。ゲルＡ中における矢印４は、血清から取り除かれる他の主たるタンパク質を表しており、これらはゲルＢには現れないか、ごくわずかな量しか現れない。両ゲルとも、２−Ｄ電気泳動に先立って、ＩＥＦゲルに約１８０μｇの血清タンパク質が加えられた。試料の付加前又は試料の溶離時に、溶離した抗体は本質的になかった。
調製例Ｃ：クロマトグラフィ分離
本発明におけるタンパク質のクロマトグラフィ分離では、少なくとも２つのカラムのためのカラム切換弁を備えたクロマトグラフィステーションが利用され、タンパク質が溶離緩衝液中における溶解度に関して異なる特性を有する場合には、ＭＣＡＡＭカラムに結合したタンパク質の個別溶離が利用される。大部分のタンパク質は、酸性条件下（例えば、５％酢酸）において、同族抗体から溶離する。しかしタンパク質には、酸性緩衝液に溶解せず、カオトロピック塩／洗剤混合物（２Ｍの尿素及び２％のＣＨＡＰＳ）による溶離を必要とするものもあり、疎水性タンパク質には、同族抗体からの溶離に有機溶剤（例えば、３０％アセトニトリル）を必要とするものもある。従って、上述の血清の例では、α−２マクログロブリン及びアポ−Ａ１リポタンパク質は、カオトロピック塩と、それぞれ２０％及び３０％の有機溶剤緩衝液を含有する緩衝液を用いると、いっそう容易に溶離する。血漿について作業する場合、免疫アフィニティマトリックスからの溶離のためにカオトロピック塩緩衝液を用いると、フィブリノーゲンがより効率的に取り除かれる。図２には、カラム切換弁及び流路を含む、免疫サブトラクションクロマトグラフィシステムの組合せに関する例が示されている。
【０１０６】
用いられた緩衝液は、
ａ．酸性溶離緩衝液：５％酢酸、５００ｍＭのＮａＣｌ
ｂ．カオトロピック塩緩衝液：２Ｍの尿素、２％ＣＨＡＰＳ、７％酢酸
ｃ．有機溶剤緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、３０％アセトニトリルであった。
【０１０７】
あるいはまた、ヒトのフィブリノーゲンは、断片Ｄへの結合性に鑑みて、受容体としてアスペルギルス・フミガーツス・コニディアを利用することによって、又はＡ群連鎖球菌の表面上のＭタンパク質を利用することによって除去することが可能である。
例Ｄ：２−ＤＧＥ用に２組のタンパク質試料を生成する免疫アフィニティとレクチンアフィニティクロマトグラフィの組合せ
本発明の異なる実施態様の１つにおいて、免疫アフィニティクロマトグラフィと、麦芽凝集素（ＷＧＡ）レクチンアフィニティクロマトグラフィが組合せられた。２つの画分が生成された。試料が血清の場合、全タンパク質の約３０％〜５０％にあたる、高度にグリコシル化されたタンパク質がＷＧＡカラムによって結合され、糖Ｎ−アセチルグルコサミンの０．５Ｍ溶液で個別に溶離されたが、第２の画分は、グリコシル化されないか、又はこのレクチンに対する親和性のないタンパク質から構成されており、従ってカラムに結合されなかった。図４のゲルは、（ａ）結合されなかった血清、又は（ｂ）結合され、糖でレクチン親和性カラムから溶離された血清からの、タンパク質の組を視覚化したものである。この分画は、２−Ｄゲル電気泳動のためのタンパク質の充填量を増すことによって、２つの画分のいずれにおいてもタンパク質をさらに濃縮することを目的としている。このレクチンアフィニティ分画の手法を用いると、２つの異なる画分において取り除かれなかった血清タンパク質のほぼ２倍の濃縮が生じ、また２−ＤＧＥゲル像の獲得時により容易な分析を可能にする、さらなる「パターンの単純化」が得られる。
【０１０８】
図４において、血清タンパク質のサブトラクションは、第１のクロマトグラフィステップで実施され、残存するタンパク質は、ビオチン化ＷＧＡでさらに固定化された、ストレパビジン誘導体化ＰＯＲＯＳマトリックスにさらされた。カラムを通過した画分から生じるゲルＡ中のタンパク質、レクチンで結合され０．５ＭのＮ−アセチルグルコサミンで溶離された分画からのゲルＢ中のタンパク質が、２−ＤＧＥによって分析された。何れのゲルにおいても、２−Ｄ電気泳動に先立って、約１８０μｇの血清タンパク質が、ＩＥＦゲルに加えられた。
例Ｅ：２−ＤＧＥ及び分析のための試料調製
ここに記述する免疫アフィニティクロマトグラフィによって生成される試料は、サブトラクションプロセス中に希釈された。３〜５ｍＬのサブトラクション血清タンパク質溶離液が収集され、ポリスルホン膜濃縮ユニット（ミリポア社製のＵｌｔｒａｆｒｅｅ ４）で濃縮され、２５ｍＭの重炭酸アンモニウムで平衡化され、凍結乾燥され、９Ｍの尿素／２％ＣＨＡＰＳ／６０ｍＭのＤＴＴ緩衝液、すなわち２−ＤＧＥの一次元分離中に試料中のタンパク質を等電点電気泳動するのに用いられる緩衝液で再度溶解される。
【実施例１】
【０１０９】
６つの豊富な血清タンパク質と結合する抗体を担持するマトリックスが生成された。６つのタンパク質は、アルブミン、ハプトグロビン、トランスフェリン、α−１−アンチトリプシン、α_２−マクログロブリン、及び、アポリポプロテインＡＩであった。これらのタンパク質は、市販品を購入し、ＰＯＲＯＳ ＡＬマトリックスに個別に加えて結合させた。このマトリックスはカラムに充填され、各タンパク質毎に市販のポリクローナル抗体が添加された。非結合マトリックスは廃棄された。抗体は、上述し図１に示した方法によって溶離され、中和され、脱塩され、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラムに充填された。抗体は、上述の方法でその場で架橋された。１つのタイプの抗体を担持する各マトリックスは、既知の技法を用いて結合能力をテストされた。これには、濃度が既知の種々の量の溶液をマトリックスにさらし、次いでマトリックスによって結合されるタンパク質がそれ以上なくなる時点を確認することを含む。これは、ＵＶ２８０ｎｍでの流通物の吸着を確認することが可能なＵＶモニタを用いるといった、既知の技法を利用して確認可能である。各マトリックスに対する結合能力を判定する。次に、６タイプ全てのマトリックスが、血清中の各タンパク質の相対量に比例した、それぞれの結合能力に基づく比率で混合され、カラムに充填された。
【０１１０】
血清試料は、カラムに通された。試料の量は一般に、１００μｌ未満の量であった。タンパク質は、中性緩衝液で洗浄された。溶離液が得られ、濃縮され、次いでその中のタンパク質が２−ＤＧＥによって分離された。ゲルはクーマシーブルー及び銀染色剤で染色され、血清のより豊富ではないタンパク質が明らかになった。
【０１１１】
約１０の血清試料を充填し、溶離を繰り返した後、α_２−マクログロブリンサブトラクションの減少が認められた。約２５血清試料を充填し、溶離を繰り返した後、アポリポプロテインＡＩサブトラクションの低減も観測された。α_２−マクログロブリン及びアポリポプロテインＡ_１を分離及び／又は可溶化する酸性の水性溶離緩衝液（０．８Ｍの酢酸／０．１５ＭのＮａＣｌ）が、不十分又は不安定になっていたものと推定された。これら２つのタンパク質は、抗体マトリックスと結合したままであるか、或いはマトリックスの抗体から解放された後に沈殿したように思われた。アルブミン、ハプトグロビン、トランスフェリン、及びα−１−アンチトリプシンを完全に取り除くこのカラムの容量は、６２．５μＬの血清中に見出されるタンパク質の量に近い。下記の緩衝液を有し、アンチ−α_２−マクログロブリン及びアンチ−アポリポプロテインＡＩが別々のカラムに入れられた、２つのカラムシステムが利用された。α_２−マクログロブリンは、１．５Ｍのチオシアン酸アンモニウムでマトリックスから溶離することができ、アポリポプロテインＡＩは、０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液中の３０％アセトニトリルで溶離できた。
【実施例２】
【０１１２】
５００ｍＭの重炭酸アンモニウム（ＡｍＢｉｃ）中の分画後のタンパク質試料が、限外濾過膜によって濃縮された。ＡｍＢｉｃの濃度は、２５ｍＭのＡｍＢｉにまで希釈され、試料は凍結乾燥バイアル（小瓶）に移され、６μＬの２Ｍスクロースが添加され、試料は少なくとも４８時間にわたって凍結乾燥された。等電点電気泳動装置チューブのゲルに試料を加える１時間前に、試料は、Ｐｉｎｋ Ｍｉｘ（９Ｍの尿素、２％ＣＨＡＰＳ（市販の緩衝液）、０．５％ＤＴＴ、及び２％両性電解質（ｐＨ８〜１０．５））中で再度可溶化され、完全に溶解したかが検査された。試料は、Anderson他著、Electrophoresis１２、ｐ．９０７−９３０（１９９１年）に記載の手順に従った後に、２−ＤＧ電気泳動に用いられた。
【実施例３】
【０１１３】
ノイラミニダーゼは、いくつかのタンパク質（グリコシル化）系列の崩壊に有効である。スポットの複雑性を軽減し、特定スポットの強度を改善するには、少量のノイラミニダーゼで十分である。９０分の消化後に、１つの２−Ｄ血清タンパク質充填アリコートに相当する量の最も明瞭なグリコシル化系列を除去するには、約２５ｍ単位のノイラミニダーゼ（プロザイム、シアリダーゼＡ）で十分であった。タンパク質スポットの有用な比較を可能にするには、脱グリコシル化が完全であることが望ましい。プロザイム酵素は組換え体であるため、汚染プロテアーゼは存在しない。
【実施例４】
【０１１４】
血漿内にある血漿タンパク質の分解は、主としてゲル内に豊富なフィブリノーゲン鎖があるため、タンパク質が組織内にある場合よりも悪い。実施例１の方法によって、ポリクローナルアンチフィブリノーゲンマトリックスが生成された。結合特異性及び能力は、フィブリノーゲンのサブトラクションを可能にするのに十分であった。
【実施例５】
【０１１５】
血清中に見出される豊富なタンパク質を取り除くための複数の抗体を担持するカラムが、脳脊髄液に用いられた。血清との主たる相違点は、脳脊髄液中のタンパク質量が少ないので、クロマトグラフィ分離のための充填量がかなり多いという点である（血清の場合の６２μＬに比べて、１．２ｍＬ）。カラムは脳脊髄液用に最適化されていなかったが、十分に機能した。図５には、免疫サブトラクション手法を用いた場合と、用いない場合の、２−ＤＥによるＣＳＦ試料タンパク質の比較結果が示されている。豊富でないタンパク質のスポットの多くは、免疫サブトラクションを施された試料の２−ＤＧにおいて視認可能であるが、これは試料全体の２−ＤＧでは観察できない。
【実施例６】
【０１１６】
タンパク質サブトラクションカラムが、試料中のタンパク質の大部分を占める共通タンパク質を除去するように準備された。血清は、約８０対の一卵性双生児から得た。血清試料には、約７０ｍｇ／ｍｌのタンパク質が含まれている。脂質は、クロマトグラフィ分離に干渉しないことが分った。２５〜５０マイクロリットルの血清試料が用いられた。
【０１１７】
幾つかの試料については、２つのカラムが用いられた。第１のカラムにはＰＯＲＯＳビーズが充填され、アルブミン、トランスフェリン、及びハプトグロビンを対象とする抗体が結合されたた（ＡＴＨカラム）。抗体はこのマトリックスに対し、プロテインＡ、プロテインＧ、又はこれら２つの混合物によって結合され、続いて上記のように架橋された。第２のカラムには、固定化された麦芽凝集素が充填された。
【０１１８】
他の試料については、第１のカラムには、α１−アンチトリプシン、アルブミン、トランスフェリン、及びハプトグロビンに対して特異な抗体が充填された（ＡＡＴＨカラム）。第２のカラムには、固定化プロテインＡが充填された。全ての抗体は、Schneider他著、J.Biol. Chem.２５７：１０７６６−１０７６９（１９８２年）に記載の方法を利用して、プロテインＡ又はプロテインＧに架橋された。約４ｍｌの親和性樹脂が用いられた。一般に、これらのカラムによって、選択された成分の全てが除去された。
【０１１９】
上述のように、第１のカラムには約１．７〜３．４ｍｇのタンパク質が添加された。ＡＴＨカラムの場合、非結合タンパク質は、０．５Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液を用いて溶離され、次いで第２のカラムに移された。第１の非結合画分は、０．５Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液で溶離され、次いで第２の画分が、０．５ＭのＮ−アセチルグルコサミン、続いて０．５Ｍの重炭酸アンモニウムを用いて溶離された。２８０ｎｍのＵＶの読み値をモニタして、再現性及びカラム挙動が制御された。カラムに保持されたタンパク質は、ｐＨ２．５の酢酸緩衝液を用いてＡＴＨカラムから除去され、カラムが再生された。
【０１２０】
血清タンパク質の約半分が、この手法によって試料から除去された。第１の試料には、グリコシル化タンパク質が含まれている。レクチンカラムに通された第２の試料には、非グリコシル化タンパク質が含まれている。最終のタンパク質濃度は、０．５Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液中において、１２〜２２ｍｇ／ｍｌの範囲であった。画分は濃縮され、緩衝液は交換され、次いで試料は凍結乾燥された。
【０１２１】
これらの試料は、９Ｍの尿素、２％ＣＨＡＰＳ（市販の緩衝液）、０．５％ＤＴＴ、及び２％両性電解質（ｐＨ８〜１０．５）を含む緩衝液中で再度可溶化され、５〜２０μｌの試料が２−Ｄゲルに加えられた。試料のタンパク質は、当該技術で既知のところに従い、また上記実施例２に従って、ＩＳＯ−ＤＡＬＴシステムで分離された。結果的に得られたクーマシーで染色されたゲルは、１３３μｍの分解能で赤色光によって走査され、ディジタル化され、像は当該技術において既知のケプラーシステムを用いて処理された。各ゲルに存在するタンパク質のパターンは、相互にほぼ完全に異なっていた。
【０１２２】
ゲルは脱染され、次いで銀染色された。像は３０秒間隔で撮影され、ＷＯ ０１／１６８８４に記載の方法に従い、２Ｌの脱イオン水中８８ｇのトリス及び４４ｍｌの氷酢酸を用いて展開が停止された。
【０１２３】
最初にＡＡＴＨカラムに流された試料も、同様に処理された。ゲルを比較して、双生児対の間における、タンパク質と、肥満、糖尿病、骨粗鬆症、骨関節炎、及び高血圧症といった特定の疾病の状態との相関関係が確認された。
【実施例７】
【０１２４】
表１に示された１２及び１４の抗原に対する抗体マトリックスを利用する点を除いて、実施例１の方法が繰り返された。図４には、免疫サブトラクション手法を用いた場合と、用いなかった場合の、試料タンパク質の２−ＤＧ比較が示されている。豊富でないタンパク質スポットの多くが、免疫サブトラクションを施された試料の２−ＤＧでは視認可能となるが、これは試料全体の２−ＤＧでは観察できない。
【実施例８】
【０１２５】
血清及び血液タンパク質に対する抗体マトリックスを利用する点を除いて、実施例１の方法が繰り返された。図６には、免疫サブトラクション手法を用いた場合と、用いなかった場合の、腎臓皮質組織タンパク質画分の２−ＤＥによる比較が示されている。豊富でないタンパク質スポットの多くが、免疫サブトラクションを施された試料の２−ＤＧでは視認可能となるが、これは試料全体の２−ＤＧでは観察できない。
【実施例９】
【０１２６】
アルブミン及びα−酸性糖タンパク質に対する抗体マトリックスを利用する点を除いて、実施例１の方法が繰り返された。図７には、免疫サブトラクション手法を用いた場合と、用いなかった場合の、尿素試料タンパク質の２−ＤＥによる比較が示されている。豊富でないタンパク質スポットの多くが、免疫サブトラクションを施された試料の２−ＤＧでは視認可能となるが、これは試料全体の２−ＤＧでは観察できない。
【実施例１０】
【０１２７】
血清中の４つの豊富なタンパク質に対する抗体を有するカラムを利用する点を除いて、実質的に実施例１の方法が繰り返された。血清試料が加えられ、非結合画分が廃棄された。結合したタンパク質は、ｐＨ２．５の酸性緩衝液によって溶離され、回収され、ｐＨ９．０のトリス−ＨＣＬ緩衝液によって中和され、上記実施例に教示した標準的な２次元電気泳動法によって調製され分離された。その結果が図８であり、この図には、予想された４つのタンパク質のタンパク質スポットと、血清試料中でこれら４つのタンパク質に結合したタンパク質及びペプチドを表す、他のいくつかの他のタンパク質スポットが示されている。
【実施例１１】
【０１２８】
関連タンパク質、タンパク質間相互作用、及びある種の選択されたタンパク質に結合された他のタンパク質は、次のように決定される。実施例１０の２次元ゲルは走査され、免疫サブトラクションが施された４つのタンパク質に明確には属さない全てのスポットがゲルから切り取られ、トリプシンで消化され、タンパク質分析の標準的方法に従って質量分析に備えて調製された。同定された全てのタンパク質は、マトリックス中の抗体によって結合された４つのタンパク質の少なくとも１つに関連したタンパク質であると考えられる。
【０１２９】
確認は、実施例１の固定化タンパク質カラムを用い、血清試料をそれに通し、非結合タンパク質を溶離し、続いて結合タンパク質の酸性ストリッピングを行い、２−ＤＥ及び質量分析法による分離及び分析を行うことによってなされる。
【０１３０】
本明細書に開示の実施態様に対して、さまざまな修正が可能であることが理解されよう。したがって以上の記述は、制限の意味にとるべきではなく、望ましい実施態様の例証としてのみ解釈すべきである。当業者であれば、添付の請求項の範囲及び思想を逸脱することなく、他の修正に思い至るであろう。
【０１３１】
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、ここでの参照によってその全体が本明細書に明示的に取り入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】抗原カラムにおける親和性結合、サイズ排除クロマトグラフィによるサイズ分画、及びプロテインＡに対する逐次の固定化による、抗血清からの精製ポリクローナル抗体の生成システムを示す図である。
【図２】試料を複数のアフィニティクロマトグラフィカラムに通すための構成を示す図である。
【図３Ａ】１４のポリクローナル血清タンパク質特異な又は血清タンパク質系統特異なクロマトグラフィＩｇＧ樹脂の混合物を用いた免疫アフィニティサブトラクション前における、ヒト血清の銀染色２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。Ｘ軸はｐＩを示し、Ｙ軸は分子量をＫダルトンで示している。
【図３Ｂ】１４のポリクローナル血清タンパク質特異な又は血清タンパク質系統特異なクロマトグラフィＩｇＧ樹脂の混合物を用いた免疫アフィニティサブトラクション後における、ヒト血清の銀染色２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。Ｘ軸はｐＩを示し、Ｙ軸は分子量をＫダルトンで示している。
【図４Ａ】１２の血清タンパク質のクロマトグラフィによる免疫アフィニティサブトラクション、及び残存するタンパク質の画分をレクチン親和性のない画分へと分画した、ヒト血清のクーマシー・ブルーＧ２５０染色を施した２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。Ｘ軸はｐＩを示し、Ｙ軸は分子量をＫダルトンで示している。
【図４Ｂ】１２の血清タンパク質のクロマトグラフィによる免疫アフィニティサブトラクション、及び残存するタンパク質の画分をレクチン親和性のある画分へと分画した、ヒト血清のクーマシー・ブルーＧ２５０染色を施した２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。Ｘ軸はｐＩを示し、Ｙ軸は分子量をＫダルトンで示している。
【図５】１、２、及び３は、ヒトの脳脊髄液のクロマトグラフィによる免疫アフィニティサブトラクション前、カラムに保持されたタンパク質、及び通過したタンパク質の、クーマシー・ブルーＧ２５０染色を施した２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。
【図６】１及び２は、クロマトグラフィによる免疫アフィニティサブトラクションの前後における、腎臓皮質組織の可溶性タンパク質画分のクーマシー・ブルーＧ２５０染色を施した２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。
【図７】１及び２は、クロマトグラフィによる免疫アフィニティサブトラクションの前後における、尿タンパク質のクーマシー・ブルーＧ２５０染色を施した２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。
【図８】本発明の免疫アフィニティクロマトグラフィ・カラムによって取り除かれた、４つの豊富な血清タンパク質及びこれらのタンパク質に結合したものの銀染色２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。
【図９】本発明の免疫アフィニティクロマトグラフィカラムによって取り除かれた、免疫グロブリン系列及びこれらのタンパク質に結合したものに関する銀染色を施された２−Ｄ電気泳動ゲルの像である。

Claims (49)

1. 相互に接触する第１及び第２の固相マトリックスと、
   第１のリガンドに対して特異的に結合可能であるが第２のリガンドに対してはそうでない、前記第１の固相マトリックスに固定化された第１の受容体と、及び
   前記第２のリガンドに対して特異的に結合可能であるが、前記第１のリガンドに対してはそうでない、前記第２の固相マトリックスに固定化された第２の受容体とからなる、親和性結合組成物。
2. 第３のリガンドに対して特異的に結合可能であるが、前記第１のリガンド又は前記第２のリガンドに対してはそうでない、第３の固相マトリックスに固定化された第３の受容体をさらに含む、請求項１に記載の親和性結合組成物。
3. 第４のリガンドに対して特異的に結合可能であるが、前記第１のリガンド、前記第２のリガンド、又は前記第３のリガンドに対してはそうでない、第４の固相マトリックスに固定化された第４の受容体をさらに含む、請求項２に記載の親和性結合組成物。
4. 第５のリガンドに対して特異的に結合可能であるが、前記第１のリガンド、前記第２のリガンド、前記第３のリガンド、又は前記第４のリガンドに対してはそうでない、第５の固相マトリックスに固定化された第５の受容体をさらに含む、請求項３に記載の親和性結合組成物。
5. 前記リガンドがタンパク質である、請求項１に記載の親和性結合組成物。
6. 前記受容体が抗体である、請求項１に記載の親和性結合組成物。
7. 前記マトリックスが多孔性である、請求項１に記載の親和性結合組成物。
8. 液体入口及び液体出口を備えるチャンバと、前記チャンバ内の請求項１に記載の親和性結合組成物からなり、前記入口から前記出口に流れる液体が前記親和性結合組成物を通過又は貫通する、親和性カラム。
9. 液体入口及び液体出口を備えるチャンバと、前記チャンバ内の請求項２に記載の親和性結合組成物からなり、前記入口から前記出口に流れる液体が前記親和性結合組成物を通過又は貫通する、親和性カラム。
10. 液体入口及び液体出口を備えるチャンバと、前記チャンバ内の請求項６に記載の親和性結合組成物からなり、前記入口から前記出口に流れる液体が前記親和性結合組成物を通過又は貫通する、親和性カラム。
11. 受容体を有する少なくとも１つの固相マトリックスが、異なる受容体を有する少なくとも１つの他の固相マトリックスから選択的に除去可能である、請求項１０に記載の親和性カラム。
12. 液体入口及び液体出口を備えるチャンバと、前記チャンバ内の請求項７に記載の親和性結合組成物からなり、前記入口から前記出口に流れる液体が前記親和性結合組成物を通過又は貫通する、親和性カラム。
13. 第１の液体入口、第１の液体出口、及び、第１の固相マトリックスに固定化され、第１のリガンドに対して特異的に結合可能であるが第２のリガンドに対してはそうでない第１の受容体を含むチャンバを備えた、第１の親和性カラムと、
    第２の液体入口、第２の液体出口、及び、第２の固相マトリックスに固定化され、第２のリガンドに対して特異的に結合可能であるが第１のリガンドに対してはそうでない第２の受容体を含むチャンバを備えた、第２の親和性カラムと、及び
    前記第１の液体出口を前記第２の液体入口に接続する導管とからなる、親和性分離装置。
14. 受容体を含む液体をリガンドに接触させ、
    前記リガンドに結合した前記受容体を、前記受容体を含む液体中の他の成分から分離し、
    前記リガンドに結合した前記受容体を溶離して、精製受容体を生成し、及び
    前記精製受容体をマトリックスに固定化して受容体マトリックスを形成することからなる、受容体マトリックスの調製方法。
15. 前記精製受容体を固定化する前に、さらに、前記溶離に寄与した試薬を中和又は除去し、或いは中和及び除去し、若しくは物理的条件を変更する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記試薬が脱塩によって除去される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記リガンドが固定化される、請求項１４に記載の方法。
18. 第２の受容体及び第２のリガンドについて前記方法を繰り返し、第２の受容体マトリックスを調製する、請求項１４に記載の方法。
19. 前記受容体マトリックスと前記第２の受容体マトリックスを混合する、請求項１８に記載の方法。
20. 第３の受容体及び第３のリガンドについて前記方法を繰り返し、第３の受容体マトリックスを調製する、請求項１８に記載の方法。
21. 前記受容体が抗体であり、前記リガンドがタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
22. 液体入口、液体出口を備え、固定化されたリガンドを含む第１のカラムと、
    液体入口、液体出口を備え、受容体を固定化するためのマトリックスを含む第２のカラムと、及び
    前記第１のカラムの出口と前記第２のカラムの入口との間の液体接続とからなる、受容体マトリックスを調製するための装置。
23. 液体入口、液体出口を備え、試薬の中和剤又は除去剤或いは受容体−リガンド結合を解離させる条件を含む中間カラムをさらに含み、
    前記第１のカラムの液体出口が前記中間カラムの入口に対する液体接続を備え、前記中間カラムの出口が前記第２のカラムの入口に対する液体接続を備える、請求項２２に記載の装置。
24. 第１の受容体マトリックスと第２の受容体マトリックスを混合することからなり、
    前記第１の受容体が前記第２の受容体とは異なるリガンドと結合する、受容体マトリックスの調製方法。
25. 複数の化学的に異なる架橋剤を２つのタンパク質に同時に反応させることからなり、
    両方の架橋剤だけで前記２つのタンパク質の間に共有結合を形成可能である、２つのタンパク質の間に共有結合を形成するための方法。
26. 前記架橋剤と反応する前に、前記２つのタンパク質は非共有結合によって相互に結合している、請求項２５に記載の方法。
27. 試料から少なくとも２つの特定の事前定義されたリガンドを除去し、及び
    前記試料中に残存するリガンドを分析することからなる、試料からリガンドを分離し、残存するリガンドを分析するための方法。
28. 少なくとも３つのリガンドが除去される、請求項２７に記載の方法。
29. 少なくとも４つのリガンドが除去される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記リガンドがタンパク質である、請求項２７に記載の方法。
31. 前記リガンドが特定の事前定義された受容体との結合によって除去され、前記受容体が不溶性形態であるか、又はリガンドとの結合後に不溶化される、請求項２７に記載の方法。
32. 前記試料中の全リガンドの少なくとも５０重量％が除去される、請求項２７に記載の方法。
33. 前記試料中の全リガンドの少なくとも７５重量％が除去される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記結合したリガンドを前記受容体から除去する、請求項３１に記載の方法。
35. 前記受容体を新しい試料に再使用することによって前記処理が繰り返される、請求項３３に記載の方法。
36. 同じ受容体で前記処理が２０回繰り返される、請求項３４に記載の方法。
37. 同じ受容体で前記処理が５０回繰り返される、請求項３５に記載の方法。
38. 同じ受容体で前記処理が２００回繰り返される、請求項３６に記載の方法。
39. 前記残存するリガンドが、前記残存するリガンドの分離及び定量によって分析される、請求項２７に記載の方法。
40. 少なくとも１つの固定化された受容体が、少なくとも１つの他の固定化された受容体から選択的に除去される、請求項３１に記載の方法。
41. １つの受容体画分を他の受容体画分から選択的に除去可能である、請求項３１に記載の方法。
42. 少なくとも２つの受容体画分が少なくとも２つの事前定義された位置に固定化され、
    少なくとも１つの受容体が、別の受容体とは異なる事前定義された位置に配置され、及び
    前記試料が、両方の事前定義された位置を順次通される、請求項３１に記載の方法。
43. 前記２つの特定の事前定義されたリガンドの本質的に全てが前記試料から除去される、請求項２７に記載の方法。
44. タンパク質含有試料から分離されたタンパク質を含む２次元電気泳動ゲルであって、少なくとも２つの所定のタンパク質が前記ゲル中に実質的に存在せず、前記タンパク質含有試料が前記所定のタンパク質を含み、前記試料中の他のタンパク質が２次元電気泳動ゲル中に存在する、２次元電気泳動ゲル。
45. タンパク質含有試料から分離されたタンパク質を含む２次元電気泳動ゲルであって、少なくとも２つの所定のタンパク質及びこれらに結合したタンパク質が前記ゲル中に存在する実質的に全てのタンパク質であり、前記タンパク質含有試料が前記所定のタンパク質及び前記これらに結合したタンパク質を前記試料中に含む、２次元電気泳動ゲル。
46. 前記２次元電気泳動ゲル中に、実質的に前記結合したタンパク質のみが存在する、請求項４４に記載の２次元電気泳動ゲル。
47. 請求項２７に記載の方法によって生成された、変性リガンド含有試料。
48. ある試料中の他のタンパク質に自然に結合した関連タンパク質を検出するための方法であって、
    １つ又はより多くのタンパク質に対する固定化された受容体と、前記タンパク質及びそれに自然に結合した関連タンパク質との結合を可能にする条件下において、前記試料を前記受容体に接触させ、
    前記固定化された受容体から非結合タンパク質を除去し、及び
    前記自然に結合した関連タンパク質の存在を検出することからなる方法。
49. 前記自然に結合した関連タンパク質を、前記受容体及び前記タンパク質から溶離する、請求項４７に記載の方法。